CN103352037A - 用于治疗补体-相关失调的适体治疗 - Google Patents

用于治疗补体-相关失调的适体治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN103352037A
CN103352037A CN2013102532569A CN201310253256A CN103352037A CN 103352037 A CN103352037 A CN 103352037A CN 2013102532569 A CN2013102532569 A CN 2013102532569A CN 201310253256 A CN201310253256 A CN 201310253256A CN 103352037 A CN103352037 A CN 103352037A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fit
sequence number
sequence
complement
ome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2013102532569A
Other languages
English (en)
Inventor
克劳德·本尼蒂特
大卫·爱泼斯坦
查尔斯·威尔逊
迪拉尔·格拉特
杰弗里·库尔兹
马克斯·库尔兹
托马斯·格瑞恩·卡尤利
詹姆斯·罗特曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Archemix Corp
Original Assignee
Archemix Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Archemix Corp filed Critical Archemix Corp
Publication of CN103352037A publication Critical patent/CN103352037A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Abstract

本发明提供了核酸治疗及在补体-相关失调的治疗中使用这些核酸治疗的方法。

Description

用于治疗补体-相关失调的适体治疗
本申请是2006年2月14日递交的申请号为200680011934.9，发明名称为“用于治疗补体-相关失调的适体治疗”的分案申请。
发明领域
本发明通常涉及核酸的领域并且尤其涉及能够结合补体系统的C5蛋白的适体，用于补体-相关的心脏，炎症，和自身免疫失调，缺血再灌注损伤和/或其它C5介导的补体活性相关的疾病或失调的治疗。本发明进一步涉及能够结合C5补体系统蛋白的适体给药的材料和方法。
技术背景
适体是通过经典的Watson-Crick碱基对之外作用的具有与分子特异结合亲合力的核酸分子。
适体，正如通过噬菌体显示或单克隆抗体(“Mabs”)产生的多肽，可以特异的结合选择靶标和调控靶标的活性，如，适体通过结合可以阻止其靶标的功能。由源于任意序列寡核苷酸集的体外选择方法制备，已经制备超过100种蛋白的适体，包括生长因子，转录因子，酶，免疫球蛋白，和受体。典型的适体是10-15kDa大小(30-45核酸)，通过亚-纳摩尔亲合力结合其靶标，并且区分密切相关的靶标(例如，适体将典型的不结合来源于相同基因家族的其它蛋白)。一系列结构研究已经说明了适体能够使用在抗体-抗原复合物中产生亲合力和特异性的相同种类的结合作用(例如，氢键结合，静电相互作用，疏水作用，空间排阻)。
适体具有许多的希望的用于治疗和诊断的特征，包括高特异性和亲合力，生物活性，和良好的药代动力学特征。此外，他们提供优于抗体和其它蛋白生物制剂的特异性竞争优势，例如：
1)速度和控制 通过体外方法制备的适体，允许快速制备初始引导序列，包括治疗引导序列。体外选择允许适体的特异性和亲合力被严格地控制并允许制备引导序列，包括针对毒性和非-免疫原靶标的引导序列。
2)毒性和免疫原性 已经证明适体作为一种类型具有极少或无毒性或免疫原性。在用高剂量的适体(每天10mg/kg，连续90天)慢性给药的大鼠或土拨鼠中，通过任何临床，细胞，或生化测定没有发现毒性。尽管通过自身抗体的免疫反应，许多单克隆抗体的功效能被严格受限，但是引发针对适体的抗体是十分困难的，最可能是因为适体不能被由MHC介导的T-细胞表达并且通常免疫反应不识别核酸片断。
3)给药 尽管当前大多数认可抗体治疗是通过静脉注射给药(典型地，大于2-4小时)，但是适体能通过皮下注射给药(在猴体试验中通过皮下注射的适体生物活性＞80％(Tucker et al.，J.Chromatography B.732：203-212，1999))。这种不同主要归因于较低溶解性及由此大多数治疗MAbs需要的大体积。具有良好的溶解性(＞150mg/mL)和较低分子量(适体；10-15kDa；抗体：150kDa)，周剂量适体可以以小于0.5mL的体积注射。此外，小尺寸的适体被允许渗透进入构象缢痕区域，而抗体或抗体片断不被允许，表明了适体-基础治疗或预防的另一优势。
4)可量测性和成本 治疗适体是化学合成的从而正如需要，能容易地被量化以适合生产的要求。但是在量化生产中的困难目前限制了某些生物制剂的有效性并且大量蛋白产品制备的资金成本是巨大的，单一的大量寡核苷酸合成器每年能生产100kg以上且需要相关合适的起动资金。目前在千克数量上适体合成的成本大约是$500/g，比得上高度优化的抗体的成本。在未来5年中，工艺发展上的继续改善是希望将适体合成的成本降低至＜$100/g。
5)稳定性 治疗适体具化学稳定性。本质上在暴露如加热和变性剂的因素下之后他们适合恢复活性并且以冻干粉的形式在室温被储存较长时期(＞1年)。
补体系统
补体系统包括在级联调控系统中攻击病原菌(如，细菌)细胞外形式的起作用的一组至少20种浆和膜蛋白。补体系统包括两种不同的酶激活级联，经典的和可选择的路径(图1)，和膜攻击路径的非-酶路径。
第一种酶激活级联，即经典路径，包括一些组合物，C1，C4，C2，C3和C5(以路径中的次序排列)。通过免疫和非-免疫催化剂，随着第一补体组合物(C1)的结合和激活，补体系统的经典路径开始出现。C1包括C1q，C1r和C1s组合物的钙-依赖性复合物，且通过C1q组合物的结合被激活。C1q包括六个相同的亚单位并且每一亚单位包括三条链(A，B和C链)。每一链具有一个球状的头部区域与胶原质状尾部连接。抗原-抗体复合物引发的C1q的结合和激活发生在C1q的头部区域。大量非抗体C1q催化剂，包括蛋白，脂质和核酸，在胶原质状的茎部区域的不同位点结合和激活C1q。C1qrs复合物随即催化补体组合物C4和C2的激活，形成作为C3转化酶的C4bC2a复合物。
第二条酶联激活，即可选择的路径，对补体系统的激活和扩大是一条快速的，抗体-依赖的路径。可选择路径包括一些组合物，C3，因子B，和因子D(在路径的中以次序排列)。当C3b，C3的一种蛋白裂解形式，被绑定到一种催化表面试剂如细菌时，发生可选择路径的激活。然后因子B被绑定到C3b，且由因子D裂解产生活性酶，Ba。然后酶Ba裂解更多C3产生更多C3b，在催化表面产生C3b-Ba复合物的广泛的沉积。
因此，经典的和可选择的补体路径都产生分裂因子C3为C3a和C3b的C3转化酶。与此同时，两种C3转化酶进一步装配成C5转化酶(C4b2a3b和C3b3Bb)。随后这些复合物分裂补体组合物C5形成两种组合物：C5a多肽(9kDa)和C5b多肽(170kDa)。C5a多肽结合7重跨膜G-蛋白偶联受体，其起初与白细胞相关而现在认为在各种组织，包括肝细胞和神经细胞中表达。C5a分子是人类补体系统的主要的趋化性组合物并且能够引发各种生物反应，包括白细胞趋化性，平滑肌收缩，胞内信号转换路径的激活，嗜中性粒细胞-内皮细胞粘连，细胞因子和脂质调节子的释放和氧化剂的形成。
随后，较大的C5b片断结合补体级联的较大组合物，C6，C7，C8和C9以形成C5B-9膜攻击复合物(“MAC”)。C5b-9MAC能直接溶解红细胞，并且在更大数量上，它是白细胞溶解酶并且破坏如肌肉，上皮和内皮细胞等组织。在亚溶破数量上，MAC能刺激粘附分子的上调作用，并增加细胞内钙浓度和细胞因子释放。此外，C5b-9MAC能刺激细胞，如内皮细胞和血小板，而不引发细胞裂解。C5a和C5b-9MAC的非-裂解作用有时非常相似。
尽管补体系统在维持健康中起了重要的角色，但是它也具有引发疾病的潜能。例如，补体系统的副作用涉及心脏冠状动脉旁路术(“CABG”)，众多肾，风湿性的，神经的，皮肤病学的，血液系统的，血管/肺部，敏感症，感染和生物适应性/休克的疾病和/或状况，和糖尿病视网膜病变。补体系统不是疾病的必要唯一原因，而是引发发病机理的多因子之一。
在Fitch et al.，Circ.100：2499-506(1999)中，测试了心脏冠状动脉旁路术体外循环(“CPB”)病人的抗-C5单链抗体片断PexelizμMab的作用。在CPB之前，病人在十分钟之内分别以0.5mg/kg，1.0mg/kg和2.0mg/kg施用单-丸剂量的PexelizμMab。在给药前，给药5分钟后，28℃5分钟后，在复温开始后，在37℃下5分钟后，和在CPB后7天，提取血液样本并测试补体的活性。药效分析表明，补体溶血活性的抑制作用具有重要的剂量-依赖性，在2mg/kg的剂量下大于14小时，并且促炎症补体副产品(sC5b-9)的产生以剂量-依赖性形式有效地被抑制。如上所述，但是，抗体治疗具有一定的限制性。
因此，在补体-相关疾病治疗的治疗和诊断中，使用补体系统的新型抑制剂是有益的。
附图说明
图1是描述补体系统的经典和可选择路径的图表。
图2是来源于随机序列寡核苷酸集落的体外适体选择(SELEXTM)方法的示意性说明。
图3A是描述抗-C5适体(序列号：1)的核酸序列和二级结构的图表，下划线残基可以是2’-H嘧啶残基或2’-氟嘧啶残基，加框的残基可以是2’-氟嘧啶残基或2’-OMe嘧啶残基，由箭头(→)表示的残基代表包扩2’-氟修饰的残基。
图3B是描述AR330抗-C5适体(序列号：2)的核酸序列和二级结构的图表，圆圈残基是2’-H残基，嘧啶残基是2’-氟替代，大多数嘌呤残基是2’-OMe替代，此外三个2’-OH嘌呤残基突出显示。
图3C是描述述ARC 186抗-C5适体(序列号：4)的核酸序列和二级结构的图表，所有21个嘧啶残基有2’-氟修饰且大多数嘌呤(14个残基)有2’-OMe修饰，此外，三个2’-OH嘌呤残基突出显示。
图4是40kD的分支PEG(1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2(4’-丁酰胺)示意图。
图5是适体5’末端带有40kD分支PEG(1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2(4’-丁酰胺)的示意图。
图6是描述合成高分子量PEG-核酸共轭物的各种方法的示意图。
图7A是一张比较了PEG化抗-C5适体(ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5))与非-PEG化抗-C5适体(ARC186(序列号：4))的溶血抑制的剂量依赖性的图表；图7B是一张根据图7A的描述，用于溶血分析的适体IC50值的表格；图7C是一张比较了PEG化抗-C5适体(ARC187(序列号：5)，ARC1537(序列号：65)和ARC1730(序列号：66))和ARC1905(序列号：67)的溶血抑制的剂量依赖性的图表；图7D是一张根据图7C的描述，用于溶血分析的适体IC50值的表格。
图8是食蟹猴血清补体与人血清补体的，抗-C5适体，ARC658(序列号：62)的溶血抑制百分数的图表。
图9是描述经15分钟孵育后，在37℃和室温(23℃)下，ARC186(序列号：4)与纯化的C5蛋白结合的图表。
图10是描述经4小时孵育后，在37℃和室温(23℃)下，ARC186(序列号：4)与纯化的C5蛋白结合的另一图表。
图11是显示在23℃下，C5·ARC186复合物溶解时间的图表。
图12是显示在23℃下，C5·ARC186复合物形成平衡时间的图表。
图13是描述在补体级联上游和下游，ARC186(序列号：4)与C5蛋白或蛋白补体结合的图表。
图14是描述在未标记的竞争者ARC186(序列号：4)，ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)或ARC 187(序列号：5)存在时，放射性标记的ARC186(序列号：4)与C5结合的百分数。
图15是描述在不同浓度的ARC186(序列号：4)适体存在时，在25℃和37℃下，孵育5小时后，在血样本中产生C5b补体蛋白数量的图表。
图16是描述在未稀释的人血清，柠檬酸化的人全血或食蟹猴血清中的酵母聚糖存在时，ARC187的(序列号：5)补体抑制百分数图表。
图17是显示在实施例1D描述的管环模型中，ARC658(序列号：62)对补体活性(C5a)的完全抑制。
图18是描述C5选择集落Round 10分裂常数的图表。通过将合适的数据填入等式：RNA片断结合＝振幅×Kd/(Kd+[C5])评估分裂常数(Kds)。“ARC520”(序列号：70)指天然的未选择的dRmY集落且“+”表示竞争者的存在(0.1mg/ml tRNA，0.1mg/ml鲑鱼精液DNA)。
图19是描述C5克隆的分裂常数曲线的图表。通过将合适的数据填入等式：RNA片断结合＝振幅×Kd/(Kd+[C5])评估分裂常数(Kds)。
图20是描述对比ARC186(序列号：4)，不同浓度的抗-C5适体克隆ARC913(序列号：75)对溶血活性抑制作用的IC50曲线的图表。
图21是描述ARC187(序列号：5)结构的示意图。
图22是描述ARC1905序列号：67)结构的示意图。
图23是描述第一个分离灌注心脏研究的试验设计的图表。
图24是暴露于人血浆(A)的分离心脏左心室(LV)心室内压力轨迹与暴露于对照适体溶液(B)的分离心脏LVP压力轨迹的比较图。
图25是暴露于等摩尔，10×和50×适体/C5溶液(其中假设C5在正常，未稀释的人类血浆中的浓度大约为500nM)的分离心脏左心室(LV)心室内压力轨迹比较图。
图26是暴露于人血浆和各种血浆/适体溶液的分离的小鼠心脏间每分钟心跳(bpm)改变比较图。
图27是暴露于包括0-1×摩尔比例ARC 186(序列号：4)(衰竭心脏)，或10-50×摩尔比例(C5适体保护的心脏)的人血浆之前和之后的分离小鼠心脏重量改变比较图。
图28是灌注分离小鼠心脏后，含有不同适体浓度的人血浆中相关C5a产生的比较图。相对C5a浓度以吸收单位(Abs)作图，其中高读数反应存在高C5a水平。
图29是灌注分离小鼠心脏后，含有不同适体浓度的人血浆中相关可溶性C5b-9产生的比较图。
图30是显示在小鼠心脏流出物中ARC186(序列号：4)对C3分裂作用的图表。
图31是显示分离灌注小鼠心脏研究中免疫组化染色结果表。
图32是显示人类或灵长类血清中，保护心脏免受C5b-介导损害所需的ARC658(序列号：62)的摩尔比例表。
图33是显示大鼠和食蟹猴血浆中作为孵育时间函数的全长ARC186剩余百分数的对数-线性图。
图34是显示实施例5描述的Sprague-Dawley大鼠中药代动力学研究试验设计的表。
图35显示Sprague-Dawley大鼠中相对于时间的ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)或ARC187(序列号：5)的平均血浆浓度表。
图36是描述在大鼠中静脉施用适体后ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)或ARC187(序列号：5)的平均血浆浓度图。
图37是显示图35和36描述的浓度相对于时间数据的非室分析表。
图38A是显示小鼠中ARC187(序列号：5)和ARC1905(序列号：67)药代动力学设计表；图38B是显示CD-1小鼠中ARC187(序列号：5)和ARC1905(序列号：67)静脉内推注给药后的药代动力学特征；图38C是显示图38描述的浓度相对于时间数据的非室分析表。
图39是显示静脉给药后小鼠心脏中所列适体的测定表。
图40是显示实施例5E中描述的动物研究1的试验设计表。
图41是显示食蟹猴静脉推注给药后适体血浆浓度相对于时间的表。
图42是研究1中对食蟹猴静脉内施用ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)后药代动力学参数罗列表。
图43(a)和43(c)是描述对食蟹猴静脉内施用抗-C5适体ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)后的sC5b-9和C5a血浆浓度图；图43(b)和43(d)是描述sC5b-9和C5a血浆浓度相对于抗-C5适体ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)浓度的图。
图44是显示实施例5F描述的研究2的试验设计图。
图45是显示对食蟹猴静脉内施用抗-C5适体ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)后不同时间点的平均血浆适体浓度图。
图46是显示对食蟹猴静脉内推注适体后对浓度相对于时间数据的两室分析表。
图47是存在酵母聚糖时食蟹猴血浆中C5b-9浓度相对于ARC187(序列号：5)或ARC658(序列号：62)浓度描述图。
图48是存在酵母聚糖时食蟹猴血浆中C5a浓度相对于ARC187(序列号：5)或ARC658(序列号：62)浓度描述图。
图49是概述食蟹猴静脉内推注加上灌注给药期间和之后ARC187(序列号：5)PK-PD研究表。
图50是概述食蟹猴静脉内推注ARC187(序列号：5)后药代动力学参数表。
图51是描述食蟹猴静脉内推注加上灌注给药期间和之后ARC187(序列号：5)药代动力学特征的计算和实际测定值图。
图52描述食蟹猴静脉内推注加上灌注给药期间和之后活性ARC187(序列号：5)血浆剩余恒量水平图。
图53是显示CABG手术所需抗-C5适体的人类剂量预测表。
图54是通过凝血时间(PT)和活性部分凝血时间(APTT)测定ARC187(序列号：5)对于凝结没有体外效应的显示图。
图55是ARC187(序列号：5)对于肝素抗-凝结活性，和鱼精蛋白促凝活性体外效应的概述表。
图56是ARC187(序列号：5)在体内不影响肝素抗凝结逆转的显示图。
图57是通过测定对酵母聚糖补体活性的抑制，肝素和鱼精蛋白不影响ARC187(序列号：5)的抗-补体功能显示图。
图58是作为抗-C5适体ARC187(序列号：5)或ARC658(序列号：62)浓度的函数，在存在人血清时绵羊红细胞溶血抑制百分率的显示图。
图59A是在存在人类，食蟹猴和大鼠血清时ARC1905(序列号：67)对于溶血抑制百分数的描述图；图59B是抗-C5适体ARC1905或不结合C5的非相关适体(阴性对照)对于人类，食蟹猴和大鼠血清的补体活性抑制平均IC50值的概述表。
图60是在竞争结合试验中，作为未标记的竞争ARC1905(序列号：67)或ARC672(序列号：63)(水平轴)的函数，放射标记ARC186(序列号：4)(垂直轴)抑制IC50值的显示图。
图61是在竞争结合试验中，作为未标记的竞争ARC1905(序列号：67)(水平轴)的函数，放射标记ARC186(序列号：4)(垂直轴)在37℃和25℃抑制IC50值的显示图。
图62是描述人类C5a(hC5a)和食蟹猴C5a(hC5a eq)标准曲线显示图。
图63是酵母聚糖-诱导的补体激活试验中测定的，ARC1905(序列号：67)在人类和食蟹猴血清中抑制C5活性的IC50，IC90和IC99值的概述表。
图64是酵母聚糖-诱导的补体激活试验中测定的，作为人类和食蟹猴血清中ARC1905(序列号：67)函数的C5a产生抑制百分数的描述图。
图65是酵母聚糖-诱导的补体激活试验中测定的，ARC1905(序列号：67)对于人类或食蟹猴血清中C3a产生的效应描述图。
图66是补体活性管环模型中测定的，5位自愿者中ARC1905抑制补体活性的IC50，IC90和IC99平均值概述表。
图67在补体活性管环模型中，作为ARC1905，一种抗-C5适体，或ARC127，一种不结合C非相关适体(阴性对照)的函数，C5a和C3a产生抑制百分数的显示图。
发明内容
本发明提供了治疗，预防和改善补体相关疾病的材料和方法。在某一实施方案中，提供了包括与PEG亚基共轭的ARC186(序列号：4)核酸序列的适体。在特定的实施方案中，这种ARC186适体/PEG共轭物与由序列号：4组成但缺乏PEG亚基的适体具有与C5补体蛋白完全相同的结合亲合力。这里所述的完全相同的亲合力指通过印迹杂交分析测得的分裂常数差异不超过大约2-10倍，尤其不超过2-5倍。在某一实施方案中，正如实施例1A所述，分裂常数由竞争性印迹杂交分析测定。在某一实施方案中，聚乙二醇亚基的分子量大于10kD，甚至有20kD，更甚至有30kD和40kD。在某一实施方案中，PEG亚基与ARC186(序列号：4)的5’末端共轭。在某一实施方案中，通过实施例5E描述的方法测定的灵长类中，适体/PEG共轭物两室模型的半衰期，尤其末端半衰期为至少15，尤其至少24小时，最合适地为至少48小时。在某一实施方案中，在大鼠中，适体/PEG共轭物两室模型的半衰期，尤其末端半衰期为至少10，尤其至少15小时。在某一实施方案中，与ARC186(序列号：4)5’末端共轭的PEG是40kD的PEG。在特定的实施方案中，40kD PEG是分支PEG。在某一实施方案中，分支的40kD PEG是1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4’-丁酰胺)。在另一实施方案中，分支的40kD PEG是2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰。
在分支的40kD PEG是1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4’-丁酰胺)的实施方案中，提供的适体结构见下面所列：
Figure BDA00003395548000141
其中，
、、、、、表示连接子
适体＝fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(SEQ ID NO：4)，
其中fC和fU＝2’-氟核酸，并且mG和mA＝2’-OMe核酸而所有其它的核酸是2’-OH且3T表示反向的脱氧胸腺嘧啶。
在分支的40kD PEG是2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰的实施方案中，提供的适体结构见下面所列：
Figure BDA00003395548000151
其中，
、、、、、表示连接子
适体＝
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(SEQ ID NO：4)，
其中fC和fU＝2’-氟核酸，并且mG和mA＝2’-OMe核酸而所有其它的核酸是2’-OH且3T表示反向的脱氧胸腺嘧啶。
在发明的这方面的某一实施方案中，连接子是烃基连接子。在特定的实施方案中，烃基连接子包括2至18个连续的CH2基团。在首选的实施方案中，烃基连接子包括2至12个连续的CH2基团。在更首选的实施方案中，烃基连接子包括3至6个连续的CH2基团。
在特殊的实施方案中，提供的适体，ARC187(序列号：5)的结构见下面所列：
Figure BDA00003395548000152
其中适体＝
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(SEQ ID NO：4)
其中fC和fU＝2’-氟核酸，并且mG和mA＝2’-OMe核酸而所有其它的核酸是2’-OH且3T表示反向的脱氧胸腺嘧啶。
在另一实施方案中，提供的适体，ARC1905(序列号：67)的结构见下面所列：
Figure BDA00003395548000161
其中适体＝
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(SEQ ID NO：4)
其中fC和fU＝2’-氟核酸，并且mG和mA＝2’-OMe核酸而所有其它的核酸是2’-OH且3T表示反向的脱氧胸腺嘧啶。
在另一方面，本发明提供药物组合物。在一种实施方案中，提供的药物组合物包括治疗有效剂量的ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)或其盐类。本发明的药物组合物可以包括制药上可接受的载体或稀释液。在这方面中，本发明提供的药物组合物包括在体内抑制C5补体蛋白裂缝的治疗有效剂量的适体或其盐类和制药上可接受的载体或稀释液。在本发明的这方面，提供用于体内疾病治疗，预防或改善的ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)药物组合物。同样，在发明的这方面中，提供用于制备药物组合物的ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)。
发明的另一方面，提供治疗的方法。在一个实施方案中，发明包括由C5补体蛋白，和/或其派生物C5a和C5b-9介导的疾病的治疗，预防或改善的方法，方法包括给脊髓动物施用一种药物组合物，包括ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)或其盐类。在某一实施方案中，方法包括给哺乳动物施用一种本发明药物组合物。在某一实施方案中，哺乳动物是人。
在某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和/或C5b-9介导的疾病是急性缺血性疾病(心肌梗死，卒中，急性/再灌注损伤)；急性炎症性病变(传染病，败血症，卒中，急性/超急性移植排斥反应)；慢性炎症性和/或免疫介导病变(敏感症，哮喘，类风湿关节炎，和其它风湿性疾病，多发性硬化症和其它神经的疾病，牛皮癣和其它皮肤病，重症肌无力，全身性红斑狼疮(SLE)，亚急性/慢性移植排斥反应，肾炎和其它肾的疾病)。在某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括与透析或环境相关的补体活化，该环境中血液流经合成管道和/或外源材料。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是从与CABG外科手术相关的心肌损伤，与血管成形术相关的心肌损伤和与再狭窄相关的心肌损伤的组中选择的。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是从与CABG外科手术相关的心肌损伤，与血管成形术相关的心肌损伤和与再狭窄相关的心肌损伤，与CABG外科手术相关的补体蛋白介导的并发症，与经皮冠脉介入，阵发性睡眠性血红蛋白尿症，急性移植排斥，超急性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥相关的由补体蛋白介导的并发症的组中选择的。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是与CABG外科手术相关的并发症。在特定的实施方案中，所治疗的疾病是与CABG外科手术相关的心肌损伤。
在某一实施方案中，发明的方法包括施用包括ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)的药物组合物以获得为内生C5补体蛋白约0.5-10倍的适体浆浓度。在某一实施方案中，施用ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)适体组合物以获得为内生C5补体蛋白大约0.75至5倍，0.75至3倍，和1.5至2倍的适体浆浓度，而在另一实施方案中，施用适体组合物以获得与内生补体蛋白相同浓度。在某一实施方案中，施用包括ARC187(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)的发明的药物组合物以获得大约5μM，4μM，3μM，2μM，1.5μM，1M，或500nM的适体浆浓度。
任何可以充分达到发明的适体浆浓度的给药路径，持续时间，和给药率的结合都可以被使用。在某一实施方案中，药物组合物通过静脉给药。在某一实施方案中，药物组合物以推注和/或通过连续输液给药。
在特殊的与CABG外科手术相关的并发症，尤其地，与CABG外科手术相关的心肌损伤的治疗，预防和/或改善的实施方案中，发明的方法包括在手术前施用药物组合物且连续给药至少24小时，在某些实施方案中大约48小时，或在某些实施方案中大约72小时。在发明这方面的特殊实施方案中，在低剂量适体的静脉输液前，同时或之后，病人按每千克体重通过静脉推注施用大约0.75至1.25，首选的，1毫克适体，以获得大约为内生补体蛋白2倍浓度的浆适体浓度，其中毫克不包括共轭PEG的重量。在某一实施方案中，以0.001至0.005毫克/千克/分钟的范围注射低剂量，其中毫克不包括共轭PEG的重量。在特殊实施方案中，以大约0.0013毫克/千克/分钟的速率注射低剂量。在发明的这方面的另一实施方案中，如果适体/共轭物有充足长的半衰期，适体药物组合物可以每天一次或每两天一次作为静脉推注剂量给药。
发明的另一方面，提供诊断方法。在某一方案中，诊断方法包括将ARC87(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)与可能包括C5补体蛋白或其突变体的组合物接触，并且测定C5补体蛋白或其突变体是否存在。在某一实施方案中的补体蛋白或其突变体是脊髓动物的，尤其是哺乳动物的，更尤其是人的。本发明提供ARC87(序列号：5)或ARC1905(序列号：67)组合物用于体外或体内诊断。
在发明的另一方面，提供的适体，其包括的核酸序列是从由ARC330(序列号：2)和ARC188-189，ARC250，ARC296-297，ARC331-334，ARC411-440，ARC457-459，ARC473，ARC522-525，ARC532，ARC543-544，ARC550-554，ARC657-658，ARC672，ARC706，ARC1537，ARC1730(序列号：6至序列号：66)组成的组中选择的。在另一实施方案中，提供用于制备药物组合物的任何一种ARC330(序列号：2)和ARC188-189，ARC250，ARC296-297，ARC331-334，ARC411-440，ARC457-459，ARC473，ARC522-525，ARC532，ARC543-544，ARC550-554，ARC657-658，ARC672，ARC706，ARC1537，ARC1730(序列号：6至序列号：66)。在这方面，发明提供包括在体内抑制C5蛋白裂缝的治疗有效剂量的适体或其盐类和制药上可接受的载体或稀释液。
在特殊的实施方案中，提供包括根据序列号：1的核酸序列的适体。在特殊的实施方案中，提供包括从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择的核酸序列的适体。在某一实施方案中，从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择的核酸序列的适体，与包括序列号：4但缺少PEG亚基的序列的适体有相同的C5补体蛋白结合京合力。
在某一实施方案中，在实施例5E灵长类动物中测定的，从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择的核酸序列的适体，在两室模型中的半衰期，尤其末端半衰期为至少15，尤其地至少30小时。在某一实施方案中，在大鼠中，从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择的核酸序列的适体，在两室模型中的半衰期，尤其末端半衰期为至少1.5，尤其地至少7小时。
在本发明这方面的某一实施方案中，其中适体包括从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择的核酸序列，适体由带有下列形式的5’连接子合成：H2N～～～～5’适体3’，其中，～～～～表示连接子。在某一实施方案中，烃基是连接子，结构为H2N-(CH2)n-5’适体3’，其中n＝2至18，尤其n＝2-12，更尤其n＝3至6，更尤其n＝6，并且适体＝
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfMMGmAmGfUfCfMMGmAmGfUfUfUAfCfCfMMGfCmG-3T(序列号：4)
其中fC和fU＝2’-氟核酸，并且mG和mA＝2’-OMe核酸而所有其它的核酸是2’-OH且3T表示反向的脱氧胸腺嘧啶。作为结果的氨基-修饰适体可以和从10kD PEG，20kD PEG，30kD PEG，40kD线形PEG组成的组中选择的PEG亚基共轭。在某一实施方案中，提供包括从序列号：1，序列号：2和序列号：6-序列号：66，尤其从序列：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择核酸序列的治疗有效剂量的适体或其盐类的药物组合物。发明的药物组合物可以包括制药上可接受的载体或稀释液。在发明的这方面，提供在体内治疗，预防或改善疾病的药物组合物，包括从序列号：2和序列号：6至序列号：66，尤其从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择的核酸序列的适体。
在另一实施方案中，提供了治疗，预防或改善由C5补体蛋白介导的疾病的方法，包括给脊髓动物施用包括适体或其盐类的药物组合物，其中的适体的核酸序列是从序列号：2和序列号：6至序列号：66，尤其从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择的。在发明这方面的某一实施方案中，方法包括给哺乳动物，优选是人，施用发明的药物组合物。
在某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和/或C5b-9介导的疾病是急性缺血性疾病(心肌梗死，卒中，急性/再灌注损伤)；急性炎症性病变(传染病，败血症，卒中，急性/超急性移植排斥反应)；慢性炎症性和/或免疫介导病变(敏感症，哮喘，类风湿关节炎，和其它风湿性疾病，多发性硬化症和其它神经的疾病，牛皮癣和其它皮肤病，重症肌无力，全身性红斑狼疮(SLE)，亚急性/慢性移植排斥反应，肾炎和其它肾的疾病)。在某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括与透析或环境相关的补体活化，该环境中血液流经合成管道和/或外源材料。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是从与CABG外科手术相关的心肌损伤，与血管成形术和与再狭窄相关的心肌损伤的组中选择的。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是从与CABG外科手术相关的心肌损伤，与血管成形术相关的心肌损伤和与再狭窄相关的心肌损伤，与CABG外科手术相关的由补体蛋白介导的并发症，与经皮冠脉介入，阵发性睡眠性血红蛋白尿症，急性移植排斥，超急性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥相关的由补体蛋白介导的并发症的组中选择的。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是与CABG外科手术相关的并发症。在特定的实施方案中，所治疗的疾病是与CABG外科手术相关的心肌损伤。
在某一实施方案中，发明的方法包括给病人施用包括从序列号：2和序列号：6至序列号：66，尤其从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择核酸序列的适体的药物组合物，以获得大约为内生C5补体蛋白0.5-10倍的适体浆浓度。在某一实施方案中，药物适体组合物被给药以获得大约为内生C5补体蛋白的0.75-5倍，0.75-3倍，和1.5-2倍适体浆浓度，而在另一实施方案中，适体组合物被给药以获得与内生补体蛋白相同浓度的的适体浆浓度。在某一实施方案中本发明的药物组合物被给药以获得大约5μM，4μM，3μM，2μM，1.5μM，1μM或500nM的适体浆浓度。
任何可以充分达到发明的适体浆浓度的给药路径，持续时间，和给药率的结合都可以被使用。在某一实施方案中，药物组合物通过静脉给药。在某一实施方案中，药物组合物以推注和/或通过连续输液给药。
在特殊的与CABG外科手术相关的并发症，尤其地，与CABG外科手术相关的心肌损伤的治疗，预防和/或改善的实施方案中，发明的方法包括在手术前施用药物组合物且连续给药至少24小时，在某些实施方案中大约48小时，或在某些实施方案中大约72小时。在发明这方面的特殊实施方案中，在低剂量适体的静脉输液前，同时或之后，通过静脉推注以获得希望的适体浆浓度，例如在某一实施方案中，是内生补体蛋白浓度的2倍，在发明的这方面的另一实施方案中，如果适体/共轭物有充足长的半衰期，适体药物组合物可以每天一次或每两天一次作为静脉推注剂量给药。
在发明的另一方面，提供诊断方法。在某一实施方案中，诊断方法包括将可能包括C5补体蛋白或其突变体的组合物与从序列号：2和序列号：6至序列号：66，尤其地，从序列号：61，序列号：62和序列号：64至序列号：66组成的组中选择的核酸序列的适体接触，并且测定C5补体蛋白或其突变体是否存在。在某一实施方案中的补体蛋白或其突变体是脊髓动物的，尤其是哺乳动物的，更尤其是人的。本发明提供一种适体组合物，其具有包括从序列号：2和序列号：6至序列号：66组成的组中选择核酸序列的适体，用于体外或体内诊断。在本发明中，提供用于制备药物组合物的适体，其包括的核酸序列是从由序列号：2和序列号：6至序列号：66组成的组中选择的。
在发明的另一方面，提供的适体，其包括的核酸序列与任何从由序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的序列有80％相同。在某一实施方案中，提供的适体，其包括的核酸序列与从序列号：75至81和序列号：88至98组成的组中选择的任何独特区的序列有80％相同。在另一实施方案中，提供的适体，其包括的核酸序列与任何从由序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的序列有90％相同。在特殊的实施方案中，提供的适体包括的核酸序列与从序列号：75至81和序列号：88至98组成的组中选择的任何独特区的序列有90％相同。而在另一实施方案中，提供的适体包括的40个连续的核酸与从由序列号：75至81和序列号：88至98组成的组中选择的任何一个核酸序列的40个连续的核酸相同。在另一实施方案中，提供的适体包括的30个连续的核酸与从由序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的任何一个核酸序列的30个连续的核酸相同。而在另一实施方案中，提供的特定结合C5补体蛋白的适体包括10个连续的核酸与从由序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的任何一个核酸序列的10个连续的核酸相同。在首选的实施方案中，提供的适体，其包括的核酸序列对应于从由序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的任何一个核酸序列。
