CN103432580A - 基于低her3表达预测对her二聚化抑制剂的响应 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及基于低HER3表达预测对HER二聚化抑制剂的响应。本申请描述了低HER3作为用HER抑制剂诸如Pertuzumab治疗患者的选择标准的用途。还描述了高HER2:HER3比作为用HER抑制剂诸如Pertuzumab治疗癌症患者诸如卵巢癌患者的选择标准的用途。另外，本申请描述了高HER3作为用化疗剂例如吉西他滨治疗癌症患者的选择标准的用途。

Description

基于低HER3表达预测对HER二聚化抑制剂的响应
本申请是申请日为2008年02月29日、中国申请号为200880014539.5、发明名称为“基于低HER3表达预测对HER二聚化抑制剂的响应”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明关注低HER3作为用HER抑制剂诸如Pertuzumab治疗癌症患者诸如卵巢癌患者的选择标准的用途。
而且，本发明涉及高HER2:HER3比作为用HER抑制剂诸如Pertuzumab治疗癌症患者诸如卵巢癌患者的选择标准的用途。
另外，本发明还涉及高HER3作为用化疗剂例如吉西他滨治疗癌症患者的选择标准的用途。
发明背景
HER受体及针对它的抗体
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。该受体家族包括四个截然不同的成员，包括表皮生长因子受体（EGFR、ErbB1或HER1）、HER2（ErbB2或p185neu）、HER3（ErbB3）和HER4（ErbB4或tyro2）。
由erbB1基因编码的EGFR已经在因果关系方面与人恶性肿瘤联系起来。具体而言，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中观察到EGFR表达升高。EGFR受体表达升高常常与同一肿瘤细胞的EGFR配体转化生长因子α(TGF-α)的产量升高有关，通过自分泌刺激途径导致受体活化。Baselga和Mendelsohn,Pharmac.Ther.64:127-154(1994)。针对EGFR或其配体TGF-α和EGF的单克隆抗体已经作为此类恶性肿瘤治疗中的治疗剂进行了评估。参见例如Baselga和Mendelsohn,见上文;Masui等,CancerResearch44:1002-1007(1984);Wu等,J.Clin.Invest.95:1897-1905(1995)。
HER家族的第二个成员p185neu最初鉴定为来自化学处理大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。neu原癌基因的活化形式源自所编码蛋白质跨膜区中的点突变（缬氨酸变成谷氨酸）。在乳腺癌和卵巢癌中观察到neu的人同系物的扩增，而且这与不良预后相关（Slamon等,Science235:177-182(1987);Slamon等,Science244:707-712(1989);美国专利第4,968,603号）。迄今为止，对于人肿瘤尚无与neu原癌基因中类似的点突变的报道。在其它癌中也已观察到HER2的过表达（频繁但不均一，原因在于基因扩增），包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰和膀胱的癌。参见King等,Science229:974(1985);Yokota等,Lancet1:765-767(1986);Fukushige等,Mol.Cell Biol.6:955-958(1986);Guerin等,Oncogene Res.3:21-31(1988);Cohen等,Oncogene4:81-88(1989);Yonemura等,Cancer Res.51:1034(1991);Borst等,Gynecol.Oncol.38:364(1990);Weiner等,Cancer Res.50:421-425(1990);Kern等,Cancer Res.50:5184(1990);Park等,Cancer Res.49:6605(1989);Zhau等,Mol.Carcinog.3:254-257(1990);Aasland等,Br.J.Cancer 57:358-363(1988);Williams等,Pathobiology59:46-52(1991);McCann等,Cancer65:88-92(1990)等等。HER2可在前列腺癌中过表达（Gu等,Cancer Lett.99:185-9(1996);Ross等,Hum.Pathol.28:827-33(1997);Ross等,Cancer79:2162-70(1997);Sadasivan等,J.Urol.150:126-31(1993)）。
针对大鼠p185neu和人HER2蛋白质产物的抗体已有记载。
Drebin及其同事制备了针对大鼠neu基因产物p185neu的抗体。参见例如Drebin等,Cell41:695-706(1985);Myers等,Meth.Enzym.198:277-290(1991);WO 94/22478。Drebin等,Oncogene2:273-277(1988)报道了与p185neu的两个不同区域有反应性的抗体混合物对植入裸鼠的neu转化的NIH-3T3细胞产生协同抗肿瘤作用。还可参见1998年10月20日公告的美国专利第5,824,311号。
Hudziak等,Mol.Cell.Biol.9(3):1165-1172(1989)描述了一组HER2抗体的生成，并使用人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3进行了表征。将SK-BR-3细胞暴露于抗体后72小时通过细胞单层的结晶紫染色测定了相对细胞增殖。利用此测定法，用称作4D5的抗体获得了最大抑制，它抑制细胞增殖达56%。该组其它抗体在此测定法中以较低程度降低细胞增殖。还发现抗体4D5使过表达HER2的乳腺肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性作用敏感化。还可参见1997年10月14日公告的美国专利第5,677,171号。Hudziak等人的文章中所讨论的HER2抗体在下列文献中进行了进一步表征：Fendly等,Cancer Research 50:1550-1558(1990);Kotts等,In Vitro26(3):59A(1990);Sarup等,GrowthRegulation1:72-82(1991);Shepard等,J.Clin.Immunol.11(3):117-127(1991);Kumar等,Mol.Cell.Biol.11(2):979-986(1991);Lewis等,Cancer Immunol.Immunother.37:255-263(1993);Pietras等,Oncogene9:1829-1838(1994);Vitetta等,Cancer Research54:5301-5309(1994);Sliwkowski等,J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994);Scott等,J.Biol.Chem.266:14300-5(1991);D′souza等,Proc.Natl.Acad.Sci.91:7202-7206(1994);Lewis等,CancerResearch 56:1457-1465(1996);Schaefer等,Oncogene15:1385-1394(1997)。
鼠HER2抗体4D5的重组人源化型式（huMAb4D5-8、rhuMAb HER2、曲妥单抗或
Figure BDA0000374590340000031
；美国专利第5,821,337号）在临床上对患有HER2过表达的转移性乳腺癌并已接受大量现有抗癌疗法的患者起作用（Baselga等,J.Clin.Oncol.14:737-744(1996)）。曲妥单抗在1998年9月25日得到了美国食品和药品管理局的销售许可，可用于治疗其肿瘤过表达HER2蛋白质的转移性乳腺癌患者。
下列文献中记载了具有各种特性的其它HER2抗体：Tagliabue等,Int.J.Cancer47:933-937(1991);McKenzie等,Oncogene4:543-548(1989);Maier等,Cancer Res.51:5361-5369(1991);Bacus等,Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990);Stancovski等,PNAS(USA)88:8691-8695(1991);Bacus等,Cancer Research 52:2580-2589(1992);Xu等,Int.J.Cancer53:401-408(1993);WO94/00136;Kasprzyk等,Cancer Research52:2771-2776(1992);Hancock等,Cancer Res.51:4575-4580(1991);Shawver等,Cancer Res.54:1367-1373(1994);Arteaga等,Cancer Res.54:3758-3765(1994);Harwerth等,J.Biol.Chem.267:15160-15167(1992);美国专利第5,783,186号;Klapper等,Oncogene14:2099-2109(1997)。
同源性筛选使得HER受体家族的两个其它成员得以鉴定：HER3（美国专利第5,183,884和5,480,968号以及Kraus等,PNAS(USA)86:9193-9197(1989)）和HER4（欧洲专利申请第599,274号;Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1746-1750(1993);Plowman等,Nature366:473-475(1993)）。这两种受体都在至少有些乳腺癌细胞系中展示出表达升高。
HER受体在细胞中通常以多种组合发现，而且认为异二聚化增加了对各种HER配体的细胞应答的多样性（Earp等,Breast Cancer Research andTreatment 35:115-132(1995)）。EGFR受到6种不同配体的结合：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、β细胞调节素和上皮调节蛋白（Groenen等,Growth Factors 11:235-257(1994)）。由单一基因的可变剪接产生的一个调蛋白蛋白质家族是HER3和HER4的配体。调蛋白家族包括α、β和γ调蛋白（Holmes等,Science256:1205-1210(1992);美国专利第5,641,869号;Schaefer等,Oncogene 15:1385-1394(1997)）；neu分化因子(NDF)；神经胶质生长因子(GGF)；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)；及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)。有关综述参见Groenen等,Growth Factors 11:235-257(1994);Lemke,G.,Molec.&Cell.Neurosci.7:247-262(1996);Lee等,Pharm.Rev.47:51-85(1995)。最近鉴定了另外三种HER配体：神经调节蛋白-2(NRG-2)，据报道它结合HER3或HER4（Chang等,Nature 387:509-512(1997);Carraway等,Nature387:512-516(1997)）；神经调节蛋白-3，它结合HER4（Zhang等,PNAS(USA)94(18):9562-7(1997)）；和神经调节蛋白-4，它结合HER4（Harari等,Oncogene 18:2681-89(1999)）。HB-EGF、β细胞调节素和上皮调节蛋白也结合HER4。
尽管EGF和TGFα不结合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成异二聚体，它活化EGFR并导致异二聚体中HER2的转磷酸作用。二聚化作用和/或转磷酸作用似乎活化HER2酪氨酸激酶。参见Earp等,见上文。同样，当HER3与HER2共表达时，形成有活性的信号复合物，而针对HER2的抗体能够破坏此复合物（Sliwkowski等,J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994)）。另外，在与HER2共表达时，HER3对调蛋白(HRG)的亲和力升高到更高的亲和力状态。关于HER2-HER3蛋白质复合物还可参见Levi等,Journal of Neuroscience15:1329-1340(1995);Morrissey等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:1431-1435(1995);Lewis等,Cancer Res.56:1457-1465(1996)。HER4，与HER3类似，与HER2形成有活性的信号复合物（Carraway和Cantley,Cell78:5-8(1994)）。
涉及HER抗体的专利出版物包括：US 5,677,171；US 5,720,937；US5,720,954；US 5,725,856；US 5,770,195；US 5,772,997；US 6,165,464；US6,387,371；US 6,399,063；US 2002/0192211 A1；US 6,015,567；US 6,333,169；US 4,968,603；US 5,821,337；US 6,054,297；US 6,407,213；US 6,719,971；US 6,800,738；US 2004/0236078 A1；US 5,648,237；US 6,267,958；US6,685,940；US 6,821,515；WO 98/17797；US 6,127,526；US 6,333,398；US6,797,814；US 6,339,142；US 6,417,335；US 6,489,447；WO 99/31140；US2003/0147884A1；US 2003/0170234A1；US 2005/0002928 A1；US 6,573,043；US 2003/0152987 A1；WO 99/48527；US 2002/0141993 A1；WO 01/00245；US 2003/0086924；US 2004/0013667 A1；WO 00/69460；WO 01/00238；WO01/15730；US 6,627,196 B1；US 6,632,979 B1；WO 01/00244；US 2002/0090662A1；WO 01/89566；US 2002/0064785；US 2003/0134344；WO 04/24866；US 2004/0082047；US 2003/0175845A1；WO 03/087131；US 2003/0228663；WO 2004/008099 A2；US 2004/0106161；WO 2004/048525；US 2004/0258685A1；US 5,985,553；US 5,747,261；US 4,935,341；US 5,401,638；US 5,604,107；WO 87/07646；WO 89/10412；WO 91/05264；EP 412,116B1；EP 494,135B1；US 5,824,311；EP 444,181 B1；EP 1,006,194 A2；US 2002/0155527A1；WO91/02062；US 5,571,894；US 5,939,531；EP 502,812B1；WO 93/03741；EP554,441 B1；EP 656,367 A1；US 5,288,477；US 5,514,554；US 5,587,458；WO 93/12220；WO 93/16185；US 5,877,305；WO 93/21319；WO 93/21232；US 5,856,089；WO 94/22478；US 5,910,486；US 6,028,059；WO 96/07321；US 5,804,396；US 5,846,749；EP 711,565；WO 96/16673；US 5,783,404；US5,977,322；US 6,512,097；WO 97/00271；US 6,270,765；US 6,395,272；US5,837,243；WO 96/40789；US 5,783,186；US 6,458,356；WO 97/20858；WO97/38731；US 6,214,388；US 5,925,519；WO 98/02463；US 5,922,845；WO98/18489；WO 98/33914；US 5,994,071；WO 98/45479；US 6,358,682B1；US 2003/0059790；WO 99/55367；WO 01/20033；US 2002/0076695A1；WO00/78347；WO 01/09187；WO 01/21192；WO 01/32155；WO 01/53354；WO01/56604；WO 01/76630；WO 02/05791；WO 02/11677；US 6,582,919；US2002/0192652A1；US 2003/0211530A1；WO 02/44413；US 2002/0142328；US 6,602,670 B2；WO 02/45653；WO 02/055106；US 2003/0152572；US2003/0165840；WO 02/087619；WO 03/006509；WO 03/012072；WO03/028638；US 2003/0068318；WO 03/041736；EP 1,357,132；US2003/0202973；US 2004/0138160；US 5,705,157；US 6,123,939；EP 616,812 B1；US 2003/0103973；US 2003/0108545；US 6,403,630 B1；WO 00/61145；WO00/61185；US 6,333,348 B1；WO 01/05425；WO 01/64246；US 2003/0022918；US 2002/0051785 A1；US 6,767,541；WO 01/76586；US 2003/0144252；WO01/87336；US 2002/0031515A1；WO 01/87334；WO 02/05791；WO 02/09754；US 2003/0157097；US 2002/0076408；WO 02/055106；WO 02/070008；WO02/089842；和WO 03/86467。
诊断剂
用HER2抗体曲妥单抗治疗的患者是基于HER2过表达/扩增而选择接受治疗的。参见例如WO 99/31140(Paton等)、US2003/0170234A1(Hellmann,S.)和US2003/0147884(Paton等)；以及WO01/89566、US2002/0064785和US2003/0134344(Mass等)。关于检测HER2过表达和扩增的免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)还可参见US2003/0152987(Cohen等)。
WO2004/053497和US2004/024815A1(Bacus等)，以及US2003/0190689(Crosby和Smith)涉及测定或预测对曲妥单抗疗法的响应。US2004/013297A1(Bacus等)涉及测定或预测对ABX0303 EGFR抗体疗法的响应。WO2004/000094(Bacus等)涉及测定对GW572016，一种小分子EGFR-HER2酪氨酸激酶抑制剂的响应。WO2004/063709(Amler等)涉及用于测定对EGFR抑制剂，盐酸erlotinib的敏感性的生物标志和方法。US2004/0209290(Cobleigh等)涉及用于乳腺癌预后的基因表达标志。
可基于HER活化或二聚化选择用Pertuzumab治疗的患者来接受治疗。涉及Pertuzumab及用其治疗的患者的选择的专利出版物包括：WO01/00245(Adams等);US2003/0086924(Sliwkowski,M.);US2004/0013667A1(Sliwkowski,M.);及WO2004/008099A2和US2004/0106161(Bossenmaier等)。
Cronin等,Am.J.Path.164(1):35-42(2004)记载了保留的石蜡包埋组织中基因表达的测量法。Ma等,Cancer Cell5:607-616(2004)记载了使用取自保留的原代活检的肿瘤组织切片的分离RNA通过基因寡核苷酸微阵列的基因概况分析。
Pertuzumab(又称为重组人单克隆抗体2C4；OMNITARGTM，Genetech,Inc,South San Francisco)是一类称为HER二聚化抑制剂(HDI)的新作用剂中第一个问世的，它的功能是抑制HER2与其它HER受体（诸如EGFR/HER1、HER3和HER4）形成活性异二聚体的能力，而且不论HER2表达水平如何，它都有活性。参见例如Harari和Yarden,Oncogene 19:6102-14(2000);Yarden和Sliwkowski,Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37(2001);Sliwkowski,Nat StructBiol 10:158-9(2003);Cho等,Nature 421:756-60(2003);Malik等,Pro Am SocCancer Res44:176-7(2003)。
已经证明，Pertuzumab对肿瘤细胞中HER2-HER3异二聚体形成的阻断抑制关键性的细胞信号传导，导致肿瘤扩增和存活降低(Agus等,Cancer Cell2:127-37(2002))。
Pertuzumab已在临床上作为单一药剂进行了检验，其中在患有晚期癌症的患者中进行Ia期试验，在患有卵巢癌和乳腺癌以及肺癌和前列腺癌的患者中进行II期试验。在I期研究中，对具有标准治疗期间或之后发展的，不可治愈的、局部发展为晚期的、复发性的或转移性的实体瘤的患者每三周静脉内给予Pertuzumab进行治疗。对Pertuzumab的耐受普遍较好。在响应可评估的20名患者中有3名实现了肿瘤消退。两名患者证实有部分响应。在21名患者中有6名观察到持续超过2.5个月的病情稳定(Agus等,Pro Am Soc Clin Oncol22:192(2003))。在2.0-15mg/kg的剂量，Pertuzumab的药动学是线性的，平均清除的范围是2.69-3.74mL/天/kg，平均终末消除半衰期的范围是15.3-27.6天。没有检测到针对Pertuzumab的抗体(Allison等,Pro Am Soc Clin Oncol22:197(2003))。
Sergina等报告了用于评估HER酪氨酸激酶抑制剂(TKI)功效的生物学标志物应当是HER3的转磷酸化而非自磷酸化(Sergina等,Nature 445(7126):437-441(2007))。
Jazaeri等评估了上皮卵巢癌中与对化疗剂的响应有关的基因表达序型(Jazaeri等,Clin.Cancer Res.11(17):6300-6310(2005))。
