CN103263387A - 缓释的抗感染药 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脂质抗感染药物制剂，其基本上不含阴离子脂质，其中脂质与抗感染药物的比为约1∶1到约4∶1，其平均的平均直径小于约1μm。本发明还提供了一种制备脂质抗感染药物制剂的方法，其包括注入步骤。本发明还提供了一种脂质抗感染药物制剂，其中脂质与药物的比为约l∶1或更小，约0.75∶1或更小，后者约0.5∶1或更小，所述制剂是通过管线内注入法制备的。本发明还涉及一种肺部感染患者的治疗方法，其包括向患者给要以治疗有效量的本发明脂质抗感染药物制剂。本发明还涉及囊性纤维化患者的治疗方法，其包括向患者给药以治疗有效量的本发明脂质抗感染药物制剂。

Description

缓释的抗感染药

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2006年7月19日；申请号：200680034397.X(PCT/US2006/027859)；发明名称：“缓释的抗感染药”。

相关申请

本申请是2004年12月28日登记的美国专利申请序列No.11/023,971的继续申请，后者是2003年10月29日登记的美国专利申请序列No.10/696,389的继续申请，该申请要求享有2002年10月29日登记的美国临时专利申请序列No.60/421,923的权益。

介绍

某些适于吸入给药的缓释技术使用脂质体和脂质复合物通过缓释和寻靶能力以及提高药物在疾病位点的吸收来向肺部和全身提供延长的药物治疗效果。本发明包括一种脂质体抗感染药物，以及使用脂质体或脂质-复合抗感染药物来治疗肺部感染的方法。

正如Goodman和Gilman′s在The Pharmaceutical Basis of Therapeutics第八版中所报导的，“由于肾中毒和耳中毒发病率与氨基糖苷积累达到的浓度有关，因此减少这些药物在肾功能损伤患者中的维持剂量是至关重要的。”由于氨基糖苷能够导致前庭或听觉功能障碍和肾中毒而不顾患者的损伤，因此减少维持剂量通常是重要的。本发明显著降低了毒性，因此允许使用比惯用剂量高的剂量。

囊性纤维化(CF)患者的肺中具有厚的粘液和/或痰液分泌物、频繁的相继感染和由细菌入侵产生的生物薄膜。所有这些液体和材料都为抗感染药有效地寻靶感染制造了障碍。本发明克服了这些障碍，甚至能够降低剂量(在总量或在频率上)，因此减少了药物代给患者的负担。对于肺部感染，通常本发明所提供的剂量方案提供了一种减轻药物负担的方法。

对于脂质药物传输系统来说，通常期望尽可能地降低脂质与药物(L/D)的比例以使脂质负担最小化从而避免体内的饱和效应。对于通过吸入进行的肺传输来说，这一点是特别正确的因为对于长期使用来说，脂质体的剂量可以会超过清除率并因此限制给药并且因此限制药物产品的效果。低L/D比将使得在达到剂量/清除率阈值之前能够给予更多的药物。

发明简介

通过本文所公开的注入法，能够制备出基本不含中等尺寸(＜1μm)的阴离子脂质的脂质体，该脂质体以一般为约4∶1到约0.5∶1的脂质/抗感染药物重量比来包埋抗感染药物。测量了脂质体的包埋体积，由这些数字能够计算出在抗感染药物表现为溶解物(即，其不会与脂质体膜相互作用但能够与水一起理想地包埋)时的理论包埋量。通过该对比，观察到的包埋量数值比预期的高3-5倍，这表明发生了特异性的相互作用使得包埋量大于预期值并且脂质/抗感染药物比小于预期值。脂质体形成于其中的溶液含有一定浓度的抗感染药物，脂质体内抗感染药物的浓度应当与溶液中的浓度大体相同。然而，计算出的内部抗感染药物浓度至少是溶液中浓度的约3倍高。

部分地，本发明的特征在于一种脂质体抗感染药物制剂，其包含脂质制剂和抗感染药物，其中所述脂质制剂基本上不含阴离子脂质，并且其中脂质与抗感染药物的重量比为约4∶1到约1∶1。在某些实施方式中，脂质与抗感染药物的重量比为约3∶1到约1∶1，2∶1到约1∶1，或为约1∶1。

在一些实施方式中，本发明涉及一种包含抗感染药物的脂质制剂，其中脂质与抗感染药物的比为约1∶1或更低，为约0.75∶1或更低，或为约0.5∶1或更低。

在某些实施方式中，脂质抗感染制剂所包含的脂质体的平均直径为约0.2μm到约1.0μm。在某些其它实施方式中，所述平均直径为约0.2μm到约0.5μm。在某些其它实施方式中，所述平均直径为约0.2μm到约0.3μm。

在某些实施方式中，所述抗感染药物可以是本领域通常已知的任何抗感染药物。在某些实施方式中，所述抗感染药物可以是氨基糖苷，其包括但不限于，阿米卡星、妥布霉素或庆大霉素，或者它们的药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，脂质制剂包含中性脂质。在某些实施方案中，脂质制剂不含阴离子脂质。在某些其它实施方案中，所述脂质是磷脂，其包括但不限于，卵磷脂例如二棕榈酰磷脂酰胆碱或二油酰磷脂酰胆碱；或者所述脂质可以是类固醇例如甾醇，其包括但不限于，胆固醇；或者所述脂质可以是它们的组合。

部分地，本发明的特征在于上述脂质抗感染药物制剂的制备方法，其包括在低于中性脂质至少一种脂质组分的相变温度下向抗感染药物的水或醇溶液或混合物中注入脂质-醇溶液或混合物，其中注入是从上方进行的。在某些实施方式中，所述醇是乙醇。

在某些实施方式中，脂质-醇溶液或混合物的浓度为约10到约30mg/mL。在某些实施方式中，抗感染药物的水或醇溶液或混合物的浓度为约20到约70mg/mL。在某些实施方式中，中性脂质-醇溶液或混合物的浓度为约10到约30mg/mL，并且抗感染药物的水或醇溶液或混合物的浓度为约20到约70mg/mL。然而，本领域普通技术人员能够理解，所述浓度是可以根据其所包含的脂质和/或抗感染药物而改变或优化的。

在某些实施方式中，本发明涉及上述的脂质制剂，其中抗感染药物选自以下药物：氨基糖苷、四环素、磺胺、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、喹诺酮、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、大环内酯、林可霉素、氯洁霉素、奇霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜类、氯苯吩嗪、瑟利德米、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑类、三唑类、灰黄霉素、特康唑、布康唑、环己吡酮乙醇胺(ciclopirax)、环吡酮胺、卤丙炔氧苯、发癣退、萘替芬、特比萘芬或它们的组合。在某些实施方式中，本发明涉及上述的脂质制剂，其中抗感染药物是氨基糖苷。在进一步的实施方式中，抗感染药物是选自阿米卡星、庆大霉素或妥布霉素的氨基糖苷。在进一步的实施方式中，抗感染药物是阿米卡星。在进一步的实施方式中，抗感染药物是庆大霉素。在进一步的实施方式中，抗感染药物是妥布霉素。

在某些实施方式中，本发明涉及上述的脂质制剂，其中所述脂质制剂是脂质体。

在某些实施方式中，本发明涉及上述的脂质制剂，其中所述脂质制剂包含磷脂。在某些实施方式中，所述脂质制剂包含类固醇。在某些实施方式中，所述脂质制剂包含甾醇。在某些实施方式中，所述脂质制剂包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。在某些实施方式中，所述脂质制剂包含胆固醇。在某些实施方式中，所述脂质制剂包含磷脂和类固醇。在某些实施方式中，所述脂质制剂包含磷脂和甾醇。在某些实施方式中，所述脂质制剂包含DPPC和胆固醇。在某些实施方式中，本发明涉及上述的制剂，其中所述脂质制剂包含DPPC、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇。

在某些实施方式中，本发明涉及上述的制剂，其中所述脂质制剂包含的DPPC和胆固醇的摩尔比为约20∶1、10∶1、5∶1、2∶1或1∶1。

在某些实施方式中，本发明涉及上述的制剂，其中所述脂质制剂包含的DPPC、DOPC和胆固醇的摩尔比为约5-20∶1-20∶0.5-1。

在某些实施方式中，本发明涉及上述的脂质制剂，其中所述脂质制剂是脂质体，抗感染药物是阿米卡星。

在某些实施方式中，本发明涉及上述的脂质制剂，其中所述脂质制剂是脂质体，抗感染药物是阿米卡星，并且所述脂质制剂包含磷脂和甾醇。

在某些实施方式中，本发明涉及上述的脂质制剂，其中所述脂质制剂是脂质体，抗感染药物是阿米卡星，并且所述脂质制剂包含DPPC和胆固醇。

在另一个实施方式中，本发明涉及包含抗感染药物的脂质制剂的制备方法，其包括：将脂质溶液或混合物的物料流与抗感染药物溶液或混合物的物料流混合，其中二种物料流是在管线内混合的。在某些实施方式中，在在管线内混合之前两种物料流先进入一个Y形连接器中。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中脂质溶液或混合物物料流和抗感染药物溶液或混合物物料流是以约700到约900mL/min的总流量混合的。在某些实施方式中，脂质溶液或混合物物料流和抗感染药物溶液或混合物料流是以约800mL/min的总流量混合的。在某些实施方式中，脂质溶液或混合物物料流是以约200到约400mL/min的流量加入的。在某些实施方式中，脂质溶液或混合物物料流是以约300mL/min的流量加入的。在某些实施方式中，抗感染药物溶液或混合物物料流是以约400到约600mL/min的流量加入的。在某些实施方式中，抗感染药物溶液或混合物物料流是以约500mL/min的流量加入的。在某些实施方式中，脂质溶液或混合物物料流是以约300mL/min的流量加入的，抗感染药物溶液或混合物物料流是以在约500mL/min的流量加入的。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中混合物料流的温度是约30-40℃。在某些实施方式中，脂质溶液或混合物的温度是约30℃，抗感染药物溶液或混合物的温度是约30℃。在某些实施方式中，脂质溶液或混合物的温度是约50℃，抗感染药物溶液或混合物的温度是室温。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中含有抗感染药物的脂质制剂的制备方法进一步包括在混合后将混合物物料流用水稀释至少约20秒的步骤。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中抗感染药物溶液或混合物的浓度是约30到约50mg/mL。在某些实施方式中，抗感染药物溶液或混合物的浓度是约40到约50mg/mL。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中脂质溶液或混合物物料流是以约300mL/min的流量加入的，抗感染药物溶液或混合物物料流是以约500mL/min的流量加入的；混合物料流的温度是约30-40℃；混合后将混合物料流用水稀释至少约20秒；并且抗感染药物溶液或混合物的浓度是约40到约50mg/mL。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述溶液或混合物是含水的或是含醇的。在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述脂质制剂是脂质体。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述抗感染药物选自：氨基糖苷、四环素、磺胺、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、喹诺酮、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、大环内酯、林可霉素、氯洁霉素、奇霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜类、氯苯吩嗪、瑟利德米、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑类、三唑类、灰黄霉素、特康唑、布康唑、环己吡酮乙醇胺、环吡酮胺、卤丙炔氧苯、发癣退、萘替芬、特比萘芬或它们的组合。在某些实施方式中，所述抗感染药物是氨基糖苷。在进某些实施方式中，所述抗感染药物是选自阿米卡星、庆大霉素或妥布霉素的氨基糖苷。在某些实施方式中，所述抗感染药物是阿米卡星。在某些实施方式中，所述抗感染药物是庆大霉素。在某些实施方式中，所述抗感染药物是妥布霉素。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述脂质包含磷脂。在某些实施方式中，所述脂质包含类固醇。在某些实施方式中，所述脂质包含甾醇。在某些实施方式中，所述脂质包含DPPC。在某些实施方式中，所述脂质包含胆固醇。在某些实施方式中，所述脂质包含磷脂和甾醇。在某些实施方式中，所述脂质包含DPPC和胆固醇。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述脂质制剂是脂质体，抗感染药物是阿米卡星。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述脂质制剂是脂质体，抗感染药物是阿米卡星，并且所述脂质体包含磷脂和甾醇。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述脂质制剂是脂质体，抗感染药物是阿米卡星，并且所述脂质包含DPPC和胆固醇。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中在所述脂质制剂中脂质与抗感染药物的比为约1∶1或低于1∶1。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中在所述脂质制剂中脂质与抗感染药物的比为约0.75∶1或低于0.75∶1。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中在所述脂质制剂中脂质与抗感染药物的比为约0.5∶1或低于0.5∶1。

在某些实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述脂质制剂是脂质体，抗感染药物是阿米卡星，所述脂质包含DPPC和胆固醇，并且脂质与抗感染药物的比为约1∶1或低于1∶1。

