CN103143016A - 通过给予神经生长因子拮抗剂及其组合物来治疗骨关节炎疼痛的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过给予神经生长因子拮抗剂及其组合物来治疗骨关节炎疼痛的方法。本发明涉及抗-NGF抗体(如抗-NGF拮抗剂抗体)及编码该抗体的多核苷酸。本发明进一步涉及这类抗体及/或多核苷酸于治疗及/或预防疼痛，包括手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛的用途。

Description

通过给予神经生长因子拮抗剂及其组合物来治疗骨关节炎疼痛的方法
本申请是基于中国专利申请No.200680020849.9的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年4月11日递交的美国申请11/104,248的优先权，该申请通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明涉及抗-NGF抗体(如抗-NGF拮抗剂抗体)。本发明进一步涉及使用拮抗剂(如抗体)用于治疗及/或预防疼痛，包括手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛的用途。
发明背景
神经生长因子(NGF)是第一个确认的神经营养素(neurotrophin)，并已经完全定出其在周围和中枢神经的发育和存活中的作用。已经显示NGF是在周围交感神经和胚胎感觉神经元与基底前脑胆碱能神经元发育上关键性的存活和维持因子。Smeyne等人，Nature 368：246-249(1994)和Crowley等人，Cell 76：1001-1011(1994)。NGF上调(up-regulate)神经肽在感觉神经元中的表达(Lindsay和Harmer，Nature 337：362-364(1989))，并经由两个不同的膜-结合受体，TrkA酪氨酸激酶受体和p75共同神经营养素受体(有时分别称为″高亲和性″和″低亲和性″NGF受体)调节其活性。p75受体在结构上与肿瘤坏死因子受体家族的其他成员有关(Chao等人，Science 232：518-521(1986))。关于NGF的综述，参见Huang等人，Annu.Rev.Neurosci.24：677-736(2001)；Bibel等人，Genes Dev.14：2919-2937(2000)。已经定出NGF的结晶结构和与trkA受体形成的复合物中的NGF的结晶结构。参见Nature 254：411(1991)；Mature 401：184-188(1996)。
除了其在神经系统上的作用之外，NGF已经逐渐涉及神经系统以外的过程。例如，已经显示NGF促进了血管通透性(Otten等人，Eur JPharmacol.106：199-201(1984))，提高T-和B-细胞免疫反应(Otten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10059-10063(1989))，诱导淋巴细胞分化和肥大细胞增殖，并引起从肥大细胞中释放出可溶性生物信号(Matsuda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6508-6512(1988)；Pearce等人，J.Physiol.372：379-393(1986)；Bischoff等人，Blood 79：2662-2669(1992)；Horigome等人，J.Biol.Chem.268：14881-14887(1993))。虽然已经显示外源添加NGF，能够拥有全部的这些作用，但重要的是注意到在活体内在任何的这些过程中，仅罕有地显示内源的NGF是重要的(Torcia等人，Cell.85(3)：345-56(1996))。因此，即使有也不清楚是何种因素可能抑制了内源NGF的生物活性。
NGF由许多细胞类型产生，包括肥大细胞(Leon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3739-3743(1994))、B-淋巴细胞(Torcia等人，Cell 85：345-356(1996))、角化细胞(Di Marco等人，J.Biol.Chem.268：22838-22846))、平滑肌细胞(Ueyama等人，J.Hypertens.11：1061-1065(1993))、纤维母细胞(Lindholm等人，Eur.J.Neurosci.2：795-801(1990))、支气管上皮细胞(Kassel等人，Clin.Exp.Allergy 31：1432-40(2001))、肾小球系膜细胞(Steiner等人，Am.J.Physiol.261：F792-798(1991))和骨骼肌肌管(Schwartz等人，J Photochem.Photobiol.B66：195-200(2002))。已经在神经系统以外的各种细胞类型上找到NGF受体。例如，已经在人类单核细胞、T-和B-淋巴细胞及肥大细胞上找到TrkA。
已经在人类患者和数种动物模式中观察到在增加NGF含量与炎症状况之间的关联。这些包括全身性红斑性狼疮(Bracci-Laudiero等人，Neuroreport 4：563-565(1993))、多发性硬化症(Bracci-Laudiero等人，Neurosci.Lett.147：9-12(1992))、牛皮癣(Raychaudhuri等人，Acta Derm.l′enereol.78：84-86(1998))、关节炎(Falcim等人，Ann.Rheum.Dis.55：745-748(1996))、间质性膀胱炎(Okragly等人，J.Urology 161：438-441(1999))和哮喘(Braun等人，Eur.J Immunol.28：3240-3251(1998))。
同样地，在周围组织中升高NGF含量与痛觉过敏和炎症反应有关，并已经在许多形式的关节炎中观察到。受风湿性关节炎侵袭的患者的滑膜，表达高量的NGF，而已经报告了在未发炎的滑膜中不可检测到NGF(Aloe等人，Arch.Rheum.35：351-355(1992))。在以实验方式诱发风湿性关节炎的大鼠中，也看到类似的结果(Aloe等人，Clin.Exp.Rheumatol.10：203-204(1992))。已经在转基因关节炎老鼠中，报告了NGF的含量升高，连同肥大细胞的数目增加(Aloe等人，Int.J.Tissue Reactions-Exp.Clin.Aspects 15：139-143(1993))。PCT公开第WO 02/096458号公开了使用具有某些特性的抗-NGF抗体，治疗各种NGF相关病症，如炎症状况(例如风湿性关节炎)。已经报告了将经过纯化的抗-NGF抗体注射到带有人类肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的关节炎转基因老鼠内，导致肥大细胞数目减少，并减少了在关节炎老鼠的滑膜中组织胺和物质P的含量(Aloe等人，Rheumatol.Int.14：249-252(1995))。已经显示外源给予NGF抗体，降低了发生在关节炎老鼠中的提高的TNF-α含量(Manni等人，Rheumatol.Int.18：97-102(1998))。
再者，已经在人类骨关节炎软骨细胞中观察到NGF和高亲和性NGF受体(TrkA)的增加表达(Iannone等人，Rheumatology 41：1413-1418(2002))。
已经报告了啮齿类抗-NGF拮抗剂抗体。参见，例如Hongo等人，Hybridoma(2000)19(3)：215-227；Ruberti等人(1993)Cell.Molec.Neurobiol.13(5)：559-568。然而，当为了治疗而将啮齿类抗体使用在人类上时，在大量接受治疗的个体中发展出人类抗-老鼠抗体反应。此外，已经发现老鼠抗体的效应物功能，在人类关系中是较低效力的。因此，人们非常需要一种抗-NGF拮抗剂抗体，包括人类化的抗-NGF拮抗剂抗体。
在本文中公开的所有参考文献、出版物和专利申请，全部以引用的方式并入本文中。
发明内容
在本文中公开的本发明涉及对抗神经生长因子的抗体。
另一方面，本发明是人类化的和亲和性成熟的抗体E3，其特异性地结合人类和啮齿类神经生长因子(″NGF″)。分别在图1A(SEQ ID NO：1)和1B(SEQ ID NO：2)中示出E3的重链和轻链可变区域的氨基酸序列。在图1A和1B中以图示表示抗体E3的CDR部分(包括Chothia和KabatCDRs)。在下文中也示出E3重和轻链的氨基酸序列，以及个别的衍生CDRs(参见下文的″抗体序列)。
另一方面，本发明是包括抗体E3的片段或区域的抗体(在本文中可互换地称为″E3″)。在一具体实施例中，该片段是在图1B中示出的抗体E3的轻链。在另一具体实施例中，该片段是在图1A中示出的抗体E3的重链。在另一具体实施例中，该片段含有一或多个得自抗体E3的轻链及/或重链的可变区域。在另一具体实施例中，该片段含有一或多个得自在图1A和1B中示出的抗体E3的轻链及/或重链的互补性决定区(CDRs)。
另一方面，本发明是包括轻链的抗体，该轻链是由保藏编号为ATCC第PTA-4893号或ATCC第PTA-4894号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括重链的抗体，该重链是由保藏编号为ATCC第PTA-4895号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括(a)轻链和(b)重链的抗体，其中该轻链是由保藏编号为ATCC第PTA-4894号或ATCC第PTA-4893号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的，该重链是由保藏编号为ATCC第PTA-4895号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的(在本文中为了方便，将由已保藏的宿主细胞产生的多核苷酸(们)称为具有ATCC第PTA-4894号、PTA-4893和PTA-4895号的保藏编号)。另一方面，本发明是包括轻链的轻链可变区的抗体，该轻链是由具有ATCC第PTA-4894号或ATCC第PTA-4893号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括重链的重链可变区的抗体，该重链是由具有ATCC第PTA-4895号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括(a)轻链的轻链可变区以及(b)重链的重链可变区的抗体，该轻链是由具有ATCC第PTA-4894号或ATCC第PTA-4893号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的，该重链是由具有ATCC第PTA-4895号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括一或多个CDR(s)的抗体，该CDR(s)是由(a)由具有ATCC第PTA-4894号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸及/或(b)由具有ATCC第PTA-4895号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的重链编码的。
在某些具体实施例中，该抗体包括人类重链IgG2a恒定区。在某些具体实施例中，该抗体包括人类轻链κ恒定区。在某些具体实施例中，该抗体包括经过修改的恒定区，如在免疫学上为惰性的恒定区，例如不诱发补体调解的溶解，或不刺激抗体-依赖性细胞调解的细胞毒性(ADCC)。在其他具体实施例中，按照在Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT公开第PCT/GB99/01441号；及/或大不列颠联合王国第9809951.8号专利申请中的描述来修改该恒定区。在另外的具体实施例中，该抗体包括人类重链IgG2a恒定区，该恒定区包括下列的突变：A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野外型IgG2a序列)。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624。
另一方面，本发明提供包括下列任一个或多个的多肽(其可以或可以不是抗体)：a)在图1A和1B中示出的抗体E3的一或多个CDR(s)；b)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的CDR H3；c)得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的CDR L3；d)得自在图1B中示出的抗体E3的重链的三个CDRs；e)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的三个CDRs；以及f)得自在图1A和1B中示出的抗体E3的轻链的三个CDRs和得自其重链的三个CDRs。本发明还提供包括下列任一个或多个的多肽(其可以或可以不是抗体)：a)衍生自在图1A和1B中示出的抗体E3的一或多(一、二、三、四、五或六)个CDR(s)；b)衍生自得自在图1A中示出的抗体E3的重链的CDR H3的CDR；及/或c)衍生自得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的CDR L3的CDR。在某些具体实施例中，CDRs可能是Kabat CDRs、Chothia CDRs，或Kabat和Chothia CDRs的组合(在本文中称为″延伸″或″混合″的CDRs)。在某些具体实施例中，多肽(如抗体)与NGF(如人类NGF)结合。在某些具体实施例中，该多肽包括在本文中描述的任何CDR组态(包括组合、变体等等)。
本发明一方面提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：9组成的重链可变区，其中I34是S、L、V、A或I；且以N、T或S取代N35。在本文中为了方便，在提及氨基酸时，″取代″或″是″意指特定位置可选择的氨基酸(们)。取代或选择，显然可以是在SEQ ID或图中表示的氨基酸。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：10组成的重链可变区，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S；且L63是L或V。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：11所组成的重链可变区，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；且其中Y110是Y、K、S、R或T。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：11所组成的重链可变区，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：11所组成的重链可变区，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：12组成的轻链可变区，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：13组成的轻链可变区，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：14组成的轻链可变区，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO：14组成的轻链可变区，其中S91是S或E；K92是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：9中示出的氨基酸序列，其中I34是S、L、V、A或I；且N35是N、T或S。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S；且L63是L或V。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；且其中Y110是Y、K、S、R或T。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：13中示出的氨基酸序列，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E；K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体，包括人类化抗体)，其包括具有下述区域的重链可变区：SEQ ID NO：9的CDR1区，其中I34为S、L、V、A或I；且N35是N、T或S；SEQ ID NO：10的CDR2区，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及SEQ IDNO：11的CDR3区，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T。在一些具体实施例中，该重链可变区包括SEQ ID NO：11的CDR3区，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；其中Y110是任何氨基酸。在另外的具体实施例中，该重链可变区包括SEQ ID NO：11的CDR3区，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。在一些具体实施例中，该多肽(如抗体)还包括抗体轻链可变区。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括具有下述区域的轻链可变区：SEQ ID NO：12的CDR1区，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；SEQ ID NO：13的CDR2区，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及SEQ ID NO：14的CDR3区，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该轻链可变区包括SEQ ID NO：14的CDR3区，其中S91是S或E；K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽(如抗体)还包括抗体重链。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括：(a)重链可变区，包括：SEQ ID NO：9的CDR1区，其中I34是S、L、V、A或I；且N35是N、T或S；SEQ ID NO：10的CDR2区，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及SEQ ID NO：11的CDR3区，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T；以及(b)轻链可变区，包括：SEQ IDNO：12的CDR1区，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；SEQ ID NO：13的CDR2区，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及SEQ ID NO：14的CDR3区，其中S91是S或E  K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该轻链可变区包括SEQ ID NO：14的CDR3区，其中S91是S或E；K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该重链可变区包括SEQ ID NO：11的CDR3区，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；其中Y110是任何氨基酸。在其他的具体实施例中，该重链可变区包括SEQ ID NO：11的CDR3区，G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。在一些具体实施例中，该多肽还包括抗体轻链。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体，包括人类化抗体)，其包括：在SEQ ID NO：9中示出的氨基酸序列，其中I34是S、L、V、A或I；且N35是N、T或S；在SEQ ID NO：10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及在SEQ IDNO：11中示出的氨基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T。在一些具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。在其他的具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。在一些具体实施例中，该多肽(如抗体)还包括还包括抗体轻链可变区。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括：在SEQ ID NO：12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；在SEQ ID NO：13中示出的氨基酸序列，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及在SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E；K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽(如抗体)还包括还包括抗体重链可变区。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括：(a)在SEQ ID NO：9中示出的氨基酸序列，其中I34是S、L、V、A或I；且N35是N、T或S；在SEQ ID NO：10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；且其中Y110是Y、K、S、R或T；以及(b)在SEQ IDNO：12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；在SEQ ID NO：13中示出的氨基酸序列，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及在SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO：14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E；K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。在其他的具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T；其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T；其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G；且其中Y110是任何氨基酸。在一些具体实施例中，该多肽还包括还包括抗体轻链可变区。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括具有下列区域的重链可变区：(a)SEQ ID NO：9的CDR1区，其中I34是S、L、V、A或I；且N35以N、T或S取代；(b)SEQ ID NO：10的CDR2区，其中M50是I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；以及(c)SEQ ID NO：11的CDR3区，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T；其中该抗体与NGF结合。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括具有下列区域的轻链可变区：(a)SEQ ID NO：12的CDR1区，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；(b)SEQ ID NO：13的CDR2区，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；以及(c)SEQ ID NO：14的CDR3区，其中K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R；其中该抗体与NGF结合。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括(a)重链可变区，包括：(i)SEQ ID NO：9的CDR1区，其中I34以S、L、V、A或I取代；且N35以N、T或S取代；(ii)SEQ ID NO：10的CDR2区，其中M50是I、G、Q、S或L；A62是A或S，且L63是L或V；和(iii)SEQ ID NO：11的CDR3区，其中Y100是Y、L或R；其中Y101是Y或W；其中G103是G、A或S；其中T104是T或S；其中S105是S、A或T；其中Y106是Y、R、T或M；其中Y107是Y或F；其中F108是F或W；其中D109是D、N或G；其中Y110是Y、K、S、R或T；以及(b)轻链可变区，包括：(i)SEQ ID NO：12的CDR1区，其中S26是S或F；D28是D、S、A或Y；且H32是H、N或Q；(ii)SEQ ID NO：13的CDR2区，其中I51是I、T、V或A；且S56是S或T；和(iii)SEQ ID NO：14的CDR3区，其中S91是S或E；K92是K、H、R或S；且其中Y96是Y或R；其中该抗体与NGF结合。
除非另行提到，在一位置的氨基酸选择(例如取代)与在任何其他位置的氨基酸选择无关。
在一些具体实施例中，多核苷酸(如抗体)与NGF(如人类NGF)结合。在一些具体实施例中，该多肽包括包括在本文中描述的任何CDR组态(包括组合、变体等等)。
从本文中的说明，显然在本文中可变区的编号使用连续编号。本领域技术人员了解一些现有的抗体编号系统(如Kabat和Chothia编号)，以及如何将连续编号转换成其他的编号系统，如Kabat编号或Chothia编号。
另一方面，本发明提供包括选自SEQ ID NO：46或50的氨基酸序列(如CDR3序列)的多肽(如抗体)。在另外的具体实施例中，该多肽还包括还包括一或多个在SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括还包括一或多个在SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供包括选自下列的氨基酸序列(如CDR区，如CDR H1及/或CDR H2区)的多肽(如抗体)：(a)SEQ ID NO：28及/或29；(b)SEQ ID NO：30及/或31；(c)SEQ ID NO：32及/或33；(d)SEQ ID NO：34及/或35；(e)SEQ ID NO：36及/或37；(f)SEQ ID NO：38及/或39；以及(g)SEQ ID NO：40和41。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ IDNO：28、30、32、34、36、38和40的氨基酸序列(如CDR H1区)。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO：29、31、33、35、37、39和41的氨基酸序列(如CDR H2区)。在另外的具体实施例中，该多肽还包括还包括一或多个在SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供包括选自下列的氨基酸序列(如CDR区，如CDR L1及/或CDR L2区)的多肽(如抗体)：(a)SEQ ID NO：18及/或19；(b)SEQ ID NO：20及/或21；和(c)SEQ ID NO：22及/或23。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO：18、20和22的氨基酸序列(如CDR L1区)。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO：19、21和23的氨基酸序列(如CDR L2区)。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供包括选自下列的氨基酸序列(如CDR区，如CDR L3及/或CDR H3区)的多肽(如抗体)：(a)SEQ ID NO：51及/或52；(b)SEQ ID NO：55及/或56；(c)SEQ ID NO：57及/或58；(d)SEQ ID NO：59及/或60；(e)SEQ ID NO：61及/或62；(f)SEQ ID NO：63及/或64。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO：51、55、57、59、61和63的氨基酸序列(如CDR L3区)。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQID NO：52、56、58、60、62和64的氨基酸序列(如CDR H3区)。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO：18、19、30和31中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供包括一或多个在SEQ ID NO：61、63、18、19、30和31中示出的氨基酸序列(如CDR区)的多肽(如抗体)。
本发明一方面提供抗-NGF抗体(如拮抗剂抗体)，其以高亲和性与NGF(如人类NGF)结合。在一些具体实施例中，高亲和性是(a)以低于大约2nM(如大约1nM、800pM、600pM、400pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM或更低)的KD，及/或比大约6x10-5s-1更慢的koff与NGF结合；并/或(b)以大约200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM或更低的IC50(在大约15pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活；并/或(c)以大约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、1pM或更低的IC50(在大约1.5pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活；并/或(d)以大约150pM、125pM、100pM、80pM、60pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或更低的IC50(在大约15pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的大鼠NGF-依赖性存活；并/或(e)以大约30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、4pM、3pM、2pM、1pM或更低的IC50(在大约1.5pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的老鼠NGF-依赖性存活；并/或(f)并以比trkA受体更高的亲和性与NGF结合。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其中该多肽(a)以低于大约2nM(如大约1nM、800pM、600pM、400pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM或更低)的KD，及/或比大约6x10-5s-1更慢的koff与NGF(如人类NGF)结合；并/或(b)以大约200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM或更低的IC50(在大约15pM NGF的存在下)，抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活；并/或(c)以大约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、1pM或更低的IC50(在大约1.5pM NGF的存在下)，抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活；并/或以比trkA受体更高的亲和性与NGF结合。在一些具体实施例中，该多肽(a)以比大约2nM更低的KD与NGF结合；并/或(b)以大约100pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中在大约15pM NGF的存在下测量该IC50；并/或(c)以大约10pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中在大约1.5pM NGF的存在下测量该IC50。在一些具体实施例中，该多肽(a)以比大约100pM更低的KD与NGF结合；并/或(b)以大约20pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中在大约15pM NGF的存在下测量该IC50；并/或(c)以大约2pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中在大约1.5pM NGF的存在下测量该IC50。
从本文中的说明，显然明确地排除在本发明之外的是由与老鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所组成的多肽具体实施例。在图1A和1B，以及在SEQ ID NO：9-14中，示出Mab 911的衍生CDR序列。
在一些具体实施例中，本发明提供任何上述的多肽或抗体，其中该多肽(如抗体)是经过分离的。在一些具体实施例中，该多肽(抗体)实质上是经过纯化的。在另外的具体实施例中，该多肽(如抗体)是亲和性成熟的。在其他的具体实施例中，该抗体是拮抗剂抗体。在一些具体实施例中，该多肽(抗体)包括人类框架(framework)序列。在另外的具体实施例中，该多肽(抗体)包括一或多个非人类框架残基。在一些具体实施例中，该多肽(抗体)以2nM或更低的KD与NGF(如人类NGF)结合。在一些具体实施例中，相对于非人类氨基酸序列(如可变区序列，如CDR序列，如框架序列)，该多肽包括一或多个(如2、3、4、5、6、7、8或更多个)人类氨基酸取代。在一些具体实施例中，相对于双亲(parent)多肽氨基酸序列(如抗体911氨基酸序列，如任一或多个的SEQ ID NO：9-14)，该多肽包括至少1、至少2或更多，如至少3、4、5、6或更多个氨基酸取代。在一些具体实施例中，相对于双亲抗体(如Mab 911)亲和性，已经改变了(在某些具体实施例中，增加了)该抗体的结合亲和性。在其他的具体实施例中，该抗体的结合亲和性比trkA受体对NGF(如人类NGF)的结合亲和性更低。在一些具体实施例中，该多肽可以是抗体。在一些具体实施例中，该抗体是人类抗体。在其他的具体实施例中，该抗体是人类化抗体。在另外的具体实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些具体实施例中，该抗体是亲和性成熟的抗体。
本发明提供多核苷酸(包括经过分离的多核苷酸)，包括编码任何上述具体实施例的多核苷酸。
另一方面，本发明提供经过分离的多核苷酸，包括编码抗体E3(在本发明中可称为″E3″)的片段或区域的多核苷酸。在一具体实施例中，该片段是如同在图1B中示出的抗体E3的轻链。在另一具体实施例中，该片段是如同在图1A中示出的抗体E3的重链。在另一具体实施例中，该片段含有一或多个得自抗体E3的轻链及/或重链的可变区。在另一具体实施例中，该片段含有一或多个得自如同在图1A和1B中示出的抗体E3的轻链及/或重链的互补性决定区(CDRs)。
另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，包括编码抗体E3的多核苷酸。在一些具体实施例中，该多核苷酸包括在图2和3中示出的任一多核苷酸或两者。
另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，其编码具有ATCC PTA-4893或ATCC PTA-4894保藏编号的E3轻链。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，其编码具有ATCC PTA-4895保藏编号的E3重链。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，包括(a)在具有ATCC PTA-4893或PTA-4894保藏编号的多核苷酸中编码的可变区，以及(b)在具有ATCCPTA-4895保藏编号的多核苷酸中编码的可变区。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，包括(a)一或多个在具有ATCC PTA-4893或PTA-4894保藏编号的多核苷酸中编码的CDR；及/或(b)一或多个在具有ATCC PTA-4895保藏编号的多核苷酸中编码的CDR。
另一方面，本发明提供编码任何在本文中描述的抗体(包括抗体片段)或多肽的多核苷酸。
另一方面，本发明提供包括任何在本文中公开的多核苷酸的载体(包括表达和选殖载体)和宿主细胞。
从在本文中的说明，显然明确地排除在本发明之外的是由与老鼠单克隆抗体911的多核苷酸序列相同的多核苷酸序列所组成的多核苷酸具体实施例。在图1A和1B，以及在SEQ ID NO：9-14中，示出Mab 911的衍生CDR序列。
另一方面，本发明是包括编码E3轻链的多核苷酸和编码E3重链的多核苷酸的宿主细胞，其中该多核苷酸(们)编码具有ATCC第PTA-4893号及/或PTA-4894号保藏编号的E3轻链，且该多核苷酸编码具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的E3重链。在一些具体实施例中，该宿主细胞包括多核苷酸，其包括(a)在具有ATCC第PTA-4893号或PTA-4894号保藏编号的多核苷酸中编码的可变区，及/或(b)在具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的多核苷酸中编码的可变区。在一些具体实施例中，该宿主细胞包括编码(a)一或多个在具有ATCC第PTA-4893号或PTA-4894号保藏编号的多核苷酸中编码的CDR；及/或(b)一或多个在具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的多核苷酸中编码的CDR的多核苷酸。在一些具体实施例中，该宿主细胞是哺乳动物细胞。
另一方面，本发明是与抗体E3结合的NGF的复合物。另一方面，该复合物是经过分离的。另一方面，该复合物实质上是经过纯化的。
另一方面，本发明是与在本文中描述的抗体或多肽结合的NGF的复合物。另一方面，该复合物是经过分离的。另一方面，该复合物实质上是经过纯化的。
另一方面，本发明是包括在本文中描述的多肽(包括抗体，如抗体E3)或多核苷酸的医药组合物，如包括抗体E3或包括抗体E3的片段的抗体的医药组合物，以及在药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本发明是产生抗体E3的方法，包括制备包括编码抗体E3的表达载体的宿主细胞，在容许抗体E3产生的条件下培养该宿主细胞或其后代；并纯化抗体E3。在一些具体实施例中，该表达载体包括在图2和3中示出的多核苷酸序列之一或两者。
另一方面，本发明是产生抗体E3的方法，包括使编码E3轻链的多核苷酸和编码E3重链的多核苷酸在适当的细胞中表达，其中编码E3轻链的多核苷酸具有ATCC第PTA-4893号及/或ATCC第PTA-4894号保藏编号，且编码E3重链的多核苷酸具有ATCC第PTA-4895号保藏编号；通常接着回收及/或分离该抗体。
另一方面，本发明提供产生任何在本文中描述的多肽(如抗体)的方法，借着使一或多个编码该抗体(其可以单一轻或重链分别表达，或可从一载体中表达轻链和重链两者)的多核苷酸在适当的细胞中表达，通常接着回收并/或分离感兴趣的抗体或多肽。
另一方面，本发明是使用在本文中公开的任何多肽(包括抗体，如抗体E3)来拮抗NGF(如人类NGF)生物活性的方法。在一具体实施例中，该方法包括使人类神经生长因子与在本文中描述的任何多肽(包括抗体E3)接触，借此拮抗、降低、阻断或压抑NGF活性(如人类神经生长因子活性)。
另一方面，本发明是使用在本文中描述的任何多肽(包括抗体，如抗体E3)来检测NGF的方法。借着检测在NGF和在本文中描述的任何多肽(如抗体E3)之间的复合物，来检测NGF的存在。当在本文中使用″检测″一词时，包括有或无参考对照组的定性及/或定量检测(测量含量)。
另一方面，本发明是利用给予有效含量的包括抗体E3或在本文中描述的任何多肽(包括抗体)或多核苷酸具体实施例的组合物，来治疗疼痛的方法。在一些具体实施例中，该疼痛是手术后的疼痛。
另一方面，本发明是利用对个体给予有效含量的抗-NGF拮抗剂抗体，在该个体中预防或治疗风湿性关节炎疼痛的方法。根据本发明，已经显示抗-NGF拮抗剂抗体能够抑制或阻断与风湿性关节炎有关的疼痛。在一些具体实施例中，在给予抗-NGF拮抗剂抗体之后大约24小时内减轻了该疼痛。在一些具体实施例中，在给予抗-NGF拮抗剂抗体之后大约4天内减轻了该疼痛。在一些具体实施例中，在个体中观察到改善炎症状况的迹象之前，或在没有改善的迹象时，减轻该疼痛。
另一方面，本发明提供在个体中减少风湿性关节炎疼痛的发生、改善风湿性关节炎疼痛、抑制风湿性关节炎疼痛、减轻风湿性关节炎疼痛及/或延迟风湿性关节炎疼痛之发作、发展或进行的方法，该方法包括对该个体给予有效含量的抗-NGF拮抗剂抗体。
另一方面，本发明提供在个体中治疗与风湿性关节炎有关的炎症恶病质(体重减轻)的方法，包括给予有效含量的抗-NGF拮抗剂抗体。
另一方面，本发明是借着对个体给予有效含量的神经生长因子的拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)，在个体中预防或治疗骨关节炎疼痛的方法。
另一方面，本发明提供在个体中减少骨关节炎疼痛的发生、改善骨关节炎疼痛、抑制骨关节炎疼痛、减轻骨关节炎疼痛及/或延迟骨关节炎疼痛之发作、发展或进行的方法，该方法包括对该个体给予有效含量的NGF抑制剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。
另一方面，本发明提供在患有骨关节炎的个体中改善物理功能的方法，该方法包括对该个体给予有效含量的NGF抑制剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。
另一方面，本发明提供在患有骨关节炎的个体中改善僵硬的方法，该方法包括对该个体给予有效含量的NGF抑制剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。