Tanner等报告了HER3预测卵巢癌中的存活(Tanner等,J.Clin.Oncol.24(26):4317-4323(2006))。
发明概述
本申请至少部分涉及如下出乎意料的观察结果，即其癌症以低水平表达HER3的癌症患者（例如卵巢癌患者）在人体临床试验中对HER二聚化抑制剂的响应好于那些其癌症以高水平表达HER3的患者。一般而言，此类患者具有高HER2:HER3比（由于HER3水平低），所以评估HER2和HER3二者的相对水平提供了额外的或备选的手段，来为HER二聚化抑制剂疗法选择患者。
如此，在第一个方面，本文中的发明关注一种用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的HER抑制剂，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。所涵盖的HER抑制剂的例子包括HER抗体或小分子抑制剂；HER2抗体或小分子抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于lapatinib,Tykerb；等。更优选地，所述HER抑制剂是HER二聚化抑制剂。因而，本发明提供了一种用于治疗患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的HER二聚化抑制剂，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
根据此实施方案，优选地，所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达第25百分位的水平表达HER3。任选地，此类患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位、优选大于中值水平、最优选大于第75百分位的水平表达HER2:HER3。用于测量HER3（和HER2）表达的优选测定法包括聚合酶链式反应(PCR)，最优选定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
优选地，所述HER二聚化抑制剂是抗体，最优选地，HER2抗体，诸如Pertuzumab。
优选地，本文中要治疗或诊断的癌症类型选自卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、转移性乳腺癌(MBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、和结肠直肠癌。最优选地，本文中要治疗或诊断的癌症类型是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌。所述癌症类型可以是化疗抗性的、铂抗性的、晚期的、顽固性的、和/或复发性的。所述方法可延长所述患者中的存活，包括无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。
所述HER抑制剂可以作为单一抗肿瘤剂来施用，或者可以与一种或多种其它疗法组合。在一个实施方案中，所述HER抑制剂是与一种或多种化疗剂一起施用的，诸如吉西他滨(gemcitabine)、卡铂(carboplatin)、帕利他塞(paclitaxel)、多西他塞(docetaxel)、拓扑替康(topotecan)、和多柔比星脂质体(liposomal doxorubicin)，优选地，抗代谢物，诸如吉西他滨。所述HER抑制剂也可以与曲妥单抗、erlotinib、或贝伐单抗组合。
在另一个方面，本发明属于一种用于治疗患有卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的Pertuzumab，其中所述患者的癌症以小于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
本文中的发明进一步关注一种用于为患有能够响应HER抑制剂（例如HER二聚化抑制剂）的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择HER抑制剂（例如HER二聚化抑制剂）作为疗法。
另外，本发明提供了一种制品，包括包装在一起的药物组合物和标签，所述药物组合物在药学可接受载体中包含HER二聚化抑制剂，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
在另一个方面，本发明属于一种用于制造HER二聚化抑制剂或其药物组合物的方法，包括在包装中组合所述抑制剂或药物组合物及标签，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种为HER二聚化抑制剂或其药学可接受组合物做广告的方法，包括向目标受众(audicence)推广HER二聚化抑制剂或其药物组合物用于治疗患有一种癌症类型的患者群的用途，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
在上述发明之外，本文中所提供的人体临床数据证明了其癌症以高水平表达HER3的癌症患者（例如卵巢癌患者）对化疗剂（诸如吉西他滨）的临床响应好于那些其癌症以低水平表达HER3的患者。
关于本发明的此方面，本发明提供了一种为患有有可能响应化疗剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择化疗剂作为疗法。优选地，所述癌症类型是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌，包括铂抗性卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌，以及晚期的、顽固性的、或复发性的卵巢癌。优选地，所选择的化疗剂是抗代谢物，诸如吉西他滨。
本发明还关注一种用于治疗患有能够响应化疗剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的化疗剂，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。优选地，所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER3表达第25百分位的水平表达HER3。用于测量HER3表达的优选测定法包括聚合酶链式反应(PCR)，最优选定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
优选地，所述化疗剂是抗代谢物，最优选吉西他滨。
优选地，依照本发明此方面要治疗或诊断的癌症类型是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌。所述癌症类型可以是化疗抗性的(chemotherapy-resistant)、铂抗性的(platinum-resistant)、晚期的、顽固性的(refractory)、和/或复发性的(recurrent)。所述方法可延长所述患者中的存活，包括无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。
在另一个方面，本发明属于一种用于治疗患有卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌的患者的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的吉西他滨，其中所述患者的癌症以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
本发明还提供了一种制品，包括包装在一起的药物组合物和标签，所述药物组合物在药学可接受载体中包含化疗剂（诸如吉西他滨），所述标签声明所述化疗剂或药物组合物指明用于治疗患有一种癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
在又一个方面，本发明关注一种用于制造化疗剂（诸如吉西他滨）或其药物组合物的方法，包括在包装中组合所述化疗剂或药物组合物及标签，所述标签声明所述化疗剂或药物组合物指明用于治疗患有一种癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种为化疗剂或其药学可接受组合物做广告的方法，包括向目标受众推广化疗剂或其药物组合物用于治疗患有一种癌症类型的患者群的用途，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
本发明提供了人体临床数据，证明了具有高HER2:HER3表达的患者更有利地响应HER抑制剂诸如Pertuzumab。如此，在另一个方面，本发明提供了一种用于选择患者的手段，其通过评估HER2和HER3表达水平，并从疗法中排除那些其癌症以低水平表达HER2:HER3的患者。
如此，本发明还关注一种用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的HER抑制剂，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。优选地，所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达中值、最优选大于第75百分位的水平表达HER2:HER3。
另外，提供了一种用于治疗患有卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌的患者的方法，包括对所述患者施用治疗有效量Pertuzumab，其中所述患者的癌症以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
在另一个方面，本发明关注一种用于为患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER2和HER3表达，并且，如果该癌症样品以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3，那么选择HER抑制剂作为疗法。
而且，本发明涉及一种制品，包括包装在一起的药物组合物和标签，所述药物组合物在药学可接受载体中包含HER抑制剂，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
此外，本发明提供了一种用于制造HER抑制剂或其药物组合物的方法，包括在包装中组合所述抑制剂或药物组合物及标签，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
另外，本发明涉及一种为HER抑制剂或其药学可接受组合物做广告的方法，包括向目标受众推广HER抑制剂或其药物组合物用于治疗患有一种癌症类型的患者群的用途，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
本发明涉及下述各项。
1.一种用于治疗患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的HER二聚化抑制剂，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
2.项1的方法，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达第25百分位的水平表达HER3。
3.项1或项2的方法，其中HER3表达是使用聚合酶链式反应(PCR)测定的。
4.项3的方法，其中所述PCR是定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
5.前述项任一项的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂。
6.前述项任一项的方法，其中所述HER二聚化抑制剂抑制HER二聚化。
7.前述项任一项的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是抗体。
8.项7的方法，其中所述抗体结合选自EGFR、HER2和HER3中的一种或多种HER受体。
9.项8的方法，其中所述抗体结合HER2。
10.项9的方法，其中所述HER2抗体结合HER2胞外结构域的结构域II。
11.项10的方法，其中所述抗体结合HER2胞外结构域的结构域I、II和III之间的连接处。
12.项10的方法，其中所述HER2抗体包含SEQ ID NO.3和4中的可变轻链和重链氨基酸序列。
13.项12的方法，其中所述HER2抗体是Pertuzumab。
14.项7-13任一项的方法，其中所述HER抗体是裸抗体。
15.项7-14任一项的方法，其中所述HER抗体是完整抗体。
16.项7-14任一项的方法，其中所述HER抗体是包含抗原结合区的抗体片段。
17.前述项任一项的方法，其中所述癌症类型选自卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、转移性乳腺癌(MBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、和结肠直肠癌中的一种或多种。
18.项17的方法，其中所述癌症类型是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌。
19.项18的方法，其中所述癌症类型是铂抗性的。
20.项18的方法，其中所述癌症类型是晚期的、顽固性的、或复发性的卵巢癌。
21.前述项任一项的方法，其延长所述患者中的无进展存活(PFS)。
22.前述项任一项的方法，其延长所述患者中的总体存活(OS)。
23.前述项任一项的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是作为单一抗肿瘤剂施用的。
24.项1-22任一项的方法，包括对所述患者施用第二治疗剂。
25.项24的方法，其中所述第二治疗剂选自：化疗剂、HER抗体、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、心脏保护剂、细胞因子、EGFR靶向药物、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、COX抑制剂、非类固醇抗炎药、法尼基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA 125的抗体、HER2疫苗、HER靶向疗法、Raf或ras抑制剂、多柔比星脂质体、拓扑替康、紫杉烷、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、治疗恶心的药物、预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法、治疗或预防腹泻的药物、降低体温的药物和造血生长因子中的一种或多种。
26.项25的方法，其中所述第二治疗剂是化疗剂。
27.项26的方法，其中所述化疗剂选自吉西他滨、卡铂、帕利他塞、多西他塞、拓扑替康和多柔比星脂质体中的一种或多种。
28.项26的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物。
29.项28的方法，其中所述抗代谢物化疗剂是吉西他滨。
30.项24的方法，其中所述第二治疗剂是曲妥单抗、erlotinib、或贝伐单抗。
31.前述项任一项的方法，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
32.项31的方法，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达水平中值的水平表达HER2:HER3。
33.项32的方法，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第75百分位的水平表达HER2:HER3。
34.一种用于治疗患有卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的Pertuzumab，其中所述患者的癌症以小于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
35.项34的方法，其中所述患者的癌症以小于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER3表达第25百分位的水平表达HER3。
36.项34或项35的方法，其中HER3表达是使用聚合酶链式反应(PCR)测定的。
37.项36的方法，其中所述PCR是定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
38.项34-37任一项的方法，其延长无进展存活(PFS)。
39.项34-38任一项的方法，其延长总体存活(OS)。
40.项34-39任一项的方法，其中所述患者患有卵巢癌。
41.项40的方法，其中所述卵巢癌是铂抗性卵巢癌。
42.项40或项41的方法，其中所述患者患有晚期的、顽固性的、或复发性的卵巢癌。
43.项34-42任一项的方法，进一步包括对所述患者施用化疗剂。
44.项43的方法，其中所述化疗剂选自吉西他滨、卡铂、帕利他塞、多西他塞、拓扑替康、和多柔比星脂质体。
45.项44的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物化疗剂。
46.项45的方法，其中所述抗代谢物化疗剂是吉西他滨。
47.项34-46任一项的方法，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
48.项47的方法，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达水平中值的水平表达HER2:HER3。
49.项48的方法，其中所述患者的癌症以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达第75百分位的水平表达HER2:HER3。
50.一种用于为患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择HER二聚化抑制剂作为疗法。
51.一种制品，包括包装在一起的药物组合物和标签，所述药物组合物在药学可接受载体中包含HER二聚化抑制剂，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
52.一种用于制造HER二聚化抑制剂或其药物组合物的方法，包括在包装中组合所述抑制剂或药物组合物及标签，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
53.一种为HER二聚化抑制剂或其药学可接受组合物做广告的方法，包括向目标受众推广HER二聚化抑制剂或其药物组合物用于治疗患有一种癌症类型的患者群的用途，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
54.一种用于为患有能够响应化疗剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择化疗剂作为疗法。
55.项54的方法，其中所述癌症类型是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌。
56.项55的方法，其中所述癌症类型是铂抗性卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌。
57.项55的方法，其中所述癌症类型是晚期的、顽固性的、或复发性的卵巢癌。
58.项54-57任一项的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物。
59.项58的方法，其中所述抗代谢物化疗剂是吉西他滨。
60.一种用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的HER抑制剂，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
61.项60的方法，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达水平中值的水平表达HER2:HER3。
62.项61的方法，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第75百分位的水平表达HER2:HER3。
63.项60-62任一项的方法，其中HER2和HER3表达是使用聚合酶链式反应(PCR)测定的。
64.项63的方法，其中所述PCR是定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
65.项60-64任一项的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER二聚化抑制剂。
66.项60-65任一项的方法，其中所述HER抑制剂是HER2抑制剂。
67.项65或项66的方法，其中所述HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂。
68.项65的方法，其中所述HER抑制剂抑制HER二聚化。
69.项60-68任一项的方法，其中所述HER抑制剂是抗体。
70.项69的方法，其中所述抗体结合选自EGFR、HER2和HER3中的一种或多种HER受体。
71.项70的方法，其中所述抗体结合HER2。
72.项71的方法，其中所述HER2抗体结合HER2胞外结构域的结构域II。
73.项71的方法，其中所述抗体结合HER2胞外结构域的结构域I、II和III之间的连接处。
74.项73的方法，其中所述HER2抗体包含SEQ ID NO.3和4中的可变轻链氨基酸序列和可变重链氨基酸序列。
75.项74的方法，其中所述HER2抗体是Pertuzumab。
76.项69-75任一项的方法，其中所述HER抗体是裸抗体。
77.项69-76任一项的方法，其中所述HER抗体是完整抗体。
78.项69-76任一项的方法，其中所述HER抗体是包含抗原结合区的抗体片段。
79.项60-78任一项的方法，其中所述癌症类型选自卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、转移性乳腺癌(MBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌和结肠直肠癌中的一种或多种。
80.项79的方法，其中所述癌症类型是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌。
81.项80的方法，其中所述癌症类型是铂抗性的。
82.项80的方法，其中所述癌症类型是晚期的、顽固性的、或复发性的卵巢癌。
83.项60-82任一项的方法，其延长所述患者中的无进展存活(PFS)。
84.项60-83任一项的方法，其延长所述患者中的总体存活(OS)。
85.项60-84任一项的方法，其中所述HER抑制剂是作为单一抗肿瘤剂施用的。
86.项60-84任一项的方法，包括对所述患者施用第二治疗剂。