在另一个实施方式中，本发明涉及在需要的患者中治疗肺部感染的方法，其包括向患者给药以治疗有效量的脂质抗感染药物制剂，所述脂质抗感染药物制剂包含脂质制剂和抗感染药物，其中所所述抗感染药物的剂量为约100mg/天或少于100mg/天。在进一步的实施方式中，所述抗感染药物的剂量为约30mg到约50mg每两天。在进一步的实施方式中，所述抗感染药物的剂量为约30mg到约50mg每三天。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所所述脂质体的平均直径为约0.2μm到约1.0μm。在进一步的实施方式中，所述脂质体的平均直径为约0.2μm到约0.5μm，或约0.2μm到约0.3μm。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中肺感染是囊性纤维化的结果。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述脂质与抗感染物的重量比为约4∶1到约0.5∶1，约3∶1到约0.5∶1，约2∶1到约0.5∶1，或者约1∶1到约0.5∶1。

在另一实施方式中，本发明涉及如上所述的方法，其中所述抗感染药物选自：氨基糖苷、四环素、磺胺、对氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、喹诺酮、β-内酰胺、β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂、氯霉素、青霉素、头孢菌素、大环内酯、林可霉素、氯洁霉素、皮质类甾醇(coricosteroids)、前列腺素、奇霉素、多粘菌素B、粘菌素、万古霉素、杆菌肽素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨基水杨酸、环丝氨酸、卷曲霉素、砜类、氯苯吩嗪、瑟利德米、多烯抗真菌剂、氟胞嘧啶、咪唑类、三唑类、灰黄霉素、特康唑、布康唑、环己吡酮乙醇胺、环吡酮胺、卤丙炔氧苯、发癣退、萘替芬、特比萘芬或它们的组合。在另一个实施方式中，所述抗感染药物是氨基糖苷。在另一个实施方式中，所述抗感染药物是阿米卡星。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的治疗方法，其中所述脂质制剂包含中性脂质。在另一个实施方式中，用于制备脂质制剂的脂质全部是中性脂质。在另一个实施方式中，所述脂质体不含阴离子脂质。在另一个实施方式中，所述脂质制剂包含磷脂。在另一个实施方式中，脂质制剂包含甾醇。在另一个实施方式中，所述脂质制剂包含DPPC和胆固醇。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的治疗方法，其中所述抗感染药物是阿米卡星，并且脂质制剂包含DPPC和胆固醇。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的治疗方法，其中所述抗感染药物是阿米卡星，脂质与抗感染药物的重量比为约4∶1到约1∶1，并且脂质制剂包含DPPC和胆固醇。在进一步的实施方式中，所述重量比为约3∶1到约1∶1，2∶1到约1∶1，或者为约1∶1。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的治疗方法，其中所述抗感染药物是阿米卡星，脂质与抗感染药物的重量比为约4∶1到约1∶1，脂质制剂包含DPPC和胆固醇，并且肺部感染是囊性纤维化的结果。在一个进一步的实施方式中，所述重量比为约3∶1到约1∶1，2∶1到约1∶1，或者为约1∶1。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的治疗方法，其中所述抗感染药物是阿米卡星，脂质与抗感染药物的重量比为约4∶1到约0.5∶1，脂质制剂包含DPPC和胆固醇，并且脂质体的平均直径为约0.1μm到约0.5μm。在进一步的实施方式中，所述平均直径为约0.2μm到约0.4μm，或约0.2μm到约0.3μm。

在另一个实施方式中，本发明涉及如上所述的治疗方法，其中所述抗感染药物是阿米卡星，脂质与抗感染药物的重量比为约4∶1到约0.5∶1，脂质制剂包含DPPC和胆固醇，肺部感染是由囊性纤维化导致的，并且脂质体的平均直径为约0.1μm到约1.0μm。在进一步的实施方式中，所述平均直径为约0.2μm到约0.5μm，或为约0.2μm到约0.3μm。

从下述说明书、附图和权利要求来看本发明的这些实施方式，其它实施方式，和它们的特征和特性是显而易见的。

附图简介

图1描述了在患有囊性纤维化的患者中所看到的痰液/生物薄膜的截面图。

图2描述了本发明药物的寻靶和库存作用的示意图。

图3和图4描述了多种形式的阿米卡星的细菌学活性示意图。

图5描述了脂质体/复合的阿米卡星和妥布霉素的缓释示意图。

图6描述了关于单体或复合的环丙沙星的数据。

图7描述了多种剂量方案给出的肺中药物残留的示意图。

图8描述了制备脂质体抗感染制剂的两物料流管线内注入法的示意图。

图9描述了硫酸阿米卡星与乙醇/水的混溶性。直线代表室温(RT)和40℃下，能够与乙醇溶液混溶的最大阿米卡星浓度(碱)。在较高的浓度下阿米卡星形成了单独的液相(凝聚层)，其后来沉淀为晶体。垂直的线表示在脂质/阿米卡星注入混合物(300/500份)中的和加入200份水后的乙醇浓度。

发明详述

本发明公开了一种包含感染药物的脂质制剂，其中该脂质制剂的尺寸以及脂质与药物的比要比先前已知的小。本发明还公开了这些脂质制剂的制备方法。

1.定义

为了方便，在进一步描述本发明前，此处收集了说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。这些定义应当根据发明公开的其余部分来理解，并且由本领域技术人员理解。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域普通技术人员理解的相同。

本文中冠词“一个”和“一种”用于指代该冠词表示的一个或多于一个(即至少一个)这样的语法目的。例如“一种组分”是指一种或多于一种的组分。

术语“生物可利用的”是本领域公认的，是指允许被所给予的个体或者患者吸收、掺入、或其它生理学可获得的本发明的一种形式，或给予量的一部分。

术语“包括”和“包含”是用于表示包含在内的，开放的意思，是指可以包含其它成分。

术语“包囊的”和“包囊”是指将抗感染药物吸附在脂质基制剂的表面上、在双层或两个单层之间的间隙区域结合抗感染药、在双层之间的空间内包埋抗感染药、或在双层的最内层或单层所围绕形成的空间内包埋抗感染药。

本文中术语“包括”是用于指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可以互换使用。

本文所讨论的术语“脂质抗感染药物制剂”或“Lip-抗感染药物”或“Lip-An”是指任何形式的抗感染药物组合物，其中按重量计至少约1％的抗感染药物与脂质相关，其或者作为与脂质复合物的一部分，或者作为脂质体，在该脂质体中抗生素可以处于水相或疏水的双层相或脂质体双层的分界面首基区域中。优选地，至少约5％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约25％能够如上所述地结合。结合可以通过用过滤器分离而测定，其中脂质和脂质-结合的抗感染药物得到保留而抗感染药物单体则在滤液中。“脂质体抗感染药物制剂”是指其中脂质基是脂质体形式的脂质抗感染药物制剂。

术语“哺乳动物”是本领域已知的，示例性的哺乳动物包括人、灵长类动物、牛、猪、狗、猫和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。

通过本方法治疗的“患者”、“个体”或“宿主”可指人或非人类动物。

术语“药学上可接受的盐”是本领域公认的，是指化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐，其包括，例如那些包含于本发明组合物中的盐。

术语“溶剂注入”是一种方法，其包括将一种或多种脂质溶解于少量的，优选最小限度量的方法相容的溶剂中形成脂质悬浮液溶液(优选溶液)，然后将该溶液加入到含有生物活性剂的含水介质中。代表性的方法相容的溶剂是在例如透析的含水处理中可被洗去的溶剂。被冷/热循环的组合物优选通过溶液注入形成，其中乙醇注入是优选的。优选醇作为溶剂。“乙醇注入”是一类溶液注入，该方法包括将一种或多种脂质溶于少量，优选最小限度量的乙醇中形成脂质溶液，然后将该溶液加入到含有生物活性剂的含水介质中。“少量”的溶剂是在注入过程中适合于形成脂质体或脂质复合物的量。术语“溶液注入”还可以包括管线内注入法，其中制剂组合物的两种物料流首先进行在管线内混合。

术语“基本上不含”是本领域公认的，其是指微小或比微小更小的量。

术语“治疗剂”是本领域公认的，是指任何的化学部分，所述化学部分是能够局部或全身地作用于个体的生物学、生理学或药理学活性物质。治疗剂，也称作“药物”，其实例描述于公知的参考文献种，例如Merck Index，the Physicians Desk Reference和ThePharmacological Basis of Therapeutics，它们包括但不限于药品；维生素；矿物补充物；用于处理、预防、诊断、治疗或缓解疾病或病症的物质；影响身体结构或机能的物质；或者前药，在被置于生物学环境后它们变为生物学活性的或活性更高。

本文所使用的术语“治疗有效量”是指包含根据本发明的脂质抗感染药物制剂的化合物、材料或组合物能够通过抑制肺部感染而有效地产生一些期望的治疗效果的量。

术语“治疗”是本领域公认的，其是指使任何病症或疾病的至少一种症状得到治疗和改善。术语“治疗”还指预防性的治疗，其作用是防止或预防病症或疾病。

2.抗感染药物

抗感染药物是能够抵抗感染的试剂，所述感染例如细菌、分枝杆菌、真菌、病毒或原生动物感染。本发明所涉及的抗感染药物包括但不限于氨基糖苷(例如，链霉素、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、萘替米星和卡那霉素等)，四环素(例如金霉素、土霉素、甲烯土霉素、强力霉素和米诺环素等)，磺胺类药物(例如，磺胺、磺胺嘧啶、新诺明(sulfamethaoxazole)、磺胺异噁唑和磺胺醋酰等)，对氨基苯甲酸，二氨基嘧啶(例如甲氧苄氨嘧啶，其经常与新诺明和吡嗪酰胺等结合使用)，喹诺酮(例如萘啶酮酸、噌

星、环丙沙星和诺氟杀星等)、青霉素(例如青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、氨下青霉素酞酯、羧苄青霉素、卡茚西林、羧噻吩青霉素、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林等)，耐青霉素酶青霉素(例如甲氧西林、

洒西林、氯唑西林、双氯西林和萘夫西林等)，第一代头孢菌素(例如头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻吩、头孢吡令和头孢唑啉等)，第二代头孢菌素(例如氯孢菌素、头孢羟唑、头孢尼西、头孢西丁、头孢替坦、头孢氨呋肟、头孢呋辛酯、头孢美唑、头孢丙烯、氯碳头孢和头孢雷特等)，第三代头孢菌素(例如氨甲苯唑头孢菌素、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢克肟、头孢泊肟和头孢布烯等)，其他β-内酰胺(例如亚胺培南、美罗培南、氨曲南、棒酸、舒巴坦和他唑巴坦等)，β内酰胺酶抑制剂(例如棒酸)，氯霉素，大环内酯(例如红霉素、阿奇霉素和克拉霉素等)，林可霉素，氯洁霉素，奇霉素，多粘菌素B，多粘菌素(例如多粘菌素A、B、C、D、E1(粘菌素A)、或E2以及粘菌素B或C等)粘菌素，万古霉素，杆菌肽素，异烟肼，利福平，乙胺丁醇，乙硫异烟胺，氨基水杨酸，环丝氨酸，卷曲霉素，砜类(例如氨苯砜和索发克松钠等)，氯苯吩嗪，瑟利德米，或者能够被脂质包囊的任何其它抗菌剂。抗感染药物可以包括抗真菌药物，包括多烯抗真菌剂(例如两性霉素B、制霉菌素和游霉素等)，氟胞嘧啶，咪唑类((例如n-噻康唑、克霉唑、益康唑和酮康唑等)，三唑类(例如伊曲康唑和氟康唑等)，灰黄霉素，特康唑，布康唑，环己吡酮乙醇胺，环吡酮胺，卤丙炔氧苯，发癣退，萘替芬，特比萘芬或者能够被脂质包囊或复合的其它任何抗真菌剂。讨论和实施例是主要针对阿米卡星的，但并不是意图将本申请的范围限于该抗感染药物。可以使用药物的组合。

优选的抗感染药物包括氨基糖苷、喹诺酮、多烯抗震真菌剂和多粘霉素。

能够用于本发明脂质抗感染药物制剂中的合适的抗感染药物的还包括抗感染药物的药学上可接受的加成盐和复合物。在化合物可以具有一个和多个手性中心的情况中，除非特别说明，本发明包括每种单独的外消旋化合物以及每种单独的非外消旋化合物。

在抗感染药物具有不饱和碳碳双键的情况中，顺式(Z)和反式(E)异构体均在本发明的范围之内。在抗感染药物可以以互变异构形式存在的情况下，例如酮-烯醇互变异构体，例如

和

每一种互变异构形式都被认为包含在本发明的范围内，无论其是以平衡形式还是以一种被R’适当取代的固定形式存在。在任何情况下任何取代基的含义都与其在任何其它情况下的含义无关，或者与任何其它情况下任何其它取代基的含义无关。

能够用于本发明脂质抗感染药物制剂的合适的抗感染药物的还包括铂化合物的前药。前药被认为是能够在体内释放活性母体化合物的任何共价键合的载体。

3.肺部感染

在肺部感染(例如囊性纤维化患者)中，能够用本发明方法治疗的是假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、食酸假单胞菌(P.paucimobilis)、恶臭假单胞菌(P.putida)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)和食酸假单胞菌(P.acidovorans))，葡萄球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，链球菌(包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))，大肠杆菌(Escherichia coli)，克氏杆菌(Klebsiella)，肠杆菌(Enterobacter)，沙雷菌(Serratia)，嗜血杆菌(Haemophilus)，耶尔森氏菌pesos(Yersinia pesos)，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(burkholderia pseudomallei)，洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)，椰毒伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)，吩嗪伯克霍尔德氏菌(B.multivorans)，越南伯克霍尔德氏菌(B.vietnamiensis)，结核菌分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，鸟分枝杆菌复合菌(M.avium complex)(MAC)(鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(M.intracellulare))，堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，蟾分枝杆菌(M.xenopi)，海洋分枝杆菌(M.marinum)，溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)或偶发分枝杆菌复合菌(M.fortuitum complex)(偶发分枝杆菌和龟分枝杆菌(M.chelonei))感染。