在某一实施方案中，上述的发明这方面的适体可以进一步包括一种从下列组中选择的化学修饰：一种在糖基上的化学替代；一种在磷酸基上的化学替代；和在核酸序列的碱基位点的化学替代。在某一实施方案中，修饰从包含修饰核酸的结合；3’帽子，高分子量，非-免疫原化合物的结合；亲脂化合物的结合；和磷酸盐主干的修饰组成的组中选择。
在发明这方面的首选实施方案中，适体调控C5补体蛋白或其突变体的功能。在尤其首选的实施方案中，适体抑制C5补体蛋白或其突变体的功能，尤其在体内，更尤其在人的体内。在发明这方面的某一实施方案中，适体调控，尤其抑制C5补体蛋白裂缝的功能。
在另一方面的某一实施方案，发明提供的药物组合物，其包括在体内阻止C5补体蛋白裂缝的治疗有效剂量的适体或其盐类的，和制药上可接受的载体或稀释液。
在某一实施方案中，提供包括与由序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的序列有80％相同，更首选90％相同的治疗有效剂量的适体或其盐类的药物组合物。在某一实施方案中，提供包括与从序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的任何独特区的核酸序列有80％相同，更首选90％相同的治疗有效剂量的适体或其盐类的药物组合物。在另一实施方案中，提供包括治疗有效剂量的适体的药物组合物，其中具有的40，30或10个连续核酸与从由序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的核酸序列的40，30或10个连续的核酸相同。发明的药物组合物可以包括制药上可接受的载体或稀释液。发明这方面，提供用于体内治疗，阻止或改善疾病的药物组合物，其中药物组合物包括具有从序列号：3至4，序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的核酸序列的适体或其盐类。在这方面，提供用于制备药物组合物的具有从序列号：3至4，序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择的核酸序列的适体。在这方面，发明提供的药物组合物，其包括在体内阻止C5补体蛋白裂缝的治疗有效剂量的适体或其盐类和药物可接受的载体或稀释液。
在某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和/或C5b-9介导的疾病是急性缺血性疾病(心肌梗死，卒中，急性/再灌注损伤)；急性炎症性病变(传染病，败血症，卒中，急性/超急性移植排斥反应)；慢性炎症性和/或免疫介导病变(敏感症，哮喘，类风湿关节炎，和其它风湿性疾病，多发性硬化症和其它神经的疾病，牛皮癣和其它皮肤病，重症肌无力，全身性红斑狼疮(SLE)，亚急性/慢性移植排斥反应，肾炎和其它肾的疾病)。在某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病包括与透析或环境相关的补体活化，该环境中血液流经合成管道和/或外源材料。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是从与CABG外科手术相关的心肌损伤，与血管成形术相关的心肌损伤和与再狭窄相关的心肌损伤的组中选择的。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是从与CABG外科手术相关的心肌损伤，与血管成形术相关的心肌损伤和与再狭窄相关的心肌损伤，与CABG外科手术相关的由补体蛋白介导的并发症，经皮冠脉介入，阵发性睡眠性血红蛋白尿症，急性移植排斥，超急性移植排斥，亚急性移植排斥，和慢性移植排斥相关的由补体蛋白介导的并发症的组中选择的。某一实施方案中，所治疗的由C5补体蛋白，C5a和C5b-9介导的疾病是与CABG外科手术相关的并发症。在特定的实施方案中，所治疗的疾病是与CABG外科手术相关的心肌损伤。
在某一实施方案中，发明的方法包括给病人施用药物组合物，其包括从由序列号：3至4，序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至98组成的组中选择核酸序列的适体，以获得大约为内生C5补体蛋白0.5-10倍的适体浆浓度。在某一实施方案中，药物适体组合物被给药以获得大约为内生C5补体蛋白0.75-5倍，0.75-3倍，和1.5-2倍的适体浆浓度，而在另一实施方案中，适体组合物被给药以获得与内生C5补体蛋白相同浓度。在某一实施方案中，本发明的药物组合物被给药以获得大约5μM，4μM，3μM，2μM，1.5μM，1μM或500nM的适体浆浓度。
任何可以充分获得发明的适体浆浓度的给药路径，持续时间，和给药率的结合都可以被使用。在某一实施方案中，药物组合物通过静脉给药。在某一实施方案中，药物组合物以推注和/或通过连续输液给药。
在特殊的与CABG外科手术相关的并发症，尤其地，与CABG外科手术相关的心肌损伤的治疗，预防和/或改善的实施方案中，发明的方法包括在手术前施用药物组合物且连续给药至少24小时，在某些实施方案中大约48小时，或在某些实施方案中大约72小时。在发明这方面的特殊实施方案中，在低剂量适体的静脉输液前，同时或之后，通过静脉推注以获得希望的适体浆浓度，例如在某一实施方案中，是内生补体蛋白浓度的2倍，在发明的这方面的另一实施方案中，如果适体/共轭物有充足长的半衰期，适体药物组合物可以每天一次或每两天一次作为静脉推注剂量给药。
在另一实施方案中，提供诊断方法，诊断方法包括将可能包括C5补体蛋白或其突变体的组合物接触从序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至99组成的组中选择的核酸序列的适体，并且测定C5补体蛋白或其突变体是否存在。在某一实施方案中的补体蛋白或其突变体是脊髓动物的，尤其是哺乳动物的，更尤其是人的。本发明提供一种适体组合物，其具有包括从序列号：75至81，序列号：83和序列号：88至99组成的组中选择核酸序列的适体，用于体外或体内诊断。
在某一实施方案中，提供尤其包括从由序列号：68和序列号：69组成的组中选择的核酸序列的适体。在某一实施方案中，提供包括从由序列号：68和序列号：69组成的组中选择的核酸序列的适体。在发明这方面的某一实施方案中，适体可以用于诊断方法中。
发明的详述
发明的某一或更多的详述列出在下面相关的描述中。尽管与这里所描述的相似或相同的方法和材料能用于本发明的试验和测试中，但是现在描述的方法和材料是首选的。其它发明的特征，目标和优势与描述相似。在说明中，单一的形式也包括复数，除非文中另有清楚说明。除非另有定义，所有这里使用的技术和科学术语对于本发明所述领域的普通技术人员具有相同的意义。如有争议，本说明将受控。
SELEXTM方法
生产适体的合适的方法是使用图2中描述以“通过指数增长使配基系统发展”(“SELEXTM”)为题的方法。SELEXTM方法是一种体内评估核酸分子与目标的高特异性结合的方法，并描述于，例如，美国专利申请号07/536428，1990年6月11日归档，目前已废止，美国转移申请号5475096，题为“核酸配体“，和美国专利号5270163(也见WO91/19813)，题为”核酸配体”，每个SELEXTM-鉴定的核酸配体，例如，每个适体，对于给定的目标化合物或分子是特定的配体。SELEXTM方法基于唯一观点，核酸具有充分的形成各种二维和三维结构及充分的化学多功能性的能力，其单体可以作为任何化学化合物单体或聚合体的配体(例如，形成特定的结合对)。任何大小或成分的分子可以作为目标。
SELEXTM作为起始点，依赖于包括任意序列的单链寡核苷酸的文库或集合。寡核苷酸可以是修饰的或非修饰的DNA，RNA，或DNA/RNA杂交。一些示范例中，集合包括100％任意或部分任意的寡核苷酸。另一实施例中，集合包括的任意或部分任意的寡核苷酸中至少包括一个包含于任意序列中的固定和/或保守序列。另一示范例中，集合包括的任意或部分任意的寡核苷酸中至少包括一个包含于任意序列中的位于5’或3’端的固定和/或保守序列，其包括可以被寡核苷酸集合分子共有的序列。固定序列如PCR引物杂交位点，RNA聚合酶启动子序列(例如，T3，T4，T7和SP6)，限制性位点，或聚合序列，如poly A或poly T区域，催化核心，亲合柱选择结合位点，和其它利于目标寡核苷酸克隆和/或测序的序列。保守序列是除上述的固定序列外，由许多结合相同目标的配体共有的序列。
集合的寡核苷酸更适宜地包括对于有效扩增必须的任意序列部分和固定序列。典型地，开始集合的寡核苷酸包括混合的5’和3’末端序列，其包括30-50任意核酸的内部区域。任意核酸可以由多种方法制备，宝库化学合成和从任意切割的细胞核酸中通过大小选择。测定核酸中序列的多样性也可以在选择/扩增重复前或期间通过突变引入或增加。
寡核苷酸的任意序列部分可以是任何长度并可以包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并可以包括修饰或非-自然核苷或核苷类似物。见，例如，美国专利号：5958691；美国专利号：5660985；美国专利号：5958691；美国专利号：5698487；美国专利号：58147635；美国专利号：5672695，和PCT申请WO92/07065。任意寡核苷酸可以通过本领域已知的固相寡核苷酸合成技术由磷酸二酯-连接的核苷合成。见，例如，Froehler等，Hucl.Acid Res.14：5399-5467(1986)。任意寡核苷酸可可以由液相方法合成，如三酯合成法。见，例如，Sood等，Nucl.AcidRes.4：2557(1997)和Hirose等，Tet.Lett，28：2449(1978)。在自动DNA合成仪上进行的典型合成可以制备1014-1016个分子，对于多数SELEXTM试验是足够的。序列设计中充足的大量任意序列区域使每种合成分子代表一个唯一序列的可能性增加了。
寡核苷酸的开始文库可以在DNA合成仪上通过自动化学合成制备。为了制备任意序列，在合成过程中的每一个核苷增加步骤加入四种核苷的混合物，使得核苷的任意整合。如上所述，某一实施方案中，任意寡核苷酸包括全部的任意序列；然而，另一实施方案中，任意寡核苷酸可以包括非任意或部分任意序列的延伸。部分任意序列可以在每一增加步骤加入不同摩尔比例的四种核苷而制备。
寡核苷酸的开始文库可以为RNA或DNA。另一情况中当RNA文库作为开始文库时，其通常通过使用T7 RNA聚合酶或修饰的T7 RNA聚合酶在体外由DNA文库转录并纯化。在有利于结合和逐步迭代结合，分离和扩增的条件下将RNA或DNA文库与目标混合，使用通常选择方案，获得任何期望的结合亲合和选择标准。更特别地，以含有核酸开始集合的混合物开始，SELEXTM方法包括：(a)在适合于结合的条件下将目标与混合物接触；(b)将未结合的核酸与具有与目标分子具有结合特性和核酸隔离；(c)分离核酸-目标复合物；(d)将从核酸-目标复合物从分离出的核酸进行扩增，制备配体-富集的核酸混合物；并(e)在任何循环中重复结合，隔离，分离，和扩增步骤以制备与目标分子高特异，高亲合的核酸配体。当选择RNA配体的情况下，SELEXTM方法进一步包括：(i)在步骤(d)扩增前将从核酸-复合物中分离的核酸进行反转录；并(ii)在重新开始过程前将步骤(d)扩增的核酸进行转录。
在包括大量可能序列和结构的核酸混合物中，对于给定的目标具有高度的结合亲合力。核酸混合物包括，例如，20核苷随机片段可以具有420种候选可能性。那些木有目标高亲合常量的通常易于结合目标。隔离，分离和扩增后，制备第二种核酸混合物，富集了高结合亲合候选物。多重的选择步骤进一步优化了最佳配体，直至作为结果的核酸混合物主要由一种或少数几种序列组成。其可以被克隆，测序并单独地测定作为纯化配体或适体的结合京合力。
重复选择和扩增循环直至获得期望的目标。在最通常情况下，持续进行选择/扩增直至循环重复中结合力不再明显增强。该方法通常用于1014种不同核酸的样品但也可以用于1018种不同核酸的样品。通常，核酸适体分子通过5至20次循环过程选择。某一实施方案中，只在最初的选择阶段引入不均一性，并在重复过程中不发生。
SELEXTM的一个实施方案中，分离强烈结合选择目标的核酸配体的选择过程是高效的，只需要一次选择和扩增循环。这种高效的选择可发生于，例如，色谱-型过程，其中核酸与结合在柱上的目标的亲合力发生于该种情况，柱可以有效分离最高亲合力的核酸配体。
许多情况中，执行SELEXTM重复步骤直至鉴定出单一的核酸配体不是必要的。目标-特异的核酸配体溶液可以包括核酸结果或模体家族，其具有多种保守序列和多种被替换或增加也不显著影响核酸配体与目标的亲合力的序列。在完成前停止SELEXTM步骤，可以测定多种核酸配体溶液家族成员的序列。
多种核酸引物，已知存在二级和三级结构。通常显示的属于非Watson-Crick型作用的结构或模体指发卡环，对称或不对称膨胀，伪结和相同的成千上万种组合。几乎所有已知的这些模体显示其可以形成不超过30个核苷的核酸序列。出于此原因，带有连续随机片段的SELEXTM步骤是优选的，并以含有20至50个核苷的随机片段，一些实施方案中约30至40个核苷的随机核酸序列起始。一个实施例中，5’-固定：随机：3’-固定的序列包括约30至50个核苷的随机序列。
核心的SELEXTM方法已经经修改获得多种特定的目的。例如，美国专利号5707796描述了联合凝胶电泳使用SELEXTM方法选择带有特定结构特征的核酸分子，如弯曲DNA。美国专利号5763177描述了基于SELEXTM方法选择含有可结合和/或光交联和/或光失活目标分子的光反应基团的核酸配体。美国专利号5567588和美国专利号5861254描述了高效分离高亲合和低亲合目标分子的寡核苷酸的基于SELEXTM的方法。美国专利号5496938描述了进行SELEXTM方法后的进行的获得改善的核酸配体的方法。美国专利号5705337描述了配体共价结合其目标的方法。
SELEXTM方法也可以用于获得超过一个位点结合目标分子的核酸配体，并获得包括结合目标特定位点的非-核酸样品的核酸配体。SELEXTM方法提供分离和鉴定结合任何预想目标的核酸配体，包括生物大分子和小分子，如根据其部分生物学功能而言的核酸-结合蛋白和非核酸结合蛋白，以及辅因子和其它小分子。例如，美国专利号5580737说明了通过SELEXTM方法鉴定的可以以高亲合力结合咖啡因和近似物茶碱的核酸序列。
计数-SELEXTM是一种通过评估核酸配体序列与一种或多种非-目标分子的交互作用来改善核酸配体对于目标分子的特异性的方法。计数-SELEXTM包括步骤：(a)制备候选核酸混合物；(b)将候选混合物与目标接触，其中候选混合物中具有与目标更高亲合力的核酸将从候选混合物中分离出；(c)从候选混合物剩余物中分离出增强亲合力的核酸；(d)将增强亲合力的核酸与目标分离；(e)将增强亲合力的核酸与一种或多种非-目标分子接触以去除与非-目标分子具有高亲合力的核酸配体；(f)对仅具有目标分子特异亲合力的核酸进行扩增，制备足够用和核酸测序的核酸混合物，其与目标分子的结合具有相应的高亲合力和特异性。如对SELEXTM的描述，需要重复进行选择和扩增循环直至获得期望目标。
使用核酸作为治疗和疫苗运用中遭遇的潜在问题是磷酸二酯形式的核苷在出现期望效应前，会由于体液中细胞外和细胞内酶如核酸内切酶和核酸外切酶而快速降解。这样，SELEXTM方法包括鉴定高-亲合力核酸配体，其包括提供配体改良的特性，如提高的体外稳定性或改善的输送特性的修饰核酸。这些修饰的示范例包括核糖和/或磷酸和/或碱基位点的化学替换这些修饰示范例包括碱基和/或磷酸和/或碱基位点的化学替换，例如，美国专利号5660985，其描述了在核糖2’位点，或嘧啶5位点，和嘌呤8位点带有源于核酸的化学修饰的寡核苷酸，美国专利号5756703，其描述了含有多种2’-修饰嘧啶的寡核苷酸，和美国专利号5580737，其描述了带有一种或多种2’-氨基(2’-NH2)，2’-氟(2’-F)，和/或2’-OMe(2’-OMe)替换的高特异性核酸配体。
本发明期望的核酸配体的修饰包括，但不局限于，那些在核酸配体碱基中整合入额外的电荷，极化性，疏水性，氢键，静电作用，和流变性或作为整体整合入核酸配体所提供的其它化学基团。制备核酸酶耐受的寡核苷酸的修饰也包括一种或多种替换核苷酸间键合，替换糖，替换碱基，或其联合。这些修饰包括，但不局限于，2’-位点糖修饰，5-位点嘧啶修饰，8-位点嘌呤修饰，环化氨基修饰，4-硫代尿苷替换，5-溴或5-碘-尿嘧啶替换；骨架修饰，硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修饰，甲基化，和非正常碱基对合并如异胞嘧啶和异胍。修饰也可以包括3’和5’修饰，如加帽子。
某一实施方案中，提供的寡核苷酸中P(O)P基团被P(O)S(“thioate”)，P(S)S(“dithioate”)，P(O)NR2(“酰氨化”)，P(O)R，P(O)OR’，CO或CH2(“formacetal”)或3’-氨基(-NH-CH2-CH2-)，其中每个R或R’是独立的H或替换或非替换的烷基。连接基团可以通过-O-，-N-，或-S-连接键与核苷接触。并非所有寡核苷酸中的连接键都需要鉴定。如此所述，术语硫代磷酸酯包括磷酸二酯酶结合中的一个或多个非-桥连氧原子被一个或多个硫原子替代。
进一步的实施方案中，寡核苷酸包括修饰的糖基团，例如，一个或多个羟基被卤素，脂肪族基团，或醚或胺替代。某一实施方案中，呋喃糖残基的2’-位点被OMe，O-alkyl，O-allyl，S-alkyl，S-allyl，或卤素基团替代。合成2’-修饰糖的方法描述于，例如，Sproat等，Nucl.Acid Res.19：733-738(1991)；Cotton等，Nucl.Acid Res.19：2629-2635(1991)；和Hobbs等，Biochemistry 12：5138-5145(1973)。其它修饰对于本域中的普通计数人员是已知的。这些修饰可以是预-SELEXTM方法修饰或后-SELEXTM方法修饰(对预先鉴定的未修饰的配体进行修饰)或可以整合入SELEX过程。
预-SELEX方法修饰或那些整合入SELEX过程修饰可制备兼具SELEXTM目标特异性和提高的稳定性，例如体内稳定性的核酸配体。对核酸配体进行的后-SELEXTM方法修饰可以提高稳定性，例如体内稳定性，而不影响核酸配体的结合能力。
SELEXTM方法包括如美国专利号5637459和美国专利号5682867中描述，将选择的寡核苷酸与其它选择的寡核苷酸和非-寡核苷酸功能单元进行联合。SELEXTM方法进一步包括将选择核酸配体与诊断或治疗混合物中的亲脂性或非-免疫原性高分子量化合物联合，描述于，例如，美国专利号6011020，美国专利号6051698，和PCT公开号WO98/18480。这些专利和申请讲授了形状和其它特征的广泛阵列的联合，及寡核苷酸的有效扩增和复制特性，和其它分子的期望特征。
通过SELEXTM方法对小的，柔性多肽的核酸配体鉴定也被叙述。小多肽具有柔性结构并通常存在于多重构象的平衡溶液中，并最初认为结合柔性多肽时构象熵的损失可限制结合亲合力。然而，美国专利号56482147中描述了鉴定溶液中小多肽的核酸配体的可能性。此专利中，坚定了配体样本P，一种11个氨基酸多肽的高亲合力RNA核酸。
通过这里所述的SELEXTM方法典型地选择本发明中对于目标具有特异和结合亲合力的适体。作为SELEXTM方法的一部分，选择的结合目标的序列被任意地最小化以测定具有期望结合亲合力的最小序列。选择的序列和/或最小化的序列通过序列的任意或直接突变进行随意的优化，以增加结合亲合力或可选地，测定序列中对于结合活性必需的位点。此外，可以对整合入修饰核酸的序列进行选择以增加适体分子对于体内降解的稳定性。
2’修饰的SELEX TM
为了使适体适合于治疗使用，其更适宜地为低价合成，体内安全和稳定的。野生-型RNA和DNA适体由于其对于核酸酶的降解易感通常在体内不稳定。通过在2’-位点整合入修饰基团可以极大增加核酸酶降解的抗性。
氟和氨基基团已经成功整合入随后选择适体的寡核苷酸文库。然而，这些修饰大大增加了合成最终适体的费用，并由于通过修饰寡核苷酸的降解并随后使用核苷作为DNA合成的材料，修饰的分子可以重组入宿主DNA，在一些情况下可涉及安全问题。
如这里的实施方案提供的，包括2’-OMe(“2’-OMe”)核苷的适体，克服了许多缺陷。包括2’-OMe核苷的寡核苷酸是核酸酶-抗性的并且是合成低价的。虽然2’-OMe核苷在生物系统中是普遍存在的，在生理条件下自然的聚合酶不接受2’-O-甲基NTPs作为材料，这样不存在循环2’-OMe核苷整合入宿主DNA中的安全问题。制备2’-修饰适体的SELEXTM方法见，例如，美国临时专利申请系列号60/430641，2002年12月3日归档，美国临时专利申请系列号60/487474，2003年7月15日归档，美国临时专利申请系列号60/517039，2003年11月4日归档，美国临时专利申请系列号10/729581，2003年12月3日归档，美国临时专利申请系列号10-873856，2004年6月21日归档，题目为“体外选择2’-OMe替换核酸的方法”，所有通过在此引述全部合并入本文。
本发明包括结合并调控补充蛋白C5功能的适体，其含有调控核苷(例如，2’位点具有修饰的核苷)，使得该寡核苷酸相比于未修饰的寡核苷酸具有更强的酶和化学降解及热和物理降解稳定性。虽然文献中有一些含有2’-OMe的适体示范例(见，例如，Green等，Current Biology 2，683-695，1995)，其通过体外修饰转录文库选择制备，其中C和U残基为2’-氟(2’-F)替换而A和G残基为2’-OH替换。一旦功能序列被鉴定，每个A和G残基测试对于2’-OMe替换的耐受性，然后所有A和G残基都经2’-OMe替换为2’-OMe残基的适体被再-合成。许多两-步法制备的适体的A和G残基经替换为2’-OMe，然而，平均约有20％并非如此。随后，用该方法制备的适体趋向于含有2至4个2’-OH残基，并且作为结果，其稳定性和合成的费用是折衷的。通过整合核酸进入转录反应制备寡核苷酸集合中使用的稳定寡核苷酸，其中适体通过SELEXTM(和/护任何其改变和改良，包括这里所述的)从寡核苷酸集合中进行选择和富集，本发明的方法消除了所选择的适体寡核苷酸的稳定需要(例如，通过用修饰核苷再合成适体寡核苷酸)。
某一实施方案中，本发明提供了ATP，GPT，CTP，TTP，UTP带有2’-OH，2’-F，2’-脱氧，和2’-OMe联合核苷修饰的适体。另一实施方案中，本发明提供了ATP，GPT，CTP，TTP，UTP带有2’-OH，2’-F，2’-脱氧，和2’-OMe，2’-NH2，和2’-甲氧基乙基联合核苷修饰的适体。另一实施方案中，本发明提供了ATP，GPT，CTP，TTP，UTP带有2’-OH，2’-F，2’-脱氧，和2’-OMe，2’-NH2，和2’-甲氧基乙基56种联合核苷修饰的适体。
使用修饰聚合酶制备本发明的2’修饰适体，例如，修饰的T7聚合酶，其对于具有呋喃糖2’位点大量替换的修饰核酸的整合速率要高于野生型聚合酶。例如，单一突变T7聚合酶(Y639F)，其使用2’脱氧，2’氨基-，和2’氟核苷三磷酸(NTPs)作为底物使位点639的酪氨酸残基改变为苯丙氨酸，并已经广泛用于合成大量应用的修饰RNAs。然而，据报道该T7聚合酶不能有效利用(例如，整合)带有大量2’-替换如2’-OMe或2’-叠氮(2’-N3)替换的NTPs。为了整合大量2’-替换，除了Y639F突变，在784位点的组氨酸改变为丙氨酸的T7聚合酶双突变(Y639F/H784A)已经被描述并应用于有限条件下整合修饰的嘧啶NTPs。见Padilla，R.和Sousa，R.，Nucleic Acids Res.，2002，30(24)：138。位点784的组氨酸改变为丙氨酸的单点突变T7聚合酶(H784A)也见描述。Padilla等，Nucleic acidsResearch，2002，30：138。在Y639F/H784A双突变和H784A单突变的T7聚合酶中，变为更小的氨基酸残基如丙氨酸可以整合大量核酸底物，例如，2’-O甲基替换核苷。
通常，具发现在这里所述的条件下，Y693F单点突变可以用于整合除了GTP的所有2’-OMe替换NTPs，而Y639F/H784A双突变可以用于整合包括GTP的所有2’-OMe替换NTPs。当在此描述的条件下使用时，H784A单点突变的特性相似于Y639F和Y639F/H784A突变。
2’-修饰的寡核苷酸可以完全由修饰核苷，或由一部分修饰的核苷合成。修饰可以是相同或不同的。所有的核苷可以是修饰的，并且所有都包括相同的修饰。所有的核苷可以是修饰的，当包括不同的修饰，例如，所有包括相同碱基的核苷可以具有一种类型的修饰，而包括其它碱基的核苷可以具有不同类型的修饰。所有嘌呤核苷可以具有一种类型的修饰(或不修饰)，而所有嘧啶核苷具有另一种不同类型的修饰(或不修饰)。该情况下，使用任何合并的修饰物制备转录物，或转录集合物，包括核苷酸(2’-OH)，脱氧核苷酸(2’-脱氧)，2’-F，2’-OMe核苷。包括2’-OMe C和U和2’-OH A和G的转录混合物为“rRmY”混合物，并且从中选择的适体为“rRmY”适体。包括脱氧A和G和2’-OMe C和U的转录混合物为“dRmY”混合物，并且从中选择的适体为“dRmY”适体。包括脱氧A，C和U和2’-OMe G的转录混合物为“rGmH”混合物，并且从中选择的适体为“rGmH”适体。任意包括2’-OMe A，C，U和G以及2’-OMe A，U，C和2’-F G的转录混合物为“任意混合物”，并且从中选择的适体为“任意混合物”适体。包括2’-OMe A，U，C和G，其中10％的G’s为核糖核酸的转录混合物为为“r/mGmH”混合物，并且从中选择的适体为“r/mGmH”适体。包括2’-OMe A，U和C和2’-F G的转录混合物为“fGmH”混合物，并且从中选择的适体为“fGmH”适体。包括2’-OMe A，U和C和脱氧G的转录混合物为“dGmH”混合物，并且从中选择的适体为“dGmH”适体。包括脱氧A和和2’-OMe C，G，U的转录混合物为“dAmB”混合物，并且从中选择的适体为“dAmB”适体。包括所有2’-OH核苷的转录混合物为“rN”混合物，并且从中选择的适体为“rN”或“rRrY”适体。“mRmY”适体是包括所有2’-OMe核苷并且来源于r/mGmH寡核苷酸，其在可能时通过后-SELEX替换将任何2’-OH Gs替换为2’-OMe Gs。
优选实施方案包括任何2’-OH，2’-脱氧和2’-OMe核苷的联合。更优选实施方案包括任何2’-脱氧和2’-OMe核苷的联合。而更优选的实施方案包括任何2’-脱氧和2’-OMe核苷的联合，其中嘧啶为2’-OMe(如dRmY，mRmY，或dGmH)。
修饰核苷整合入本发明的适体可在选择过程前(-预先)完成(例如，预-SELEXTM方法修饰)。可选地，预-SELEXTM方法修饰的修饰核苷组成的适体可以进一步进行后-SELEXTM方法修饰(例如，在预-SELEXTM方法修饰后进行后-SELEXTM方法修饰)。预-SELEXTM方法修饰产生SELEXTM目标特异和体内稳定性增强的修饰核酸配体。后-SELEXTM方法修饰，例如修饰(例如，切断，删除，替换或对整合了通过预-SELEXTM方法修饰的核苷的预先鉴定的配体进行额外的核苷修饰)可以进一步提高体内稳定性而不相反地影响整合了预-SELEXTM方法修饰的核苷的核酸配体的结合能力。
为了在聚合酶接受2’-修饰的NTPs的条件下制备2’-修饰(例如，2’-OMe)RNA转录产物集合，优选的聚合酶是Y693F/H784A双突变或Y693F单突变的。其它聚合酶，特别是那些显示了对于大量2’-替换高耐受性的聚合酶，也可以用于本发明。这些聚合酶可以在这里描述的转录条件下通过分析其整合修饰核苷的能力而筛选其性能。
许多因素已经鉴定对于这里描述的方法中使用的转录条件是重要的。例如，在DNA转录模板的5’端整合入一段引导序列以增加修饰转录物的产量，从而转录产物的至少前六个残基都是嘌呤。
获得整合了修饰核苷的转录产物的另一重要因素是2’-OHGTP的存在或聚集。转录可以分为两个步骤：第一步是初始，NTP加至GTP(或其它替换的鸟嘌呤)的3’-羟基末端以制备二核苷酸并延伸至约10-12个核苷；第二步是延伸，此过程在10-12个核苷之后进行转录。据发现，在含有额外2’-OMe GTP的转录混合物中加入少量的2’-OH GTP，可以有效使聚合酶使用2’-OH GTP初始转录，但当转录进入延伸阶段时，2’-OMe和2’-OH GTP间区别的减少，及2’-OMe GTP多于2’-OHGTP使得整合主要地为2’-OMe GTP。
整合2’-OMe替换核酸入转录产物的重要因素是在转录混合物中使用二价镁和锰。氯化镁和氯化锰不同浓度的混合物可以影响2’-OMe转录产物的产量，氯化镁和氯化锰最佳浓度依赖于结合二价金属离子的转录反应NTPs混合物的浓度。为获得最大限度2’替换OME转录物(例如，所有A，C和U及约90％G核苷)的最大产量，当每种NTP浓度为0.5mM时，5mM氯化镁和1.5mM氯化锰是优选的。当每种NTP浓度为1.0mM时，6.5mM氯化镁和2.0mM氯化锰是优选的。当每种NTP浓度为2.0mM时，9.6mM氯化镁和2.9mM氯化锰是优选的。任何情况下，偏离这些浓度最高至2倍时仍然得到高产的修饰转录产物。
GMP或鸟嘌呤引发转录也是重要的。该方面从聚合酶对于初始核苷的特异性影响结果。作为结果，该方法制备的任何转录产物的5’-末端核苷一般为2’-OH G。优选的GMP(或鸟嘌呤)的浓度为0.5mM，更优选地为1mM。据发现在转录反应中包括PEG，优选地为PEG-8000，可以使修饰核苷的整合最佳化。
为最佳化整合2’-OME ATP(100％)，UPT(100％)，CTP(100％)和GTP(～90％)(“r/mGmH)入转录产物，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 5mM(当每种NTP浓度为1.0mM时其浓度为6.5mM)，MnCl2 1.5mM(当每种NTP浓度为1.0mM时其浓度为2.0mM)，2’-OME NTP(每种)500μM(更合适地，1.0mM)，2’-OH GTP30μM，2’-OH GMP 500μM，pH7.5，Y639F/H784A T7 RNA聚合酶1.5单位/ml，无机焦磷酸酶5单位/ml，和至少8个核苷长度的全-嘌呤引导序列。这里使用的，一个单位的Y639F/H784A突变T7 RNA聚合酶(或任何这里特指的突变T7 RNA聚合酶)指在r/mGmH条件下整合1n摩尔2’-OME NTPs入转录产物所需的酶量。这里使用的，一个单位的无机焦磷酸酶定义为在25℃，pH7.2时每分钟释放1.0摩尔无机焦磷酸所需的酶量。
为最佳化整合(100％)2’-OME ATP，UPT和CTP(“rGmH”)入转录产物，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-80010％(w/v)，TritonX-100 0.01％(w/v)，MgCl2 5mM(当每种NTP浓度为1.0mM时其浓度为9.6mM)，MnCl2 1.5mM(当每种NTP浓度为1.0mM时其浓度为2.9mM)，2’-OME NTP(每种)500μM(更合适地，2.0mM)，pH7.5，Y639F T7 RNA聚合酶15单位/ml，无机焦磷酸酶5单位/ml，和至少8个核苷长度的全-嘌呤引导序列。
为最佳化整合(100％)2’-OME UPT和CTP  (“rRmY”)入转录产物，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT40mM，亚精胺2mM，PEG-800 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 5mM(当每种NTP浓度为1.0mM时其浓度为9.6mM)，MnCl2 1.5mM(当每种NTP浓度为1.0mM时其浓度为2.9mM)，2’-OME NTP(每种)500μM(更合适地，2.0mM)，pH7.5，Y639F/H784A T7 RNA聚合酶15单位/ml，无机焦磷酸酶5单位/ml，和至少8个核苷长度的全-嘌呤引导序列。
为最佳化整合(100％)脱氧ATP和GTP及2’-OME UPT和CTP(“dRmY”)入转录产物，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，精胺2mM，亚精胺2mM，PEG-800 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 9.6mM，MnCl2 2.9mM，2’-OME NTP(每种)2.0mM，pH7.5，Y639FT7 RNA聚合酶15单位/ml，无机焦磷酸酶5单位/ml，和至少8个核苷长度的全-嘌呤引导序列。
为最佳化整合(100％)2’-OME ATP，UPT和CTP及2’-F GTP(“fGmH”)入转录产物，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 9.6mM，MnCl2 2.9mM，2’-OME NTP(每种)2.0mM，pH7.5，Y639F T7 RNA聚合酶15单位/ml，无机焦磷酸酶5单位/ml，和至少8个核苷长度的全-嘌呤引导序列。
为最佳化整合(100％)脱氧ATP和2’-OMEUPT和GTP和CTP(“dAmB”)入转录产物，以下条件是优选的：HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl2 9.6mM，MnCl2 2.9mM，2’-OME NTP(每种)2.0mM，pH7.5，Y639F T7 RNA聚合酶15单位/ml，无机焦磷酸酶5单位/ml，和至少8个核苷长度的全-嘌呤引导序列。
上述的每种情况(a)转录适宜地在20℃至约50℃进行，更合适地为30℃至45℃，跟适宜地在37℃至少反应2小时，并且(b)使用50-300nM双链DNA转录模板(200nM模板用于循环1以增加差异(300nM模板用于dRmY转录))，随后循环中运用这里描述的条件，使用约50nM，最优PCR反应的1/10稀释倍数。)优选的DNA转录模板见下描述(ARC254和ARC256在所有2’-OME条件下进行转录，而ARC255在rRmY条件下转录)。
ARC254(SEQ ID NO：99)：
5’-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
ARC255(SEQ ID NO：100)：
5’-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
ARC256(SEQ ID NO：101)：
5’-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
在本发明的rN转录条件下，转录反应混合物包括2’-OH三磷酸腺嘌呤核苷酸(ATP)，2’-OH三磷酸鸟嘌呤核苷酸(GTP)，2’-OH三磷酸胞嘧啶核苷酸(CTP)，2’-OH三磷酸尿嘧啶核苷酸(UTP)。使用本发明的rN转录混合物的修饰寡核苷酸产物包括所有的2’-OH腺嘌呤核苷，2’-OH鸟嘌呤核苷，2’-OH胞嘧啶核苷，和2’-OH尿嘧啶核苷。在rN转录的优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，至少80％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤核苷，至少80％的胞嘧啶核苷是2’-OH胞嘧啶核苷，至少80％的尿嘧啶核苷是2’-OH尿嘧啶核苷。更优选的rN转录实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，至少90％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤核苷，至少90％的胞嘧啶核苷是2’-OH胞嘧啶核苷，至少90％的尿嘧啶核苷是2’-OH尿嘧啶核苷。最优选的rN转录实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中100％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，100％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤核苷，100％的胞嘧啶核苷是2’-OH胞嘧啶核苷，100％的尿嘧啶核苷是2’-OH尿嘧啶核苷。
在本发明的rRmY转录条件下，转录反应混合物包括2’-OH三磷酸腺嘌呤核苷酸，2’-OH三磷酸鸟嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸胞嘧啶核苷酸，2’-OME三磷酸尿嘧啶核苷酸。使用本发明的rRmY转录混合物的修饰寡核苷酸产物包括所有的2’-OH腺嘌呤核苷，2’-OH鸟嘌呤核苷，2’-OME胞嘧啶核苷，和2’-OME尿嘧啶核苷。在优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，至少80％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤核苷，至少80％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少80％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。更优选的实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，至少90％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤核苷，至少90％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少90％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。最优选的实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中100％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，100％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤核苷，100％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，100％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。