87.项86的方法，其中所述第二治疗剂选自：化疗剂、HER抗体、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、心脏保护剂、细胞因子、EGFR靶向药物、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、COX抑制剂、非类固醇抗炎药、法尼基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA 125的抗体、HER2疫苗、HER靶向疗法、Raf或ras抑制剂、多柔比星脂质体、拓扑替康、紫杉烷、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、治疗恶心的药物、预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法、治疗或预防腹泻的药物、降低体温的药物和造血生长因子中的一种或多种。
88.项86的方法，其中所述第二治疗剂是化疗剂。
89.项88的方法，其中所述化疗剂选自吉西他滨、卡铂、帕利他塞、多西他塞、拓扑替康和多柔比星脂质体中的一种或多种。
90.项88的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物。
91.项90的方法，其中所述抗代谢物化疗剂是吉西他滨。
92.项86的方法，其中所述第二治疗剂是曲妥单抗、erlotinib、或贝伐单抗。
93.一种用于治疗患有卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的Pertuzumab，其中所述患者的癌症以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
94.项93的方法，其中所述患者的癌症以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达水平中值的水平表达HER2:HER3。
95.项94的方法，其中所述患者的癌症以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达第75百分位的水平表达HER2:HER3。
96.项93-95任一项的方法，其中HER2和HER3表达是使用聚合酶链式反应(PCR)测定的。
97.项96的方法，其中所述PCR是定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
98.项93-97任一项的方法，其延长无进展存活(PFS)。
99.项93-98任一项的方法，其延长总体存活(OS)。
100.项93-99任一项的方法，其中所述患者患有卵巢癌。
101.项100的方法，其中所述卵巢癌是铂抗性卵巢癌。
102.项100或项101的方法，其中所述患者患有晚期的、顽固性的、或复发性的卵巢癌。
103.项93-102任一项的方法，进一步包括对所述患者施用化疗剂。
104.项103的方法，其中所述化疗剂选自吉西他滨、卡铂、帕利他塞、多西他塞、拓扑替康和多柔比星脂质体中的一种或多种。
105.项103的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物化疗剂。
106.项105的方法，其中所述抗代谢物化疗剂是吉西他滨。
107.一种用于为患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER2和HER3表达，并且，如果该癌症样品以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3，那么选择HER抑制剂作为疗法。
108.一种制品，包括包装在一起的药物组合物和标签，所述药物组合物在药学可接受载体中包含HER抑制剂，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
109.一种用于制造HER抑制剂或其药物组合物的方法，包括在包装中组合所述抑制剂或药物组合物及标签，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
110.一种为HER抑制剂或其药学可接受组合物做广告的方法，包括向目标受众推广HER抑制剂或其药物组合物用于治疗患有一种癌症类型的患者群的用途，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
111.一种用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的HER抑制剂，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
112.一种用于为患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择HER抑制剂作为疗法。
113.项111或项112的方法，其中所述HER抑制剂是HER2抑制剂。
附图简述
图1提供了HER2蛋白质结构的示意图，及其胞外结构域的结构域I-IV的氨基酸序列（分别是SEQ ID No.19-22）。
图2A和2B描绘了鼠单克隆抗体2C4的轻链可变区(VL)（图2A）和重链可变区(VH)（图2B）（分别是SEQ ID No.1和2）；变体574/Pertuzumab的VL和VH结构域（分别是SEQ ID No.3和4）；及人VL和VH共有框架（humκ1，轻链κ亚组I；hum III，重链亚组III）（分别是SEQ ID No.5和6）的氨基酸序列对比。星号标示Pertuzumab可变域和鼠单克隆抗体2C4之间或Pertuzumab可变域和人框架之间的差异。互补决定区(CDR)包在括号中。
图3A和3B显示了Pertuzumab轻链（图3A；SEQ ID No.13）和重链（图3B；SEQ ID No.14）的氨基酸序列。CDR以粗体显示。轻链和重链的计算分子量是23,526.22Da和49,216.56Da（半胱氨酸为还原形式）。碳水化合物模块(moiety)附着于重链的Asn299。
图4以图描述了2C4在HER2的异二聚体结合位点处的结合，由此阻止与活化的EGFR或HER3的异二聚化。
图5描绘了HER2/HER3与MAPK和Akt途径的偶联。
图6比较了Trastuzumab和Pertuzumab的各种活性。
图7A和7B分别显示了Trastuzumab轻链（图7A；SEQ ID No.15）和重链（图7B；SEQ ID No.16）的氨基酸序列。
图8A和8B分别描绘了变体Pertuzumab轻链序列（图8A；SEQ ID No.17）和变体Pertuzumab重链序列（图8B；SEQ ID No.18）。
图9描绘了实施例1中的临床试验的研究设计/方案，涉及患有铂抗性卵巢癌、原发性腹膜癌、或输卵管癌的、用吉西他滨和安慰剂或吉西他滨和Pertuzumab治疗的患者。
图10A描绘了来自实施例1中研究的所有患者的无进展存活(PFS)。
图10B是图10A的更新版。已经通过随机化分层因素（ECOG PS、针对铂抗性疾病的在先治疗方案(regimen)的数目、和疾病可测性）使用分层Cox模型和分层longrank检验估算了PFS。
图11A呈现了通过预测pHER2状态得到的PFS。
图11B是图11A的更新版。
图12A呈现了通过qRT-PCR EGFR(HER1)截留得到的PFS。
图12B是通过wRT-PCR EGFR(HER1)截留得到的PFS的另一呈现，也指明了各种EGFR截留值时HER1（高）和HER1（低）组中的受试者数目。
图13A呈现了通过qRT-PCR HER2截留得到的PFS。
图13B是通过qRT-PCR HER2截留得到的PFS的另一呈现，也指明了各种HER2截留值时HER1（高）和HER1（低）组中的受试者数目。
图14A呈现了通过qRT-PCR HER3截留得到的PFS。
图14B是通过qRT-PCR HER3截留得到的PFS的另一呈现，也指明了各种HER3截留值时HER3（高）和HER3（低）组中的受试者数目。
图15A显示了通过HER3亚组得到的PFS。Pertuzumab活性在患有低HER3表达肿瘤的患者中最大，且趋向于随HER3基因表达水平降低而升高。
图15B是通过qRT-PCR HER3水平得到的PFS的另一呈现。
图16A展示了通过HER3亚组得到的PFS。数据显示了在具有HER3高表达的肿瘤的患者中，Pertuzumab与吉西他滨之间可能有消极的相互作用。
图16B是通过qRT-PCR HER3水平得到的PFS的另一呈现。数据进一步证实了在具有HER3高表达的肿瘤的患者中，Pertuzumab与吉西他滨之间可能有消极的相互作用。
图17A总结了通过HER3亚组得到的PFS：高HER3表达亚组和低HER3表达亚组。
图17B是图17B所示通过qRT-PCR HER3水平得到的PFS的更新版。
图18A进一步展示了通过HER3亚组得到的PFS。
图18B是图18A所示通过HER3表达四分位得到的PFS分析的更新版。
图19A显示了通过HER3 qRT-PCR得到的PFS，50/50拆分；低HER3表达在小于第50百分位中，而高HER3表达在大于或等于第50百分位中。
图19B是图19A所示通过HER3 qRT-PCR得到的PFS，50/50拆分的更新版
图20A显示了通过HER3 qRT-PCR得到的PFS，25/75拆分；低HER3表达在小于第25百分位中，而高HER3表达在大于或等于第25百分位中。
图20B是图20A所示通过HER3 qRT-PCR得到的PFS，25/75拆分的更新版。
图21A显示了所有患者中的总体存活(OS)的初步数据。数据基于46/130例事件。
图21B是OS数据的更新图，即通过随机化分层因素（ECOG PS、针对铂抗性疾病的在先治疗方案的数目、和疾病可测性）估算的层次Cox模型和分层logrank-检验。
图22A图示了在qRT-PCR中通过HER3得到的OS初步数据。数据基于43/119例事件。
图22B是在qRT-PCR中通过HER3得到的OS的更新图，50/50拆分，低HER3表达在小于第50百分位中，而高HER3表达在大于或等于第25百分位中。
图23A展示了通过HER3 qRT-PCR得到的PFS，比较了高对低危害比(highversus low hazard ratio,HR)。
图23B是通过HER3 qRT-PCR得到的PFS的更新图，比较高对低危害比(HR)。
图24A显示了实施例1中Pertuzumab铂抗性卵巢癌的全套数据，及通过qRT-PCR HER3得到的PFS。注意：HR和Log-rank p值没有为多重比较进行调整。
图24B是Pertuzumab铂抗性卵巢癌的另一套数据，及通过qRT-PCR HER3得到的PFS。正如图24A中的，HR和Log-rank p值没有为多重比较进行调整。
图25显示了为如实施例2中那样用Pertuzumab单一药剂治疗的患者通过HER3 qRT-PCR得到的PFS和OS。高HER3为在大于和等于第75百分比中的患者；低HER3中的患者为那些小于第75百分位的。低表达患者的存活中值为3.31年（95%CI，1.93-4.69）；高HER3表达患者的存活中值为1.80（95%CI，0.83-2.78）。
图26A显示了HER3校准标准化比(calibrated normalizated ratio)；表达范围为约20-80倍。大多数样品的CP介于约23和30之间。
图26B是显示HER3校准标准化比的另一图；表达范围为约20-80倍。大多数样品的CP介于约23和30之间。
图27显示了体外诊断(IVD)测定法工作流程中的
Figure BDA0000374590340000211
2.0Pertuzumab qRT-PCR。
图28显示了Pertuzumab IVD测定法工作流程和分析，其中有一种标志物和参照物。
图29A提供了为实施例1中所治疗的患者通过HER2:HER3百分位得到的PFS。
图29B是显示为实施例1中所治疗的患者通过HER2:HER3百分位得到的PFS的另一图。注意：HR和log-rank p值没有为多重比较进行调整。
图30A使用Kaplan Meyer图对实施例1评估通过HER2:HER3比得到的PFS，具体是对HER2对HER3比值高于中值的、或高于第75百分位的患者。
图30B是使用Kaplan Meyer图对实施例1显示通过HER2:HER3比得到的PFS的更新，具体是对HER2对HER3比值高于中值的、或高于第75百分位的患者。
图31A评估了通过HER2:HER3比四分位亚组得到的PFS，同样来自实施例1。
图31B是通过HER2/HER3四分位复发性卵巢癌得到的PFS分析的另一总结。
图32显示了如实施例3中所述治疗的、卵巢癌分别具有小于中值的或者等于或大于中值的HER3水平的受试者的PFS的Kaplan-Meier图。
图33显示了HER3水平小于中值的和等于或大于中值的患者组中用化疗或Pertuzumab治疗卵巢癌的受试者的PFS Kaplan-Meier图。
图34显示了用Pertuzumab和化疗或用单独的Pertuzumab治疗卵巢癌的、HER2/HER3比低于中值的和等于或大于中值的受试者的PFS Kaplan-Meier图。
图35显示了用化疗或Pertuzumab治疗卵巢癌的、HER2/HER3比低于中值的和等于或大于中值的受试者的PFS Kaplan-Meier图。
发明详述
I.定义
“HER受体”是属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体通常将包含胞外结构域，它可结合HER配体和/或与另一HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和含有数个可磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。HER受体可以是“天然序列”HER受体或其“氨基酸序列变体”。优选的是，HER受体是天然序列人HER受体。
术语“ErbB1”、“HER1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可互换使用，指例如Carpenter等,Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中所披露的EGFR，包括其天然存在的突变体形式（例如Humphrey等,PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR）。erbB1指编码EGFR蛋白质产物的基因。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用，指例如Semba等,PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等,Nature 319:230-234(1986)中记载的人HER2蛋白（Genebank编号X03363）。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因，而“neu”指编码大鼠p185neu的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。
在本文中，“HER2胞外结构域”或“HER2 ECD”指HER2在细胞外的结构域，或是锚定于细胞膜或是在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER2的胞外结构域可包含4个结构域：“结构域I”（大约第1-195位氨基酸残基；SEQ ID NO:19）、“结构域II”（大约第196-319位氨基酸残基；SEQ ID NO:20）、“结构域III”（大约第320-488位氨基酸残基；SEQ ID NO:21）和“结构域IV”（大约第489-630位氨基酸残基；SEQ ID NO:22）（残基编号不包括信号肽）。参见Garrett等,Mol.Cell.11:495-505(2003);Cho等,Nature421:756-760(2003);Franklin等,Cancer Cell 5:317-328(2004);Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)，以及本文中的图1。
“ErbB3”和“HER3”指例如美国专利第5,183,884号和第5,480,968号及Kraus等,PNAS(USA)86:9193-9197(1989)中所披露的受体多肽。
术语“ErbB4”和“HER4”指例如欧洲专利申请第599,274号;Plowman等,Proc.Natl.Acad.Sci USA90:1746-1750(1993);Plowman等,Nature366:473-475(1993)中所披露的受体多肽，包括其同种型，例如1999年4月22日公布的WO99/19488中所披露的。
“HER配体”指结合和/或活化HER受体的多肽。本文中特别感兴趣的HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)(Savage等,J.Biol.Chem.247:7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等,Science223:1079-1082(1984))；双调蛋白(amphiregulin)，也称为施旺细胞瘤或角质形成细胞自分泌生长因子(Shoyab等,Science243:1074-1076(1989);Kimura等,Nature348:257-260(1990);Cook等,Mol.Cell.Biol.11:2547-2557(1991))；β细胞调节素(betacellulin)(Shing等,Science 259:1604-1607(1993);Sasada等,Biochem.Biophys.Res.Commun.190:1173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等,Science251:936-939(1991))；上皮调节蛋白(epiregulin)(Toyoda等,J.Biol.Chem.270:7495-7500(1995);Komurasaki等,Oncogene15:2841-2848(1997))；α调蛋白(heregulin)（见下文）；神经调节蛋白(neuregulin)-2(NRG-2)(Carraway等,Nature387:512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang等,Proc.Natl.Acad.Sci.94:9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari等,Oncogene18:2681-89(1999))；和cripto(CR-1)(Kannan等,J.Biol.Chem.272(6):3330-3335(1997))。结合EGFR的HER配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β细胞调节素(betacellulin)、HB-EGF和上皮调节蛋白(epiregulin)。结合HER3的HER配体包括调蛋白。能够结合HER4的HER配体包括β细胞调节素、上皮调节蛋白、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和调蛋白。
“调蛋白”(HRG)在用于本文时指由调蛋白基因编码的多肽，如美国专利第5,641,869号或Marchionni等,Nature362:312-318(1993)中所披露的。调蛋白的例子包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等,Science256:1205-1210(1992);美国专利第5,641,869号)；neu分化因子(NDF)(Peles等,Cell69:205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls等,Cell72:801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGF)(Marchionni等,Nature362:312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho等,J.Biol.Chem.270:14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer等,Oncogene 15:1385-1394(1997))。
“HER二聚体”在本文中指包含至少两个HER受体的非共价结合二聚体。在表达两种或多种HER受体的细胞暴露于HER配体时可形成这样的复合物，可通过免疫沉淀来分离并通过SDS-PAGE来分析，如例如Sliwkowski等,J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994)中所记载的。其它蛋白质，诸如细胞因子受体亚基（例如gp130）可与二聚体结合。优选的是，所述HER二聚体包含HER2。
“HER异二聚体”在本文中指包含至少两个不同HER受体的非共价结合异二聚体，诸如EGFR-HER2、HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体。
“HER抑制剂”指干扰HER活化或功能的药剂。HER抑制剂的例子包括HER抗体（例如EGFR、HER2、HER3或HER4抗体）；EGFR靶向药物；小分子HER拮抗剂；HER酪氨酸激酶抑制剂；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如lapatinib/GW572016；反义分子(参见例如WO2004/87207)；和/或结合下游信号分子诸如MAPK或Akt（见图5）或干扰其功能的药剂。优选的是，所述HER抑制剂是结合HER受体的抗体或小分子。
“HER二聚化抑制剂”指抑制HER二聚体或HER异二聚体形成的药剂。优选的是，HER二聚化抑制剂是HER2二聚化抑制剂和/或抑制HER二聚化。优选的是，HER二聚化抑制剂是抗体，例如在HER2的异二聚体结合位点结合HER2的抗体。本文中最优选的HER二聚化抑制剂是Pertuzumab或MAb2C4。2C4对HER2的异二聚体结合位点的结合示于图4。HER二聚化抑制剂的其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体（例如EGFR单克隆抗体806，MAb806，它结合活化的或“未系留的(untethered)”EGFR；参见Johns等,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004)）；结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；肽二聚化抑制剂(美国专利第6,417,168号)；反义二聚化抑制剂；等等。
“HER2二聚化抑制剂”指抑制包含HER2的二聚体或异二聚体形成的药剂。
“HER抗体”指结合HER受体的抗体。任选的是，HER抗体还干扰HER活化或功能。优选的是，HER抗体结合HER2受体。本文中特别感兴趣的HER2抗体是Pertuzumab。HER2抗体的另一个例子是trastuzumab。EGFR抗体的例子包括cetuximab和ABX0303。
“HER活化”指任何一种或多种HER受体的活化或磷酸化。通常，HER活化导致信号转导（例如由HER受体胞内激酶结构域引起的信号转导，该激酶结构域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基）。HER活化可由结合包含目的HER受体的HER二聚体的HER配体介导。结合HER二聚体的HER配体可活化二聚体中一种或多种HER受体的激酶结构域，由此导致一种或多种HER受体中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它底物多肽诸如Akt或MAPK胞内激酶中酪氨酸残基的磷酸化。参见例如图5。