在一些具体实施例中，该个体为人类。在一些具体实施例中，为了治疗骨关节炎疼痛，抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率是在每天一次和每10周一次之间，或是更低的频率。
另一方面，本发明提供包括任一或多个在本文中描述的组合物的试剂盒和组合物。这些试剂盒，通常是在适当的包装中并提供适当的说明书，适用在本文中描述的任何方法。
本发明也还提供任何适合在本文中描述的任何用途的组合物和试剂盒，无论是在医药品的用途，及/或用来制造医药品的前后文中。
附图简要说明
图1A显示E3抗体的重链可变区的氨基酸序列(标示为″6″和″5+亲和性成熟H3″)。分别借着加下标线的原文和粗斜体的原文来描述ChothiaCDRs和Kabat CDRs。图1A也显示下列重链可变区氨基酸序列的直线排列：(1)老鼠911抗体的CDRs H1(SEQ ID NO：9)，H2(SEQ ID NO：10)及H3(SEQ ID NO：11)；(2)VH4-59人类生殖种系接受者序列(标示为″VH4-59″或″2″)(SEQ ID NO：69)；(3)以老鼠抗体911的衍生CDRs移植的接受者序列(标示为″CDR移植″或″3″)(SEQ ID NO：70)；(4)CDR移植的接受者序列，包括V71K取代(标示为″3+一框架突变″或″4″)(SEQ ID NO：71)；(5)含有亲和性成熟CDRs H1和H2的纯种系(标示为″5″或″4+亲和性成熟H1，H2″)(SEQ ID NO：72)；以及抗体E3(如上述)(SEQ ID NO：1)。
图1B显示E3抗体的轻链可变区的氨基酸序列(标示为″5″或″4+亲和性成熟L3″)。分别借着加下标线的原文和粗斜体的原文来描述ChothiaCDRs和Kabat CDRs。图1B也显示下列轻链可变区氨基酸序列的直线排列：(1)老鼠911抗体的CDRs L1(SEQ ID NO：12)，L2(SEQ ID NO：13)及L3(SEQ ID NO：14)；(2)O8人类生殖种系接受者序列(标示为″O8″或″2″)(SEQ ID NO：73)；(3)以老鼠抗体911的衍生CDRs移植的接受者序列(标示为″CDR移植″或″3″)(SEQ ID NO：74)；(4)CDR移植的接受者序列(标示为″3+亲和性成熟L1，L2″或″4″)(SEQ ID NO：75)；(5)含有亲和性成熟CDRs L1和L2的纯种系(标示为″5″或″4+亲和性成熟L3″)；以及抗体E3(如上述)(SEQ ID NO：2)。
图2显示包括编码抗体E3的重链可变区的多核苷酸序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO：76)。
图3显示包括编码抗体E3的轻链可变区的多核苷酸序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO：77)。
图4是在各种浓度的人类和大鼠NGF的存在下，表示E13.5神经元的NGF-依赖性存活的图表。X轴代表NGF浓度(纳克/毫升)且Y轴代表计算出的神经元。
图5为在0.04纳克/毫升人类NGF(约1.5pM；在下图中示出)或0.4纳克/毫升人类NGF(约15pM；在上图中示出)的存在下，比较各种Fabs的NGF阻断效力的图表。在各种浓度的Fab E3；老鼠911Fab；和Fab H19-L129与Fab 8L2-6D5中，评估E13.5老鼠三叉神经元的存活。在每个NGF浓度下，计算每个Fab的IC50(以pM计)，并在表9中示出。Fab E3在15pM人类NGF的存在下以大约21pM的IC50，并在1.5pM人类NGF的存在下以大约1.2pM的IC50，强有力地阻断了人类NGF-依赖性的三叉神经元存活。Fab 3C和H19-L129也强有力地阻断了人类NGF-依赖性的三叉神经元存活。在两图中，X轴代表抗体浓度(nM)且Y轴代表计算出的神经元。1.5pM的NGF约为IC50，而15pM则代表NGF的饱和浓度。
图6为在0.04纳克/毫升大鼠NGF(约1.5pM；在下图中示出)或0.4纳克/毫升大鼠NGF(约15pM；在上图中示出)的存在下，比较各种Fabs的NGF阻断效力的图表。在各种浓度的Fab E3；老鼠Fab 911；和Fab H19-L129与Fab 8L2-6D5中，按照上述评估E13.5老鼠三叉神经元的存活。在每个NGF浓度下，计算每个Fab的IC50(以pM计)，并在表9中示出。Fab E3在15pM大鼠NGF的存在下以大约31.6pM的IC50，并在1.5pM大鼠NGF的存在下以大约1.3pM的IC50，强有力地阻断了人类NGF-依赖性的三叉神经元存活。Fab 3C和H19-L129也强有力地阻断了大鼠NGF-依赖性的三叉神经元存活。1.5pM的NGF约为IC50，而15pM则代表NGF的饱和浓度。在两图中，X轴代表抗体浓度(nM)且Y轴代表计算出的神经元。
图7是表示在手术后24小时评估静止疼痛，并显示以0.02毫克/千克、0.1毫克/千克、0.6毫克/千克或1毫克/千克的抗-NGF抗体E3治疗降低了疼痛的图表。″*″表示与阴性对照组有统计学上的显著差异(p＜0.5)。
图8是表示在手术后24小时评估静止疼痛，并显示以0.5毫克/千克的抗-NGF抗体E3治疗，当在手术后2小时注射，显著(p＜0.05)地降低了静止疼痛的图表。
图9是显示人类NGF与老鼠抗体911(Fab)的结合亲和性的BIAcore分析的结果的图表。老鼠抗体911以3.7nM的KD，8.4x10-5s-1的koff和2.2x104Ms-1的kon与人类NGF结合。
图10是显示人类NGF与抗体E3(Fab)(称为″3E Fab″)的结合亲和性的BIAcore分析的结果的图表。E3抗体以0.07nM的KD(并以大约6.0x105M- 1s-1的kon和大约4.2x10-5s-1的koff)与人类NGF结合。
图11是表示抗体E3阻断NGF与其受体trkA和p75的交互作用的图表，借着在NGF和trkA(以黑色圆形表示)以及NGF和p75(以空心正方形表示)之间检测到的结合百分比来评估。X轴代表抗体3E(Fab)的浓度，而Y轴代表NGF结合(最大值RU的百分比)。增加Fab 3E的浓度，阻断了NGF与p75和trkA两者的交互作用，可借着减少的信号来表示(以RU来测量)。当抗体E3(Fab)浓度等于NGF浓度时，没有观察到任何NGF结合(以信号为0来表示)。
图12是表示完整抗体E3和Fab E3的人类NGF阻断能力的图表。在人类NGF和各种浓度的Fab E3及抗体E3的存在下，评估E13.5老鼠三叉神经元的存活。X轴代表NGF结合位置(nM)，而Y轴代表三叉神经(TG)元的标准化计数。当将完整抗体和Fab的浓度对NGF结合位置的数目标准化(Fab有一个结合位置，而完整抗体有两个结合位置)时，完整抗体E3和Fab 3E，对三叉神经元的NGF-依赖性存活显示出类似的抑制程度。
图13是表示在0.4纳克/毫升人类NGF(饱和条件)的存在下，各种浓度(20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128和0.0nM)的抗体E3(实心三角形；称为″3E″)、抗体911(实心圆形)和trkA受体免疫粘附素(immunoadhesin)(阴暗的正方形；称为″trkA-Fc″)，抑制E13.5三叉神经元的NGF-依赖性存活的能力的图表。X轴代表抗体浓度(nM)且Y轴代表计算出的神经元。这些结果证实抗体E3阻断了NGF，明显比老鼠单克隆抗-NGF抗体911或trkA免疫黏附素更好。
图14是表示抗-NGF拮抗剂抗体E3(在图中称为″3E″)或Fab 911不能抑制由NT3、NT4/5和MSP促进的神经元存活的图表，甚至是高达200nM的抗体浓度。数据代表在培养48小时之后，相对于在每个实验的阳性对照组中观察到存活(在饱和NGF浓度的存在下生长的三叉神经元100％存活)的平均存活百分比(±平均值的标准差，每个数据点n＝3)。在不加神经营养素(称为″对照组″)、400pM NGF(称为″NGF-400pM″)、10nMNT3(称为″NT3-10nM)或600pM MSP(称为″MSP-600pM″)的存在下，使用各种浓度(20nM、2nM或0.2nM)的E3Fab(在图中称为″3E″)和老鼠抗体911Fab。
图15是表示抗-NGF拮抗剂抗体E3(Fab或完整抗体)(在图中称为″3E″)或老鼠抗体911(Fab或完整抗体)不能抑制由NT3、NT4/5和MSP促进的神经元存活的图表，甚至是高达200nM的抗体浓度。在不加神经营养素(称为″无因子″)、400pM NGF(称为″NGF-400pM″)、10nM NT3(称为″NT3-10nM)或600pM MSP(称为″MSP-600pM″)的存在下，使用各种浓度(200nM和80nM)的E3Fab和完整抗体，以及老鼠抗体911完整抗体和Fab。
图16是表示抗-NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不能抑制由BDNF、NT4/5或LIF促进的E17结节神经元存活的图表。也测试老鼠抗-NGF拮抗剂抗体911，并观察到类似的结果。在不加神经营养素(称为″无因子″)、400pM BDNF(称为″BDNF-400pM″)、400pM NT4/5(称为″NT4/5-400pM″)或2.5nM LIF(称为″LIF-2.5nM″)的存在下，测试各种浓度(200nM或80nM)的完整抗体E3(在图中称为″3E″)、Fab E3、完整抗体911或Fab 911。
图17是表示抗-NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不能抑制由BDNF、NT4/5或LIF促进的E17结节神经元存活的图表。在不加神经营养素(称为″对照组″)、400pM BDNF(称为″BDNF-400pM″)、400pM NT4/5(称为″NT4/5-400pM″)或2.5nM LIF(称为″LIP-2.5nM″)的存在下，测试各种浓度(200nM、20nM、2nM)的Fab E3(在图中称为″E3″)或Fab 911。
图18是在第14和19天给予抗-NGF抗体(E3和911)之后，证实在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中的感受伤害反应的图表。将E3(1毫克/千克，静脉内，第14和19天)、911(10毫克/千克，静脉内，第14和19天)或吲哚(吲哚美辛(indomethacin)3毫克/千克，10天内每天口服)给予关节炎老鼠。以平均值±sem，按mV计来表现发声强度值。
图19是在第14和19天给予抗-NGF抗体之后，证实抗-NGF抗体在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中对体重的影响的图表。将E3(1毫克/千克，静脉内，第14和19天)、911(10毫克/千克，静脉内，第14和19天)或吲哚(吲哚美辛3毫克/千克，10天内每天口服)给予关节炎老鼠。以平均值±sem，按公克计来表现体重值。
图20是在第14和18天给予不同剂量的抗-NGF抗体E3(0.003毫克/千克、0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，证实在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中的感受伤害反应的图表。以平均值±sem，按mV计来表现发声强度值。
图21是在第14和18天给予不同剂量的抗-NGF抗体E3(0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，证实在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中抗-NGF抗体E3对第14天的体重百分比(对第14天标准化)的影响的图表。
图22是在第14和18天给予不同剂量的抗-NGF抗体E3(0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，证实在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中抗-NGF抗体E3对体重丧失的影响的图表。将体重值对第0天标准化。
图23表示E3重链可变区氨基酸序列(图23A)和轻链可变区氨基酸序列(图23B)，使用连续编号Kabat编号和Chothia编号来编号。
图24表示在给予抗-NGF抗体E3之后，与在第0天的基准线相比较，在平均每日疼痛强度上的改变。Y轴代表与在第0天的平均每日疼痛强度相比较，在平均每日疼痛强度(VAS分数)上的降低。X轴代表在给予抗-NGF抗体E3之后的天数。
图25表示在给予抗-NGF抗体E3之后的平均VAS分数。″SE″意指标准差。
图26表示在给予抗-NGF抗体E3之后从第2到第14天，和从第2到第28天，在总计疼痛强度差异(SPID)上的最大降低百分比。
图27表示在给予不同剂量(3微克/千克、10微克/千克、30微克/千克、100微克/千克和300微克/千克)的抗-NGF抗体E3之后从第1到第28天，对WOMAC的最小二乘方平均值(LSM)反应、疼痛次量表(subscale)、物理功能次量表和僵硬次量表。″SE″意指标准差。X轴代表所给予的抗-NGF抗体E3的剂量。″*″表示在Dunnett′s检定之下，与基准线相比较P＜0.05。
具体实施方式
在本文中公开的本发明，提供抗-NGF拮抗剂抗体，其以高亲和性与NGF(如人类NGF)结合。本发明还提供衍生自与NGF结合的E3的抗体和多肽，以及制造和使用这些抗体的方法。在一些具体实施例中，本发明提供人类化抗体E3，其与神经生长因子(″NGF″)结合，以及制造和使用该抗体的方法。本发明也还提供与NGF结合的E3多肽(包括抗体)，以及编码E3抗体及/或多肽的多核苷酸。
在本文中公开的本发明，也提供了利用给予在治疗上有效的含量的抗-NGF拮抗剂抗体在个体中预防及/或治疗风湿性关节炎疼痛的方法。
在本文中公开的本发明，也提供了利用给予在治疗上有效的含量的NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)在个体中预防及/或治疗骨关节炎疼痛的方法。
本发明还提供调整抗体的亲和性的方法，以及表征CDR区的特征的方法。
通用技术
除非另行指定，本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生化和免疫学的传统技术，这些均为本领域技术人员所擅长的。在文献中充分说明了这类技术，如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)Cold Spring HarborPress；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑，1984)；Methods inMolecular Biology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，和D.G. Newell，编辑，1993-1998)J.Wiley和Sons；Methodsin Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller和M.P. Calos编辑，1987)；Current Protocolsin Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，编辑，1987)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction，(Mullis等人，编辑，1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人，编辑，1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty编辑，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编辑，Oxford University Press，2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；TheAntibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，Harwood Academic Publishers，1995)；以及Cancer：Principles and Practice of Oncology(V. T.DeVita等人，编辑，J.B.Lippincott Company，1993)。
定义
″抗体″是能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区的抗原认知位置，与标靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等等)特异性结合的免疫球蛋白分子。当在本文中使用时，该名词不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及包括抗原认知位置的免疫球蛋白分子的任何其他修改组态。抗体包括任何种类的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，且抗体不一定是任何特殊的种类。依据抗体重链的恒定功能部位的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成不同的种类。有五大类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而这些有可能进一步细分成亚类(同型物)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。分别将与不同种类免疫球蛋白相符合的重链恒定功能部位称为α、δ、ε、γ和μ。已完全明了不同种类的免疫球蛋白的次单元结构和三维组态。
″Fv″是含有完整抗原-认知和-结合位置的抗体片段。在双链Fv物种中，该区域是由以紧密、非共价结合的一重链和一轻链可变功能部位的二聚体组成。在单链Fv物种中，可借着有弹性的肽交联剂，共价连接一重链和一轻链可变功能部位，使得该轻链和重链可以类似在双链Fv物种中的二聚体结构来结合。在该组态中，每个可变功能部位的三个CDRs交互作用，将抗原-结合特异性限定在VH-VL二聚体的表面上。然而，甚至单一的可变功能部位(或半个Fv，仅包括对抗原特异的3个CDRs)也具有认出抗原并与其结合的能力，虽然通常是以比完整结合位置更低的亲和性。
Fab片段也含有轻链的恒定功能部位和重链的第一个恒定功能部位(CH1)。Fab′片段与Fab片段之差异在于在重链CH1功能部位的羧基终端加上数个残基，包括一或多个得自抗体绞链区的半胱氨酸。
″单克隆抗体″意指均一的抗体族群，其中该单克隆抗体是由涉及抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在或非天然存在的)所组成。单克隆抗体的族群针对单一的抗原性位置是高度特异性的。″单克隆抗体″一词不仅包括完整的单克隆抗体和全长的单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及包括与抗原结合的特异性和能力所需的抗原认知位置的免疫球蛋白分子的任何其他修改组态。本发明并非企图限制关于抗体的来源或其制造方式(例如借着融合瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等等)。
当在本文中使用时，″人类抗体″意指抗体具有与由人类产生，及/或已经使用现有技术中已知或在本文中公开的制造人类抗体的任何技术制造的抗体一致的氨基酸序列。人类抗体的定义，包括由至少一个人类重链多肽或至少一个人类轻链多肽所组成的抗体。这类实例之一，是包括老鼠轻链和人类重链多肽的抗体。可使用现有技术中已知的各种技术产生人类抗体。在一具体实施例中，人类抗体选自表达人类抗体的噬菌体库(Vaughan等人，1996，Nature Biotechnology，14：309-314；Sheets等人，1998，PNAS，(USA)95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等人，1991，J.Mol.Biol.，222：581)。也可利用将人类免疫球蛋白位点导入转基因动物，例如其中已经使内源免疫球蛋白基因部分或全部失活的老鼠中，来制造人类抗体。在美国专利第5,545,807号；5,545,806号；5,569,825号；5,625,126号；5,633,425号和5,661,016号中公开了该方法。或者，可借着永存不死的人类B淋巴细胞来制备人类抗体，其产生针对标靶抗原的抗体(可从个体中回收这类B淋巴细胞，或可以是已经在活体外免疫的)。参见，例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boemer等人，1991，J.Immunol.，147(1)：86-95；以及美国专利第5,750,373号。
″嵌合型抗体″意指其中每个重和轻链的氨基酸序列的一部分均是与在衍生自特定物种的抗体中的相对应序列同源的，或属于特定种类，而链的剩余断片是与在其他物种中的相对应序列同源的那些抗体。在这些嵌合型抗体中，轻链和重链两者的可变区通常模仿衍生自一哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分则是与抗体中衍生自另一物种的序列同源的。这类嵌合形式的一个显著优点是，例如可使用迅速可用的融合瘤或得自非人类宿主生物的B细胞，从目前已知的来源便利地衍生可变区，并与衍生自例如人类细胞制备物的恒定区混合。虽然可变区具有容易制备的优点，但特异性并不受其来源影响，恒定区则是人类，比得自非人类来源的恒定区，更不可能在注射该抗体时从人类个体中诱发免疫反应。然而，该定义并未受限于该特殊实例。
″有功能的Fc区″具有固有序列Fc区的至少一种效应物功能。代表性的″效应物功能″包括C1q结合；补体-依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞-调解的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调(down-regulate)等等。这类效应物功能通常需要将与结合功能部位(例如抗体可变功能部位)结合的Fc区，并可使用现有技术中已知用来评估这类抗体效应物功能的各种测定来对其评估。
″固有序列Fc区″包括与自然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。″变种Fc区″包括与固有序列Fc区之差异为至少一个氨基酸修改，但仍保留固有序列Fc区的至少一个效应物功能的氨基酸序列。变种Fc区与固有序列Fc区或与双亲多肽的Fc区相比较，最好具有至少一个氨基酸取代，例如从大约1到大约10个氨基酸取代，且最好是在固有序列Fc区或在双亲多肽的Fc区中，具有从大约1到大约5个氨基酸取代。在本文中，变种Fc区最好与固有序列Fc区及/或双亲多肽的Fc区，将具有至少大约80％序列同一性，且与其最好有至少大约90％序列同一性，更佳的是与其有至少大约95％序列同一性。
当在本文中使用时，″抗体-依赖性细胞-调解的细胞毒性″和″ADCC″意指细胞-调解的反应，其中表达Fc受体(FcRs)(例如自然杀手(NK)细胞、嗜中性白血球和巨噬细胞)的非特异性细胞毒性细胞识别在标靶细胞上已结合的抗体，随后引起标靶细胞的溶解。可使用活体外的ADCC测定，如在美国专利第5,500,362号或5,821,337号中描述的，评估感兴趣分子的ADCC活性。适用于这类测定的效应物细胞包括周围血液单核细胞(PBMC)和NK细胞。或者，或另外也可在活体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模式中，如在Clynes等人，1998，PNAS(USA)，95：652-656中公开的。
当在本文中使用时，″Fc受体″和″FcR″描述与抗体的Fc区结合的受体。较佳的FcR是固有序列人类FcR。此外，较佳的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，并包括FcγR I、FcγR II和FcγRIII亚类的受体，包括对偶基因变体，以及这些受体的其它接合形式。FcγR II受体包括FcγR IIA(″激活受体″)和FcγRII B(″抑制受体″)，其具有类似的氨基酸序列，主要的差异为其细胞质功能部位。在Ravetch和Kinet，1991，Ann.Rev.Immunol.，9：457-92；Capel等人，1994，Immunomethods，4：25-34；以及de Haas等人，1995，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41中回顾了FcRs。″FcR″也包括新生儿受体FcRn，其负责将成熟IgGs运送至胎儿(Guyer等人，1976，J.Immunol.，117：587；以及Kim等人，1994，J.Immunol.，24：249)。
″补体依赖性细胞毒性″和″CDC″意指在补体存在下的标靶溶解。利用补体系统的第一个补体(C1q)与已与关联抗原复合的分子(例如抗体)结合，发动补体激活路径。欲评估补体激活作用，可进行CDC测定，例如像是在Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods，202：163(1996)中的描述。
当在本文中使用时，可互换使用的名词″E3″、″3E″和″抗体E3″，意指包括分别在图1A(SEQ ID NO：1)和1B(SEQ ID NO：2)中示出的重链和轻链可变区的氨基酸序列的抗体。在图1A和1B中，以图解描述抗体E3的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDRs)。图2和3分别显示编码重和轻链的多核苷酸，包括分别在图1A和1B中示出的重和轻链可变区。在实例中说明E3的产生及特征。与E3有关的不同生物功能，包括但不限于与NGF结合并抑制NGF生物活性及/或由NGF发送信号来调解之下游路径(们)的能力；以及抑制老鼠E13.5三叉神经元的NGF-依赖性存活的能力。如同在本文中讨论的，本发明的抗体可具有这些特征之一或多项。在一些具体实施例中，″E3″一词意指由(a)编码具有ATCC第PTA-4893号或ATCC第PTA-4894号保藏编号的E3轻链的多核苷酸，以及(b)编码具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的E3重链的多核苷酸编码的免疫球蛋白。
当在本文中使用时，抗体的″免疫特异性″结合意指抗原特异性的结合交互作用发生在抗体的抗原结合位置与由该抗体认出的特定抗原之间(即该抗体在ELISA或其他免疫测定中与该蛋白质反应，但与无关蛋白质没有可检测到的反应)。
一个抗原决定位与抗体或多肽″特异性地结合″或″优先结合″(在本文中可互换使用)，是现有技术中已熟知的字眼，且判定这类特异性或优先结合的方法也是现有技术中已熟知的。若一分子以比它与其它细胞或物质更频繁、更迅速，并以更长的期间及/或更高的亲和性与一特定细胞或物质反应或结合，便说该分子表现出″特异性地结合″或″优先结合″。若一抗体以比它与其他物质更高的亲和性、抗体亲抗原性，更迅速及/或以更长的期间结合，便说该抗体与标靶″特异性地结合″或″优先结合″。例如，与NGF抗原决定位特异性地或优先结合的抗体，是以比它与其他NGF抗原决定位或非NGF抗原决定位更高的亲和性、抗体亲抗原性，更迅速及/或以更长的期间与该抗原决定位结合的抗体。借着阅读该定义也明了，例如与第一个标靶特异性地或优先结合的抗体(或部分或抗原决定位)，可能是或可能不是特异性地或优先与第二个标靶结合。″特异性地结合″或″优先结合″不一定需要(虽然它可能包括)独占的结合。通常，但不一定，在提到结合时意指优先结合。
名词″多肽″、″低聚肽″、″肽″和″蛋白质″在本文中可互换使用，意指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直线或分支的，其可包括经过修改的氨基酸，且其可被非氨基酸中断。该名词也包括已经以天然方式或通过干涉方式修改的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化作用、脂化作用、乙酰化作用、磷酸化作用或任何其他的操作或修改，如与标记组份共轭。在该定义中，也包括例如含有一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及在现有技术中已知的其他修改。因为本发明的多肽是以抗体为基础，该多肽当然可以单链或结合链的形式存在。
″多核苷酸″或″核酸″在本文中可互换使用，意指任何长度的核苷酸的聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修改的核苷酸或碱基，及/或其类似物，或任何能够由DNA或RNA聚合酶并入聚合物内的物质。多核苷酸可包括经修改的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。若出现修改，可能在聚合物组装之前或之后，给予对该核苷酸结构的修改。可利用非核苷酸组份打断核苷酸的序列。可在聚合作用之后进一步修改多核苷酸，如与标记组份共轭。其他类型的修改包括，例如″加帽″、以类似物取代一或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间的取代，像是例如具有不带电键合(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰氨酸、氨基甲酸酯等等)和带电荷键合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)的那些，含有垂悬部分的那些，像是例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-离氨酸等等)，具有嵌入剂的那些(例如吖啶、补骨脂素等等)，含有螯合剂的那些(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等等)，含有烷化剂的那些，带有修改键合的那些(例如α异头核酸等等)，以及多核苷酸(们)的未修改形式。此外，任何经常出现在糖中的羟基基团，也可被例如膦酸盐基团、磷酸盐基团置换，以标准保护基保护，或激活，来制备与其他核苷酸的额外键合，或可与固体支撑物共轭。可将5′和3′终端OH磷酸化，或以胺或1至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。也可将其他的羟基衍生成标准保护基。多核苷酸也可含有核糖或去氧核糖糖的类似形式，通常是现有技术中已知的，包括例如2′-O-甲基、′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖类、表异构糖类，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环化类似物和非碱基核苷类似物，如甲基核糖苷。可利用其它连接基来取代一或多个磷酸二酯键合。这些其它连接基包括，但不限于其中以P(O)S(″硫代酯″)、P(S)S(″二硫代酯″)、(O)NR2(″酰胺化物″)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(″甲缩醛(formacetal)″)置换磷酸盐的具体实施例，其中每个R或R′分别为H或经取代或未经取代的烷基(1-20C)，其可视需要含有(-O-)键合、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。在多核苷酸中并非全部的键合都要是相同的。先前的说明适用于所有在本文中提及的多核苷酸，包括RNA和DNA。
抗体的″可变区″意指单独或混合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重和轻链的可变区分别由四个框架区(FR)所组成，由三个也称为高变区的互补性决定区(CDRs)连接。在每个链中的CDRs都由紧邻的FRs维持在一起，并与来自其他链的CDRs形成抗体的抗原结合位置。至少有两种判定CDRs的技术：(1)以交叉-物种序列变异性为基础的方法(即Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))；以及(2)以抗原-抗体复合物的结晶学研究为基础的方法(Chothia等人(1989)Nature 342：877；Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。当在本文中使用时，CDR可以意指以任一方法或两种方法的组合定义的CDRs。
抗体的″恒定区″意指单独或混合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。
当在本文中使用时，″神经生长因子″和″NGF″意指神经生长因子及其保留至少一部分NGF的生物活性的变体。当在本文中使用时，NGF包括所有哺乳动物物种的固有序列NGF，包括人类、狗、猫、马或牛。
″NGF受体″意指与NGF结合或被NGF激活的多肽。NGF受体包括任何哺乳动物物种的TrkA受体和p75受体，包括但不限于人类、狗、猫、马、灵长类或牛。
当在本文中使用时，″抗-N G F拮抗剂抗体″(也可称为″抗-NGF抗体″)意指能够与NGF结合，并抑制NGF的生物活性及/或借由NGF发送信号调解的下游路径(们)的抗体。抗-NGF拮抗剂抗体包括阻断、拮抗、压抑或降低(包括明显地)NGF生物活性的抗体，包括借由NGF发送信号调解的下游路径，如受体结合及/或诱发对NGF的细胞反应。为了本发明的目的，要明确地理解名词″抗-NGF拮抗剂抗体″包括所有先前确认的名词、标题，以及功能状态和特征，其中以任何有意义的程度，使NGF本身、NGF生物活性(包括但不限于其调解任何方面的手术后疼痛的能力)或生物活性的结果无效、减少或中和。在一些具体实施例中，抗-NGF拮抗剂抗体与NGF结合并预防NGF二聚作用及/或与NGF受体(如p75及/或trkA)结合。在其他的具体实施例中，抗-NGF抗体与NGF结合，并预防trkA受体二聚作用及/或trkA自我磷酸化作用。在本文中提供抗-NGF拮抗剂抗体的实例。
NGF的″生物活性″通常意指与NGF受体结合及/或激活NGF受体发送信号路径的能力。生物活性包括，但不限于下列之一或多项：与NGF受体(如p75及/或trkA)结合的能力；提高trkA受体二聚作用及/或自我磷酸化作用的能力；激活NGF受体发送信号路径的能力；在细胞生理学上促进细胞分化、增殖、存活、生长及其他变化的能力，包括(在神经元的案例中，包括周围和中枢神经元)神经元形态学上的变化、突触生成(synaptogenesis)、突触功能、在创伤之后的神经递质及/或神经肽释放和再生；促进老鼠E13.5三叉神经元存活的能力；以及调解疼痛，包括手术后疼痛的能力。
当在本文中使用时，″实质上纯的″意指一物质是至少50％纯的(即不含污染物)，更优选的是至少90％纯的，更优选的是至少95％纯的，更优选的是至少98％纯的，更优选的是至少99％纯的。
″宿主细胞″包括个别的细胞或细胞培养物，其可以是或已经是并入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，且该子代可能因为天然、偶然或故意的突变作用，与原始的双亲细胞不一定是完全相同的(在形态学或在基因组DNA补体上)。宿主细胞包括在活体外以本发明的多核苷酸(们)转移感染的细胞。
当在本文中使用时，″治疗″是获得有利或想要的临床结果的方法。为了本发明，有利或想要的临床结果包括，但不限于下列之一或多项：改善或减轻任何方面的疼痛，包括急性、慢性、炎症性、神经病变、手术后的疼痛、风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛。为了本发明，有利或想要的临床结果包括，但不限于下列之一或多项：减轻严重性，缓和一或多个与疼痛有关的症状，包括任何方面的疼痛(如缩短疼痛期间、降低疼痛的严重性或感觉)。
药物、化合物或医药组合物的″有效含量″是足以达成有利或想要的结果，包括临床结果，如减轻或降低疼痛感觉的量。可以一或多次投药，来给予有效含量。为了本发明，有效含量的药物、化合物或医药组合物是足以治疗、改善、降低强度并/或预防疼痛的量，包括手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛及/或骨关节炎疼痛。在一些具体实施例中，″有效含量″可降低疼痛至静止(静止疼痛)或以机械方式诱导的疼痛(包括在移动之后的疼痛)，或两者，并可在切入、割伤、撕裂或受伤之前、期间或之后，及/或在疼痛刺激之前、期间或之后给药。就像在临床状况中所了解的，药物、化合物或医药组合物的有效含量，可单独达到，或可并用其他的药物、化合物或医药组合物一起达到。因此，可从给予一或多种治疗剂的情况来考量″有效含量″，若与一或多个其他制剂并用，可能或达到想要的结果，便可认为以有效含量给予该单一制剂。
疼痛的″降低发生率″意指任何的降低严重性(其可包括减少对于该状况经常使用的其他药物及/或疗法的需要，及/或减少(例如接触)用量，包括例如鸦片制剂)、期间，及/或频率(包括，例如，在个体中延迟或增加到出现手术后疼痛的时间)。本领域技术人员了解个体可能随着对治疗的反应而有所不同，因此，例如″在个体中降低风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛的发生率的方法″，表示以合理的期待为基础给予抗-NGF拮抗剂抗体，使得这类投药可能得以在特殊个体中引起这类的发生率降低。
″改善″疼痛或一或多个疼痛的症状(如风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)，意指与未给予抗-NGF拮抗剂抗体相比较，减少或改善一或多个疼痛的症状。″改善″也包括缩短或减少症状的期间。
″减轻″疼痛或一或多个疼痛的症状(如风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)，意指在以根据本发明的抗-NGF拮抗剂抗体治疗的个体或个体族群中，减少一或多个手术后疼痛的不受欢迎的临床征候的程度。
当在本文中使用时，″延迟″疼痛的发展意指延缓、阻止、减慢、妨碍、使稳定及/或延后疼痛的进行，如手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛。该延迟可以是不同长度的时间，视待治疗的疾病及/或个体的病史而定。对本领域技术人员而言，显然充分或重大的延迟，事实上可包含预防，在这一点上该个体不发展出疼痛。″延迟″症状发展的方法就是在与不使用该方法相比较时，在特定的时间框架中降低发展出症状的可能性，及/或在特定的时间框架中降低症状之程度的方法。这类比较通常是以临床研究为基础，使用有统计学意义的数目的实验者。
当在本文中使用时，″疼痛″意指任何病因学的疼痛，包括急性和慢性疼痛，以及任何有炎症组份的疼痛。疼痛的实例包括手术后疼痛、操作后疼痛(包括牙齿痛)、偏头痛、头痛和三叉神经痛、与烧伤、创伤或肾结石有关的疼痛、与外伤(包括头部外伤)有关的疼痛、神经病变的疼痛、与肌肉-骨胳病症有关的疼痛，如风湿性关节炎、骨关节炎、脊椎僵直性脊椎炎、血清-阴性(非风湿性)关节病、非关节性风湿病和关节周围病症，以及与癌症有关的疼痛(包括″突破疼痛″和与癌症末期有关的疼痛)、周围神经病变和带状疱疹后神经痛。有炎症组份的疼痛的实例(除了上述的那些)，包括风湿性疼痛、与粘膜炎有关的疼痛和经痛。
″手术后疼痛″(可互换地称为″切入后″或″受伤后疼痛″)意指起因于外伤的疼痛，如个体组织的割伤、穿刺伤、切入、撕裂或受伤(包括起因于所有手术程序的那些，无论是侵入性或非侵入性的)。当在本文中使用时，手术后疼痛不包括没有外在物理创伤而发生(出现或发作)的疼痛。在一些具体实施例中，手术后疼痛是内在或外在(包括周围)的疼痛，并可能偶尔(有外伤)或故意(有手术切开)发生受伤、割伤、外伤、撕裂或切口。当在本文中使用时，″疼痛″包括感受伤害和感觉疼痛，可使用疼痛计分和现有技术中已知的方法，主观和客观地评估疼痛。手术后疼痛，当在本文中使用时，包括异常性疼痛(即增加对正常无害刺激的反应)和痛觉过敏(即增加对正常有害或讨厌刺激的反应)，其实际上可依次为热或机械(触觉)的。在一些具体实施例中，通过热敏感性、机械敏感性及/或静止疼痛来表征疼痛的特征。在一些具体实施例中，手术后疼痛包括以机械方式引起的疼痛或静止疼痛。在其他的具体实施例中，手术后疼痛包括静止疼痛。该疼痛为主要或次要疼痛，如同现有技术中已熟知的。
″生物试样″包括各种获自个体的试样类型，并可用在诊断或监视测定中。该定义包括血液及其他生物来源的液体试样，固体组织试样，如生检样本或从其衍生而来的组织培养物或细胞，及其子代。该定义也包括已经在其采样之后以任何方式处理过的试样，如利用试剂处理、促溶、增强某些组份，如蛋白质或多核苷酸，或为了切片而埋入半固体或固体基质内。″生物试样″一词包括临床试样，也包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞产物、血清、血浆、生物液体和组织试样。
″个体″是脊椎动物，最好是哺乳动物，更佳的是人类。哺乳动物包括，但不限于农场动物(如牛)、竞赛动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类、老鼠和大鼠。
当在本文中使用时，″载体″意指构筑体，其能够输送，且最好能在宿主细胞中表达一或多个感兴趣的基因(们)或序列(们)。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或RNA表达载体、质体、粘接质体或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂结合的DNA或RNA表达载体、包胶于脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核生物细胞，如生产者细胞。
当在本文中使用时，″表达控制序列″意指指挥核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动基因，如组成或可诱导的启动基因，或促进子。表达控制序列以可操作的方式与待转录的核酸序列连接。
当在本文中使用时，″在药学上可接受的载剂″包括任何物质，当将其与活性成分混合时，容许该成分保留生物活性，且不与该个体的免疫系统起反应。实例包括，但不限于任何标准药学载剂，如磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂，如油/水乳剂，以及各种形式的湿润剂。适合气溶胶或非经肠投药的较佳稀释剂是磷酸缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。利用已熟知的传统方法，来调配包括这类载剂的组合物(参见，例如Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版，A.Gennaro编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；以及Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版MackPublishing，2000)。
当在本文中使用时，″Koff″企图意指抗体从抗体/抗原复合物中解离的关闭速率常数。
当在本文中使用时，″Kd″企图意指抗体-抗原交互作用的解离常数。
抗体E3、E3-衍生抗体、组合物和使用方法
E3组合物、E3衍生的组合物，以及制造组合物的方法
本发明包括组合物，含有由E3抗体或多肽组成的医药组合物；以及由编码E3抗体或多肽的序列组成的多核苷酸。当在本文中使用时，组合物包括一或多个与NGF结合的抗体或多肽(可以是或可以不是抗体)，及/或一或多个多核苷酸，包括编码一或多个与NGF结合的抗体或多肽的序列。这些组合物可还包括适当的赋形剂，如在药学上可接受的赋形剂，包括缓冲溶液，其为现有技术中已熟知的。