在本发明的dRmY转录条件下，转录反应混合物包括2’-脱氧三磷酸腺嘌呤核苷酸，2’-脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷酸，2’-O-甲基三磷酸胞嘧啶核苷酸，2’-O-甲基三磷酸尿嘧啶核苷酸。使用本发明的dRmY转录混合物的修饰寡核苷酸产物包括所有的2’-脱氧腺嘌呤核苷，2’-脱氧鸟嘌呤核苷，2’-O-甲基胞嘧啶核苷，和2’-O-甲基尿嘧啶核苷。在优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2’-脱氧腺嘌呤核苷，至少80％的鸟嘌呤核苷是2’-脱氧鸟嘌呤核苷，至少80％的胞嘧啶核苷是2’-O-甲基胞嘧啶核苷，至少80％的尿嘧啶核苷是2’-O-甲基尿嘧啶核苷。在更优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺嘌呤核苷是2’-脱氧腺嘌呤核苷，至少90％的鸟嘌呤核苷是2’-脱氧鸟嘌呤核苷，至少90％的胞嘧啶核苷是2’-O-甲基胞嘧啶核苷，至少90％的尿嘧啶核苷是2’-O-甲基尿嘧啶核苷。在最优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中100％的腺嘌呤核苷是2’-脱氧腺嘌呤核苷，100％的鸟嘌呤核苷是2’-脱氧鸟嘌呤核苷，100％的胞嘧啶核苷是2’-O-甲基胞嘧啶核苷，100％的尿嘧啶核苷是2’-O-甲基尿嘧啶核苷。
在本发明的rGmH转录条件下，转录反应混合物包括2’-OH三磷酸腺嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸鸟嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸胞嘧啶核苷酸，2’-OME三磷酸尿嘧啶核苷酸。使用本发明的rGmH转录混合物的修饰寡核苷酸产物包括所有的2’-OH腺嘌呤核苷，2’-OME鸟嘌呤核苷，2’-OME胞嘧啶核苷，和2’-OME尿嘧啶核苷。在优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，至少80％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，至少80％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少80％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。在更优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，至少90％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，至少90％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少90％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。在最优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中100％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，100％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，100％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，100％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。
在本发明的r/mGmH转录条件下，转录反应混合物包括2’-OME三磷酸腺嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸鸟嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸胞嘧啶核苷酸，2’-OME三磷酸尿嘧啶核苷酸和2’-OH三磷酸鸟嘌呤核苷酸。使用本发明的r/mGmH转录混合物的修饰寡核苷酸产物包括所有的2’-OME腺嘌呤核苷，2’-OME鸟嘌呤核苷，2’-OME胞嘧啶核苷，和2’-OME尿嘧啶核苷，其中鸟嘌呤核苷中混合有大约10％是2’-OH鸟嘌呤。在优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2’-OME腺嘌呤核苷，至少80％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，至少80％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少80％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷，并且不超过10％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤。在更优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺嘌呤核苷是2’-OME腺嘌呤核苷，至少90％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，至少90％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少90％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷，并且不超过10％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤。在最优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中100％的腺嘌呤核苷是2’-OME腺嘌呤核苷，100％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，100％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，100％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷，并且不超过10％的鸟嘌呤核苷是2’-OH鸟嘌呤。
在本发明的fGmH转录条件下，转录反应混合物包括2’-OME三磷酸腺嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸鸟嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸胞嘧啶核苷酸，2’-F三磷酸尿嘧啶核苷酸。使用本发明的fGmH转录混合物的修饰寡核苷酸产物包括所有的2’-OH腺嘌呤核苷，2’-OME鸟嘌呤核苷，2’-OME胞嘧啶核苷，和2’-F尿嘧啶核苷。在优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，至少80％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，至少80％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少80％的尿嘧啶核苷是2’-F尿嘧啶核苷。在更优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，至少90％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，至少90％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少90％的尿嘧啶核苷是2’-F尿嘧啶核苷。在最优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中100％的腺嘌呤核苷是2’-OH腺嘌呤核苷，100％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，100％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，100％的尿嘧啶核苷是2’-F尿嘧啶核苷。
在本发明的dAmB转录条件下，转录反应混合物包括2’-还原三磷酸腺嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸鸟嘌呤核苷酸，2’-OME三磷酸胞嘧啶核苷酸，2’-OME三磷酸尿嘧啶核苷酸。使用本发明的dAmB转录混合物的修饰寡核苷酸产物包括所有的2’-还原腺嘌呤核苷，2’-OME鸟嘌呤核苷，2’-OME胞嘧啶核苷，和2’-OME尿嘧啶核苷。在优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少80％的腺嘌呤核苷是2’-还原腺嘌呤核苷，至少80％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，至少80％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少80％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。在更优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中至少90％的腺嘌呤核苷是2’-还原腺嘌呤核苷，至少90％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，至少90％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，至少90％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。在最优选实施方案中，修饰寡核苷酸包括的序列中100％的腺嘌呤核苷是2’-还原腺嘌呤核苷，100％的鸟嘌呤核苷是2’-OME鸟嘌呤核苷，100％的胞嘧啶核苷是2’-OME胞嘧啶核苷，100％的尿嘧啶核苷是2’-OME尿嘧啶核苷。
每种情况中，转录产物可以用于SELEXTM方法的文库以鉴定适体和/或测定具有给定目标结合特异性的序列保守模体。结果序列是稳定的，从过程中去除该步骤以达到稳定的适体序列并给出更稳定的适体。2’-OME SELEXTM方法的另一优点是结果序列可以含有较少的序列所需2’-OH核苷，可以为无。对于剩余的多于2’OH核苷，其可以通过后-SELEXTM方法去除。
如下列描述，完全整合2’替换核苷的更低但有用的转录产物可以在除上述最佳条件的其它条件下获得。例如，上述转录条件的变化包括：
HEPES溶液的浓度范围可以为0至1M。本发明也预计使用其它具有5至10之间pKa值的其它溶液，例如，Tris(羧甲基)氨基甲烷。
DTT浓度范围可以为0至400mM。本发明的方法也提供使用其它还原试剂，包括，例如，巯基乙醇。
亚精胺和/或精胺浓度范围可以为0至20mM。
PEG-8000浓度范围可以为0至50％(w/v)。本发明的方法也提供使用其它亲水聚合物包括，例如，其它分子重量的PEG或其它聚乙二醇。
Triton X-100浓度范围可以为0至0.1％(w/v)。本发明的方法也提供使用其它非-离子清洁剂包括，例如，其它清洁剂，包括其它Triton X清洁剂。
MgCl2浓度可以为0.5mM至50mM。MnCl2浓度可以为0.15mM至15mM。MgCl2和MnCl2都必需在所述的范围内，在优选实施方案中MgCl2∶MnCl2比率为10至3，合适地，比率为3-5∶1，更合适地，比率为3-4∶1。
2’-OME NTP浓度(每种NTP)可以为5μm至5mM。
2’-OH GTP浓度可以为0μm至300mM。
2’-OH GMP浓度可以为0至5Mm.
pH可以为6至pH9。本发明的方法可以在多数聚合酶具备整合修饰核苷活性的pH范围内实施。此外，本发明的方法提供了在转录反应条件下优化使用的螯合试剂，包括，例如，EDTA，EGTA，DTT。
下列实施例中描述的通过生物分析显示的具有高亲合力和特异结核性的选择适体适用于C5补体蛋白相关的疾病状况的治疗。
具有补体系统蛋白C5亲合力的适体
虽然补体系统在维持健康中扮演重要角色，其也具有导致或引发疾病的潜力。这样，期望发展补体系统的抑制物作为治疗应用。由于补体蛋白C5兼为补体激活级联的经典和选择性路径中的成分，故特别期望发展其抑制物(Matis和Rollins(1995)NatureMedicine 1(8)：839-842)。相应地，C5抑制物可以防止补体-介导的由两种路径引起的损害。一些补体系统蛋白，如C1q和C3，对于正常的应对微生物的防御机制和免疫主峰和损害组织的清除是重要的；然而，C5相应地对于这些功能是不重要的。这样，C5的功能可以在短期或长期内被抑制而不影响补体系统的保护作用。
治疗的C5抑制物也是期望的，由于其抑制C5的分裂从而防止两种潜在的危害性补体活性的产生。第一，抑制C5分裂产生C5a从而消除了主要的补体趋化和血管活性。第二，抑制C5分裂产生C5b从而阻止细胞溶解C5b-9膜攻击复合物(”MAC“)的装配。抑制C5分裂同时阻止了白细胞和组织如内皮细胞中的C5a和C5b活性(Ward(1996)Am.J.Pathol.149：1079)。
C5a和MAC已经涉及人类疾病相关的急性和慢性炎症，并且其在疾病阶段中的作用已经在动物模型中被证实。C5a对于补体和嗜中性粒细胞依赖的肺血管损伤是必需的(Ward(1997).J.Lab.Clin.Med.129：400；Mμlligan等(1998)J.Clin.Invest98：503)，并且于在休克和烧伤损伤中的嗜中性粒细胞和血小板活性相关(Schmid等，(1997)Shock 8：119)。MAC介导急性自身免疫重症肌无力的肌肉损伤(Bicsccker和GOMez(1989)J.Immunol.142：2654)，移植中的器官排斥(Bldwin等，(1995)移植59：797；Brauer等，(1995)移植59：288；Takahashi等，(1997)Immunol.Res.16：273)，和自身免疫肾小球肾炎中的肾损伤(Biesecker  (1981)J.Exp.Med.39：1779；Nangaku(1997)Kidney Int.52：1570)。C5a和MAC涉及急性心肌缺血(HOMeister和Lucchesi(1994)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.34：17)，急性(Bednar等，(1997)J.Neurosurg.86：139)和慢性CNS损伤(Morgan  (1997)Exp.Clin.Immunogenet.14：19)，体外循环中的白细胞活性(Sun等，(1995)Nucleic Acids Res.23：2909；Spycher和Nydegger(1995)Infushionsther.Transfusionsmed.22：36)和包括风湿性关节炎和狼疮的自身免疫疾病中的组织损伤(Wang等，(1996)Immunology 93：8563)。
补体活性也涉及糖尿病视网膜病变，并且复合和启动视网膜血管损伤(Zhang等，(2002)Diabetes 51：3499)。低水平的构成补体活性通常发生在非-糖尿病眼疾中，以非-糖尿病大鼠眼中MAC和补体调节蛋白的存在为证据，表明补体失调发生在糖尿病人中(Sohn等，(2000)IOVS 41：3492)。此外，C5b-9的沉积已经在糖尿病人志愿者的视网膜血管中被检测，而在非-糖尿病人志愿者是缺乏的(Zhang等)，糖尿病视网膜中CD55和CD59的表达降低(Zhang等)，并且在糖尿病人尿中存在糖基化CD59，但不存在于非-糖尿病人中(Acosta等，(2002)PNAS 97，5450-5455)。此外，已知在I型糖尿病人中补体和血管系统是活化的。见，例如，Hansen，T.K.等，Diabetes，53：1570-1576(2004)。C5a通过与免疫和补体系统相互作用激活内皮细胞。见，例如，Albrocht，E.A.等，Am J Pathology，164：849-859(2004)。血管系统在包括糖尿病视网膜病的眼疾中被激活。间，例如，Gert，V.B.等，Invest Opthalmol Vis Sci，43：1104-1108(2002)。补体系统在糖尿病视网膜病中也被激活。见，例如，Gert，V.B.等，Invest Opthalmol Vis Sci，43：1104-1108(2002)和Badouin，C等，Am J Opthalmol，105：383-388(1988)。
一些实施方案中，本发明的材料包括一些约15至60核苷长度的核酸适体，其特异结合补体蛋白C5并且其功能性地调控，例如，阻止，体内和/或细胞-基础分析中的补体蛋白C5活性。
这里列出了可以特异结合和调控补体蛋白C5的适体。这些适体提供了低-毒性，安全，的治疗有效形式，其改进和/或阻止多种补体-相关疾病或失调，例如，补体-相关的心脏失调(例如，心肌损伤；C5介导的心脏冠状动脉旁路术(CABG)相关的补体并发症，如手术-后出血，系统性嗜中性粒细胞和白细胞活化，增加心肌梗塞的危险性，并增加认知障碍；再狭窄；和C5介导的经皮冠状动脉介入治疗相关的补体并发症)，缺血-再灌注损伤(例如，心肌梗死，卒中，冻伤)，补体相关的发炎疾病(例如，哮喘，关节炎，败血症，和器官移植后排斥)，和补体相关的自身免疫疾病(如，重症肌无力，全身性红斑狼疮(SLE))。其它C5抑制的症状包括，例如，肺炎(Mμlligan等，(1998)J.Clin.Invest.98：503)，体外补体活化(Rinder等(1995)J.Clin.Invest.96：1564)，抗体-介导的补体活化(Biesecker等(1989)J.Immunol142：2654)，肾炎和其它肾疾病，眼部症状如，C5介导的眼组织损伤，如糖尿病视网膜病，和阵发性睡眠性血红蛋白尿症。这些适体也可以用于诊断学。
正如这里所述的这些适体可以包括修饰，其包括，如与亲油性的或高分子量复合物(如，PEG)共轭，与戴帽亚基的结合，与修饰核酸的结合，并且修饰磷酸骨架。
在发明的某一实施方案中，提供结合C5补体蛋白的分离的，非-自然出现的适体。在某些实施方案中，分离的，非-自然出现的适体的C5补体蛋白分离常数(“Kd”)少于100μM，少于1μM，少于500nM，少于100nM，少于50nM，少于1nM，少于500pM，少于100pM，少于50pM。在发明的某些实施方案中，正如在下面实施例1中描述的，分离常数是由点杂交滴定测定的。
在另一实施方案中，发明的适体调节C5补体蛋白的功能。在另一实施方案中发明的适体抑制C5功能，而在另一实施方案中适体刺激C5的功能。正如这里使用的C5补体蛋白突变体包括本质地执行与C5补体蛋白功能相同的突变体。更适宜地，C5补体蛋白突变体实际上包括相同的结构且在某些实施方案中，与含有下列(序列号：102)氨基酸序列的C5补体蛋白氨基酸序列有80％序列相等，更适宜地90％序列相等，且更适宜地95％序列相等(在Haviland等，J.Immunol.1991 Jan 1；146(1)：362-8被引用)：
   1 mgllgilcfl iflgktwgqe qtyvisapki frvgaseniv iqvygyteaf datisiksyp
  61 dkkfsyssgh vhlssenkfq nsailtiqpk qlpggqnpvs yvylevvskh fskskrmpit
 121 ydngflfiht dkpvytpdqs vkvrvyslnd dlkpakretv ltfidpegse vdmveeidhi
 181 giisfpdfki psnprygmwt ikakykedfs ttgtayfevk eyvlphfsvs iepeynfigy
 241 knfknfeiti karyfynkvv teadvyitfg iredlkddqk emmqtamqnt mlingiaqvt
 301 fdsetavkel syysledlnn kylyiavtvi estggfseea eipgikyvls pyklnlvatp
 361 lflkpgipyp ikvqvkdsld qlvggvpvtl naqtidvnqe tsdldpsksv trvddgvasf
 421 vlnlpsgvtv lefnvktdap dlpeenqare gyraiayssl sqsylyidwt dnhkallvge
 481 hlniivtpks pyidkithyn ylilskgkii hfgtrekfsd asyqsinipv tqnmvpssrl
 541 lvyyivtgeq taelvsdsvw lnieekcgnq lqvhlspdad ayspgqtvsl nmatgmdswv
 601 alaavdsavy gvqrgakkpl ervfqfleks dlgcgagggl nnanvfhlag ltfltnanad
 661 dsqendepck eilrprrtlq kkieeiaaky khsvvkkccy dgacvnndet ceqraarisl
 721 gprcikafte ccvvasqlra nishkdmqlg rlhmktllpv skpeirsyfp eswlwevhlv
 781 prrkqlqfal pdslttweiq gvgisntgic vadtvkakvf kdvflemnip ysvvrgeqiq
 841 lkgtvynyrt sgmqfcvkms avegictses pvidhqgtks skcvrqkveg ssshlvtftv
 901 lpleiglhni nfsletwfgk eilvktlrvv pegvkresys gvtldprgiy gtisrrkefp
 961 yripldlvpk teikrilsvk gllvgeilsa vlsqeginil thlpkgsaea elmsvvpvfy
1021 vfhyletgnh wnifhsdpli ekqklkkklk egmlsimsyr nadysysvwk ggsastwlta
1081 falrvlgqvn kyveqnqnsi cnsllwlven yqldngsfke nsqyqpiklq gtlpvearen
1141 slyltaftvi girkafdicp lvkidtalik adnfllentl paqstftlai sayalslgdk
1201 thpqfrsivs alkrealvkg nppiyrfwkd nlqhkdssvp ntgtarmvet tayalltsln
1261 lkdinyvnpv ikwlseeqry gggfystqdt inaiegltey sllvkqlrls mdidvsykhk
1321 galhnykmtd knflgrpvev llnddlivst gfgsglatvh vttvvhktst seevcsfylk
1381 idtqdieash yrgygnsdyk rivacasykp sreesssgss havmdislpt gisaneedlk
1441 alvegvdqlf tdyqikdghv ilqlnsipss dflcvrfrif elfevgflsp atftvyeyhr
1501 pdkqctmfys tsnikiqkvc egaackcvea dcgqmqeeld ltisaetrkq tackpeiaya
1561 ykvsitsitv envfvkykat lldiyktgea vaekdseitf ikkvtctnae lvkgrqylim
1621 gkealqikyn fsfryiypld sltwieywpr dttcsscqaf lanldefaed iflngc
在发明的某些实施方案中，正如下面描述目标突变体的序列鉴定是使用BLAST测定的。在文章中两种或更多核酸或蛋白质序列的术语“序列相等”，指当与最大对应对比，使用下列序列比对算法之一或通过视觉检测测定时，两种或更多序列或核酸是相同的或特定百分比的氨基酸残基或核酸相同。对于序列对比，典型地一种序列作为参考序列，测试序列与其对比。当使用序列比对算法时，测试和参考序列被输入计算机，如果需要则设计子序列坐标，并且设计序列算法程序参数。基于设计的程序参数，序列比对算法计算测试序列相对与参考序列的序列相等百分数。通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源算法，通过Needleman&Wunsch，J Mol.Biol.48：443(1970)的同源融合算法，通过查找Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似方法，通过计算机执行这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA Wisconsin遗传软件包，遗传计算机小组，575 Science Dr.，Madison，wis.)或通过视觉检测(通常见，Ausubel等，infra)，可以进行用于对比序列的最佳算法。
适合测定序列相等百分数的算法的一个实施例子是用于序列局部对比查询的算法(之后为“BLAST”)，见，例如，Altschμl等，J Mol.Biol.215：403-410(1990)和Altschμl等，Nucleic AcidsRes.，15：3389-3402(1997)。通过国家生物技术信息中心(之后为“NCBI”)，执行BLAST分析的软件可公开获得。通过NCBI获得的软件如，BLASTN(适合核酸序列)和BLASTP(适合氨基酸序列)用于测定序列一致的默认参数在McGinnis等，NucleicAcids Res.，32：W20-W25(2004)中被描述。
在发明的另一实施方案中，提供了与包括任何序列号1-2，5-67，75-81，83或88-98的适体具有充分相同的结合C5补体蛋白能力的适体。发明的另一实施方案中，适体与包括任何序列号1-2，5-67，75-81，83或88-98的适体具有充分相同的结构和结合C5补体蛋白的能力。另一实施方案中，对应于任何序列号2，5-67，75-81，83或88-98，发明的适体具有包括任何化学修饰的序列。在另一实施方案中，发明的适体作为药物组合物中的活性成分使用。在另一实施方案中，包括本发明的适体的适体或组合物用于治疗多种补体相关的疾病或失调，其包括从下列组中选择的任何一种：补体-相关的心脏失调(例如，心肌损伤；C5介导的心脏冠状动脉旁路术(CABG)相关的补体并发症，如手术-后出血，系统性嗜中性粒细胞和白细胞活化，增加心肌梗塞的危险性，并增加认知障碍；再狭窄；和C5介导的经皮冠状动脉介入治疗相关的补体并发症)，缺血-再灌注损伤(例如，心肌梗死，卒中，冻伤)，补体相关的发炎疾病(例如，哮喘，关节炎，败血症，和器官移植后排斥)，和补体相关的自身免疫疾病(如，重症肌无力，全身性红斑狼疮(SLE))，肺炎，体外补体活化，抗体-介导的补体活化，眼部症状如C5介导的眼组织损伤，如糖尿病视网膜病。
在某一实施方案中，发明的抗-C5适体是包括2’-氟修饰的核苷，2’-OMe修饰的核苷(“2’-OMe”)和2’-OH嘌呤残基的混合物。修饰的抗-C5适体的描述性的通常序列(序列号：1)显示在表1中，并且在图3A中显示了其结构。极大多数的嘌呤(A和G)为2’-OMe修饰，除了两个G残基仍然为2’-OH(下划线显示残基)。画圈的残基代表一组嘧啶，其可以同时修饰2’-H而不明显地影响适体的抗-C5活性(见，下面表1中的ARC330(序列号：2，图3B))。图3A中的下划线残基代表包括2’-氟或2’-H修饰(但不是2’-OMe)的嘧啶残基，而画框的残基代表包括2’-氟或2’-OMe修饰(但不是2’-H)的嘧啶残基。带有箭头(→)的残基必需含有2’-氟修饰。不带有箭头(→)表示的2’-氟修饰的残基，将造成适体溶血活性的显著降低。在首选的实施方案中，发明的抗-C5适体包括对应于序列号：1的核酸序列。
根据发明的抗-C5适体的实施例是ARC186(序列号：4)，其在图3C中显示并且在U.S.Pat.Ser.No.6395888中描述，其通过在此引述全部合并于本文。所有ARC186D的21个嘧啶残基具有2’-氟修饰。大多数的嘌呤(14个残基)具有2’-OMe修饰，除了三个2’-OH嘌呤残基(在图3C中以下划线显示)。本发明的抗-C5适体也可以包括2’-氟和2’-H的混合。例如，图3B中显示的本发明的另一种抗-C5适体ARC330(序列号：2)。ARC330(序列号：2)包括7个2’-H修饰(图3B中画圈残基)，带有2’-氟修饰的14个嘧啶残基，带有2’-OMe修饰的14个嘌呤残基，及3个2’-OH修饰的嘌呤残基(图3B中以下划线表示)。
其它包括2’-氟修饰，2’-OMe修饰，2’-OH嘌呤残基混合物，及与不同大小的非-免疫原性，高分子量化合物(例如，PEG)共轭的适体的联合，其每一种都来源于ARC186(序列号：4)，在图1中显示。本发明包括了图1中描述的适体。本发明也包括如下所述的但缺乏所示3’帽子(例如，插入脱氧胸苷帽子)和/或者下列所示的包括3’帽子(例如，插入dT)，其中3’帽子未显示的适体。
除非另有说明，下面表1中的核酸序列以5’至3’方向排列。在表1中的每一单独序列，所有2’-OMe嘌呤或嘧啶修饰以“m”显示在相应的核酸前；所有2’-氟嘧啶修饰以“f”显示在相应的核酸前；所有的嘌呤或嘧啶的脱氧修饰以“d”显示在相应的核酸前；且任何在核酸前不带有“m”，“f”或者“d”的嘌呤或嘧啶表示2’-OH残基。进一步，“3T”表明插入脱氧胸腺核苷，“NH”表明已胺连接子，“NH2”表示已胺末端基团，“PEG”表示具有指示分子量的聚乙烯乙二醇基团，且“生物素”表示5’末端共轭生物素的适体。
表1：
SEQ ID NO：1
X1X2fCfCrGfCX3X4fUX5X6X7X8X9X10X11rGX12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23fUfUX24X25X26X27X28fCX29
其中：
X1＝fC或mC
X2＝rG或gy
X3＝rG或mG
X4＝rG或mG
X5＝fC或dC
X6＝fU或dT
X7＝fC或dC
X8＝rA或mA
X9＝rG或mG
X10＝rG或mG
X11＝fC或dC
X12＝fC或mC
X13＝fU或mU
X14＝rG或mG
X15＝rA或mA
X16＝rG或mG
X17＝fU或dT
X18＝fC或dC
X19＝fU或dT
X20＝rG或mG
X21＝rA或mA
X22＝fG或mG
X23＝fU或dT
X24＝rA或mA
X25＝fC或dC
X26＝fC或dC
X27＝fU或dT
X28＝rG或mG
X29＝rG或mG
ARC330(SEQ ID NO：2)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC185(SEQ ID NO：3)
GAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfUfCGfUfC
ARC186(SEQ ID NO：4)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC187(SEQ ID NO：5)
40kDa PEG--NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
其中分支40kDa PEG是，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4’-butamide)
ARC188(SEQ ID NO：6)
AGGAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfUfCGfUfC
ARC189(SEQ ID NO：7)
AGfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC250(SEQ ID NO：8)
GGfCGfCfCGfCGGfUfCfUfCAGGfCGfCfUGAGfUfCfUGAGfUfUfUAfCfCfUGfCG
ARC296(SEQ ID NO：9)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG-3T
ARC297(SEQ ID NO：10)
mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGmCmG-3T
ARC331(SEQ ID NO：11)
dCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGdCmG
ARC332(SEQ ID NO：12)
dCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC333(SEQ ID NO：13)
fCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC334(SEQ ID NO：14)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGdCmG
ARC411(SEQ ID NO：15)
fCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC412(SEQ ID NO：16)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGmCmG
ARC413(SEQ ID NO：17)
mCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC414(SEQ ID No：18)
mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGmCmG
ARC415(SEQ ID NO：19)
fCmGfCdCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC416(SEQ ID NO：20)
fCmGfCfCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC417(SEQ ID NO：21)
fCmGfCdCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC418(SEQ ID NO：22)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC419(SEQ ID NO：23)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCTmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC420(SEQ ID NO：24)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCTmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC421(SEQ ID NO：25)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC422(SEQ ID NO：26)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUTfUAfCfCfUmGfCmG
ARC423(SEQ ID NO：27)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUTAfCfCfUmGfCmG
ARC424(SEQ ID NO：28)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTTTAfCfCfUmGfCmG
ARC425(SEQ ID NO：29)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCTmGfCmG
ARC426(SEQ ID NO：30)
fCmGfCfCGfCmGmGmUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG
ARC427(SEQ ID No：31)
fCmGfCmCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC428(SEQ ID NO：32)
fCmGfCfCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC429(SEQ ID NO：33)
fCmGfCmCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC430(SEQ ID NO：34)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCfUmGmAmGfUdCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC431(SEQID NO：35)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGfCmUmGmAmGfUdCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCm
ARC432(SEQ ID NO：36)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGfUdCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC433(SEQ ID NO：37)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGmUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC434(SEQ ID NO：38)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUmUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC435(SEQ ID NO：39)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUmUAfCfCfUmGfCmG
ARC436(SEQ ID NO：40)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGmUmUmUAfCfCfUmGfCmG
ARC437(SEQ ID NO：41)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCmUmGfCmG
ARC438(SEQ ID NO：42)
fCmGfCfCdGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC439(SEQ ID NO：43)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCdGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC440(SEQ ID NO：44)
fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUdAfCfCfUmGfCmG
ARC457(SEQ ID NO：45)
mGfCmGfUfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmAfCmGmC
ARC458(SEQ ID NO：46)
mGmGmGfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmCmCmC
ARC459(SEQ ID NO：47)
mGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGmC
ARC473(SEQ ID NO：48)
mGmGmAfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGfUfCfU-3T
ARC522(SEQ ID NO：49)
mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGTdCTmGmAmGTfUfUAdCdCTmGfCmGmCmC
ARC523(SEQ ID NO：50)
mGmGmCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGTdCTmGmAmGTTTAdCdCTmGdCmGmCmC
ARC524(SEQ ID NO：51)
mGmGmCmGdCdCGdCmGmGTdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGTdCTmGmAmGTTTmAdCdCTmGdCmGmCmC
ARC525(SEQ ID NO：52)
mGmGmCmGdCdCGdCmGmGTdCmUmCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGmUmCmUmGmAmGTTTmAdCdCTmGdCmGmCmC
ARC532(SEQ ID NO：53)
Biotin-
AGfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG
ARC543(SEQ ID NO：54)
mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGmCmC
ARC544(SEQ ID NO：55)
mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUmCmUmCmAmGmGmCGfCfUmGmAmGmUmCmUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGmCmC
ARC550(SEQ ID NO：56)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC551(SEQ ID NO：57)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC552(SEQ ID NO：58)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGTfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC553(SEQ ID NO：59)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC554(SEQ ID NO：60)
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAmGTfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC 657(SEQ IDNO：61)
20kDa PEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC 658(SEQ IDNO：62)
30kDa PEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC 672(SEQ ID NO：63)
NH2-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC706(SEQ ID NO：64)
10kDa PEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC1537(SEQ ID NO：65)
40kDa PEG-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
ARC1730)(SEQ ID NO：66)
PEG20K-NH-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-NH-PEG20K
ARC1905(SEQ ID NO：67)
40K PEG-NH--
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T
其中分支40kDa PEG是2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-I-氨基甲酰
ARC243(SEQ ID NO：68)
GGfCGAfUfUAfCfUGGGAfCGGAfCfUfCGfCGAfUGfUGAGfCfCfCAGAfCGAfCfUfCGfCfC
ARC244(SEQ ID NO：69)
GGfCfUfUfCfUGAAGAfUfUAfUfUfUfCGfCGAfUGfUGAAfCfUfCfCAGAfCfCfCfC
本发明的结合补体蛋白C5的其它适体在下面实施例3中被描述。
在某些实施方案中，本发明的适体治疗具有极大的靶标亲合力和特异性，而且降低由于适体治疗在病人或宿主体内分解导致的非-自然核酸置换的毒害负面作用。在某些实施方案中，包括本发明的适体治疗的治疗组合物没有或具有减少数量的氟化核酸。
本发明的适体能通过在生物领域已知的核酸合成技术合成，其包括在生物领域所熟知的固相核酸合成技术(见，例如，Froehler等，Nucl.Acid.Res.14：5399-5467(1986)和Froehler等，Tet.Lett.27：5575-5578(1986))和液相方法，如三酯法合成(见，例如，Sood等，Nucl.Acid.Res.45：2557(1997)和Hirose等，Tet.Lett.，28：2449(1978))。
药物组合物
发明也包括包括结合补体蛋白C5的适体分子的药物组合物。在某些实施方案中，组合物合适内服，并且其包括单独的或与一种或更多种药物可接受载体结合的发明的药物活性化合物的有效成分。化合物尤其有效，因为他们的毒性相当地低。
发明的组合物能用于治疗或阻止病理，如疾病或失调，或减轻病人中这些疾病或失调的症状。例如，本发明的组合物能用于治疗或阻止与补体-相关的心脏疾病相关的病理(如，心肌损伤，C5介导的心脏冠状动脉旁路术(CABG)相关的补体并发症，如手术-后出血，系统性嗜中性粒细胞和白细胞活化，增加心肌梗塞的危险性，并增加认知障碍；再狭窄；和C5介导的经皮冠状动脉介入治疗相关的补体并发症)，缺血-再灌注损伤(例如，心肌梗死，卒中，冻伤)，补体相关的发炎疾病(例如，哮喘，关节炎，败血症，和器官移植后排斥)，和补体相关的自身免疫疾病(如，重症肌无力，全身性红斑狼疮(SLE，或狼疮))；肺炎，体外补体活化，抗体-介导的补体活化，眼部症状如C5介导的眼组织损伤，如糖尿病视网膜病。施用发明的组合物有助于遭受或诱发与发明的适体特异结合的补体蛋白C5相关的疾病或失调的病人。
发明的组合物能用于具有病理的病人或宿主的治疗方法。发明的方法包括给病人或宿主施用适体或包括结合补体蛋白C5的适体的组合物，通过适体与补体蛋白C5的结合改变其生物功能，因此治疗病理。
具有病理的病人或宿主，例如，通过此发明的方法治疗的病人或宿主可以是脊髓动物，更尤其地是哺乳动物，或更尤其地是人。
实际上，适体或其药物可接受盐类是以足以发挥其希望生物活性，例如，抑制适体与其受体的结合，阻止目标蛋白的分裂的剂量注射的。
发明的某一实施方案包括发明的适体组合物结合其它针对C5介导的补体失调的治疗。发明的适体组合物可以包括，例如，多于一种适体。在某些实施例中，包括一种或更多种发明的化合物的发明的适体组合物，与其它有用的组合物，如抗-发炎药剂，免疫抑制剂，抗病毒剂或类似物结合被注射。此外，正如上面描述的，发明的化合物可以联合细胞毒素，抑制细胞生长或化学疗法药剂如烷化剂，抗-代谢物，有丝分裂抑制剂或细胞毒素抗生素被注射。一般而言，用于此种结合的已知治疗药剂的目前可获得的剂量形式将是合适的。
“联合治疗”(或“共-治疗”)包括施用发明的适体组合物和至少第二种作为特定治疗方案的药剂，通过这些治疗药剂的共-作用提供有益的效果。结合的有益效果包括但不局限于，由于治疗药剂结合导致的药代动力学或药效学的共-作用。典型地，这些治疗药剂的结合注射执行需要特定的时间段(根据结合的选择，通常为分，小时，天或周)。
“联合治疗”可以，但通常不是，期望包括单独的单药治疗方案部分的两种或更多的这些治疗药剂的注射，其附带地和任意地导致本发明的结合。“联合治疗”包括以相继的方式注射这些治疗药剂，即，每一药剂在不同的时间被注射，及事实上以同时的方式注射这些药剂，或至少治疗药剂的两种。事实上，同时给药可以例如，通过给宿主施用具有每一治疗药剂的混合比率的单独胶囊或施用多个治疗药剂的单独胶囊来实现。
每一治疗药剂的连续或实际上同时的给药可以通过任何适当的路径起作用包括，但不局限于，局部给药，口服，静脉注射，肌肉注射，和通过黏膜组织直接吸收。治疗药剂能通过相同的路径或不同的路径施用。例如，第一种选择的联合治疗药剂可以通过注射给药，而其它联合药剂可以局部给药。
可选择地，例如，所有的治疗药剂可以局部给药或所有治疗药剂可以通过注射给药。除非其它注明，治疗药剂给药的次序并非十分关键。正如上面所描述的，“联合治疗”也能包括治疗药剂进一步结合其它生物活性成分的给药。联合治疗进一步包括非-药剂治疗，只要治疗药剂和非-药剂治疗联合的共-作用可以获得有效的效果，非-药剂治疗可以在任何合适的时间执行。例如，在适当的实施方案中，当暂时从治疗药剂的给药中移走非-药剂治疗，也许数天或甚至数星期时，仍然可以获得有效的效果。
通常，本发明的治疗或药理的组合物包括治疗的活性成分的有效剂量，其以不溶的或分散的形式存在于药物可接受介质中。药物可接受介质或载体包括任何和所有溶剂，分散介质，涂层剂，抗细菌和抗真菌药剂，等渗和吸收延迟药剂和类似物。这种药物活性物质的介质和药剂的使用在生物领域被熟知。添加活性成分也能合并入本发明的治疗组合物。
根据本发明所公开的内容，药物或药理的组合物的制备将为本领域的技术人员所知。典型的，这些组合物可以制备为注射剂型，可为液体溶液或悬浮液；在注射前易溶解或悬浮于液体中的固体形式；药片或其它口服给药的固体形式；如缓释胶囊；或其它任何目前使用的形式，包括眼药水，霜剂，洗剂，药膏，吸入剂和类似物。无菌形式的应用，如由外科医生，医师或健康护理人员在手术部位的特别区域进行的生理盐水-基础的冲洗，也可以特异应用。组合物也可以通过微装置，微粒或海绵输送。
形成制剂后，治疗物可以以适合于剂量形式的方式，并以药理有效的剂量给药。制剂可以以多种剂量形式给药，例如上述的注射溶液形式，也可以应用药物释放胶囊和类似形式。
本文中，施用的活性成分的数量和组合物的体积依赖于所治疗的宿主动物。需要施用的活性化合物的精确成分依赖于实施者的判断并且对于每个人都是特异的。
通常使用分散活性化合物需要的最小体积。给药的合适方式也可以是多变的，但可以典型地初始施用该化合物并监控结果，随后给予进一步的受控剂量。
例如，对于口服给药的药片或胶囊形式(例如，凝胶胶囊)，活性药物成分可以与口服的，无-毒性药物可接受惰性载体，如乙醇，甘油，水和类似物相联合。此外，当期望或需要时，合适的连接剂，润滑剂，分裂剂和染色剂也可以整合入混合物中。合适的连接剂包括淀粉，镁铝硅酸盐，淀粉糊，凝胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，自然糖如葡萄糖或beta-乳糖，玉米甜味剂，自然和合成树胶如阿拉伯树胶，黄芪胶或藻酸钠，聚乙二醇，蜡和类似物。这些剂量形式中施用的润滑剂包括油酸盐，硬脂酸钠，硅石，滑石，硬脂酸，其镁或钙盐和/或聚乙二醇和/或类似物。分裂剂包括，不限制于，淀粉，甲基纤维素，琼脂，膨润土，黄原胶淀粉，琼脂，褐藻酸或其钠盐，或泡腾合剂，和类似物。稀释液，包括，例如，乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露醇，山梨糖醇，纤维素和/或糖胶。
注射组合物适宜地为由脂肪乳剂或悬浮液方便的制备的水相等渗溶液或悬浮液，和栓剂。组合物可以为无菌的并且/或者含有佐剂，如保存剂，稳定剂，保湿剂或乳化剂，溶液促进剂，调节渗透压的盐和/或缓冲液。此外，其也可以包括其它治疗有效物质。分别根据常规的混合，颗粒化或包裹方法制备组合物，并且典型地包括约0.1至75％，合适地为1至50％的活性成分。
本发明的组合物也可以以定时释放和缓释药片或胶囊，药丸，粉末，颗粒，西也剂，酊剂，糖浆和乳剂的口服剂量形式给药。
液体，特别是注射组合物可以，例如，通过溶解，分散等制备。活性化合物溶解或混合入药物纯度的溶剂，如水，盐，水溶葡萄糖，甘油，乙醇，和类似物，形成组成溶液或悬浮液。此外，也可以制备在注射前适合于分散入液体的固体形式。
本发明的化合物可以以静脉内(推注和灌输都可)，腹膜内，皮下或肌肉内形式给药，其使用药物领域中的普通技术人员已知的形式。注射剂兼可制备成液体溶液或悬浮液形式。
注射给药通常用于皮下，肌肉内或静脉内注射和灌输。此外，一种注射给药的方法利用慢释或缓释系统，其确保维持恒定的剂量水平，根据美国专利号3710795，通过引述在此合并。
此外，本发明的优选化合物可以通过局部使用合适的鼻内装置，吸入剂进行鼻内形式给药，或使用本领域中普通技术人员熟知的这些透皮小片通过透皮途径给药。透皮输送系统的给药形式，其给药的剂量将比间断给药剂量方法更具持续性。其它优选的局部制备物包括乳剂，软膏，洗剂，气溶胶喷雾和凝胶，其中活性成分的浓度范围从0.01％至15％，w/w或w/v。
包括药物等级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁和类似物的固体组合物，赋形剂可以被使用。用例如，端叠氮基聚乙二醇，例如，丙二醇作为载体，上述定义的活性化合物可以制成栓剂。在某些实施方案中，栓剂由脂质乳液或悬浮液便利地制成。
本发明的化合物也可以以脂质体输送系统给药，如小单室脂质体囊泡，大单室脂质体囊泡和多室脂质体囊泡。脂质体可以由多种含有胆固醇，十八烷胺或磷脂酰胆碱。一些实施方案中，脂质成分的薄膜与药物溶液水合以形成包埋药物的脂质层，如美国专利号5262564中描述。例如，提供这里描述的适体分子，其通过生物领域已知的方法制备，作为带有亲脂性的化合物或非-免疫原的，高分子量化合物的复合物。与核酸相关的复合物的一个实施例在美国专利号6011020中被提供。
本发明的化合物也可以偶联作为可命中目标的药物载体的可溶的聚合体。这种聚合体包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟基丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚，聚羟基乙基aspanamide苯酚，或由棕榈酰残基取代的聚乙烯基氧化多溶素。而且，本发明的化合物可以偶联一类有利于获得药物控制释放的可生物降解的聚合体，例如，聚乳酸，polyepsilon caprolactone，聚β-羟基丁酸，聚原酸酯，聚缩醛，聚二氢吡喃，聚氰基丙烯酸，交联或者两亲嵌段共聚物的水合凝胶。
如果需要的话，施用的药物组合物可以包括少量非-毒性的辅助的物质，例如，湿润或者乳化剂，pH缓冲剂，和其它物质，例如，醋酸钠，油酸三乙醇胺。
根据各种因素，包括，类型，物种，年龄，体重，性别和病人的药物情况；所治疗情况的严重性；给药的途径；病人的肾和肝功能；和使用的特定适体或其盐类选择使用适体的剂量方法。普通技术医师或兽医可以容易的决定和给出阻止，控制或阻遏病情发展的药物的有效剂量。
当用于期望效果时，本发明的口服剂量将在约0.05至7500mg/天的范围内。适宜地，组合物以包括0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100.0，250.0，500.0和1000.0mg活性成分的药片形式提供。本发明的化合物可以以每天单一剂量给药，或以每天两次，三次或四次给药。
灌输剂量，鼻内剂量和透皮剂量将在0.05至7500mg/天的范围内。皮下，静脉内和腹腔内剂量将在0.05至mg/天的范围内。
本发明化合物的有效血浆浓度范围为0.002mg/mL至50mg/mL。
适体治疗的药代用力学和生物分布的监控
包括适体的所有寡核苷酸-基础的治疗药物的药代动力学特性，特定地适合于期望的药物应用。当直接针对细胞内目标的适体不受与细胞内输送相关的困难(如反义链和RNAi基础的治疗)影响时，这些适体必需能够分布于目标器官和组织，并且在身体中保留(非修饰的)与期望剂量方法一致的时间。
这样，本发明提供了影响适体药代动力学的材料和方法，并且，特异地，调整适体药代动力学的能力。通过将调节基团(例如，PEG聚合物)与适体结合，和/或整合修饰核苷(例如，2’-氟或2’-OME)以改变核酸的化学组成而获得适体药代动力学的调整能力(例如，调节能力)。适体药代动力学的调整能力用于改善已经具有的治疗应用，或可选地，发展新的治疗应用。例如，在一些治疗应用中，例如，在期望快速药物清除或去除的抗-肿瘤或急性护理中，期望减少适体在循环中的保留时间。可选地，另一治疗应用，例如，维持治疗药物中，其中治疗药物的系统循环是所期望时，将增加适体循环的保留时间。
此外，适体药代动力学的调控被用于修正主体中适体治疗药物的生物分布。例如，一些治疗应用中，可以期望改变适体治疗药物的生物分布以针对特定类型的组织或特定器官(或一组器官)。这些应用中，适体治疗药物适宜地在特定组织或器官中聚集。另一治疗应用中，可以期望针对表达一种细胞标记或给定疾病相关症状的目标组织，从而适体治疗药物适宜地聚集在影响组织中。例如，如题为“适体治疗药物的药代动力学和生物分布的受控调控”的申请中的临时申请美国系列号60/550790，2004年三月5日归档所描述，适体治疗药物的PEG化(例如，50kDa PEG聚合体的PEG化)被用于针对炎症组织，从而PEG化适体治疗药物适宜
为测定适体治疗药物(例如，适体联合物或具有改变化学性的适体，如修饰核酸)的药代动力学和生物分布，将监控多种参数。这些参数包括，例如，半衰期(t1/2)，血浆清除率(C1)，分布体积(Vss)，浓度-时间曲线下的面积(AUG)，最大血清或血浆浓度(Cmax)，和适体组合物的平均保留时间(MRT)。这里使用的，术语“AUC”指适体给药后，适体治疗药物血浆浓度相对于时间的图形下的面积。AUC值用于评估生物有效性(例如，适体给药后适体治疗药物在循环中的百分数)和/或给定适体治疗药物的全部清除率(C1)(例如，适体治疗药物从循环中清除的速率)。分布体积涉及适体治疗药物血浆浓度相对于身体中适体存在的量。Vss越大，血浆中的适体越多(例如，更多外溢)。通过将适体与调节基团结合，如小分子，多肽，或多具末端基团，或通过整合修饰核酸入适体中，在受控情况下，本发明提供调控体内稳定的适体组合物的药代动力学和生物分布的材料和方法。如此所述，调节基团的结合和/或核酸化学组成的改变将根本改变适体在循环中的保留时间和组织分布的模式。
除核酸酶的清除以外，寡核苷酸治疗物通过肾过滤也可减少。所以，静脉内给药的核酸酶-抗性的寡核苷酸典型地显示体内小于10分钟的半衰期，除非肾过滤可以被阻止。这可以通过促进从血清进入组织的快速分布或增加寡核苷酸的分子重量使之大于肾小球临界点的有效大小而完成。上述的小治疗药物和PEG聚合体的结合(PEG化)，可以增加适体在训话中的保留时间，从而减少剂量频率并增强血管目标的有效性。
适体可以结合多种修饰基团，如高分子量聚合体，例如PEG；多肽，例如，Tat(HIV Tat蛋白的13个氨基酸片段(Vives，等(1997)，J.Biol.Chem.272(25)：16010-7))，Ant(源于果蝇antennapedia同源异型蛋白的16个氨基酸序列的三维螺旋)(Pietersz，等(2001)，Vaccine(19(11-12)：1397-405))和Arg7(小的，多聚精氨酸(Arg7)的正电细胞-渗透多肽成分。(Rothbard，等(2000)，Nat.Med.6(11)：1253-7；Rothbard，J等(2002)，J.Med.Chem.45(17)：3612-8))；和小分子，例如，亲脂性化合物如胆固醇。这这里描述的多种结合物中，适体的体内特性通过与PEG基团的结合而极大改变。例如，2’F和2’-OME修饰适体治疗药物的混合物与20kDa PEG聚合物的结合阻碍了肾过滤并促进适体在健康和炎症组织中的分布。此外，20kDa PEG聚合物-适体的结合证明其阻止适体的肾过滤效果与40kDa PEG聚合物相近。而PEG化的一种效果在于适体的清除率，20kDa基团提供延长的系统暴露量，也促进适体在组织中的分布，特别是那些高灌注器官和炎症发生位置，从而PEG化适体优先在炎症组织中聚集。一些情况下，20kDa PEG化适体结合物可以进入内部细胞，例如，肾细胞。
综述，由低分子量修饰基团，包括胆固醇和细胞-渗透多肽产生的适体药代动力学和组织分布效果要小于PEG化或核苷修饰(例如，改变化学成分)产生的结果。当不受理论限制时，具显示胆固醇-介导的与血浆脂蛋白的结合，假设其发生于反义结合情况下，被特定的适体-胆固醇结合折叠结构排除，并且/或者涉及胆固醇基团的亲脂性自然特性。与胆固醇类似，与48小时肾脏中高水平存在的结合物相比较，Tat多肽标签的存在促进了适体在血流中的清除。已经在文中报道介导大分子通过体内细胞膜的其它多肽(例如，Ant，Arg7)，并不显示其促进适体在循环中的清除。然而，与Tat类似，与其它适体相比Ant结合物在肾中显著聚集。当不受理论限制时，在体内三维折叠适体中存在的Ant和Arg7多肽修饰基团可能削弱多肽影响适体运输特性的能力。
修饰核苷也可以用于调节适体的血浆清除。例如，整合有2’-F和2’OME稳定性化学物的未结合适体，其作为目前典型的适体产物，当与未修饰的适体比较，显示了体内和体外的高度核酸酶稳定性，显示了快速的血浆丢失(例如，快速血浆清除率)和组织中的快速分布，主要在肾脏中。
PEG-派生核酸
如上所述，带有高分子量非-免疫原性聚合物的核酸派生物具有改变核酸药代动力学和药代动力学特征的特性并使其为更有效的药物。优化的活性改变可以包括增加对核酸酶降解的抗性，降低肾过滤，降低对于免疫系统的暴露，并改变治疗药物在身体中的分布。
本发明的适体组合物可以源自聚醚(“PAG”)基团。PAG-派生的核酸实施例见美国转移申请号10/718833，2003年11月21日归档，其通过在此引述全部合并于本文。发明中使用的典型的聚合物包括聚(乙二醇)(“PEG”)，也可为聚(氧乙烯)(“PEO”)和聚(丙二醇)(包括聚异丙二醇)。此外，不同环氧烷烃的任意或大批共聚物(例如，氧乙烯和环氧丙烯)可以用于许多应用。在其最常见形式，聚醚，如PEG，在每一末端都有羟基基团的是一种线性聚合物：HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。该聚合物，alpha-，OMega-二氢聚(乙二醇)，也可以表示为HO-PEG-OH，其中PEG符号表示下列结构单元：-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中n典型地在4至10000范围内。
正如所示，PEG分子是双-功能的并一些时候指“PEG二醇”。PEG分子的末端部分相关地为非-反应羟基基团，-OH基团，其可以被活化，或转变为功能基团，附加PEG至其它化合物的反应位点。这里活化的PEG二醇指双-活化PEG。例如，通过将相应的非反应羟基基团，-OH，替换为来源于N-羟基琥珀酰亚胺的琥珀酰亚胺活性酯基团，PEG二醇的末端基团被功能化为具氨基基团选择反应的活性碳酸盐酯。
许多应用中，设计在PEG分子的一个末端加上充分非-反应基团帽子，使得PEG分子为单-功能(或单-活性)。在通常显示活性PEG多反应位点的蛋白治疗药物，双-功能活性PEGs导致额外的交联，产生不好的功能聚集。为制备单-活性PEGs，PEG二醇分子一个末端的羟基分子典型地替换为非-反应甲氧基末端基团，-OCH3-。PEG分子未加帽的另一末端典型地转化为反应末端基团，可以活化连接某一表面或分子如蛋白质的反应位点。
PAG是典型地具有在水中和许多有机溶剂中可溶性特性，无毒素，无免疫原性的聚合物。PAG的一种应用是将聚合物共价与非可溶性分子结合使结果的PAG-分子“变为”可溶。例如，已显示非-水溶性药物紫杉醇，当与PEG结合时，变得水溶性。Greenwald，等，J.Org.Chem.，60：331-336(1995)。PAG结合通常不仅仅用于增强可溶性和稳定性，也可以增长分子的血液循环半衰期。
本发明的聚烷基组合物大小典型地在5至80kD之间，然而任何大小都可以使用，选择依赖于适体和应用。本发明的其它PAG组合物大小在10至80kD之间。而其它PAG组合物大小在10至60kD之间。例如，PAG聚合物可以至少为10，20，30，40，50，60，或80kD大小。这些聚合物可以是线性或分支的。
相对于生物-表达的蛋白质治疗药物，核酸治疗药物典型地从活性单核苷化学合成。PG-核酸共轭物可以通过使用相同的重复单体合成整合PEG而制备。例如，转化为亚磷酰胺形式的活性PEGs可以整合入固-相寡核苷酸合成。可选地，寡核苷酸合成可以由反应PEG接触位点的位点-特异整合完成。最通常，通过在5’-末端加入一个自由初级氨基酸而完成(在固相合成的最后结合阶段使用修饰的亚磷酰胺完成)。应用该方法，反应PEG(例如，其为活化的从而可以反应并与胺形成连接)与纯化寡核苷酸连接，接反应发生在溶液中。一些实施方案中聚合物是分支PEG分子。其它实施方案中聚合物是40kDa分支PEG，见，例如图4中描述的(1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4’-丁唑酰胺)。如图5描述，一些实施方案中40kDa分支PEG(1，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4’-丁唑酰胺)与适体的5’端连接。
PEG连接改变治疗药物的生物分布的能力设计多种因素，包括共轭物外观大小(例如，以水力半径测定)。已知较大的共轭物(＞10kDa)更有效地阻止肾过滤并随后增加大分子(例如，多肽，反义寡核苷酸)的血清半衰期。PEG共轭物阻止过滤的能力已经在大约为50kDa的PEG中发现(对于半衰期的定义，由巨噬细胞-介导的新陈代谢胜于肾清除，所以进一步增大仅有极小的作用)。
高分子量PEGs(＞10kDa)的生产是困难的，低效的，昂贵的。作为合成高分子量PEG-核酸共轭物的途径，先前的工作关注于制备高分子量的活性PEGs。制备这些分支的一种方法包括制备分支活性PEG，其中两个或多个PEGs结合于一个带有活性基团的核心。这些高分子量PEG分支的末端部分，例如，相应的非-活性羟基基团，可以是活性的，或转变为功能基团，使一个或多个PEG是结合至其它组合物的反应位点。分支的活性PEGs可以具有超过两个末端，从而两个或多个末端被激活，这些激活的高分子量PEG分支在这里被称为，多-活性PEGs。一些情况下，并非分支PEG分支的所有末端都是激活的。当分支PEG分支的任何两个末端激活时，该PEG分支称为双-活性PEGs。当分支PEG分支一个末端激活时，该PEG分支称为单-活性PEGs。本方法的一个实施例中，由两个单甲氧基PEGs与赖氨酸结合制备的活化PEG，其随后激活以进行反应，已经描述于(Harris等，Nature，vol.2：214-221，2003)。
本发明提供另一个合成包括多PEG化核酸的高分子量PEG-核酸(优选地，适体)共轭物的经济的方法。本发明也包括PEG-连接的多股寡核苷酸，例如，二聚适体。本发明也涉及高分子量组合物，其中PEG稳定基团是适体不同分离部分的连接物，例如，PEG结合单一适体序列，从而高分子量适体的线性排列是，例如，核酸-PEG-核酸(-PEG-核酸)n，其中n大于等于1。
本发明的高分子量组合物包括那些具有分子量至少为10Kd的分子。组合物典型地具有10至80kD大小的分子量。本发明的高分子量组合物至少为10，20，30，40，50，60，或80kD。
稳定基团是一种分子，或分子的部分，其提高本发明的高分子量适体组合物的药代动力学和药效特性。一些情况下，稳定基团是使两个或多个适体，或适体区域接近，或使本发明的高分子量适体组合物的全部自由旋转度减少的分子或分子的部分。稳定基团可以是聚醚，如聚乙二醇，其可以是线性或分子的，均聚合物或杂聚合物。其它稳定基团包括的聚合物如多肽核酸(PNA)。寡核苷酸可为稳定基团；这些寡核苷酸可以包括修饰核苷，和/或修饰连接子，如硫代磷酸酯。稳定基团可以是适体组合物的整合部分，例如，其共价结合适体。
本发明提供高分子量适体组合物，其中两个或多个核酸基团共价结合至少一个聚醚基团。聚醚基团起稳定基团作用。组合物中聚醚基团共价结合每个适体的末端，从而聚醚与核酸基团共存与一个分子中，聚醚被称为连接基团。在这种组合物中，共价分子的初始结构包括线性排列的核酸-PAG-核酸。一个实施例是具有初始结合核酸-PEG-核酸的组合物。另一实施例是线性排列：核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。
为制备核酸-PEG-核酸共轭物，核酸被最初合成从而其带有单一反应位点(例如，其为单-活性的)。在优选实施方案中，这种反应位点是通过在寡核苷酸固相合成的最后阶段加入修饰硫代磷酸酯在5’-末端引入氨基基团。修饰核酸去蛋白和纯化后，重新制备高浓度溶液使活性PEG的自动水解最小化。优选实施方案中，寡核苷酸的浓度为1mM并且新制备溶液中含有200mM NaHCO3-缓冲液，pH8.3。共轭物的合成以缓慢的，阶梯式增加高纯度双-功能PEG作为起始。优选实施方案中，PEG二醇通过琥珀酰亚胺丙酸酯的衍生在其两端都活化(双-活性)。随着反应，PEG-核酸共轭物以凝胶电泳或液相色谱纯化以分离完全的-，部分的-，和未-共轭的样本。多PAG分子连接(例如，任意或批共聚物)或小PAG链可以相连获得不同长度(或分子量)。非-PAG连接可以用于不同长度的PAG链之间。
2’-OME，2’-氟和其它修饰的核酸修饰增加适体对于核酸酶的稳定性并增加其体内半衰期。3’-3’-dT帽子也增加核酸酶抗性。见，例如，美国专利号5674685；5668264；6207816；和6229002，其通过引述在此全部合并于本文。
反应核酸的PAG-派生物
高分子量PAG-核酸-PAG共轭物可以通过将单-功能活性PEG与含有超过一个位点的核酸反应而制备。某一实施方案中，核酸是双-功能的，或双-活性的，并含有两个反应位点：通过亚磷酰胺合成法引入核酸的一个5’氨基基团和一个3’-氨基基团，例如：图6中描述的3’-5’-双-PEG化。可选实施方案中，可以在内部位置引入反应位点，使用例如，嘧啶5-位点，嘌呤8-位点，或核糖的2’-位点作为初始氨基接触的位置。这种实施方案中，核酸可以具有几个活性或反应位点并称为多活性的。合成并纯化后，在促进寡核苷酸反应位点的选择反应并使自动水解最小化的条件下，修饰的寡核苷酸与单-活性PEG联合。优选实施方案中，单甲氧基-PEG与琥珀酰亚胺丙酸酯反应，在pH8.3进行连接反应。为促进双-替换PEG的合成，提供相对于寡核苷酸的理想配比过剩的PEG。反应后，PEG-核酸共轭物以凝胶电泳或液相色谱纯化以分离完全的-，部分的-，和未-共轭的样本。
连接区域可以具有一个或多个连接的聚醚基团。如PAG可以为不同长度并以合适的组合使用以获得组合物的期望分子量。
特定连接的效果可以受其化学成分和长度影响。太长，太短，或形成不适宜结构和/或与目标的离子交互作用将妨碍适体和目标间复合物的形成。超出核酸间距离范围长度的连接子，将减少配基的有效浓度而奸杀结合稳定性。这样，有必要最优化连接子成分和长度使适体对于目标的亲合力最大化。
所有这里论述的申请和专利文件通过在此引述全部合并于本文，正如显示，这些申请或文件特定地和单独地通过在此引述全部合并于本文。申请和专利文件的引用并不意味一种许可，任何都于前述领域相关，其也不组成与相同内容和数据相关的任何许可。本发明已经通过文字描述进行了叙述，本领域中的技术人员将意识到本发明可以在多种实施方案中引用，并且之前描述的和以下的实施例是出于说明的目的并不限制以下的权利要求。
实施例1
经典和可选补体途径中的抗-C5适体活性
实施例1A：溶血试验。
CH50试验测定在标准抗体-包被绵羊红血球悬浮液中，血清试验样本中的补体系统裂解50％细胞的能力。在不同的抗C5适体存在或不存在情况下，将0.2％人血清样本与抗体-包被的绵羊红细胞混合(Diamedix EZ补体CH50试剂盒，Diamedix公司，Miami，FL)。根据试剂盒方案，以含有钙，镁和1％凝胶(GVB++补体缓冲液)的巴比妥-缓冲盐溶液，在37℃孵育30分钟进行试验。孵育后，样本通过离心沉淀未受影响的红细胞。测定上清液在412nm的吸光值(OD412)以定量可溶性血红素的释放，其与溶血的程度成比例(Green等，(1995)Chem.Biol.2：683-95)。为证明适体阻止C5的活性，一些血红素上清根据ELISA试剂盒的方案通过ELISA分析C5a和C5b-9的存在(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA；C5a ELISA试剂盒，BDBiosciences，San Diego，CA)。
反应混合物中非-PEG化抗-C5适体(ARC 186)(序列号：4)的加入以剂量依赖的形式抑制了溶血，如图7A中所示，IC50为0.5±0.1nM，(见图7B)，其值与硝化纤维过滤测定的KD一致。在非常高的适体浓度下(＞10nM)，血红素的量不能本质上从背景中(未加血清)区分出，显示ARC186(序列号：4)可以完全阻止补体活性。在CH50溶血试验中，20KDa(ARC657；序列号：61)，30KDa(ARC658；序列号：62)，分支40KDa(1，3-双(mPEG-[20Kda])-丙基-2-(4’-butamide)(ARC187；序列号：5)，分支40Kda(2，3-双(mPEG-[20Kda])-丙基-1-氨基甲酰)(ARC1905；序列号：67)，线性40kDa(ARC1537；序列号：65)，和线性2×20kDa(ARC1730；序列号：66)PEG基团与ARC186(序列号：4)适体的结合对于适体的抑制活性具有较小作用(图7A-图7D)。
进一步研究中，在上述的CH50溶血试验中，PEG化抗-C5适体AR1905(分支40Kda(2，3-双(mPEG-[20Kda])-丙基-1-氨基甲酰)；序列号：67)的抑制活性与非-PEG化前体，ARC672(序列号：63)，其含有末端5’-氨基，进行了比较。在存在或不存在不同浓度的ARC1905和ARC627时，人血清溶液(Innovative Research，Southfield，MI)混合抗体-包被的绵羊活细胞(Diamedix EZ补体CH50试剂盒，DiamedixCorp.，Miami，FL)，每个试验中的最终血清浓度是0.1％，并根据制造商的推荐方案进行试验。溶血反应在37℃下反应一小时并不断搅拌使细胞保持悬浮。孵育后，影响的细胞通过离心沉淀(2000rpm，2分钟，室温)，200μL上清转移至平底聚苯乙烯品(VWR，cat#62409-003)。测定上清在415nm处的吸光值(OD415)对可溶性血红素定量。用等式％inh＝100-100×(A样 本-A无血清)/(A无适体-A无血清)计算每个适体浓度测定值，其中A样本是在适体不同浓度的吸收值，A无血清是在无血清时的背景血红素吸收值(100％抑制对照)而A无适体是在缺失适体时由于基础补体活性引起的吸收(0％抑制对照)。使用等式％inh＝(％inh)最 大×[抑制剂]n/IC50 n+[抑制剂]n)+背景从％抑制相对于[抑制剂]的图形测定IC50值。使用等式IC90＝IC50×[90/(100-90)]1/n和IC90＝IC50×[99/(100-99)]1/n从IC50值计算IC90和IC99值。在此平行研究中ARC1905和ARC627的IC50值分别为0.648+/-0.0521和0.913+/-0.0679(见图58)，进一步证明PEG化具有较小的，如果有，影响适体功能的效应。
溶血上清的ELISA试验表明功能性抑制与C5a释放的抑制相关。这样，溶血数据显示ARC186(序列号：4)，和其PEG化共轭物，是高度潜在的具抑制C5转化酶-催化活性功能的补体抑制剂。
非-PEG化材料进行的溶血试验表明抗-C5适体不与来源于非-灵长类物种，包括大鼠，豚鼠，狗和猪的C5发生交联反应。然而，在灵长类血清筛选中观察到显著的抑制活性，包括食蟹猴，食蟹猴和黑猩猩。抗-C5适体的体内效应用ARC658(序列号：62)，ARC186(序列号：4)的30kDa-PEG类似物进一步在食蟹猴血清中进行研究。在并列比较中(n＝3)，ARC658抑制人补体活性的IC50为0.21±0.0nM，抑制食蟹猴补体活性的IC50为1.7±0.4nM(图8)。这样根据这项测定，ARC658(序列号：62)在食蟹猴血清中的效力比人类中小8±3倍。
相关研究中，分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)PEG化抗-C5适体，ARC1905(序列号：67)在人血清(Innovative Research，Southfield，MI)，食蟹猴血清(Bioreclamation，Hicksville，NY)，或大鼠血清(Bioreclamation，Hicksville，NY)中，通过绵羊红血球溶血试验研究其在经典补体途径中的活性。这些试验在高稀释血清中，人类和食蟹猴中0.1％，大鼠0.3％，在前述的比较ARC 1905相对于ARC672对于绵羊红血球溶血抑制效果的相同条件下进行。在并列比较中，ARC1905在人类和食蟹猴中都获得体内补体活性的完全抑制(90-99％)而ARC1905在大鼠补体样本中显示了较小或无特异抑制活性(图59A)。类似于ARC658，ARC1905在试验条件下对于食蟹猴中补体活性的潜力具有～10倍的减少，如图59B中报道的IC90和IC99值。