4.治疗方法

本发明的一个实施方式包括一种治疗方法，所述方法包括给药以治疗有效量的脂质抗感染药物制剂。

当下文中没有提供特定的剂量时，如果是通过喷雾器向肺传送的，则本发明优选的剂量是最小单体药物(当然其也可以是盐)有效量的50％或小于50％，35％或小于35％，20％或小于20％，10％或小于10％，从而使肺中的CFU计数在14天的治疗疗程中减少一个数量级。药物当量是累积数量，其将在应用本发明药物给药方案的剂量周期中使用。本段中所定义的最小单体药物当量是一个“相当于单体药物的量”。

本发明的非-CF治疗实施方式可以使用任何动物，虽然优选的是人。针对所给定的动物测定这种动物的相对用量。

剂量方案优选是一天一次或少于一天一次。在优选的实施方式中，剂量方案是每两天一次，每三天一次，每周一次或者更少。例如，剂量方案可以是每两天使用50％或者小于50％的单体药物当量，或者是比这更少的剂量。或者，例如所述剂量可以是每天使用35％或小于35％的单体药物当量。参见图3和4的动物数据，它们显示本发明的脂质抗感染药物制剂比药物单体更有效。

为了治疗感染，抗感染药物的有效量是临床医师可获知的，但是其包括对治疗、减轻、改善、消除或预防所要治疗的疾病或所要避免或治疗的病症的一种或多种症状有效的量，或者是对使疾病或病症产生临床上可识别的病理学变化的有效的量。改善包括在所预防性治疗的动物中，感染的发病率或严重性的减少。在某些实施方式中，有效量是在肺部感染症状出现后对治疗或改善有效的量。在某些其它实施方式中，有效量是在所预防性治疗的动物中对治疗或改善感染的平均发病率或严重性有效的量(是通过统计学研究测定的)。

脂质体或其它脂质传输系统可以作为雾化喷雾、粉末或气雾剂进行吸入给药，或者进行鞘内给药。吸入给药是优选的。总的结果是，与药物单体或胃肠外形式的药物相比，其降低了给药频率并且提高了治疗指数。脂质体或其它脂质制剂是特别有利的，这是由于它们具有在与肺泡衬里或肺泡表面活性物质相容的同时还能够保护药物的能力。

本发明包括用于治疗肺部革兰氏阴性感染的方法。一个有效地得到治疗的感染是CF患者中的慢性假单胞菌感染。已知的用氨基糖苷对肺部感染进行的治疗(例如在CF患者中)通常包括通过吸入每天给药以大约200-600mg的阿米卡星或妥布霉素。在一个优选的实施方式中，本发明允许通过每天给药以100mg或小于100mg(或者如果剂量不太频繁，则其在标准化后相当于100mg每天)的阿米卡星来进行治疗。在又另一个实施方式中，每天给药以60mg或小于60mg的阿米卡星。在仍另一个实施方式中，进行每两天不超过一次的大约30到50mg的给药。最优选的实施方式包括每隔一天或每三天给药大约30到50mg。

5.脂质和脂质体

本发明组合物中所用的脂质可以是合成、半合成或天然存在的脂质，包括磷脂、生育酚、甾体、脂肪酸、糖蛋白例如白蛋白、阴离子脂质和阳离子脂质。脂质可以是阴离子的、阳离子的或是中性的。在一个实施方式中，脂质制剂基本上不含阴离子脂质。在一个实施方式中，脂质制剂仅包含中性脂质。在另一个实施方式中，脂质制剂不含阴离子脂质。在另一个实施方式中，脂质是磷脂。磷脂包括卵磷脂酰胆碱(EPC)，卵磷脂酰甘油(EPG)，卵磷脂酰肌醇(EPI)，卵磷脂酰丝氨酸(EPS)，卵磷脂酰乙醇胺(EPE)和卵磷脂酸(EPA)；大豆对应物，大豆磷脂酰胆碱(SPC)；SPG，SPS，SPI，SPE，和SPA；氢化卵和大豆对应物(例如，HEPC，HSPC)，其它的由脂肪酸在甘油的2和3位的酯键所构成的磷脂，其中所述甘油含有12到26个碳原子的链并且在甘油的1位具有不同的端基，包括胆碱，甘油，肌醇，丝氨酸，乙醇胺以及相应的磷脂酸。这些脂肪酸上的链可以是饱和或不饱和的，并且所述磷脂可以由不同链长度和不同不饱和度的脂肪酸组成。特别是，制剂的组成可以包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，天然存在的肺表面活性物质的一种主要成分，和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。其它实例包括二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)，二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)和混合磷脂如棕榈酰硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)和棕榈酰硬脂酰基磷脂酰甘油(PSPG)，driacylglycerol，二酰甘油，seranide，鞘氨醇，鞘磷脂和单酰基化磷脂如单-油酰基-磷脂酰乙醇胺(MOPE)。

所使用的脂质可以包括脂肪酸、磷脂和甘油酯，甾体，磷脂酰甘油(PGs)，磷脂酸(PAs)，磷脂酰胆碱(PCs)，磷脂酰肌醇(Pis)和磷脂酰丝氨酸(PSs)的铵盐。脂肪酸包括碳链长度为12到26个碳原子的脂肪酸，其可以是饱和或不饱和的。一些具体的例子包括：肉豆蔻酰胺、棕榈酰胺、月桂酰胺、硬脂酰胺、二月桂酰乙基磷酸胆碱(DLEP)、二肉豆蔻酰乙基磷酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N-(2，3-二-(9-(Z)-十八烯基氧)-丙-1-基-N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTMA)和1，2-二(油酰氧)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)。甾体的实例包括胆固醇和麦角固醇。PGs，Pas，Pis，PCs和PSs的实例包括DMPG，DPPG，DSPG，DMPA，DPPA，DSPA，DMPI，DPPI，DSPI，DMPS，DPPS和DSPS，DSPC，DPPG，DMPC，DOPC，卵PC。

由卵磷脂，例如DPPC，组成的脂质体或脂质抗感染制剂能够帮助肺部细胞例如肺泡巨噬细胞的吸收并且有助于抗感染药剂在肺部的缓释(Gonzales-Rothi等人(1991))。带负电荷的脂质例如PGs、Pas、PSs和PIs，除了能够减少粒子的聚集以外，还可以在吸入制剂的缓释特性以及在制剂穿过肺部(转胞吞作用)以便全身性吸收的传输中起作用。甾醇化合物被认为影响了制剂的释放和渗滤特性。

脂质体是含有包埋含水容积的完全闭合的脂质双分子层膜。脂质体可以是单层泡囊(具有单一薄膜双分子层膜)或多层泡囊(是以多层薄膜双分子层膜为特征的洋葱状结构，每一层通过含水层二彼此分离)。所述双分子层由两个具有疏水“尾”区域和亲水“头”区域的脂质单层组成。薄膜双分子层的结构是脂质单层的疏水(非极性)“尾”朝向双分子层的中心，而亲水性“头”朝向水相。脂质抗感染制剂是脂质和抗感染药物的结合。该结合可以是共价的、离子的、静电的、非共价的或者是立体化学的。这些复合物是非-脂质体的并且不能包埋另外的水溶性溶质。这样的复合物的实例包括两性霉素B的脂质复合物(Janoff等人，Proc.Nat Acad.ScL，85：6122 6126，1988)和心磷脂与阿霉素的复合物。

脂质笼合物是用一种或多种脂质形成的三维的、笼样的结构，其中所述结构包埋有生物活性剂。这样的笼合物也被归入本发明的范围。

前体脂质体是在与含水溶液浸渍接触后能够变为脂质体或脂质复合物的制剂。搅拌或其它的混合操作是必要的。这样的前体脂质体也被归入本发明的范围内。

脂质体可以通过许多方法制备(例如，参见，Bally，Cullis等人的，Biotechnol Adv.5(1)：194，1987)。Bangham′s procedure(J.MoI.Biol.，J MoI Biol.13(1)：238-52，1965)制备了普通的多层泡囊(MLVs)。Lenk等人，(美国专利号4,522,803、5,030,453和5,169,637)，Fountain等人(美国专利号4,588,578)和Cullis等人(美国专利号4,975,282)公开了制备下述多层脂质体的方法，所述多层脂质体在其各个含水间隔中具有基本上相等的层间溶质分布。Paphadjopoulos等人在美国专利号4,235,871中公开了通过反向蒸发来制备寡层脂质体。

单层泡囊可以由MLVs通过许多技术来制备，例如Cullis等人(美国专利号5,008,050)和Loughrey等人的(美国专利号5,059,421)挤压方法。超声处理和匀质化作用可以用于由较大的脂质体制备较小的单层脂质体(参见，例如Paphadjopoulos等人，Biochim.Biophys.Acta.，135：624-638，1967；Deamer，美国专利号4,515,736；和Chapman等人，Liposome Technol.，1984，第1-18页)。

Bangham等人(J.MoI.Biol.，1965，13：238-252)最初的脂质体的制备方法包括将磷脂悬浮于有机溶剂中，然后蒸干，在反应容器中留下磷脂薄膜。接下来，加入适量的含水相，使混合物“膨胀”，通过机械手段将所得的由多层泡囊(MLVs)组成的脂质体分散。该制备方法为Paphadjopoulos等人描述的小的超生处理单层泡囊(Biochim.Biophys，Acta.，1967，135：624-638)和较大的单层泡囊的开发提供了基础。

可以将制备大单层泡囊(LUVs)的技术，例如，反相蒸发法、注入法和清洁剂稀释法，用于制备脂质体。在本文中可以发现对制备脂质体的这些以及其它方法的回顾。将Liposomes，Marc Ostro编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1983，第1章，的相关部分引入本文以作参考。还参见Szoka，Jr.等人，(1980，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9：467)，也将该文献的相关部分引入本文以作参考。

用于制备泡囊的其它技术包括那些形成反相蒸发泡囊(REV)的技术，Papahadjopoulos等人，美国专利号4,235,871。另一类可使用的脂质体是那些特征在于层溶质分布大体相等的脂质体。如在Lenk等人的美国专利号4,522,803中所定义的，该类脂质体被命名为稳定的多层泡囊(SPLV)，其包括Fountain等人的美国专利号4,588,578中所描述的单相泡囊和如上所述的冷冻和熔化的多层泡囊(FATMLV)。

许多甾醇和它们的水溶性衍生物例如胆固醇半琥珀酸酯已经被用于形成脂质体；特别是参见Janoff等人的美国专利号4,721,612，该文献是在1988年1月26日发行的，题目为“Steroidal Liposomes.”。Mayhew等人描述了通过将抗菌剂和抗病毒剂包埋于包含α-生育酚及其某些衍生物的脂质体中来降低抗菌剂和抗病毒剂的毒性的方法。并且，许多生育酚和它们的水溶性衍生物已经被用于形成脂质体，参见Janoff等人，美国专利号5,041,278。

6制备方法

用于形成脂质体或者脂质抗感染药物制剂的方法包括“溶剂注入”法。该方法包括将一种或多种脂质溶于少量的，优选最小限度量的方法相容的溶剂中以形成脂质悬浮液或溶液(优选溶液)，然后将该溶液注入到含有抗感染药物的含水介质中。代表性的方法相容的溶剂是那些在诸如透析或透滤的水处理中能够被洗去的溶剂。“乙醇注入”是一类溶液注入，该方法包括将一种或多种脂质溶于少量，优选最小限度量的乙醇中以形成脂质溶液，然后将该溶液注入到含有抗感染药物的含水介质中。“少量”的溶剂是在注入过程中适合于形成脂质体或脂质复合物的量。这样的方法描述于Lee等人，2003年8月4日登记的美国专利申请10/634,144，Pilkiewicz等人，2003年3月5日登记的美国专利申请10/383,173，和Boni等人，2003年3月5日登记的美国专利申请10/383,004，在此将这些专利申请的全部内容引入作为参考。

将脂质-醇溶液注入含有抗感染药物的水或酒精溶液或混合物的步骤可以高于或低于含有抗感染药物的水或醇溶液或混合物的表面进行。优选地，所述步骤是在高于所述溶液或混合物的表面进行的。

脂质体还可以通过共同未决的专利申请：2003年3月5日登记的10/383,004、2003年8月4日登记的10/634,144、2002年8月20日登记的10/224,293；和2003年10月29日登记的10/696,389中描述的方法制备，在此将它们的说明书的全部内容引入本文作为参考。