本发明也包括经过分离的抗体、多肽和多核苷酸具体实施例。本发明也包括实质上纯的抗体、多肽和多核苷酸具体实施例。
本发明的抗体和多肽可具有任何(一或多项)下列的特征：(a)与NGF结合的能力；(b)降低及/或抑制NGF生物活性及/或由NGF发送信号调解的下游路径(们)的能力；(c)降低及/或抑制老鼠E13.5三叉神经元的NGF-依赖性存活的能力；(d)缺少任何对NT3、NT4/5及/或BDNF明显的交叉反应性；(e)治疗及/或预防疼痛(包括手术后疼痛)的能力；(f)增加NGF的清除的能力；(g)降低或抑制trkA受体的激活作用的能力，可使用例如激酶受体激活作用测定(KIRA)来检测(参见美国专利第6,027,927号)。
在下文中概述抗体E3的结合特性，与双亲老鼠抗-NGF单克隆抗体911相比较，其以高亲和性和慢解离动力学与人类NGF结合。E3以比双亲老鼠抗体911更高大约50倍的结合亲和性与人类NGF结合。
  抗体   kD   Koff   Kon
  911(Fab)   3.7nM   9x10-5s-1   2.2x104M-1s-1
  E3(Fab)   0.07nM   ＜4x 10-5s-1   6x105M-1s-1
E3抗体和相关抗体也显示出强有力的拮抗人类NGF的能力，可经由在活体外的测定来评估(参见实例2和3)。例如，抗体E3在15pM人类NGF的存在下以大约21pM的IC50，并在1.5pM人类NGF的存在下以大约1.2pM的IC50拮抗老鼠E13三叉神经元的NGF-依赖性存活。
因此，另一方面，更进一步确认本发明的抗体和多肽具有下列特征：(h)以高亲和性和低解离动力学与人类NGF结合(在一些具体实施例中，具有低于大约2nM的KD，及/或比大约6x10-5s-1更慢的koff)，及/或(i)在大约15pM NGF(在一些具体实施例中，人类NGF)下，以大约100pM或更低的IC50，并/或在大约1.5pM NGF下以大约20pM或更低的IC50，抑制(阻断)老鼠E13.5三叉神经元的NGF依赖性存活的能力。
在一些具体实施例中，该抗体与人类NGF结合，但不与得自其他脊椎动物物种(在一些具体实施例中为哺乳动物)的NGF明显地结合。在一些具体实施例中，该抗体与人类NGF，以及一或多个得自其他哺乳动物物种(在一些具体实施例中为哺乳动物)的NGF结合。在另外的具体实施例中，该抗体与NGF结合，但不与其他神经营养素(如相关的神经营养素，NT3、NT4/5及/或BDNF)产生明显的交叉反应。在一些具体实施例中，该抗体结合NGF，以及至少一个其他的神经营养素。在一些具体实施例中，该抗体与哺乳动物物种的NGF结合，如马或狗，但不与得自其他哺乳动物物种的NGF明显地结合。
在一些具体实施例中，本发明是包括由多核苷酸编码的轻链的抗体，该多核苷酸是由具有ATCC第PTA-4893号或ATCC第PTA-4894号保藏编号的宿主细胞产生的。另一方面，本发明是包括由多核苷酸编码的重链的抗体，该多核苷酸是由具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的宿主细胞产生的。本发明也包括E3的各种调配物及等同的抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等等)、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及E3的任何其他经过修改的组态，其包括所需的特异性的抗原(NGF)认知位置。E3的等同抗体，包括E3的抗体和多肽片段(其可以是或可以不是抗体)，以及借着上述的任何(一或多项)基准确认并表征的包括E3的多肽片段的多肽。
因此，本发明提供任何下列的，或包括任何下列的组合物(包含医药组合物)：(a)抗体E3；(b)抗体E3的片段或区域；(c)如图1B所示的抗体E3的轻链；(c)如图1A所示的抗体E3的重链；(d)得自抗体E3的轻链及/或重链的一或多个可变区(们)；(e)在图1A和1B中示出的抗体E3的一或多个CDR(s)(一、二、三、四、五或六个CDRs)；(f)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的CDR H3；(g)得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的CDR L3；(h)得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的三个CDRs；(i)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的三个CDRs；(j)得自在图1A和1B中示出的抗体E3的轻链的三个CDRs和重链的三个CDRs；以及(k)包括(b)到(j)中任一个的抗体。从本文的说明可以明了，显然明确地排除由与老鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所组成的多肽具体实施例。在图1A和1B中，并在SEQ ID NO：9-14中示出了Mab 911的衍生CDR序列。
在图1A和1B中以图解说明抗体E3的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDRs)，并由下列的氨基酸序列组成：(a)重链CDR 1(″CDRH1″)GFSLIGYDLN(SEQ ID NO：3)；(b)重链CDR 2(″CDRH2″)IIWGDGTTDYNSAVKS(SEQ ID NO：4)；(c)重链CDR 3(″CDRH3″)GGYWYATSYYFDY(SEQ ID NO：5)；(d)轻链CDR 1(″CDRL1″)RASQSISNNLN(SEQ ID NO：6)；(e)轻链CDR 2(″CDRL2″)YTSRFHS(SEQ ID NO：7)；和(f)轻链CDR 3(″CDRL3″)QQEHTLPYT(SEQ ID NO：8)。CDR区域的判定为本领域技术人员已熟知的。在一些具体实施例中，CDRs当然可以是Kabat和Chothia CDR的组合(也称为″组合的CDRs″或″衍生的CDRs″)。在一些具体实施例中，CDRs包括Kabat CDR。在另外的具体实施例中，CDRs为ChothiaCDRs。
在一些具体实施例中，本发明提供包括至少一个CDR的抗体，该CDR实质上是与E3的至少一个CDR、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个CDRs是同源的(或在一些具体实施例中，与E3的所有6个CDRs是同源的，或衍生自E3)。其他的具体实施例包括具有至少2、3、4、5或6个CDR(s)的抗体，该CDRs实质上是与E3的至少2、3、4、5或6个CDRs是同源的，或衍生自E3。当然为了本发明，通常保留了结合特异性及/或全部的活性(可从治疗及/或预防疼痛或抑制E13.5老鼠三叉神经元的NGF-依赖性存活的方面来看)，虽然与E3比较活性的程度可能有变化(可能更大或更小)。
本发明也提供包括E3的氨基酸序列(在图1A和1B中所示)的多肽(可以是或可以不是抗体)，其具有下列任一项：E3序列的至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少大约10个连续的氨基酸、至少大约15个连续的氨基酸、至少大约20个连续的氨基酸、至少大约25个连续的氨基酸、至少大约30个连续的氨基酸，其中至少3个氨基酸是得自E3的可变区，并了解明确地排除由与老鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所组成的具体实施例。在图1A和1B中，并在SEQ ID NO：9-14中示出了Mab 911的衍生CDR序列。在一具体实施例中，该可变区得自E3的轻链。在另一具体实施例中，该可变区得自E3的重链。在其他的具体实施例中，5个(或更多个)连续的氨基酸是得自在图1A和1B中示出的E3的互补性决定区(CDR)。
在另一具体实施例中，本发明提供包括E3的氨基酸序列的多肽，其具有下列任一项：E3序列的至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少大约10个连续的氨基酸、至少大约15个连续的氨基酸、至少大约20个连续的氨基酸、至少大约25个连续的氨基酸、至少大约30个连续的氨基酸，其中该E3序列包括下列任一或多项：CDRH1的氨基酸残基L29、CDRH2的I50、CDRH3的W101，及/或CDRH3的A103；及/或CDRL1的氨基酸残基S28、CDRL1的N32、CDRL2的T51、CDRL3的91E，及/或CDRL3的H92，并了解明确地排除由与老鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所组成的具体实施例。
显然在本公开内容中，使用连续的氨基酸编号体系来称呼可变区中的氨基酸残基(即在每个可变区中的氨基酸残基均按顺序编号)。如同现有技术中已熟知的，当比较两个抗体或多肽时，如E3抗体和E3变体(或怀疑其为E3变体的多肽)，可使用Kabat及/或Chothia编号系统。在现有技术中，例如，若需要在E3和其他多肽之间进行比较时，当然知道如何将连续编号转变为Chothia及/或Kabat编号。图23表示使用连续的Chothia和Kabat编号，将E3可变区编号。此外，为了便于比较，框架残基通常，但并非总是，具有约略相同的残基数目。然而，CDRs的大小可能有变化(即可能插入及/或删除一或多个氨基酸残基)。当比较E3抗体和候选的E3变体(例如，在得自候选序列的CDR区比在与其比对的抗体E3中的序列更长的案例中)，可能遵循下列的步骤(虽然在现有技术中已知其他的方法)。将候选抗体序列与E3抗体重链和轻链可变区对齐。可用手或借着电脑，使用普遍接受的电脑程序来进行排列。可借着使用对大多数Fab序列而言常见的一些氨基酸残基，使得排列更为容易。例如，轻链和重链通常都有两个半胱氨酸，通常是在保留位置发现它们。当然候选变体抗体的氨基酸序列可能是更长(即有插入的氨基酸残基)或更短的(有删除的氨基酸残基)。可将残基编号加上字尾，代表插入额外的残基，例如残基34abc。至于候选序列，例如将其与E3序列排成一直线，例如残基33和35，但在它们之间没有残基与残基35排在一起，简单地不指派该残基35为一残基。在其他的方法中，在比较不同长度的CDRs时，通常已知可在结构相等的(例如在抗原-抗体复合物中的相同位置)氨基酸之间进行比较。例如Chothia编号(Al-Lazikani等人，在前)，通常(但并非在所有情况下)在结构正确的位置安排插入和删除。也可使用X-射线结晶学或双突变环分析(参见Pons等人(1999)Prot.Sci.8：958-968)来推论或证实结构同等。
抗-NGF抗体对NGF(如hNGF)的结合亲和性，可能是大约0.10至大约0.80nM、大约0.15至大约0.75nM，以及大约0.18至大约0.72nM。在一些具体实施例中，结合亲和性是大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM、大约40pM或比大约40pM更高。在一具体实施例中，结合亲和性是在大约2pM到22pM之间。在其他的具体实施例中，结合亲和性是低于大约10nM、大约5nM、大约4nM、大约3.5nM、大约3nM、大约2.5nM、大约2nM、大约1.5nM、大约1nM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM、大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约100pM、大约90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约10pM。在一些具体实施例中，结合亲和性是大约10nM。在其他的具体实施例中，结合亲和性是低于大约10nM。在其他的具体实施例中，结合亲和性是大约0.1nM或大约0.07nM。在其他的具体实施例中，结合亲和性是低于大约0.1nM或低于大约0.07nM。在其他的具体实施例中，结合亲和性是大约10nM、大约5nM、大约4nM、大约3.5nM、大约3nM、大约2.5nM、大约2nM、大约1.5nM、大约1nM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM、大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约100pM、大约90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约10pM之中任一者至大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM或大约40pM之中任一者。在一些具体实施例中，结合亲和性是大约10nM、大约5nM、大约4nM、大约3.5nM、大约3nM、大约2.5nM、大约2nM、大约1.5nM、大约1nM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM、大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约100pM、大约90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约10pM之中任一者。在另外的具体实施例中，结合亲和性是大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM、大约40pM或比大约40pM更高。
可使用现有技术中已熟知的方法，判定抗体对NGF的结合亲和性。一种判定抗体对NGF的结合亲和性的方法是借着测量抗体的单功能Fab片段的亲和性，如同在实例中的描述。欲获得单功能Fab片段，可利用木瓜酵素切开抗体(例如IgG)，或以重组方式表达。可借着表面等离子体激光共振(BIAcore3000TM表面等离子体激光共振(SPR)系统，BIAcore，INC，Piscataway NJ)，按照在实例中的描述，判定抗体的抗-NGF Fab片段的亲和性。该草案适用于判定抗体对任何物种的NGF的结合亲和性，包括人类NGF、其他脊椎动物的NGF(在一些具体实施例中为哺乳动物)(如老鼠NGF、大鼠NGF、灵长类NGF)，并适用于其他的神经营养素，如相关的神经营养素NT3、NT4/5，及/或BDNF。
在一些具体实施例中，本发明的抗体或肽可(在大约15pM的NGF的存在下)以大约200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM或更低的IC50，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活。在一些具体实施例中，本发明的抗体或肽可(在大约1.5pM的NGF的存在下)以大约50pM、40pM、30pM、10pM、20pM、10pM、5pM、2pM、1pM或更低的IC50，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活。在一些具体实施例中，本发明的抗体或肽可(在大约15pM的NGF的存在下)以大约150pM、125pM、100pM、80pM、60pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或更低的IC50，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的大鼠NGF-依赖性存活。在一些具体实施例中，本发明的抗体或肽可(在大约1.5pM的NGF的存在下)以大约30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、4pM、3pM、2pM、1pM或更低的IC50，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的大鼠NGF-依赖性存活。测量老鼠三叉神经元的NGF-依赖性存活的方法是现有技术中已知的，并在实例2中说明。
本发明也提供制造任何这些抗体或多肽的方法。可借着现有技术中已知的程序，在实例中解释其中一些，来制造本发明的抗体。可借着蛋白水解或抗体的其他作用，借着上述的重组方法(即单一或融合多肽)，或借着化学合成来产生多肽。借着化学合成便利地制造抗体的多肽，尤其是较短的，最多大约50个氨基酸的多肽。化学合成的方法是现有技术中已知的，并为市售的。例如，可借着使用固相法的自动多肽合成器，产生E3抗体。也参见美国专利第5,807,715号、4,816,567号和6,331,415号。也可在活体外使用合成蛋白质化学的已知方法，包括涉及交联剂的那些，来制备嵌合型或杂种抗体。例如，可使用二硫交换反应，或借着形成硫酯键结，来建构免疫毒素。适合该目的的试剂的实例包括亚胺硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚酰胺盐。
在另一种选择中，可以重组方式制造抗体，使用现有技术中已熟知的程序。在一具体实施例中，将包括编码抗体E3(在图1A和1B中示出)的可变和轻链区的序列的多核苷酸选殖到载体内，以便在宿主细胞(例如CHO细胞)中表达或繁殖。在另一具体实施例中，将在图2和3中示出的多核苷酸序列选殖到一或多个载体内，以便表达或繁殖。可将编码感兴趣的抗体的序列保存在在宿主细胞中的载体内，然后可为了未来使用将宿主细胞扩大并冷冻。在本文中进一步描述了载体(包括表达载体)和宿主细胞。已经公开了在植物或乳汁中以重组方式表达抗体的方法。参见，例如Peeters等人(2001)Vaccine 19：2756；Lonberg，N.和D.Huszar(1995)Int.Rev.Immunol 13：65；以及Pollock等人(1999)J Immunol Methods 231：147。制造抗体衍生物的方法，例如人类化、单链等等，为现有技术中已知的。
本发明也包括本发明的抗体，如E3的单链可变区片段(″scFv″)。借着使用短交联肽连接轻及/或重链可变区，制造单链可变区片段。Bird等人(1988)Science 242：423-426。交联肽的实例为(GGGGS)3(SEQ ID NO：15)，其在一可变区的羧基终端和另一可变区的氨基终端之间架起约3.5纳米的桥。已经设计并使用其他序列的交联剂(Bird等人(1988))。为了额外的功能，如附接药物或附接固体支撑物，可转而修改交联剂。可以重组或合成方式产生单链变体。关于scFv的合成产生，可使用自动合成器。至于scFv的重组产生，可将含有编码scFv的多核苷酸的适当质体导入适当的宿主细胞内，宿主细胞可以是真核生物的，如酵母菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核生物的，如大肠杆菌。可借着例行的操作，如多核苷酸的连接，制造编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用现有技术中已知的标准蛋白质纯化技术，分离所得的scFv。
也包括其他形式的单链抗体，如微型双功能抗体(diabodies)。微型双功能抗体是二价的，双重特异性的抗体，其中在单一的多肽链上表达VH和VL功能部位，但所使用的交联剂太短，以致于不容许在同一链上两个功能部位之间配对，借此迫使功能部位与在另一链上的互补功能部位配对，并创造两个抗原结合位置(参见，例如Holliger，P.等人(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人(1994)Structure 2：1121-1123)。
抗体可以是双重特异性的抗体，对至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。可使用在本文中公开的抗体制备双重特异性的抗体。制造双重特异性抗体的方法，为现有技术中已知的(参见，例如Suresh等人，1986，Meyhods in Enzymology 121：210)。在传统上，双重特异性抗体的重组产生，是以两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达为基础，而这两个重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，1983，Nature 305，537-539)。
根据一制造双重特异性抗体的方法，将具有想要结合特异性(抗体-抗原结合位置)的抗体可变功能部位与免疫球蛋白恒定功能部位序列融合。该融合最好是利用免疫球蛋白重链恒定功能部位，包括至少一部分绞链、CH2和CH3区。最好是有第一个重链恒定区(CH1)，含有轻链结合所需的位置，出现在至少一个融合中。将编码免疫球蛋白重链融合，若需要还有免疫球蛋白轻链的DNAs，插入分开的表达载体中，并共同转移感染到适当的宿主生物内。这在使用不等比例的三个多肽链来建构，以便提供最佳产量的具体实施例中，在调整三个多肽片段的突变比例上提供了相当大的弹性。然而，也有可能在一表达载体中插入二或全部三个多肽链的密码序列，此时以等比例表达至少两个多肽链，结果产生高产量，或此时该比例并不是特别重要的。
在一方法中，双重特异性抗体由杂种的免疫球蛋白重链组成，在一臂上有第一个结合特异性，而在另一臂上有杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二个结合特异性)。该不对称的结构，仅在双重特异性分子的一半具有免疫球蛋白轻链，使想要的双重特异性化合物更容易与不想要的免疫球蛋白链组合分开。在1994年3月3日发表的PCT公开第WO 94/04690号中描述了该方法。
包括两个共价连接的抗体的异源共轭抗体，也在本发明的范围内。已经使用这类抗体使免疫系统细胞瞄准不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)，并用来治疗HIV感染(PCT申请公开第WO 91/00360号和WO92/200373号；欧洲专利第03089号)。可使用任何便利的交联法，制造异源共轭抗体。适当的交联剂和技术是现有技术中已熟知的，并描述在美国专利第4,676,980号中。
该抗体可以是人类化抗体，例如如同在现有技术中已知的，并在本文中描述。
可按照在1999年11月18日发表的PCT公开第WO 99/58572中描述的，来修改(修饰)抗体。除了针对标靶分子的结合功能部位之外，这些抗体包括具有实质上与人类免疫球蛋白重链的全部或部分恒定功能部位同源的氨基酸序列的效应物功能部位。这些抗体能够与标靶分子结合，不诱发明显的补体依赖性溶解，或细胞-调解的标靶破坏。效应物功能部位最好能够特异性地结合FcRn及/或FeγRII b。这些通常是以衍生自二或多个人类免疫球蛋白重链CH2功能部位的嵌合型功能部位为基础。最好是在慢性抗体疗法中使用以此方式修改的抗体，以避免炎症和其他对传统抗体疗法不利的反应。
本发明包括对抗体E3的修改，包括不显著影响其特性的功能相等的抗体，以及具有提高或降低活性的变体。在现有技术中，例行地实行多肽的修改，并在实例中进一步举例说明。修改多肽的实例包括具有氨基酸残基的取代(包括保守取代)，一或多个不会明显有害地改变功能活性的氨基酸删除或添加的多肽，或使用化学类似物。
当在本文中使用时，多肽″变体″是与固有蛋白质之差异在于一或多个取代、删除、添加及/或插入的多肽，使得实质上并未减少该多肽的免疫反应性。换句话说，相对于固有蛋白质，可提高或不改变变体特异性地与抗原结合的能力，或相对于固有蛋白质，可减少至低于50％，较佳的是低于20％。多肽变体最好对已经确认的多肽，显示出至少大约80％，更佳的是至少大约90％，且最佳的是至少大约95％的同一性(根据在本文中的描述来判定)。
可借着将适当的核苷酸改变导入抗体DNA内，或借着肽合成，来制备抗体的氨基酸序列变体。这类变体包括，例如从在本文中描述的SEQID NO：1或2的氨基酸序列中删除及/或插入及/或取代残基。可进行删除、插入和取代的任何组合以获得最终的构筑体，其限制条件为最终的构筑体具有想要的特征。氨基酸变化也可改变抗体的转译后加工，如改变糖基化作用的数目和位置。
一种确认抗体的某些残基或区域是进行诱变或修改的较佳场所的有用方法，叫做″丙氨酸扫描诱变″，并由Cunningham和Wells，1989，Science，244：1081-1085描述了。确认一残基或一群标靶残基(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并以中性或带负电的氨基酸(最好是丙氨酸或聚丙氨酸)取代，影响氨基酸与抗原的交互作用。然后借着在取代位置导入更多或其他变体，改进那些证实对取代有功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然预先判定导入氨基酸序列变化的位置，仍不必预先判定突变本身的性质。例如，欲分析突变在特定位置的效能，在标靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机突变生成作用，并就想要的活性筛选所表达的抗体变体。也可使用在本文中描述的库扫描突变生成作用，确认在抗体中适合突变或修改的位置。
氨基酸序列插入包括范围从一个残基到含有一百或更多残基的多肽的氨基-及/或羧基-终端融合，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。终端插入的实例包括带有N-终端甲硫胺酰基残基的抗体，或与抗原决定位标签融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括酵素或增加抗体的血清半衰期的多肽与抗体的N-或C-终端融合。
取代变体在抗体分子中移除至少一个氨基酸残基，并在其位置插入另一个残基。取代突变生成作用最感兴趣的位置包括高变区，但也期待FR改变。在表1中，在″保守性取代″项目之下示出保守取代。若这类取代结果改变了生物活性，然后可导入更多实质上的改变，在表1中称为″典型的取代″，或按照下文在提及氨基酸种类时更多的描述，并筛选产物。
表1：氨基酸取代
  原始残基   保守性取代   典型的取代
  Ala(A)   Val   Val；Leu；Ile
  Arg(R)   Lys   Lys；Gln；Asn
  Asn(N)   Gln   Gln；His；Asp；Lys；Arg
  Asp(D)   Glu   Glu；Asn
  Cys(C)   Ser   Ser；Ala
  Gln(Q)   Asn   Asn；Glu
  Glu(E)   Asp   Asp；Gln
  Gly(G)   Ala   Ala
  His(H)   Arg   Asn；Gln；Lys；Arg
  Ile(I)   Leu   Leu；Val；Met；Ala；Phe；去甲亮氨酸
  Leu(L)   Ile   去甲亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
  Lys(K)   Arg   Arg；Gln；Asn
  Met(M)   Leu   Leu；Phe；Ile
  Phe(F)   Tyr   Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
  Pro(P)   Ala   Ala
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr   Tyr；Phe
  Tyr(Y)   Phe   Trp；Phe；Thr；Ser
  Val(V)   Leu   Ile；Leu；Met；Phe；Ala；去甲亮氨酸
借着选择某种取代，该取代与其对维持(a)在取代区中的多肽主链的结构，例如片状或螺旋构形，(b)在标靶位置的分子的电荷或疏水性，或(c)庞大侧链的影响明显不同，来完成抗体的生物特性的实质修改。以共同的侧链特性为基础，将天然存在的残基分类：
(1)疏水性的：去甲亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性的：Cys，Ser，Thr；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：Asn，Gln，His，Lys，Arg；
(5)影响链方位的残基：Gly，Pro；和
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
借着将这些种类之一的成员与另一种类的交换，进行非保守取代。
也可取代，通常是以丝氨酸取代任何不涉及维持抗体的适当构形的半胱氨酸，以便改善该分子的氧化稳定性，并防止反常的交联。相反地，可在抗体中加入半胱氨酸键结(们)，以改善其稳定性，特别是在该抗体为抗体片段，如Fv片段之处。
氨基酸修改的范围可从改变或修改一或多个氨基酸到整个区域的重新设计，如可变区。在可变区中的改变可改变结合亲和性及/或特异性。在一些具体实施例中，在CDR功能部位中进行不超过1至5个保守性氨基酸取代。在其他的具体实施例中，在CDR3功能部位中进行不超过1至3个保守性氨基酸取代。在另外的具体实施例中，CDR功能部位是CDRH3及/或CDRL3。
修改也包括糖基化和未糖基化的多肽，以及有其他转译后修改的多肽，像是例如有不同糖类的糖基化，酰基化作用和磷酸化作用。抗体在其恒定区中的保留位置被糖基化(Jefferis和Lund，1997，Chem.Immunol.65：111-128；Wright和Morrison，1997，TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质功能(Boyd等人，1996，Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe和Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)，以及在部分糖蛋白之间的分子间交互作用，其可影响糖蛋白的构形和现存的三维表面(Hefferis和Lund，在前；Wyss和Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡糖也可作为特定糖蛋白对某些分子的标靶，是以特定的认知结构为基础。也已经报告了抗体的糖基化作用影响抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。特定而言，报告了带有四环素-调节的β(1，4)-N-乙酰基葡糖氨基转移酶III(GnTIII)表达，葡糖基转移酶催化的二等份GlcNAc形成的CHO细胞，具有改善的ADCC活性(Umana等人，1999，Mature Biotech.17：176-180)。
抗体的糖基化作用通常是N-连接或O-连接的。N-连接意指碳水化合物部分附接在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸，是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酵素附接的认知序列。因此，这些三肽序列的任一者出现在多肽中，产生可能的糖基化作用位置。0-连接的糖基化作用意指糖类N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接在羟氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基离氨酸。
借着改变氨基酸序列，使其含有一或多个上述的三肽序列(对于N-连接的糖基化作用位置)，便利地完成在抗体中添加糖基化作用位置。也可借着添加或以一或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代原始抗体的序列(对于O-连接的糖基化作用位置)，来进行改变。
也可改变抗体的糖基化作用模式，但不改变潜在的核苷酸序列。糖基化作用相当依赖用来表达抗体的宿主细胞。因为用来表达可能成为治疗剂的重组糖蛋白，例如抗体的细胞类型，很少是天然的细胞，预期在抗体的糖基化作用模式上有所改变(参见，例如Hse等人，1997，J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除了宿主细胞的选择之外，在抗体的重组产生期间影响糖基化作用的因素还包括生长模式、培养基调配、培养密度、氧合作用、pH值、纯化方案及其类似物。已经提出各种方法来改变在特殊宿主生物中获得的糖基化作用模式，包括导入或过度表达某些涉及寡糖产生的酵素(美国专利第5,047,335号；5,510,261号和5,278,299号)。可以酵素方式从糖蛋白中移除糖基化作用，或某些类型的糖基化作用，例如使用内切糖苷酶(endoglycosidase)H(endo H)。此外，也可以遗传方式设计重组宿主细胞，使其在处理某些类型的多糖方面是有缺陷的。这些及类似的技术均为现有技术中已熟知的。
其他的修改方法包括使用现有技术中已知的偶联技术，包括但不限于酵素工具、氧化取代和螯合。修改可使用，例如附接免疫测定用的标记。使用在现有技术中已确立的程序来制造经过修改的E3多肽，并可使用现有技术中已知的标准测定筛选，其中一些将在下文和实例中描述。
其他的抗体修改包括已经按照在1999年11月18日发表的PCT公开第WO 99/58572号中的描述加以修改的抗体。这些抗体，除了针对标靶分子的结合功能部位之外，还包括效应物功能部位，具有实质上与人类免疫球蛋白重链的全部或部分恒定功能部位同源的氨基酸序列。这些抗体能够与标靶分子结合，不诱发明显的补体依赖性溶解，或细胞-调解的标靶破坏。在一些具体实施例中，该效应物功能部位能够特异性地结合FcRn及/或FcγR II b。这些通常是以衍生自二或多个人类免疫球蛋白重链CH2功能部位的嵌合型功能部位为基础。以此方式修改的抗体，特别适合用在慢性抗体疗法中，以避免炎症和其他对传统抗体疗法不利的反应。
本发明也包括由一或多个得自本发明的抗体(如E3)或多肽的片段或区域所组成的融合蛋白。在一具体实施例中，提供包括在图1B中所示的可变轻链区的至少10个连续氨基酸，及/或在图1A中所示的可变重链区的至少10个氨基酸的融合多肽。在其他的具体实施例中，该融合多肽包括E3的轻链可变区及/或重链可变区，如在图1A和1B中所示。在其他的具体实施例中，该融合多肽包括一或多个E3的CDR(s)。在另外的具体实施例中，该融合多肽包括抗体E3的CDR H3及/或CDR L3。在另一具体实施例中，该融合多肽包括下列的任一或多项：CDRH1的氨基酸残基L29，CDRH2的I50，CDRH3的W101，及/或CDRH3的A103；及/或CDRL1的氨基酸残基S28，CDRL1的N32，CDRL2的T51，CDRL3的91E及/或CDRL3的H92。为了本发明，E3融合蛋白含有一或多个E3抗体，以及在天然分子中未附接的其他氨基酸序列，例如异源序列或得自其他区域的同源序列。代表性的异源序列包括，但不限于″标签″，如FLAG标签或6His标签。标签为现有技术中已熟知的。
可借着现有技术中已知的方法来创造E3融合多肽，例如以合成或重组方式。通常，借着使用在本文中描述的重组方法，制备并表达编码其的多核苷酸，来制造本发明的E3融合蛋白，虽然也可借着现有技术中已知的其他方法来制备，包括例如化学合成。
本发明也提供组合物，其包括与有助于偶联固体支撑物(如生物素或抗生物素蛋白)的制剂共轭(例如连接)的E3抗体或多肽。为了简化，通常将提到E3或抗体，但应了解这些方法适用于任何在本文中描述的NGF结合的具体实施例。共轭通常意指连接在本文中描述的这些组份。可利用任何方式完成连接(通常是将这些组份紧密地结合固定，至少是为了投药)。例如，当制剂和抗体均具有能够彼此反应的取代基时，在它们之间可能有直接反应。例如，亲核基团，如氨基或硫氢基，其能够与在另一个上的含有羰基的基团，如酐或酰基卤，或含有良好释离基(例如卤化物)的烷基基团反应。
可将本发明的抗体或多肽与标示用制剂(或称为″标记″)连接，如萤光分子、放射性分子或任何现有技术中已知的标记。现有技术中已知的标记通常提供(直接或间接)信号。因此，本发明提供经标示的抗体及多肽。
可使用现有技术中已知的方法，其中一些在实例中描述，测试本发明的抗体和多肽的能力，如与NGF结合；降低或抑制NGF的生物活性；降低及/或阻断NGF-诱导的E13.5老鼠三叉神经元的存活。
本发明也提供包括抗体E3，如同该公开内容明确指出的，和任何或所有在本文中描述的抗体及/或多肽的组合物(包括医药组合物)和试剂盒。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明也提供经过分离的多核苷酸，其编码本发明的抗体和多肽(包括由在图1A和1B中示出的轻链和重链可变区的多肽序列所组成的抗体)，以及包括该多核苷酸的载体和宿主细胞。
因此，本发明提供多核苷酸(或组合物，包括医药组合物)，包括编码下列任一项的多核苷酸：(a)抗体E3；(b)抗体E3的片段或区域；(c)如在图1B中示出的抗体E3的轻链；(d)如在图1A中示出的抗体E3的重链；(e)一或多个得自抗体E3的轻链及/或重链的可变区(们)；(f)在图1A和1B中示出的抗体E3的一或多个CDR(s)(1、2、3、4、5或6个CDRs)；(g)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的CDR H3；(h)得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的CDR L3；(i)得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的三个CDRs；(j)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的三个CDRs；(k)得自在图1A和1B中示出的抗体E3的轻链的三个CDRs和得自重链的三个CDRs；或(l)由(b)至(k)中任一个所组成的抗体。在一些具体实施例中，多核苷酸包括在图2和3中示出的任一多核苷酸(们)或两者。
另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，其编码具有ATCC第PTA-4893号或ATCC第PTA-4894号保藏编号的E3轻链。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，其编码具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的E3重链。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，其包括(a)在具有ATCC第PTA-4894号保藏编号的多核苷酸中编码的可变区，和(b)在具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的多核苷酸中编码的可变区。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，其包括(a)一或多个在具有ATCC第PTA-4894号保藏编号的多核苷酸中编码的CDR；及/或(b)一或多个在具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的多核苷酸中编码的CDR。
另一方面，本发明提供编码在本文中描述的任何抗体(包括抗体片段)和多肽的多核苷酸。可借着现有技术中已知的程序制造多核苷酸。
另一方面，本发明提供包括本发明的任何多核苷酸的组合物(如医药组合物)。在一些具体实施例中，该组合物包括由编码在本文中描述的E3抗体的多核苷酸所组成的表达载体。在其他的具体实施例中，该组合物包括由编码任何在本文中描述的抗体或多肽的多核苷酸所组成的表达载体。在另外的具体实施例中，该组合物包括在图2和3中示出的任一多核苷酸或两者。在本文中进一步描述表达载体，以及多核苷酸组合物的投药。
另一方面，本发明提供制造任何在本文中描述的多核苷酸的方法。
本发明也包括与任何这类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单股的(密码或反义)或双股的，并可以是DNA(基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有插入序列，并以一对一的方式与DNA分子相对应，以及不含插入序列的mRNA。在本发明的多核苷酸中，可以但不必出现额外的密码或非密码序列，且多核苷酸可以但不必与其他的分子及/或支撑物质连接。
多核苷酸可包括天然的序列(即编码抗体或其一部分的内源序列)，或可包括这类序列的变体。多核苷酸变体含有一或多个取代、添加、删除及/或插入，使得相对于天然的免疫反应性分子，不会减少编码多肽的免疫反应性。变体最好是对编码天然抗体或其一部分的多核苷酸序列显示出至少大约70％同一性，较佳的是至少大约80％同一性，且最佳的是至少大约90％同一性。
按照下述为了最大一致性而将其排列比对时，若在两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸序列是相同的，这两个序列就是所谓″相同的″。通常借着在确认并比较序列类似性的局部区域的比较窗上比较序列，来进行两个序列之间的比较。当在本文中使用时，″比较窗″意指一段至少大约20个连续的位置，通常是30到大约75，40到大约50个，其中在将两个序列最适切地排列之后，将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列做比较。
可使用在生物信息学软件Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，使用预设参数，进行最适合比较的序列排列。该程序收录在下列参考文献中描述的数个排列比对方案：Dayhoff，M.0.(1978)蛋白质的进化改变模式-检测远距关系的矩阵(A model ofevolutionary change in proteins-Matrices for detecting distantrelationships)。在Dayhoff，M.O.(编辑)蛋白质序列和结构的图谱(Atlas ofProtein Sequence and Structure)，National Biomedical Research Foundation，Washington DC，第5册，附录3，第345-358页；Hein J.，1990，排列的一致方法和系统发生学(Unified Approach to Alignment and Phylogenes)第626-645页Methods in Enzymology第183册，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.，1989，CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.和Muller W.，1988，CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11：105；Santou，N.，Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.，1973，数字分类学原理和数字分类学的实行(Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy)，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
最好借着在至少20个位置的比较窗上，比较两个最佳排列的序列，判定″序列同一性百分比″，其中为了两个序列的最佳排列，该多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分，与参考序列(其不包括添加或删除)相比较，可包括20％或更少，通常是5至15％，或10至12％的添加或删除(即间隙)。借着判定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，产生相配位置的数目，将相配位置的数目除以在参考序列中的位置的总数(即窗尺寸)，并将结果乘以100，产生序列同一性的百分比，来计算该百分比。