硝酸纤维素滤膜结合试验。单独的适体通过γ-32P-ATP和核酸聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)孵育在其5’端以32P-标记。聚丙烯酰氨凝胶电泳后通过凝胶-过滤将反射标记的适体从游离ATP中分离出。为测定抗-C5适体亲合力，放射标记的适体(≤10pM)与提升浓度(0.05-100nM)的纯化C5蛋白(Quidel，San Diego，CA)在含有1m M MgCl2的磷酸盐-缓冲液中以室温(23℃)和37℃孵育15分钟和4小时。使用Minifold I点-杂交，96-孔真空吸滤器(Schleicher和Schuell，Keene，NH)通过硝酸纤维素过滤分析结合反应。使用三层滤膜，由(从上至下)Protran硝酸纤维素膜(Schleicher和Schuell)，Hybond-P尼龙膜(amersham Biosciences，Piscataway，NJ)和GB002凝胶杂交纸(Schleicher和Schuell)组成。硝酸纤维素层，其选择性结合蛋白强于核酸，适宜地保留蛋白配基复合物中的抗-C5适体，而非-复合的抗-C5适体将通过硝酸纤维素膜并附着于尼龙膜。凝胶杂交纸作为其它滤膜的支撑介质。过滤后，分离过滤层，干燥并在荧屏上曝光(Amersham Biosciences)并用Storm 860 Phosphorimager
Figure BDA00003395548000831
杂交显示系统(AmershamBiosciences)定量。
如图9和10所示，升高的C5浓度增加了硝酸纤维素膜上捕获的ARC186。ARC186结合力对于升高的C5浓度的依赖性可以由单一-位点结合模型很好地描述(C5+ARC186C5·ARC186；％结合率＝Cmax/(1+KD/[C5]；Cmax是在饱和[C5]下的最大％结合率；KD是分离常数)。图9和10分别显示了在15分钟和4小时孵育后两个温度下的ARC 186结合曲线。15分钟孵育后，ARC186在23和37℃的结合曲线无明显区别，其KD值为0.5-0.6nM(图9)。当孵育时间增加时，23和37℃的结合曲线间的差别变得显著。孵育4小时后(图10)，23℃的KD值减少为0.08±0.01nM，而37℃的KD值未变化(0.6±0.1nM)。
为验证室温下长期孵育必要条件的基础，使用动力学方法进一步分析此温度下的亲合力。描述C5·ARC186分离的逆向反应速率表示为vrev＝k-1[C5·ARC186]，其中vrev是速率(单位为M分钟-1)而k-1是第一位分离速率常数(单位为分钟-1)。描述C5·ARC186复合物形成的以下反应的速率表示为vfor＝k1[C5][ARC186]，其中vfor是速率(单位为M分钟-1)而k1是第二位结合速率常数(单位为M-1分钟-1)。使用准-一级假定分析数据，其中一种反应物的浓度(这里为C5)对于其它物质极大过量([C5]＞＞[ARC186]，这样在反应过程中保持必要的恒定。在这种情况下，以下反应以第一位过程速率等式描述，vfor＝k1’[ARC186]，其中k1’＝k1[C5]。
为分析C5·ARC186的分离，放射标记的ARC186(≤10pM)在含有1mM MgCl2的磷酸盐-缓冲液中以5nM C5蛋白于室温(23℃)预-平衡。通过加入非-标记ARC186(1μM)起始分离反应，其作为游离C5的捕捉者，并以硝酸纤维素膜过滤分离结合的和游离的放射标记ARC186。通过变换分离反应起始和过滤之间的时间间隔获得ARC186的分离时间曲线。分离时间曲线，以硝酸纤维素过滤膜捕获的放射标记ARC186减少的百分数表示(相等于结合至C5的百分数)，通过单一指数衰减描述，其中％ARC186结合＝100×e-k -1 i(见图11)。本方法测定的分离速率常数的值，k-1，为0.013±0.02分钟-1，对应于半衰期(t1/2＝In2/k-1)53±8分钟。
为分析结合反应，C5·ARC186形成的平衡速率常数(keq)在不同浓度C5蛋白(1-5nM)存在时进行测定。在含有1mMMgCl2的PBS中于室温将C5蛋白和放射标记ARC186混合起始复合物形成。如分离反应中的描述，通过改变反应起始和过滤的间隔时间获得复合物形成的时间曲线。平衡时间曲线，以硝酸纤维素过滤膜捕获的放射标记ARC186增加的百分数表示，通过单一指数衰减描述，其中％ARC186结合＝100×e-k -1 i。图12显示了1，2和4nM C5的平衡时间曲线。如期望的，keq值根据[C5]以线性增加(keq(1nM)＝0.19±0.02分钟-1；keq(2nM)＝0.39±0.03分钟-1；keq(3nM)＝0.59±0.05分钟-1；keq(4nM)＝0.77±0.06分钟-1；keq(5nM)＝0.88±0.06分钟-1)。在试验的条件下，keq，k1和k-1的相关性为keq＝k1[C5]+k-1。这样，从keq相对于[C5]的图形斜率推导出k1的评估值(见图12插入部分)，此处为0.18±0.01nM-1分钟-1。
这些数据表明，在低C5浓度的条件下(例如，0.1nM)，需要延长孵育使C5和放射标记的ARC186混合物道道平衡。在这些条件下，keq＝(0.18±0.01nM-1分钟-1)(0.1nM)+0.013分钟-1＝0.03分钟-1，对应于半衰期22分钟。这样，室温孵育时需要约2小时(～5倍半衰期)以达到完全(＞95％)平衡。较短的孵育时间(例如，15分钟)将明显低估复合物的实际亲合力，如以上显示的15分钟(KD＝0.5nM)相对于4小时(KD＝0.08nM)孵育时获得的不同亲合力。可以根据相关性KD＝k-1/k1从动力学数据计算室温KD可选的评估值。此情况下，计算的KD为0.07±0.01nM，其与上述热动力学方法测定的KD完全一致。
通过比较补体级联放大中C5上游和下游补体成分，以硝酸纤维素过滤方法评估ARC186(序列号：4)对于C5的特异性。从Complement Technologies(Tyler，TX)购买的纯化人类蛋白和蛋白复合物包括：C1q(目录号#A099.18；2.3μM)，C3(目录号#A113c.8；27μM)，C5(目录号#A120.14；5.4μM)，C5a des Arg目录号#(A145.6；60μM)，sC5b-9(目录号#A127.6；1μM)，因子B(目录号#A135.12；11μM)和因子H(目录号#A137.13P；6.8μM)。在含有1mM MgCl2，0.02mg/mL BSA和0.002mg/mLt RNA的PBS中进行蛋白的系列稀释以建立结合反应，在25℃或37℃孵育1-4小时，随后使用前述的硝酸纤维素过滤装置。通过等式：％硝酸纤维素结合＝振幅×[C5]/(KD+[C5])获得％硝酸纤维素结合相对于[C5]半-log图测定分离常数KD。
图13显示的结果表明适体本质上不识别C5a(KD＞＞3μM)，虽然其显示了对于可溶性C5b-9(KD＞0.2μM)较弱的亲合力，推测其由于与C5b成分的交互作用引起。另一补体成分显示中等至较弱的适体亲合力。非-活性C3本质上不结合适体；然而，因子H(KD～100nM)以及，较少范围内，C1q(KD＞0.3μM)结合适体。综述，数据表明ARC186(序列号：4)主要通过识别C5b区域，以高亲合力结合人类C5。这样，ARC186和其PEG化派生物，例如ARC1905将不干扰C3不的产生，其对于细菌的调理作用重要，或不干扰调控因子对于C’活性的自然调控。
适体与高分子量PEG的结合引入了导致亲合力减少的位阻的可能性。PEG-修饰的适体由于其在缺失目标蛋白的情况下仍具有附着硝酸纤维素的趋势，硝酸纤维素过滤法直接结合不能对其进行评估。然而，这些适体的相对亲合力可以以已知的竞争结合方法通过在37℃进行的硝酸纤维素过滤，比较与放射标记的，非-PEG化适体(≤10pM)竞争结合目标的能力进行评估。当冷(例如，非-放射标记)竞争物浓度上升时，放射标记适体结合目标蛋白的百分数减少了。如图14所示，当存在2nM C5蛋白时，冷ARC186(序列号：4)或PEG化适体(ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)，和ARC187(序列号：5))浓度的增加(0.05-1000nM)易于同放射标记的ARC186(序列号：4)竞争结合。此外，所有四个适体的滴度曲线几乎交叉，表明ARC657，ARC658和ARC187的PEG-共轭物较少或不影响适体与C5的京合力。
相似研究中，使用竞争结合试验通过比较ARC672(带有5’-末端氨基的ARC186；序列号63)和ARC1905(结合分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)PEG的ARC627)来测定PEG共轭物结合C5的效应。1以含有1mMMgCl2，0.01mg/mL BSA，0.02mg/mL tRNA的PBS制备10μM储量的每种适体，并系列稀释制备包括＞100-倍范围适体浓度的10×样本系列。12μl的每种样本在96-孔板中加入至96μl32P-放射标记ARC186以制备标记和冷竞争的1.1×溶液。90μl的标记/竞争溶液加入至10μl 10×C5蛋白使反应起始。每个反应中放射标记ARC186的最终浓度保持恒定。结合反应在37℃平衡15-30分钟，随后在前述的硝酸纤维素过滤装置上过滤。出于数据分析目的，冷竞争适体被当作ARC186/C5相互作用的竞争抑制物；用缺失竞争的对照反应(0％抑制对照)校准数据计算％抑制。通过将数据符合等式：％抑制＝振幅×[竞争]n/(IC50n+[竞争]n)，从％抑制相对于[ARC672]或[ARC1905]的半对数图测定IC50值。
如图60所示，根据竞争结合测定，分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)PEG的加入低于适体的亲合力较小或无影响。根据图60中IC50值相对于C5数据线性的y-截距，0.46+/-0.149nM和0.71+/-0.130nM的KD值分别与ARC672和ARC1905接近。两个值都接近于37℃测定的ARC186KD值.
ARC1905和C5间相互作用的温度依赖性也通过竞争试验评估。如前述，ARC1905连续稀释制备10×样本系列。结合反应在25℃或37℃平衡1-4小时，并用硝酸纤维素过滤装置过滤。通过将数据与缺失竞争(0％抑制对照)或缺失C5蛋白(100％抑制对照)的对照反应进行校准计算抑制百分数。通过将数据符合等式：％抑制＝振幅×[竞争]n/(IC50n+[竞争]n)，从％抑制相对于[ARC672]或[ARC1905]的半对数图测定IC50值。如图61所示，ARC1905在25℃和37℃都具有结合C5的高亲合力。从IC50相对与C5数据的y-截距获得25℃和37℃的KD值，分别为0.15±0.048nM和0.69±0.148nM。两个数据都与上述测定的ARC186/C5作用KD值一致。
实施例1B：全血试验
使用以下全血试验分析抗-C5适体在补体系统选择性途径中的作用。缺失抗凝血剂时，从正常人类志愿者中采血。血样本(不含抗-凝血剂)与升高浓度的ARC186(序列号：4)在室温或37℃孵育5小时。样本经离心分离血清并通过sC5b-9ELISA(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA)测定C5b的存在。如图15所示，在不同温度下孵育的样本抗-补体活性，其以C5b-9的产生为反映，在3μM时交叉。室温的数据表明定量抑制所需的适体浓度在3-6μM范围内，而报道的C5浓度约为400nM。这些结果显示完全抑制C5活性需要超过十倍摩尔量的抗-C5适体(ARC186；序列号：4)。
实施例1C：酵母聚糖的补体活性
酵母聚糖是酵母细胞壁的多糖成分，是选择性补体级联放大的潜在催化剂。在血液，血浆或血清体外样本中加入酵母聚糖将刺激补体活性产生，包括C5a和C5b-9(s C5b-9)可溶性形式。未稀释的人类血清(血液研究中心，Boston，MA)，柠檬酸人全血(血液研究中心，Boston，MA)或食蟹猴血清(Charles River实验室，Wilmington，MA)加入升高浓度的ARC658(序列号：62)，ARC186(序列号：4)的30K PEG类似物。为激活补体，10×酵母聚糖(Sigma，St.Louis，MO)悬液加入至样本至终浓度5mg/mL。37℃孵育15分钟后，通过离心去除酵母聚糖颗粒，用C5a和/或sC5b-9ELISA(C5b-9ELISA(试剂盒，Quidel，San Diego，CA；C5a ELISA试剂盒，BD Biosciences，San Diego，CA)测定补体活性范围。
缺失适体时，与未处理样本的～1％活性相比，酵母聚糖处理激活～50％血清或全血C5活性。加入抗-C5适体至50nM(血液中C5浓度的～10％)对于sC5b-9形成具有较小效应。然而，如图16所示，对C5施加增加浓度的ARC658(序列号：62)以剂量-依赖模式抑制C5的活性。在人类血清或全血中，0.8-1μM ARC658(序列号：62)获得量化(～99％)抑制，相应于～2摩尔适体相对于C5。在食蟹猴血清中需要更高浓度的适体以获得可比较的抑制。此情况下，仅在10μM适体，或～20摩尔适体相对于C5时获得99％抑制。
类似研究中，如下所述使用酵母聚糖激活选择性途径的补体活性测定人类和食蟹猴样本中ARC1905(ARC186的分支40kDa(2，3-双(mPEG-[20kDa])-丙基-1-氨基甲酰)PEG化形式)的抑制效应。来源于cerevisiae酵母的酵母聚糖A由Sigma-Aldrich公司提供(目录号Z4250-1G，St.Louis，MO)。酵母聚糖A以粉末形式提供并悬浮于Dμlbecco’s PBS(Gibco，Carlsbad，CA，目录号14190-144)制备50mg/mL悬液。冻存的正常人血清(目录号IPLA-SER)从Innovative Reearch(Southfield，MI)购买。冻存食蟹猴血清(目录号CYNSRM)从Bioreclamation(Hicksville，NY)购买。供应商提供的5-10mL每瓶的血清在37℃融化，分装(～1mL)并储存于-20℃。分装样在需要使用前以37℃孵育融化并在试验过程中储存于冰上。每个试验中血清的最终浓度为～100％。以0.9％盐溶液制备ARC1905的20μM储液并系列稀释至包括～90-倍适体浓度范围的10×样本系列。无-适体(盐溶液)样本作为阴性(0％抑制)对照也包括在内。
90μL血清加入至96-孔PCR板(VWR，目录号1442-9596)。10μL适体样本于室温直接在血清中稀释并混合。分离的96-孔PCR板中加入8μL的50mg/mL酵母聚糖。两块板同时在37℃预-孵育15分钟。预-孵育之后，在8μL酵母聚糖中加入80μL血清/适体混合物，制备5mg/mL的酵母聚糖终浓度。反应板封口并于37℃孵育15分钟。孵育末期，孔中加入8μL 0.5MEDTA并混合以终止反应。离心沉淀酵母聚糖(3700rpm，5分钟，室温)并转移～80μL终止液上清至新96-孔PCR板并封口。上清于液氮中快速冷冻并储存于-20℃。为控制酵母聚糖-不依赖的背景活性，如上所述制备和处理血清样本，加入替代酵母聚糖的8μL盐溶液。
C5活性的活性程度从每个酵母聚糖-激活样本产生的相关C5a水平测定，根据C5a ELISA试剂盒方案通过C5a ELISA测定(ALPCO Diagnostics，Windham，NH，目录号EIA-3327)。C5a ELISA试剂盒包括人类特异试剂并按分析分析血浆或血清样本中人类C5a(hC5a)设计。有必要用食蟹猴浓度标准品对ELISA对于食蟹猴C5a反应进行特征化。为制备一套通用标准，0.5mL人类或食蟹猴血清在37℃与5mg/mL酵母聚糖孵育15分钟，用12.5μl 0.5M EDTA终止反应并离心去除酵母聚糖。通过与试剂盒提供的h C5a标准血浆比较，酵母聚糖-激活的人类血清样本中C5a浓度经测定为约2μl/mL h C5a。以人类C5a相等物(h C5a eq)表达的食蟹猴样本中的C5a浓度，经测定为约0.6μl/mLh C5a eq。通过在大鼠血清(其不影响ELISA)中稀释制备包括0.4-400ng/mL h C5a或0.12-120ng/mL C5a eq范围的标准品系列。根据ELISA试剂盒方案标准品用蛋白-沉淀试剂预-处理，并不需要进一步稀释即可应用于ELISA板。通过VersaMax紫外/可见光吸收板读数计(Molecμlar Dynamics，Sunnyvale，CA)在最大吸收峰450nm(A450)对ELISA读书。A450值随C5a浓度而变化，低C5a时为0.1-0.2，高C5a时上升为～3.5。为对分析样本中的C5a定量，定量的高限和低限分别为，人类中25和0.78ng/mL hC5a，食蟹猴中15和0.94ng/mL hC5a eq。A450相对于ng/mL hC5a或hC5a eq关系图显示于图62中，将数据应用等式y＝((A-D)/(1+(x/C)B))+D根据4-参数获得标准曲线。
在C5a分析前，根据ELISA试剂盒方案对分析的样本(包括盐和非-酵母聚糖对照)用但被沉淀试剂预-处理。未稀释的分析样本中(包括一些非-酵母聚糖对照)C5a水平典型地超出定量上限(MLOQ)。因此，根据分析样本中C5a原浓度进行1/5，1/50和1/250稀释并测定。通过与合适的(人类或食蟹猴)标准曲线比较和稀释度对C5a进行定量。应用等式％inh＝100-100×(C5样本-C5a无-酵母聚糖)/(C5a盐-C5a无-酵母聚糖)计算每个适体浓度的％抑制率。用等式％inh＝(％inh)最小×[ARC1905]n/(IC50 n+[ARC1905]n)+背景，从％inh相对于[ARC1905]的图形测定IC50值。用等式IC90＝IC50×[90/100-90]1/n和IC99＝IC50×[99/100-99]1/n从IC50值计算IC90和IC99值。
C3活性的活性程度(C5下游的通常补体途径步骤)从每个酵母聚糖-激活样本产生的相关C3a水平测定，根据C3a ELISA试剂盒方案通过C3a ELISA测定(Becton-Dickinson OptiEIAC3a ELISA试剂盒，目录号550499，Franklin Lakes，NJ)。
进行C3a分析前，样本(包括盐和非-酵母聚糖对照)在0.9％盐溶液中系列稀释。C3a ELISA比C5a更灵敏；因此，需要进行1/500，1/5000和1/25000以适应样本C3a全浓度的范围。使用来源于人血清的试剂盒标准品，不同于C5a分析中制备的通用标准品。因为C3a水平变化不大，人类-特异的标准品提供了其相关水平的充足的指标。
从C5a和C3ELISAs获得的数据使用Microsoft Excel分析，用Kaleidagraph(v.3.51，Synergy软件)对平均％抑制值作图。对Excel使用Xlfit 4.1插件程序测定IC50，IC90和IC99值。此方法测定的ARC1905对于人类和食蟹猴补体活活性的效应比较，在图63和64中概述。从图中可知，在人类和食蟹猴血清的体外试验中都获得ARC1905对于通过选择性途径的C5活性的完全抑制。在人类血清中，抑制90％C5活性所需的未稀释样本中ARC1905浓度为442±23nM，大约相等于C5的平均摩尔浓度。然而，对于食蟹猴补体活性，在试验条件下ARC1905的潜力减少4-6倍，由IC90和IC99值反映。
由C3a水平测定的ARC1905 C3活性效应，在图65中概述。特异针对补体途径末端的原理是阻止了C5a和膜攻击复合物(MAC)的促-炎症功能，而不影响由于C3a和C3b产生而达到顶点的下游因子的病原体-攻击功能。图65中的数据表明ARC1905，高至2μM，不抑制C3a产生并显示下游补体活性未受ARC1905负面影响。使用ARC1905在人类和食蟹猴血清样本中都获得对选择性途径C5活性的充分完全阻止。在本试验的条件下，ARC1905抑制食蟹猴C5活性的潜力比抑制人类C5活性极大地减弱。不受理论约束，由于C3活性未受抑制，ARC1905对于补体活性的抑制效应特定针对C5。
实施例1D：补体活性的管环模型
为测定抗-C5适体阻止由异源材料暴露引起的补体活性的能力，如在心肺旁路循环中发现的，我们使用了Nilsson和同伴描述的管环模型(Gong等，(1996)Journal of ClinicalImmunology 16，222-9；Nilsson等，(1998)92，1661-7)。TygonS-50-HL医用/手术管(1/4”内径)(美国塑料公司((Lima，OH)，目录号#00542)被切割成约300毫米长度(约9mL体积)并灌注5mL含有0.4单位/mL肝素(Celsus)和不同浓度的ARC658(序列号：62)(0-5μM)的人类志愿者血液。如Gong等描述，用一小段(～50mm)非-手术硅连接管(3/8”内径)(美国塑料公司(型号R-3603，目录号#00271)将每个长度的聚乙烯管闭合成回环状。管环在37℃水浴中以30rpm旋转1小时。环中的内容物灌注入含有EDTA(10mM终浓度)聚丙烯圆锥终止补体活性。通过离心分离无血小板血浆并通过ELISA分析C5a和C3a(C3a ELISA试剂盒，Quidel，San diego，CA；C5a ELISA试剂盒，BD Biosciences，San diego，CA)。
与酵母聚糖试验比较，在缺失适体时全部补体活性较小。典型地，随着1小时孵育，C5a水平增加至约为6ng/mL，对应于＜1％的可用C5活性。然而，此增加是可重复的并通过ARC658(序列号：62)滴定所抑制。如图17所示，300-400nM的ARC658(序列号：62)足以抑制99％的C5活性，其水平接近或略小于血液中C5摩尔浓度。当不受任何理论约束时，虽然此模型中获得C5活性99％抑制所需适体量少于酵母聚糖模型，本发现可以反映两种试验中使用的补体-激活刺激物的充分不同。C3a的产生也可以作为对照受控，以证明ARC658(序列号：62)不阻止在补体级联放大中早于C5的激活步骤。尽管1小时孵育，C3a水平增高至4000ng/mL，对应于可用C3的10％活性。对比于C5a的生产，ARC658(序列号：62)滴定观察到C3a生产的小剂量依赖性，显示ARC658(序列号：62)特异阻止C5裂解。
管环模型研究用抗-C5适体ARC1905(序列号
67)重复。ARC1905在0.9％盐溶液中系列稀释制备包括100-倍适体浓度范围的20×样本系列(10-100nM试验终浓度)。含有非相关适体(ARC127)的样本作为非-特异寡核苷酸效应对照。无-适体(仅为盐溶液)样本也作为阴性对照包括在内。从内部志愿者中通过标准抽血方法抽取个体-志愿者血液样本。5位志愿者的全血直接抽入60mL注射器(becton-Dickinso，(Franklin Lakes，NJ)，目录号#309653)并立即灌注+/-适体的bivalirudin(20μM终浓度)(Prospec-Tany Technogene Ltd.，(Israel)，目录号#105BIV01)。抗-凝血bivalirudin，一种直接的凝血酶抑制剂，替代可干扰补体活性的肝素使用。
如上所述充分地应用管环模型。从志愿者抽取血后立即灌注5mL血液/适体/bivalirudin样本至～300mm管(直径1/4”，体积～9mL)。管子用小硅胶连接管(～50mm)小心地固定成环状，并产生～4mL的空气体积。管环在37℃水浴以32rpm垂直旋转1小时。孵育后，所有5mL样本转移至含有100Ml 0.5M EDTA 15mL离心管(Corning，(Corning，NY)，目录号#430766)，使EDTA终浓度为10Mm。4离心(Eppendorf离心机5804)(3300rpm，20分钟)后从每个终止样本中收集1mL血浆上清。上清于液氮快速冷冻并储存于-20℃。为控制背景活性，将5mL新鲜血液直接加入置于冰上的含有100μL 0.5M EDTA的15mL圆锥管中制备预-CPB样本。此样本作为血清处理并如上所述储存。
通过上述的C5a ELISA从每个活性样本中相关的C5a产生水平测定C5活性范围。根据ELISA试剂盒方案对未稀释血浆样本进行C5a ELISA，并通过比较制造商提供的C5a标准品对样本C5a水平定量。应用等式％inh＝100-100×(C5样本-C5a预-CPB)/(C5a盐-C5a预-CPB)计算每个适体浓度产生的C5a的％抑制率。用等式％inh＝(％inh)最小×[ARC1905]n/(IC50 n+[ARC1905]n)+背景，从％抑制率相对于[ARC1905]的图形测定IC50值。用等式IC90＝IC50×[90/100-90]1/n和IC99＝IC50×[99/100-99]1/n从IC50值计算IC90和IC99值。
通过上述的C3a ELISA从每个活性样本中相关的C3a产生水平测定C3活性程度。C3a分析前，样本(包括盐溶液和预-CPB对照)在0.9％盐溶液中系列稀释。C3a ELISA比C5a的灵敏度更高；因此，需要1/5000的稀释度以适合样本的C 3a浓度范围。通过比较试剂盒标准品对样本C3a定量，如C5a所述计算％抑制率。数据使用Microsoft Excel分析，用Kaleidagraph(v.3.51，Synergy软件)对平均％抑制值作图。对Excel使用Xlfit 4.1插件程序测定IC50，IC90和IC99值。
图66概述了了五位志愿者中ARC1905和非相关适体ARC127对于补体活性的平均效应。如图67显示，以C5a的产生为反映的C5活性的完全抑制，在＜500nM ARC1905时即可获得，而非相关适体在1μM时无抑制效应。平均全血IC50，IC90和IC99值分别为119±28.6nM，268±39.2nM和694±241nM(图66)。不受理论约束，有理由假设ARC1905排除在细胞血体积之外，其包括大约总体积的45％。IC50，IC90和IC99值，适合于反映血浆中C5抑制，为216±52.0nM，487±71nM和1261±438nM。这些值于ARC1905抑制酵母聚糖-介导的血清补体活性所计算的参数一致，显示细胞血成分不明显影响ARC1905抗-C5活性。高至1μM的ARC1905或非相关适体不抑制C3a的产生。不受理论约束，其表明ARC1905既不抑制C3转化酶的反应，也不阻止其它如C3聚集和转化酶汇集等促进级联放大活性的步骤。
实施例2
重新选择和序列
dRmY集合选择C5
进行两种选择以鉴定人类全长C5蛋白的dRmY适体。使用全长(“FL”)和部分胰蛋白酶水解(“TP”)形式的C5蛋白(QuidelCorporation，San Diego，CA或Advanced Research Technologies，San Diego，CA)并以已经固定于疏水板中的蛋白靶标进行直接选择。相对于自然的，未选择的集合，两种选择都产生了显著富集的结合全长C5的集合。此实施例中显示的所有序列以5’至3’显示。
集合制备：具有以下序列的DNA TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GGTCGATCGATCGATCATCGATG(ARC520；序列号：70)根据标准方法由ABI EXPEDITETM DNA合成仪合成，并去蛋白。模板以5’引物TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC(序列号：71)和3’引物CATCGATGATCGATCGATCGACC(序列号：72)扩增并作为模板以Y639F单点突变T7 RNA聚合酶进行体外转录。使用200Mm HEPES，40mM DTT，2mM亚精胺，0.01％TritonX-100，10％PEG-8000，9.5mM MgCl2，2mM NTPs，2mM GMP，2mM精胺，0.01单位/μl无机焦磷酸酯，和Y639F单点突变T7 RNA聚合酶进行转录反应。
选择：循环1，用硝酸纤维素过滤结合柱进行阳性选择步骤。简要地，1×1015分子(0.5n摩尔)的RNA在100μl结合缓冲液(1×DPBS)中与3μM全长C5或2.6μM部分胰蛋白酶酶解的C5在室温孵育1小时。RNA：蛋白复合物和游离RNA分子用Schleicher & Schuell(Keene，NH)的0.45μm硝酸纤维素旋转柱分离。柱子用1mL 1×DPBS预-冲洗，含有RNA：蛋白的溶液加入至柱中并以1500g离心2分钟。以1mL缓冲液冲洗3次从滤柱上去除非特异结合物，结合滤柱的RNA：蛋白用200μl冲洗或洗脱缓冲液(7M尿素，100mM柠檬酸钠，3mM EDTA，预热至95℃)洗脱2次。沉淀洗脱的RNA(2μl肝糖，1倍体积的异丙醇，1/2体积的乙醇)。使用上述序列号：72所述的3’引物，根据制造商说明用ThermoScript RT-PCRTM系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)对RNA进行反转录，随后进行PCR扩增(20mMTris pH 8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM序列：71和序列：72的引物，0.5nM每种dNTP，0.05单位/μL Taq聚合酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA))。用Centricep柱(PrincetonSeparations，Princeton，NJ)纯化PCR模板并用于转录下一轮集合。
后一种选择循环，结合和游离RNA的分离在Nunc Maxisorp疏水板(Nunc，Rochester，NY)上进行。在100μl 1×DPBS中加入20p摩尔全长C5和部分胰蛋白酶酶解的C5并固定于板表面置于室温1小时起始反应。去除上清并用120μl洗液(1×DPBS)冲洗孔四次。加入含有0.1mg/mL酵母tRNA和0.1mg/mL鲑精DNA的1×DPBS缓冲液作为竞争者封闭蛋白孔。使用的集合物浓度通常超出蛋白浓度5倍。集合RNA也加入至空孔中置于室温1小时去除任何塑料结合序列，然后在无蛋白的封闭孔中孵育以在阳性选择步骤前从集合中去除任何竞争结合序列。集合RNA于室温孵育1小时，通过加入RT混合液(3’引物，序列号：72，Thermoscript RT，Invitrogen)在65℃孵育1小时直接在选择板中反转录结合固定C5的RNA。得到的cDNA作为PCR(Taq聚合酶，New England Biolabs)的模板。扩增的模板DNA用Centrisep柱(Princeton Separations)根据制造商建议的条件去盐，并用于转录下轮选择所需的RNA集合。每轮的转录集合用10％聚丙烯酰氨凝胶纯化。
选择过程用夹心过滤结合(点杂交)试验监控。5’-32P-标记的集合RNA(痕量浓度)与C5，加入0.1mg/mL tRNA和0.1mg/mL鲑精DNA的1×DPBS缓冲液室温孵育30分钟，并用点杂交装置(Schleicher和Schuell)进行硝酸纤维素和尼龙过滤夹心。每三轮进行单点扫描(+/-300nM C5)计算并监控结合硝酸纤维素的RNA的百分比。如上所述使用蛋白滴定和点杂交装置测定集合的Kd值。
选择数据：两种选择经10轮后都被富集并超过自然集合。见图18。在第10轮，全长的集合Kd值约为115nM而胰蛋白酶酶解的为150nM，但在两者的高区结合的程度都仅为10％。第十轮的10集合用TOPO TA克隆试剂盒(iNVITROGEN)克隆并测序。
序列信息：每个集合的45个克隆被测序。第十轮的全长集合中一种单克隆ARC913(序列号：75)占多数，其占集合的24％，剩余为2套双重的和单一序列。第十轮胰蛋白酶酶解集合中含有ARC913(序列号：75)的8个拷贝，但集合主要为其它序列(AMX221.A7；46％)。克隆ARC913(序列号：75)的Kd值为140nM并且结合的程度为20％。见图19。
表5中列出的单独序列以5’至3’为方向，并表示了在提供的dRmY SELEXTM条件下选择的适体核糖核苷酸序列。在本发明源于此选择的实施方案中(并且反应了所列序列)，嘌呤(A和G)为脱氧的而嘧啶(U和C)为2’-OME。表5所列的序列可以含有或不含有帽子(例如，3’-插入dT)。以下的适体唯一序列开始于第23位核苷，紧随以下的固定序列GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(序列号：73)，并延伸至3’固定核酸序列GGUCGAUCGACGARCAUCGAUG(序列号：74)。
表5：C5dRmY适体的核苷序列
ARC913(序列号：75)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGARCGAUCGAUCAUCGAUG
溶血试验：ARC913(序列号：75)在补体系统经典途径中的效应，与ARC186(序列号：4)(抗-C5适体，阳性对照)和未选择的dRmY集合(阴性对照)相比，使用前述的溶血试验分析。溶血抑制试验中，在存在滴定的ARC913(序列号：75)时将0.2％人血清溶液与抗体-包被的绵羊红细胞(Diamedix EZComplement CH50 Test，Diamedix Corporation，Miami，FL)。试验在含有钙，镁和1％凝胶的巴比妥-缓冲盐溶液(GVB++补充缓冲液)中进行，置25℃孵育1小时。孵育后离心样本。测定上清在415nm的最大吸收值(OD415)。溶血活性的抑制表示为与对照相比的％溶血活性。见图20。适体的IC50经计算为约30nM。
实施例3
最佳组合物和序列
实施例3A：ARC913的最小化：
六种基于ARC913(序列号：75)的结构被转录，凝胶纯化，并用点杂交测试与C5的结合。ARC954相似于亲本克隆，其Kd值为130nM，结合程度为20％，而ARC874(序列号：76)是以1μM  Kd值结合C5的仅有其它克隆。
表6所列单独序列方向为5’至3’，并来源于在提供的dRmYSELEX条件下选择的适体。在来源于此选择的(并反应了所列序列)本发明的实施方案中，嘌呤(A和G)为脱氧的而嘧啶(U和C)为2’-OME。表6所列的序列可以含有或不含有帽子(例如，3’-插入dT)。
表6.ARC913最小化克隆的核苷序列
ARC874(SEQ ID NO：76)
CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGG
ARC875(SEQ ID NO：77)
CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAAACGCAGGG
ARC876(SEQ ID NO：78)
GGGUUUGGCACAGGCAUACAUACCC
ARC877(SEQ ID NO：79)
GGGUUUGGCACAGGCAUACAAACCC
ARC878(SEQ ID NO：80)
GGCGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGCC
ARC954(SEQ ID NO：81)
CGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCG
实施例3B：ARC913最优化：参杂重选
为优化克隆ARC913(序列号：75)C5结合亲合力并测定关键的结合因素，执行掺杂重选。掺杂重选用于探究活性克隆序列的要求。用基于单一序列的设计的，合成并退化的集合进行选择。退化水平通常为70％至85％的野生型核苷。通常，可获得中立的突变，但一些情况下可序列改变可以提高亲合力。复合序列信息可以用于鉴定最小集合模体并有助于最优化效果。
集合制备：模板序列
taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GTTACGACTAGCATCGATG(序列号：82)基于ARC913(序列号：75)并以来源于15％水平杂合的随机区域的每个残基合成，例如，每个随机(”N”)位置，残基具有85％的可能性是野生型序列CTTGGTTTGGCACAGGCATA CATACGCAGGGGTCGATCG(序列号：83)中的核苷，及15％的可能性为其它三种核苷。
掺杂重选的模板和RNA集合如前述制备。模板用引物taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC(序列号：84)和CATCGATGCTAGTCGTAAC(序列号：85)扩增。以全长C5进行两种选择，一种在冲洗步骤中使用高浓度盐溶液。如上所述进行选择方案，除了两点不同；1)仅用阳性在疏水板(与随后步骤相同)上进行第一轮；及2)选择全程中不使用竞争物。C5浓度和RNA集合浓度分别保持在200nM和1μM。
掺杂重选数据。正常和高盐选择在5轮后相比自然集合都被富集。第5轮高盐选择的集合Kd值为165nM而正常盐浓度选择为175nM。两者高区的结合程度约为20％。第4轮集合用TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆，对每个集合的48个克隆测序。每个集合的12个克隆经转录并以500nM C5进行单点杂交试验分析。使用前述的单点杂交试验再次测定分裂常数(KdS)。通过将数据代入等式：部分RNA结合＝振幅×Kd/(Kd+[C5])，评估单点扫描鉴定的11个最佳克隆的KdS。三个最佳KdS的克隆为序列号：91(73nM)，序列号：96(84nM)和序列号：95(92nM)。以下表7列出了这11个克隆的序列。
表7中列出的序列以5’至3’为方向，并表示了在提供的dRmYSELEX条件下选择的适体核糖核苷酸序列。在本发明源于此选择的实施方案中(并且反应了所列序列)，相应的序列包括残基的dRmY联合，如文中所示，嘌呤(A和G)为脱氧的而嘧啶(U和C)为2’-OME。表7所列的序列可以含有或不含有帽子(例如，3’-插入dT)。以下的适体唯一序列开始于第23位核苷，紧随以下的固定序列GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(序列号：86)，并延伸至3’固定核酸序列GUUACGACUAGCAUCGAUG(序列号：87)。
表7.来源于掺杂重选克隆的核苷序列
(SEQ ID NO：88)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(SEQ ID NO：89)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGUGUCGAUCUGUUACGACUAGCAUCGAUG
(SEQ ID NO：90)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUAAAUACGCAGGGCUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(SEQ ID NO：91)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCCCAGGCAUAUAUACGCAGGGAUUGAUCCGUUACGACUAGCAUCGAUG