脂质体或脂质制剂的尺寸可以通过许多方法获得，例如挤出、超声处理和匀质化技术，这些都是本领域普通技术人员所熟知的并且容易实施。挤出包括在压力下使脂质体一次或多次地通过具有规定孔尺寸的过滤器。虽然过滤器通常是由聚碳酸酯制成的，但是过滤器可以由任何下述耐久的材料制成，其中所述材料不会与脂质体相互作用并且是足够坚固的以便能够在足够的压力下进行挤出。优选的过滤器包括“直通”过滤器，因为它们通常能够经得起本发明优选挤出方法的较高的压力。也可以使用“曲径”过滤器。挤出还可以使用不对称过滤器，例如Anopore^TM过滤器，其包括使脂质体挤出通过枝状-孔型氧化铝多孔过滤器。

还可以通过超声处理来减小脂质体或脂质制剂的尺寸，其利用声能来分裂或裁剪脂质体，脂质体将自然地重整为较小的脂质体。超声处理是通过将含有脂质体悬浮液的玻璃管浸渍到由水浴型声波仪产生的声波震心中而进行的。或者，可以使用探针型声波仪，其中声能是通过直接与脂质体悬浮液接触的钛探针的振动产生的。可以使用匀质化和碾压设备来将较大的脂质体或脂质制剂分解为较小的脂质体或脂质制剂，所述匀质化和碾压设备例如Gifford Wood匀化器、Polytron^TM或Microfluidizer。

可以使用本领域熟知的方法将所得的脂质体制剂分割成匀质的种群；所述方法例如切向流过滤。在该方法中，不同尺寸的脂质体或脂质制剂种群被穿过切向流过滤器，由此产生了具有最高和/或最低尺寸限制的脂质体种群。当使用了两种不同尺寸即具有不同孔径的过滤器时，小于第一孔径的脂质体穿过过滤器。通过第二过滤器对该滤液进行切向流过滤，所述第二过滤器的孔径比第一过滤器小。该过滤的滞留物是尺寸分别大于和小于由第一和第二过滤器的孔径所限定的尺寸范围的脂质体/复合物种群。

Mayer等人发现使用横跨膜离子梯度可以缓解与亲脂性可电离生物活性剂例如抗肿瘤剂，如阿霉素或长春花生物碱，的包埋效率有关的问题。除了能够引发更大量的吸收外，这样的跨膜梯度还能够起到增加抗感染药物在脂质体制剂中的滞留的作用。

脂质抗感染药物制剂具有缓释抗感染效果和较低的毒性，这使其具有较低的给药频率和提高的治疗指数。在临床前动物研究中以及在与以相等剂量水平吸入的妥布霉素(非脂质体或脂质基的)的对比中，脂质体阿米卡星在从给药后不久到24小时后的这段时间内显示具有的肺部药物水平是妥布霉素的二到几百倍。此外，脂质体阿米卡星能够使上述水平保持远远超过24小时。在用来模拟CF患者中出现的假单胞菌感染的动物模型中，脂质体阿米卡星在与氨基糖苷单体比较时显示出动物肺部感染的明显消除。

肺表面活性物质使得肺在呼吸过程中能够膨胀和收缩。这是通过用脂质和蛋白的结合物包覆肺脏而实现的。脂质是作为单分子层存在的，所述单分子层具有直接向外的疏水链。脂质代表了80％的肺表面活性物质，大多数脂质是卵磷脂，其中50％是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)(Veldhuizen等人，1998)。表面活性蛋白(SP)具有保持结构和促进肺表面活性物质象呼吸期间进行的那样膨胀和收缩的功能。在这些表面活性蛋白中，特别是SP-B和SP-C具有溶胞性质，其能够溶解脂质体(Hagwood等人，1998；Johansson，1998)。这种溶胞性质可以促进脂质体的逐步分解。脂质体还可以通过噬菌作用直接被巨噬细胞吞噬(Couveur等人，1991；Gonzales-Roth等人，1991；Swenson等人，1991)。脂质体被肺泡巨噬细胞摄取的另一个含义是药物被输送到了患病位点。

用于形成吸入用脂质体或脂质制剂的脂质优选是与肺表面活性物质中存在的内生脂质相同的脂质。脂质体由能够包埋所需药物的双分子层组成。可以将它们设置成同心双分子层的多层泡囊，其中药物被包埋在不同层的脂质内部或各层之间的含水空间内部。本发明利用独特的方法创造出独特的脂质体或脂质抗感染药物制剂。所述方法和这些方法的产品均是本发明的一部分。

6.1管线内注入法

在一个特别优选的实施方式中，本发明的脂质体抗感染药物制剂是通过管线内浸注入制备的，其中脂质溶液物料流是在管线内与抗感染药物溶液物料流混合的。例如，如图8中所描述的，两种溶液可以在前部装有Y形连接物的混合管内部进行在管线内混合。以这样的方式，管线内注入法不同于上述的注入法，在后者中脂质溶液是作为加入到大量抗感染药物溶液中的物料流注入的。意想不到的是，本方法产生了较低的脂质对药物比和较高的包囊效率。所述方法可以通过优化参数例如流量、温度、抗感染药物浓度和在注入步骤后进行盐加成而得到进一步的改善。

6.1.a流量的影响

保持总流量为800mL/min而改变各物料单独的流量。为了实现上述条件，使用了两个设置为不同泵速的单独的泵。将混合后的溶液注入到含有NaCl溶液的烧杯中保持10秒，以使最终的NaCl浓度为1.5％，最终的乙醇浓度不超过30％。混合后，使1mL的等分部分流过Sephadex G-75凝胶过滤柱以从包囊的阿米卡星中分离出阿米卡星单体。收集1mL具有最高密度(通过可视浑浊度来确定)的部分以用于进一步的分析。所获得的结果显示于表1中。增大脂质/阿米卡星流量比，在所述流量比到达300/500mL/min之前所产生的L/D几乎为恒定值。随着脂质流量的进一步增加，L/D开始增加并且粒子尺寸也开始变大。同时，较高的脂质流量在加入了更多脂质物质的同时还提供了较好的阿米卡星回收率(包囊效率)。

表1.流量对阿米卡星包囊的影响。*

*脂质和阿米卡星溶液保存在40℃。阿米卡星原液为50mg/mL。在注入前加入NaCl 10％溶液以获得1.5％的最终浓度。注入时间为10s。混合管长10cm；6-元管线内搅拌器设置在0cm处。

脂质/阿米卡星流量为300/500mL/min的第3批显示出最好的L/D和粒子尺寸，以及合理的高阿米卡星回收率。因此决定在所有的进一步的实验中均使用这样的流量。

如表2中所显示的，为了重复选择条件时的结果，制备了一个使用透滤法完全洗涤的批次(第6批)。在注入前向烧杯中加入NaCl 10％溶液以使最终浓度为2％(作为与表1批次中的1.5％的对比)。所得L/D(1.71)不如表1中第3批中的好，并且粒子尺寸较大。这可能是由于在脂质体形成初期用浓高度的NaCl接触脂质体所带来的不良影响。与用透滤法洗涤的样品相比，使用凝胶-过滤柱分离(洗涤)的样品倾向于具有较好的L/D。这可能与应力脂质体实验的不同等级有关，或者是简单地由于在凝胶过滤柱上分离的样品含有一部分具有较好L/D的脂质体，其并不能代表整个种群。

表2.完全洗涤批次的总结。改变的方法参数是：温度、阿米卡星原药浓度以及其它(参见下面的表3)。将所有批次均浓缩到接近最大程度直到入口压力达到10PSI。

*第3列代表了临注入前的脂质和阿米卡星溶液的温度，和洗涤(透滤法)过程中的温度。RT＝室温。

“VOL尺寸”是容重粒子尺寸。

表3.第1-18批的操作条件。*

*将脂质和阿米卡星溶液以300/500mL/min的速度注入30s(实施例6-10)或20s(实施例11-18)。加入另外的含水溶液(NaCl或水)(其份数相当于500份的阿米卡星体积)。

6.1b操作温度的影响

除了加入NaCl溶液的量较少以外，其它设置保持与第3批中的相同，制得的最终浓度为1.0％。在开始注入前再次加入溶液，因为注入时间较短所以难以在注入期间进行加入。同时，在注入期间在流动压力的作用下管线内搅拌器被移到混合管的末端。搅拌器的位置为距管前端5cm处，而不是第3批中的2cm处。这可能是重要的，因为在第20批中在相同温度，40/44℃，的条件下获得的L/D比为0.55，这几乎是第3批中的一半。通过比较不同注入温度下的阿米卡星的包囊情况，意外地发现，较低的温度给出了较好的L/D。在所试验的温度中，脂质/阿米卡星温度为30/30℃和50/RT时给出了相似的L/D比，为0.32和0.37。另一方面，如在第1-5批中，用凝胶-过滤进行洗涤的样品的数值低，该数值可能小于如果用透滤法洗涤该批次时所获得的数值。

表4.温度对阿米卡星包囊的影响。*

*将脂质和阿米卡星溶液以300/500mL/min的速度注入30s。阿米卡星原液为50mg/mL。在注入前加入NaCl 10％溶液以获得最终1.0％的浓度。混合管长10cm，6-元管线内搅拌器位于5cm处。

在单独的实验中发现，在30℃和30℃下或者在50℃和22℃下混合90％乙醇和水分别产生了相似的最终温度，所述温度为接近36℃。这提示，对于阿米卡星包囊来说重要的是最终混合物的温度而不是单独各组分的温度。实施例6-15中使用的温度是50℃/RT。实施例16-18中使用的两种物料流的温度是30℃和30℃，其获得了相当的结果，虽然观察到的阿米卡星包囊稍少一些。

6.1c注入后加入含水溶液的体积的影响

接下来将注意力集中到NaCl溶液加入步骤和洗涤方法上。在多个方面改变工艺参数。在流量为300/500的注入步骤刚结束时，混合物中乙醇的浓度达到34％。在该浓度下阿米卡星具有有限溶解度(参见图9)。

如果实验从50mg/mL的阿米卡星原液开始，则在与脂质溶液混合后阿米卡星的总量将超过30mg/mL，假设包囊效率为50％，则其中至少一半(15mg/mL)是阿米卡星单体。这高于其在34％乙醇中的溶剂度极限。该问题的一个可行解决方案就是向具有脂质/阿米卡星混合物的容器中加入更多的水。例如，向800份的脂质/阿米卡星中加入200份的水(或NaCl溶液)，这将使乙醇减少到27％(图9)。这使阿米卡星能够在15mg/mL甚至更高的浓度下溶解，其中所述更高的浓度取决于温度。

此外，加入NaCl可以使渗透条件稳定化。当在200-300mg/mL的内部浓度下形成脂质体并包囊阿米卡星时，仅有～15mg/mL左右的阿米卡星没有被包囊。缺少盐水将导致渗透不平衡，其随后将导致阿米卡星的漏失。向800份的脂质/阿米卡星中加入150份的10％NaCl将产生约15％的最终NaCl浓度(脂质体外)。

针对注入操作进行了很多批次的实验，其中包括在不同时间加入不同量的NaCl溶液(或者在一些批次中加入的是水)(参见表5，汇编自表2和3)。从表中可以看出一般趋势，从而得到以下结论：

-为了获得低L/D(如果使用的是短混合管)，则必须在注入和加入含水溶液之间存在一定的时间间隔。在第6-15批中，那些具有20s或更长时间间隔的批次具有低的L/D。这可能说明脂质体不是完全在物料流混合之后立即形成的。当使用较长的混合管时(第16-18批)，其能够提供较长的混合时间，所以不需要时间间隔。

-加入高浓度的NaCl溶液来平衡渗克压度实际上并不会帮助保留阿米卡星。实际上，在适当的时间间隔后加入纯水产生了最低的L/D和总阿米卡星浓度。

-在注入后5min时加入100份10％的NaCl(第9批)给出了有竞争性的L/D比但是没有给出良好的总阿米卡星浓度。这可能是由于NaCl，当在早期与相对较高的乙醇浓度同时存在时，导致了聚集和粘性的增加。

表5.加入到脂质/阿米卡星混合物中用以调节乙醇浓度的含水容积和NaCl浓度的作用。没有显示所有的变量；参见表2和3。

6.1d抗感染药物原液的影响

先前发现，使用50mg/mL的阿米卡星原液产生了最好的包埋。当使用常用方法时，将阿米卡星原药浓度降低到40mg/mL会增加L/D。使用二-物料流流管线内注入法时，乙醇浓度达到了较高的水平，因此现在50mg/mL的阿米卡星可能不是最大浓度。

表6总结了使用多种阿米卡星原药浓度的影响。40mg/mL给出了类似的或者较好的L/D值，甚至改善了阿米卡星的回收率。相对于恒量的脂质使用较少的阿米卡星并且提供相似的L/D，导致了较高的包囊百分比(第12批)。将阿米卡星原药的浓度进一步降低到30mg/mL，虽然回收率仍是令人印象深刻的但其导致L/D稍微有所增加(第13批)。