变体也可以是，或者是与天然基因或其一部分或补体实质上同源的。
这类多核苷酸变体能够在中等严格的条件下与编码天然抗体的天然存在的DNA序列(或互补序列)杂交。
适当的″中等严格的条件″包括以5X SSC，0.5％SDS，1.0mMEDTA(pH8.0)的溶液预先冲洗；在50℃-65℃，5X SSC下杂交过夜；接着在65℃下20分钟，以含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC各冲洗两次。
当在本文中使用时，″高度严格的条件″或″高严格度条件″是下列那些：(1)使用低离子强度和高温冲洗，例如在50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间使用变性剂，如甲酰胺，例如在42℃下，带有0.1％牛血清白蛋白的50％(体积/体积)甲酰胺/0.1％水溶性聚蔗糖(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸钠缓冲溶液，带有750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下使用50％甲酰胺，5xSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x登哈特氏液，音波震荡的鲑精DNA(50微克/毫升)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下以0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)冲洗，在55℃下以50％甲酰胺冲洗，接着是在55℃下以含有EDTA的0.1xSSC组成的高严格度冲洗。本领域技术人员将知晓如何调整适应因子，如探针长度及其类似物所需的温度、离子强度等等。
本领域技术人员将了解因为遗传密码简并的结果，有许多编码在本文中描述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中有些对任何天然基因的核苷酸序列有少许同源性。然而，本发明特别期待因为在密码子使用上的差异而有所不同的多核苷酸。此外，包括在本文中提供的多核苷酸序列的基因的对偶基因，也在本发明的范围内。对偶基因是内源的基因，是由于一或多个核苷酸的突变，如删除、添加及/或取代而改变。所得的mRNA和蛋白质可能，但不必具有改变的结构或功能。可使用标准技术(如杂交、扩大及/或数据库序列比较)来确认对偶基因。
可使用化学合成、重组方法或PCR来获得本发明的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法是现有技术中已熟知的，不必在下文中详细说明。本领域技术人员可使用在本文中提供的序列和市售的DNA合成器，产生想要的DNA序列。
为了使用重组方法制备多核苷酸，可将包括想要序列的多核苷酸插入适当的载体内，并可转而将载体导入适当的宿主细胞内，按照在本文中进一步的讨论，进行复制和扩大。可借着现有技术中已知的任何方法，将多核苷酸插入宿主细胞内。借着直接摄取、胞饮作用、转移感染、F-接合或电穿透作用，借着导入外源多核苷酸来转化细胞。一旦导入，可将外源的多核苷酸维持在细胞内，成为未被整合的载体(如质体)或整合到宿主细胞的基因组内。可借着在现有技术中已熟知的方法，从宿主细胞中分离如此扩大的多核苷酸。参见，例如Sambrook等人(1989)。
或者，PCR容许产生DNA序列。PCR技术为现有技术中已熟知的，并在美国专利第4,683,195号，4,800,159号，4,754,065号和4,683,202号，以及PCR：The Polymerase Chain Reaction，Mullis等人编辑，Birkauswer Press，Boston(1994)中描述。
可借着在适当载体中的经过分离的DNA，并将其插入适当的宿主细胞内，获得RNA。此时细胞复制并将DNA转录成RNA，然后可使用本领域技术人员已熟知的方法分离RNA，例如在Sambrook等人(1989)中的陈述。
可根据标准技术建构，或可从现有技术中可利用的大量选殖载体中选择适当的选殖载体。虽然可根据企图使用的宿主细胞，改变所选择的选殖载体，但有用的选殖载体通常将具有自我-复制的能力，可能具有特殊核酸内切限制酶的单一标靶，并/或可能带有用来选择含有该载体的纯种系的标记基因。适当的实例包括质体和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBK SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNAs和往返载体，如pSA3和pAT28。这些和许多其他的选殖载体可得自商业卖主，如BioRad、Strategene和Invitrogen。
表达载体通常是可复制的多核苷酸构筑体，其含有根据本发明的多核苷酸。暗示表达载体在宿主细胞中必须是可复制的，如附加体或染色体DNA的嵌入部分。适当的表达载体包括但不限于质体、病毒载体，包括腺病毒、腺病毒伴随病毒、逆转录病毒、粘接质体和在PCT公开第WO87/04462号中公开的表达载体(们)。载体组份通常可包括，但不限于下列的一或多项：信号序列；复制起点；一或多个标记基因；适当的转录控制元件(如启动基因、促进子和终止序列)。为了表达(即转译)，通常也需要一或多个转译控制元件，如核糖体结合位置、转译开始位置和终止密码子。
可借着任何适当的方法，包括电穿透作用、转移感染、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质；微粒撞击；脂染作用；以及感染(例如在载体为传染原之处，如痘苗病毒)，将含有感兴趣的多核苷酸的载体导入宿主细胞内。导入载体或多核苷酸的选择，通常将视宿主细胞的特性而定。
本发明也提供包括任何在本文中描述的多核苷酸的宿主细胞。为了分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因，可使用任何能够过度-表达异源DNAs的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括，但不限于COS、HeLa和CHO细胞。也参见PCT公开第WO 87/04462号。适当的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌或枯草杆菌)和酵母菌(如酒酵母菌、裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K.lactis)。较佳的是，该宿主细胞以比相对应的感兴趣的内源抗体或蛋白质(若出现在宿主细胞中)更高大约5倍，更佳的是10倍，再更佳的是20倍的程度表达cDNAs。借着免疫测定或FACS，完成针对与NGF的特异性结合来筛选宿主细胞。可确认过度表达感兴趣的抗体或蛋白质的细胞。
使用E3和E3衍生的抗体的方法
可使用与NGF结合的抗体E3，确认或检测NGF的存在或缺乏。为了简化，通常提到E3或抗体，应了解这些方法适用于任何在本文中描述的NGF结合具体实施例(如多肽)。检测通常涉及使生物试样与在本文中描述的抗体接触，其与NGF结合并在NGF与特异性地结合NGF的抗体(例如E3)之间形成复合物。这类复合物的形成可以是在活体外或在活体内的。当在本文中使用时，″检测″一词包括定性及/或定量检测(测量含量)，有或无参考对照组。
可使用各种已知方法中的任一种来进行检测，包括但不限于免疫测定，使用多肽结合的抗体，例如借着酵素-连接的免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)及其类似者；以及针对编码多肽的功能测定，例如结合活性或酵素测定。在一些具体实施例中，以可检测的方式标示抗体。
E3和衍生物的诊断用途
本发明的抗体和多肽可应用在与改变或异常NGF表达(在一些具体实施例中，(相对于正常试样)增加或降低NGF表达，及/或不适当的表达，如在正常不表达NGF的组织(们)及/或细胞(们)中出现表达，或在正常有NGF表达的组织(们)及/或细胞(们)中没有NGF表达)有关的疾病、状况或病症的检测、诊断和监视上。本发明的抗体和多肽更可进一步用来检测NGF表达，例如在与对NGF有改变或异常的敏感性或反应性有关的疾病中。在一些具体实施例中，在得自怀疑或患有疾病、病症的个体的试样中，检测NGF表达，该疾病或病症的特征为对NGF表达有改变或异常的敏感性或反应性，或与其有关(例如其中NGF促进生长及/或转移的癌症)。
因此，在一些具体实施例中，本发明提供的方法包括使怀疑有改变或异常NGF表达的个体的样本(试样)与本发明的抗体或多肽接触，并判定NGF的含量是否与对照组或比较样本有差异。在一些具体实施例中，该个体患有心律不整、阿兹海默氏症及/或自主神经功能障碍。
在其他的具体实施例中，本发明提供的方法包括使个体的样本(试样)接触，并判定NGF表达的程度。在一些具体实施例中，怀疑该个体患有特征为对NGF表达有改变或异常的敏感性或反应性，或与其有关的疾病或病症。在一些具体实施例中，该个体患有小细胞肺癌、乳癌、胰脏癌、前列腺癌、卵巢癌、肝细胞癌或黑色素瘤。
为了诊断应用，通常以可检测部分来标示抗体，包括但不限于放射性同位素、萤光标记和各种酵素-受质标记。使标记与抗体共轭的方法是现有技术中已知的。在本发明其他的具体实施例中，不必标示本发明的抗体，可使用与本发明的抗体结合并经过标示的抗体来检测它的存在。
也可在任何已知的测定方法中使用本发明的抗体，如竞争性结合测定、直接或间接三明治测定，以及免疫沉淀测定。Zola，单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，第147-158页(CRC Press，Inc.1987)。
也可在活体内的诊断测定中使用抗体，如在活体内的显影。通常以放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I或3H)来标示抗体，而得以使用免疫闪烁照相法来定位感兴趣的细胞或组织。
也可在病理学中将抗体当作染色试剂来使用，依据在现有技术中已熟知的技术。
使用E3及衍生物治疗的方法
抗体E3可用来降低及/或阻断NGF的生物活性。咸相信该拮抗活性可用来治疗与内源的NGF产生有关的病理学状况，如疼痛。通常，在这些具体实施例中，对个体给予有效的含量。因此，本发明一方面提供使用任何在本文中公开的多肽(包括抗体，如抗体E3)，拮抗人类NGF生物活性的方法。在一具体实施例中，该方法包括使人类神经生长因子与任何在本文中公开的多肽(包括抗体E3)接触，从而拮抗、降低、阻断或抑制人类神经生长因子活性。在另外的具体实施例中，给予患有疼痛(如手术后疼痛或风湿性关节炎疼痛)的个体E3来治疗。
为了简化，通常提到E3或抗体，了解这些方法适用于任何在本文中描述的E3变体抗体和多肽。
可使用各种E3或E3片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等等)的调配物来进行投药，如单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及任何其他经过修改的E3组态，其包括特异性所需的抗原NGF认知位置。在一些具体实施例中，可给予纯的E3抗体或E3的各种调配物。在其他的具体实施例中，给予E3或E3的各种调配物(包括在本文中描述的任何组合物实施例)，以及在药学上可接受的赋形剂，且其可以是各种调配物。在药学上可接受的赋形剂是现有技术中已知的，并是相对上较惰性的物质，其有助于在药学上有效的物质的投药。例如，该赋形剂可提供形状或密度，或作为稀释剂。适当的赋形剂包括但不限于稳定剂、湿润剂和乳化剂、改变渗透压的盐类、包胶制剂、缓冲剂和皮肤穿透促进剂。在Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版Publishing(2000)中陈述了非经肠和经肠药物输送的赋形剂和调配物。
在一些具体实施例中，将这些制剂调配成借着注射投药(例如腹腔内、静脉内、皮下、肌肉内等等)的，虽然也可使用其他的投药形式(例如口服、粘膜、经吸入、舌下等等)。因此，最好将E3抗体及其相等物与在药学上可接受的媒剂混合，如生理盐水、林格氏液、右旋糖溶液及其类似物。特殊的剂量摄生法，即剂量、给药时间和重复次数，将视特殊的个体和个体的医学病史而定。通常可使用任何下列的剂量：投药至少大约50毫克/千克体重；至少大约10毫克/千克体重；至少大约3毫克/千克体重；至少大约1毫克/千克体重；至少大约750微克/千克体重；至少大约500微克/千克体重；至少大约250微克/千克体重；至少大约100微克/千克体重；至少大约50微克/千克体重；至少大约10微克/千克体重；至少大约1微克/千克体重；或更低的剂量。为了在数天或更长的期间内重复给药，视状况而定，持续治疗直到出现期望的疾病症状的抑制为止。代表性的剂量摄生法包括给予大约2毫克/千克的最初剂量，接着是大约1毫克/千克抗-NFD抗体的每周维持剂量，或接着每隔一周给予大约1毫克/千克的维持剂量。然而，其他的剂量摄生法可能也是有用的，视医师希望达到的药物动力学衰退模式而定。凭经验的考量，如半衰期，通常将用以判定剂量。借着传统的技术和测定，轻易地监视该疗法的进行。
在某些个体中，可能需要一次以上的给药。可在疗程中判定并调整投药的频率。例如，可以欲治疗之疼痛的类型和严重性、为了预防或治疗目的而给予制剂、先前的疗法、患者的临床病史和对该制剂的反应，以及临床医师的判断为基础，来判定并调整投药的频率。通常，临床医师将给予抗-NGF拮抗剂抗体(如E3)，直到达到获得想要结果的剂量为止。在某些情况下，持续连续释放的E3抗体调配物可能是适合的。达到持续释放的各种调配物和装置为现有技术中已知的。
在一具体实施例中，可在已经给予一或多次投药的个体中，凭经验判定E3抗体(或多肽)的剂量。给予个体增加剂量的E3。欲评估E3或其他等同抗体的效力，可监视疾病症状(如疼痛)的标记。
根据本发明的方法给予抗体(如E3)或多肽，可以是连续或间歇的，视例如接受者的生理学状况、投药目的是否为治疗性或预防性，以及熟练的医师已知的其他因素而定。抗体的投药基本上可能是在预先选择的时间内连续的，或可以是一连串分开的剂量，例如在发展出疼痛之前、期间或之后，发展出疼痛之前、期间、之前和之后、期间和之后，或之前、期间和之后。投药可以在受伤、切开、创伤、手术和任何其他类似引起手术后疼痛的事件之前、期间及/或之后。
其他调配物包括现有技术中已知的适当输送形式，包括但不限于载剂，如脂质体。参见，例如Mahato等人(1997)Pharm.Res.14：853-859。脂质体制备物包括，但不限于细胞转染剂、多层囊泡和单层囊泡。
在一些具体实施例中，可能出现一种以上的抗体或多肽。该抗体可以是单克隆或多克隆的。这类组合物可含有至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的抗体。在现有技术中经常以抗体的混合物来表示，其在治疗较广泛的个体族群时是特别有用的。
编码任何本发明的抗体或多肽(如抗体E3)的多核苷酸，也可用来在想要的细胞中，输送及表达任何本发明的抗体或多肽(如抗体E3)。显然可使用表达载体来指挥E3抗体或多肽的表达。可借着现有技术中已知的任何方法，给予表达载体，如腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、心室内、口服、经肠、非经肠、鼻内、经皮、舌下或借着吸入。例如，表达载体的投药包括局部或系统的投药，包括注射、口服投药、颗粒枪或插入导管投药，以及局部投药。本领域技术人员通晓表达载体的投药，获得外源蛋白质在活体内的表达。参见，例如美国专利第6,436,908号；6,413,942号和6,376,471号。
也可使用包括编码任何本发明的抗体或多肽(如抗体E3)的多核苷酸的治疗组合物的靶向输送。在例如Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，基因疗法：直接基因转移的方法和应用(GeneTherapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer)(J.A.Wolff编辑)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述了受体-调解的DNA输送技术。在基因疗法草案中，为了局部投药，以大约100纳克到大约200毫克DNA的范围，给予含有多核苷酸的治疗组合物。在基因疗法草案期间，也可使用大约500纳克到大约50毫克、大约1微克到大约2毫克、大约5微克到大约500微克，以及大约20微克到大约100微克DNA的浓度范围。可使用基因输送媒介，输送本发明的治疗用多核苷酸和多肽。基因输送媒介可以是病毒或非病毒来源的(通常参见Jolly，CancerGene Therapy(1994)1：51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1：185；以及Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148)。可使用内源的哺乳动物或异源启动基因，诱导这类密码序列的表达。密码序列的表达可以是组成上的或经调节的。
用来输送想要的多核苷酸，并在想要的细胞中表达的以病毒为基础的载体，为现有技术中已熟知的。代表性的以病毒为基础的媒介包括，但不限于重组的逆转录病毒(参见，例如PCT公开第WO 90/07936号；WO94/03622号；WO 93/25696号；WO 93/25234号；WO 93/11230号；WO91/02805号；WO 91/02805号；美国专利第5,219,740号；4,777,127号；英国专利第2,200,651号；和欧洲专利第0345242号)、以α病毒为基础的载体(例如辛得比斯病毒(Sindbis virus)载体、胜利森林病毒(Semilikiforest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross Rivervirus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532))，腺病毒伴随病毒(AAV)载体(参见，例如PCT公开第WO 94/12649号；WO 93/03769号；WO 93/19191号；WO 94/28938号；WO 95/11984号和WO 95/00655号)。也可使用在Curiel，Hum.GeneTher.(1992)3：147中描述的与已杀死的腺病毒连接的DNA来投药。
也可使用非病毒输送媒介和方法，包括但不限于聚阳离子凝聚的DNA，与杀死的腺病毒连接或单独不与其连接(参见，例如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配体-连接的DNA(参见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核生物细胞输送媒介细胞(参见，例如美国专利第5,814,482号；PCT公开第WO 95/07994号；WO 96/17072号；WO95/30763号和WO 97/42338号)，以及核电荷中和作用或与细胞膜融合。也可使用裸露的DNA。在PCT公开第WO 90/11092号和美国专利第5,580,859号中描述了代表性的裸露DNA导入法。在美国专利第5,422,120号；PCT公开第WO 95/13796号；WO 94/23697号；WO 91/14445号和欧洲专利第0524968号中描述了可作为基因输送媒介的脂质体。在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述了额外的方法。
关于在本文中描述的所有方法，参考抗-NGF拮抗剂抗体，也包括由一或多个这些制剂所组成的组合物。这些组合物可进一步包括适当的赋形剂，如在药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其为现有技术中已熟知的。本发明可单独使用，或与其他传统治疗方法并用。
使用抗-NGF拮抗剂抗体治疗或预防风湿性关节炎疼痛的方法
在某些方面，本发明提供在个体，包括哺乳动物，人类和非人类两者中，治疗及/或预防风湿性关节炎疼痛的方法。因此，本发明一方面提供在个体中治疗风湿性关节炎疼痛的方法，包括给予有效含量的抗-NGF拮抗剂抗体。抗-NGF拮抗剂抗体是现有技术中已知的，并在本文中描述。
另一方面，本发明提供在个体中降低发生率、改善、压抑、减轻及/或延迟风湿性关节炎疼痛之发生、发展或进行的方法。因此，在一些具体实施例中，在发展出疼痛或疼痛事件之前，在患有风湿性关节炎的个体中给予抗-NGF拮抗剂抗体。
另一方面，本发明提供在个体中治疗与风湿性关节炎有关的炎症性恶病质(体重丧失)的方法，包括给予有效含量的抗-NGF拮抗剂抗体(Roubenoff等人，Arthritis Rheum.40(3)：534-9(1997)；Roubenoff等人，J.Clin.Invest.93(6)：2379-86(1994))。
在现有技术中，已确立了风湿性关节炎疼痛的诊断或评估。可以在现有技术中已知的测量为基础进行评估，如使用各种疼痛计分，定出患者疼痛的特征。参见，例如Katz等人，Surg Clin North Am.(1999)79(2)：231-52；Caraceni等人J Pain Symptom Manage(2002)23(3)：239-55。也有常用来测量疾病状态的计分表，如美国风湿病学会(American College ofRheumatology)(ACR)(Felson等人，Arthritis and Rheumatism(1993)36(6)：729-740)，健康评估问卷(Health Assessment Questionnaire)(HAQ)(Fries等人，(1982)J.Rheumatol.9：789-793)、保罗士(Paulus)计分表(Paulus等人，Arthritis and Rheumatism(1990)33：477-484)，以及关节炎冲击量表(Arthritis Impact Measure Scale)(AIMS)(Meenam等人，Arthritis andRheumatology(1982)25：1048-1053)。可经由任何适当的路径给予抗-NGF拮抗剂抗体。在本文中描述不同投药路径的实例。
可通过疼痛缓解的时间经过，确定出疼痛缓解的特征。因此，在一些具体实施例中，在给予抗-NGF拮抗剂抗体之后大约24小时内观察到疼痛缓解。在其他的具体实施例中，在给予抗-NGF拮抗剂抗体之后大约36、48、60、72小时或4天内观察到疼痛缓解。在另外的具体实施例中，在观察到改善与风湿性关节炎有关的炎症状况的指标之前，就观察到疼痛缓解。在一些具体实施例中，减少疼痛的频率及/或强度，并/或增加那些受该疾病所苦者的生活品质。
在以下的章节中(″N GF拮抗剂″；″抗-N GF拮抗剂抗体″；″其他的NGF拮抗剂″；″确认NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)″；″用于本发明的方法中的组合物″；″给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)″)，描述制造和使用NGF拮抗剂(包括抗-NGF抗体)的那些方法。
使用抗-NGF拮抗剂抗体来治疗或预防骨关节炎疼痛的方法
在某些方面，本发明提供在个体，包括哺乳动物，人类和非人类两者中，治疗及/或预防骨关节炎疼痛的方法。因此，本发明一方面提供在个体中治疗骨关节炎疼痛的方法，包括给予有效含量的NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。NGF拮抗剂，包括抗-NGF拮抗剂抗体是现有技术中已知的，并在本文中描述。
另一方面，本发明提供在个体中降低发生率、改善、压抑、减轻及/或延迟骨关节炎疼痛之发生、发展或进行的方法，包括给予有效含量的NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。因此，在一些具体实施例中，在发展出疼痛或疼痛事件之前，在患有骨关节炎的个体中给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。
在现有技术中，已确立了骨关节炎疼痛的诊断或评估。可以在现有技术中已知的测量为基础进行评估，如使用各种疼痛计分，定出患者疼痛的特征。参见，例如Katz等人，Surg Clin North Am.(1999)79(2)：231-52；Caraceni等人J Pain Symptom Manage(2002)23(3)：239-55。例如，可使用WOMAC移动疼痛计分(Ambulation Pain Scale)(包括疼痛、僵硬和物理功能)，以及100毫米视觉类比量表(Visual Analogue Scale)(VAS)来评估疼痛，并评估对治疗的反应。
可经由任何适当的路径对个体给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。在本文中描述了不同投药路径的实例。
在一些具体实施例中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每十五周一次、每二十周一次、每二十五周一次或每二十六周一次，给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。在一些具体实施例中，每个月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次或每六个月一次，给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。
可通过疼痛缓解的时间经过，确定出疼痛缓解的特征。因此，在一些具体实施例中，在给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)之后大约24小时内观察到疼痛缓解。在其他的具体实施例中，在给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)之后大约36、48、60、72小时或4天内观察到疼痛缓解。在一些具体实施例中，减少疼痛的频率及/或强度，并/或增加那些受该疾病所苦者的生活品质。
在以下的章节中(″N GF拮抗剂″；″抗-NGF拮抗剂抗体″；
″其他的NGF拮抗剂″；″确认NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)″；″用于本发明的方法中的组合物″；″给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)″)，描述制造和使用NGF拮抗剂(包括抗-NGF抗体)的那些方法。
NGF拮抗剂
本发明的方法(关于风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)使用NGF拮抗剂，其意指任何阻断、压抑或降低(包括明显地)NGF生物活性，包括由NGF发送信号来调解的下游路径，如与NGF结合的受体及/或诱发对NGF的细胞反应的分子。″拮抗剂″一词意指非特异性的生物作用机制，并认为明确地包含并包括所有可能的与NGF的药理学、生理学和生化交互作用，及其可借着各种不同的，在化学上歧异的组合物达到的结果。代表性的NGF拮抗剂包括，但不限于抗-NGF抗体、针对NGF的反义分子(包括针对编码NGF的核酸的反义分子)、针对NGF受体(如TrkA受体及/或p75受体)的反义分子(包括针对编码TrkA及/或p75的核酸的反义分子)、NGF抑制化合物、NGF结构类似物、与NGF结合的TrkA受体的负面优势突变、TrkA免疫黏附素、抗-TrkA抗体、与NGF的p75的负面优势突变、抗-p75抗体和激酶抑制剂。为了本发明，明确地了解″拮抗剂″一词包括所有先前确认的名词、标题和功能状态，并借此定出NGF本身、NGF生物活性的特征(包括但不限于其调解任何方面的疼痛的能力)，或该生物活性的结果，实质上以任何有意义的程度使其无效、减少、或中和。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂(例如抗体)与NGF结合(与NGF产生物理交互作用)，与NGF受体(如TrkA受体及/或p75受体)结合，及/或降低(妨碍及/或阻断)下游的NGF受体发送信号。因此，在一些具体实施例中，NGF拮抗剂与NGF结合(与NGF产生物理交互作用)。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂嗜与NGF结合的多肽。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂是在PCT WO 2004/026329中描述的肽或经过修改的肽(如与Fc功能部位融合的NGF结合肽)。在另一具体实施例中，NGF拮抗剂与NGF受体(如TrkA受体或p75)结合。在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂降低(妨碍及/或阻断)下游的NGF受体发送信号(例如激酶发送信号的抑制剂)。在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂抑制(降低)了NGF合成及/或释放。在另外的具体实施例中，NGF拮抗剂是不属于TrkA免疫黏附素的NGF拮抗剂(即为TrkA免疫黏附素以外的)。在另一具体实施例中，NGF拮抗剂是抗-NGF抗体以外的。在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂是TrkA免疫黏附素和抗-NGF抗体以外的。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂与NGF(如hNGF)结合，但不明显地与相关的神经营养素，如NT-3、NT4/5及/或BDNF结合。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂与有害的免疫反应无关。在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂是抗-NGF抗体。在另外的具体实施例中，抗-NGF抗体是人类化的(如在本文中描述的抗体E3)。在一些具体实施例中，抗-NGF抗体是抗体E3(如同在本文中描述的)。在其他的具体实施例中，抗-NGF抗体包括一或多个抗体E3的CDR(s)(如1、2、3、4、5个，或在一些具体实施例中，得自E3的全部6个CDRs)。在其他的具体实施例中，该抗体是人类。在另外的具体实施例中，抗-NGF抗体包括在图1A中示出的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和在图1B中示出的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。在另外的具体实施例中，抗体包括经过修改的恒定区，如在免疫学上惰性的恒定区，例如不诱发补体调解的溶解，或不刺激抗体-依赖性细胞调解的细胞毒性(ADCC)。在其他的具体实施例中，按照在Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请案第PCT/英国99/01441号；及/或大不列颠联合王国专利申请案第9809951.8号中的描述来修改恒定区。
抗-NGF拮抗剂抗体
本发明的方法(关于风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)使用抗-NGF拮抗剂抗体，其意指任何阻断、压抑或降低(包括明显地)NGF生物活性，包括由NGF发送信号调解的下游路径，如受体结合及/或诱发对NGF的细胞反应的抗体分子。
抗-NGF拮抗剂抗体应显示出下列特征之中任一项或多项：(a)与NGF结合并抑制NGF生物活性，或由NGF发送信号功能调解的下游路径；(b)预防、改善或治疗任何方面的风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛；(c)阻断或减少NGF受体激活作用(包括TrkA受体二聚作用及/或自动磷酸化作用)；(d)增加NGF的清除；(e)抑制(降低)NGF合成、产生或释放。抗-NGF拮抗剂抗体为现有技术中已知的，参见，例如PCT公开第WO 01/78698号、WO 01/64247号、美国专利第5,844,092号、5,877,016号和6,153,189号；Hongo等人，Hybridoma，19：215-227(2000)；Cell Molec.Biol.13：559-568(1993)；GenBank登录编号U39608、U39609、L17078或L17077。也在PCT WO 2005/019266中描述了抗-NGF拮抗剂抗体和多肽。
为了本发明，该抗体以抑制NGF及/或由NGF发送信号功能调解的下游路径的方式与NGF反应。在一些具体实施例中，抗-NGF拮抗剂抗体认识人类NGF。在另外的具体实施例中，抗-NGF拮抗剂抗体特异性地与人类NGF结合。在一些具体实施例中，抗-NGF拮抗剂抗体不明显地与相关的神经营养素，如NT-3、NT4/5及/或BDNF结合。在另外的具体实施例中，抗-NGF抗体能够与NGF结合，并有效地抑制NGF与其TrkA及/或p75受体在活体外的结合，并/或有效地抑制NGF激活其TrkA及/或p75受体。在另外的具体实施例中，抗-NGF拮抗剂抗体是单克隆抗体。在其他的具体实施例中，抗-NGF抗体是人类化的(如在本文中描述的抗体E3)。在一些具体实施例中，抗-NGF抗体是人类。参见，例如WO2005/019266。在一具体实施例中，该抗体是人类抗体，其识别在人类NGF上的一或多个抗原决定位。在另一具体实施例中，该抗体是老鼠或大鼠抗体，其识别在人类NGF上的一或多个抗原决定位。在另一具体实施例中，该抗体识别在选自灵长类、狗、猫、马和牛所组成的群的NGF上的一或多个抗原决定位。在其他的具体实施例中，抗-NGF拮抗剂抗体基本上与与选自下列之中任一或多项的抗体相同的NGF抗原决定位6结合：MAb 911、MAb 912和MAb 938(参见Hongo等人，Hybridoma19：215-227(2000))。在其他的具体实施例中，该抗体与与MAb 911相同的抗原决定位结合。在另一具体实施例中，该抗体包括在免疫学上为惰性的恒定区(例如不诱发补体调解的溶解或抗体依赖性细胞调解的细胞毒性(ADCC))。可使用在美国专利第5,500,362号中公开的方法评估ADCC活性。在一些具体实施例中，按照在Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请案第PCT/英国99/01441号；及/或大不列颠联合王国专利申请案第9809951.8号中的描述来修改恒定区。
在一些具体实施例中，抗-NGF拮抗剂抗体是人类化的老鼠抗-NGF单克隆抗体，叫做抗体″E3″，任何在本文中描述的E3相关抗体，或其任何片段，均是NGF拮抗剂。
在本发明中有用的抗体可包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等等)、嵌合型抗体、双重特异性抗体、异源共轭物抗体、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人类化抗体，以及免疫球蛋白分子的任何其他经过修改的组态，其包括所需特异性的抗原认知位置，包括抗体的糖基化作用变体、抗体的氨基酸序列变体，以及共价修改的抗体。该抗体可以是老鼠、大鼠、人类或任何其他来源的(包括嵌合型或人类化的抗体)。
抗-NGF拮抗剂抗体对NGF(如hNGF)的结合亲和性，可以是大约0.10到大约0.80nM，大约0.15到大约0.75nM和大约0.18到大0.72nM。在一具体实施例中，结合亲和性是在大约2pM到22pM之间。在一具体实施例中，结合亲和性是在大约23pM到大约100pM之间。在一些具体实施例中，结合亲和性是大约10nM。在其他的具体实施例中，结合亲和性是低于大约10nM。在其他的具体实施例中，结合亲和性是大约0.1nM或大约0.07nM。在另外的具体实施例中，结合亲和性低于大约0.1nM或低于大约0.07nM。在另外的具体实施例中，结合亲和性是大约100nM、大约50nM、大约10nM、大约1nM、大约500pM、大约100pM、大约50pM中的任一个到大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM或大约40pM中的任一个。在一些具体实施例中，结合亲和性是大约100nM、大约50nM、大约10nM、大约1nM、大约500pM、大约100pM或大约50pM中的任一个，或低于大约50pM。在一些具体实施例中，结合亲和性低于大约100nM、大约50nM、大约10nM、大约1nM、大约500pM、大约100pM或大约50pM。在另外的具体实施例中，结合亲和性是大约2pM、大约5pM、大约10pM、大约15pM、大约20pM、大约40pM或超过大约40pM。
一种判定抗体对NGF的结合亲和性的方法是测量抗体的单功能Fab片段的结合亲和性。欲获得单功能Fab片段，可利用木瓜蛋白酶切开抗体(例如IgG)，或以重组方式表达。可通过表面等离子体激光共振(BIAcore3000TM表面等离子体激光共振(SPR)系统，BIAcore，INC，PiscawayNJ)，判定抗体的抗-NGF Fab片段的亲和性。可根据供应商的说明书，利用N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)-碳化二酰亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，激活CM5晶片。可以10mM乙酸钠pH 4.0稀释人类NGF(或任何其他的NGF)，并以0.005毫克/毫升的浓度注射到已经激活的晶片上。使用可变的流动时间，跨越个别的晶片通道，可达到两种抗原密度范围：100-200反应单位(RU)，进行详细的动力学研究，以及500-600RU，进行筛选测定。以乙醇胺阻断晶片。再生研究已经显示Pierce洗脱缓冲溶液(产品编号21004，Pierce Biotechnology，Rockford IL)和4MNaCl(2∶1)的混合物，有效地移除已经结合的Fab，同时在200次注射中仍保持在晶片上的hNGF的活性。使用HBS-EP缓冲溶液(0.01M HEPES，pH7.4，0.15NaCl，3mM EDTA，0.005％界面活性剂P29)作为BIAcore测定的执行缓冲溶液。以100微升/分钟，注射连续稀释的(0.1-10x已确立的KD)经过纯化的Fab试样1分钟，并容许高达2小时的解离时间。借着ELISA及/或SDS-PAGE电泳判定Fab蛋白质的浓度，使用具有已知浓度(借着氨基酸分析判定)的Fab作为标准物。借着使用BIA评估程序，使数据符合1∶1的Langmuir结合模式(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L. Petersson，B.(1994)Methods Enzymology 6.99-110)，同时获得动力学结合率(kon)和解离率(koff)。按koff/kon计算平均解离常数(KD)值。该草案适合用来判定抗体对任何NGF，包括人类NGF、其他脊椎动物(在一些具体实施例中，为哺乳动物)的NGF(如老鼠NGF、大鼠NGF、灵长类NGF)的结合亲和性，并可用于其他的神经营养素，如相关的神经营养素NT3、NT4/5及/或BDNF。
在一些具体实施例中，与人类NGF结合的抗体并不会显著地与得自其他脊椎动物物种(在一些具体实施例中，为哺乳动物)的NGF结合。在一些具体实施例中，该抗体与人类NGF和一或多个得自其他脊椎动物(在一些具体实施例中，为哺乳动物)的NGF结合。在另外的具体实施例中，与NGF结合的抗体并不显著地与其他神经营养素(如相关的神经营养素，NT3、NT4/5及/或BDNF)产生交叉反应。在一些具体实施例中，该抗体与NGF和至少一个其他的神经营养素结合。在一些具体实施例中，该抗体与哺乳动物物种的NGF结合，如马或狗，但不显著地与得自其他哺乳动物物种的NGF结合。
抗原决定位(们)可以是连续或间断的。在一具体实施例中，该抗体基本上与与选自在Hongo等人，Hybridoma，19：215-227(2000)中描述的MAb911、MAb 912和MAb 938所组成的组的抗体相同的hNGF抗原决定位结合。在另一具体实施例中，该抗体基本上与与MAb 911相同的hNGF抗原决定位结合。在另一具体实施例中，该抗体基本上与与MAb 909相同的抗原决定位结合。Hongo等人，在前。例如，抗原决定位可包括下列的一或多项：在hNGF的可变区1(氨基酸23-35)中的残基K32、K34和E35；在hNGF的可变区4(氨基酸81-88)中的残基F79和T81；在可变区4中的残基H84和K88；在hNGF的可变区5(氨基酸94-98)与hNGF的C-终端(氨基酸111-118)之间的残基R103；在hNGF之前-可变区1(氨基酸10-23)中的残基E11；在hNGF的可变区2(氨基酸40-49)与hNGF5的可变区3(氨基酸59-66)之间的残基Y52；在hNGF的C-终端中的残基L112和S113；在hNGF的可变区3中的残基R59和R69；或在hNGF之前-可变区1中的残基V18、V20和G23。此外，抗原决定位也可包括一或多个hNGF的可变区1、可变区3、可变区4、可变区5、N-终端区及/或C-终端。在另一具体实施例中，该抗体明显地降低hNGF的残基R103的溶剂可及性。应了解虽然上述的抗原决定位是相对于人类NGF，但本领域技术人员可将人类NGF与其他物种NGF的结构排列比对，并确认这些抗原决定位可能的配对物。
一方面可借着使用表达全长NGF或其部分序列的免疫原，制造能抑制NGF的抗体(例如人类、人类化、老鼠、嵌合型)。另一方面，也可使用包括过度表达NGF的细胞的免疫原。可使用的免疫原的其他实例是NGF蛋白质，其含有全长NGF或一部分的NGF蛋白质。
可借着现有技术中已知的任何方法制造抗-NGF拮抗剂抗体。免疫宿主动物的路径和方案，通常与已确立和传统的抗体刺激与产生技术一致，如同在本文中进一步描述的。产生人类和老鼠抗体的普通技术为现有技术中已知的，并在本文中描述。
也可以操纵任何哺乳动物个体(包括人类)或从其中产生抗体的细胞，作为产生哺乳动物(包括人类)的融合瘤细胞株的基础。通常以在本文中描述的免疫原的用量，以腹腔内、肌肉内、口服、皮下、跖内(intraplantar)及/或皮内接种宿主动物。
可从淋巴细胞和永存不朽的骨髓瘤细胞来制备融合瘤，使用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256：495-497的一般体细胞杂交技术，或按照Buck，D.W.等人，In Vitro，18：377-381(1982)的修改。在杂交作用中可使用可获得的骨髓瘤细胞株，包括但不限于X63-Ag8.653，以及得自SalkInstitute，Cell Distribution Center，San Diego，Calif.，USA的那些。通常，该技术涉及使用融合剂(fusogen)，如聚乙二醇，或借着本领域技术人员已熟知的电方法，将骨髓瘤细胞与淋巴样细胞融合。在融合之后，从融合培养基中分离细胞，并使其生长在选择培养基中，如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺核苷(HAT)培养基，排除未杂交的双亲细胞。可使用有或无补充血清的在本文中描述的任何培养基来培养分泌单克隆抗体的融合瘤。另一种细胞融合技术，可使用EBV永存不朽的B细胞，产生本发明的抗-NGF单克隆抗体。扩大并继代选殖融合瘤，若需要，可借着传统的免疫测定程序(例如放射性免疫测定、酵素免疫测定或萤光免疫测定)，测定上清液的抗-免疫原活性。
可用来作为抗体来源的融合瘤，包括所有的衍生物、产生对NGF特异性的单克隆抗体的双亲融合瘤的子代，或其一部分。