“磷酸化”指对蛋白质诸如HER受体，或其底物添加一个或多个磷酸基团。
“抑制HER二聚化”的抗体指抑制或干扰HER二聚体形成的抗体。优选的是，此类抗体在HER2的异二聚体结合位点处结合HER2。本文中最优选的二聚化抑制性抗体是Pertuzumab或MAb2C4。2C4对HER2的异二聚体结合位点的结合示于图4。抑制HER二聚化的抗体的其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体（例如EGFR单克隆抗体806，MAb806，它结合活化的或“未系留的”EGFR；参见Johns等,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004)）；结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；及结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体。
“比trastuzumab更有效地阻断配体对HER受体之活化”的抗体指比trastuzumab更有效（例如功效提高至少约2倍）地降低或消除HER配体对HER受体之活化的抗体。优选的是，此类抗体至少大约像鼠单克隆抗体2C4或其Fab片段或者像Pertuzumab或其Fab片段那样有效地阻断HER配体对HER受体之活化。可通过直接研究HER二聚体，或者通过评估由HER二聚化引起的HER活化或下游信号传导，和/或通过评估抗体-HER2结合位点等来评估抗体阻断配体对HER受体之活化的能力。用于筛选比trastuzumab更有效地抑制配体对HER受体之活化的抗体的测定法记载于Agus等,Cancer Cell2:127-137(2002)和WO01/00245(Adams等)。仅作为例示，可测定以下各项：对HER二聚体形成的抑制(参见例如Agus等,Cancer Cell2:127-137(2002)的附图1A-B和WO01/00245)；表达HER二聚体的细胞中HER配体活化的降低(例如WO01/00245和Agus等,Cancer Cell2:127-137(2002)的附图2A-B)；对HER配体结合表达HER二聚体的细胞的阻断(例如WO01/00245和Agus等,CancerCell 2:127-137(2002)的附图2E)；在存在（或缺乏）HER配体时对表达HER二聚体的癌细胞（例如MCF7、MDA-MD-134、ZR-75-1、MD-MB-175、T-47D细胞）的细胞生长抑制(例如WO01/00245和Agus等,Cancer Cell 2:127-137(2002)的附图3A-D)；对下游信号传导的抑制（例如对HRG依赖性AKT磷酸化的抑制或者对HRG或TGFα依赖性MAPK磷酸化的抑制）(例如WO01/00245和Agus等,Cancer Cell2:127-137(2002)的附图2C-D)。还可通过研究抗体-HER2结合位点来评估抗体是否抑制HER二聚化，例如通过评估与HER2结合的抗体的结构或模型，诸如晶体结构来评估抗体是否抑制HER二聚化(参见例如Franklin等,Cancer Cell5:317-328(2004))。
HER2上的“异二聚体结合位点”指在HER2与EGFR、HER3或HER4形成二聚体时，与EGFR、HER3或HER4胞外结构域中某区域接触或形成介面的HER2胞外结构域中的区域。已发现所述区域在HER2的结构域II中。Franklin等,Cancer Cell5:317-328(2004)。
HER2抗体可以比trastuzumab更有效地（例如功效提高至少2倍）“抑制HRG依赖性AKT磷酸化”和/或抑制“HRG或TGFα依赖性MAPK磷酸化”(参见例如Agus等,Cancer Cell2:127-137(2002)和WO01/00245)。
HER2抗体可以是像Pertuzumab那样“不抑制HER2胞外域切割”的抗体(Molina等,Cancer Res.61:4744-4749(2001))。另一方面，trastuzumab可抑制HER2胞外域切割。
“结合HER2的异二聚体结合位点的”HER2抗体结合结构域II中的残基（任选还结合HER2胞外结构域的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基），且至少在一定程度上可在空间上阻碍HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体的形成。Franklin等,Cancer Cell5:317-328(2004)表征了存放在RCSB蛋白质数据库（ID Code IS78）的HER2-Pertuzumab晶体结构，图解了结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。
“结合HER2的结构域II”的抗体结合结构域II中的残基和任选HER2的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基。优选的是，结合结构域II的抗体结合HER2的结构域I、II和III之间的连接处。
蛋白质“表达”指基因中所编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋白质。
在本文中，“表达”目的蛋白质（诸如HER3和/或HER2）的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA或蛋白质包括其片段的样品或细胞。
“以小于一种癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3”的样品、细胞、肿瘤或癌症指其中HER3表达水平被技术人员认为是该癌症类型的“低HER3水平”的样品、细胞、肿瘤或癌症。一般而言，此类水平会在相对于相同癌症类型的一群样品、细胞、肿瘤、或癌症中HER3水平而言约0至小于约50%的范围内。例如，用于获得所述表达水平中值的群体可以是一般而言的卵巢癌样品，或其亚组，诸如化疗抗性卵巢癌、铂抗性卵巢癌、以及晚期的、顽固性的或复发性的卵巢癌。本文中的实施例证明了如何能测定表达水平中值。这可构成表达绝对值。如此，参照本文中的图17A和17B，以被认为以低水平表达HER3的铂抗性卵巢癌患者的截留(cut off)可以是约2.8或更小（小于第60百分位）；约2.41或更小（小于第55百分位）；约2.28或更小（小于第50百分位）；约1.88或更小（小于第45百分位）；约1.71或更小（小于第40百分位）；约1.57或更小（小于第35百分位）；约1.4或更小（小于第30百分位）；约1.19或更小（小于第25百分位）；约0.99或更小（小于第20百分位）；等。此类绝对值会在规定的测定条件下的测定法中量化，诸如本文中所公开的qRT-PCR，最优选实施例1中的qRT-PCR测定法。优选地，HER3表达水平小于第50百分位，最优选小于第30或第25百分位。
本文中的表述“HER2:HER3”或“HER2对HER3”指样品、细胞、肿瘤或癌症中HER2表达水平相对于HER3表达水平。此类表达水平可使用多种不同技术来量化，诸如本文中所公开的那些。虽然这可以以HER2表达对HER3表达的比来计算，但是本发明涵盖以各种其它方式评估HER2和HER3水平，从而为本文中的疗法选择患者，包括但不限于使用决策树(decision tree)，其中，如果患者的HER2和/或HER3表达高于或低于某截留等，那么选择他们。本文中的短语“HER2:HER3”或“HER2对HER3”涵盖用于比较HER2与HER3的此类各种其它手段。
“以大于一种癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3”的样品、细胞、肿瘤或癌症指其中HER2表达相对于HER3表达的比不是该癌症类型的“低HER2:HER3水平”的样品、细胞、肿瘤或癌症。优选地，此类水平会在相对于相同癌症类型的一群样品、细胞、肿瘤、或癌症中HER2:HER3水平而言大于约25%至约100%的范围内。例如，用于获得所述表达水平的群体可以是一般而言的卵巢癌样品，或其亚组，诸如化疗抗性卵巢癌、铂抗性卵巢癌、以及晚期的、顽固性的或复发性的卵巢癌。本文中的实施例证明了如何能测定百分位表达水平。在一个实施方案中，HER2:HER3水平构成表达绝对值。如此，参照本文中的图29A和29B，以此水平表达HER2:HER3的铂抗性卵巢癌患者的截留可以是约0.82或更大（大于第25百分位）；约0.90或更大（大于第30百分位）；约1.06或更大（大于第35百分位）；约1.13或更大（大于第40百分位）；约1.26或更大（大于第45百分位）；约1.53或更大（大于第50百分位）；约1.70或更大（大于第55百分位）；约1.86或更大（大于第60百分位）；约2.15或更大（大于第65百分位）；约2.49或更大（大于第70百分位）；约2.62或更大（大于第75百分位）；约2.92或更大（大于第80百分位）；等。此类绝对值会在规定的测定条件下的测定法中量化，诸如本文中所公开的qRT-PCR，最优选实施例1中的qRT-PCR测定法。在一个实施方案中，HER2:HER3水平大于第50百分位，优选大于第70百分位，最优选大于第75百分位。其癌症以本文所述水平表达HER2:HER3的患者可过表达或不过表达HER2。
“聚合酶链式反应”或“PCR”技术在用于本文时一般指其中如1987年7月28日公告的美国专利第4,683,195号中所记载的，扩增微量的核酸、RNA和/或DNA特定片段的流程。通常，需要获知目的区域末端或以外的序列信息，从而可设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上将与待扩增模板的相对链相同或相似。两条引物的5’末端核苷酸可与所扩增物质的末端一致。PCR可用于从总基因组DNA和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等扩增特定RNA序列、特定DNA序列。一般参见Mullis等,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.51:263(1987);Erlich ed.,PCR Technology,Stockton Press,NY,1989。在用于本文时，PCR视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应方法的一个但非唯一的例子，包括使用已知核酸（DNA或RNA）作为引物并利用核酸聚合酶来扩增或生成特定核酸片段，或者扩增或生成与特定核酸互补的特定核酸片段。
“定量实时聚合酶链式反应”或“qRT-PCR”指PCR的一种形式，其中在PCR反应的每个步骤测量PCR产物的量。这种技术已经记载于多份出版物，包括Cronin等,Am.J.Pathol.164(1):35-42(2004);Ma等,Cancer Cell.5:607-616(2004)。
术语“微阵列”指可杂交阵列元素，优选多核苷酸探针在基片上的有序排列。
术语“多核苷酸”在以单数或复数使用时一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未经修饰的RNA或DNA或者是经过修饰的RNA或DNA。如此，例如，本文中所定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包含单链区和双链区的DNA、单链和双链RNA、及包含单链区和双链区的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子，它可以是单链的，或者更典型的是双链的，或者包含单链区和双链区。另外，术语“多核苷酸”在用于本文时指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区。此类区中的链可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包含一种或多种分子的整个，但是更典型的是只包含有些分子的一个区。三股螺旋区的分子之一常常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cDNA。该术语包括包含一种或多种经修饰碱基的DNA（包括cDNA）和RNA。如此，主链为稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA也是“多核苷酸”该术语在本文中的意图所在。此外，包含罕见碱基诸如肌苷或经修饰碱基诸如氚化碱基的DNA或RNA也包括在本文中所定义的术语“多核苷酸”内。一般而言，术语“多核苷酸”涵盖未修饰多核苷酸的所有化学、酶学和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞，包括简单和复杂细胞的特征性的DNA和RNA的化学形式。
术语“寡核苷酸”指相对较短的多核苷酸，包括但不限于单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂合物、及双链DNA。寡核苷酸，诸如单链DNA探针寡核苷酸，常常通过化学方法来合成，例如使用商品化的自动化寡核苷酸合成仪。然而，寡核苷酸可通过多种其它方法来制备，包括体外重组DNA介导的技术和通过DNA在细胞和生物体中的表达。
短语“基因扩增”指通过它在特定细胞或细胞系中形成基因或基因片段的多个拷贝的过程。所复制区域（一段扩增的DNA）常常称为“扩增子”。通常，所生成的信使RNA(mRNA)的量也按所表达特定基因生成的拷贝数的比例升高。
杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易地确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于小于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针与可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果，可推出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,1995。
“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，通常：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50%(v/v)甲酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5及750mM氯化钠,75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)采用50%甲酰胺,5x SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH6.8),0.1%焦磷酸钠,5x Denhardt氏溶液,超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml),0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苷，于42℃，及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50%甲酰胺中洗涤，接着于55℃在含EDTA的0.1x SSC中进行高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以如Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,New York,Cold Spring Harbor Press,1989中所述来鉴定，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件（例如温度、离子强度和%SDS）。中等严格条件的例子是于37℃在含20%甲酰胺,5x SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH7.6),5x Denhardt氏溶液,10%硫酸右旋糖苷,和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于大约37-50℃在1x SSC中洗涤滤膜。熟练技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
“天然序列”多肽指与衍生自自然界的多肽（例如HER受体或HER配体）具有相同氨基酸序列的多肽，包括天然存在的或等位变体。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。如此，天然序列多肽可具有天然存在人多肽、鼠多肽、或来自任何其它哺乳动物类物种的多肽的氨基酸序列。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体）、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95%，在一些实施方案中重量超过99%，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。
抗体“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可称作“VH”。轻链的可变域可称作“VL”。这些域一般是抗体中最易变的部分，而且含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应物功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如Abbas等,Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
“裸抗体（裸露的抗体）”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力小于完整结合位点。
Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在成对Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plückthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，1994，第269-315页。本文中的scFv片段明确包括“小分子免疫药物”(SMIP)，诸如指派给Trubion的US2005/0180970A1和US2005/0186216A1中所披露的。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链（VH-VL）中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO1993/01161;Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975);Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版1988);Hammerling等,于:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等,Nature 352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等,Nature362:255-258(1993);Bruggemann等,Year in Immuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5,661,016;Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg等,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567;Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。
非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
人源化HER2抗体包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或trastuzumab
Figure BDA0000374590340000351
如美国专利第5,821,337号表3中所记载的，明确收入本文作为参考；人源化520C9(WO 93/21319)；及人源化2C4抗体，诸如pertuzamab，如本文所述。
为了本发明的目的，“trastuzumab”、和“huMAb4D5-8”指包含分别在SEQ ID No.15和16中示出的轻链和重链氨基酸序列的抗体。
在本文中，“Pertuzumab”和“OMNITARGTM”指包含分别在SEQ ID No.13和14中示出的轻链和重链氨基酸序列的抗体。
trastuzumab与Pertuzumab之间的功能差异示于图6。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole等,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner等,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
“框架”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的HVR残基以外的残基。
术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等,见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入（依照Kabat为残基52a）及重链FR残基82后的插入残基（例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等）。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
贯穿本说明书和权利要求书，Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基（大约是轻链残基1-107和重链残基1-113）时使用(例如Kabat等,Sequencesof Immunological Interest.5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。
“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用（例如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中报道的EU索引，明确收入本文作为参考）。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临时申请No.60/640,323,EU编号方式的图)。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些规程来生成。例如Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：例如Barbas等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994);Schier等,Gene169:147-155(1995);Yelton等,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至C末端的区段。Fc区的C末端赖氨酸（残基447，根据EU编号系统）可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程。因此，完整抗体组合物可包括消除了所有K447残基的抗体群体、没有消除K447残基的抗体群体、或者混合了有和没有K447残基的抗体的抗体群体。