表6.降低阿米卡星原液浓度的同时改善了效率。

阿米卡星的回收率是以所获得的L/D为基础计算的并且假定脂质的回收率为100％。

降低阿米卡星原药的浓度具有另一个含义。其降低了注入前脂质/阿米卡星混合物中阿米卡星单体的浓度，使得其在较高的乙醇浓度下仍保持是可溶解的。假设脂质和阿米卡星是以300/500的比例混合的，阿米卡星原药是50mg/mL，包囊有效率是37％，那么初始阿米卡星单体将是～20mg/mL。类似地，包囊率为52％的40mg/mL的阿米卡星原药将产生～12mg/mL的阿米卡星单体，包囊率为46％的30mg/mL的阿米卡星原药将产生～10mg/mL的阿米卡星单体。

7.脂质与药物的比

提高抗感染药物(例如氨基糖苷如阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素)在脂质体中的包埋的方法有几种。一种方法是制备非常大的脂质体(＞1μm)，这样单位数量的脂质所包埋的体积是大的。该方法获得的L/D比较小，不能实际用于脂质体吸入剂(喷雾)，其原因是1)喷雾作用期间的切应力趋向于以尺寸依赖的方式使脂质体破裂，其中较大的脂质体(＞0.5μm)会遭受较多的破裂释放，和2)较小的雾滴尺寸是获得良好的肺部沉积所必需的，该尺寸本身小于约～3μm。因此为了吸入，希望能够使脂质体的尺寸保持尽可能的小以避免过多的破裂释放。目前，本文公开的脂质体的平均直径小于约0.4μm(参见表4)。

另一个降低L/D的方法是使用带负电荷的脂质。以上所列出的氨基糖苷都是高正性的，每种化合物都有4到5个胺。用于治疗性制剂的通常是这些氨基糖苷的硫酸盐。多阳离子特性所带来的是与带负电荷的脂质体的强结合。这导致在脂质体形成期间具有较多的包埋。抗感染药物制剂的目的是向肺部环境提供持续的释放。通过巨噬细胞的吸收来快速地清除脂质体是与上述目的背道而驰的。已经有充分的文献报导，带负电荷的脂质体所经受的被巨噬细胞摄取的程度比中性脂质体高得多。因此，使用中性脂质体是所希望的。

一组能够使很多药物包埋在小脂质体中的技术是以梯度负载为基础的，其中pH梯度、硫酸铵梯度或硫酸镁梯度被用来负载胺-药物成为脂质体：参见美国专利号：5,578,320 5,736,155 5,837,279 5,922,350(pH梯度)；5,837,282 5,785,987(硫酸镁梯度)；和5,316,771(硫酸铵梯度)。这些技术仅对膜可渗透性胺(中性形式的单-胺是可渗透性的，如亚德利亚霉素和道诺红霉素)有效。梯度负载对某些抗感染药物例如氨基糖苷不起作用，因为它们是非渗透性的(太大且电荷过多)。

本文中所描述的所有方法均能够很容易地为大规模的无菌制造厂所接受。最终脂质体的尺寸可以通过改变脂质组成、浓度、赋形剂和工艺参数而得到调整。

本发明方法所使用的脂质与药物的比为约4∶1到约1∶1。在另一个实施方式中，脂质与药物的比为约3∶1到约1∶1，2∶1到约1∶1，约1∶1或小于1∶1，约0.75∶1或小于0.75∶1，或者约0.5∶1或小于0.5∶1。此外，降低了抗感染药物单体的百分比，所述抗感染药物单体在产品被渗析后还会存在一段特定的时间。

8.结果

8.1肺部感染的生物薄膜障碍

治疗感染性疾病例如铜绿假单胞菌的障碍是药物向上皮细胞上的痰液/生物薄膜障碍内的渗透(图1)，其中所述铜绿假单胞菌是导致囊性纤维化患者的慢性疾病的主要原因。在图1中，环形代表脂质体抗感染药物制剂，“+”符号代表抗感染药物单体，“-”符号代表粘蛋白、海藻酸和DNA，实心棒形符号代表铜绿假单胞菌。该障碍是由植入和漂浮的铜绿假单胞菌，所述铜绿假单胞菌是嵌入在海藻酸或来自细菌的外多糖中的，以及来自受损白血球的DNA和来自肺上皮细胞的粘蛋白组成的，所有这些物质均具有净负电荷(Costerton等人，1999)。这些负电荷结合在一起阻挡了正电性药物例如氨基糖苷的渗透，使它们成为生物学无效的(Mendelman等人，1985)。将抗感染药物包埋在脂质体或脂质制剂内部可以保护或部分地保护抗感染药物免受与痰液/生物薄膜的非特异性结合，使脂质体或脂质制剂(具有包埋的氨基糖苷)能够渗透通过(图1)。

阿米卡星已经显示出对细菌酶类具有高度的抵抗力，因此其提供了比其它氨基糖苷包括妥布霉素和庆大霉素所显示的更高的易影响临床分离株百分比(Price等人，1976)。特别是，铜绿假单胞菌分离株对阿米卡星比对其它氨基糖苷敏感得多，并且显示无交叉抗药性(Damaso等人，1976)。

从图2中可以清楚地看出阿米卡星脂质体制剂的缓释和库存效果。在该研究中通过气管内和静脉内给药向大鼠提供妥布霉素。此外，通过气管给予大鼠同样剂量(4mg/大鼠)的阿米卡星脂质体制剂。数据表明只有阿米卡星脂质体制剂获得了缓释和库存效果。实际上，在给药后24小时，只有阿米卡星脂质体制剂在动物肺部显示出了明显的药物水平，而两种妥布霉素制剂所显示的水平均可忽略不计，认为这主要是由于快速地全身性吸收。这比在肺部增加一百倍的氨基糖苷还要好，因为脂质体抗感染药物制剂证明了下述观点，即缓释脂质体制剂抗感染药物的服用频率能够明显地少于目前批准的制剂(一种由Chiron Corporation，Ameryville，CA制备的妥布霉素吸入剂溶液)。

而且，痰液/生物薄膜的存在阻挡了氨基糖苷单体的渗透，因为其将抗感染药物束缚在其表面上(图1)。因此，在CF患者中需要使用超过1,000gm妥布霉素/克肺组织的剂量才能显示出治疗效果。阿米卡星脂质体制剂克服了这一问题。因此，阿米卡星脂质体制剂中的药物治疗水平所保持的时间比妥布霉素单体的长。结合和渗透的这种促进作用还意味着阿米卡星脂质体制剂可以显著地减少细菌抗药性，所述细菌抗药性通常出现在抗感染药物以低于最低抑菌浓度存在于体内时。

8.2药代动力学

阿米卡星的药代动力学是在气管内(IT)给予大鼠妥布霉素单体或阿米卡星脂质体制剂后测定的。将这些数据与尾部静脉注射妥布霉素单体后在肺部获得的分步进行比较。在所有情况中，给药剂量均为4mg/大鼠。正如从图2中所看到的，IT能够输送的氨基糖苷沉积物要比注射能够输送的大得多。脂质体抗感染药物技术的库存效果也得到了证明，因为与IT或IV给予的妥布霉素相比，阿米卡星脂质体制剂在给药后二十四小时仍在肺部保持有大于一百倍的药物增加。因此，与妥布霉素单体相比，阿米卡星脂质体制剂中的药物治疗水平能够保持较长的一段时间。

氨基糖苷与CF患者痰液的结合是值得关注的，特别是在如果该结合降低了抗感染药物的生物学活性时(Hunt等人，1995)。为了确定阿米卡星脂质体制剂是否能够使生物活性保持的时间段延长，将正常的大鼠通过气管内滴注给药以阿米卡星脂质体制剂。接着在第2或24小时时通过支气管肺泡灌洗法(BAL)将其移出以确定生物活性。用超滤法(0.2微米)浓缩样品接着进行过滤以除去污染肺脏的微生物。使用TDX检测仪测定阿米卡星的浓度并用Mueller Hinton肉汤稀释测定法测定其生物活性(铜绿假单胞菌)。结果显示于表7中。

表7.显示阿米卡星脂质体制剂能够使生物活性保持时间延长的结果。

如上表所显示的，回收的过滤后的阿米卡星脂质体制剂能够在Mueller Hinton肉汤试验中杀灭铜绿假单胞菌，甚至在24小时后MIC还为4。在2小时时获得的MIC为2，其与由过滤后的脂质体/复合阿米卡星原药所获得的相似。因此，在肺部24小时后阿米卡星脂质体制剂仍具有活性。24小时时在BAL中未能检测到以同样剂量给予的妥布霉素单体。这表明不仅脂质体抗感染药物制剂仍保留在肺中，而且其还能够随时间自由地渗透过痰液/生物薄膜。将这些数据与图2和表9(在下文中)所显示的事实相结合，结果是阿米卡星脂质体制剂能够随时间释放出抗感染药物单体同时又能够使肺部的抗感染药物保持在高水平，这证明了该系统可以产生随时间的缓释效果的理论。该效果将证明其在降低假单胞菌的生物-负载和由抗感染药物的水槽水平而引起的抗性发展方面是重要的。

作为对阿米卡星脂质体制剂缓释以及其持续抗感染效果的体外证明，将所述制剂培养在来自患有慢性阻塞性肺病(COPD)患者的痰液中，所述痰液中含有PAOI黏液假单胞菌(Pseudomonas.)。还将阿米卡星脂质体制剂培养在含有PAOI黏液假单胞菌的海藻酸中。如表8中所示，在两种情况中均观察到了随时间持续且增高的假单胞菌杀灭作用。

表8.假单胞菌体外随时间的杀灭作用。

经典杀灭曲线不适用于脂质体抗感染药物制剂技术，因为脂质体制剂显示出抗感染作用逐步增大的抗感染药物缓释效果。脂质制剂保护阿米卡星免受痰液和/或海藻酸的影响直至其释放。观察到了及时、彻底的杀灭作用，这与对抗感染药物无干扰或钝化的缓释持续的抗感染效果模型相一致。

脂质体阿米卡星制剂的效力是用慢性肺部感染模型研究的(Cash等人，1979)，其中将嵌在琼脂糖粒基质中的铜绿假单胞菌滴入到大鼠的气管中。建立该黏液假单胞菌属动物模型以模拟CF患者中所显示的假单胞菌感染。一些与CF临床相关的因素包括：相似的肺部病理学；免疫复合物障碍的建立；以及通过铜绿假单胞菌株向黏液表型的转换(Cantin和Woods，1999)。用超过107CFUs的黏液假单胞菌(菌株PAO1)感染大鼠肺部，所述黏液假单胞菌来自CF患者的离析株，接着用以下物质进行治疗(a)氨基糖苷单体，(b)仅使用脂质载体作为非药物对照，和(c)脂质体阿米卡星制剂。此外，根据在Kirby-Bauer板上杀灭体外铜绿假单胞菌的能力来对制剂进行头道筛选。

对多种脂质体阿米卡星制剂进行了试验，所述试验是以不同的脂质组分或制备参数为基础的，所述不同的组分或制备参数能够在体外实验中产生不同的杀灭范围。设计该实验的目的是测量由脂质体氨基糖苷制剂获得的效力相对于氨基糖苷单体的增加。比较空白对照脂质组合物、两种不同的脂质体阿米卡星制剂和阿米卡星单体以及妥布霉素单体以相同的氨基糖苷浓度用作脂质体抗感染制剂时的情况。此外，还进行了10倍高剂量的阿米卡星单体和10倍高剂量的妥布霉素单体试验。给药方案是每日IT给药共七天。结果(图3)表明在两种制剂(脂质组分不同)中的脂质体阿米卡星显示出CFU水平的明显降低并且在降低CFU方面要优于10倍高剂量的阿米卡星单体或妥布霉素单体。在图3中，Lip-An-14是DPPC/胆固醇/DOPC/DOPG(42∶45∶4∶9)和10mg/mL的阿米卡星，Lip-An-15是DDPC/胆固醇(1∶1)，其也为10mg/mL。本文中所有的脂质-脂质和脂质-药物比均为重量对重量比。

设计下一个实验(图4)的目的是证明脂质体阿米卡星制剂的缓释和持续抗感染能力。给药方案是隔日给药共14天，以与先前实验中的每天给药共七天进行对比。结果表明两种制剂(脂质组分不同)中的脂质体阿米卡星的效力比阿米卡星单体或妥布霉素单体的高10到100倍(具有较高的降低CFU水平的能力)。每日600mg

(由ChironCorporation，Ameryville，CA制备的妥布霉素吸入溶液)的人类剂量，或为约375mg/m²，相当于每日9.4mg的大鼠剂量。因此所述数据与10到100倍的人类效力改善直接相关。应当注意的是，在该模型中所能观察到的最好的情况是log值降低了2个单位。痰液试验中铜绿假单胞菌减少100倍已经与肺功能的改善相关(Ramsey等人，1993)。脂质体阿米卡星制剂的持续释放表明能够用较低的剂量和/或较少的定量给药频率获得比氨基糖苷单体所获得的高的细菌生长减少。

脂质体阿米卡星制剂的效力是在慢性肺部感染用模型中研究的，其中将嵌在琼脂糖粒基质中的铜绿假单胞菌通过Sprague/Dawley大鼠的气管滴入。三天后每日(图3)或隔日(图4)给药以阿米卡星单体或脂质体阿米卡星，给药剂量为1mg/大鼠或10mg/大鼠的给定氨基糖苷或者1mg/大鼠的脂质体阿米卡星，并用空白脂质体(脂质载体)作为对照，五只大鼠为一组。