(SEQ ID NO：92)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCGCAGGCAUACAUACGCAGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(SEQ ID NO：93)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGUUGUGGCACAGCCAACCCUACGCACGGAUCGCCCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(SEQ ID NO：94)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGUCGAUCGGUUACGACUA
(SEQ ID NO：95)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUAGGUUCGCACUGUCAUACAUACACACGGGCAAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(SEQ ID NO：96)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCNCAGGCAUANAUACGCACGGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAU
(SEQ ID NO：97)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUUCUCUGCCACAAGCAUACCUUCGCGGGGUUCUAUUGGUUACGACUAGCAUCGAUG
(SEQ ID NO：98)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUAUAUACGCAGGGUCGAUCCGUUACGACUAGCAUCGAUG
实施例3C：40kDa分子PEG修饰的ARC186
寡核苷酸5’NH2-
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCf
UmGfCmG-3T-3’(ARC672，序列号：63)根据制造商的方案，使用标准商业化的2’-OME RNA和2’-F RNA和TBDMS-保护的RNA亚磷酰胺三酯(Glen Research，Sterling，VA)和提供的插入脱氧嘧啶CPG，用Expedite DNA合成仪(ABI，FosterCity，CA)合成。末端氨基与5’-氨基-修饰物连接，6-(三氟乙酰氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺三酯，C6-TFA(Glen Research，Sterling，VA)。去蛋白后，寡核苷酸用Super Q 5PW(30)树脂(Tosoh Biosciences)离子交换色谱纯化并乙醇沉淀。
合成后，氨基-修饰的适体与不同的PEG配基连接。适体溶解于水/DMSO(1∶1)溶液至浓度在1.5至3mM之间。加入pH8.5碳酸钠缓冲液至终浓度为100mM，寡核苷酸与溶解于相等体积乙腈中的1.7摩尔过剩的期望PEG试剂(例如，ARC1905 40kDaSunbright GL2-400NP p-硝酸碳酸酯[NOF Corp，日本]，或ARC187 40kDa Mpeg2-NHS酯[Nektar，Huntsville AL])反应过夜。结果产物用Super Q 5PW(30)树脂(Tosoh Biosciences)离子交换色谱纯化，并用Amberchrom CG300-S树脂(Rohm和Haas)进行反向色谱脱盐，并冻干。图21显示了ARC187(序列号：5)的结构，图22显示了ARC1905(序列号：67)的结构。
实施例4
分离灌注心脏模型
实施例4A：ARC186原理证明
人血浆中的补体成分C5浓度约为500nM。当将分离的小鼠心脏灌注6％人类血浆的krebs Heinseleit缓冲液后，激活人类补体级联放大，导致C5分裂为C5a和C5b。成分C5b随后与补体成分C6，C7，C8和C9形成复合物“膜攻击复合物”(“MAC”或C5b-9)，其可破坏心脏血管和心肌细胞，从而导致心肌功能失调(增加末端舒张压力，心律不齐)和心搏停止(Evans等，Molecμlar Immunology，32，1183-1195(1995))。先前，在此模型中使用阻止人类C5分裂的单克隆和单链抗体(PexelizμMab或PexelizμMab的单-链ScFv形式)显示可抑制心肌分裂和失调(Evans等，1995)。
此模型用于确立，C5-阻抑适体ARC186(序列号：4)，类似于Pexeluzimab，抑制人类C5-介导的对分离灌注小鼠心脏的补体损害。C57 B1/6小鼠从Charles River实验室购买，(Wilmington，MA)。简要地，深度麻醉后，取出每只小鼠的心脏并用钝针头插入动脉，将心脏连续灌注krebs Heinseleit缓冲液。在左心室插入压力传感器(小鼠型，Bostion，MA)连续测定心律和心室内压力。平衡15-分钟后获得测定的基线，心脏随后灌注缓冲液和包括或不包括不同浓度适体的6％人类血浆(见图23)。从此研究中及Evans等所述，我们发现将血浆加入灌注液5分钟后，灌注krebs Heinseleit缓冲液和6％人类血浆的心脏发生故障，而仅仅连续灌注缓冲液的心脏跳动超过2小时。因此，每个试验的持续时间定为15分钟。图23描述了ARC186在此研究中的要点。
连续监控并纪录心室内压力获得压力波动轨迹(图24和25)。最低点表示舒张末压(“EDP”)而高点表示收缩压(“SP”)。每个轨迹显示了位于左边的标记“0”的垂直黑色线基线压力波动。如前发表所述(Evans等，1995)，灌注6％人血浆的心脏发生快速增加的左心室舒张末压，5分钟内最后导致心搏停止(心脏停止)(图24)。当非相关适体以超过50倍摩尔量加入人类血浆时，获得升高的EDP和心搏停止(图24)。
当ARCD186以相等摩尔量加入至系统中时，EDP仍急剧上升，最后导致心搏停止(图25)。在表现补体-介导损害，升高EDP和心搏停止的三组心脏中，在试验末期心脏表现为水肿和肿胀。当ARC186以超过10-倍或50-倍摩尔量加入血浆时(图25)，心室压力波动保持正常并且不发生心搏停止。此外，在这些组中也未发现前述的水肿和肿胀。
每个试验期间，以5-分钟间隔纪录心律，并对组中的每个间隔平均心律作图。图26显示无适体或非相关适体灌注的心脏立刻发生心搏停止，通常在5分钟之内。相等摩尔量加入系统的ARC186轻微延缓了心搏停止的发生。然而，此组中的心脏最后衰竭。ARC186以超过10-倍或50-倍摩尔量加入血浆时杂每个试验期间保持了心律。
以衰竭心脏代表性样本(无适体或超过50-倍摩尔量的非相关适体)计算超过基线的心脏重量增加百分率，并比较ARC186-保护的心脏(ARC186超过10-倍或50-倍摩尔量)。如图27所示，ARC186保护的心脏比对照组中衰竭心脏具有显著较少的重量。
由于AR186抑制C5而非C3的分裂，在ARC186保护的分离心脏流液中可以发现C3分裂产物(C3a)而非C5分裂产物(C5a或C5b)。为直接显示ARC186对人类血浆C5的抑制，从不同组中的流出液中用商业提供的ELISA试剂盒(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA；C5a和C3a ELISA试剂盒，BDBiosciences，San Diego，CA)测定人类补体蛋白C5a和C5b(C5分解产物)和C3a(C3分裂产物)的相关水平。ARC186以剂量依赖的形式抑制人类血浆C5分裂和C5a(图28)和C5b-9(图29)的产生。相反，ARC186对于人类C3分裂为C3a和C3b无作用(图30)，进一步显示分子的C5特异性。
一旦产生，补体C3b和C5b片段在补体活性位置附近的组织中聚集。试验完成后，小鼠心脏在OCT介质(Sakura Finetek，Torrance，CA)中冷冻，切片并用标准免疫组化染色以研究人类C3b(克隆H11，Chemicon，Temecμla，CA)，人类C5b-9(克隆aE11，DAKO，Carpinteria，CA)或对照小鼠IgG(VetorLaboratories，Burlingame，CA)的存在。图31显示了此研究的结果。
如此研究描述，基于先前发表的研究中(Evans，MolecμlarImmunol 32：1183，(1995)描述的测试抗-C5抗体，Pexeluzimab对于补体系统的效应的模型，使用Krebs Heinseleit缓冲液和6％肝素化人血浆灌注分离小鼠心脏的补体成分C5-介导的组织损害体外模型对C5-抑制适体ARC186进行测试。使用此模型，其显示C5-抑制适体(a)抑制人血浆C5(而非C3)的分裂，(b)抑制人C5b(而非C3b)在小鼠心脏组织中的聚集和(c)在临床相关浓度下(5μM，相对于C5的适体十倍摩尔超过量)抑制人C5b-9介导的心搏停止功能紊乱。这些数据显示当人类补体剂量放大以生理相关形式激活时，C5-抑制适体可以抑制血浆C5的分裂并阻止心搏停止损害和功能紊乱。
实施例4B：PEG化适体的效应
本研究中使用的材料和方法与上述实施例4A中完全相同。图32显示了试验设计和结果。试验第一个半部分使用人肝素化血浆(Center for Blood Research，Harvard Medical School，Boston，MA)作为补体的来源，第二个半部分使用肝素化食蟹猴血浆(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)作为补体来源，PEG化适体(ARC658；序列号：62)以升高摩尔比率加入至系统中。虽然收集了所有相关心室压力轨迹，表中只列出升高舒张末压(EDP)的存在或缺失，有无心搏停止发生及心脏衰竭的时间(定义为存在升高EDP和心搏停止)。
人血浆试验中，ARC658(序列号：62)的最佳剂量测定为相等摩尔量(500nM)，而在非-人类灵长类血浆试验中，需要50-倍摩尔量(25μM)以保护心脏受C5b-介导的损害(见图32)。
这些数据与体外数据显示的抗-C5适体对于人类和非-人类灵长类C5亲合力间的差异相一致。不受理论约束，在我们随后的实施例5描述的食蟹猴PK/PD研究中，我们进一步显示需要超过30-倍摩尔量的适体以抑制酵母聚糖-介导的C5裂解，进一步支持适体结合灵长类C5的亲合力低于人类C5的观点。
综合，这些研究表明C5-抑制适体ARC186(序列号：4)和更大范围的ARC658(序列号：62)在小鼠分离的，灌注心脏模型中是有效的。此模型也显示与人类C5-介导的心脏损害相比(相等摩尔量)，需要明显更多的ARC658(序列号：62)抑制食蟹猴血浆C5-介导的心脏损害(超出30倍摩尔量)，进一步支持适体结合灵长类C5的亲合力更低的观点。最后，这些数据食蟹猴需要超过30-倍摩尔量以在PK/PD研究中获得体内的C5阻止。
实施例5
抗-C5适体在动物中的药物代谢和药代动力学
实施例5A-5G中，所有基于质量的浓度数据都仅仅涉及适体中寡核苷酸部分的分子量，不考虑PEG结合物的质量。
实施例5A：C5抑制物ARC186在灵长类和大鼠血浆中的代 谢稳定性
适体的非-PEG化寡核苷酸前体(例如，ARC 186；实力和：4)在大鼠和食蟹猴血浆(Charles River Labs，Wilmington，MA)中测试以评估其稳定性，动力速率，和降解途径。使用5’末端-放射标记(32P)适体与95％血浆(柠檬酸盐)在37℃孵育50小时。在选择时间点，取出等量的包括适体的血浆，液氮中快速冷冻，储存于-80℃。使用液-液(苯酚-氯仿)抽提，随后凝胶电泳(10％变性聚丙烯酰氨测序凝胶)和高分辨率放射自显影测定和分析血浆中的适体和其代谢产物。
图33显示了大鼠和食蟹猴血浆中作为孵育时间的函数的全-长适体剩余百分数的对数-线性图。两个物种中的降解特性都充分显示为单相的，其固定速率约为k～0.002小时-1。
实施例5B：大鼠静脉内注射ARC657，ARC658和ARC187 的药代动力学
为评估ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的药代动力学特征，并评估灵长类和人类中需要的剂量水平和频率，在插入导管的Sprague-Dawley大鼠(Charles River Labs，Wilmington，MA)中进行药代动力学研究。在无菌条件下将适体在标准盐溶液中制备成10mg/mL(寡核苷酸重量)注射形式并无菌过滤(0.2μM)入预先-灭菌的剂量瓶中。大鼠研究中的给药途径为以10mg/kg的剂量通过尾静脉内注射。研究中每组有3只动物，在给药前和48小时内的特定时间点采血。图34显示了研究的设计。血液样本从手术插入颈静脉导管获得，直接转移至EDTA-包被的管中，倒置混合，置于冰上直至用于血浆试验。
血浆通过将血液-EDTA管以5000rpm离心5分钟收集，转移上清(血浆)至新的预-标记的管中。血浆样本在-80℃储存直至分析。利用直接将血浆加入含有商业提供的荧光核酸检测试剂OligreenTM(Molecμlar Probes，Eugene，OR)的孔中，使用均一分析形式分析ARC187血浆样本。室温简短孵育(5分钟)后，避光，实验板用荧光板读数仪读数(Spectramax Gmini XS，Molecμlar devices，sunnyvale，CA)。每孔中的荧光信号与孔中的适体浓度成正比，通过将荧光值代入荧光-浓度标准曲线(双重或三重平均值曲线)计算样本浓度。从每组的三只动物获得每个时间点的平均血浆浓度。使用工业标准药带动力学模型软件WinNonLinTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)对血浆浓度相对于时间数据进行非房室模型分析(NCA)。评估从以下基本药带动力学常数获得：最大血浆浓度，Cmax；浓度-时间曲线下的面积，AUC；半衰期，t1/2；最终清除，C1；和稳定阶段的分布体积，Vss。
图35显示了平均血浆浓度相对于时间的数据并在图36中作图。使用WinNonLinTMv.4.0对浓度相对于时间的数据进行非房室模型分析(NCA)。图37显示了此分析产生的值。
如预期的，40kDa适体ARC187(序列号：5)具有更长的半衰期而20kDa适体，ARC657(序列号：61)较短。已知血浆体积(～40mL/kg)相关的Vss显示在血管外空间，ARC187(序列号：5)具有中等程度的与蛋白和/或组织的结合/螯合。假设需要维持超过5-倍摩尔量的适体，本研究的结果显示ARC187(序列号：5)在剂量频率和维持期望血浆水平所需适体的总量上具有更明显的优势。
先前以更小的组合物在啮齿类和灵长类进行的研究(数据未显示)已经显示了在剂量高至30mg/kg时仍具有剂量比例性/线性，所以在此剂量水平下导致非线性药带动力学特征是非预期的。
实施例5C：小鼠静脉注射ARC187和ARC1905后的药带动 力学
为评估连接不同40kDa分支PEG的ARC186(序列号：4)寡核苷酸骨架超越ARC187(序列号：5)的药带动力学特征，在雌性CD-1小鼠(CharlesRiver Labs获得，Wilmington，MA)上进行药带动力学研究。在无菌条件下将适体在标准盐溶液中制备成2.5mg/mL(寡核苷酸重量)注射形式并无菌过滤(0.2μM)入预先-灭菌的剂量瓶中。小鼠研究中的给药途径为以10mg/kg的剂量通过尾静脉内注射。研究中每组有3只动物，在给药前(例如，非-剂量对照组)和72小时内的特定时间点末端采血。图38A显示了研究的设计。
血液样本从手术插入颈静脉导管获得，直接转移至EDTA-包被的管中，倒置混合，置于冰上直至用于血浆试验。血浆通过将血液-EDTA管以5000rpm离心5分钟收集，转移上清(血浆)至新的预-标记的管中。血浆样本在-80℃储存直至分析。利用直接将血浆加入含有商业提供的荧光核酸检测试剂OligreenTM(Molecμlar Probes，Eugene，OR)的孔中，使用均一分析形式分析ARC187和1905血浆样本。室温简短孵育(5分钟)后，避光，实验板用荧光板读数仪读数(Spectramax Gmini XS，Molecμlardevices，sunnyvale，CA)。每孔中的荧光信号与孔中的适体浓度成正比，通过将荧光值代入荧光-浓度标准曲线(双重或三重平均值曲线)计算样本浓度。从每组的三只动物获得每个时间点的平均血浆浓度。使用工业标准药带动力学模型软件WinNonLinTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)对血浆浓度相对于时间数据进行非房室模型分析(NCA)。评估从以下基本药带动力学常数获得：最大血浆浓度，Cmax；浓度-时间曲线下的面积，AUC；半衰期，t1/2；最终清除，C1；和稳定阶段的分布体积，Vss。图38B显示了平均血浆浓度相对于时间的数据图。使用WinNonLinTMv.4.0对浓度相对于时间的数据进行非房室模型分析(NCA)。图38C显示了此分析产生的值。正如期望的，两个供应商的40kDa PEGs都显示了在小鼠中相等的药带动力学。
上述用于oligreen分析的ARC187和1905的相同血浆样本将用高效液相(HPLC)分析和UV测定。
用Microsoft Excel 2003计算ARC187和ARC1905的平均血浆浓度值。当血浆浓度低于给药前(时间0)生物分析的LLOQ时，赋予零值。给药后低于LLOQ的样本值在平均血浆浓度计算中省略。使用WinNonlin，版本5.1(Pharsight Corporation，Mountainview，CA)对平均血浆浓度数据进行模型-依赖的PK分析。使用线性梯形法评估血浆浓度-时间曲线(AUC0-last)下的面积。为方便计算，任何低于LLOQ的试验值，除了给药前样本，都从PK参数评估计算中去除。使用形式t1/2＝0.693/λz计算表观末端半衰期，其中λz是从浓度相对于时间曲线的末端倾斜的衰减中评估的消除速率常数。末端相峰浓度之后的至少三个血浆浓度值被用于测定λz，并且决定系数(r2)要求≥0.85。
综合，HPLC分析验证了上述的oligreen分析，显示基于比较平均Cmax，AUC0-last和AUC0-∞参数评估值，ARC1905和ARC187是生物等效的。ARC1905和ARC187间AUC0-last和AUC0 -∞值的差异(HPLC测定)在±20％的生物相等可接受标准内。
实施例5D：C5抑制物ARC657，ARC658和ARC187小鼠 静脉内给药后的组织摄取研究。
从Charles River Labs(Wilmington，MA)获得CD-1雌性小鼠。制备注射用ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的5mg/mL盐溶液。在无菌条件下将剂量形式无菌-过滤(0.2μM)入预-灭菌的剂量瓶，动物通过尾静脉以25mg/kg给药。研究包括3只动物组成的组及四个时间点，t＝给药前，3，6，12小时。放血后，每个动物的血管用盐溶液大量灌注(V～30mL)以去除血管中的任何血液。收集组织(心脏，肺，肾)，称重，在标准盐溶液中以50％重量/体积匀浆，并储存于-80℃直至测试。
使用杂交-基础的ELISA-型试验分析ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)组织。此试验中，生物素标记的探针在结合溶液中以125nM浓度在96-孔微孔板的孔中预-固定3小时。用1×PBS冲洗板孔5次。用TBS中的1×SuperBlock(Pierce Chemical，Rockford，IL)以150μl/孔封闭板。再次冲洗板，加盖并储存于4℃直至使用。在分离的管中，样本在含有200nM FAM-标记的(5’-荧光素)样本-检测探针缓冲液中于90℃退火10分钟，并置于冰上骤冷。血浆/组织的浓度标准品和对照样本也用样本-检测探针溶液预-退火，随后加入至含有固定生物素捕获探针的分析板孔中，并在45℃退火2.5小时。板再次冲洗，并加入100μl/孔溶于1×PBS的1ug/mL抗-荧光素单克隆抗体结合辣根过氧化酶(抗-FITC Mab-HRP，分子探针，Eugene，OR)，孵育大约1小时。板如上所述再次冲洗。分析板孔加入100μl含有荧光HRP底物的溶液(QuantaBlu，Pierce Chemical，rockford，IL)，并避光孵育20-30分钟。孵育45分钟后，加入100μl/孔终止液以终止荧光沉淀-产生反应。板子立刻在荧光微孔板测定仪(SpectraMax Gemini XS，Molecμlar Devices，Sunnyvale，CA)上，以荧光激发光325nm和发射光420nm读数。每孔读数10次。心脏组织中所有三个适体在三个时间点都可测定(图39)。
实施例5E：C5抑制物ARC657，ARC658和ARC187在食蟹 猴静脉内给药研究1中的药代动力学和药效学
制备注射用ARC657(序列号：61)，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的10mg/mL盐溶液。在无菌条件下无菌过滤(0.2μM)入预先-灭菌的剂量瓶中。短尾猴研究中的给药途径为以30mg/kg的剂量(约超过50-倍摩尔量)通过股静脉手术插入导管静脉内给药。图40显示了研究设计。血液样本从股静脉导管获得，直接转移至柠檬酸钠-包被的管中，倒置混合，置于冰上直至离心分离血浆(3000rpm离心5分钟)。血浆分装成250μl小份并储存于-80℃，每个样本取一份用在上述的大鼠PK部分描述的荧光-基础的OligreenTM方法评估适体浓度。
灵长类血浆浓度对于时间的数据以表格形式描述于图41。如期望的，40kDa PEG适体ARC187(序列号：5)在血浆中持续最长的时间，而20kDa PEG适体ARC657(序列号：61)持续最短的时间。图41显示的数据表明双-分隔模型的数据将最是适合的。这样，图42报告的药代动力学参数评估值来源于双-分隔模型，并使用工业标准药带动力学模型软件WinNonLinTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)。
如图42所示，所有适体具有相似的Cmax值，在23至30μM之间，表明适体剂量(30mg/kg)可以有效地获得超过C5浓度的50-倍摩尔量的血浆适体(50倍超过量，约25μM)。虽然他们差别10000分子量，ARC657(20kDa PEG)(序列号：61)和ARC658(30kDa PEG)(序列号：62)具有相似的暴露(AUC)，t1/2(α)和t1/2(β)值。相反，ARC187(序列号：5)比其它分子具有明显更高的暴露(AUC)值，更长的t1/2(α)和较长的t1/2(β)值。
在药代动力学研究中收集的额外血浆样本随后用于体外分析以测定对于灵长类C5抑制的效果。如前述进行酵母聚糖活性分析测定灵长类C5b-9和C5a的产生量。数据以几种不同形式作图，包括C5b-9浓度相对于样本时间(图43a)，C5b-9浓度相对于适体浓度(图43b)，C5a浓度相对于样本时间(图43c)，C5a浓度相对于适体浓度(图43d)。
40kDa PEG适体ARC 187(序列号：5)长时间抑制灵长类C5分裂(C5b-9和C5a浓度)(图43a和43c)。当C5b-9和C5a数据对于适体浓度作图时，显示C5抑制适体的浓度必需超过30-倍摩尔量，不考虑PEG分子的大小，以完全抑制C5的分裂(图43b和43d)。
简要地，来源于食蟹猴PK/PD研究的数据显示，(a)如预料的，在食蟹猴体内需要超过30-倍摩尔量的适体(约15μM血浆适体浓度)以抑制C5分裂，而不考虑PEG基团的大小，(b)C5-抑制适体不引起该物种中的明显毒性，及(c)当动物以高水平给药时(超过50-倍摩尔量)，血浆适体水平在取样期间位于适当的分析范围内使得可以计算药代动力学参数。
实施例5F：C5抑制物ARC658和ARC187在食蟹猴静脉内 给药研究2中的药代动力学和药效学
研究2的设计与上述的研究1相似，除了以下例外a)只有两个组合物被评估(ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)；b)每组中动物的数量增加至4只；并且c)取消1-分钟血浆样本并以144小时样本取代以确保末端半衰期的计算以更多数据点为基础。这两种适体的形式和剂量，血液取样和血浆分离技术与研究1中描述的一致。图44概述了研究2的设计。
随研究2的完成，血浆分装样本按研究1所述分析以测定a)静脉给药后不同时间点的血浆适体浓度，和b)C5抑制的效果。
血浆适体浓度作为时间函数作图(图45)并且在图39和40中以表格形式分别描述了ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的原始数据。40kDa PEG适体ARC187(序列号：5)在血浆中维持最长时间。图45显示的数据表明双-分隔模型的数据将最是适合的。图46报告的药代动力学参数评估值来源于使用WinNonLinTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)的双-分隔模型。
比较在PK/PD研究1和研究2中产生的药代动力学参数，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的数据除了ARC187的t1/2(α)测定值之外都相似。不期望收理论约束，ARC187的t1/2(α)测定值在两种研究中的差异可能由于初步研究中较小的样本尺寸。
如图46所示，ARC658(序列号：62)和ARC187(序列号：5)的Cmax值相似。相反，药物暴露(AUC)在用ARC187(序列号：5)处理的动物中明显更大。并且，ARC187与ARC658(序列号：62)相比具有更长的t1/2(α)和t1/2(β)值。这些数据，与PK/PD研究1中产生的数据一起，表明了给定剂量的C5-抑制适体ARC187可以提供最有效的体内C5抑制作用。
在药代动力学研究中收集的额外血浆样本随后用于体外分析以测定对于灵长类C5抑制的效果。如前述进行酵母聚糖活性分析测定灵长类C5b-9和C5a的产生量。以C5b-9浓度相对于适体浓度(图43b)和C5a浓度相对于适体浓度(图48)的数据作图。
如前PK/PD研究中所显示，C5抑制适体的浓度必需超过30-倍摩尔量，或大约15μM，而不考虑PEG分子的大小，以完全抑制C5的分裂(图41和42)。
通过观察图39和40表中的数据，显示以30-mg/kg静脉内给药后，ARC658(序列号：62)在4小时内保持大于15μM，而ARC187在8小时内保持15μM。这样，给予相同的给药剂量，40k适体ARC187比30K适体ARC658(序列号：62)提供了两倍持久性的临床效果。
综合，食蟹猴必需用至少超过血浆C530-倍摩尔量的适体以抑制体内的C5转化。这些数据经先前的体外(溶血)和间接体内(分离灌注小鼠心脏)研究证实，显示相比于人类C5，C5-结合适体对于灵长类C5具有更低的亲合力。已经显示C5-抑制适体可以以超过30mg/kg的剂量安全地通过静脉内给药，其相等于大约超过C5浓度的50-倍摩尔量的适体。
实施例5G：静脉内推注给药后食蟹猴中的ARC1905
C5抑制物ARC1905的药效学通过食蟹猴静脉内给药评估。在无菌条件下将ARC1905在标准盐溶液中制备成7.5mg/mL(寡核苷酸重量)注射形式并无菌过滤(0.2μM)入预先-灭菌的剂量瓶中。通过尾静脉内注射对食蟹猴(n＝4)以0(盐溶液对照)或30mg/kg给药。血液样本从外周静脉或动脉接入口获得，血液样本(0.5mL)直接转移至EDTA二钾(K2)管中，置于湿冰上，4℃离心30分钟收集。
血浆样本经体外试验测定ARC1905抑制灵长类C5的效果。实施例1C中描述的ARC1905相关的酵母聚糖试验被用于测定灵长类C5a的产生量。给药0.5和2小时后，后-酵母聚糖C5a值的减少表明ARC1905在食蟹猴体内抑制C5分裂，其方式与应用酵母聚糖活性试验在体外以相同给药浓度和相同途径测定的ARC187相似。
实施例5H：食蟹猴静脉内推注给药和灌输C5抑制物ARC187 后的药代动力学和药效学
通过静脉内推注后立即进行静脉内灌输，ARC187(序列号：5)的药代动力学(Pk)和药效学(PD)特征在食蟹猴中评估。图49显示了此研究的设计。
使用来源于图50所列静脉内推注研究的药代动力学参数，计算达到1μM目标稳定阶段须将浓度所需要的推注剂量和灌输频率。
共三只食蟹猴以1mg/mL静脉内推注ARC187，随后立即以0.0013mg/kg/分钟静脉内灌输48小时。治疗后从0-192小时采集全血，储存于湿冰上，分离血浆，冻存于-80℃。使用荧光核酸染色试验(实施例5B中描述)和GLP-认证的液相色谱(HPLC)试验测定血浆样本中的ARC187浓度。对测定猴血浆中ARC187的HPLC试验方法用Clintrials Bio-Research(Montreal，Canada)验证。验证试验遵照美国食品药品监督管理局(FDA)实验室研究质量规范(GLP)法规(21CFR§58)执行。HPLC试验方法根据以下因素验证：选择性，线性，定量低值(LLOQ)，遗留量，批内精密度和准确度，批间精密度和准确度，存储溶液的稳定性，注射介质稳定性，短期基质稳定性，冻-融稳定性，长期基质稳定性和稀释完整性。试验的可用线性动力浓度范围经测定为0.080至50.0μM。
在这些条件下测定的ARC187的PK特征与仅使用静脉内推注PK参数(见图51)得出的计算特征一致。给药后小于5分钟内获得1μM的目标血浆浓度，并保持于灌输的全过程。停止灌输后，适体显示了末期清除半衰期，t1/2(β)～40-60小时。
对前述的间接体内酵母聚糖活性试验进行修饰，食蟹猴样本血浆十倍稀释入10％人血浆并用5mg/mL酵母聚糖处理，通过使用PK研究中收集的血浆样本评估ARC187(序列号：5)在食蟹猴中的药效学。C5活性，以C5a分裂产物的存在为反映，通过人类C5a特异的ELISA测定(C5a ELISA试剂盒，BDBiosciences，San Diego，CA)。使，每个样本中的活性ARC187浓度通过与用已知ARC187水平制备的样本得出的标准曲线(见图52)比较而定量。此研究显示ARC187在灌输期间以和上述的药效学特征充分一致的水平保持其抗-补体活性。
实施例5I：预测人类剂量需求
预防，改善，或治疗CABG相关的并发症所需的人类剂量以下列假设为基础：第一，CABG病人在最初手术前施用单剂量静脉内推注的抗-C5适体，并随后连续灌输以建立和维持CABG手术后24-48小时内稳定-阶段的1.5μM血浆浓度。使用前述食蟹猴中仅仅-静脉内推注和推注加上灌输的研究中获得的药代动力学参数经计算作为推注剂量和灌输速率的评估基础。ARC187评估的推注剂量为1mg/kg，相关的灌注速率为0.0013mg/kg/分钟。在推注加上48小时灌输模式总，ARC187的预期药物全部需要量为0.4g，其中质量仅指寡核苷酸重量(见图53表中的柱7)。图53显示的表中柱2指连接ARC187寡核苷酸部分的PEG基团重量，柱3指ARC187寡核苷酸部分的分子重量(并对于所有这里的适体都相同，包括ARC186(序列号：4)的寡核苷酸序列)，柱4指通过上述实施例3C描述的氨基反应化学连接ARC186(序列号：4)的40kDa PEG的分子重量，柱5指在双分隔模型中ARC187的α相半衰期，柱6指双分隔模型中ARC187的β相半衰期。
实施例6
抗-C5适体和肝素/鱼精蛋白的相互作用
抗-C5适体的一种期望应用是预防或消除冠状动脉旁路术(CABG)相关的验证副反应。高浓度的抗凝血剂肝素(3-5单位/mL或1-2μM)在CABG期间典型地施用以防止血栓形成并维持旁路泵组件的畅通；施用相同高浓度的鱼精蛋白(～5μM)，在此过程后逆转肝素的效应，并恢复正常止血功能。这些药物效应的任何影响都给病人带药潜在的危险，有必要表明抗C5适体(1)不改变药物的活性和(2)不显示使病人抗凝血治疗复杂化的凝血效应。
肝素是带有阴离子的硫酸化多糖，其平均分子量约为15kDa，其通过促进与抗凝血酶的相互作用在凝血级联中表现了对多种蛋白酶的抑制效果。鱼精蛋白，一种高度正电的多糖，可以通过至少部分地由于静电性质的未清楚定义的交互作用而抑制肝素活性。ARC187(序列号：5)的功能中心，类似于肝素，是高度带负电的。这样，ARC187可能非特异结合肝素-结合位点或鱼精蛋白并干涉这些分子的活性。下列研究显示ARC187固有的(例如，类似-肝素)抗凝血特性，ARC187对于肝素功能的效果，ARC187通过鱼精蛋白对于肝素-中和的效果，和鱼精蛋白对于ARC187补体抑制特性的效果。
实施例6A：ARC187的体外凝结作用
使用外源性和内源性凝血级联标准临床试验，凝血酶原时间(PT)和活性部分凝血活酶时间(aPTT)研究ARC187(序列号：5)对于血浆凝结的作用。如图54所示，在超出设计剂量(高至20μM)的浓度孔中以柠檬酸化人类血浆滴定，结果未改变PT，经仅有轻微的aPTT升高。
为评估ARC187对于肝素和鱼精蛋白功能的体外效应，来自3位志愿者的血液中加入与CABG手术中使用的肝素水平相关剂量的4-5单位/mL肝素。使用在手术中监控肝素活性的全血凝集试验途径，活性凝集时间(ACT)来评估这些样本的血凝。在这些肝素浓度下，无其它附加物存在时，在4U/mL肝素存在时ACT由基线值明显延长～150秒至～500秒，或在5U/mL肝素存在时为～800秒。额外加入10μM ARC187至这些样本中对于凝血时间只有较小作用，显示ARC187不干涉肝素的抗血凝活性。
用高至6-8μM(4U/mL肝素)或12μM(5U/mL肝素)的鱼精蛋白滴定可以容易地中和肝素抗血凝效果。存在有肝素和中和浓度的鱼精蛋白时的ACT值明显区别于基线。既然ARC187(12kDa)的核酸中心比鱼精蛋白的分子量(5kDa)要大，可以预计等摩尔浓度的ARC187加入至鱼精蛋白将充分完全逆转鱼精蛋白的中和活性。然而，将鱼精蛋白和大约相等摩尔浓度的ARC187预孵育仅对ACT产生较小效应。含有中和浓度的鱼精蛋白的血液样本在存在或缺失10μM ARC187时显示了相似的ACT值，表明ARC187对于鱼精蛋白的促凝血活性仅具有轻微作用。图55概述了这些结果。
实施例6B：ARC187对于血凝的体内作用
在施用抗-C5适体ARC187(序列号：5)时，研究临床剂量肝素和临床/亚临床/超临床鱼精蛋白功能间的干涉，以测定临床/亚临床血浆浓度的ARC187是否干涉鱼精蛋白逆转的肝素抗血凝活性。图56概述了此研究结果。简要地，在所有测试的肝素剂量下ACT基线值都不受10μM(超过临床剂量10-倍摩尔量)ARC187影响。相似地，肝素的抗血凝程度不受10μM ARC187影响。缺失ARC187时，鱼精蛋白的最小有效剂量为～30％(临床剂量＝100％)。此外，30％鱼精蛋白逆转的肝素的抗血凝作用不受超过临床剂量(例如，10μM)10-倍摩尔量的ARC187影响。这样，在临床设定中(例如，CABG)使用ARC187对补体的抑制不受同时使用的典型剂量的肝素和鱼精蛋白影响。
实施例6C：肝素和鱼精蛋白对ARC187抗-补体功能的效 应
如实施例1所述，在酵母聚糖集活动柠檬酸化全血样本中测定肝素和鱼精蛋白对于ARC187(序列号：5)抗-补体活性的作用。酵母聚糖激活前，ARC187滴定入四中条件处理的柠檬酸血液样本：1)无处理(无肝素或鱼精蛋白)；2)4U/mL肝素；3)6μM鱼精蛋白；4)U/mL肝素+6μM鱼精蛋白。酵母聚糖激活后，通过ELISA(C5b-9ELISA试剂盒，Quidel，San Diego，CA)测定血浆中的sC5b-9定量C5活性。对于每个条件，以C5活性抑制百分数相对于ARC187浓度表示的结果，在误差内不能加以区别(见图57)。在所有情况中1-2μM ARC187可获得完全抑制。这样，肝素和鱼精蛋白，以其在CABG手术中使用相关的联合或单独浓度，不显示影响ARC187的抗-补体活性。
本发明已经通过文字描述和实施例进了了叙述，本领域的普通技术人员可以意识到本发明可以在不同实施方案中实施，并且上述的叙述和实施例是出于例证目的并不限制以下权利要求。
Figure IDA00003395548700011
Figure IDA00003395548700021
Figure IDA00003395548700031
Figure IDA00003395548700051
Figure IDA00003395548700071
Figure IDA00003395548700081
Figure IDA00003395548700091
Figure IDA00003395548700101
Figure IDA00003395548700111
Figure IDA00003395548700121
Figure IDA00003395548700131
Figure IDA00003395548700141
Figure IDA00003395548700151
Figure IDA00003395548700161
Figure IDA00003395548700171
Figure IDA00003395548700201
Figure IDA00003395548700211
Figure IDA00003395548700221
Figure IDA00003395548700241
Figure IDA00003395548700261
Figure IDA00003395548700271
Figure IDA00003395548700281
Figure IDA00003395548700291
Figure IDA00003395548700301
Figure IDA00003395548700311
Figure IDA00003395548700321
Figure IDA00003395548700341
Figure IDA00003395548700361
Figure IDA00003395548700371
Figure IDA00003395548700391
Figure IDA00003395548700401
Figure IDA00003395548700441
Figure IDA00003395548700451
Figure IDA00003395548700461
Figure IDA00003395548700471
Figure IDA00003395548700481
Figure IDA00003395548700491
Figure IDA00003395548700501
Figure IDA00003395548700521
Figure IDA00003395548700531
Figure IDA00003395548700541
Figure IDA00003395548700551
Figure IDA00003395548700561