除非另有说明，本文中免疫球蛋白重链中残基的编号是如Kabat等,见上文中的EU索引的编号。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面受体（例如B细胞受体；BCR）下调等。此类效应器功能通常要求Fc区与结合域（例如抗体可变域）联合，而且可使用多种已公开的（例如在本文中的定义中）测定法来评估。
“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区（非A和A同种异型）、天然序列人IgG2Fc区、天然序列人IgG3Fc区、及天然序列人IgG4Fc区，及其天然存在变体。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰，优选一处或多处氨基酸替代而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区具有与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%的同源性，更优选至少约90%的同源性，最优选至少约95%的同源性。
“Fc受体”和“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR（γ受体），包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA（“活化受体”）和FcγRIIB（“抑制受体”），它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如
Figure BDA0000374590340000381
,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见例如Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel等,Immunomethods4:25-34(1994);de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))和调节免疫球蛋白的动态平衡。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie和Ward,Immunol Today18(12):592-598(1997);Ghetie等,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997);Hinton等,J.Biol.Chem279(8):6213-6216(2004);及WO2004/92219(Hinton等))。
可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO2000/42072(Presta)记载了对FcR的结合得到改良或消除的抗体变体。还可参见例如Shields等J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞（例如NK细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞）上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体（适宜亚类的）起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列（具有变异Fc区的多肽）及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551B1和WO 1999/51642。还可参见例如Idusogie等,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
“含Fc区抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸（依照EU编号系统的残基447）可以消除，例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编码抗体的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有与没有K447残基的抗体的混合物。
术语“主要种类抗体”在本文中指组合物中作为数量上主要抗体分子的抗体结构。在一个实施方案中，主要种类抗体是HER2抗体，诸如结合HER2的结构域II的抗体、比Trastuzumab更有效的抑制HER二聚化的抗体、和/或结合HER2的异二聚体结合位点的抗体。本文中主要种类抗体的优选实施方案是包含SEQ ID No.3和4中的轻链和重链可变区氨基酸序列，最优选包含SEQID No.13和14中的轻链和重链氨基酸序列的抗体（Pertuzumab）。
“氨基酸序列变体”抗体在本文中指具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少约70%的同源性，而且优选的是，它们将是与主要种类抗体至少约80%，更优选至少约90%同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体氨基酸序列内部或邻近的某些位置具有替代、删除和/或添加。本文中氨基酸序列变体的例子包括酸性变体（例如脱酰胺抗体变体）、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基末端前导延伸（例如VHS-）的抗体、在其一条或两条重链上具有C-末端赖氨酸残基的抗体、等，且包括重链和/或轻链氨基酸序列变异的组合。本文中特别感兴趣的抗体变体是在其一条或两条轻链上包含氨基末端前导延伸的抗体，任选相对于主要种类抗体还包含其它氨基酸序列和/或糖基化差异。
“糖基化变体”抗体在本文中指附着有一种或多种碳水化合物模块且所述碳水化合物与附着于主要种类抗体的一种或多种碳水化合物模块不同的抗体。本文中糖基化变体的例子包括其Fc区附着有G1或G2寡糖结构代替G0寡糖结构的抗体、其一条或两条轻链附着有一种或两种碳水化合物模块的抗体、其一条或两条重链没有附着碳水化合物模块的抗体、等，及糖基化改变的组合。
若抗体具有Fc区，则抗体的一条或两条重链，例如残基299处（298，Eu残基编号）可附着有寡糖结构。对于Pertuzumab，G0是主要的寡糖结构，而在Pertuzumab组合物中找到的其它寡糖结构诸如G0-F、G-1、Man5、Man6、G1-1、G1(1-6)、G1(1-3)和G2的量较少。
除非另有说明，“G1寡糖结构”在本文中包括G1、G1-1、G1(1-6)和G1(1-3)结构。
“氨基末端前导延伸”在本文中指在抗体的任何一条或多条重链或轻链的氨基末端存在的氨基末端前导序列的一个或多个氨基酸残基。例示性的氨基末端前导延伸包含三个氨基酸残基，VHS或由其组成，它们存在于抗体变体的一条或所有两条轻链上。
“脱酰胺”抗体指其中一个或多个天冬酰胺残基衍生成例如天冬氨酸、琥珀酰亚胺或异天冬氨酸的抗体。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。本文中的“癌症类型”指癌症的一个特定类别或适应症。此类癌症类型的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤（包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤）、肉瘤（包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤）、神经内分泌肿瘤（包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌）、间皮瘤、施旺氏细胞瘤（包括听神经瘤）、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌（例如上皮鳞状细胞癌）、肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer,hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌（包括转移性乳腺癌）、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤、及头和颈癌，以及任何此类癌症的亚类，包括但不限于其化疗抗性的、铂抗性的、晚期的、顽固性的、和/或复发性的类型。
“能够响应HER抑制剂的癌症类型”指依照熟练肿瘤学家知道的治疗任何有效性标准，包括本文中详述的那些，特别是在存活方面，包括无进展存活(PFS)和/或总体存活(OS)，在用HER抑制剂（诸如HER2抗体或小分子抑制剂）治疗时在患者中显示出治疗有效益处的癌症类型。优选地，此类癌症选自卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、转移性乳腺癌(MBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、和结肠直肠癌。最优选地，所述癌症是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌，包括此类癌症的铂抗性形式，以及晚期的、顽固性的或复发性的卵巢癌。
“能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型”指依照熟练肿瘤学家知道的治疗任何有效性标准，包括本文中详述的那些，特别是在存活方面，包括无进展存活(PFS)和/或总体存活(OS)，在用HER二聚化抑制剂（诸如Pertuzumab）治疗时在患者中显示出治疗有效益处的癌症类型。优选地，此类癌症选自卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、转移性乳腺癌(MBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、和结肠直肠癌。最优选地，所述癌症是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌，包括此类癌症的铂抗性形式，以及晚期的、顽固性的或复发性的卵巢癌。
“有效响应”和类似用语指比来自不以期望水平表达HER3的患者的响应显著高于对HER二聚化抑制剂、HER抑制剂或化疗剂的响应。
“晚期”(advanced)癌症指通过局部侵入或转移而扩散到最初的部位或器官之外的癌症。
“顽固性”或“不应性”(refractory)癌症指即使对患者施用抗肿瘤剂，诸如化疗剂，仍然发生进展的癌症。顽固性癌症的一个例子是铂抗性癌症。
“复发性”(recurrent)癌症指在对初始治疗的响应之后，在初始部位或远端部位再次生长的癌症。
在本文中，“患者”指人患者。所述患者可以是“癌症患者”，即患有或有风险患上癌症的一种或多种症状的患者。
“肿瘤样品”在本文中指衍生自患者肿瘤或包含来自患者肿瘤的肿瘤细胞的样品。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、循环中的肿瘤细胞、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
“固定的”肿瘤样品指已经使用固定剂以组织学方法保存的肿瘤样品。
“福尔马林固定的”肿瘤样品指已经使用甲醛作为固定剂保存的肿瘤样品。
“包埋的”肿瘤样品指用坚固的且通常是硬的介质诸如石蜡、蜡、火棉或树脂包围的肿瘤样品。包埋使得有可能切出薄片供显微镜检查或生成组织微阵列(TMA)。
“石蜡包埋的”肿瘤样品指用衍生自石油的固体碳氢化合物的纯化混合物包围的肿瘤样品。
在本文中，“冷冻的”肿瘤样品指冷冻的或冷冻过的肿瘤样品。
“展示出HER表达、扩增或活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中表达（包括过表达）HER受体，具有扩增的HER基因，和/或以其它方式展现出HER受体活化或磷酸化的癌或生物学样品。
“HER受体过表达或扩增”的癌细胞指与同一组织类型的非癌细胞相比，具有显著更高水平的HER受体蛋白质或基因的癌细胞。此类过表达可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的HER蛋白质水平的升高（例如通过免疫组化测定法；IHC）来测定HER受体的过表达或扩增。或者/另外，可测量细胞中编码HER的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH;参见1998年10月公布的WO98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。还可通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原（例如HER胞外结构域）来研究HER受体过表达或扩增(参见例如1990年6月12日公告的美国专利第4,933,294号;1991年4月18日公布的WO 91/05264;1995年3月28日公告的美国专利第5,401,638号;Sias等,J.Immunol.Methods132:73-80(1990))。在上述测定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估该抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活检样品进行检测。
相反，“HER受体不过表达或扩增”的癌症指与同一组织类型的非癌细胞相比，没有高于正常水平的HER受体蛋白质或基因的癌症。抑制HER二聚化的抗体，诸如Pertuzumab，可用于治疗不过表达或扩增HER2受体的癌症。
在本文中，“抗肿瘤剂”指用于治疗癌症的药物。本文中的抗肿瘤剂的非限制性例子包括化疗剂、HER抑制剂、HER二聚化抑制剂、HER抗体、针对肿瘤相关抗原的抗体、抗激素化合物、细胞因子、EGFR靶向药物、抗血管发生剂、酪氨酸激酶抑制剂、生长抑制剂和生长抑制性抗体、细胞毒剂、诱发凋亡的抗体、COX抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、结合癌胚蛋白CA125的抗体、HER2疫苗、Raf或ras抑制剂、多柔比星脂质体、托泊替康、紫杉烷(taxane)、双重酪氨酸激酶抑制剂、TLK286、EMD-7200、Pertuzumab、trastuzumab、erlotinib、和bevacizumab。
“已批准的抗肿瘤剂”指已经得到管理机构诸如食品和药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)或其相当的外国机构的上市批准，用于治疗癌症的药物。
若HER抑制剂或HER二聚化抑制剂作为“单一抗肿瘤剂”施用，则它是唯一施用来治疗癌症的抗肿瘤剂，即它不与另一抗肿瘤剂诸如化疗联合施用。
“标准治疗”(standard of care)在本文中意指常规用来治疗特定形式的癌症的一种或多种抗肿瘤剂。例如，对于铂抗性卵巢癌，标准治疗是托泊替康或多柔比星脂质体。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达HER的癌细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达HER的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)（长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见TheMolecular Basis of Cancer,Mendelsohn和Israel编,章1,题为“Cell cycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”,Murakami等,WB Saunders,Philadelphia,1995,尤其是第13页。
“生长抑制性”抗体的例子是那些结合HER2并抑制过表达HER2的癌细胞生长的抗体。优选的生长抑制性HER2抗体在约0.5-30μg/ml的抗体浓度对细胞培养物中SK-BR-3乳腺肿瘤细胞的生长抑制超过20%，优选超过50%（例如约50%至约100%），其中生长抑制是在SK-BR-3细胞暴露于抗体后6天测定的(参见1997年10月14日公告的美国专利第5,677,171号)。该专利及下文中更详细的描述了SK-BR-3细胞生长抑制测定法。优选的生长抑制性抗体是鼠单克隆抗体4D5的人源化变体，例如trastuzumab。
“诱导凋亡”的抗体指根据膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊（称作凋亡小体）形成的测定，诱导程序性细胞死亡的抗体。所述细胞通常是过表达HER2受体的细胞。优选的是，所述细胞是肿瘤细胞，例如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰或膀胱肿瘤细胞。在体外，所述细胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu3细胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。有多种方法可用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；及可通过亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是，诱导凋亡的抗体是在使用BT474细胞的膜联蛋白结合测定法（见下文）中导致对膜联蛋白的结合相对于未处理细胞诱导约2至50倍，优选约5至50倍，最优选约10至50倍的抗体。诱导凋亡的HER2抗体的例子有7C2和7F3。
“表位2C4”指HER2的胞外结构域中抗体2C4所结合的区域。为了筛选结合2C4表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane,1988中所记载的。优选的是，所述抗体将2C4对HER2的结合阻断约50%或更多。或者，可进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的2C4表位。表位2C4包含来自HER2胞外结构域中结构域II的残基。2C4和Pertuzumab在结构域I、II和III的连接处结合HER2的胞外结构域。Franklin等,Cancer Cell5:317-328(2004)。
“表位4D5”指HER2的胞外结构域中抗体4D5（ATCC CRL10463）和trastuzumab所结合的区域。此表位接近HER2的跨膜结构域，且在HER2的结构域IV内。为了筛选结合4D5表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,EdHarlow和David Lane,1988中所记载的。或者，可进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的4D5表位（例如HER2ECD的大约第529位残基至大约第625位残基区域（含两端点）内的任何一个或多个残基，残基编号包括信号肽）。
“表位7C2/7F3”指HER2的胞外结构域的结构域I内N末端处7C2和/或7F3抗体（各自保藏于ATCC，见下文）所结合的区域。为了筛选结合7C2/7F3表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane,1988中所记载的。或者，可进行表位作图以确定抗体是否结合HER2上的7C2/7F3表位（例如HER2ECD的大约第22位残基至大约第53位残基区域内的任何一个或多个残基，残基编号包括信号肽）。
“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处置和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有癌症的以及那些要预防癌症的。因此，本文中待治疗的患者可能已经诊断为患有癌症或者可能有患上癌症的倾向性或易感性。
术语“治疗有效量”或“有效量”指在患者中有效治疗癌症的药物量。有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制（即一定程度的减缓和优选阻止）癌细胞浸润到周围器官中；抑制（即一定程度的减缓和优选阻止）肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与癌症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的（细胞毒性的）。有效量可延长无进展存活（例如根据实体瘤的响应评估标准(Response EvaluationCriteria for Solid Tumors,RECIST)或CA-125变化的测量），导致客观响应（包括部分响应，PR或完全响应，CR），改善存活（包括总体存活和无进展存活），和/或改善癌症的一种或多种症状（例如根据FOSI的评估）。最优选地，所述药物的治疗有效量有效改善无进展存活(PFS)和/或总体存活(OS)。
“存活”(survival)指患者保持存活，包括总体存活(overall survival)和无进展存活(progress free survival)。
“总体存活”指保持一定时期诸如1年、5年等存活的患者，自诊断或治疗时起计算。
“无进展存活”指保持存活且癌症没有进展或恶化的患者。
“延长存活”意味着使接受治疗的患者的总体存活或无进展存活相对于未接受治疗的患者（即相对于未用HER抑制剂、HER二聚化抑制剂诸如Pertuzumab治疗的患者）或者不以期望水平表达HER3或HER2:HER3的患者，和/或相对于用已获批准的抗肿瘤剂（诸如托泊替康或多柔比星脂质体，在癌症是卵巢癌时）治疗的患者有延长。
“客观响应”(objective response)指可测量的响应，包括完全响应(CR)或部分响应(PR)。
“完全响应”(complete response)或“CR”指癌症的所有体征响应治疗而消失。这并不总是意味着癌症已经治愈。
“部分响应”(partial response)或“PR”指一处或多处肿瘤或损害的大小或体内癌症的程度响应治疗而减小。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素）、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)
Figure BDA0000374590340000471
磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)（屈大麻酚(dronabinol),）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11（伊立替康(irinotecan)，）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou等,Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括
Figure BDA0000374590340000481
吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂
Figure BDA0000374590340000482
脂质体多柔比星TLC D-99
Figure BDA0000374590340000483
PEG化脂质体多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0000374590340000485
替加氟(tegafur)
Figure BDA0000374590340000486
卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA0000374590340000487
埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物类，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物类，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物类，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他塞(paclitaxel)
Figure BDA0000374590340000492
帕利他塞的清蛋白改造纳米颗粒剂型(ABRAXANETM)和多西他塞(docetaxel)
Figure BDA0000374590340000493
）；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂类，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)，它们阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)
Figure BDA0000374590340000494
长春新碱(vincristine)
Figure BDA0000374590340000495
长春地辛(vindesine)
Figure BDA0000374590340000497
和长春瑞滨(vinorelbine)
Figure BDA0000374590340000498
依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)
Figure BDA0000374590340000499
二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例或
Figure BDA00003745903400004911
依替膦酸盐(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)
Figure BDA0000374590340000502
帕米膦酸盐(pamidronate)
Figure BDA0000374590340000503
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA0000374590340000504
或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA0000374590340000505
曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸类，特别是那些抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗类，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如
Figure BDA0000374590340000507
疫苗、
Figure BDA0000374590340000508
疫苗和
Figure BDA0000374590340000509
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如
Figure BDA00003745903400005010
rmRH(例如
Figure BDA00003745903400005011
BAY439006(sorafenib;Bayer)；SU-11248(Pfizer)；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂（例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)）、蛋白体抑制剂（例如PS341）；bortezomib
Figure BDA00003745903400005012
CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib；ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如哈眠那(oblimersen sodium)
Figure BDA00003745903400005013
pixantrone；EGFR抑制剂（参见下文定义）；酪氨酸激酶抑制剂（参见下文定义）；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。
在本文中，化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)
Figure BDA00003745903400005014
艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)
Figure BDA00003745903400005015
曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌激素类，诸如氟维司群(fulvestrant)和EM800（此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平）；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)
Figure BDA00003745903400005017
和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrozole)
Figure BDA00003745903400005018
来曲唑(letrozole)
Figure BDA00003745903400005019
和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)
Figure BDA0000374590340000512
法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide)和
Figure BDA0000374590340000514
戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类(progestine)，诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)，雌激素类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。
“抗代谢物类化疗剂”指在结构上与代谢物相似但不能被身体以生产性方式利用的药剂。许多抗代谢物类化疗剂干扰核酸，RNA和DNA的生成。抗代谢物类化疗剂的例子包括吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0000374590340000515
5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)(XELODATM)、6-巯基嘌呤、甲氨喋呤(methotrexate)、6-硫鸟嘌呤、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine ARA-C cytarabine)
Figure BDA0000374590340000516
达卡巴嗪(dacarbazine)偶氮胞嘧啶(azocytosine)、脱氧胞嘧啶(deoxycytosine)、pyridmidene、氟达拉滨(fludarabine)
Figure BDA0000374590340000518
克拉屈滨(cladrabine)、2-脱氧-D-葡萄糖等。优选的抗代谢物类化疗剂是吉西他滨。
“吉西他滨”或“2′-脱氧-2′,2′-二氟胞苷单盐酸（b-异构体）”是展现出抗肿瘤活性的核苷类似物。盐酸吉西他滨的经验式是C9H11F2N3O4·HCl。盐酸吉西他滨由Eli Lilly以商标销售。
“基于铂的化疗剂”包括包含铂作为分子的主要部分的有机化合物。基于铂的化疗剂的例子包括卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatinum)。
“基于铂的化疗法”指使用一种或多种基于铂的化疗剂的疗法，任选联合一种或多种其它化疗剂。
“化疗法耐受性”癌症指癌症患者在接受化疗方案时（癌症）有进展（即患者是“化疗不应性”的），或者患者在完成化疗方案后12个月内（例如6个月内）（癌症）有进展。
“铂抗性”癌症指癌症患者在接受基于铂的化疗法时（癌症）有进展（即患者是“铂不应性”的），或者患者在完成基于铂的化疗方案后12个月内（例如6个月内）（癌症）有进展。
“抗血管发生剂”指阻断或一定程度的干扰血管发育的化合物。抗血管发生因子可以是例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。在本文中优选的抗血管发生因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如bevacizumab
Figure BDA0000374590340000521
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
在用于本文时，术语“EGFR靶向药物”指结合EGFR并任选抑制EGFR活化的治疗剂。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB8506）、MAb 455(ATCC CRLHB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利第4,943,533号,Mendelsohn等)及其变体，诸如嵌合化225(C225或Cetuximab;
Figure BDA0000374590340000522
和重构人225(H225)(参见WO 96/40210,ImcloneSystems Inc.)；IMC-11F8，一种完全人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利第5,212,290号)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利第5,891,996号中所记载的；及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见WO 98/50433,Abgenix)；EMD 55900(Stragliotto等,Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD 7200(matuzumab)，一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，其与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合；及mAb 806或人源化mAb806(Johns等,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可偶联细胞毒剂，如此产生免疫偶联物(参见例如EP659,439A2,Merck PatentGmbH)。结合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM;AstraZeneca)；CP-358774或Erlotinib(TARCEVATM;Genentech/OSI)；和AG1478、AG1571(SU5271;Sugen)；EMD-7200。
“酪氨酸激酶抑制剂”指抑制酪氨酸激酶诸如HER受体的酪氨酸激酶活性的分子。此类抑制剂的例子包括上一段中提到的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从Takeda购买的TAK165；CP-724,714，一种口服的ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR二者过表达细胞的双重HER抑制剂，诸如EKB-569(可从Wyeth购买)；GW572016(可从Glaxo购买)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis购买)；泛(pan)HER抑制剂，诸如canertinib(CI-1033;Pharmacia)；Raf-1抑制剂，诸如可从ISIS Pharmaceuticals购买、抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132；非HER靶向TK抑制剂，诸如可从Glaxo购买的Imatinib mesylate(GLEEVACTM)；MAPK胞外调控激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia购买)；喹唑啉类，诸如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶；姜黄素（二阿魏酰甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)-酞亚胺）；含硝基噻吩模块的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lambert)；反义分子（例如那些结合HER编码核酸的）；喹喔啉类(美国专利第5,804,396号)；tryphostins(美国专利第5,804,396号)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制剂，诸如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS3521;Isis/Lilly)；Imatinib mesylate(Gleevac;Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或任何以下专利出版物中所记载的：美国专利第5,804,396号;WO 99/09016(American Cyanimid);WO98/43960(American Cyanamid);WO 97/38983(Warner Lambert);WO99/06378(Warner Lambert);WO 99/06396(Warner Lambert);WO 96/30347(Pfizer,Inc.);WO 96/33978(Zeneca);WO 96/3397(Zeneca);WO 96/33980(Zeneca)。
本文中，化疗剂的“固定的”(fixed)或“不变的”(flat)剂量指不考虑患者的体重(WT)和体表面积(BSA)而施用于人类患者的剂量。因此，固定的或不变的剂量不是作为mg/kg剂量或mg/m2剂量提供的，而是作为治疗剂的绝对量提供的。
“加载”(loading)剂量在本文中一般包括施用于患者的治疗剂的初始剂量，后续其一个或多个维持剂量。一般而言，施用单个加载剂量，但本文中也设想了多个加载剂量。通常，所施用的加载剂量的量超过所施用的维持剂量的量，和/或加载剂量的施用比维持剂量更频繁，从而比使用维持剂量更早达到化疗剂的期望稳态浓度。
“维持”(maintenance)剂量在本文中指在治疗期间施用于患者的一个或多个剂量的治疗剂。通常，维持剂量以一定的治疗间隔施用，例如大约每周一次，大约每两周一次，大约每三周一次，或大约每四周一次。
“药物”指用于治疗癌症的活性药物，诸如HER抑制剂、HER二聚化抑制剂（诸如Pertuzumab）或化疗剂（诸如吉西他滨）。
“目标受众(target audience)”指接受如通过推销或做广告（尤其为了特定用途、治疗、或适应症）进行的特定药物宣传或即将进行的特定药物宣传的人群或机构，诸如患者个体，患者群体，报纸、医学文献、和杂志读者，电视或因特网观众，无线电或因特网听众，内科医生，药品公司等。
“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它治疗用产品和/或警告等的信息。
II.抗体的生成
由于在优选的实施方案中，HER抑制剂是抗体，下文描述了用于生成依照本发明使用的HER抗体的例示性技术。用于生成抗体的HER抗原可以是例如可溶形式的HER受体胞外结构域或其包含期望表位的部分。或者，在其细胞表面表达HER的细胞（例如经转化而过表达HER2的NIH-3T3细胞；或癌细胞系，诸如SK-BR-3细胞，参见Stancovski等,PNAS(USA)88:8691-8695(1991)）可用于生成抗体。可用于生成抗体的其它形式HER受体对于本领域技术人员将是显而易见的。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯（通过半胱氨酸残基偶联）、N-羟基琥珀酰亚胺（通过赖氨酸残基）、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N=C=NR（其中R和R1是不同的烃基），将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物（分别用于兔或小鼠）与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
本领域有多种方法可用于制备本文中的单克隆抗体。例如，单克隆抗体可使用最初由Kohler等,Nature256:495(1975)记载的杂交瘤方法、通过重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制备。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,Rockville,Maryland,USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生成人单克隆抗体也已有记载(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序（例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)及Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等,Nature 348:552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等,Nature 352:624-628(1991)及Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nuc.Acids Res.21:2265-2266(1993))，生成高亲和力（nM范围）的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利第4,816,567号;Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价接合。
典型的是，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体
本领域已经记载了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型的取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等,Nature321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988)），通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中本质上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia等,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992);Presta等,J.Immunol.151:2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
WO01/00245记载了结合HER2并阻断配体对HER受体之活化的例示性人源化HER2抗体的生成。本文中特别感兴趣的人源化抗体基本上像鼠单克隆抗体2C4（或其Fab片段）一样有效的阻断EGF、TGF-α和/或HRG介导的MAPK激活，和/或基本上像鼠单克隆抗体2C4（或其Fab片段）一样有效的结合HER2。本文中的人源化抗体可例如包含掺入人重链可变域的非人高变区残基，而且还可在选自69H、71H和73H的位置包含框架区(FR)替代，采用的是Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中列出的可变域编号系统。在一个实施方案中，人源化抗体在69H、71H和73H的两个或所有位置包含FR替代。
本文中感兴趣的例示性人源化抗体包含重链可变域互补决定残基GFTFTDYTMX，其中X优选是D或S（SEQ ID NO:7）；DVNPNSGGSIYNQRFKG（SEQ ID NO:8）；和/或NLGPSFYFDY（SEQ ID NO:9），任选包含那些CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰基本上保持或改善抗体的亲和力。例如，目的抗体变体可在上述重链可变域CDR序列中具有约1处至约7处或者约5处氨基酸替代。此类抗体变体可通过亲和力成熟来制备，例如如下文所述。最优选的人源化抗体包含SEQ ID NO:4中的重链可变域氨基酸序列。
例如，在前一段中的那些重链可变域CDR残基之外，人源化抗体还可包含轻链可变域互补决定残基KASQDVSIGVA（SEQ ID NO:10）；SASYX1X2X3，其中X1优选是R或L，X2优选是Y或E，而X3优选是T或S（SEQID NO:11）；和/或QQYYIYPYT（SEQ ID NO:12）。此类人源化抗体任选包含上述CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰基本上保持或改善抗体的亲和力。例如，目的抗体变体可在上述轻链可变域CDR序列中具有约1处至约7处或者约5处氨基酸替代。此类抗体变体可通过亲和力成熟来制备，例如如下文所述。最优选的人源化抗体包含SEQ ID NO:3中的轻链可变域氨基酸序列。