14天的实验后，分析匀质化大鼠肺脏(冷冻)中氨基糖苷的含量和活性。用TDX检测仪进行临床化学测定，而生物鉴定是通过测量嵌有草枯杆菌(Bacillus subtilis)的琼脂板上的抑菌区进行的。结果显示于表9中：

表9.脂质体阿米卡星制剂治疗大鼠肺部铜绿假单胞菌感染的结果

药物的重量是标准化后的，不包含任何的盐形式。

表10的结果表明，两种脂质体抗感染药物制剂中均存在氨基糖苷并具有活性，而对于氨基糖苷单体，在甚至用10倍高的剂量时仍只能够检测到很少的氨基糖苷。这些进一步的结果证实了脂质体抗感染药物制剂的缓释特性，并且还证明了其保留的抗感染药物仍然具有活性。在上述制剂中只有妥布霉素单体(0.1微克/mL)显示在肾中具有任何可检测水平的氨基糖苷。

脂质体阿米卡星制剂的缓释和库存效果在图5中得到进一步的证实。将嵌在琼脂糖粒基质中的铜绿假单胞菌通过气管滴入以使大鼠患有慢性肺部感染，使用与效力研究中所使用的相同的微粒。接着通过气管内给药给予大鼠相的剂量(2mg/大鼠)的妥布霉素单体或脂质体阿米卡星(制剂Lip-An-14)。数据表明，所述数据是以微克抗感染药物每克肺组织为单位随时间测量的，脂质体抗感染药物显示出缓释和库存效果，而妥布霉素单体在24小时后显示的肺部中的水平可忽略不计，认为这主要是由于快速的全身性的吸收。这比在肺部增加一百倍的氨基糖苷还要好，因为被感染大鼠中的脂质体阿米卡星制剂能够证明下述观点，即持续释放的脂质体抗感染药物的服用频率明显地少于目前批准的

制剂(一种由Chiron Corporation，Ameryville，CA制备的妥布霉素吸入剂溶液)。

阿米卡星的药代动力学是通过气管内(IT)给予大鼠妥布霉素单体或脂质体阿米卡星测定的。给药剂量为2mg/大鼠。脂质体抗感染药物技术的库存效果得到了证明，因为与IT给予的妥布霉素单体相比，脂质体阿米卡星在给药后二十四小时仍在感染肺部保持有大于一百倍的药物增加。因此，与妥布霉素单体相比，脂质体制剂中的药物治疗水平能够保持较长的一段时间。

图7显示了有效量的抗感染药物在肺中的显著停留时间和累积，所述结果证明可以使用相对较不频繁的剂量。每个剂量均为吸入(如上所述，在大鼠中，3只大鼠为一组)15mg/mL阿米卡星的雾化脂质体阿米卡星制剂(DPPC/胆固醇，1∶1)4小时。给药在第一天；第一、三和五天；或者第一、二、三、四和五天进行。将提供所给出的数据柱状图的大鼠在获得各自的剂量数据柱状图后宰杀。所述制剂是如实施例中制备的。

可以使用相似的抗感染药物来治疗细胞内感染如肺炭疽和兔热病。在肺炭疽中炭疽孢子随气雾剂达到肺泡。吸入的孢子被肺泡中的肺巨噬细胞吞下并通过淋巴管传送到局部气管支气管淋巴结或纵隔淋巴结(Pile等人，1998；Gleiser等人，1968)。巨噬细胞位于两种传染性通道的中央并且是使宿主自毁于全身性(吸入)炭疽的主要原因。此外，由于其缓释和寻靶特性，脂质体抗感染药物制剂技术能够加强细胞吸收并且能够将肺泡巨噬细胞和肺上皮细胞用于药物寻靶和传送。具有这些特征被认为能够促进下述细胞内感染的治疗，所述感染发生在肺部并且通过巨噬细胞传送。更重要的是，这些特征能够使抗感染药物更加有效，因为脂质体抗感染药物应能够被许多患有疾病的细胞吞噬。抗感染药物将以针对靶标的方式被细胞内释放，所以进攻感染是在其分散前进行的。所包囊的药物可以是已经批准的药物如环丙沙星、四环素、红霉素或阿米卡星。已经开发出了脂质体环丙沙星制剂。

在研究中，将该化合物给药于小鼠，并将其与细胞内给药的环丙沙星单体和口服给药的环丙沙星单体进行比较，所述三种化合物全部是以同样剂量给予的(图6)。每只小鼠的剂量是15mg/kg，每组有三只小鼠。脂质体环丙沙星是DPPC/胆固醇(9∶1)的形式，有效浓度为3mg环丙沙星/mL，所述制剂是如实施例制备的。脂质与药物的比按重量计为12.5∶1。与口服给药的环丙沙星相比，小鼠肺部存在的脂质体环丙沙星的量比环丙沙星单体的量高两个数量级。此外，24小时后只有脂质体环丙沙星在肺部仍呈现出可检测的水平，而口服给药的药品在不到两小时时就检测不到了。该数据支持，使用脂质体环丙沙星制剂和其它的抗感染药物如氨基糖苷、四环素和大环内酯来治疗和预防性防止生物恐怖袭击所使用的细胞内疾病。

8.3.脂质体参数

将所要使用的脂质溶于乙醇中以形成脂质-乙醇溶液。将所述脂质-乙醇溶液注入到含有将被包埋的生物活性剂分子的水或乙醇溶液中。脂质自然地形成泡囊。

表10公开了脂质体抗感染药物制剂的参数，其中脂质是DPPC和胆固醇。

表10.补充的脂质体抗感染药物制剂参数。

*DPPC/胆固醇脂质体，其中DPPC/胆固醇的摩尔比为大约1∶1。

**在计算L/D时仅考虑了阿米卡星的包埋量。

关于形成脂质体抗感染药物制剂的详细情况可以参见2003年3月5日登记的PCT/US03/06847，将其全部内容引入本文作为参考。

包埋体积是脂质体制剂的一个基本特征，其是作为每单位脂质的脂质体内水相体积而确定的。其通常用单位μ升/μ摩尔表示。通常认为在脂质体形成时脂质体内部的溶质浓度等于外部本体溶液中的浓度。较高的包埋体积随后将导致较高的药物/脂质比，即较高的最终制剂总药物浓度。

然而，在脂质体阿米卡星的制剂过程中发现产生的实际药物/脂质比率比以包埋体积为基础预期的比率高3倍以上。表11显示了4种不同脂质抗感染药物制剂制品样品(参见实施例一节中的实施例2)的结果。

表11.负载在不同方法制备的脂质体中的阿米卡星。

样品1和2是通过本文所公开的乙醇注入法制备的，样品3和4是通过本领域已知的脂质体形成技术制备的。

阿米卡星的浓度是通过免疫荧光试验测量的，所述试验使用了置于TDx分析器仪上的INNOFLUO Seradyn试剂。脂质是通过反相HPLC测定的，所述HPLC使用的是C-8柱和光散射检测器。

样品#1-3中的脂质体体积(每单位总体积中脂质体所占的体积)是通过测量总体积和制剂滤失体积中的荧光探针(Sulforhodamine 101或Carboxyfluorescein)的浓度而确定的，其中所述滤失体积是在CentriSart过滤装置中通过离心分离获得的。由于探针从脂质体所占体积中的排出，所以滤液中的探针浓度高于平均浓度。

在样品#4中，脂质体体积是通过向其中加入固定量的钾离子后测量样品中的钾离子的浓度而确定的，其中向10mL的脂质体悬浮液(V₀)中加入250ul的KCl(V_加入)。接着将药品以4000rpm的转速离心分离30min并取上层清液用Cole-Parmer钾敏感电极测量钾离子(K)。由于钾离子从脂质体所占体积中的排出，因此所测得的钾离子的浓度通常比预期的高。在对照样试验中，向10mL盐水溶液中加入等量的KCl。测量对照Kc中的钾浓度。接着如下估算水和脂质体的体积：

已知脂质体体积和脂质浓度后就可以确定包埋体积：

其中L_W和L_m分别是重量和摩尔脂质浓度。脂质的密度假定为接近1mg/mL。如果药物理想地分散在脂质体内外的含水空间中，则由此就可以计算出样品将具有的预期脂质/药物比：

其中D₀是脂质体形成期间的药物体积浓度，M_L是脂质的平均重量分子量。

正如所看到的，样品#1和#2的实际L/D比(1.8和1.9)一致地低于由均匀分布的阿米卡星所预期的比(5.6和6.0)，而样品#3和#4的L/D与理论值接近。

在2种脂质抗感染药物制剂样品制品之间进行类似的比较，其中所述抗感染药物是硫酸庆大霉素(参见实施例一节的实施例3)。表12中的数据表明本文所公开的方法提供了对庆大霉素的意想不到的高包埋。在#5和#6两个样品中，实际脂质/药物比几乎是理论预期值的两倍。

表12.负载在不同方法制备的脂质体上的庆大霉素

8.4.由铜绿假单胞菌感染介导的药物释放

药物以活性形式在感染附近的释放是本发明脂质体药物制剂作用的一个重要方面。上述寻靶释放的潜能是通过监测下述过程中的药物释放而测定的，所述过程为用来自CF患者的痰液进行培养，将其释放到用铜绿假单胞菌预先培养过的大鼠肺部中，以及测量抵抗铜绿假单胞菌培养物的活性。

用本发明的脂质体阿米卡星制剂直接培养铜绿假单胞菌培养物时的阿米卡星的释放在前面已经讨论过了。为了进一步研究该现象，将脂质体阿米卡星制剂用痰液制备物进行培养，其中所述痰液制备物来自感染有铜绿假单胞菌的囊性纤维化患者。将咳出的痰液用牛DNase I和海藻酸裂解酶在37℃下液化2hr。将脂质体氨丁卡制剂或溶解的阿米卡星(1mg/mL的阿米卡星)与液化的痰液或对照物以1∶1的比例混合，并在37℃下轻轻摇动。用Abbott TDx分析仪分析一部分样品的阿米卡星浓度。将完整的脂质体用去污剂细胞溶解于每种样品的单独的等分试样中，所述去污剂为1％的Triton X-100。取每种样品的上层清液用于分析。48小时后，在上述条件下(80-90％)的阿米卡星以时间依赖的方式从脂质组合物中释放，这表明在CF肺部的感染位点处可能发生了药物释放。

比较药物单体在已经用含有铜绿假单胞菌的琼脂粒侵染过的老鼠(3.5×10⁴CFU/大鼠)和那些没有被侵染的老鼠体内的从脂质体中的释放。颗粒侵染三天后，使大鼠每日(无细菌的组)或隔日(用所述颗粒侵染的组)地吸入本发明的脂质体阿米卡星制剂(日剂量大约为6mg/kg)14天。在最后一次治疗的24小时后，如上所述地测量总阿米卡星量和阿米卡星单体量。在接种了细菌的大鼠中，平均大约50-70％的被检测阿米卡星是单体的形式，即从脂质体中释放的阿米卡星。在没有接种细菌的大鼠中，大约20-25％的药物是单体的形式。这些数据强有力地表明阿米卡星单体从从脂质体中的释放可能是由体内存在的铜绿假单胞菌介导的。

释放和活性的体外试验是在与肺部药代动力学试验相似的条件下进行的，其中前面的内容已经表明抗生素单体在几小时的时间坐标处得到清除。在无菌的5mL Slide-A-Lyzer筒中用铜绿假单胞菌PA01(～10⁸/mL)培养不同药物浓度的阿米卡星单体或脂质体阿米卡星制剂。在这样的条件下，单体药物在几小时的时间坐标处从筒中渗出。24hrs后，从筒中取出样品并涂板以测量CFU。在初步实验中，阿米卡星单体仅略微地减少了这些样品的CFU，而对以相同阿米卡星浓度(50μg/mL)含有脂质组分的阿米卡星来说则观察到CFU的log值减少了两个单位。这些数据表明在存在细菌时阿米卡星实际上是以主动的形式释放的，并且所述制剂赋予的缓释特性使得能够更有效地使用药物。

本发明脂质体阿米卡星制剂与铜绿假单胞菌或其毒力因子的相互作用导致阿米卡星的释放可能会直接地释放到感染位点处。当阿米卡星得到释放时其能够主动地抵抗铜绿假单胞菌，并且在细菌附近的缓慢释放要优于非特异性的分散和吸入药物单体的快速清除。

8.5.吸入的脂质体药物制剂对肺泡巨噬细胞功能的影响

本发明的脂质体阿米卡星制剂在一个实施方式中是纳米尺寸的(200-300nm)脂质体-微囊形式的阿米卡星，所述阿米卡星是被配制用来治疗囊性纤维化患者中的慢性铜绿假单胞菌感染的。将试验设计为在肺中吸入缓释的阿米卡星。由于已知肺泡巨噬细胞能够积极地摄取该尺寸范围内的粒子，所以脂质体制剂对这些细胞的作用是特别值得关注的。大鼠肺泡巨噬细胞的基本和激发的功能是通过灌洗获得的，研究给予和不给予脂质体阿米卡星制剂时的上述功能并与多种对照物进行比较。