可使用已知的程序，使产生这类抗体的融合瘤在活体外或在活体内生长。若希望可借着传统的免疫球蛋白纯化程序，如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析法和超过滤作用，从培养基或体液中分离单克隆抗体。若出现不想要的活性，可借着例如在使免疫原附接在固相上制成的吸附剂上执行制备，并从免疫原中洗脱或释放出想要的抗体来移除它。使用双重功能或衍生制剂，例如顺丁烯二酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(经由半胱氨酸残基共轭)、N-羟基琥珀酰亚胺(经由离氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基，将对欲免疫的物种为免疫原性的蛋白质与人类NGF或含有标靶氨基酸序列的片段共轭，用以免疫宿主动物，产生抗体族群(例如单克隆抗体)。
若想要，可将感兴趣的抗-NGF拮抗剂抗体(单克隆或多克隆的)定序，然后可将多核苷酸序列选殖到载体内进行表达或繁殖。可将编码感兴趣的抗体的序列维持在宿主细胞中的载体内，然后可扩大宿主细胞并冷冻以供未来使用。或者，也可使用多核苷酸序列进行基因操纵，″人类化″抗体，或改善亲和性或抗体的其他特征。例如，可设计恒定区使其更像人类恒定区，若将该抗体用于临床试验并用来治疗人类，便可避免免疫反应。可能想要以遗传方式操纵抗体序列，以便对NGF获得更高的亲和性，或在抑制NGF上获得更大的效力。本领域技术人员将知晓可对抗-NGF拮抗剂抗体进行一或多个多核苷酸改变，但仍维持其对NGF的结合能力。
有四个对单克隆抗体人类化的一般步骤。其为(1)判定起始抗体轻和重可变功能部位的核苷酸和预测的氨基酸序列，(2)设计人类化抗体，即决定在人类化加工期间使用哪一个抗体框架区，(3)实际的人类化方法/技术，和(4)人类化抗体的转移感染与表达。参见，例如美国专利第4,816,567号；5,807,715号；5,866,692号；6,331,415号；5,530,101号；5,693,761号；5,693,762号；5,585,089号和6,180,370号。
已经描述了许多包括衍生自非人类免疫球蛋白的抗原-结合位置的″人类化″抗体分子，包括嵌合型抗体，具有与人类恒定功能部位融合的啮齿类或经过修改的啮齿类V区和其结合的互补性决定区(CDRs)。参见，例如Winter等人Nature 349：293-299(1991)，Lobuglio等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224(1989)，Shaw等人J.Immunol.138：4534-4538(1987)和Brown等人Cancer Res.47：3577-3583(1987)。其他参考文献描述啮齿类CDRs移植到人类的支撑框架区(FR)内，之后再与适当的人类抗体恒定功能部位融合。参见，例如Riechmann等人Nature 332：323-327(1988)，Verhoeyen等人Science 239：1534-1536(1988)，和Jones等人Nature321：522-525(1986)。其他的参考文献描述借着以重组方式在外侧镶嵌啮齿类框架区，支撑啮齿类CDRs。参见，例如欧洲专利公开第0519596号。设计这些″人类化″分子，使对啮齿类抗-人类抗体分子的不想要的免疫反应减至最少，其限制了这些部分在人类接受者中的治疗应用的期间和效力。例如，可设计抗体恒定区，使其成为免疫学惰性的(例如不诱发补体溶解)。参见，例如PCT公开第PCT/英国99/01441号；大不列颠联合王国专利申请案第9809951.8号。也可利用由Daugherty等人，Nucl.Acids Res.19：2471-2476(1991)，以及在美国专利第6,180,377号；6,054,297号；5,997,867号；5,866,692号；6,210,671号和6,350,861号；以及在PCT公开第WO 01/27160号中公开的人类化抗体的其他方法。
另外，可借着使用已经设计成表达特定人类免疫球蛋白蛋白质的市售老鼠，获得全部的人类抗体。也可使用经过设计产生更想要(例如全部的人类抗体)或更强免疫反应的转基因动物，产生人类化或人类抗体。这类技术的实例为得自Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM和得自Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-
Figure BSA00000643035000771
和TC MouseTM。
另外，也可以重组方式制造抗体，并使用现有技术中已知的任何方法表达。或者，可借着噬菌体展示技术以重组方式制造抗体。参见，例如美国专利第5,565,332号；5,580,717号；5,733,743号和6,265,150号；以及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。或者，可使用噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))在活体外从得自未免疫捐赠者的免疫球蛋白可变(V)功能部位基因节目中产生人类抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V功能部位基因以框架选殖到丝状噬菌体，如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因内，并以功能抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单股DNA副本，故以抗体的功能特性为基础的选择也导致选出编码表达那些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模仿B细胞的某些特性。可以各种格式进行噬菌体展示；关于回顾，参见例如Johnso，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。可使用数个来源的V-基因断片进行噬菌体展示。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)从衍生自免疫老鼠脾脏的V基因的小型随机综合库中分离出抗-恶唑酮抗体的多种阵列。可建构得自未免疫人类捐赠者的V基因的节目(repertoire)，并基本上依据由Mark等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBOJ.12：725-734(1993)描述的技术，分离对抗多种抗原阵列(包括自身-抗原)的抗体。在天然的免疫反应中，抗体基因以高速累积突变(体细胞的突变过高)。某些改变的导入，将赋予较高的亲和性，并在后续的抗原攻毒期间，展现出高-亲和性表面免疫球蛋白的B细胞优先复制和分化。可借着使用称为″链洗牌″的技术模仿该自然过程。Marks等人，Bio/Technol.10：779-783(1992)。在该方法中，可借着随后以获自未免疫捐赠者的V功能部位基因的天然存在变体之节目(节目们)置换重和轻链V区基因，改良经由噬菌体展示而获得的″原始″人类抗体的亲和性。该技术容许产生亲和性在pM-nM范围内的抗体和抗体片段。已经由Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)描述了制造极大噬菌体抗体节目(也称为″万库之母″)的策略。也可使用基因洗牌，从啮齿类抗体中衍生人类抗体，其中人类抗体具有与起始啮齿类抗体类似的亲和性和特异性。根据该方法，也称为″抗原决定位铭记″，以人类V功能部位基因的节目置换借着噬菌体展示技术获得的啮齿类抗体的重或轻链V功能部位基因，创造出啮齿类-人类嵌合体。抗原选择导致分离出能够恢复有功能的抗原-结合位置的人类可变区，即抗原决定位支配(铭记)了伙伴的选择。当重复该过程以便置换剩下的啮齿类V功能部位时，获得人类抗体(参见1993年4月1日发表的PCT公开第WO 93/06213号)。不像啮齿类抗体借着CDR移植的传统人类化作用，该技术提供了完整的人类抗体，没有啮齿类来源的框架或CDR残基。
虽然上文的讨论显然是关于人类化抗体，但所讨论的一般原则也适用于在例如狗、猫、灵长类、马和牛中定做的抗体。显然可混合在本文中描述之一或多种人类化抗体的方法，例如CDR移植、框架突变和CDR突变。
可借着先从宿主动物中分离抗体和产生抗体的细胞，获得基因序列，并使用该基因序列以重组方式在宿主细胞(例如CHO细胞)中表达抗体，以重组方式制造抗体。可使用其他方法在植物(例如烟草)或转基因牛奶中表达抗体序列。已经公开了在植物或乳汁中以重组方式表达抗体的方法。参见，例如Peeters等人，Vaccine 19：2756(2001)；Lonberg，N.和D.HuszarInt.Rev.Immunol 13：65(1995)；和Pollock等人，J.Immunol Methods231：147(1999)。制造抗体衍生物，例如人类化、单链等等的方法，为现有技术中已知的。
也可使用免疫测定和流动细胞计数分类技术，如萤光激活细胞分类(FACS)分离对NGF特异性的抗体。
抗体可与许多不同的载剂结合。载剂可以是有活性或惰性的。已熟知的载剂的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然和经过修改的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载剂的性质可以是可溶或不可溶的。本领域技术人员将知道其他适合与抗体结合的载剂，或将能够使用例行的实验探知这类载剂。在一些具体实施例中，载剂包括瞄准心肌的部分。
使用传统程序(例如通过使用能够特异性地与编码单克隆抗体的重和轻链的基因结合的寡核苷酸探针)，迅速地分离编码单克隆抗体的DNA，并测序。融合瘤细胞是这类DNA的最佳来源。一旦分离，便可将DNA放在表达载体(如在PCT公开第WO 87/04462号中公开的表达载体)内，然后将其转移感染到宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另行产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞内，在重组的宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。参见，例如PCT公开第WO 87/04462号。也可修改DNA，例如借着以人类重和轻链恒定功能部位的密码序列取代同源的老鼠序列，Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851(1984)，或借着共价连接免疫球蛋白密码序列与全部或部分的非免疫球蛋白多肽的密码序列。以此方式，制备具有本文的抗-NGF单克隆抗体的结合特异性的″嵌合型″或″杂种″抗体。
可使用现有技术中已熟知的方法定出抗-NGF拮抗剂抗体的特征。例如，一种方法是确认与其结合的抗原决定位，或″抗原决定位作图″。在现有技术中已知许多作图并定出在蛋白质上抗原决定位的位置特征的方法，包括解释抗体-抗原复合物的结晶结构、竞争性测定、基因片段表达测定和以合成肽为基础的测定，如同在例如Harlow and Lane，Using Antibodies，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999第11章中的描述。在另外的实例中，可使用抗原决定位作图判定抗-NGF拮抗剂抗体与之结合的序列。抗原决定位作图可购自各种来源，例如Pepscan系统(Edelhertweg 15，8219PH Lelystad，TheNetherlands)。抗原决定位可以是直线的抗原决定位，即包含在单片氨基酸中的，或借着氨基酸的三维交互作用形成的组态抗原决定位，其可能不一定包含在单片中。可分离或合成(例如以重组方式)不同长度的肽(例如至少4-6个氨基酸长)，并用在与抗-NGF拮抗剂抗体的结合测定中。在其他的实例中，可在借着使用衍生自NGF序列的部分重叠肽的系统筛选中，判定与抗-NGF拮抗剂抗体结合的抗原决定位，并借着抗-NGF拮抗剂抗体判定结合作用。根据基因片段表达测定，随机或借着特定遗传建构打破编码NGF的开放编阅框架，并判定所表达的NGF片段与欲测试的抗体的反应性。可借着例如PCR产生基因片段，然后在放射性氨基酸的存在下，在活体外转录并转译成蛋白质。然后借着免疫沉淀法和凝胶电泳，判定抗体与放射性标示的NGF片段的结合。也可借着使用在噬菌体颗粒表面上展示的大型随机肽序列库(噬菌体库)，确认某些抗原决定位。或者，可在简单的结合测定中，针对与受试抗体的结合，测试部分重叠肽片段的限定库。在另外的实例中，也可进行抗原结合功能部位的突变生成作用、功能部位交换实验和丙氨酸扫描突变生成作用，确认抗原结合所需、有资格及/或必要的残基。例如，可使用其中已经利用得自密切相关，但在抗原性上不同的蛋白质(如神经营养素蛋白质家族的其他成员)的序列置换(交换)各种NGF多肽片段的突变NGF，进行功能部位交换实验。借着评估抗体与突变NGF的结合作用，可评估特殊NGF片段对于抗体结合的重要性。
另一种可用来定出抗-NGF拮抗剂抗体的特征的方法，是使用利用已知与相同抗原，即在NGF上的各种片段结合的其他抗体的竞争性测定，判定抗-NGF拮抗剂抗体是否与与其他抗体相同的抗原决定位结合。竞争性测定为本领域技术人员已熟知的。可用在本发明的竞争性测定中的抗体的实例包括MAb 911、912、938，如同在Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)中描述的。
可使用表达载体直接表达抗-NGF拮抗剂抗体。本领域技术人员熟知表达载体的投药，以便获得外源蛋白质在活体内的表达。参见，例如美国专利第6,436,908号；6,413,942号和6,376,471号。表达载体的投药包括局部或全身性投药，包括注射、口服、颗粒枪或导管投药，以及局部投药。在其他的具体实施例中，直接对交感神经干或神经节给予表达载体，或给予冠状动脉、心房、心室或心包囊。
也可使用含有表达载体或次基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向输送。在例如Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff编辑)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述了受体-调解的DNA输送技术。在基因疗法草案中，关于局部投药，以大约100纳克到大约200毫克DNA的范围给予含有多核苷酸的治疗组合物。在基因疗法草案期间，也可使用大约500纳克到大约50毫克，大约1微克到大约2毫克，大约5微克到大约500微克，以及大约20微克到大约100微克DNA的浓度范围。可使用基因输送媒介输送治疗性多核苷酸和多肽。基因输送媒介可以是病毒或非病毒来源的(通常参见Jolly，Cancer GeneTherapy(1994)1：51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy (1995)1：185；以及Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148)。可使用内源的哺乳动物或异源的启动基因，诱导这类密码序列的表达。密码序列的表达可以是组成上或经调节的。
输送想要的多核苷酸，并在想要的细胞中表达的以病毒为基础的载体，为现有技术中已熟知的。以病毒为基础的媒介的实例包括，但不限于重组的逆转录病毒(参见，例如PCT公开第WO 90/07936号；WO94/03622号；WO 93/25698号；WO 93/25234号；WO 93/11230号；WO 93/10218号；WO 91/02805号；美国专利第5,219,740号和4,777,127号；英国专利第2,200,651号和欧洲专利第0345242号)、以α病毒为基础的载体(例如辛得比斯病毒(Sindbis virus)载体、胜利森林病毒(Semilikiforest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross Rivervirus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532))，以及腺病毒伴随病毒(AAV)载体(参见，例如PCT公开第WO 94/12649号；WO 93/03769号；WO 93/19191号；WO94/28938号；WO 95/11984号和WO 95/00655号)。也可使用在Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的与已杀死的腺病毒连接的DNA来投药。
也可使用非病毒输送媒介和方法，包括但不限于聚阳离子凝聚的DNA，与杀死的腺病毒连接或单独不与其连接(参见，例如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配体-连接的DNA(参见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核生物细胞输送媒介细胞(参见，例如美国专利第5,814,482号；PCT公开第WO 95/07994号；WO 96/17072号；WO95/30763号和WO 97/42338号)，以及核电荷中和作用或与细胞膜融合。也可使用裸露的DNA。在PCT公开第WO 90/11092号和美国专利第5,580,859号中描述了代表性的裸露DNA导入法。在美国专利第5,422,120号；PCT公开第WO 95/13796号；WO 94/23697号；WO 91/14445号和欧洲专利第0524968号中描述了可作为基因输送媒介的脂质体。在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述了额外的方法。
其他的NGF拮抗剂
可使用抗-NGF抗体以外的NGF拮抗剂(关于风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)。在本发明的一些具体实施例中，NGF拮抗剂包括至少一个能够阻断或减少有功能的NGF表达的反义分子。NGF的核苷酸序列是已知的，并可迅速地获自公开取得的数据库。参见，例如Borsani等人，Nuc.Acids Res.1990，18，4020；登录编号NM 002506；Ullrich等人，Nature303：821-825(1983)。例行地制备反义寡核苷酸分子，其将特异性地与NGFmRNA结合，但与其他多核苷酸没有交叉反应。代表性的瞄准位置包括，但不限于起始密码子、5′调节区、密码序列和3′未转译区。在一些具体实施例中，该寡核苷酸是大约10至100个核苷酸长、大约15至50个核苷酸长、大约18至25个核苷酸长或更长。该寡核苷酸可包括主链修改，像是例如现有技术中已熟知的硫代磷酸盐键合和2′-O糖修改。代表性的反义分子包括在美国公开第20010046959号中描述的NGF反义分子，也参见http://www.rna-tec.com/repair.htm。
在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂包括至少一个能够阻断或减少有功能的NGF受体(如TrkA及/或p75)表达的反义分子。Woolf等人，J.Neurosci.(2001)21(3)：1047-55；Taglialetela等人，J.Neurochem(1996)66(5)：1826-35。TrkA和p75的核苷酸序列是已知的，并可迅速地获自可公开取得的数据库。
或者，可使用现有技术中已熟知的基因剔除、吗啉并寡核苷酸、RNAi或核糖酵素法，减少NGF表达及/或释放及/或NGF受体表达。参见http://www.macalester.edu/～montgomery/RNAi.html                       ；http://pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage？topicID＝6.topic；http://www.highveld.com/ribozyme.html。
在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂包括至少一个NGF抑制化合物。当在本文中使用时，″NGF抑制化合物″意指抗-NGF抗体以外，直接或间接降低、抑制、中和或废除NGF生物活性的化合物。NGF抑制化合物应显示出任一或多项下列的特征：(a)与NGF结合并抑制NGF生物活性及/或由NGF发送信号功能调解的下游路径；(b)预防、改善或治疗任何方面的疼痛(如骨关节炎疼痛)；(c)阻断或减少NGF受体激活作用(包括TrkA受体二聚作用及/或自动磷酸化作用)；(d)增加NGF  清除；(e)抑制(降低)NGF合成、产生或释放。代表性的NGF抑制化合物包括在美国公开第20010046959号中描述的小分子NGF抑制剂；抑制NGF与p75结合的化合物，如在PCT公开第WO 00/69829号中的描述，以及由Colquhoun等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.310(2)：505-11(2004)描述的PD90780[7-(苯甲酰胺基)-4，9-二氢-4-甲基-9-氧基-吡唑并[5，1-b]喹唑啉-2-羧酸]；抑制NGF与TrkA及/或p75结合的化合物，如在PCT公开第WO 98/17278号中描述的。NGF抑制化合物的其他实例包括在PCT公开第WO 02/17914号和WO 02/20479号中；以及在美国专利第5,342,942号；6,127,401号和6,359,130号中描述的化合物。更多代表性的NGF抑制化合物是属于NGF竞争性抑制剂的化合物。参见美国专利第6,291,247号。此外，本领域技术人员可制备其他小分子的NGF抑制化合物。
在一些具体实施例中，NGF抑制化合物与NGF结合。代表性的标靶(结合)位置包括，但不限于NGF与TrkA受体及/或p75受体结合的部分，以及NGF紧邻受体-结合区，并一部分负责该受体-结合区的正确三维形状的那些部分。在另外的具体实施例中，NGF抑制化合物与NGF受体(如TrkA及/或p75)结合，并抑制NGF生物活性。代表性的标靶位置包括TrkA及/或p75与NGF结合的那些部分。
在包括小分子的具体实施例中，该小分子可具有大约100至20,000道尔吞、500至15,000道尔吞或1000至10,000道尔吞的分子量。小分子库是市售的。可使用现有技术中已知的任何方法给予小分子，包括吸入、腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、心室内、口服、经肠、非经肠、鼻内或经皮。通常，当根据本发明的NGF-拮抗剂是小分子时，以0.1至300毫克/千克患者体重的比例，分成1至3或更多个剂量投药。对于正常体重的成年患者，可给予范围从每个剂量1毫克到5克的剂量。
在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂包括至少一个NGF结构类似物。在本发明中，″NGF结构类似物″意指具有类似NGF一部分的3-维结构，且其在活体外或在活体内在生理学条件下与NGF受体结合的化合物，其中该结合至少部分地抑制了NGF生物活性。在一具体实施例中，NGF结构类似物与TrkA及/或p75受体结合。代表性的NGF结构类似物，包括但不限于在PCT公开第WO 97/15593号中描述的双环肽；在美国专利第6,291,247号中描述的双环肽；在美国专利第6,017,878号中描述的环状化合物；以及在PCT公开第WO 89/09225号中描述的NGF-衍生肽。也可设计适当的NGF结构类似物，并经由NGF-受体结合的分子塑型来合成，例如借着在PCT公开第WO 98/06048号中描述的方法。该NGF结构类似物可以是单体或二聚体/低聚物，按任何想要的相同或不同结构的组合，以便获得改善的亲和性和生物效力。
在其他的具体实施例中，本发明提供包括至少一个TrkA受体及/或p75受体的显性抑制突变体的NGF拮抗剂。本领域技术人员可制备例如TrkA受体的显性抑制突变体，使得该受体将与NGF结合，并因此作为捕捉NGFs的″沟槽″。然而，当与NGF结合时，该显性抑制突变体将没有TrkA受体的正常生物活性。代表性的显性抑制突变体包括，但不限于在下列参考文献中描述的突变体：Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，10884；Eide等人，J.Neurosci.1996，16，3123；Liu等人，J.Neurosci 1997，17，8749；Klein等人，Cell 1990，61，647；Valenzuela等人，Neuron 1993，10，963；Tsoulfas等人，Neuron 1993，10，975；和Lamballe等人，EMBOJ.1993，12，3083，分别以引用的方式全部并入本文中。可以蛋白质形式或以表达载体的形式，给予显性抑制突变体，而得以在活体内表达该显性抑制突变体，例如突变的TrkA受体。可使用任何现有技术中已知的方法，如腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、心室内、口服、经肠、非经肠、鼻内、经皮或借着吸入，给予该蛋白质或表达载体。例如，表达载体的投药包括局部投药或全身性的投药，包括注射、口服、颗粒枪或导管投药和局部投药。本领域技术人员熟悉表达载体的投药，以便获得外源蛋白质在活体内的表达。参见，例如美国专利第6,436,938号；6,413,942号和6,376,471号。
也可使用含有反义多核苷酸、表达载体或次基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向输送。在例如Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct GeneTransfer(J.A.Wolff编辑)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述了受体-调解的DNA输送技术。在基因疗法草案中，关于局部投药，以大约100纳克到大约200毫克DNA的范围给予含有多核苷酸的治疗组合物。在一些具体实施例中，在基因疗法草案期间，也可使用大约500纳克到大约50毫克，大约1微克到大约2毫克，大约5微克到大约500微克，以及大约20微克到大约100微克DNA或更多的浓度范围。可使用基因输送媒介输送本发明的治疗性多核苷酸和多肽。基因输送媒介可以是病毒或非病毒来源的(通常参见Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1：185；以及Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148)。可使用内源的哺乳动物或异源的启动基因及/或促进子，诱导这类密码序列的表达。密码序列的表达可以是组成上或经调节的。
输送想要的多核苷酸，并在想要的细胞中表达的以病毒为基础的载体，为现有技术中已熟知的。以病毒为基础的媒介的实例包括，但不限于重组的逆转录病毒(参见，例如PCT公开第WO 90/07936号；WO94/03622号；WO 93/25698号；WO 93/25234号；WO 93/11230号；WO93/10218号；WO 91/02805号；美国专利第5,219,740号和4,777,127号；英国专利第2,200,651号和欧洲专利第0345242号)、以α病毒为基础的载体(例如辛得比斯病毒(Sindbis virus)载体、胜利森林病毒(Semiliki forestvirus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCCVR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCCVR-532))，以及腺病毒伴随病毒(AAV)载体(参见，例如PCT公开第WO94/12649号；WO 93/03769号；WO 93/19191号；WO 94/28938号；WO95/11984号和WO 95/00655号)。也可使用在Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的与已杀死的腺病毒连接的DNA来投药。
也可使用非病毒输送媒介和方法，包括但不限于聚阳离子凝聚的DNA，与杀死的腺病毒连接或单独不与其连接(参见，例如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配体-连接的DNA(参见，例如Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核生物细胞输送媒介细胞(参见，例如美国专利第5,814,482号；PCT公开第WO 95/07994号；WO 96/17072号；WO95/30763号和WO 97/42338号)，以及核电荷中和作用或与细胞膜融合。也可使用裸露的DNA。在PCT公开第WO 90/11092号和美国专利第5,580,859号中描述了代表性的裸露DNA导入法。在美国专利第5,422,120号；PCT公开第WO 95/13796号；WO 94/23697号；WO 91/14445号和欧洲专利第0524968号中描述了可作为基因输送媒介的脂质体。在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述了额外的方法。
也可使用表达载体，直接表达任何在本文中描述的以蛋白质为基础的NGF拮抗剂(例如抗-NGF抗体、TrkA免疫黏附素等等)。例如，其他能够阻断(部分到全部阻断)NGF及/或NGF生物活性的TrkA受体片段为现有技术已知的。
在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂包括至少一个TrkA免疫黏附素。在本文中使用的TrkA免疫黏附素意指可溶性嵌合型分子，包括TrkA受体的细胞外功能部位和免疫球蛋白序列，其仍保留了TrkA受体的结合特异性(实质上保留了trkA受体的结合特异性)，并能够与NGF结合。
TrkA免疫粘附素为现有技术中已知的，并已经发现其阻断NGF与TrkA受体的结合。参见，例如美国专利第6,153,189号。Brennan等人报告了在手术后疼痛的大鼠模式中给予TrkA免疫黏附素。参见Society forNeuroscience Abstracts 24(1-2)880(1998)。在一具体实施例中，TrkA免疫粘附素包括得自能够与NGF结合的TrkA细胞外功能部位的TrkA受体氨基酸序列(或其一部分)(在一些具体实施例中，该氨基酸序列实质上保留了trkA受体的结合特异性)与免疫球蛋白序列的融合。在一些具体实施例中，该TrkA受体是人类TrkA受体序列，并与免疫球蛋白恒定功能部位序列融合。在其他的具体实施例中，免疫球蛋白恒定功能部位序列是免疫球蛋白重链恒定功能部位序列。在另外的具体实施例中，两个TrkA受体-免疫球蛋白重链融合的结合(例如经由二硫键(们)的共价键合)，导致同源二聚的类免疫球蛋白结构。免疫球蛋白轻链可进一步与在二硫-键结的二聚体中一或两个TrkA受体-免疫球蛋白嵌合体结合，产生同源三聚或同源四聚的结构。适当的TrkA免疫粘附素的实例包括在美国专利第6,153,189号中描述的那些。
在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂包括至少一个能够阻断、压抑、改变及/或降低NGF与TrkA受体的物理交互作用，及/或下游发送信号的抗-TrkA抗体，借此降低及/或阻断NGF生物活性。抗-TrkA抗体是现有技术中已知的。代表性的抗-TrkA抗体包括在PCT公开第WO 97/21732号、WO 00/73344号、WO 02/15924号和美国公开第20010046959号中描述的那些。
在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂包括至少一个能够阻断、压抑及/或降低NGF与p75受体的物理交互作用，及/或下游发送信号的抗-p75抗体，借此降低及/或阻断NGF生物活性。
在另外的具体实施例中，NGF拮抗剂包括至少一个能够抑制下游激酶发送与TrkA及/或p75受体活性有关的信号的激酶抑制剂。代表性的激酶抑制剂是K252a或K252b，其为现有技术中已知的，并在Knusel等人，J.Neurochem.59：715-722(1992)；Knusel等人，J.Neurochemistry 57：955-962(1991)；Koizumi等人，J.Neuroscience 8：715-721(1988)；Hirata等人，Chemical Abstracts 111：728，XP00204135，参见摘要和第12版Collective Chemical Substance Index，第3423页，c.3(48-50，52-53)；以及美国专利第6,306,849号中描述。
若临床医师需要，也期待确认许多其他种类的NGF拮抗剂。
确认NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)
可使用现有技术中已知的方法，确认并表征NGF拮抗剂(包括抗-NGF拮抗剂抗体)的特征，借此检测及/或测量NGF生物活性的降低、改善或中和。可使用在PCT WO 04/065560中描述的方法。可使用其他方法，例如在美国专利第5,766,863号和5,891,650号中描述的激酶受体激活(KIRA)测定，来确认抗-NGF制剂。该ELISA-型的测定适合定性或定量测量激酶活性，借着测量受体蛋白质酪氨酸激酶(在后文中称为″rPTK″)，如TrkA受体的激酶功能部位的自我磷酸化作用，并确认和定出所选的rPTK，例如TrkA可能拮抗剂的特征。测定的第一阶段涉及激酶受体，例如TrkA受体的激酶功能部位的磷酸化作用，其中该受体出现在真核生物细胞的细胞膜中。该受体可以是内源的受体或编码受体的核酸，或可转化至细胞内的受体构筑体。通常，以实质上均质的这类细胞族群(通常是哺乳动物细胞株)涂覆第一个固相(例如第一个测定盘的壁)，使细胞粘着在固相上。通常，细胞是有粘性的，并借此自然地粘在第一个固相上。若使用″受体构筑体″，其通常包括激酶受体和flag多肽的融合。flag多肽被在测定的ELISA部分中的捕捉剂，通常是捕捉抗体认出。然后在含有粘附细胞的孔中，与NGF一起加入分析物，如候选的NGF拮抗剂(包括抗-NGF拮抗剂抗体)，使酪氨酸激酶受体(例如TrkA受体)暴露在NGF和分析物下(或与其接触)。该测定能够确认抑制由其配体NGF激活TrkA的作用的拮抗剂(包括抗体)。在与NGF和分析物接触之后，使用溶解缓冲溶液(其具有促溶的去垢剂)使粘附的细胞溶解，并温和地搅拌，借此释放出细胞的溶胞产物，可使其直接接受测定的ELISA部分，不需浓缩或使细胞溶胞产物澄清。
然后准备使如此制备的细胞溶胞产物接受测定的ELISA阶段。在ELISA阶段的第一个步骤中，以捕捉剂(通常是捕捉抗体)涂覆第二个固相(通常是ELISA微量滴定盘的壁)，该捕捉剂特异性地与酪氨酸激酶受体结合，或在受体构筑体的案例中与flag多肽结合。完成第二个固相的涂覆，使得捕捉剂粘在第二个固相上。捕捉剂通常是单克隆抗体，但如同在本文实例中的描述，也可使用多克隆抗体。然后使所获得的细胞溶胞产物暴露或与已粘着的捕捉剂接触，使得该受体或受体构筑体粘在(或被捕捉到)第二个固相上。然后进行冲洗步骤，以便移除未结合的细胞溶胞产物，留下被捕捉到的受体或受体构筑体。然后使粘住或被捕捉到的受体或受体构筑体暴露或与抗-磷酸酪氨酸抗体接触，其确认在酪氨酸激酶受体中磷酸化了的酪氨酸残基。在一具体实施例中，抗-磷酸酪氨酸抗体(直接或间接)与催化非放射性颜色试剂的颜色变化的酵素共轭。因此，可借着后续试剂的颜色变化来测量受体的磷酸化作用。酵素可与抗-磷酸酪氨酸抗体直接结合，或与与抗-磷酸酪氨酸抗体共轭的共轭分子(例如生物素)结合，且该酵素后续可经由共轭分子与抗-磷酸酪氨酸抗体结合。最后，借着例如颜色试剂的颜色变化，来测量与捕捉受体或受体构筑体结合的抗-磷酸酪氨酸抗体。
也可借着将候选制剂与NGF一起培养，并监视任一或多项的下列特征，来确认NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)：(a)与NGF结合并抑制NGF生物活性或由NGF发送信号功能调解的下游路径；(b)抑制、阻断或减少NGF受体激活作用(包括TrkA二聚作用及/或自我磷酸化作用)；(c)增加NGF的清除；(d)治疗或预防任何方面的风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛；(e)抑制(降低)NGF合成、产生或释放。在一些具体实施例中，可借着将候选制剂与NGF一起培养，并监视结合及/或附带的NGF生物活性之降低或中和作用，来确认NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)。可利用经过纯化的NGF多肽(们)，或利用天然表达或经过转移感染而得以表达NGF多肽(们)的细胞，来进行结合测定。在一具体实施例中，该结合测定是竞争性结合测定，其中评估候选制剂(如抗体)与已知的抗-NGF拮抗剂抗体竞争与NGF结合的能力。可以各种格式进行测定，包括ELISA格式。在其他的具体实施例中，借着将候选制剂与NGF一起培养，并监视结合及附带的trkA受体二聚作用及/或自我磷酸化作用的抑制作用，来确认NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。
在初步确认之后，可进一步借着已知用于测试靶向生物活性的生物测定，证实并改进候选抗-NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)的活性。或者，可使用生物测定直接筛选候选者。例如，NGF在反应性细胞中促进了许多在形态学上可认知的改变。这些包括，但不限于促进了PC12细胞的分化，并增加来自这些细胞的轴突的生长(Greene等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.73(7)：2424-8，1976)，促进轴突从反应性感觉和交感神经节的移植物中长出(Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.Nerve growth factor.Physiol.Rev.48：534-569，1968)，并促进NGF依赖性神经元，如胚胎背根神经节、三叉神经节或交感神经节神经元的存活(例如Chun & Patterson，Dev.Biol.75：705-711，(1977)；Buchman & Davies，Devrlopment 118：989-1001(1993))。因此，抑制NGF生物活性的测定需要将NGF反应性细胞与NGF加分析物，如候选的NGF拮抗剂(包括抗-NGF拮抗剂抗体)一起培养。在适当的时间之后，将测量细胞反应(细胞分化、轴突长出或细胞存活)。
也可根据Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)中的描述，借着在胚胎大鼠背根神经节存活生物测定中，监视候选制剂抑制NGF调解的存活的能力，来评估候选的NGF拮抗剂(包括抗-NGF拮抗剂抗体)阻断或中和NGF的生物活性的能力。
在本发明的方法中使用的组合物
在本发明方法中使用的组合物(适合风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)，包括有效用量的NGF拮抗剂(如抗-NGF抗体)，且在某些具体实施例中，还包括在药学上可接受的赋形剂。在一些具体实施例中，该组合物适用于在本文中描述的任何方法中。这类组合物的实例，以及如何调配，也描述在较早的章节和后文中。在一具体实施例中，该组合物包括NGF拮抗剂。在另一具体实施例中，该组合物包括一或多个NGF拮抗剂。在其他的具体实施例中，该组合物包括一或多个选自下列任一或多项的NGF拮抗剂：与NGF结合(在物理上产生交互作用)的拮抗剂(例如抗体)、与NGF受体(如TrkA及/或p75受体)结合的拮抗剂，以及降低(妨碍及/或阻断)下游NGF受体发送信号的拮抗剂。在另外的具体实施例中，该组合物包括任何不是TrkA免疫黏附素的NGF拮抗剂(即TrkA免疫黏附素以外的)。在其他的具体实施例中，该组合物包括任何抗-NGF抗体以外的NGF拮抗剂。在另外的具体实施例中，该组合物包括任何TrkA免疫黏附素和抗-NGF抗体以外的NGF拮抗剂。在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂抑制(降低)NGF合成、产生或释放。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂与NGF结合，且不明显地与相关神经营养素(如NT3、NT4/5及/或BDNF)产生交叉-反应。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂不与有害的免疫反应结合。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂选自抗-NGF抗体、针对NGF的反义分子(包括针对编码NGF的核酸的反义分子)、针对NGF受体(如TrkA及/或p75)的反义分子、NGF抑制化合物、NGF结构类似物、与NGF结合的TrkA受体的显性抑制突变、TrkA免疫黏附素、抗-TrkA抗体、抗-p73抗体和激酶抑制剂所组成的组。在其他的具体实施例中，NGF拮抗剂是抗-NGF抗体。在其他的具体实施例中，抗-NGF抗体识别人类NGF。在一些具体实施例中，抗-NGF抗体是人类。在另外的具体实施例中，抗-NGF抗体是人类化的(如在本文中描述的抗体E3)。在另一具体实施例中，抗-NGF抗体包括恒定区，其不诱发不想要或不希望的免疫反应，如抗体-调解的溶解或ADCC。在其他的具体实施例中，抗-NGF抗体包括抗体E3的一或多个CDR(s)(如1、2、3、4、5，或在一些具体实施例中，得自E3的全部6个CDRs)。
组合物当然可包括一个以上的NGF拮抗剂。例如，组合物可包括一种NGF拮抗剂中一个以上的成员(例如抗-NGF抗体的混合物，其识别NGF不同的抗原决定位)，以及不同种类NGF拮抗剂的成员们(例如抗-NGF抗体和NGF抑制化合物)。其他代表性的组合物包括一种以上的抗-NGF抗体，其识别相同的抗原决定位(们)，不同物种的抗-NGF抗体，其与NGF不同的抗原决定位结合，或不同的NGF抑制化合物。
在本发明中使用的化合物更可包括在药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins，编辑K.E.Hoover)，以冷冻干燥调配物或水溶液的形式。在本文中进一步说明在药学上可接受的赋形剂。
NGF拮抗剂及其组合物也可与其他制剂并用，用以提高及/或补充该制剂的效力。对于骨关节炎疼痛，NGF拮抗剂可连同一或多个其他的止痛剂、NSAIDS或类固醇一起给药。止痛剂包括，但不限于对乙酰胺基酚(acetaminophen)、曲马朵(tramadol)、辣椒素(capsaicin)(局部的)。NSAIDS的实例是乙酰水杨酸盐类，包括阿斯匹灵；非乙酰水杨酸盐类，包括双水杨酸酯(salsalate)、双氟尼酸(diflunisal)；乙酸类，包括依托度酸(etodolac)、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)；丙酸类，包括苯氧苯丙酸(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、萘普生钠、丙嗪(oxaprozin)；芬那酸盐类(fenamates)，包括甲氯芬那酸盐(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamicacid)；保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)；COX-2抑制剂，包括希乐葆(celecoxib)、万克适(etoricoxib)、伐地考昔(valdecoxib)、伟克适(rofecoxib)、鲁米雷昔(lumiracoxib)。类固醇的实例是关节内的皮质类固醇(IACs)。