本申请还设想了亲和力成熟的抗体，它结合HER2并阻断配体对HER受体之活化。亲本抗体可以是人抗体或人源化抗体，例如所含轻链可变域和/或重链可变域序列分别为SEQ ID NO:3和4（即包含Pertuzumab的VL和/或VH）的抗体。亲和力成熟的抗体优选以优于鼠2C4或Pertuzumab的亲和力结合HER2受体（例如根据使用HER2胞外结构域(ECD)ELISA的评估，例如亲和力提高约2倍或约4倍至约100倍或约1000倍）。例示性的用于替代的重链可变域CDR残基包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99，或者上述残基的两个或多个的组合（例如这些残基中的2个、3个、4个、5个、6个或7个的组合）。用于改变的轻链可变域CDR残基的例子包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97，或者上述残基的两个或多个的组合（例如这些残基中的2个至3个、4个、5个或直到约10个的组合）。
设想了各种形式的人源化抗体或亲和力成熟的抗体。例如，人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是抗体片段，诸如Fab，它任选与一种或多种细胞毒剂偶联以产生免疫偶联物。或者，人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是完整抗体，诸如完整的IgG1抗体。优选的完整IgG1抗体包含SEQ ID NO:13中的轻链序列和SEQ ID NO:14中的重链序列。
(iv)人抗体
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物（例如小鼠）。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等,Nature362:255-258(1993);Bruggermann等,Year in Immuno.7:33(1993);及美国专利第5,591,669号、第5,589,369号和第5,545,807号。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等,Nature352:624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到大量不同的抗口恶唑酮抗体。可本质上遵循Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等,EMBO J.12:725-734(1993)所记载的技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原（包括自身抗原）的抗体。还可参见美国专利第5,565,332号和第5,573,905号。
如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号)。
1998年6月30日公告的美国专利第5,772,997号和1997年1月3日公布的WO 97/00271中记载了人HER2抗体。
(v)抗体片段
已经开发了用于生成包含一个或多个抗原结合区的抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992);Brennan等,Science229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利第5,571,894号;美国专利第5,587,458号。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利第5,641,870号中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体指具有对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合HER2蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体可将HER2结合位点与EGFR、HER3和/或HER4的结合位点组合在一起。或者，可将HER2臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子（例如CD2或CD3）或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合在一起，使得细胞防御机制聚焦于表达HER2的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达HER2的细胞。这些抗体拥有HER2结合臂和结合细胞毒剂（例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨喋呤或放射性同位素半抗原）的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段（例如F(ab′)2双特异性抗体）。
WO 96/16673记载了一种双特异性HER2/FcγRIII抗体，美国专利第5,837,234号披露了一种双特异性HER2/FcγRI抗体IDM1(Osidem)。WO98/02463显示了一种双特异性HER2/Fcα抗体。美国专利第5,821,337号教授了一种双特异性HER2/CD3抗体。MDX-210是一种双特异性HER2/FcγRIII抗体。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等,Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤（四源杂交瘤(quadroma)）生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker等,EMBO J.10:3655-3659(1991)中披露了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性（抗体-抗原结合位点）的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是，在至少一种融合物中，第一重链恒定区(CH1)包含轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和（如果需要）免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对（提供第二结合特异性）构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methodsin Enzymology 121:210(1986)。
依照美国专利第5,731,168号中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域的CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起披露于美国专利第4,676,980号。
文献中还记载了自抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的流程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)记载了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子。每个Fab′片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶胞活性。
还记载了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
(vii)其它氨基酸序列修饰
设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有期望的特性，可进行删除、插入和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989)所记载的。这里，鉴定了一个残基或一组靶残基（例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸），并用中性或带负电荷的氨基酸（最优选丙氨酸或聚丙氨酸）替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在给定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机诱变，并对所表达的抗体变体筛选期望活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶（例如用于ADEPT）或提高抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也设想了FR改变。保守替代在表1中显示在标题“优选替代”下。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入表1中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。
表1
原始残基 例示替代 优选替代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Asp;Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu;Asn Glu
Cys(C) Ser;Ala Ser
Gln(Q) Asn;Glu Asn
Glu(E) Asp;Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val;Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 Leu
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger,in:Biochemistry,2nd ed.,pp.73-75,Worth Publishers,New York,1975)：
(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，基于共同的侧链特性，可将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
任何不涉及保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性（特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时）。
特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改良的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点（例如6-7个位点）突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性（例如结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与人HER2之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，就如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸序列变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸（其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸）是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成（用于N-连接的糖基化位点）。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行（用于O-连接的糖基化位点）。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请US 2003/0157108 A1(Presta,L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621 A1(Kyowa HakkoKogyo Co.,Ltd.)。WO 03/011878(Jean-Mairet等)和美国专利第6,602,684号(Umana等)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 97/30087(Patel等)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 98/58964(Raju,S.)和WO 99/22764(Raju,S.)。
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改进的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等,Cancer Research53:2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶胞和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-Cancer DrugDesign3:219-230(1989)。
WO 00/42072(Presta,L.)记载了在存在人效应细胞时具有改进的ADCC功能的抗体，其中所述抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。优选的是，具有改进的ADCC的抗体在Fc区的位置298、333和/或334（Eu残基编号）包含替代。优选的是，改变的Fc区是在这些位置中的一个、两个或三个处包含替代或由其组成的人IgG1 Fc区。任选将此类替代与一处或多处增加C1q结合和/或CDC的替代结合起来。
WO 99/51642、美国专利第6,194,551B1号、美国专利第6,242,195B1号、美国专利第6,528,624 B1号和美国专利第6,538,124号(Idusogie等)中记载了具有改变的C1q结合和/和补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。所述抗体在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334（Eu残基编号）中的一个或多个处包含氨基酸替代。
为了延长抗体的血清半衰期，可将补救受体结合表位掺入抗体（尤其是抗体片段），如例如美国专利第5,739,277号中所记载的。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子（例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
WO 00/42072(Presta,L.)和US2005/0014934A1(Hinton等)中记载了具有改进的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一处或多处改进Fc区对FcRn结合的替代的Fc区。例如，Fc区可在一个或多个以下位置具有替代：238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428或434（Eu残基编号）。优选的具有改进的FcRn结合的含Fc区抗体变体在其Fc区的位置307、380和434（Eu残基编号）中的一个、两个或三个处包含氨基酸替代。
还设想了具有三个或更多（优选四个）功能性抗原结合位点的工程改造抗体(美国申请号US 2002/0004587 A1,Miller等)。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离（在天然存在氨基酸序列变体的情况中），或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
(viii)筛选具有期望特性的抗体
上文已经描述了用于生成抗体的技术。如果需要，可以进一步选择具有某些生物学特性的抗体。
为了鉴定阻断配体对HER受体之活化的抗体，可测定抗体阻断HER配体结合表达HER受体（例如连同另一种HER受体，该HER受体与目的HER受体形成HER异寡聚体）的细胞的能力。例如，可将天然表达或者经转染而表达HER异寡聚体的HER受体的细胞与抗体一起温育，然后暴露于经标记的HER配体。然后可评估抗体阻断配体结合HER异寡聚体中的HER受体的能力。
例如，可以以24孔板的形式在冰上使用单层MCF7培养物进行HER2抗体对HRG结合MCF7乳腺肿瘤细胞系的抑制，基本上如WO 01/00245中所记载的。可将HER2单克隆抗体添加到每个孔中并温育30分钟。然后可加入125I标记的rHRGβ1177-224（25pm），并可继续温育4-16小时。可绘制剂量-应答曲线，并可计算目的抗体的IC50值。在一个实施方案中，阻断配体对HER受体之活化的抗体在此测定法中抑制HRG结合MCF7细胞的IC50为约50nM或更低，更优选10nM或更低。若抗体是抗体片段诸如Fab片段，则在此测定法中抑制HRG结合MCF7细胞的IC50可以是例如约100nM或更低，更优选50nM或更低。
或者/另外，可评估抗体阻断HER异寡聚体中存在的HER受体的HER配体刺激的酪氨酸磷酸化的能力。例如，可将内源表达或者经转染而表达HER受体的细胞与抗体一起温育，然后使用抗磷酸酪氨酸单克隆（任选偶联有可检测标记物）测定HER配体依赖性酪氨酸磷酸化活性。美国专利第5,766,863号中记载的激酶受体活化测定法也可用于测定HER受体活化和抗体对该活性的阻断。
在一个实施方案中，可以筛选在MCF7细胞中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抗体，基本上如WO 01/00245中所记载的。例如，可将MCF7细胞分配到24孔板中，并将HER2的单克隆抗体加入每个孔中，于室温温育30分钟；然后可向每个孔中加入rHRGβ1177-244至终浓度0.2nM，并可继续温育8分钟。从每个孔中吸走培养基，通过加入100μl SDS样品缓冲液（5%SDS,25mMDTT,25mM Tris-HCl,pH6.8）来终止反应。可在4-12%梯度凝胶(Novex)上对每一份样品（25μl）进行电泳，然后通过电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。可对抗磷酸酪氨酸（以1μg/ml）免疫印迹显影，并通过反射密度法(reflectancedensitometry)对分子量约180,000的主要反应性条带的强度定量。在此测定法中，所选抗体优选将HRG刺激p180酪氨酸磷酸化显著抑制至对照的大约0-35%。可绘制通过反射密度法测定的对HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抑制作用的剂量-应答曲线，并可计算目的抗体的IC50。在一个实施方案中，阻断配体对HER受体之活化的抗体在此测定法中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的IC50为约50nM或更低，更优选10nM或更低。若抗体是抗体片段诸如Fab片段，则在此测定法中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的IC50可以是例如约100nM或更低，更优选50nM或更低。
还可评估抗体对MDA-MB-175细胞的生长抑制效果，例如基本上如Schaefer等,Oncogene 15:1385-1394(1997)中所记载的。依照此测定法，可将MDA-MB-175细胞用HER2单克隆抗体（10μg/mL）处理4天，并用结晶紫染色。与HER2抗体的温育对此细胞系显示的生长抑制效果可能与使用单克隆抗体2C4所展示的相似。在还有一个实施方案中，外源HRG不会显著逆转这种抑制作用。优选的是，存在和缺乏外源HRG时，该抗体都将能够以大于单克隆抗体4D5的程度（并且任选以大于单克隆抗体7F3的程度）抑制MDA-MB-175细胞的细胞增殖。
在一个实施方案中，根据免疫共沉淀实验的测定，诸如WO 01/00245中所记载的，目的HER2抗体可在MCF7和SK-BR-3细胞中阻断调蛋白依赖性的HER2与HER3结合，实质上比单克隆抗体4D5更有效，优选实质上比单克隆抗体7F3更有效。
为了鉴定生长抑制性HER2抗体，可筛选抑制HER2过表达的癌细胞生长的抗体。在一个实施方案中，在约0.5-30μg/ml的抗体浓度，所选生长抑制性抗体能够将细胞培养物中SK-BR-3细胞的生长抑制约20-100%，优选约50-100%。为了鉴定此类抗体，可进行美国专利第5,677,171号中记载的SK-BR-3测定法。依照此测定法，在补充有10%胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素链霉素的培养基DMEM和F12的1:1混合液中培养SK-BR-3细胞。将SK-BR-3细胞以20,000个细胞分配入35mm细胞培养皿（2ml/35mm培养皿）。每个培养皿加入0.5-30μg/ml HER2抗体。6天后，使用电子COULTERTM细胞计数器对细胞数计数，与未处理细胞进行比较。可选择那些将SK-BR-3细胞的生长抑制约20-100%或约50-100%的抗体作为生长抑制性抗体。关于用于筛选生长抑制性抗体诸如4D5和3E8的测定法，参见美国专利第5,677,171号。
为了选择诱导凋亡的抗体，可利用使用BT474细胞的膜联蛋白结合测定法。如前一段所讨论的，在培养皿中培养和接种BT474细胞。然后除去培养基，只用新鲜培养基或者含有10μg/ml单克隆抗体的培养基替换。在3天温育期后，用PBS洗涤细胞单层，并通过胰蛋白酶消化脱离。然后如上文关于细胞死亡测定法所讨论的，离心细胞，重悬于Ca2+结合缓冲液，并等分到试管中。然后往试管中加入经标记的膜联蛋白（例如膜联蛋白V-FTIC）（1μg/ml）。可使用FACSCANTM流式细胞计数仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(Becton Dickinson)来分析样品。选择那些相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗体作为诱导凋亡的抗体。在膜联蛋白结合测定法之外，还可利用使用BT474细胞的DNA染色测定法。为了进行此测定法，将已经如前两段所述用目的抗体处理过的BT474细胞与9μg/ml HOECHST33342TM于37℃温育2小时，然后在EPICS ELITETM流式细胞计数仪(Coulter Corporation)上使用MODFIT LTTM软件(Verity Software House)进行分析。可选择在此测定法中诱导的凋亡细胞百分比变化为未处理细胞的2倍或更高（优选3倍或更高）（直到100%凋亡细胞）的抗体作为促凋亡抗体。关于用于筛选诱导凋亡的抗体诸如7C2和7F3的测定法，参见WO 98/17797。