Claims (12)

1.一种适体或其盐，其中，所述适体包括序列号：75、76、91、95或者96的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的适体或其盐，其中，所述适体在糖位点、磷酸位点或者碱基位点包括一种化学取代物。
3.根据权利要求1所述的适体或其盐，其中，所述适体包括修饰的核苷。
4.根据权利要求1所述的适体或其盐，其中所述适体进一步包括3’封端。
5.根据权利要求1所述的适体或其盐，其中，所述适体与一种高分子量部分共轭。
6.根据权利要求1所述的适体或其盐，其中，所述高分子量部分是聚乙二醇基团。
7.根据权利要求6所述的适体或其盐，其中聚乙二醇基团的大小是至少10、20、30、40、50、60或80KD。
8.根据权利要求6所述的适体或其盐，其中，所述聚乙二醇基团是线性的。
9.根据权利要求6所述的适体或其盐，其中，所述聚乙二醇基团是带有支链的。
10.一种组合物，包括权利要求1-9中任意一项所述的适体或其盐，以及一种药学上可接受的载体或者稀释剂。
11.权利要求1-9中任意一项所述的适体或其盐在制备用于治疗C5补体蛋白，C5a和/或C5b-9-介导的失调的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其中治疗的疾病是与CABG外科手术相关的心肌损伤，与球囊血管成形术相关的心肌损伤、与再狭窄相关的心肌损伤、与CABG外科手术相关的补体蛋白介导的并发症、与经皮冠状动脉介入治疗术相关的补体蛋白介导的并发症、阵发性血红蛋白尿、急性移植排斥，超急性移植排斥，亚急性移植排斥或慢性移植排斥。
CN2013102532569A 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体-相关失调的适体治疗 Pending CN103352037A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/058,134 US7803931B2 (en) 2004-02-12 2005-02-14 Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
US11/058,134 2005-02-14