为了治疗风湿性关节炎疼痛，NGF拮抗剂可与一或多个其他的止痛剂、NSAIDS、皮质类固醇(例如脱氢可的松)或其他的疾病修改抗-风湿药物一起给药。疾病修改抗-风湿药物的实例为胺甲碟呤、羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、TNF抑制剂、可溶性介白素-1受体、金-共轭物、细胞毒性制剂(硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、环孢灵A)。
NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)的投药
可经由任何适当的路径，将NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)给予个体(风湿性关节炎和骨关节炎)。本领域技术人员应知晓在本文中描述的实例并非企图限制，仅为了解释可利用的技术。因此，在一些具体实施例中，根据已知的方法将NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体给予个体，如静脉内投药，例如以积储注射或借着在一段时间内连续输液，借着肌肉内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、舌下、滑液囊内、经由吹入、鞘内、口服、吸入或局部路径。投药可以是全身的，例如静脉内投药或局部的。市售的雾化器适合液体调配物，包括喷射雾化器和超音波雾化器均可用以投药。可将液体调配物直接雾化，并可在重组之后将冷冻干燥的粉末雾化。或者，可使用氟碳调配物和定量剂量吸入器将NGF拮抗剂(抗-NGF拮抗剂抗体)气溶胶化，或以冷冻干燥和磨细的粉末形式吸入。
在一具体实施例中，经由位置-特异性的或瞄准局部的输送技术，给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。位置-特异性的或局部靶向技术的实例，包括各种可植入的NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)的积储来源或局部输送导管，如输液套管、留置套管或针头套管、合成的移植物、外膜包覆物、吻合器或支架，或其他可植入的装置、位置特异性的载剂、直接注射或直接涂抹。参见，例如PCT公开第WO 00/53211号和美国专利第5,981,568号。
可使用NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)的各种调配物来进行投药。在一些具体实施例中，可单纯给予NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。在一些具体实施例中，NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)和在药学上可接受的赋形剂可以在各种调配物中。在药学上可接受的赋形剂为现有技术中已知的，并为相对上惰性的物质，其有助于给予在药理学上有效的物质。例如，赋形剂可提供形状或浓度，或作为稀释剂。适当的赋形剂包括，但不限于稳定剂、湿润剂和乳化剂、改变渗透压的盐类、包胶制剂、缓冲剂和皮肤穿透促进剂。在Remington，The Science and Practice ofPharmacy第20版Publishing(2000)中陈述了非经肠和经肠药物输送的赋形剂和调配物。
在一些具体实施例中，将这些制剂调配成借着注射投药(例如腹腔内、静脉内、皮下、肌肉内等等)的。因此，可将这些制剂与在药学上可接受的媒剂混合，如生理盐水、林格氏液、右旋糖溶液及其类似物。特殊的剂量摄生法，即剂量、给药时间和重复次数，将视特殊的个体和个体的医学病史而定。
可使用任何适当的方法，给予抗-NGF拮抗体，包括借着注射(例如腹腔内、静脉内、皮下、肌肉内等等)。也可经由吸入给予抗-NGF抗体，如同在本文中描述的。通常，为了给予抗-NGF抗体，一开始的候选剂量可以是大约2毫克/千克。为了本发明，典型的每日剂量范围可从大约0.1微克/千克到1微克/千克，到3微克/千克，到30微克/千克到300微克/千克到3毫克/千克，到30毫克/千克，到100毫克/千克或更多，视上文提及的因素而定。例如，可以大约1微克/千克、大约10微克/千克、大约20微克/千克、大约50微克/千克、大约100微克/千克、大约200微克/千克、大约500微克/千克、大约1毫克/千克或大约2毫克/千克给予抗-NGF抗体。至于在数天或更长的时间内重复给药，视情况而定，持续治疗直到出现想要的症状抑制，或直到达到充分的治疗程度以便降低疼痛。代表性的给药摄生法包括给予大约2毫克/千克的起始剂量，接着是大约1毫克/千克的抗-NGF抗体的每周维持剂量，或接着是大约1毫克/千克每隔一周的维持剂量。然而，也可使用其他的给药摄生法，视医师希望达到的药物动力学衰退模式而定。例如，在一些具体实施例中，期待每周给药四次。也可使用更低频率的给药。在一些具体实施例中，每2周、每3周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每15周、每20周、每25周或更久给予抗-NGF抗体。在一些具体实施例中，每1个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月或更久一次抗-NGF抗体给药。借着传统的技术和测定轻易地监视该疗法的进行。可在一段时间内改变给药摄生法(包括所使用的NGF抑制剂(们))。
在患有膝盖骨关节炎之中等疼痛到严重疼痛的患者中进行研究(在实例9中概述)，证实范围在3至300微克/千克的剂量提供了不同期间的疼痛减轻。所有受试的剂量(3、10、30、100和300微克/千克)产生疼痛降低至少7天；较高的剂量导致延长的疼痛减轻至少28天(图24)。100微克/千克的剂量产生至少80天的疼痛减轻(图25)。
通常，当NGF拮抗剂不是抗体时，(在一些具体实施例中)可以大约0.1到300毫克/千克患者体重的比例，分成1至3个剂量，或按照在本文中公开的给药。在一些具体实施例中，对于正常体重的成年患者，可给予从大约0.3到5.00毫克/千克的剂量。特殊的给药摄生法，即剂量、给药时间和重复次数，将视特殊个体和个体的医学病史，以及个别制剂的特性(如制剂的半衰期和现有技术中已熟知的其他考量)而定。
为了本发明，NGF拮抗剂(包括抗-NGF拮抗剂抗体)的适当剂量，将视所使用的NGF拮抗剂(或其组合物)、待治疗的疼痛的类型和严重性、该制剂是否为了预防或治疗目的而给予、先前的疗法、患者的临床病史和对该制剂的反应，以及临床医师的判断而定。通常，临床医师将给予NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)，直到达到获得想要的结果的剂量为止。可在治疗期间内改变剂量及/或频率。
经验上的考量，如半衰期，通常将助成剂量的判定。例如，可使用可与人类免疫系统相容的抗体，如人类化抗体或完整的人类抗体，延长抗体的半衰期，并防止抗体被宿主的免疫系统攻击。可在疗程中判定并调整投药频率，且通常但不一定以治疗及/或压抑及/或改善及/或延迟疼痛为基础。或者，NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)的持续连续释放调配物可能是适合的。各种达到持续释放的调配物和装置均为现有技术中已知的。
在一具体实施例中，可凭经验在已经给予一或多种NGF拮抗剂投药的个体中判定NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)的剂量。给予个体增加的NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)剂量。欲评估NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)的效力，可追踪疼痛的指标。
可连续或间断地根据本发明的方法给予NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)，例如视接受者的生理学状况、投药目的是否为治疗或预防性，以及熟练的医师已知的其他因素而定。NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)的投药基本上可能是在预先选择的时间内连续的，或可以是一连串分开的剂量，例如在发展出疼痛之前、期间或之后，发展出疼痛之前、期间、之前和之后、期间和之后，或之前、期间和之后。
在一些具体实施例中，可出现一个以上的NGF拮抗剂，如抗-NGF拮抗剂抗体。可出现至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个不同的，或更多个NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)。通常那些NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)具有互补的活性，彼此没有不利的影响。NGF拮抗剂也可与其他制剂并用，用来促进该制剂的效力及/或与其互补。
以冷冻干燥调配物或水溶液的形式，借着将具有想要纯度的NGF拮抗剂(例如抗体)与任意的在药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版MackPublishing(2000))混合，来制备根据本发明来使用，并可储存的NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)的治疗调配物。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂是在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒性的，并可褒括缓冲溶液，如磷酸、柠檬酸及其他有机酸类；盐类，如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯苄烷铵(benzalkonium chloride)；苄索氯铵(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间-甲酚)；低分子量(低于大约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或离氨酸；单醣类、双醣类和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；及/或非离子界面活性剂，如吐温TM、普罗尼克(PLURONICS)TM或聚乙二醇(PEG)。
可借着现有技术中已知的方法制备含有NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)的脂质体，如在Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；和美国专利第4,485,045号和4,544,545号中描述的。在美国专利第5,013,556号中公开了具有增加循环时间的脂质体。可借着逆向蒸发法，利用由磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)组成的脂质组合物，来产生特别有用的脂质体。通过具有限定孔隙尺寸的滤纸挤出脂质体，产生具有想要直径的脂质体。
也可使活性成分陷入微胶囊中，例如借着凝聚技术或借着界面聚合作用来制备，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(异丁烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物输送系统(例如脂质体、白蛋白中心体、微滴乳状液、奈米-颗粒和奈米胶囊)或粗滴乳状液中。在Remington：The Science andPractice of Pharmacy第20版Mack Publishing(2000)中公开了这类技术。
可制备持续释放的制备物。持续-释放制备物的适当实例包括半通透基质的固体疏水性聚合物，其中含有拮抗剂(如抗体)，该基质为有形状的物件，如薄膜或微胶囊。持续-释放的基质的实例包括聚酯类、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙里德(leuprolide acetate)所组成的注射用中心体)、蔗糖醋酸异丁酸酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
可用于活体内投药的调配物必须是无菌的。这可借着例如通过无菌过滤膜过滤而轻易地完成。通常将治疗用的NGF拮抗剂(例如抗-NGF拮抗剂抗体)组合物放在具有无菌接近孔的容器，例如静脉内溶液袋，或具有可被皮下注射针头贯穿的塞子的小瓶中。
根据本发明的组合物可以是单位剂量形式，如锭剂、药丸、胶囊、粉末、颗粒、溶液或悬浮液，或栓剂，以供口服、非经肠或直肠投药，或借着吸入或吹入投药。
为了制备固体组合物，如锭剂，将主要的活性成分与药学载剂，例如传统压制锭剂的成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其他的药学稀释剂，如水混合，形成固体配方前(preformulation)组合物，其含有本发明化合物或其无毒性在药学上可接受的盐的均质混合物。当说这些配方前组合物是均质的时，意指活性成分均匀地分布在整个组合物中，而得以迅速地将该组合物细分成同样有效的单位剂量形式，如锭剂、药丸和胶囊。然后将该固体配方前组合物细分成上述类型的单位剂量形式，含有从0.1到大约500毫克的本发明的活性成分。可涂覆或另行调配该新颖组合物的锭剂或药丸，提供足以提供延长作用之优点的剂量形式。例如，锭剂或药丸可包括内层剂量和外层剂量组份，后者为覆盖前者的封套形式。可借着肠衣层分开两种组份，其用以抵抗胃中的分解，并容许内层组份完整地通过进入十二指肠或延迟释放。这类肠衣层或涂料可使用各种材料，包括各种聚合酸，以及聚合酸与紫胶片、鲸蜡醇和醋酸纤维素的类材料的混合物。
适当的界面活性剂特别包括，非离子制剂，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如吐温TM20、40、60、80或85)和其他脱水山梨糖醇(例如斯盘(Span)TM20、40、60、80或85)。带有界面活性剂的组合物，将便利地包括0.05到5％之间的界面活性剂，并可在0.1到2.5％之间。将知晓若需要可加入其他的成分，例如甘露糖醇或其他在药学上可接受的媒剂。
可使用市售的脂肪乳剂，如英脱利匹特(Intralipid)TM、利波赛(Liposyn)TM、英肪纽醇(Infonutrol)TM、力保脂宁(Lipofundin)TM和力匹非森(Lipiphysan)TM制备适当的乳剂。可将活性成分溶解于预先混合的乳剂组合物中，或者可将其溶解在油(例如大豆油、红花油、棉子油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，并将所形成的乳剂与磷脂(例如蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合。将知晓可加入其他成分，例如甘油或葡萄糖，调整乳剂的张力。适当的乳剂通常将含有高达20％的油，例如在5到20％之间。脂肪乳剂可包括0.1到1.0微米之间的脂肪小滴，特别是在0.1到0.5微米之间，并具有范围在5.5到8.0的pH值。
乳剂组合物可以是借着混合NGF拮抗剂(如神经生长因子抗体)与英脱利匹TM或其组份(大豆油、蛋磷脂、甘油和水)制备的那些。
吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的含水或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可含有适当的在药学上可接受的赋形剂，如同上文陈述的。在一些具体实施例中，为了局部或全身性作用，借着口或鼻呼吸路径给予该组合物。可借着使用气体，将在适当无菌的、在药学上可接受的溶剂中的组合物雾化。可直接从雾化装置中呼吸雾化了的溶液，或可将雾化装置附接面罩、帐篷或间歇性正压的呼吸机器。最好是经口或鼻，从以适当方式输送调配物的装置中给予溶液、悬浮液或粉末组合物。
可借着现有技术中已熟知的方法评估治疗效力。
包括本发明的抗体或多核苷酸的试剂盒
本发明也提供包括抗体或多肽的试剂盒，用来检测及/或治疗。因此，在一些具体实施例中，该试剂盒包括抗体E3。在一些具体实施例中，该试剂盒包括在本文中描述的任何抗体或多肽。
另一方面，可使用试剂盒进行在本文中描述的任何方法，包括例如治疗有疼痛(包括手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛)的个体。可适当地包装本发明的试剂盒，并可视需要提供额外的组份，如缓冲溶液和在本文中描述的任何方法中使用抗体的说明书。在一些具体实施例中，试剂盒包括治疗疼痛的说明书。在一些具体实施例中，试剂盒包括在本文中描述的抗-NGF拮抗剂抗体，以及在个体中治疗及/或预防风湿性关节炎疼痛的说明书。在其他的具体实施例中，试剂盒包括在本文中描述的NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)，以及在个体中治疗及/或预防骨关节炎疼痛的说明书。在一些具体实施例中，该抗-NGF拮抗剂抗体是抗体E3。
另一方面，本发明提供包括编码如在本文中描述的E3多肽的多核苷酸的试剂盒。在一些具体实施例中，该试剂盒还包括在本文中描述的任何方法中使用该多核苷酸的说明书。
调整抗体的亲和性的方法，以及定出CDR特征的方法
我们已经发展出定出抗体的CDR的特征，及/或改变(例如改善)多肽，如抗体的结合亲和性的新颖方法，称为″库扫描突变生成作用″。通常，如下进行库扫描突变生成作用。使用现有技术认可的方法，以二或多个(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸取代在CDR中的一或多个氨基酸位置。这产生小型纯种系库(在一些具体实施例中，每个氨基酸位置分析一次)，各有二或多个成员的复杂性(若在每个位置有二或多个氨基酸被取代)。通常，该库也包括由本来的(未经取代的)氨基酸所组成的纯种系。针对与标靶多肽的结合亲和性，从每个库中筛选出少数的纯种系，例如大约20-80个纯种系(视库的复杂性而定)，并确认具有增加、相同、降低或无结合的候选者。判定结合亲和性的方法是现有技术中已熟知的。在一些具体实施例中，使用BIAcore表面等离子体激光共振分析，判定结合亲和性，其检测在大约2-倍或更高的结合亲和性上的差异。当起始的抗体业已以相对较高的亲和性，例如大约10nM或更低的KD结合时，BIAcore是特别有用的。在本文的实例中描述了使用BIAcore表面等离子体激光共振的筛选。
在其他的具体实施例中，使用Kinexa Biocensor闪烁接近测定、ELISA、ORIGEN免疫测定(IGEN)、萤光猝灭、萤光转移及/或酵母菌展示，判定结合亲和性。在其他的具体实施例中，使用适当的生物测定筛选结合亲和性。
在一些具体实施例中，使用现有技术认可的突变生成方法(在本文中描述其中一些)，以全部20个天然氨基酸取代在CDR中的每个氨基酸位置(在一些具体实施例中，一次一个)。这产生小型纯种系库(在一些具体实施例中，每个氨基酸位置分析一次)，各有20个成员的复杂性(若在每个位置均取代全部20个氨基酸)。
在一些具体实施例中，欲筛选的库包括在二或多个位置处取代，其可以是在相同的CDR或在二或多个CDRs中。因此，在一些具体实施例中，该库包括在一CDR中之二或多个位置处的取代。在其他的具体实施例中，该库包括在二或多个CDRs中之二或多个位置处的取代。在另外的具体实施例中，该库包括在二、三、四、五或六个CDRs中找到的3、4、5或更多位置处的取代。在一些具体实施例中，使用低重复性的密码子来准备取代。参见，例如Balint等人，(1993)Gene 137(1)：109-18的表2。
在一些具体实施例中，该CDR为CDRH3及/或CDRL3。在其他的具体实施例中，该CDR为一或多个CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及/或CDRH3。在一些具体实施例中，该CDR为Kabat CDR、Chothia CDR或衍生的CDR。
可定序具有改善结合的候选者，借此确认结果改善了亲和性的CDR取代突变体(也称为″改善的″取代)。例如，如同在实例1中证实的，使用该方法容许确认改善结合的单一取代，即使是在相同氨基酸位置处已确立的18个其他取代未导致结合(即丧失抗体功能)。也可定序结合的候选者，以便确认仍保持结合的CDR取代。
在一些具体实施例中，进行多次的筛选。例如，具有改善结合的候选者(分别包括一或多个CDR之一或多个位置的氨基酸取代)也可用来设计第二个库，在每个改善的CDR位置(即CDR中的氨基酸位置，在那里取代突变体显示出改善的结合)含有至少一个原始和经取代氨基酸。在下文进一步讨论该库的制备和筛选或选择。
库筛选突变生成作用也提供定出CDR特征的方法，只要有改善结合、相同结合、减少结合或无结合的纯种系的频率，也提供关于每个氨基酸位置对抗体-抗原复合物的稳定性的重要性的信息即可。例如，若CDR位置在变成全部20个氨基酸时仍保持结合，便确认该位置不可能是抗原结合所必需的。相反的，若CDR位置仅在一小部分取代时保持结合，则确认该位置是对CDR功能是很重要的位置。因此，库扫描突变生成法产生了与在CDRs中可变成许多不同氨基酸(包括全部20个氨基酸)的位置，以及在CDRs中不能改变，或仅能变成少数氨基酸的位置有关的信息。在实例1中讨论该观点并举例说明。
在一些具体实施例中，在第二个库中混合具有改善亲和性的候选者，其在位置上包括改良的氨基酸、原始的氨基酸，且可在位置上进一步包括额外的取代，视想要的库复杂性或准许使用的想要筛选或选择方法而定。此外，若需要可将邻近氨基酸位置随机化成至少二或多个氨基酸。邻近氨基酸的随机化，可容许在突变CDR中有额外组态上的弹性，其可转而容许或有助于导入较大数量的改善突变。在一些具体实施例中，该库也包括在第一轮筛选时未显示出改善亲和性的位置处的取代。
使用现有技术中已知的任何方法，包括使用BIAcore表面等离子体激光共振分析，就带有改善及/或改变结合亲和性的库成员，筛选或选择第二个库，并使用现有技术中已知的任何选择方法来选择，包括噬菌体展示、酵母菌展示和核糖体展示。
调整抗体的亲和性并定出CDR特征的方法的优点
该方法可用来预先筛选CDR氨基酸位置，以便确认改善结合或保持结合的氨基酸取代。预先确认重要的残基，改善结合的取代及/或保留抗体功能的取代，容许有效地设计，并筛选亲和性成熟库。
本方法也可用来定出CDR的特征，并提供关于在CDR中对于抗原结合很重要的每个氨基酸位置的广泛信息。本方法也可用来确认改善结合的取代。
使用小型库，其中可将每个位置随机化(在一些具体实施例中，一次一个)，容许使用敏感的方法，如提供详细动力学信息的BIAcore，筛选取代突变体。当筛选较大的库时，筛选方法通常是不实用的。确实，诸如噬菌体展示、酵母菌展示和核糖体展示之类的选择方法，经常用来确认保持结合的纯种系。噬菌体展示和ELISA测定可能极度依赖从纯种系制备的蛋白质试样的浓度，并因此有极度偏向有增加表达、增加稳定性或降低毒性的纯种系的倾向，而非确认有增加结合亲和性的纯种系。此外，纯种系在表达程度上的差异，掩盖了在结合亲和性上的少许改善。这些缺点在使用具高结合亲和性的抗体作为起始材料时是特别剧烈的，因为为了足够严格的筛选，必须使用极低量的抗原。
相对之下，本发明的方法，如在每个位置的随机化(在一些具体实施例中，一次一个位置)，容许导入并定出例如，在给定位置的全部20个氨基酸取代的影响。该分析提供了在特定位置可容忍多少取代(及保持抗体结合)的信息，其转而提供关于每个氨基酸对于抗体功能的重要性的信息。此外，可确认结果改善了结合的取代，甚至是在其中在特定位置的许多或大多数取代产生无功能(不-结合)抗体的情况下。相对而言，丙氨酸-扫描突变生成作用，经常用来确认重要的CDR位置，提供了关于丙氨酸的取代是否容许或阻止结合的信息。通常，从亲和性成熟库中移除在丙氨酸取代阻止了结合的位置。然而，在许多情况下，丙氨酸在CDR位置可能是不良的取代基。
本方法也容许确认并定出单一CDR突变的影响的特征。相对而言，诸如噬菌体展示之类的方法，同时导入并选择许多突变，并因此可能增加肯定突变将被出现在特殊纯种系中的有害突变掩盖的风险。
也可使用本方法改善亲和性，同时仍保留原始(起始)抗体的结合特异性，只要本方法容许确认改善结合亲和性的少量突变(例如在单一CDR中有1、2、3、4或5个突变)。相对之下，诸如噬菌体展示之类的方法，通常使用一次多个突变，改善了结合亲和性，结果可能导致抗体特异性的转变，及/或增加了不想要的交叉-反应性。
实例
实例1：老鼠拮抗剂抗-NGF抗体911的人类化作用和亲和性成熟
A.通用方法
在本实例中使用下列的通用方法
库的产生
借着PCR卡匣突变生成作用，利用在Kay等人(1996)，肽和蛋白质的 噬菌体展示：实验室手册(Phage display of peptides and proteins：a laboratory  manual)，San Diego，Academic Press(参见第277-291页)中描述的简并寡核苷酸，产生库。使用填补密码子NNK，将一个氨基酸位置随机化，包括20个可能的氨基酸。欲随机化一个氨基酸位置，使其仅包括一具有特定特性的氨基酸亚组，使用在Balint等人(1993)Gene 137(1)：109-18中描述的填补密码子。使用在Innis等人，(1990)PCR草案：方法和应用的指引(PCRProtocols：A guide to methods and applications)(参见第177-183页)中描述的重组PCR，进行指定位置的突变生成作用。
小规模的Fab制备
在96孔培养盘中的小规模表达，最适合用来筛选Fab库。从以Fab库转化的大肠杆菌开始，挑选菌落接种在主培养盘(琼脂LB+氨苄青霉素(50微克/毫升)+2％葡萄糖)和工作培养盘(2毫升/孔，96孔/培养盘，含有1.5毫升LB+氨苄青霉素(50微克/毫升)+2％葡萄糖)两者上。使两种培养盘生长在30℃下8-12小时。将主培养盘储存在4℃下，并以5000rpm使得自工作培养盘的细胞形成小球，再悬浮于1毫升LB+氨苄青霉素(50微克/毫升)+1mM IPTG中，诱导Fabs表达。在30℃下5小时表达时间之后，借着离心收集细胞，然后再悬浮于500微升缓冲溶液HBS-EP(100mMHEPES缓冲溶液pH 7.4，150mM NaCl，0.005％P20，3mM EDTA)中。借着一次冷冻(-80℃)然后在37℃下融解的循环，使再悬浮于HBS-EP中的细胞溶解。以5000rpm离心细胞溶胞产物30分钟，从含有Fabs的上清液中分离细胞碎屑。然后将上清液注入BIAcore等离子体激光共振装置内，获得每个Fab的亲和性信息。从主培养盘中救出表达Fabs的纯种系，定序DNA并进行大规模Fab产生，然后按照下述定出详细的特征。
大规模的Fab制备
欲获得详细的动力学参数，表达Fabs并从大量培养物中纯化。以5毫升得自选出表达Fab的大肠杆菌纯种系的过夜培养物接种含有200毫升LB+氨苄青霉素(50微克/毫升)+2％葡萄糖的锥形烧瓶。在30℃下培养纯种系，直到达到1.0的0D550nm，然后借着以200毫升LB+氨苄青霉素(50微克/毫升)+1mM IPTG置换培养基诱导它。在30℃下5小时表达时间之后，借着离心使细胞形成小球，然后再悬浮于10毫升PBS(pH8)中。借着两次冷冻/融解(分别为-80℃和37℃)的循环，获得细胞的溶解。将细胞溶胞产物的上清液装入以PBS，pH8平衡过的Ni-NTA超流琼脂糖(Qiagen，Valencia CA)管柱中，然后以5倍管柱体积的PHS，pH8冲洗。以PBS(pH8)+300mM咪唑，将个别的Fabs洗脱至不同的溶离份中。集合含有Fabs的溶离份，并在PBS中透析，然后在定出亲和性特征之前，借着ELISA定量。
完整抗体的制备
为了表达完整的抗体，在2个哺乳动物表达载体(Eb.911.E3或Eb.pur.911.3E适合轻链，而Db.911.3E适合重链；在本文中描述)中选殖重和轻链可变区，并使用脂染胺转移感染到HEK293细胞内，进行暂时的表达。使用标准方法，使用蛋白质A纯化抗体。
Biacore测定
使用BIAcore3000TM表面等离子体激光共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)判定抗-NGF Fabs和单克隆抗体的亲和性。根据供应商的说明，利用N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)-碳化二酰亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，激活CM5晶片。以10mM乙酸钠pH4.0稀释人类NGF，并以0.005毫克/毫升的浓度注射到已经激活的晶片上。使用可变的流动时间，跨越个别的晶片通道，达到两种抗原密度范围：100-200反应单位(RU)，进行详细的动力学研究，以及500-600RU，进行筛选测定。以乙醇胺阻断晶片。再生研究已经显示Pierce洗脱缓冲溶液(产品编号21004，Pierce Biotechnology，Rockford IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物，有效地移除已经结合的Fab，同时在200次注射中仍保持在晶片上的hNGF的活性。使用HBS-EP缓冲溶液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15NaCl，3mM EDTA，0.005％界面活性剂P29)作为所有BIAcore测定的执行缓冲溶液。
筛选测定
筛选BIAcore测定最适合判定来自库的Fab纯种系的亲和性。以50微升/分钟注射少量培养物溶胞产物的上清液2分钟。使用10至15分钟的解离时间，使用BIA评估软件，判定单一指数解离率(koff)。为了证实，注射显示与用来创造库的模板(纯种系8L2-6D5，koff1x10-3s-1)相同范围的koff的试样，而高达45分钟的解离时间容许获得较佳的koff值。大规模表达显示出改善(较慢)koff值的纯种系，并对经过纯化的蛋白质判定全部的动力学参数kon和koff。该测定能够检测出大约2-倍或更大的亲和性差异。
亲和性判定测定
以100微升/分钟，注射连续稀释的(0.1-10x已确立的KD)经过纯化的Fab试样1分钟，并容许高达2小时的解离时间。借着ELISA及/或SDS-PAGE电泳判定Fab蛋白质的浓度，使用具有已知浓度(借着氨基酸分析判定)的Fab作为标准物。借着使用BIA评估程序，使数据符合1∶1的Langmuir结合模式(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994)Methods Enzymology 6：99-110)，同时获得动力学结合率(kon)和解离率(koff)。按koff/kon计算平均解离常数(KD)值。
B.老鼠拮抗剂抗-NGF抗体911的人类化和亲和性成熟
选择老鼠拮抗剂抗-NGF抗体911(参见Hongo等人，(2000)Hybridoma19(3)：215-227)进行人类化和亲和性成熟。Mab 911以高亲和性与人类和大鼠NGF结合，并显示与神经营养素NT3、NT4/5或BDNF没有明显的交叉-反应性。参见Hongo，同上。按照上述使用BIAcore分析，判定使用木瓜蛋白酶-切开的老鼠Mab 911的Fab片段的亲和性。木瓜蛋白酶-切开的老鼠Mab 911的Fab片段，以大约10nM的KD与人类NGF结合。
如下以数个步骤进行人类化和亲和性成熟：
(1)制备CDR-移植模板。将抗体911的轻链衍生的CDRs(即包括Kabat和Chothia CDR区两者)移植到带有JK2的人类生殖种系接受者序列O8内，并将抗体911的重链衍生的CDRs移植到带有JH4的人类生殖种系接受者序列VH4-59内。在图1A和1B中示出人类生殖种系接受者序列的氨基酸序列。氨基酸编号是连续的。使用上文提及的蛋白质框架，替编码带有老鼠CDRs的人类框架的合成基因，设计DNA序列。将这些人类化的重和轻可变功能部位分别称为hVH和hVL。密码子最适合大肠杆菌和仓鼠使用。使用数个部份重叠的寡核苷酸(长度69-90个碱基)，其利用每个链的两个短的侧面引子延伸全长的hVL和hVH，借着基本上按照在Prodromou等人，(1992)Protein Eng 5(8)：827-9中描述的循环PCR，分别合成两个基因。以凝胶纯化具有正确长度的所得DNA片段，然后选殖到大肠杆菌二顺反子表达质体(氨苄青霉素抗药性的)内。抗体的表达是在IPTG可诱导的lacZ启动基因的控制之下，类似在Barbas(2001)噬菌体展示：实验室手册(Phage display：a laboratory manual)，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laborayory Press(参见Vector pComb3X，在第2.10页)中的描述，然而，修改包括下列额外的功能部位的加入和表达：人类κ轻链恒定功能部位(参见GenBank登录编号CAA09181)和IgG2a人类免疫球蛋白的CHI恒定功能部位(GenBank登录编号P01859)。
也在图1A和1B中示出CDR-移植抗体的可变区的氨基酸序列(也称为″模板″)，称为8L2-4D5。使用上述的BIAcore分析判定8L2-4D5的亲和性。8L2-4D5以大约38nM的KD与人类NGF结合。
(2)将点突变导入框架序列内。使用如同在Innis等人，(1995)PCR策略(PCR strategies)，San Diego，Academic Press中描述的重组PCR指定位置的突变生成作用，将V71K取代导入CDR-移植重链内。该取代以相对应的老鼠框架残基置换人类的框架残基。将所得的抗体称为8L2-6D5，并在图1A中示出8L2-6D5重链可变区的氨基酸序列。使用上述的BIAcore分析判定8L2-6D5的亲和性。8L2-6D5的Fab片段以大约15nM的KD与人类NGF结合。选择8L2-6D5作为亲和性成熟的模板。
(3)CDRs L1、L2、H1和H2的人类化和亲和性成熟。使CDRs L1、L2、H1和H2接受人类化和亲和性成熟作用。以Chothia正统结构为基础(参见Al-Lazikani等人(1997)J.Mol.Biol.273(4)：927-48)，确认在CDRsL1、L2、H1和H2中对于CDRs的结构并非必要的氨基酸位置；并如下接受随机化作用。使用PCR卡匣突变生成作用，利用在Kay等人(1996)，肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册(Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual)，San Diego，Academic Press中描述的简并寡核苷酸，使用在Balint等人，(1993)Gene 137(1)：109-18中描述的填补密码子，制备两个分别含有如表2的轻链突变或重链突变，以及移植的(老鼠)CDR L3或CDR H3的库。通常，以抗体911轻链和重链氨基酸序列与人类生殖种系抗体序列的排列为基础，将氨基酸残基变成较常出现在人类抗体中的残基。在库中也陈述了野外型(未经取代的)氨基酸残基，除了CDR H2残基50，甲硫氨酸以外，在库中并未神述野外型甲硫氨酸。使甲硫氨酸残基接受氧化作用；因此，预期该残基的置换改善了所得抗体的稳定性。如同上述，将Fabs的库选殖到载体pComb3X加人类CH1和C？区内。
表2：
1.重链H1/H2库：
CDR-H1
将I34变成F、L、V、S、P、T、A或I
将N35变成N、T、S或Y
CDR-H2
将M50变成全部20个天然的氨基酸
将A62变成A或S
将L63变成L或V
2.轻链L1/L2库
CDR-L1
将S26变成S、A、V或F
将D28变成D、A、S或Y
将H32变成H、N、K、D、E、Q或Y
CDR-L2
将Y50变成Y、D、A或S
将I51变成I、T、A或V
将F54变成F或L
将S56变成S和T
关于亲和性筛选实验，更进一步将每个库与相对应的CDR-移植的轻或重链配对(例如H1/H2库与CDR-移植的轻链配对)，表达该抗体，并根据制造者的说明并按照上述，使用BIACORE表面等离子体激光共振(SPR)系统(BIAcore，Inc.Piscataway，NJ)，筛选个别纯种系对人类NGF的亲和性，判定koff、kon和KD。以koff率为基础，排列抗体纯种系，因为通常在koff率上看到最大的亲和性变化，并更进一步因为koff率与抗体浓度无关。
判定已结合的纯种系的序列，并在表3中示出已结合的纯种系的序列。
表3：L1和L2氨基酸序列，H1和H2氨基酸序列，以及在H1/H2或
L1/L2库纯种系的亲和性筛选之后，已结合的纯种系的动力学数据
Figure BSA00000643035001091
Figure BSA00000643035001101
Figure BSA00000643035001111
按照上文指示将粗体的氨基酸随机化
*使用kon4e4M-1s-1来计算KD
**为了方便，在本文中使用″e″来表示″x10″。因此4e4意指4x104。
含有下列取代的CDRs仍保持结合：
CDR-H1
I34：S、L、V、I和A结合
N35：N、T和S结合
CDR-H2
M50：M、I、G、Q、S、L结合
A62：A和S结合
L63：L和V结合
CDR-L1
S26：S和F结合
D28：D、S、A、Y结合
H32：H、N、Q结合
CDR-L2
Y50：Y结合
I51：I、T、V、A结合
F54：F结合
S56：S和T结合
通常，以结合亲和性为基础选出含有下列取代的CDRs，并组合成单一的纯种系，称为H19-L129：
CDR-H1：I34L；N35N(无改变)
CDR-H2：M50I；A62A(无改变)；L63V
CDR-L1：S26S(无改变)；D28S；H32N
CDR-L2：Y50Y(无改变)；I51T；F54F(无改变)；S56S(无改变)
组合这些突变(借着以PCR扩大H和L链，以限制酵素切开PCR产物和载体(pRN8)，并进行3个片段的连接)成为单一的纯种系，称为H19-L129，其也包括移植的H3和L3CDRs。在图1A和1B中示出H19-L129的重链和轻链可变区的序列，而表4显示CDRs L1、L2、H1和H2的氨基酸序列。H19-L129以大约1nM的KD与NGF结合，使用上述的BIAcore分析判定。
表4：CDRs H1、H2、L1和L2的氨基酸序列，以及组合纯种系H19-L129的动力学数据
*使用kon4e4M-1s-1来计算KD
(4)H3和L3CDRs的亲和性成熟。以两个步骤进行H3和L3CDRs的亲和性成熟。首先，在叫做″库扫描突变生成″的过程中，分别预先筛选在H3和L3中的每个氨基酸残基，以便确认突变导致对人类NGF的结合亲和性增加的氨基酸位置。以库扫描突变生成作用(也称为″小型库随机化分析″)的结果为基础，选择在H3和L3中氨基酸位置的亚组，来制备亲和性成熟库，并使用上述的BIAcore分析，针对对人类NGF的亲和性来筛选该亲和性成熟库。了解通常可应用这些技术。
(a)库扫描突变生成作用
分别就结果增加了对人类NGF的结合亲和性的取代，先筛选在H3和L3CDRs中每个氨基酸位置。在每个特定位置，氨基酸取代的频率结果导致改善的结合、相同的结合、较差的结合或不结合，提供了有关于在CDRs中可变成许多不同的氨基酸(包括全部的20个氨基酸)的位置，在CDRs中不能改变的位置，或仅可变成少数氨基酸的位置的信息。也确认结果增加了结合亲和性的氨基酸取代。以该筛选的结果为基础，选出在CDRs H3和L3中氨基酸位置的亚组，来制备亲和性成熟库。
制备个别的Fab库，其中L3和H3CDRs的每个氨基酸均被随机化成全部20个氨基酸，一次一个，结果产生数个(5个轻链的库和13个重链的库)小型库，均在每个氨基酸位置处可能有20个氨基酸的复杂性。在所有的情况下，在库中陈述本来的(即未改变的)氨基酸。借着PCR卡匣突变生成作用，利用在Kay等人，(1996)，肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册(Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual)，San Diego，Academic Press中描述的简并寡核苷酸制备库，使用填补密码子NNK，将一个氨基酸位置随机化，包括20个可能的氨基酸。8L2-6D5(CDR移植抗体，具有框架突变V71K)作为库建构的模板，因为CDR移植抗体的低亲和性容许在筛选期间，较容易检测出在H3和L3突变体中的亲和性差异。因此，每个库成员均含有具有1个氨基酸取代的CDR3(H3或L3)，和5个移植CDRs。
使用上述的BIAcore分析，从每个小型库中筛选出20-80个纯种系。在BIAcore晶片的一个通道上针对与NGF的结合亲和性，并在感应晶片的另一个通道上针对Fab的存在，借着与-his标签抗体结合，检测在重链的C终端处的his标签，借着BIAcore同时分析试样。按照具有相同的亲和性、较差的亲和性、较佳的亲和性或不结合，将表达蛋白质的纯种系分类，使用koff来分类：在表5中示出该分析的结果。
表5：按照具有相同的亲和性、较差的亲和性、较佳的亲和性或不结合，以koff为基础将表达蛋白质的纯种系分类。
Figure BSA00000643035001141
判定所有具有改善亲和性的纯种系的序列，揭露导致增加亲和性的氨基酸取代的频率和身份。此外，从每个库中选出少数保持类似8L2-6D5纯种系的亲和性的纯种系，以便探查容许在特定位置进行的氨基酸序列取代，即使虽然该取代不一定增加结合亲和性。在表6中概述该分析的结果。
表6
Figure BSA00000643035001151
Figure BSA00000643035001161
*使用kon4e4M-1s-1来计算KD
数个突变导致增加的结合亲和性。与8L2-6D5模板相比较，至少下列的突变导致明显增加的结合亲和性：H_Y101W(CDR序列GGYWYGTSYYFDY(SEQ ID NO：46))；H_S105A(CDR序列GGYYYGTAYYFDY(SEQ ID NO：47))；H_S 105T(CDR序列GGYYYGTTYYFDY(SEQ ID NO：48))；H_G103A(CDR序列GGYYYATSYYFDY(SEQ ID NO：49))和L_S91E(CDR序列QQEKTLPYT(SEQ ID NO：50))。
使用本实验的结果，指引氨基酸位置的选择，产生亲和性成熟库。
本实验也提供关于如在表5中所示，结果产生改善结合、相同结合、较差结合或不结合的在任何特定位置的氨基酸取代频率的信息。该信息容许确认在CDRs中可变成许多不同氨基酸(包括全部20种氨基酸)的氨基酸位置，以及在CDRs中可变成少数氨基酸或极少数氨基酸(在一些具体实施例中，没有氨基酸)的位置。这些结果也证实增加结合亲和性的氨基酸取代。
(b)亲和性成熟
接下来，使用小型库随机化分析的结果(上文)，选择产生用以进行H3和L3CDRs的亲和性成熟的H3和L3库的残基。选择CDR H3的残基Y101和G103，以及CDR L3的残基S91和K92，产生H3和L3库，进行H3和L3的亲和性成熟。
该库混合同时在CDR-移植纯种系8L2-6D5中，以及分别在H19-L129主链中的H3和L3的突变，并有80个各式各样的不同纯种系。表7显示为了取代所选出的氨基酸残基，以及在每个位置被取代的氨基酸。
表7.在H3和L3中为了取代所选出的氨基酸残基，以及在每个位置被取代的氨基酸
CDR-H3：
Y101变成Y和W，C(注意包含C，因为使用在一简并寡核苷酸中的密码子TRS，也产生密码子C)。
G103变成A，P，S
CDR-L3：
S91变成E
K92变成所有20种氨基酸。A，R，K和H结合。
以Fab表达每个多肽，并根据制造者的说明和上述，使用BIACORE分析，对每个库筛选96个个别纯种系对人类NGF的亲和性。在表8中示出该分析的结果。
表8.