用PARI LC Star雾化器制备脂质体阿米卡星制剂、阿米卡星、安慰剂脂质体和盐水的气雾剂，并且使

雌性大鼠在鼻部专用吸入室中吸入上述气雾剂。每天吸入治疗4hr并连续进行14天，从而使脂质体阿米卡星组的总酯质的估算每日肺部剂量为大约12mg/kg，安慰剂脂质体组的为11mg/kg。对剩余的老鼠在第43天时实施安乐死。收集每只老鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)并储存在-80℃下以用于随后的一氧化氮(代表总硝酸盐)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分析。通过离心分离收集来自BALF的细胞，计数，并在含和不含脂多糖(LPS)的培养基中培养24hr。通过离心分离来浓缩这些培养物的上层清液并分析一氧化氮和TNF-α。BAL巨噬细胞((10⁶)/mL)的吞噬功能是通过测量细菌调理过的荧光微球(0.2μm，2(10⁹)/mL)而测定的。

14天连续吸入脂质体阿米卡星制剂、空白的脂质体、溶解的阿米卡星或盐水没有在大鼠肺部产生显著的急性或延迟性炎症响应，正如BALF中的一氧化氮(硝酸盐)和TNF-α水平所证明的那样，其中所述一氧化氮和TNF-α水平没有明显的不同于对照样品，虽然在接受了吸入剂，包括对照样品，的所有组中均存在早期达到较高NO水平的倾向。所有组中的细胞总病愈率没有显著的差异，在所有接受了吸入剂的组中在早期就倾向于具有较多的多形核白细胞白血球。尽管事实上在吸入脂质体的组中在第15天时所述大鼠肺泡巨噬细胞有增大的表现，但大鼠肺泡巨噬细胞在暴露于以上试验制品的喷雾剂之后仍具有正常的功能。在研究的第15或43天检测培养基中的肺泡巨噬细胞培养物，所检测到的硝酸盐和TNF-α浓度与对照试验的浓度并无显著差异。当接受LPS刺激时，巨噬细胞反应正常，产生了大量浓度的一氧化氮(20-40nmol/10⁶个细胞)和TNF-α(5-20ng/10⁶个细胞)。这些巨噬细胞对荧光粒的吸收与未处理的对照物相同，这表明这些巨噬细胞仍具有正常的噬菌细胞功能。

从细菌调理过的微粒的吞噬作用、炎性介质TNF-和NO的产生方面来看，连续14天吸入脂质体阿米卡星制剂基本上没有影响肺泡巨噬细胞的功能。

9.剂量

本发明的任何组合物的剂量将依赖患者的症状、年龄和体重，要治疗或预防疾病的性质和严重性，给药途径和受试组合物的形式而改变。任何受试制剂都可以以单一剂量或分剂量给予。本发明组合物的剂量可通过本领域技术人员已知的技术或本文的教导容易地确定。

在某些实施方式中，受试化合物的剂量通常在约0.01ng到约10g每千克的范围内，特别是在约100ng到约50mg每千克的范围内。

对于本发明任何具体的组合物都需要确定有效剂量或有效量，以及影响制剂给药周期的任何可能。这可以通过本文所描述的常规实验使用一组或多组动物(优选每组至少5只动物)或者如果合适的话在人体试验中完成。任何受试化合物和治疗或预防方法的有效性均可以通过下述方法进行评价，即给予组合物，测量一种或多种可应用的指数来评价给药的作用，以及将这些指数治疗后的数值与同一指数治疗前的数值进行比较。

任何具体受试组合物在给定患者中产生最有效治疗的给药精确时间和量依赖于受试组合物的活性、药代动力学和生物利用度，患者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况和对给定药物剂量和类型的响应性)，以及给药途径等。本文所给出的指导可以用于优化治疗，例如确定最佳的给药时间和/或给药量，这需要的只是进行由监测个体和调整剂量和/或时间组成的常规实验。

在个体接受治疗的同时，可以通过在治疗期间以预定次数测量一个或多个相关指数来监测患者的健康状态。治疗，包括组合物、用量、给药次数和制剂，可以根据上述监测的结果而被最优化。可以对患者进行周期性的再评估以确定改善的程度。可以基于这些再评估来调整受试组合物的给药量并且还可能对给药时间进行调整。

治疗可以从低于该化合物最佳剂量的较小的剂量开始。此后，可以通过很小的增量增加剂量直到获得最佳治疗效果。

使用受试组合物可以减少组合物中所含的各个单个试剂(例如抗感染药物)所需的剂量，因为不同试剂的起效和持续时间是可以互补的。

受试组合物的毒性和治疗效果可以通过标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定，例如测定LD₅₀和ED₅₀。

从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可以用于形成在人类中使用的剂量范围。任何受试组合物的剂量优选处在循环浓度的范围之内，所述范围包括低或无毒性的ED₅₀。所述剂量可以在该范围内变化，这依赖于所采用的剂型和所利用的给药途径。对于本发明的组合物，治疗有效量最初可以由细胞培养试验进行估算。

10.制剂

本发明的脂质抗感染制剂可以包含水分散系和脂质体。所述制剂可以含有形成脂质体的脂质赋形剂，和提供适当渗透性和pH值的盐/缓冲液。所述制剂可以包含药物赋形剂。药物赋形剂可以是在将任何目标组合物或其组分从身体的一个器官或部位带入或转移到另一个器官或部位中所涉及的液体、稀释剂、溶剂或包囊材料。每种赋形剂必须都是“可接受的”，也就是与目标组合物及其组分相容并且对患者无害的。合适的赋形剂包括海藻糖、棉子糖、甘露糖醇、蔗糖、亮氨酸、trileucine和氯化钙。其它合适的赋形剂的实例包括(1)糖类，例如乳糖和葡萄糖；(2)淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄芪胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡类；(9)油类，例如花生油、棉子油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘油、山梨糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)其它用于药物制剂的无毒相容物质。

实施例

实施例1

以下详细地说明了150mL的脂质体/复合阿米卡星的制备方法。

总初始体积＝1.5L

乙醇含量＝23.5％(v/v)

脂质组合物：DPPC/胆固醇(摩尔比为1∶1)

初始[脂质]＝7.6mg/mL

初始[硫酸阿米卡星]＝57.3mg/mL

最终产品的体积＝150mL

I)复合和注入：

将7.47g DPPC和3.93g胆固醇在50℃的水浴中直接溶解在352.5mL乙醇中。将85.95g硫酸阿米卡星直接溶解在1147.5mL的PBS缓冲液中。接着将溶液用ION NaOH或KOH滴定以使pH达到大约6.8。

加入352.5mL的乙醇/脂质或者将其注入到1147.5mL的阿米卡星/缓冲液中以获得1.5L的初始体积。将乙醇/脂质用蠕动泵以-30mUmin(又称为注入速度)泵送注入到阿米卡星/缓冲液中，所述阿米卡星/缓冲液是在室温下在搅拌板上的反应容器中以150RPM的速度快速搅拌着的。

将产品在室温下搅拌20-30分钟。

II)透滤或“洗涤”步骤：

将混合容器钩在蠕动泵和透滤筒上。透滤筒是截留分子量为500,000道尔顿的凹膜纤维。在室温下将产品从反应容器中抽出，接着通过透滤筒倒进混合容器中。在整个弹药筒内产生了大约7psi的反压力。所述反压力迫使阿米卡星单体和乙醇通过中空纤维膜，而脂质体阿米卡星(产品)则留在后面。在室温下洗涤产品8次。向反应容器中加入(通过另一个蠕动泵)新鲜的PBS缓冲液以补偿渗透除去的部分并且保持稳定产物的体积。

将产品浓缩。

实施例2

阿米卡星的高脂质体包埋。根据以下方法以多种脂质和抗感染药物浓度制备四个脂质抗感染药物制剂样品。

样品#1.将1.72kg硫酸阿米卡星溶解在23升的盐水溶液(0.9％NaCl)中并通过加入所需量的NaOH将pH调节到6.5。将脂质-98.2g DPPC和51.8g胆固醇溶解在7升的乙醇中。在匀速搅拌下以～600mL/min的流量将脂质溶液注入到阿米卡星溶液中从而形成脂质体。接着将所产生的悬浮液用孔径为500kD的Amersham Hollow Fiber筒进行透滤从而得到洗涤，以除去乙醇和未包埋的阿米卡星。对悬浮液进行浓缩使其最终体积为～3.5L。

样品#2.方法与样品#1的类似，只是所有材料的量均按比例缩小100倍。将17.2g硫酸阿米卡星溶解在230mL的盐水溶液(0.9％NaCl)中并通过加入所需量的NaOH将pH调节到6.6。将脂质-0.982g DPPC和0.518g胆固醇溶解在70mL的乙醇中。在匀速搅拌下以～300mL/min的流量将脂质溶液注入到阿米卡星溶液中从而形成脂质体。接着将所产生的悬浮液用Amersham Hollow Fiber筒进行透滤从而得到洗涤，以除去乙醇和未包埋的阿米卡星。浓缩悬浮液使其最终体积为～35mL。

样品#3.通过被称为SPLV的方法来制备脂质体。将1.4g硫酸阿米卡星溶解在20mL盐水溶液(0.9％NaCl)中使pH为3.3。将脂质体，即0.666g DPPC和0.333g胆固醇溶解在40mL二氯甲烷中。在一个500mL的圆底烧瓶中将阿米卡星和脂质溶液混合在一起并简单地进行超声处理以形成乳化液。接着将烧瓶连接到BUCHI旋转蒸发系统上从而在真空(-5英寸Hg)、50℃和匀速旋转下除去二氯甲烷直至阿米卡星-脂质混合物形成凝胶。当凝胶最终破裂时，将真空逐渐增加到-20英寸Hg并继续干燥30多分钟。所形成的脂质体悬浮液的最终体积是22mL。

样品#4.方法与样品#3的类似。将1.3g硫酸阿米卡星溶解在20mL盐水溶液中并通过加入NaOH将pH调节到6.5。将脂质体，即0.583gDPPC和0.291g胆固醇溶解在35mL二氯甲烷中。跳过超声处理步骤。在40℃下在旋转蒸发系统上进行2hr的除溶剂步骤。最终体积为20mL。

实施例3

庆大霉素的高脂质体包埋。

样品#5.将20.0g硫酸庆大霉素溶解在230mL盐水溶液(0.9％NaCl)中并通过加入所需量的硫酸将pH调节到6.5。将脂质-0.982g DPPC和0.518g胆固醇溶解在70mL乙醇中。在匀速搅拌下以～500mL/min的流量将脂质溶液注入到庆大霉素溶液中来形成脂质体。用AmershamHollow Fiber筒通过渗滤作用除去未包埋的庆大霉素和乙醇。浓缩悬浮液至最终体积为～35mL。

样品#6.方法与样品#5的类似，除了：将17.0g硫酸庆大霉素溶解在230mL Na₂SO₄的100mM溶液中并通过加入所需量的H₂SO₄将pH调节到6.5。将脂质-0.982g DPPC和0.518g胆固醇溶解在75mL乙醇中。

实施例4

其它盐形式的阿米卡星的包埋。

样品#7.方法与实施例2中的样品#2类似。将10.7g阿米卡星碱和4.2g柠檬酸溶解在230mL盐水溶液(0.9％NaCl)中。所得的阿米卡星-柠檬酸溶液的pH为6.2。将脂质-0.982g DPPC和0.518g胆固醇溶解在70mL乙醇中。在匀速搅拌下以～500mL/min的流量将脂质溶液注入到阿米卡星溶液中以形成脂质体。用Amersham Hollow Fiber筒进行透滤以除去未包埋的阿米卡星和乙醇。浓缩悬浮液至其最终体积为～35mL。

实际的脂质/药物比与样品#2的类似并且也低于预期值(药物包埋比预期的高)。认为事实上是，样品#7中的包埋体积仅为1.5(对比于样品#2的2.5)，预期/实际L/D比高达5.2。因此，脂质体柠檬酸阿米卡盐，与硫酸阿米卡星一样，也能够用高包埋配制。

表13.样品5-7的参数总结。

实施例5

大鼠中来自所吸入的脂质体阿米卡星制剂的阿米卡星的生物利用度。

在被大鼠吸入后测量来自脂质体的阿米卡星的释放速度并与吸入的溶解阿米卡星的释放速度进行比较。

将测试物用附着在鼻部专用吸入室上的Pari LC Star雾化器雾化。使

大鼠连续14天地接受阿米卡星，其中肺部沉积剂量的推定量对于脂质体制剂形式的阿米卡星来说为6mg/kg，对于溶解的阿米卡星为5mg/kg，所述剂量可以作为单次剂量或日剂量。用Polytron仪将肺或其它组织匀质化。从肺部清除阿米卡星的动力学是通过在单次剂量治疗后或在多次剂量给药后的第1天和第28天时在变化的时间点分析肺组织匀浆而检验的。阿米卡星的水平是通过在存在或不存在1％Triton X-100时的Abbott