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800119349A Division CN101155822B (zh) 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体-相关失调的适体治疗

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103352037A true CN103352037A (zh) 2013-10-16

Family

ID=36916987

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800119349A Active CN101155822B (zh) 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体-相关失调的适体治疗
CN201810051401.8A Active CN108148840B (zh) 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体-相关失调的适体治疗
CN2013102532569A Pending CN103352037A (zh) 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体-相关失调的适体治疗
CN201410685384.5A Active CN104404046B (zh) 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体‑相关失调的适体治疗

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800119349A Active CN101155822B (zh) 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体-相关失调的适体治疗
CN201810051401.8A Active CN108148840B (zh) 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体-相关失调的适体治疗

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410685384.5A Active CN104404046B (zh) 2005-02-14 2006-02-14 用于治疗补体‑相关失调的适体治疗

Country Status (21)

Country Link
US (8) US7803931B2 (zh)
EP (2) EP2623602A3 (zh)
JP (1) JP5253818B2 (zh)
KR (4) KR20150095956A (zh)
CN (4) CN101155822B (zh)
AU (1) AU2006214437C1 (zh)
BR (1) BRPI0607002B1 (zh)
CA (4) CA2992874C (zh)
CY (1) CY1115059T1 (zh)
DK (1) DK1850880T3 (zh)
ES (1) ES2449047T3 (zh)
HK (3) HK1110329A1 (zh)
IL (2) IL185312A (zh)
MX (1) MX2007009807A (zh)
NZ (1) NZ560804A (zh)
PL (1) PL1850880T3 (zh)
PT (1) PT1850880E (zh)
RU (1) RU2406507C2 (zh)
SI (1) SI1850880T1 (zh)
WO (1) WO2006088888A2 (zh)
ZA (1) ZA200707191B (zh)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6395888B1 (en) * 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
CN102813923B (zh) * 2003-08-27 2015-04-01 奥普索特克公司 用于治疗眼新血管疾病的组合治疗
EP3385384B1 (en) * 2004-02-12 2020-04-08 Archemix LLC Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
AU2013204622B2 (en) * 2006-03-08 2016-04-21 Archemix Llc Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders
AU2016204713B2 (en) * 2006-03-08 2017-08-10 Iveric Bio., Inc. Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders
EP1991275B1 (en) * 2006-03-08 2014-11-05 Archemix LLC Complement binding aptamers and anti-c5 agents useful in the treatment of ocular disorders
JP2009544627A (ja) * 2006-07-21 2009-12-17 プロミックス・ピーティーワイ・リミテッド 内膜過形成および関連する状態に対する治療
MX2009002856A (es) * 2006-09-15 2009-03-30 Enzon Pharmaceuticals Inc Conjugados polimericos que contienen porciones cargadas positivamente.
RU2010116245A (ru) * 2007-09-24 2011-11-10 Ноксон Фарма Аг (De) НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ C5a
WO2010039690A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of inhibiting biomaterial-induced procoagulant activity using complement inhibitors
US20120065254A1 (en) * 2009-03-23 2012-03-15 Noxxon Pharma Ag C5A binding nucleic acids and the use thereof
CA2860806C (en) 2012-01-10 2020-10-20 Noxxon Pharma Ag New c5a binding nucleic acids
SI2817329T1 (sl) 2012-02-20 2019-04-30 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polipeptidi, ki se vežejo na človeški komplement c5
IN2014KN02324A (zh) * 2012-04-06 2015-05-01 Omeros Corp
CN110818798A (zh) 2012-10-25 2020-02-21 美国比奥维拉迪维股份有限公司 抗补体C1s抗体和其用途
LT2914291T (lt) 2012-11-02 2022-06-10 Bioverativ Usa Inc. Antikūnai prieš komplemento c1s ir jų panaudojimo būdai
RU2523450C1 (ru) * 2013-05-06 2014-07-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ КПССЗ" СО РАМН) Способ профликатики ранней послеоперационной когнитивной дисфункции у пациентов после коронарного шунтирования в условиях искуственного кровообращения
KR20220061248A (ko) 2013-07-12 2022-05-12 이베릭 바이오, 인크. 안과적 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법
DE102013112915A1 (de) 2013-11-22 2015-05-28 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) DNA-Aptamere, die E- und P-Selektine spezifisch binden
BR112016029076B1 (pt) * 2014-06-12 2024-02-15 Ra Pharmaceuticals, Inc Polipeptídeo e composição compreendendo o mesmo para inibir a clivagem de c5 em um sistema celular
GB201411150D0 (en) * 2014-06-23 2014-08-06 Altermune Technologies Llc Novel aptamers and therapeutic uses thereof
SI3250230T1 (sl) 2015-01-28 2022-01-31 Ra Pharmaceuticals, Inc. Modulatorji aktivnosti komplementa
BR112017021289A2 (pt) 2015-04-06 2018-06-26 Bioverativ Usa Inc anticorpos anti-c1s humanizados e métodos de uso dos mesmos
AU2016370210A1 (en) 2015-12-16 2018-06-21 Ra Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement activity
DE102016100039A1 (de) 2016-01-04 2017-07-06 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) α6-Integrin bindendes DNA-Aptamer
CN108934169A (zh) 2016-01-20 2018-12-04 维特里萨医疗公司 用于抑制因子d的组合物和方法
CN110087668A (zh) 2016-12-07 2019-08-02 Ra制药公司 补体活性的调节剂
WO2018136827A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Vitrisa Therapeutics, Inc. Stem-loop compositions and methods for inhibiting factor d
WO2019022986A1 (en) * 2017-07-24 2019-01-31 Vitrisa Therapeutics, Inc. NUCLEIC ACID COMPOSITIONS AND METHODS OF INHIBITING D-FACTOR

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US5212071A (en) 1988-04-01 1993-05-18 The Johns Hopkins University Nucleic acids encoding a human C3b/C4b receptor (CR1)
US5981481A (en) 1974-12-06 1999-11-09 The Johns Hopkins University Human C3b/C4b receptor (CR1)
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4959309A (en) 1983-07-14 1990-09-25 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
AU4434585A (en) 1985-03-30 1986-10-23 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
US4935363A (en) 1987-03-30 1990-06-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Sterol regulatory elements
WO1989006694A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Trustees Of The University Of Pennsylvania Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
US5244805A (en) 1989-05-17 1993-09-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Baculovirus expression vectors
US5070010A (en) 1989-10-30 1991-12-03 Hoffman-La Roche Inc. Method for determining anti-viral transactivating activity
CA2078659A1 (en) 1990-03-21 1991-09-22 David J. Ecker Reagents and methods for modulating gene expression through rna mimicry
US5789157A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US6147204A (en) 1990-06-11 2000-11-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6140490A (en) * 1996-02-01 2000-10-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US5763177A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5476766A (en) 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5707796A (en) 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5503978A (en) 1990-06-11 1996-04-02 University Research Corporation Method for identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase
US5726017A (en) 1990-06-11 1998-03-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV-1 gag nucleic acid ligands
US5459015A (en) 1990-06-11 1995-10-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity RNA ligands of basic fibroblast growth factor
US5527894A (en) 1990-06-11 1996-06-18 Nexstar Pharmacueticals, Inc. Ligands of HIV-1 tat protein
US5674685A (en) 1990-06-11 1997-10-07 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity PDGF nucleic acid ligands
US5668264A (en) 1990-06-11 1997-09-16 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity PDGF nucleic acid ligands
US5861254A (en) 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5654151A (en) 1990-06-11 1997-08-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV Nucleocapsid nucleic acid ligands
US5543293A (en) 1990-06-11 1996-08-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. DNA ligands of thrombin
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US6395888B1 (en) 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US5635615A (en) 1990-06-11 1997-06-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV nucleocapsid nucleic acid ligands
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5763173A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5648214A (en) 1990-06-11 1997-07-15 University Research Corporation High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5472841A (en) 1990-06-11 1995-12-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying nucleic acid ligands of human neutrophil elastase
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5475096A (en) 1990-06-11 1995-12-12 University Research Corporation Nucleic acid ligands
EP0549692A4 (en) 1990-09-21 1993-08-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Protein sequence-specific oligonucleotide sequences
CA2093664C (en) 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
CA2104698A1 (en) 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
WO1992014842A1 (en) 1991-02-21 1992-09-03 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for thrombin and methods of use
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5252216A (en) 1992-03-24 1993-10-12 Smithkline Beecham Corporation Protein purification
WO2002081494A1 (en) 2001-03-26 2002-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
US5456909A (en) 1992-08-07 1995-10-10 T Cell Sciences, Inc. Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo
US5338671A (en) 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody
AU5442194A (en) 1992-10-14 1994-05-09 University Research Corporation Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5262564A (en) 1992-10-30 1993-11-16 Octamer, Inc. Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents
DE69431290D1 (de) 1993-02-12 2002-10-10 Avant Immunotherapeutics Inc PULMONÄRE VERABREICHUNG DES LÖSLICHEN KOMPLEMENT-RECEPTORS TYP 1 sCR1
US5428149A (en) 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
RU2073518C1 (ru) 1993-06-17 1997-02-20 Совместное русско-американское акционерное общество закрытого типа "Неофарм" Средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза
CN1130353A (zh) 1993-07-09 1996-09-04 史密丝克莱恩比彻姆公司 蛋白质的纯化
US5817635A (en) 1993-08-09 1998-10-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Modified ribozymes
EP0724647A4 (en) 1993-09-08 2003-09-17 Gilead Sciences Inc NUCLEIC ACIDS AS LIGANDS AND IMPROVED PRODUCTION METHODS
EP1889910A3 (en) 1993-09-17 2009-09-02 SomaLogic, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
CA2192950A1 (en) 1994-06-22 1995-12-28 Danny P.C. Mcgee Novel method of preparation of known and novel 2'-modified nucleosides by intramolecular nucleophilic displacement
US5681702A (en) 1994-08-30 1997-10-28 Chiron Corporation Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5723750A (en) 1995-01-12 1998-03-03 Vanderbilt University Transgenic plants expressing disassembly deficient viral coat proteins
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
EP0828849B1 (en) 1995-06-02 2006-10-25 Gilead Sciences, Inc. High-affinity oligonucleotide ligands to pdgf
EP2080813B1 (en) 1995-06-07 2011-01-05 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands that bind to and inhibit DNA polymerases
US6229002B1 (en) 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
US6111095A (en) 1995-06-07 2000-08-29 Merck & Co., Inc. Capped synthetic RNA, analogs, and aptamers
ATE468396T1 (de) 1996-02-01 2010-06-15 Gilead Sciences Inc Nukleinsäureliganden mit hoher affinität für das c1q protein des komplementsystems
US5668564A (en) * 1996-02-20 1997-09-16 R.A. Miller Industries, Inc. Combined AM/FM/cellular telephone antenna system
AU2994997A (en) 1996-05-07 1997-11-26 T Cell Sciences, Inc. Aptamers for complement protein c3b
US6051698A (en) 1997-06-06 2000-04-18 Janjic; Nebojsa Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
RU2177950C2 (ru) 1996-10-25 2002-01-10 Нексстар Фармасьютикалз, Инк. Комплексы нуклеиновых кислот - лигандов сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf)
US6278039B1 (en) 1997-05-28 2001-08-21 Axys Pharmaceuticals, Inc. C. elegans deletion mutants
US7419663B2 (en) 1998-03-20 2008-09-02 Genentech, Inc. Treatment of complement-associated disorders
US6251588B1 (en) 1998-02-10 2001-06-26 Agilent Technologies, Inc. Method for evaluating oligonucleotide probe sequences
IL143596A0 (en) 1998-12-22 2002-04-21 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists and uses thereof
US6329145B1 (en) 1999-02-09 2001-12-11 Gilead Science, Inc. Determining non-nucleic acid molecule binding to target by competition with nucleic acid ligand
US20020102581A1 (en) 1999-02-19 2002-08-01 Hageman Gregory S. Diagnostics and therapeutics for ocular disorders
US7306799B2 (en) 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US6573299B1 (en) 1999-09-20 2003-06-03 Advanced Medical Instruments Method and compositions for treatment of the aging eye
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2001087351A1 (en) 2000-05-17 2001-11-22 Gilead Sciences, Inc. Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to pdgf
EP1463563B1 (en) 2001-12-14 2009-02-18 Alcon, Inc. Superoxide dismutase mimics for the treatment of ocular disorders and diseases
RU2222345C2 (ru) 2002-01-21 2004-01-27 Волчек Игорь Анатольевич Фармацевтическая композиция цитокинового и иммуномодулирующего действия
WO2003068967A2 (en) 2002-02-18 2003-08-21 Lynkeus Bio Tech Gmbh Novel retina specific human proteins wdr17, net01, protein kinase a203, protein kinase mak a194, protein a105, protein a106 and c12orf3variants
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
WO2003106659A2 (en) 2002-06-18 2003-12-24 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
AU2003301813A1 (en) 2002-10-30 2004-06-07 University Of Kentucky Research Foundation Methods and animal model for analyzing age-related macular degeneration
US7816497B2 (en) 2002-10-30 2010-10-19 University Of Kentucky Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration
JP2006516151A (ja) 2002-11-21 2006-06-22 アーケミックス コーポレイション 改良された薬力学的特性を有する多価アプタマー治療剤ならびにそれらの作製方法および使用法
US20050037394A1 (en) 2002-12-03 2005-02-17 Keefe Anthony D. Method for in vitro selection of 2'-substituted nucleic acids
EP1570085A4 (en) 2002-12-03 2007-07-25 Archemix Corp PROCESS FOR IN VITRO SELECTION OF 2'-SUBSTITUTED NUCLEIC ACIDS
CA2513004A1 (en) 2003-01-21 2004-08-05 Archemix Corporation Aptamer therapeutics useful in ocular pharmacotherapy
CL2004001996A1 (es) 2003-08-08 2005-05-06 Eyetech Pharmaceuticals Inc Aptameros anti-vegf (factor de crecimiento endotelial vascular) con bloqueo nucleotidico 5'-5' o 3'-3' invertido, composicion que lo contiene, util para trastornos de neovascularizacion.
CN102813923B (zh) 2003-08-27 2015-04-01 奥普索特克公司 用于治疗眼新血管疾病的组合治疗
US8298532B2 (en) 2004-01-16 2012-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
EP3385384B1 (en) * 2004-02-12 2020-04-08 Archemix LLC Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
WO2005084412A2 (en) 2004-03-05 2005-09-15 Archemix Corp. Controlled modulation of the pharmacokinetics and biodistribution of aptamer therapeutics
US20070059336A1 (en) 2004-04-30 2007-03-15 Allergan, Inc. Anti-angiogenic sustained release intraocular implants and related methods
US7919094B2 (en) 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
US20080033053A1 (en) 2004-07-22 2008-02-07 Wolfgang Curt D Cross-Reference To Related Applications
EP3034089A1 (en) 2004-11-02 2016-06-22 Archemix LLC Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
WO2007005645A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of fully 2'-modified nucleic acid transcripts
EP1991275B1 (en) 2006-03-08 2014-11-05 Archemix LLC Complement binding aptamers and anti-c5 agents useful in the treatment of ocular disorders
ES2742284T3 (es) 2012-03-28 2020-02-13 Somalogic Inc Aptámeros contra PDGF y VEGF y su utilización en el tratamiento de afecciones mediadas por PDGF y VEGF
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
CA3012718A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-17 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions with improved intravitreal half-life and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006088888A3 (en) 2007-10-04
CN101155822A (zh) 2008-04-02
BRPI0607002B1 (pt) 2021-06-22
AU2006214437C1 (en) 2013-03-28
PL1850880T3 (pl) 2014-04-30
US8436164B2 (en) 2013-05-07
PT1850880E (pt) 2014-03-05
US20120322860A1 (en) 2012-12-20
AU2006214437B2 (en) 2012-08-16
EP1850880B1 (en) 2013-11-27
US9617546B2 (en) 2017-04-11
IL185312A (en) 2013-05-30
CA2597889A1 (en) 2006-08-24
KR20130064145A (ko) 2013-06-17
EP2623602A2 (en) 2013-08-07
US20210332361A1 (en) 2021-10-28
MX2007009807A (es) 2007-10-08
CA2597889C (en) 2015-11-10
HK1110329A1 (en) 2008-07-11
US20060018871A1 (en) 2006-01-26
HK1256789A1 (zh) 2019-10-04
CA2897900A1 (en) 2006-08-24
CA2992874A1 (en) 2006-08-24
ES2449047T3 (es) 2014-03-18
EP2623602A3 (en) 2013-10-09
KR20150095956A (ko) 2015-08-21
CN104404046A (zh) 2015-03-11
CA2897900C (en) 2018-03-13
KR101374931B1 (ko) 2014-03-17
US8236773B2 (en) 2012-08-07
CN101155822B (zh) 2013-07-24
ZA200707191B (en) 2008-07-30
DK1850880T3 (en) 2014-03-03
US20190185858A1 (en) 2019-06-20
CY1115059T1 (el) 2016-12-14
CA2992874C (en) 2021-08-03
SI1850880T1 (sl) 2014-04-30
KR20070114159A (ko) 2007-11-29
US20150159158A1 (en) 2015-06-11
US11913000B2 (en) 2024-02-27
JP5253818B2 (ja) 2013-07-31
RU2007134212A (ru) 2009-03-20
KR20140019039A (ko) 2014-02-13
RU2406507C2 (ru) 2010-12-20
EP1850880A4 (en) 2010-09-22
IL226339B (en) 2018-05-31
IL226339A0 (en) 2013-06-27
US10947544B2 (en) 2021-03-16
US20180030446A1 (en) 2018-02-01
CA3124030A1 (en) 2006-08-24
CN104404046B (zh) 2018-02-23
HK1207661A1 (zh) 2016-02-05
CN108148840B (zh) 2021-09-24
NZ560804A (en) 2010-08-27
US20110060027A1 (en) 2011-03-10
WO2006088888A2 (en) 2006-08-24
KR101622490B1 (ko) 2016-05-18
US8946184B2 (en) 2015-02-03
AU2006214437A1 (en) 2006-08-24
IL185312A0 (en) 2011-08-01
BRPI0607002A2 (pt) 2009-07-28
EP1850880A2 (en) 2007-11-07
CN108148840A (zh) 2018-06-12
US20130237589A1 (en) 2013-09-12
JP2008530133A (ja) 2008-08-07
US7803931B2 (en) 2010-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101155822B (zh) 用于治疗补体-相关失调的适体治疗
US7538211B2 (en) Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1188811

Country of ref document: HK

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20131016