Figure BSA00000643035001171
Figure BSA00000643035001181
*使用kon4e4M-1s-1来计算KD
以结合亲和性为基础，选出最佳的纯种系E3(可互换地地称为″3E″)和3C进行下一步定出特征。E3包括下列的CDR取代：CDR-H3：Y101W，G103A；以及CDR-L3：S91E，K92H，将其组合成单一的纯种系，其也包括下列的L1、L2、H1和H2突变：
CDR-H1：134L；
CDR-H2：M50I；L63V；
CDR-L1：D28S；H32N；
CDR-L2：I51T。
在图1A和1B中示出E3的重链和轻链可变区的序列。3C包括下列的CDR取代：CDR-L3：S91E，K92R；CDR-H3：Y101W，G103A；将其组合成单一的纯种系，其也包括对纯种系E3描述的L1、L2、H1和H2突变。
将3E和3C纯种系选殖到哺乳动物表达载体内，产生Fab和完整抗体，并在HEK293细胞中表达，并使用Ni-NTA或蛋白质A层析法纯化。借着氨基酸分析精确地定量纯的蛋白质。
根据制造者的说明和上文的描述，除了在晶片上使用100RU NGF以保护再结合效力，使用BIAcore分析测量Fabs E3和3C对人类NGF的结合亲和性。简言之，将数个浓度的抗体(Fabs)注射到CM5晶片上2分钟，在该晶片上带有100RU固定了的人类NGF，并容许解离1800秒。分析老鼠抗体911(Fab)作为对照组。使用BIA评估软件，依据制造者的说明分析数据。在图9和10中示出抗体E3和911的分析结果。E3以大约0.07nM的KD与人类NGF结合(并具有大约6.0e5M-1s-1的kon，和大约4.2e-5s-1的koff)。3C以大约0.35nM的KD与人类NGF结合(具有大约1.4E-5的koff)。相对而言，老鼠抗体911以3.7nM，8.4x10-5s-1的koff和2.2x104Ms-1的kon与NGF结合。
以高结合亲和性为基础，选出抗体E3(也可称为3E)进行进一步的分析。欲测试E3阻止NGF与NGF受体trkA和p75的交互作用的能力，将2.5nM人类NGF与0至50nM的抗体E3(Fab)预先混合并培养1小时。在培养之后，以10微升/分钟将试样注射在含有260RU的p75(通道2)和600RU的TrkA(通道3)的BIAcore CM5晶片上，并判定结合百分比。在图11中示出该分析的结果。借着减少信号发送所示(以RU来测量)，增加浓度的Fab E3阻断了NGF与p75和trkA两者的交互作用，表示Fab E3阻断了人类NGF与trkA和p75两者的交互作用。当抗体E3(Fab)浓度等于NGF浓度时(大约2.5nM NGF浓度)，没有观察到NGF结合(由信号0表示)。当NGF的浓度等于抗体3E的浓度时，出现0％的NGF-受体结合，暗示2.5nM比E3对NGF的KD更高至少10倍，并达到平衡。
实例2：使用老鼠E13.5三叉神经元存活测定，评估抗-NGF抗体的NGF-阻断能力
借着测量抗体在活体外抑制老鼠E13.5三叉神经元的NGF-依赖性存活的能力，来评估Fab E3或完整抗体E3阻断NGF活性的能力。三叉神经节包括支配颜面区神经的皮肤感觉神经元。老鼠E13.5三叉神经元的存活是评估抗-NGF拮抗剂抗体阻断NGF活性的敏感测定，因为NGF为支持这些神经元存活所必需的。例如，在NGF的饱和浓度下，在培养物中存活48小时接近100％。相反地，在缺少NGF时48小时，低于5％的神经元存活。
如下进行存活测定：借着CO2吸入将按时交配并怀孕的Swiss Webster雌鼠安乐死。移出子宫角，并取出在胚胎阶段E13.5的胚胎将其断头。使用电解磨尖的钨针头切开三叉神经节。然后以胰蛋白酶消化神经节，以机械方式解离，并以每孔200-300个细胞的密度平铺在限定的、不含血清的培养基中，在以聚-L-鸟氨酸和昆布氨酸涂覆的96孔培养盘中。
借着在三叉神经元中加入各种剂量的抗-NGF抗体Mab 911(Fab)、8L2-6D5；H19-L129；E3和3C；以及下列浓度的人类或大鼠NGF：0.4纳克/毫升(约15pM；该浓度代表存活的NGF的饱和浓度)和0.04纳克/毫升(约1.5pM；该浓度接近IC50)，评估抗-NGF Fabs或抗体的阻断活性。在培养48小时之后，使细胞在Biomek FX液体操作工作站(Beckman Coulter)上接受如下的自动免疫细胞化学草案：使用4％甲醛，5％蔗糖和PBS固定；使用在PBS中的0.3％三通X-100使其可通透；使用5％正常山羊血清，在PBS中的0.11％BSA阻断非特异性的结合位置；并接着与初级和二级抗体一起培养，以便检测神经元。初级抗体是对抗蛋白质基因产物89.5(PGP9.5，Chemicon)，一种已确立的神经元表达型标记的兔多克隆抗体。二级抗体是Alexa Fluor 488山羊抗-兔(Molecular Probes)，连同核染料Hoechst 33342(Molecular Probes)，标示所有出现在培养物中的细胞的核。在Discovery-I/Gen II显影器(Universal Imaging Corporation)上进行影像获得和影像分析。在适合Alexa Fluor 488和Hoechst 33342的两个波长处自动获得影像，并使用核染色作为显影器的以影像为基础的自动对焦系统的参考点，因为核染色出现在所有的孔中。选择适当的目标和每孔显影位置的数目，涵盖每个孔的整个表面。设定自动影像分析，以其与抗-PGP9.5抗体的特异性染色为基础，计算在培养48小时之后，出现在每孔中的神经元的数目。小心地取舍影像的阈值，并应用形态学和以选择性滤纸为基础的萤光强度，产生每孔神经元的精确计数。
本实验的结果证实Fab E3以高亲和性阻断了NGF活性。在图4-6和表9中示出结果。
图4为显示在各种浓度的人类和大鼠NGF的存在下，E13.5神经元的NGF依赖性存活的图表。
图5为在0.04纳克/毫升人类NGF(约1.5pM；示出在下图中)或0.4纳克/毫升人类NGF(约15pM；示出在上图中)的存在下，比较各种Fabs的NGF阻断效力的图表。1.5pM的NGF约为促进存活的NGF的EC50，而15pM则代表NGF的饱和浓度。按照上述评估在各种浓度的Fab E3；老鼠911Fab和Fab H19-L129与Fab 8L2-6D5之下，E13.5老鼠三叉神经元的存活。在每个NGF浓度下，计算每个Fab的IC50(按pM计)，并在表9中示出。Fab E3在15pM人类NGF的存在下，以大约21pM的IC50，并在1.5pM人类NGF的存在下，以大约1.2pM的IC50，强有力地阻断了人类NGF-依赖性的三叉神经元存活。Fabs 3C和H19-L129也强有力地阻断了人类NGF-依赖性的三叉神经元存活。
图6为在0.04纳克/毫升大鼠NGF(约1.5pM；示出在下图中)或0.4纳克/毫升大鼠NGF(约15pM；示出在上图中)的存在下，比较各种Fabs的NGF阻断效力的图表。1.5pM的NGF约为EC50，而15pM则代表NGF的饱和浓度。按照上述评估在各种浓度的Fab E3；老鼠Fab 911和FabH19-L129与Fab 8L2-6D5之下，E13.5老鼠三叉神经元的存活。在每个NGF浓度下，计算每个Fab的EC50(按pM计)，并在表9中示出。Fab E3在15pM大鼠NGF的存在下，以大约31.6pM的IC50，并在1.5pM大鼠NGF的存在下，以大约1.3pM的IC50，强有力地阻断了大鼠NGF-依赖性的三叉神经元存活。Fabs 3C和H19-L129也强有力地阻断了大鼠NGF-依赖性的三叉神经元存活。
表9：
Figure BSA00000643035001221
在不同的实验中，我们比较完整抗体E3与Fab 3E，在0.4纳克/毫升(饱和浓度)的人类NGF的存在下，抑制E13.5神经元的NGF-依赖性存活的能力。在图12中示出分析的结果。当将完整抗体和Fab的浓度对NGF结合位置的数目标准化(Fab具有一个结合位置而完整抗体具有两个结合位置)时，完整抗体E3和Fab E3显示出类似程度的抑制NGF-依赖性存活。这些结果证实没有抗体亲抗原性的影响，因为完整抗体与NGF二聚体结合。
在其他的实验中，我们在0.4纳克/毫升(饱和浓度)的存在下，比较各种浓度(20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128和0.0nM)的抗体E3、抗体911和trkA受体免疫粘附素(由NGF受体trkA的细胞外功能部位与免疫球蛋白Fc功能部位CH2-CH3融合所组成)，抑制E13.5神经元的NGF-依赖性存活的能力。在图13中示出这些结果。这些结果证实抗体E3阻断了NGF，比抗体911或trkA免疫黏附素更好。
实例3：使用老鼠三叉神经元和结节神经元存活测定，评估抗-NGF抗体E3的特异性
借着在饱和浓度的NGF、NGF相关的神经营养素NT3，或与NGF无关的神经营养因子、巨噬细胞刺激蛋白质(MSP)的存在下，测量抗体在活体外抑制老鼠E17/18三叉神经元存活的能力，评估抗体E3特异性地阻断NGF活性的能力。老鼠E17/18三叉神经元的存活是评估抗-NGF拮抗剂抗体的NGF-阻断活性的敏感性测定，因为支持这些神经元存活需要比支持E13.5TG神经元存活所需的NGF含量更高浓度的NGF。NT3或MSP也支持这些神经元的存活，因此，这些神经元的存活也是评估抗-NGF拮抗剂抗体是否也阻断NT3或MSP的敏感性测定。
也借着在饱和浓度的BDNF或NT4/5的存在下，测量抗体抑制老鼠结节E17神经元存活的能力，评估抗体E3特异性地阻断NGF活性的能力。BDNF或NT4/5也支持结节神经元的存活，因此，这些神经元的存活也是评估抗-NGF拮抗剂抗体的阻断BDNF或NT4/5能力的敏感性测定。
如下进行存活测定：借着CO2吸入将按时交配并怀孕的Swiss Webster雌鼠安乐死。移出子宫角，并取出胚胎(在胚胎第17或18天)将其断头。切下三叉神经和结节神经节并清洁。然后以胰蛋白酶消化神经节，以机械方式解离，并以每孔100-300个细胞的密度平铺在限定的、不含血清的培养基中，在以聚-L-鸟氨酸和昆布氨酸涂覆的4孔培养盘(Greiner)中。
使E17/18三叉神经元在不添加神经营养因子(阴性对照组)，或在饱和浓度的人类NGF(400pM和15pM)(阳性对照组)；NT3(400pM)或MSP(600pM)的存在下生长。设定一式两份的培养物，其包括各种浓度的E3和911Fabs，以及完整抗体。每个结合位置指出Fab和完整抗体的浓度(例如完整抗体含有两个结合位置，而Fab含有一个结合位置)。
使E17结节神经元在缺少添加神经营养因子(阴性对照组)，或带有饱和浓度的BDNF(400pM)(阳性对照组)，或NT4/5(400pM)或与NGF无关的生长因子ILF(介白素抑制因子)之下生长。使用高浓度的神经营养素，因为本实验的目标是测试抗体的特异性。设定一式两份的培养物，其包括各种变化，有或无添加抗体E3和911。在培养48小时之后，借着手工计数，使用逆相显微镜，探查在每个条件下，在每孔中的存活神经元的总数。
这些实验的结果证实E3和911抗体完全阻断了NGF对E18三叉神经元的存活促进效力。相反的，E3和911抗体不影响由NT3或MSP促进的三叉神经元的存活，或由BDNF或NT4/5或LIF促进的结节神经元的存活。这些结果证实抗体E3对NGF具有选择性特异性，在比阻断NGF的有效浓度更高1000-倍至10,000倍的浓度下，在这些抗体与其他NGF相关神经营养素(NT3、NT4/5、BDNF)之间并没有检测到交互作用。此外，这些结果也证实添加抗体或Fab E3时，在NGF-支持的NGF-依赖性神经元的培养物中看到神经元死亡，归因于在这些抗体与NGF之间特异性的交互作用，而不是因为一般化的毒性作用。也测试老鼠抗-NGF拮抗剂抗体911，并观察到类似的结果。注意到因为使用高农度的神经营养素，抗体E3和911两者均非常接近其滴定条件，并预期以类似的程度与NGF结合，因为在这些抗体与NGF的结合亲和性上的差异，在这些条件下将较不明显。
在图14、15、16和17中示出了这些实验的结果。数据显示在培养48小时之后，相对于在每个实验的阳性对照组中看到存活(例如在饱和NGF浓度的存在下生长的三叉神经元为100％存活，且在饱和BDNF浓度的存在下生长的结节神经元也为100％存活)的平均存活百分比(±平均值的标准差，每个数据点的n＝3)。图14-15为显示抗-NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不抑制由NT3和MSP促进的存活的图表，即使是在高达200nM的抗体浓度下。相反的，20nM的抗体E3或Fab E3和Fab 911完全阻断了NGF-诱发的存活。也测试老鼠抗-NGF拮抗剂抗体911，并观察到类似的结果。明确地说，图14是显示在不添加神经营养素(称为″对照组″)、400pM NGF(称为″NGF-400pM″)、10nM NT3(称为″NT3-10nM″)或600pM MSP(称为″MSP-600pM″)的存在下，比较各种浓度(20nM、2nM或0.2nM)的E3Fab(在图中称为″3E″)和老鼠抗体911Fab对E18三叉神经元存活的影响的图表。图15是描述在不添加神经营养素(称为″无因子″)、400pM NGF(称为″NGF-400pM″)、10nM NT3(称为″NT3-10nM″)或600pM MSP(称为″MSP-600pM″)的存在下，比较各种浓度(200nM和80nM)的E3Fab和完整抗体，以及老鼠抗体911的完整抗体和Fab对E17三叉神经元存活的影响的图表。
图16-17是显示抗-NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不抑制由BDNF、NT4/5或LIF促进的E17结节神经元存活的图表。也测试老鼠抗-NGF拮抗剂抗体911，并观察到类似的结果。明确地说，图16是显示在不添加神经营养素(称为″无因子″)、400pM BDNF(称为″BDNF-400pM″)、400pM NT4/5(称为″NT4/5-400pM″)或2.5nM LIF(称为″LIF-2.5nM″)的存在下，比较各种浓度(200nM或80nM)的完整抗体E3(在图中称为″3E″)、Fab E3、完整抗体911或Fab 911对E17结节神经元存活的影响的图表。图17是显示在不添加神经营养素(称为″对照组″)、400pMBDNF(称为″BDNF-400pM″)、400pM NT4/5(称为″NT4/5-400pM″)或2.5nM LIF(称为″LIF-2.5nM″)的存在下，比较各种浓度(200nM、20nM或2nM)的Fab E3(在图中称为″3E″)或Fab 911对E17结节神经元存活的影响的图表。
实例4：制备哺乳动物表达载体，并在哺乳动物细胞中表达抗体E3
设计并建构三个哺乳动物表达载体，以便用来在哺乳动物细胞中表达抗体E3。
载体Db.911.3E是包括E3抗体的重链可变区和人类IgG2a恒定区的表达载体，并适用于重链的暂时性或稳定表达。Db.911.3E由符合下列区域的核苷酸序列组成：老鼠细胞巨大病毒启动基因区(核苷酸1-612)；合成的插入序列(核苷酸619-1507)；DHFR密码区(核苷酸707-1267)；人类生长激素信号肽(核苷酸1525-1602)；抗体E3重链可变区(核苷酸1603-1965)；含有下列突变的人类重链IgG2a恒定区：A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野外型IgG2a序列；参见Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；SV40晚期聚腺苷酸化作用信号(核苷酸2974-3217)；SV40促进子区域(核苷酸3218-3463)；噬菌体f1区(核苷酸3551-4006)和β内酰胺酶(AmpR)密码区(核苷酸4443-5300)。Db.911.3E于2003年1月8日保藏在ATCC，并分配到ATCC登录编号PTA-4895。
载体Eb.911.3E是包括E3抗体的轻链可变区和人类κ链恒定区的表达载体，并适用于轻链的暂时性表达。Eb.911.3E由符合下列区域的核苷酸序列组成：老鼠细胞巨大病毒启动基因区(核苷酸1-612)；人类EF-1插入序列(核苷酸619-1142)；人类生长激素信号肽(核苷酸1173-1150)；抗体E3轻链可变区(核苷酸1251-1571)；人类κ链恒定区(核苷酸1572-1892)；SV40晚期聚腺苷酸化作用信号(核苷酸1910-2153)；SV40促进子区域(核苷酸2154-2399)；噬菌体f1区(核苷酸2487-2942)和β内酰胺酶(AmpR)密码区(核苷酸3379-4236)。Eb.911.3E于2003年1月8日保藏在ATCC，并分配到ATCC登录编号PTA-4893。
载体Eb.pur.911.3E是包括E3抗体的轻链可变区和人类κ恒定区的表达载体，并适用于轻链的稳定表达。Eb.pur.911.3E由符合下列区域的核苷酸序列组成：老鼠细胞巨大病毒启动基因区(核苷酸1-612)；人类EF-1插入序列(核苷酸619-1758)；pac基因(嘌罗霉素R)密码区(核苷酸739-1235)；人类hsp705′UTR区(核苷酸1771-1973)；人类生长激素信号肽(核苷酸1985-2062)；抗体E3轻链可变区(核苷酸2063-2383)；人类κ链恒定区(核苷酸2384-2704)；SV40晚期聚腺苷酸化作用信号(核苷酸2722-2965)；SV40促进子区域(核苷酸2966-3211)；噬菌体f1区(核苷酸3299-3654)和β内酰胺酶(AmpR)密码区(核苷酸4191-5048)。Eb.pur.911.E3于2003年1月8日保藏在ATCC，并分配到ATCC登录编号PTA-4894。
如下进行暂时的细胞表达：以每种质体各25微克(即一种含有重链的质体和一种含有轻链的质体)暂时地共同转移感染在150毫米培养皿中的CHO和HEK293T细胞。根据制造者的说明，将DNA与100微升脂染胺2000(Invitrogen)混合。容许该DNA-脂质混合物与细胞在不含血清或抗生素的DMEM/F12培养基中接触5小时。在该培养之后，为了表达将培养基换成没有任何添加物的Opti-MEM(Invitrogen)2天。利用后续的培养基更换，连续收获含有抗体的细胞上清液4次。借着亲和性层析法纯化上清液，使用MapSelect蛋白质A树脂(Amersham biosciences 17：5199-02)。抗体在0.3M甘氨酸、0.6M NaCl缓冲溶液，pH 8中与蛋白质A树脂结合，然后以0.1M柠檬酸缓冲溶液，pH 3洗脱。立刻以1M Tris缓冲溶液，pH8.0中和含有抗体的溶离份，然后在PBS中透析抗体溶离份并浓缩。
实例5：抗-NGF抗体E3在治疗手术后疼痛上是有效的
我们使用模仿手术后疼痛的疼痛模式来评估以抗体E3治疗的效力。抗体E3包括含有下列突变的人类重链IgG2a恒定区：A330P331至S330S331(氨基酸编号参考野外型IgG2a序列；参见Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；人类轻链κ恒定区；以及在表1A和1B中示出的重和轻链可变区。
动物。从Harlan(Wisconsin)购买重量在220-240克之间的雄性SpragueDawley大鼠，并在手术前先使其适应动物设施的环境1周。
手术。手术是以由Brennan等人Pain 64：493-501(1996)描述的程序为基础。以在空气中2％异氟烷的混合物麻醉动物，并在手术期间经由鼻圆锥筒维持麻醉。以聚维酮-碘垫准备右后脚掌的跖表面，并通过皮肤和筋膜，从离脚后跟边缘0.5公分开始向着脚趾延伸，做1公分的中央纵切。使用弯钳举起跖肌，并纵向切开。在起点和插入之间，通过肌肉的全深切开它。在手术期间，借着经由纱布垫施压控制出血。以两个褥式缝法(5-0ethilon黑色单一纤维)关闭伤口。将这些缝线打结5-6次，松松地绑住第一个结。将伤口位置涂上杆菌肽溶液。在再度测试行为之前，容许动物在干净的笼子里恢复并休息2小时或更久。
评估静止疼痛。使用累积疼痛计分来评估与支撑体重有关的疼痛。将动物放在干净塑胶笼子中的塑胶网(格子：8平方毫米)上，可在平台上将其升高(高度：18时)，容许检查它们脚掌的底面。在20分钟的适应期间之后，按0至2的刻度评估体重支撑。若脚掌变白或再度踩在网子上，表示完全支撑体重，则给0分。若偏好使用的脚掌皮肤仅轻触网子，没有变白或皮肤凹入，便给1分。若完全不使脚掌碰到网子，便给2分。若大鼠仍在休息，认为缩起脚掌即是2。每只动物每5分钟观察1分钟，持续30分钟。使用在1/2小时期间获得的6次计分之总合(0-12)，评估切伤脚掌的疼痛。也计算2分的频率，并用来评估严重疼痛的发生率或动物对脚掌的整体保护。在手术前24小时(基准线)，以及手术后2小时、24小时、48小时和72小时测试每只动物。在图1中示出本实验的结果，其描述在以35毫克/千克抗-NGF老鼠抗体911治疗的动物中观察到的累积静止疼痛分数。这些结果证实以抗-NGF抗体治疗，显著地降低了手术后静止疼痛。体重支撑与动物将如何使用肢体有良好关系，并因此是疼痛减轻的有效测量。
在切开前15小时，以各种浓度的抗体(每千克动物体重0.004、0.01、0.02、0.1、0.6和1毫克)腹腔内(i.p.)注射E3抗体。阴性对照组没有接受抗体，但以生理盐水溶液腹腔内注射。在进行24小时手术后测试之前30分钟，腹腔内注射0.01毫克/千克的芬太尼作为阳性对照组。对于每种条件，每个实验涉及8只动物(每组n＝8)，且对照组有56只动物。按照上述进行手术并测量累积疼痛分数。在手术后24小时评估静止疼痛。
如在图7中所示，当给予0.02毫克/千克至1毫克/千克剂量时，人类化抗-NGF抗体E3明显地在手术后降低了静止疼痛(p＜0.05)。″*″代表明显与对照组有显著差异(p＜0.05)。以0.02毫克/千克治疗改善疼痛行为，至少像0.01毫克/千克芬太尼一样有效。该剂量的芬太尼是该有效类鸦片的正常人类剂量的10倍。
在其他实验中，测试在手术后给予时，E3抗体降低手术后疼痛的效力。在手术后2小时静脉内(i.v.)注射抗体E3(0.5毫克/千克)。对照组没有接受抗体，但静脉内注射生理盐水溶液。进行手术并以在手术后24小时评估的累积疼痛分数表示静止疼痛。如在图8中所示，当在切开后2小时给予抗体时，在切开后24小时以抗-NGF抗体治疗明显地(p＜0.05)降低了静止疼痛。这些结果证实当在手术后给予时，E3抗体有效地改善了手术后疼痛。
实例6：在风湿性关节炎的大鼠模式中，评估抗-NGF拮抗剂抗体911的止痛效果
使用发声测试，调查在以完全福瑞德(Freund′s)佐剂(CFA)-诱导的慢性关节炎的大鼠中，抗-NGF抗体911(参见Hongo等人，Hybridoma19(3)：215-227(2000))的止痛效果，与用来作为参考物的吲哚美辛相比较。
在本研究中包括50只在实验初期重150克至220克的雄性Lewis大鼠(LEWIS LEW/Crl Ico)(Charles River Belgium)。在实验之前饲养所有的动物至少5天，并关在温度(19.5-24.5℃)、相对湿度(45-65％)和12-小时亮/暗周期-控制的屋子里，在实验期间可任意接近经过过滤的自来水和标准小颗粒实验室食物(U.A.R.，France)。在尾巴上分别标示每只动物的身份。
在第0天(D0)，借着皮内注射0.05毫升在矿物油中的丁酸分枝杆菌(Mycobacterium butyricum)(Difco，USA)悬浮液(10毫克/毫升)至尾巴内，在大鼠中诱导关节炎。在第14天(D14)，根据在温和地弯曲后脚掌时它们发声的能力，并借着使用炎症反应分数评估每个后和前脚掌而得的关节炎指数(参见Kuzuna等人，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)23：1184-1191(1975)；Pearson等人，Arthritis Rheum.2：440-459(1959))，将关节炎的大鼠纳入本研究中。以下列的判断标准为基础对动物计分：0分：正常外观；1分：红斑；2分：红斑和轻微的水肿；3分：严重的炎症反应但没有关节僵硬；4分：关节僵硬。本研究只包含在温和弯曲时发出声音并得到2或3分的动物。
在本研究中包含四组各10只动物。第1组(媒剂)，在选出之后第14天(D14)，以媒剂(生理盐水)静脉内给予大鼠。在第18天(D18)，借着温和地弯曲后脚掌评估感受伤害的强度，并纪录每只动物发声程度的强度。第2组(4天)，在选出之后第14天，以911(10毫克/千克)静脉内给予大鼠。在第18天(D18)，借着温和地弯曲后脚掌评估感受伤害的强度，并纪录每只动物发声程度的强度。第3组(24小时)，在注射CFA之后第17天，以911(10毫克/千克)静脉内给予大鼠。在24小时之后，借着温和地弯曲后脚掌评估感受伤害的强度，并纪录每只动物发声程度的强度。第4组(吲哚美辛)，在第18天(D18)，在口服给药吲哚美辛(10毫克/千克)之后1小时，借着温和地弯曲后脚掌评估感受伤害的强度。也纪录每只动物发声程度的强度。借着静脉内的路径，在5毫升/千克的体积下，以盲目和随机的方式给予受试物质，而在10毫升/千克的体积下口服给予吲哚美辛。
在表10中示出抗-NGF抗体911的止痛效果。以按mV(平均值±SEM)计对每只动物纪录的发声程度的强度来评估的感受伤害强度，表示每组的结果，并从媒剂-处理组的平均值来计算感受伤害强度的变化百分比。在变异数的单尾分析之后使用剩余变异数，以Dunnett′s检定判定在治疗组和媒剂组之间的统计显著性(P＜0.05)。
表10.在大鼠的完全福瑞德佐剂-诱导的慢性关节炎中，911的止痛效果
Figure BSA00000643035001301
Figure BSA00000643035001311
以平均值±SEM表示结果
每组n＝10只老鼠
第0天(D0)：利用给予CFA诱导慢性关节炎
媒剂：生理盐水
在D14或D17静脉内给予911(10毫克/千克)，并在D18进行疼痛测量。仅在D18口服给予吲哚美辛(10毫克/千克)，并在给药后1小时进行疼痛测量。Dunnett′s检定：*表示与媒剂-处理组比较有显著差异P＜0.05
如在表10中所示，在风湿性关节炎的大鼠模式中，在单次给予抗体之后24小时或4天，抗-NGF抗体911明显地降低了疼痛。
实例7：在风湿性关节炎的大鼠模式中，抗-NGF拮抗剂抗体E3和911的药理学作用
调查在大鼠中以完全福瑞德佐剂(CFA)-诱导的慢性关节炎的模式中，抗-NGF拮抗剂抗体E3和911的药理学作用(消炎和止痛效果)，与作为内部阳性对照物质的吲哚美辛相比较。借着测量感受伤害的反应来评估E3和911的止痛效果。借着脚掌体积、关节炎指数(炎症反应分数)、体重和后脚掌重来评估消炎效果。在实验结束时，进行脚掌细胞激动素含量(IL-6、IL-1β、TNF-α和TGF-β1)、血清中的循环TGF-β1、E3和911血浆浓度、生物学参数和X-光摄影。
实验草案
1.研究设计
在本研究中，包括80只5-周龄的雄性Lewis大鼠(LEWISLew/Ico)(Charles River Laboratories-Belgium)。将它们饲养在温度(19.5-24.5℃)和相对湿度(45-65％)，12-小时亮/暗周期-控制的屋子里，在实验期间可任意接近经过过滤的自来水和标准小颗粒实验室食物(SAFE，France)。当动物设施收到动物时，以每个笼子5只饲养，并在任何测试之前先观察10-天的适应期。在尾巴上分别标示每只动物的身份。
在本研究中包含五组各10只动物(5-周龄的雄性Lewis大鼠-LEWISLew/Ico，得自Charles River Laboratories-Belgium)：第1组：无关节炎大鼠/生理盐水(媒剂)，静脉内积储注射，n＝10；第2组：关节炎大鼠/生理盐水(媒剂)，静脉内积储注射，n＝10；第3组：关节炎大鼠/吲哚美辛3毫克/千克，10天内每天口服，n＝10；第4组：关节炎大鼠/E3，1毫克/千克，静脉内积储注射，n＝10；第5组：关节炎大鼠/911，10毫克/千克，静脉内积储注射，n＝10。以自由物质的观点来表示剂量(毫克/千克)。临时以生理盐水从母液制备E3和911至想要的浓度。E31毫克/千克：3.41毫升母液(0.88毫克/毫升)适量15毫升生理盐水。91110毫克/千克：12毫升母液(2.5毫克/毫升)适量15毫升生理盐水。使用0.20微米的灭菌滤纸单元将所有稀释溶液(在静脉内注射之前)灭菌。在每次静脉内注射之前测量稀释溶液的pH值和渗透压。在第一次静脉内注射之前，生理盐水、E3和911的渗透压(毫渗透压/公升)分别为278、269和308；生理盐水、E3和911的pH值分别为5.93、6.76、6.71。在第二次静脉内注射之前，生理盐水、E3和911的渗透压(毫渗透压/公升)分别为280、270和309；生理盐水、E3和911的pH值分别为5.86、6.72和6.59。
在关节炎诱导之后，第14和第19天借着静脉内积储注射，以编码和随机的顺序，给予体积5毫升/千克的E3或911或生理盐水。在第14和第19天，借着静脉内积储注射给予无关节炎组体积5毫升/千克的生理盐水。临时以1％甲基纤维素制备吲哚美辛。在关节炎诱导之后，在第14至23天，以编码和随机的顺序，在10天内每天一次口服给予体积10毫升/千克的吲哚美辛，
2.关节炎的诱导
在第0天(D0)，在70只大鼠中借着皮内注射0.05毫升丁酸分枝杆菌悬浮液至尾巴内，诱导关节炎。A组10只大鼠不接受任何皮内注射(无关节炎大鼠)。在第14天(D14)，根据下列的判断标准将关节炎的大鼠纳入本研究中：与在无关节炎组中的平均脚掌体积(左和右脚掌体积的平均值)相比较，所有被纳入的大鼠均展现出增加平均脚掌体积(左和右脚掌体积的平均值)至少0.30毫升(脚掌体积的测量如下述)：当温和地弯曲时所有被纳入的大鼠均发出声音(感受伤害的反应测量如下述)；且所有被纳入的大鼠每只后脚掌均得到2-3分的关节炎指数(关节炎指数测量如下述)(放弃得0、1或4分的动物)。
3.体重
从第0天到第24天，每天将动物秤重一次(除了在治疗前的周末期间：D1、D2、D8、D9、D10)。在早上9:00到12:00之间进行所有的测量，除了在第14天(早上7:30-9:00)和第24天(早上7:30-8:00)之外。
3.脚掌体积测量
使用体积测量器测量每只大鼠(关节炎和无关节炎大鼠)右和左后脚掌的体积。在下列时间(诱导关节炎之后)进行测量：第14天(在静脉内积储注射或口服之前)；和第24天(在最后一次静脉内积储注射之后5天，或在最后一次口服投药之后24小时)。在早上9:00到12:00之间进行所有的测量。由WinDas软件收集和储存所有的数据。
4.关节炎指数
使用每只后和前脚(关节炎大鼠)的炎症计分，评估关节炎指数：0分：正常外观；1分：红斑；2分：红斑和轻微的水肿；3分：严重的炎症反应但没有关节僵硬；4分：关节僵硬。在下列时间(在诱导关节炎之后)进行该评估：第14天(在静脉内积储注射或口服投药之后)；和第24天(在最后一次静脉内积储注射之后5天，或在最后一次口服投药之后24小时)。在下午2:00到3:00之间(D14)和早上8:00到9:00之间(D24)进行所有的测量。由WinDas软件收集和储存所有的数据。
5.测量感受伤害的反应(发声测试)
借着以4至5秒之间隔，用操作者的手指重复两次温和地弯曲右和左后脚掌，评估感受伤害的反应(关节炎大鼠)。对每只动物纪录每只后脚掌的发声程度之强度(2次：在右后脚掌：s1和s3；2次：在左后脚掌：s2和s4)。在下列时间(在诱导关节炎之后)进行该评估：第14天(在静脉内积储注射或口服投药之前)；第18天(在第二次静脉内积储注射之前，或在口服投药之后1小时)；以及第24天(在最后一次静脉内积储注射之后5天，或在最后一次口服投药之后24小时)。在早上9:00到12:00之间进行所有的测量，除了D14(早上7:30-9:00)和D24(早上7:30-9:00)。
6.收集血液用来测量E3或911浓度，以及循环中的TGF-β1和血液学参数
在第24天(在测量脚掌体积和关节炎指数，以及测试发声之后)，在使用异氟烷(以氧气和一氧化二氮的混合物)的普通麻醉下，借着毛细管作用以微量吸移管从眼眶后窦中收集血液试样(大约800-1000微升)。
测量E3或911浓度(第2、4和5组)：将一部分血液试样收集在含有Li-肝素的试管(保持在冰上)中，并以2500-3000g离心10分钟。获得血浆试样(至少100微升)，在液态氮中冷冻，储存在-80℃下。一份试样稍微有溶血(媒剂-处理的关节炎大鼠#36)。
测量循环中的TGF-β1(第1-2-3-4-5组)：将一部分血液试样收集在微量试管中，在室温下制备血清。在试样收集之后，混合血液并容许在离心之前凝固30分钟。以大约6000g离心试管3分钟。等分每个血液试样(至少100微升，除了大鼠#52和#53)，并储存在-20℃下，直到为了TGF-β1分析而激活试样为止。从实验结束开始，这些等份(50个小瓶)可保存6个月。有些试样稍有溶血(媒剂-处理无关节炎大鼠：#2、#5、#9、#10；媒剂处理的关节炎大鼠：#53、#63；E3-处理的关节炎大鼠：#31、#51；911-处理的关节炎大鼠：#52、#62、#64)。使用人类TGF-β1ELISA试剂盒(ref.DB100，Batch 212258和213610，R&D Systems-France)测量TGF-β1含量。
为了血液学参数收集血液(第1-2-3-4-5组；50个小瓶)：将一部分血液试样收集在含有K3-EDTA的试管中(至少100微升)。在收集当天进行参数的判定，不需储存试样。以血液学细胞计数器，测量血液学参数，包括红血球、白血球、血小板、血红素、血球容积(D24)。没有测量到一些血液学参数，因为试样凝固了(媒剂-处理无关节炎大鼠：#10；E3-处理的关节炎大鼠：#59、#67；911-处理的关节炎大鼠：#16)。
7.脚掌细胞激动素含量
在第24天(在最后一次静脉内积储注射之后5天，或在最后一次口服投药之后24小时)(在X-光摄影之后)，将每只动物的后脚掌(关节炎和无关节炎大鼠)秤重，并收集在已标示的聚乙烯小瓶中。在液态氮中冷冻组织试样，并储存在-80℃下。
制备关节匀浆：使用生物-研磨机将冷冻的后脚掌磨碎。然后将粉末状的后脚掌放在含有3毫升PBS，补充有50微升抗-蛋白酶鸡尾酒的50毫升圆锥形离心管中，并使用Ultra-Turrax均质机在冰上均质化(最大速度的50％)。然后在4℃下以2000xg离心匀浆15分钟，并通过0.2微米Sartorius滤纸过滤上清液，等分并储存在-80℃下，直到使用为止。
细胞激动素含量测量：根据制造者的说明，以一式两份判定TNF-α(大鼠TNF-αELISA试剂盒，ref.RTA00，Batch 213718，R&D Systems，France)、IL-1β(大鼠IL-1βELISA试剂盒，ref.RLB00，Batch 212435，R&D Systems，France)、IL-6(大鼠IL-6ELISA试剂盒，ref.R6000，Batch 211773，214008和214362，R&D Systems，France)和TGF-β1(人类TGF-β1ELISA试剂盒，ref.DB100，Batch 212258和213610，R&D Systems，France)的细胞激动素含量。将后脚掌匀浆的等份储存在-80℃下。
8.X-光分析
在第24天，在收集血液之后牺牲动物，并获得X-光照片(后脚掌)，评估关节病变。X-光分析集中在两只后脚掌上的关节糜烂、关节腔、骨膜异常。借着检查七个不同的项目来分析所有的放射线照片：软组织伤害、变形、去矿物质化、关节腔、糜烂、成骨作用和骨膜反应。对每只动物，分析前六个项目，与检查较差的后脚无关。借着检查尾巴分析骨膜反应。对每个项目，得分是从0(正常)到4(最大伤害)。因此，总分是从0到28。由不知道关于动物(处理或未处理组)任何事情的相同审查员进行放射线照片解读。
9.观察
在吲哚美辛投药之后D23(在D23投药之前)，一只动物(#65)因未知的原因死亡。
10.结果的分析和表示
在每个时间点，以每组中10只大鼠的平均值±S.E.M.来报告所有的结果。以从右和左脚掌体积的平均值计算出的毫升来表示脚掌体积。从4只脚掌分别获得的分数的总和来计算关节炎指数。借着对每只动物纪录的发声程度的强度，按mV计，来评估感受伤害的反应(4个值的平均值：2次/脚掌)。从媒剂-处理关节炎组的平均值计算感受伤害反应的抑制百分比[(媒剂-处理关节炎组的平均值-处理的关节炎组的平均值/媒剂-处理关节炎组的平均值)*100]。以克表示体重。以克表示后脚掌(左和右)的重量。以微微克/毫升表示美之后脚掌的细胞激动素含量(IL-6、IL-1β、TNF-α和TGF-β1)。以微微克/毫升表示TGF-β1的循环含量。从每个参数所获得的分数的总和，来计算每个参数的放射学指数(去矿物质化、糜烂、骨膜反应、软组织伤害、关节腔、成骨作用、变形)和总放射学指数(总分)。当等变异数或常态检定失败时，借着Student t检定或Mann-Whitney Rank Sum检定，评估在媒剂-处理组(关节炎大鼠)和媒剂-处理组(无关节炎大鼠)的值之间的组内偏差显著性。借着变异数ANOVA的1-尾分析，接着是不成对Dunnett t检定，评估在媒剂-处理组(关节炎大鼠)和E3-和911-和吲哚美辛-处理组的值之间的组内偏差显著性。认为P≤0.05的或然率是显著的。借着SigmastatTM体进行所有的统计分析。
结果
1.感受伤害反应(发声测试)
如同在表11和图18中所示，在D14，在媒剂-、吲哚美辛-、E3-和911-治疗的关节炎组中，感受伤害的反应分别为4147±331、4386±235、4644±367和4468±143。与媒剂-处理的关节炎组相比较(D18：1511±398对5279±326mV；D24：1552±508对5905±345mV)，吲哚美辛在3毫克/千克/天口服(持续10天)之后，在D18和D24分别以大约
-3768mV(抑制％：71％)和-4353mV(抑制％：74％)，强有力且明显地降低了感受伤害反应。与媒剂-处理的关节炎组相比较(D18：1112±401对5279±326mV；D24：0±0对5905±345mV)，E3(在D14和D19，1毫克/千克静脉内注射)在D18和D24分别以大约-4167mV(抑制％：79％)和-5905mV(抑制％：100％)，强有力且明显地降低了感受伤害反应。与媒剂-处理的关节炎组相比较(D18：1347±492对5279±326mV；D24：547±307对5905±345mV)，911(10毫克/千克静脉内注射，在D14和D19两天)在D18和D24分别以大约-3932mV(抑制％：74％)和-5358mV(抑制％：91％)，强有力且明显地降低了感受伤害反应。
表11.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对感受伤害反应的影响
Figure BSA00000643035001371
按照平均值±S.E.M.以mV表示数值
每组n＝10只动物，除了吲哚美辛D24(n＝9)
Dunnett t检定：*P＝0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
2.体重
如表12和图19中所示，从D0到D14，与关节炎大鼠相比较，在关节炎大鼠中观察到明显减少增重，是因为关节炎的建立。在D14(选择日)，与无关节炎大鼠相比较，关节炎大鼠展现出体重的明显减少(289±2对217±4克)(Student t检定P＜0.05)。然而，在所有关节炎组中没有检测到任何明显的体重差异(D14)(Dunnett t检定P＞0.05)。与媒剂-治疗只关节炎大鼠相比较，在吲哚美辛-治疗组(3毫克/千克/天，持续10天)中，从D17至D24体重中等并显著地增加(261±5对218±3克)，在D24有大约43克的最大值。与媒剂-治疗的关节炎大鼠相比较，在E3治疗(1毫克/千克静脉内，在D14和D19)之后，从D17至D24体重中等并显著地增加(264±5克对218±3克)，在D24有大约46克的最大值。与媒剂-治疗的关节炎大鼠相比较，在911治疗(10毫克/千克静脉内，在D14和D19)之后，从D18至D24体重中等并显著地增加(265±7克对218±3克)，在D24有大约47克的最大值。
表12.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对体重的影响
Figure BSA00000643035001381
Figure BSA00000643035001391
按照平均值±S.E.M.表示数值，每组n＝10只动物，除了吲哚美辛的D23和D24(n＝9)
Dunnett t检定：*P＝0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
3.脚掌体积
在D14，进行随机化以便从脚掌体积的观点来看，获得均一的组别。如同在表13中所示，在D14，在关节炎组中后脚掌体积(右和左脚掌体积)明显比在无关节炎组中的更大(2.10±0.05对1.44±0.02毫升(Student t检定P＜0.05))。与媒剂-处理的关节炎组相比较，吲哚美辛(3毫克/千克/天口服持续10天)明显地降低脚掌体积大约-0.75毫升(D24)(1.59±0.03毫升对2.34±0.08毫升)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，E3(1毫克/千克静脉内，在D14和D19)稍微并明显地增加脚掌体积大约0.37毫升(2.71±0.09毫升对2.34±0.08毫升)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，911(10毫克/千克静脉内，在D14和D19)稍微并明显地增加脚掌体积大约0.36毫升(2.70±0.11毫升对2.34±0.08毫升)。
表13.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对脚掌体积的影响
Figure BSA00000643035001401
按照平均值±S.E.M.以毫升表示数值
每组n＝10只动物，除了吲哚美辛D24(n＝9)
Dunnett t检定：*P＝0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
4.关节炎指数
如在表14中所示，在D14，在媒剂-、吲哚美辛-、E3-和911-处理的关节炎组中，关节炎指数分别为10.1±0.8、8.7±0.6、10.2±0.4和9.7±0.7。与媒剂-处理的关节炎组相比较，吲哚美辛在3毫克/千克/天口服(持续10天)之后，强有力且明显地降低了关节炎指数(2.7±0.7对10.7±0.6)，最大值大约-8.0。与媒剂-处理的关节炎组相比较，E3(1毫克/千克静脉内，在D14和D19)不影响关节炎指数(11.4±0.4对10.7±0.6)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，911(10毫克/千克静脉内，在D14和D19)不影响关节炎指数(10.9±0.7对10.7±0.6)。
表14.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对关节炎指数的影响
Figure BSA00000643035001411
按照平均值±S.E.M.表示数值(分数)
每组n＝10只动物，除了吲哚美辛(n＝9)
Dunnett t检定：*P＝0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
5.脚掌细胞激动素含量
如在表15中所示，在D24，与无关节炎的媒剂-处理组相比较，在关节炎媒剂-处理组中，增加了左和右脚掌的细胞激动素含量，最大值约3.5(IL-1β)、4(TNF-α)和1.8(TGF-β1)倍。至于IL-6含量，在右和左脚掌中，在两组之间则没有观察到明显的差异。在左和右脚掌中，关节炎组的细胞激动素含量是类似的：IL-6、IL-1β、TNF-α和TGF-β1分别为259.7±38.5对219.2±32.4、4802.8±365.5对4007.1±380.4、17.8±1.6对18.6±1.9和9735.0±1219.8对9161.4±846.1微微克/毫升。与媒剂-处理的关节炎组相比较，吲哚美辛在3毫克/千克/天口服(持续10天)之后，稍微但明显地降低了右脚掌中TGF-β1的含量大约1.3倍(7057.4±335.6对9161.4±846.1)，而它并未修改IL-6、TNF-α或IL-1β含量。在左脚掌中也观察到类似但不明显的影响。与媒剂-处理的关节炎组相比较，E3(1毫克/千克静脉内，在D14和D19)不影响在两只脚掌中的IL-6、IL-1β、TNF-α或TGF-β1含量。与媒剂-处理的关节炎组相比较，911(10毫克/千克静脉内，在D14和D19)增加了在右脚掌中的IL-1β含量(6215.3±666.7对4007.1±380.4)。它对在两只脚掌中其他的细胞激动素含量并无影响。
表15.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对细胞激动素含量的影响
左脚掌细胞激动素含量
Figure BSA00000643035001421
右脚掌细胞激动素含量
Figure BSA00000643035001422
Figure BSA00000643035001431
按照平均值±S.E.M.以微微克/毫升表示数值
每组n＝10只动物，除了无关节炎/媒剂(右脚掌)，关节炎/媒剂(左脚掌)和吲哚美辛(n＝9)
Dunnett t检定：*P＝0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
6.循环TGF-β1的测量
如在表16中所示，在D24，与无关节炎的媒剂-处理组相比较，在关节炎媒剂-处理组中增加了血清TGF-β1含量(81715.7±1984.1对60269.9±2142.8)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，吲哚美辛在3毫克/千克/天口服(持续10天)之后，明显地减少了血清TGF-β1的含量大约1.5倍(57222.2±3194.1对81715.7±1984.1)。E3(1毫克/千克静脉内，在D14和D19)和911(10毫克/千克静脉内，在D14和D19)明显地减少了血清TGF-β1含量，使得在E3-和911-处理组中的细胞激动素含量可与在媒剂-处理的无关节炎组中观察到的相比拟(分别为69408.8±3926.7和67214.5±3649.4对60269.9±2142.8)。