分析仪的免疫荧光偏振测量的，所述Triton X-100能够使阿米卡星从脂质体中释放出来。在匀质化前，用脂质体刺穿整个肺样品以在上述条件下检测阿米卡星的释放。在含或不含1％Triton X-100的情况下测量单体和总阿米卡星的量以评价药物的渗出量。

用Polytron匀化器在不存在上述去污剂时撒对组织进行匀质化的结果是，刺穿整个肺样品的脂质体阿米卡星显示不存在明显的阿米卡星释放。然而，1％Triton X-100的加入能够使所有预期药物均被回收。因此可以对阿米卡星的总水平(具有去污剂)与肺组织中的可利用单体水平进行直接比较。

在以6mg/kg的单次剂量施用脂质体阿米卡星后立刻观察到了高的阿米卡星总浓度(大约500-600μg/g肺组织)，该浓度在7天时间后缓慢减少大到约50％。来自这些脂质体的阿米卡星单体的瞬时释放曲线显示药物单体具有高的初始浓度，这可能是由于喷雾作用导致的阿米卡星释放。该阶段之后是，在约第24小时处达到最低点，接下来增高，在给药后96小时时达到279μg/g的最大值。在7天的实验结束时，留在肺中的大部分(大约50-70％)药物都是单体形式的。通过吸入给予的可溶解药物的一小部分似乎也在肺中残留了很长一段时间。然而，大多数以溶解形式给予的阿米卡星都在几小时内就消失了，脂质体阿米卡星动物7天后的显著阿米卡星单体AUC值比接受可溶解阿米卡星的动物的高至少2倍。这一特性的某些方面能够用适当的清除速率常数和药物从脂质体中的缓释速率常数来定量地模型化。

14天的连续给药后(最后剂量后24小时)，在接受脂质体阿米卡星的大鼠肺部中，有超过20％的总阿米卡星以药物单体的形式存在(大约650μg/g)。该总药物单体水平甚至高于吸入了可溶解阿米卡星大鼠中的量(大约500μg/g)。

在健康动物的肺部中，阿米卡星单体是从脂质体阿米卡星制剂的脂质体中以天数为时间坐标缓慢地释放的。所释放的药物单体在肺中具有相对较长的停留时间，正如所看到的，其使药物单体大量地库存于在肺部。

实施例6

管线内注入法

管线内注入法的关键是将脂质溶液物料流与抗感染药物溶液物料流通过例如Y形连接器来“管线内”混合，所述Y形连接器连接在一段管子上，该管子被定义为混合管，在该管中进行进一步的混合。从这一点来看，该新方法不同于“传统的”乙醇注入法，后者是将脂质溶液作为物料流注入到大量的阿米卡星溶液中。

阿米卡星和脂质溶液制品

将12.0g硫酸阿米卡星溶解在200mL水中并通过加入需要量的25％的NaOH溶液将pH调节到6.5。将脂质，即1.480g DPPC和0.520g的胆固醇溶解在60mL乙醇和10mL水的混合物中。这样的量在分别以300/500mL/min的脂质/阿米卡星流量注入后能够产生300mL的批料。如果需要较大的规模或不同的流量，可以按比例调整所述体积。

根据以上方法制备的阿米卡星溶液能够产生大约40mg/mL的阿米卡星(每碱基)溶液。所存在的脂质溶液是DPPC/胆固醇(摩尔比为60/40)，其浓度为大约20mg总脂质/mL溶液(90％的乙醇)。为了更快的溶解，将脂质加热到～40℃。

300mL批量所需的精确用量为：阿米卡星150mL，脂质90mL，以及60mL额外的盐水(或水)，在注入后或在注入过程中加入所述盐水(或水)以调节最终的乙醇浓度。

制造方法。

图8中显示了注入系统的一个实施方式。

使用Y形连接器(ID 3.2mm，OD 6.4mm)将脂质和阿米卡星溶液以～300/500mL/min(即用～1/1.67的体积比代替传统方法中～1/3.35的体积比)的流量进行在管线内混合。使用MasterFlex管L/S 25(ID 4.8mm)来输送脂质溶液，使用管L/S 17(ID 6.4mm)来输送阿米卡星溶液。为了获得同步的流量，用一个MasterFlex来驱动两个泵头。根据管的横截面积，理论流量比应该是4.8²/6.4²＝0.562＝1/1.78。当将用于阿米卡星管L/S 17的泵动力设置在500mL/min时，测量到的流量为～300/500＝1/1.67。

由于脂质溶液含有90％的乙醇，所以在管线内混合物含有～34％的乙醇。为了防止阿米卡星沉淀，可以在注入后或注入期间以100-200mL/min的流量加入NaCl溶液(假设此时已经形成了脂质体)。因此，最终混合物将具有～27％的乙醇，预计这些乙醇能够溶解所有的阿米卡星单体。

800-1000mL/min的总液体注入流量与当使用两个透滤筒时的渗透流量相当。这使得同时进行注入和透滤浓缩成为可能。

使用Amersham hollow fiber筒UFP-500-C-3MA(隔膜面积140cm，纤维ID 0.5mm)通过透滤来洗涤所产生的脂质体悬浮液以除去阿米卡星单体。在第一个步骤中，悬浮液被浓缩到接近原始体积的一半(150mL)。然后，在透滤洗涤期间，将悬浮液进行再循环，并以～6mL/min的流量向混合物中投入新鲜的盐水溶液以与渗透流量相匹配并因此保持恒容。继续进行透滤直到分配了4倍悬浮液体积的投入盐水溶液(即4*150mL＝600mL)。该透滤/洗涤方法被称为4次“洗涤”。最后，浓缩悬浮液(进行不投入盐水的透滤)以获得具有所需阿米卡星和脂质浓度的最终产品。透滤步骤期间的再循环流量为～350mL/min，在最后的浓缩步骤中逐渐将该流量降低为～150mL/min以使入口压力保持低于10PSI。

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参考文献的引入

在此将本说明书中引用的出版物和参考文献的全部内容完整地引入作为参考，其中所述出版物和参考文献包括但不限于专利和专利申请，引入方式就象每篇单独的出版物或参考文献都被具体且分别地指出在此引入作为参考一样，引入程度就像上述出版物或参考文献被完全公开了一样。将本申请要求享有优选权的任何专利申请也在此引入作为参考，引入方式与上述的引入出版物和参考文献的方式相同。

等价方案

虽然已经着重于优选实施方案对本发明进行了描述，但是所使用的优选装置和方法可以被改变，还可以试图将本发明用与本文详述的实施方式不同的方式实施，这些都是本领域普通技术人员显而易见的。因此，本发明包括所有包括在本发明精神和范围之内的所有改进，其中本发明的精神和范围是如下述权利要求所定义的。

Claims (41)

1.一种包含脂质制剂和抗感染药物的脂质抗感染药物制剂，其中所述抗感染药物为阿米卡星，所述脂质制剂包含磷脂和甾醇，但不含阴离子脂质，并且其中脂质与抗感染药物的重量比为0.75:1或小于0.75:1。

2.如权利要求1所述的脂质抗感染药物制剂，其中所述脂质制剂是脂质体。

3.如权利要求2所述的脂质抗感染药物制剂，其中所述脂质体的平均直径为0.1 μm到1.0 μm。

4.如权利要求1-3中任一项所述的脂质抗感染药物制剂，其中所述甾醇是胆固醇。

5.如权利要求2所述的脂质抗感染药物制剂，其中所述脂质制剂是平均直径为0.2 μm到0.5 μm的脂质体。

6.如权利要求1-4中任一项所述的脂质抗感染药物制剂，其中所述磷脂是二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC。

7.如权利要求1所述的脂质抗感染药物制剂的制备方法，其包括在低于至少一种脂质的相变温度的温度下向抗感染药物的水或醇溶液中注入脂质-醇溶液，其中所述抗感染药物的水或醇溶液的注入是从上方进行的。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述脂质-醇溶液的浓度为10到30 mg/mL。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述抗感染药物的水或醇溶液的浓度为20到70 mg/mL。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述脂质-醇溶液的浓度为10到30 mg/mL，所述抗感染药物的水或醇溶液的浓度为20到70 mg/mL。

11.如权利要求1所述的脂质抗感染药物制剂，其中所述脂质与抗感染药物的重量比小于0.75:1。

12.如权利要求11所述的脂质抗感染药物制剂，其中所述脂质与抗感染药物的重量比为0.5:1或小于0.5:1。

13.如权利要求11所述的脂质抗感染药物制剂，其中所述脂质制剂是脂质体。

14.一种包含脂质制剂和阿米卡星的脂质抗感染药物制剂的制备方法，其包括：将脂质制剂溶液物料流与阿米卡星溶液物料流混合，其中两种物料流在管线内混合，所述脂质制剂包含磷脂和甾醇且不含阴离子脂质且脂质与阿米卡星的重量比为0.75:1或小于0.75:1。

15.如权利要求14所述的方法，其中两种物料流在进行在管线内混合之前要先进入Y形连接器。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述溶液是含水或醇的。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述脂质制剂是脂质体。

18.如权利要求14所述的方法，其中脂质溶液物料流与阿米卡星溶液物料流是以700到900 mL/min的总流量混合的。

19.如权利要求14所述的方法，其中脂质溶液物料流与阿米卡星溶液物料流是以800 mL/min的总流量混合的。

20.如权利要求14所述的方法，其中所述甾醇是胆固醇。

21.如权利要求14所述的方法，其中所述磷脂是二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC。

22.如权利要求14所述的方法，其中阿米卡星溶液物料流是以400到600 mL/min的流量加入的。

23.如权利要求14所述的方法，其中阿米卡星溶液物料流是以500 mL/min的流量加入的。

24.如权利要求14所述的方法，其中脂质溶液物料流是以300 mL/min的流量加入的，阿米卡星溶液物料流是以500 mL/min的流量加入的。

25.如权利要求14所述的方法，其中混合的物料流的温度是30-40℃。

26.如权利要求14所述的方法，其中脂质溶液的温度为30℃，阿米卡星溶液的温度为30℃。

27.如权利要求14所述的方法，其中脂质溶液的温度为50℃，阿米卡星溶液的温度是室温。

28.如权利要求14所述的方法，其进一步包括在混合后将混合的物料流用水稀释至少20秒的步骤。

29.如权利要求14所述的方法，其中阿米卡星溶液的浓度是10到50 mg/mL。

30.如权利要求14所述的方法，其中阿米卡星溶液的浓度是40到50 mg/mL。

31.如权利要求14所述的方法，其中脂质溶液物料流是以300 mL/min的流量加入的，阿米卡星溶液物料流是以500 mL/min的流量加入的；混合的物料流的温度是30-40℃；混合后将混合的物料流用水稀释至少20秒；并且抗感染药物溶液的浓度是40到50 mg/mL。

32.如权利要求14所述的方法，其中脂质与阿米卡星的重量比小于0.75:1。

33.如权利要求14所述的方法，其中脂质与阿米卡星的重量比为0.5:1或小于0.5:1。

34. 权利要求1-6和11-13中任一项的脂质抗感染药物制剂在治疗肺部感染的患者中的用途。

35. 如权利要求34所述的用途，其中所述患者为囊性纤维化病患者。

36. 如权利要求34所述的用途，其中所述肺部感染为假单胞菌（pseudomonas）感染。

37. 如权利要求34所述的用途，其中所述肺部感染为分枝杆菌感染。

38. 如权利要求34所述的用途，其中所述肺部感染为葡萄球菌感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染、链球菌感染、大肠杆菌（Escherichia coli）感染、克氏杆菌（Klebsiella）感染、肠杆菌（Enterobacter）感染、沙雷菌（Serratia）感染、嗜血杆菌（Haemophilus）感染、耶尔森氏菌pesos（Yersinia pesos）感染、类鼻疽伯克霍尔德氏菌（burkholderia pseudomallei）感染、洋葱伯克霍尔德氏菌（B. cepacia）感染、椰毒伯克霍尔德氏菌（B. gladioli）感染、吩嗪伯克霍尔德氏菌（B. multivorans）感染、或越南伯克霍尔德氏菌（B. vietnamiensis）感染。

39. 如权利要求36所述的用途，其中所述假单胞菌（pseudomonas）感染为铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染、少动假单胞菌（P. paucimobilis）感染、恶臭假单胞菌（P. putida）感染、荧光假单胞菌（P.fluorescens）感染和食酸假单胞菌（P. acidovorans）感染。

40. 如权利要求29所述的用途，其中所述假单胞菌（pseudomonas）感染为铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染。

41. 如权利要求37所述的用途，其中所述分枝杆菌感染为结核菌分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染，鸟分枝杆菌复合菌（M. avium complex）（MAC）(鸟分枝杆菌（M. avium）以及胞内分枝杆菌（M. intracellulare）)感染、堪萨斯分枝杆菌（M. kansasii）感染、蟾分枝杆菌（M. xenopi）感染、海洋分枝杆菌（M. marinum）感染、溃疡分枝杆菌（ M. ulcerans）感染、偶发分枝杆菌复合菌（M. fortuitum complex）(偶发分枝杆菌（M. fortuitum）以及龟分枝杆菌（ M. chelonei）)感染。

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