表16.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对血清TGF-β1含量的影响
Figure BSA00000643035001432
按照平均值±S.E.M.以微微克/毫升表示数值
每组n＝10只动物，除了无关节炎/媒剂(右脚掌)，关节炎/媒剂(左脚掌)和吲哚美辛(n＝9)
Dunnett t检定：*P＝0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
7.血液学参数
如在表17中所示，与媒剂-处理的无关节炎大鼠相比较，在媒剂-处理的关节炎大鼠中血液学参数，如白血球和血小板是较高的(Student t检定P＞0.05)，而红血球、血红素和血球容积则未改变(Student t检定P＞0.05)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，吲哚美辛在3毫克/千克/天口服(持续10天)之后，不影响血液学参数。与媒剂-处理的关节炎组相比较，E3(1毫克/千克静脉内，在D14和D19)不影响血液学参数。与媒剂-处理的关节炎组相比较，911(10毫克/千克静脉内，在D14和D19)不影响血液学参数。
表17.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对血液参数的影响(在D24测量)
Figure BSA00000643035001441
按照平均值±S.E.M.表示数值
Anova：P＞0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
7.后脚掌重量
如在表18中所示，在媒剂-处理的关节炎大鼠中的左和右后脚掌重量比在媒剂-处理的无关节炎大鼠中的更高(分别为3.43±0.11对1.98±0.01和3.32±0.12对1.99±0.02克)(Student t检定或Mann-Withney P＜0.05)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，吲哚美辛在3毫克/千克/天口服(持续10天)之后，明显地减少了后脚掌重量(左后脚掌：2.23±0.04对3.43±0.11克；右后脚掌：2.20±0.05对3.32±0.12克)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，E3(1毫克/千克静脉内，在D14和D19)仅明显增加了左后脚掌重量(左后脚掌：3.86±0.14对3.43±0.11克；右后脚掌3.72±0.13对3.32±0.12克)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，911(10毫克/千克静脉内，在D14和D19)仅明显增加了右后脚掌重量(左后脚掌：3.73±0.12对3.43±0.11克；右后脚掌：3.83±0.15对3.32±0.12克)。
表18.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对后脚掌重量的影响(在D24测量)
Figure BSA00000643035001451
Figure BSA00000643035001461
按照平均值±S.E.M.以克表示数值
每组n＝10只动物，除了吲哚美辛(n＝9)
Dunnett t检定：*P＝0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
8.X-光分析
如在表19中所示，在媒剂-处理的无关节炎大鼠中观察到0.0±0.0的总分。媒剂-处理的关节炎大鼠有15.1±1.3的总分，并有高分的去矿物质化(2.4±0.3)、糜烂(2.7±0.3)、软组织伤害(3.1±0.2)和关节腔(3.3±0.2)，中间分数的骨膜反应(1.0±0.3)、成骨作用(0.8±0.2)和变形(1.8±0.2)。与媒剂-处理的关节炎大鼠相比较，吲哚美辛(3毫克/千克/天口服，持续10天)强有力且明显地减少总分大约10.7(4.4±0.9对15.1±1.3)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，E3(1毫克/千克静脉内，在D14和D19)不影响总分(14.2±1.3对15.1±1.3)。与媒剂-处理的关节炎组相比较，911(10毫克/千克静脉内，在D14和D19)不影响总分(15.4±1.0对15.1±1.3)。
表19.在静脉内注射(2天：D14-D19)之后，E3和911在风湿性关节炎的大鼠中对X-光参数的影响
Figure BSA00000643035001462
Figure BSA00000643035001471
按照平均值±S.E.M.表示数值(分数)
每组n＝10只动物，除了吲哚美辛(n＝9)
Dunnett t检定：*P＝0.05对媒剂-处理的关节炎大鼠
结论
在上述的实验条件下，E3(1毫克/千克静脉内，2天：D14-D19)和911(10毫克/千克静脉内，2天：D14-D19)显示出强的止痛效果，但在本关节炎模式中未显示出明显的消炎效果。
实例8：不同剂量的抗-NGF抗体E3在风湿性关节炎的大鼠模式中的效力
借着检查在E3投药与疼痛降低之间的剂量反应关系，进一步调查E3在关节炎大鼠中产生疼痛降低的能力。按照上述以佐剂处理大鼠，诱导关节炎。使用10只未注射佐剂的大鼠作为无关节炎对照组。在佐剂注射的14天之后，以上述的判断标准为基础，选出适任本研究的动物，随机分成8组每组10只大鼠，并测试其发声反应的强度。然后在14天按照上述给药，使用生理盐水，或0.003毫克/千克、0.01毫克/千克、0.03毫克/千克、0.1毫克/千克、0.3毫克/千克、1毫克/千克或5毫克/千克的E3抗体。在第16、18、20和24天测试动物的发声反应。在发声测试之后第18天，再度对动物给予生理盐水或相同剂量的E3。在第14天开始，每天也将动物秤重。因此在第14和18天，以特定剂量的抗体或生理盐水对动物投药两次，并在第14、16、18、20和24天评估疼痛5次。在表20-22和图20-22中示出数据。
表20.不同剂量的E3在风湿性关节炎的大鼠中对感受伤害反应的影响，按平均值±s.e.m.以mV表示发声强度
Figure BSA00000643035001481
借着使用二-尾ANOVA，与在以媒剂处理的关节炎动物与以特定剂量抗体E3处理的那些之间逐对获得的结果相比较，以统计方式分析以各种剂量的抗-NGF抗体E3处理动物，对疼痛诱导的发声(在表20中示出数据)的影响。在所有受试含量的E3处均有极为显著的影响(p＜0.0001)。即使是最低的受试剂量(0.003毫克/千克的E3)，在发声上的差异也是明显的(p＜0.0001)。
如在表20和图20中所示，与上文的实验一致，以1毫克/千克的抗体E3处理，显示快速和强烈的疼痛减轻。在2天内(最早的测试时间点)，发声强度降低90％。以较低浓度的E3处理，也提供强烈的疼痛减轻，虽然较低的剂量显示疼痛减轻花费稍长的时间。在第24天效力可能都明显地降低，除了最高的受试剂量，因为血浆E3含量的实际含量降低次于主题大鼠的免疫反应。似乎像0.003毫克/千克这样低的剂量，在本模式中也提供了至少部分的疼痛减轻。
表21.不同剂量的E3在风湿性关节炎的大鼠中对体重的影响(在第14天测量)
Figure BSA00000643035001491
Figure BSA00000643035001492
Figure BSA00000643035001501
表22.不同剂量的E3在风湿性关节炎的大鼠中对体重的影响(在第0天测量)
Figure BSA00000643035001502
Figure BSA00000643035001503
借着使用二-尾ANOVA，与在以媒剂处理的关节炎动物与以特定剂量抗体E3处理的那些之间逐对获得的结果相比较，以统计方式分析以各种剂量的抗-NGF抗体E3处理动物对体重的影响。使用在第14天对体重标准化的数据(表21)，0.03毫克/千克E3的剂量结果明显地改变了体重(p＜0.005)。在所有较高剂量的E3处，在处理和未处理关节炎动物之间的差异均是显著的(p＝或＜0.0001)。使用在第0天对体重标准化的数据(表22)，0.03毫克/千克E3的剂量结果明显地改变了体重(p＜0.002)。在所有较高剂量的E3处，在处理和未处理关节炎动物之间的差异均是显著的(p＜0.0001)。
再度与稍早的研究一致，以E3处理的大鼠显示出比生理盐水处理的关节炎大鼠更不明显的体重丧失(表22和图22)。事实上，以高剂量抗体E3处理的大鼠，体重丧失的恢复比其无关节炎的队友更早，且实际增重更快(表21和图21)。
实例9.抗-NGF抗体E3在因膝盖骨关节炎而有中等至严重疼痛的患者中的止痛效果
在本随机、安慰剂-对照、双盲、剂量-逐渐升高的研究中，在因膝盖骨关节炎而有中等至严重疼痛的患者中，比较抗-NGF抗体E3的单次静脉内给药(3微克/千克、10微克/千克、30微克/千克、100微克/千克或300微克/千克)与安慰剂的止痛效果。使体验到因膝盖骨关节炎而有中等-至-严重疼痛，但在其他方面整体健康良好的成年男女(年龄在35至65之间)加入本研究中。在筛选期间内，患者必须在给予抗-NGF抗体E3之前，先中断关节炎药物，如NSAIDs、环氧化酶第2型(COX-2)抑制剂和鸦片制剂至少14天。容许患者使用对乙酰胺基酚或布洛芬的解救药物，以实验室发现或过去的医疗病史为基础而有一些限制。有些患者在研究期间采用解救药物，但在给予抗-NGF抗体E3之前和之后2天不能吃解救药物。
34位患者参加本研究，并在研究第-1、1和2天经评估成为住院病人。在第1天早晨发生抗-NGF抗体E3的投药。使用电子日志纪录膝盖疼痛指数，以及在门诊和家里使用的解救药物。以安慰剂治疗10位患者。以抗-NGF抗体E3治疗24位患者：3微克/千克(第1队)、10微克/千克(第2队)和30微克/千克(第3队)每种剂量各4位患者；100微克/千克(第4队)和300微克/千克(第5队)每种剂量各6位患者。所使用的安慰剂是无菌的0.9％氯化钠注射，USP(生理盐水)。抗
-NGF抗体E3是冷冻液体调配物，由在10mM组氨酸、275mM蔗糖、0.01％聚山梨糖醇20，pH 6.0中的10毫克/毫升抗体所组成。在静脉内投药之前1小时，将冷冻的抗体融解，并以氯化钠注射液，USP稀释。以个体第-1天的体重为基础来计算每位患者的体积，并指定剂量含量，第1队的范围是从3-6cc，第2队是10-20cc，第3队是30-60cc，而第4和第5队是100cc。关于第1和第2队，在3至5分钟内借着缓慢静脉内积储给予抗体E3，接着以5cc氯化钠注射液，USP静脉内冲洗。至于第3-5队，经由输液帮浦以100cc/小时给予抗体E3，接着以5cc氯化钠注射液，USP静脉内冲洗，并中止IV。在每队中，借着与抗体E3相同的方式缓慢积储注射或连续输液给予安慰剂(氯化钠注射液，USP)。
在住院2天之后，让患者出院回家。依据各队的剂量含量，持续评估他们的疼痛程度，持续至抗体E3投药之后28天(第1、第2和第3队)，或高达抗体E3投药之后181天(第4和第5队)。在所有患者中进行定期安全性评估，持续181天。
在给药前和给予抗体E3之后多次评估止痛效果。对于目前的膝盖疼痛指数，使用范围从0-100的核准电子VAS，具有101点分辨率。每天提示患者四次并教导患者指出那时关节炎疼痛在膝盖指数中的等级。在步行期间对于膝盖指数也使用范围从0-100的核准电子VAS，具有101点分辨率。每天与第四次目前膝盖疼痛指数VAS同时完成在步行期间对膝盖疼痛指数的VAS。
在第-8和第-7天配给收集资料的电子日志，从第-8到第-2天进行电子日志服从的筛选评估，判定特定个体使用电子日志是否顺利。教导个体每天四次完成日志。使用在筛选期间纪录的平均VAS作为评估效果的基准线。
也使用WOMAC(Western Ontario and McMaster UniversitiesArthritis Scale)3.1骨关节炎指数
Figure BSA00000643035001531
来评估关节炎疼痛。WOMAC3.1TM包括分成三个领域的24个问题：疼痛(5个问题)、僵硬(2个问题)和物理功能(17个问题)。Bellamy等人，J.Rheumatol 15：1833-40(1988)；以及Bellamy等人，Semin.Arthritis Rheum.18：14-7(1989)。物理功能领域提供执行每天生活的活动能力的信息。在设计的出诊访问期间，患者直接在电子日志上进行测试，使用范围从0-100的核准的电子VAS，具有101个点分辨率。借着判定组成问题的VAS分数的平均值，对每个领域计分。借着判定分别来自三个领域的分数的平均值，计算总WOMAC3.1TM的分数。患者也须经由电子日志报告解救药物的使用。
按照与基准线(在筛选期间的疼痛程度)的改变评估成果，以疼痛强度差异(PID)或不同剂量含量的总和疼痛强度差异(SPID)来表示。使用共变数分析(ANCOVA)模式，分析在活动测量上与基准线的变化，以处理方式作为主要因子，并以基准线作为共变量。关于平均值和平均变化，使用Dunnett′s检定进行抗体E3与安慰剂的比较。使用Tukey-Ciminera-Heyse趋势检定，来评估剂量-反应关系。
如在图24中所示，在每个受试剂量中观察到在单次给予抗-NGF抗体E3之后，平均每日疼痛强度的降低。通常，在较高剂量(30微克/千克、100微克/千克和300微克/千克)处理组中，降低疼痛强度的效果比较低剂量(3微克/千克和10微克/千克)处理组更持久。如在图25中所示，在给予100微克/千克的E3之后，疼痛强度的降低至少持续80天。
下表23显示与基准线相比较，每种E3剂量的2-8天、2-14天、2-21天和2-28天的总和疼痛强度差异(SPID)。使用ANCOVA进行统计分析。表23指出在单次给予抗-NGF抗体E3之后，疼痛降低在统计学上是显著的(p＜0.05)。
表23.与基准线相比较，各种时间间隔的总和疼痛强度差异
Figure BSA00000643035001551
进行统计分析，不调整或为了多重比较而调整。在每个时间点，在括弧中的第一排p值是不调整的；在括弧中的第二排p值是以Dunnett′s调整的。
如图26所示，借着单次给予抗-NGF抗体E3，对每种受试的E3剂量，在SPID上最大降低的百分比从第2至第14天达到大约45％至大约65％，并对于10微克/千克、30微克/千克、100微克/千克和300微克/千克的E3剂量，从第2至第28天达到大约45％至大约60％。
如在图27中所示，抗-NGF抗体E3的投药也从第1至第28天降低了WOMAC分数。在100微克/千克剂量的E3下，明显降低了疼痛、物理功能和僵硬分数。这些数据暗示抗-NGF抗体的单次投药，在患有骨关节炎的患者中不仅降低了疼痛，也改善了物理功能和僵硬。
生物材料的保藏
下列材料已经保藏于美国典型培养物收集中心(American Type CultureCollection)，10801University Boulevard，Manassas，Virginia，USA(ATCC)：
Figure BSA00000643035001561
载体Eb.911.3E是编码E3轻链可变区的多核苷酸；载体Eb.pur.911.3E是编码E3轻链可变区的多核苷酸，且载体Db.911.3E是编码E3重链可变区的多核苷酸。
在国际承认用于专利的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty onthe International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposeof Patent Procedure and the Regulations thereunder)(布达佩斯条约)之下进行该保藏。这确保从保藏日起，维持保藏物可存活的培养物30年。在布达佩斯条约的期限和在Rinat Neuroscience Corp.和ATCC同意的题目之下，将由ATCC利用保藏物，其在相关的美国专利授权时，或任何美国或外国专利申请案提前公开时(无论哪个时间在先)，对大众确保永久和不受限地利用保藏培养物的子代，并对由美国专利和商标管理员(U.S.Commissioner of Patents and Trademarks)判定，根据35USC第122节和依据其局长令(包括37CFR第1.14节，并特别参考886OG 638)赋予资格者确保子代的可用性。
本申请案的受让人已经同意，若在保藏处的材料培养物当在适当的条件下培养时死亡或丧失或遭到破坏，将通告以其他的等同物迅速地置换该材料。不可将保藏材料的可用性解释为实施本发明的授权，亦不可违反在根据其专利法律的任何政府权力之下赐与的权力。
抗体序列
重链可变区域(Kabat CDRs用下划线表示；Chothia CDRs用黑斜体表示)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS
Figure BSA00000643035001571
WIRQPPGKGLEWIG
Figure BSA00000643035001572
Figure BSA00000643035001573
VTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
Figure BSA00000643035001574
WGQGTLVTVS (SEQ ID NO：1)
轻链可变区域(Kabat CDRs用下划线表示；Chothia CDRs用黑斜体表示)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BSA00000643035001575
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BSA00000643035001576
GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC
Figure BSA00000643035001577
FGQGTKLEIKRT (SEQ IDNO：2)
E3重链延伸的CDRs
CDRH1：GFSLIGYDLN(SEQ ID NO：3)
CDRH2：IIWGDGTTDYNSAVKS(SEQ ID NO：4)
CDRH3：GGYWYATSYYFDY(SEQ ID NO：5)
E3轻链延伸的CDRs
CDRL1：RASQSISNNLN(SEQ ID NO：6)
CDRL2：YTSRFHS(SEQ ID NO：7)
CDRL3：QQEHTLPYT(SEQ ID NO：8)
老鼠单克隆911延伸的CDRs
911重链延伸的CDRs
CDRH1：GFSLIGYDIN(SEQ ID NO：9)
CDRH2：MIWGDGTTDYNSALKS(SEQ ID NO：10)
CDRH3：GGYYYGTSYYFDY(SEQ ID NO：11)
911轻链延伸的CDRs
CDRL1：RASQDISNHLN(SEQ ID NO：12)
CDRL2：YISRFHS(SEQ ID NO：13)
CDRL3：QQSKTLPYT(SEQ ID NO：14)
E3重链氨基酸序列(全长)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTD
YNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQP
REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：16)
3E轻链氨基酸序列(全长抗体)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGV
PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDLATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
STLTLSKADYEKHXVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：17)
3E重链核苷酸序列(全长抗体)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGT
CCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCC
GACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAA
CCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCA
AGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGG
GGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTT
CCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTG
ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTC
AGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAA
CGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGT
TGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCT
GTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCT
GTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATG
TGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCA
ACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAA
CGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGA
GAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTG
CCACCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGA
AGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGA
GAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTA
TTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGT
TCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTC
TCCAGGAAAGTAA(SEQ ID NO：65)
3E重链可变区域核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGT
CCCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTTATCGGCTATGATCTTAACTGGATCC
GACAGCCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGATTATCTGGGGTGATGGAA
CCACAGACTATAATTCAGCTGTCAAATCCCGCGTCACCATCTCAAAAGACACCTCCA
AGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCGAGAGGAGGTTATTGGTACGCCACTAGCTACTACTTTGACTACTGG
GGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：66)
3E轻链核苷酸序列(全长抗体)
GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGT
CACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAGC
AGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACTCA
GGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACCAT
TAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATACCC
TTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCA
CCATCTGTCTTCATCTTTCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCT
GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG
TGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG
CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTAC
GAGAAACACMAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAG
TCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA(SEQ ID NO：67)
3E轻链可变区域核苷酸序列
GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGT
CACCATCACCTGCCGCGCATCTCAGTCCATTAGCAATAATCTGAACTGGTATCAG
CAGAAGCCAGGCAAAGCCCCAAAACTCCTGATCTACTACACCTCACGCTTCCACT
CAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCACCTTCACC
ATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGGAGCATA
CCCTTCCATATACCTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGC(SEQ IDNO：68)
在本文中描述的实例和具体实施例当然仅为了解释的目的，并且本领域技术人员可以据此提出各种修改或变化，且也将其纳入本申请的精神和范围内。
Figure ISA00000643035200011
Figure ISA00000643035200031
Figure ISA00000643035200041
Figure ISA00000643035200051
Figure ISA00000643035200061
Figure ISA00000643035200071
Figure ISA00000643035200081
Figure ISA00000643035200091
Figure ISA00000643035200101
Figure ISA00000643035200111
Figure ISA00000643035200121
Figure ISA00000643035200131
Figure ISA00000643035200151
Figure ISA00000643035200161
Figure ISA00000643035200171
Figure ISA00000643035200181
Figure ISA00000643035200191
Figure ISA00000643035200201
Figure ISA00000643035200211
Figure ISA00000643035200231
Figure ISA00000643035200241
Figure ISA00000643035200251
Figure ISA00000643035200261
Figure ISA00000643035200291
Figure ISA00000643035200301

Claims (85)

1.一种用于在个体中治疗骨关节炎疼痛的方法，包括给予该个体有效量的NGF拮抗剂。
2.如权利要求1的方法，其中所述个体是人。
3.如权利要求1的方法，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
4.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
5.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率为每个月1次、每两个月1次、每三个月1次、每四个月1次、每五个月1次或每六个月1次。
6.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以每三个月1次给予个体。
7.如权利要求3的方法，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，该疼痛的减轻持续至少大约7天的期间。
8.如权利要求3的方法，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，该疼痛的减轻持续至少大约14天的期间。
9.如权利要求3的方法，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，该疼痛的减轻持续至少大约4周的期间。
10.如权利要求3的方法，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，该疼痛的减轻持续至少大约12周的期间。
11.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约1毫克/千克范围内的剂量使用。
12.如权利要求11的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约100微克/千克的剂量使用。
13.如权利要求11的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约300微克/千克的剂量使用。
14.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以静脉内给药。
15.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以皮下给药。
16.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是单克隆抗体。
17.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是人类化抗体。
18.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体与人类NGF结合。
19.如权利要求18的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还与啮齿类NGF结合。
20.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体：
(a)以低于大约2nM的KD与NGF结合；
(b)以大约100pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约15pM人类NGF的存在下测量到的；以及
(c)以大约10pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约1.5pM的NGF的存在下测量到的。
21.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括重链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：3中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：4中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：5中的CDR3区。
22.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括轻链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：6中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：7中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：8中的CDR3区。
23.如权利要求22的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还包括重链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：3中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：4中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：5中的CDR3区。
24.如权利要求23的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQ ID NO：1和2中的氨基酸序列的抗体。
25.如权利要求24的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQ ID NO：16和17中的氨基酸序列的抗体。
26.一种用于改善患有骨关节炎的个体的物理功能的方法，包括给予该个体有效量的NGF拮抗剂。
27.如权利要求26的方法，其中所述个体是人。
28.如权利要求26的方法，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
29.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
30.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率为每个月1次、每两个月1次、每三个月1次、每四个月1次、每五个月1次或每六个月1次。
31.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以每三个月1次给予个体。
32.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约1毫克/千克范围内的剂量使用。
33.如权利要求32的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约100微克/千克的剂量使用。
34.如权利要求32的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约300微克/千克的剂量使用。
35.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以静脉内给药。
36.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以皮下给药。
37.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是单克隆抗体。
38.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是人类化抗体。
39.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体与人类NGF结合。
40.如权利要求39的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还与啮齿类NGF结合。
41.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体：
(a)以低于大约2nM的KD与NGF结合；
(b)以大约100pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约15pM人类NGF的存在下测量到的；以及
(c)以大约10pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约1.5pM的NGF的存在下测量到的。
42.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括重链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：3中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：4中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：5中的CDR3区。
43.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括轻链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：6中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：7中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：8中的CDR3区。
44.如权利要求43的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还包括重链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：3中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：4中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：5中的CDR3区。
45.如权利要求44的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQ ID NO：1和2中的氨基酸序列的抗体。
46.如权利要求45的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQ ID NO：16和17中的氨基酸序列的抗体。
47.一种用于在患有骨关节炎的个体中改善僵硬的方法，包括给予该个体有效量的NGF拮抗剂。
48.如权利要求47的方法，其中所述个体是人。
49.如权利要求47的方法，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
50.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
51.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率为每个月1次、每两个月1次、每三个月1次、每四个月1次、每五个月1次或每六个月1次。
52.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以每三个月1次给予个体。
53.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约1毫克/千克范围内的剂量使用。
54.如权利要求53的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约100微克/千克的剂量使用。
55.如权利要求53的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约300微克/千克的剂量使用。
56.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以静脉内给药。
57.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以皮下给药。
58.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是单克隆抗体。
59.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是人类化抗体。
60.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体与人类NGF结合。
61.如权利要求60的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还与啮齿类NGF结合。
62.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体：
(a)以低于大约2nM的KD与NGF结合；
(b)以大约100pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约15pM人类NGF的存在下测量到的；以及
(c)以大约10pM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约1.5pM的NGF的存在下测量到的。
63.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括重链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：3中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：4中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：5中的CDR3区。
64.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括轻链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：6中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：7中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：8中的CDR3区。
65.如权利要求64的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还包括重链可变区，其包括：
(a)显示在SEQ ID NO：3中的CDR1区；
(b)显示在SEQ ID NO：4中的CDR2区；以及
(c)显示在SEQ ID NO：5中的CDR3区。
66.如权利要求65的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQ ID NO：1和2中的氨基酸序列的抗体。
67.如权利要求66的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQ ID NO：16和17中的氨基酸序列的抗体。
68.一种试剂盒，其包括有效量的NGF拮抗剂以及为了治疗个体中的骨关节炎而将有效量的NGF拮抗剂给予个体的说明书。
69.如权利要求68的试剂盒，其中所述个体是人。
70.如权利要求68的试剂盒，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
71.如权利要求70的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
72.如权利要求70的试剂盒，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，疼痛的减轻持续至少大约7天的期间。
73.一种试剂盒，其包括有效量的NGF拮抗剂以及为了改善患骨关节炎个体的物理功能而将有效量的NGF拮抗剂给予个体的说明书。
74.如权利要求73的试剂盒，其中所述个体是人。
75.如权利要求73的试剂盒，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
76.如权利要求75的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
77.如权利要求75的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约1毫克/千克范围内的剂量使用。
78.一种试剂盒，其包括有效量的NGF拮抗剂以及为了在患骨关节炎的个体中改善僵硬而将有效量的NGF拮抗剂给予个体的说明书。
79.如权利要求78的试剂盒，其中所述个体是人。
80.如权利要求78的试剂盒，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
81.如权利要求80的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
82.如权利要求80的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约1毫克/千克范围内的剂量使用。
83.一种用于在个体中治疗骨关节炎疼痛的医药组合物，其包括NGF拮抗剂和在药学上可接受的载剂。
84.一种用于在患有骨关节炎的个体中改善物理功能的医药组合物，其包括NGF拮抗剂和在药学上可接受的载剂。
85.一种用于在患有骨关节炎的个体中改善僵硬的医药组合物，其包括NGF拮抗剂和在药学上可接受的载剂。
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