为了筛选结合HER2上目的抗体所结合的表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Ed Harlow和David Lane,1988中所记载的，以评估所述抗体是否交叉阻断诸如2C4或Pertuzumab等抗体与HER2的结合。或者/另外，可通过本领域知道的方法进行表位作图和/或可研究抗体-HER2结构(Franklin等,Cancer Cell 5:317-328(2004))以了解抗体结合HER2的哪个/哪些结构域。
(ix)Pertuzumab组合物
在HER2抗体组合物的一个实施方案中，该组合物包含主要种类Pertuzumab抗体及其一种或多种变体的混合物。本文中Pertuzumab主要种类抗体的优选实施方案是包含SEQ ID No.3和4中的轻链和重链可变域氨基酸序列，最优选包含选自SEQ ID No.13和17的轻链氨基酸序列及选自SEQ IDNo.14和18的重链氨基酸序列的抗体（包括那些序列的脱酰胺和/或氧化变体）。在一个实施方案中，所述组合物包含主要种类Pertuzumab抗体及其包含氨基末端前导延伸的氨基酸序列变体的混合物。优选的是，所述氨基末端前导延伸位于抗体变体的轻链上（例如位于抗体变体的一条或两条轻链上）。所述主要种类HER2抗体或抗体变体可以是全长抗体或抗体片段（例如Fab或F(ab’)2片段），但优选二者都是全长抗体。本文中的抗体变体可以在其任何一条或多条重链或轻链上包含氨基末端前导延伸。优选的是，所述氨基末端前导延伸位于抗体的一条或两条轻链上。所述氨基末端前导延伸优选包含VHS-或由其组成。所述组合物中氨基末端前导延伸的存在可通过多种分析技术来检测，包括但不限于N-末端序列分析、电荷异质性的测定法（例如阳离子交换层析或毛细管区带电泳）、质谱等。所述组合物中抗体变体的量通常在如下范围内，从构成用于检测变体的任何测定法（优选N-末端序列分析）的检出限量到少于主要种类抗体量。通常，所述组合物中约20%或更少（例如从约1%至约15%，例如从5%至约15%）的抗体分子包含氨基末端前导延伸。这样的百分比量优选使用定量N-末端序列分析或阳离子交换分析（优选使用高分辨率、弱阳离子交换柱，诸如PROPAC WCX-10TM阳离子交换柱）来测定。除氨基末端前导延伸变体之外，还设想了主要种类抗体和/或变体的其它氨基酸序列改变，包括但不限于在其一条或所有两条重链上包含C-末端赖氨酸残基的抗体、脱酰胺抗体变体等。
此外，主要种类抗体或变体还可包含糖基化变异，其非限制性例子包括包含附着于其Fc区的G1或G2寡糖结构的抗体、包含附着于其轻链的碳水化合物模块的抗体（例如一种或两种碳水化合物模块，诸如葡萄糖或半乳糖附着于抗体的一条或两条轻链，例如附着于一个或多个赖氨酸残基）、包含一条或两条非糖基化重链的抗体、或包含附着于其一条或两条重链的唾液酸化寡糖的抗体等。
所述组合物可从表达HER2抗体的基因工程细胞系回收，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，或者可通过肽合成来制备。
(x)免疫偶联物
本发明还涉及包含抗体与细胞毒剂偶联的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素（例如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体）或放射性同位素（即放射偶联物）。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素的偶联物，所述小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美国专利第5,208,020号)、单端孢菌毒素(trichothene)和CC1065。
在本发明的一个优选实施方案中，将抗体与一个或多个美登素分子偶联（例如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登素分子）。例如，可将美登素转变为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应(Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992))以生成美登木素生物碱类-抗体免疫偶联物。
另一种感兴趣的免疫偶联物包含抗体与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等,Cancer Research53:3336-3342(1993);Lode等,CancerResearch 58:2925-2928(1998))。还可参见美国专利第5,714,586号；第5,712,374号；第5,264,586号和第5,773,001号，明确收入本文作为参考。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(PhytolacaAmericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体与具有核酸水解活性的化合物（例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）之间形成的免疫偶联物。
有多种放射性同位素可用于生成放射偶联的HER2抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体与细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基）环己胺-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚胺二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯-2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可制备蓖麻毒蛋白免疫毒素，如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所记载的。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research52:127-131(1992))。
或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体与细胞毒剂的融合蛋白。
本文还设想了其它免疫偶联物。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接，所述聚合物例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物传递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.ed.,1980。
本文公开的抗体还可配制成免疫脂质体。可通过本领域知道的方法来制备包含抗体的脂质体，诸如Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985);Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980);美国专利第4,485,045号和第4,544,545号;1997年10月23日公布的WO 97/38731中所记载的。美国专利第5,013,556号中披露了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体可用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有限定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联，如Martin等,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所记载的。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等,J.National CancerInst.81(19):1484(1989)。
III.诊断方法
在第一个方面，本文中的发明提供了一种用于为患有能够响应HER抑制剂或HER二聚化抑制剂（例如Pertuzumab）的癌症类型（例如卵巢癌）的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3和/或所述癌症样品以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位（或大于水平中值）的水平表达HER2:HER3，那么选择HER抑制剂或HER二聚化抑制剂作为疗法。
在第二个方面，本发明提供了一种用于为患有能够响应化疗剂的癌症类型（例如卵巢癌）的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择化疗剂（例如吉西他滨）作为疗法。
可以基本上在测量HER3表达（或HER2和HER3表达）的同时测定中值或百分位表达水平，或者可以事先测定。
在下文所描述的治疗方法之前，评估患者的癌症中的HER3表达水平和任选的HER2表达水平。一般而言，自需要治疗的患者获得生物学样品，对该样品进行一种或多种诊断测定法，通常是至少一种体外诊断(IVD)测定法。然而，本文明确涵盖评估HER3和/或HER2表达的其它形式，诸如体内诊断。所述生物学样品通常是肿瘤样品，优选来自卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、转移性乳腺癌(MBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、或结肠直肠癌肿瘤样品。
本文中的生物学样品可以是固定的样品，例如福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)样品，或者是冷冻的样品。
用于测定mRNA或蛋白质表达的方法有多种，包括但不限于基因表达概况分析、聚合酶链式反应(PCR)包括定量实时PCR(qRT-PCR)、微阵列分析、基因表达系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)、MassARRAY、通过大量平行签名测序(Massive Parallel Signiture Sequencing,MPSS)进行的基因表达分析、蛋白质组学、免疫组化(IHC)等。优选对mRNA定量。所述mRNA分析优选使用聚合酶链式反应(PCR)技术或通过微阵列分析来进行。若采用PCR，则优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。优选的qRT-PCR测定法就是下文实施例1中所描述的。
多篇已发表的期刊论文(例如Godfrey等,J.Molec.Diagnostics 2:84-91(2000);Specht等,Am.J.Pathol.158:419-29(2001))中给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的代表性基因表达概况分析方案的步骤：包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简单的说，一种代表性方法首先将石蜡包埋的肿瘤组织样品切成约10微米厚的切片。然后提取RNA并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，如果需要可以包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异性启动子逆转录RNA，然后PCR。最后分析数据，根据所检验肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达模式来确定患者可用的最佳治疗选项。
现在将更详细的描述用于测定基因表达的各种例示性方法。
(i)基因表达制谱
一般而言，基因表达制谱(gene expression profiling)方法可分成两大组：基于多核苷酸杂交分析的方法和基于多核苷酸测序的方法。本领域知道的用于对样品中的mRNA表达定量的最常用方法包括northern印迹和原位杂交（Parker & Barnes,Methods in Molecular Biology 106:247-283(1999)）；RNA酶保护测定法（Hod,Biotechniques 13:852-854(1992)）；及聚合酶链式反应(PCR)（Weis等,Trends in Genetics 8:263-264(1992)）。或者，可采用可识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。基于测序的基因表达分析的代表性方法包括基因表达连续分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)和通过大量平行签名测序(massively parallel signature sequencing,MPSS)进行的基因表达分析。
(ii)聚合酶链式反应(PCR)
在上文所列技术中，PCR是一种灵敏且灵活的定量方法，它可用于比较经过或未经药物处理的、正常和肿瘤组织中的、不同样品群中的mRNA水平，以表征基因表达型式、区分密切相关的mRNA、及分析RNA结构。
第一步是从靶样品分离mRNA。起始材料典型的是分别从人肿瘤或肿瘤细胞系及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如此，可从多种原发性肿瘤中分离RNA，包括乳房、肺、结肠、前列腺、脑、肝、肾、胰、脾、胸腺、睾丸、卵巢、子宫等肿瘤或肿瘤细胞系，及来自健康供体的合并DNA。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，那么mRNA可从例如冷冻的或归档的石蜡包埋且固定（例如福尔马林固定）的组织样品提取。用于提取mRNA的通用方法是本领域众所周知的，公开于分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等人，《Current Protocols of Molecular Biology》，John Wiley and Sons，1997。用于从石蜡包埋组织提取RNA的方法公开于例如Rupp和Locker,Lab Invest.56:A67(1987);De Andrés等,BioTechniques 18:42044(1995)。具体而言，RNA分离可使用来自商业制造商诸如Qiagen的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶依照制造商的说明书进行。例如，来自培养细胞的总RNA可使用Qiagen RNeasy微型柱分离。其它商品化RNA分离试剂盒包括
Figure BDA0000374590340000761
完整DNA和RNA纯化试剂盒(
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Madison,Wis.)和石蜡块RNA分离试剂盒(Ambion,Inc.)。来自组织样品的总RNA可使用RNA Stat-60(Tel-Test)分离。从肿瘤制备的RNA可通过例如氯化铯密度梯度离心来分离。
由于RNA不能充当PCR的模板，通过PCR进行基因表达制谱的第一步是将RNA模板逆转录成cDNA，接着是它在PCR反应中的指数式扩增。最常用的两种逆转录酶是禽类成髓细胞白血病病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。逆转录步骤典型的使用特异性引物、随机六聚物或oligo-dT引物引发，取决于表达制谱的情况和目标。例如，提取的RNA可使用GENEAMPTMRNA PCR试剂盒(Perkin Elmer,Calif.,USA)遵循制造商的说明书逆转录。然后可将衍生的cDNA作为模板用于后续PCR反应。尽管PCR步骤可使用多种热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶，典型的采用Taq DNA聚合酶，它具有5′-3′核酸酶活性但缺乏3′-5′校正内切核酸酶活性。如此，PCR典型的利用Taq或Tth聚合酶的5′-核酸酶活性来水解与其靶扩增子结合的杂交探针，但是可使用具有等效5′核酸酶活性的任何酶。使用两种寡核苷酸引物来生成扩增子，典型的是PCR反应的。第三种寡核苷酸或探针设计用于检测位于前两种PCR引物之间的核苷酸序列。探针是Taq DNA聚合酶不可延伸的且用报道荧光染料和淬灭荧光染料标记。在两种染料如它们在探针上的那样位置靠近时，任何激光诱发的来自报道染料的发射受到淬灭染料的淬灭。在扩增反应期间，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式切割探针。所得探针片段在溶液中解离，来自所释放表达染料的信号不再受到第二荧光团的淬灭效应的作用。每合成一个新的分子就释放一个分子的报道染料，未淬灭报道染料的检测提供了数据定量阐述的基础。
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PCR可使用商品化设备进行，诸如例如ABI PRISM
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序列检测系统(Perkin-Elmer-Applied Biosystems,Foster City,Calif.,USA)或Lightcycler(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany)。在一个优选的实施方案中，在实时定量PCR装置上运行5'核酸酶流程，诸如ABI PRISM
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序列检测系统。该系统由热循环仪、激光（器）、电荷耦合装置(CCD)、照相机和计算机组成。该系统在热循环仪上以96孔形式扩增样品。在扩增过程中，通过光线电缆实时收集所有96个孔的激光诱发的荧光信号，并在CCD处检测。该系统包括用于运行设备和分析数据的软件。
5′-核酸酶测定法数据最初表述为Ct，或循环阈值(threshold cycle)。如上文所讨论的，在每个循环期间记录荧光值并代表至扩增反应中该点时扩增的产物的量。首次记录到有统计学意义的荧光信号的点即循环阈值(Ct)。
为了将错误和样品间变异的影响降至最低，通常使用内部标准进行PCR。理想的内部标准在不同组织间以恒定水平表达，不受实验处理的影响。最频繁的用于基因表达型式标准化的RNA是持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和P-肌动蛋白的mRNA。
PCR技术的一种最新变化形式是定量实时PCR(qRT-PCR)，它通过双重标记的荧光生成探针（即
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探针）测量PCR产物积累。实时PCR与定量竞争性PCR（其中使用每种靶序列的内部竞争物来进行标准化）和定量比较性PCR（使用样品内包含的标准化基因或持家基因供PCR之用）都兼容。更多详情参阅例如Held等,Genome Research6:986-994(1996)。
多份发表的期刊论文给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源用于基因表达制谱的代表性方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增（例如Godfrey等,J.Molec.Diagnostics2:84-91(2000);Specht等,Am.J.Pathol.158:419-29(2001)）。简单的说，一种代表性方法由切出石蜡包埋的肿瘤组织样品的约10微米厚切片开始。然后，提取RNA，并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，在必要时可包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异启动子逆转录RNA，随后是PCR。
依照本发明的一个方面，PCR引物和探针是基于待扩增基因中存在的内含子序列设计的。在这个实施方案中，引物/探针设计的第一步是描绘基因内的内含子序列。这可通过公众可得到的软件来进行，诸如由Kent,W.,GenomeRes.12(4):656-64(2002)开发的DNA BLAT软件或BLAST软件，包括与其有所不同的软件。后续步骤遵循完全建立的PCR引物和探针设计方法。
为了避免非特异性信号，重要的是在设计引物和探针时掩盖(mask)内含子内的重复序列。这可容易地通过使用Repeat Masker程序来实现，该程序可通过贝勒医学院(Baylor College of Medicine)在线获得，它针对重复元件文库筛选DNA序列并返回其中掩盖了重复元件的查询序列。然后可使用任何商品化或通过其它途径公众可获得的引物/探针设计包将掩盖后的内含子序列用于设计引物和探针序列，诸如Primer Express(Applied Biosystems)；MGBassay-by-design(Applied Biosystems)；Primer3(Rozen和Skaletsky(2000)Primer3在万维网上供一般用户和生物学家编程员使用。在Krawetz S,MisenerS编的《Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology》中，Humana Press，Totowa，N.J.，第365-386页)。
PCR引物设计中考虑的因素包括引物长度、解链温度(meltingtemperature,Tm)、G/C含量、特异性、互补引物序列、和3′-末端序列。一般而言，最佳的PCR引物通常长17-30个碱基，包含约20-80%诸如例如约50-60%G+C碱基。典型的优选Tm在50和80℃之间，例如约50-70℃。
关于PCR引物和探针设计的进一步指导参见例如Dieffenbach等人，“General Concepts for PCR Primer Design”（PCR引物设计的一般概念），在《PCR Primer,A Laboratory Manual》中，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1995，第133-155页；Innis和Gelfand，“Optimization of PCRs”（PCR的优化），在《PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications》中，CRCPress，London，1994，第5-11页；及Plasterer,T.N.,Primerselect:Primer andprobe design.Methods Mol.Biol.70:520-527(1997)，将其完整公开内容明确收入本文作为参考。
下文实施例1中描述了优选的条件、引物、探针、和内部参照（G6PDH）。
(iii)微阵列
差别基因表达也可使用微阵列技术来鉴定或验证。如此，可使用微阵列技术在新鲜的或石蜡包埋的肿瘤组织中测量乳腺癌相关基因的表达谱。在这种方法中，在微芯片基片上涂布(plate)或排列(array)目的多核苷酸序列（包括cDNA和寡核苷酸）。然后使排列的序列与来自目的细胞或组织的特异性DNA探针杂交。如在PCR方法中一样，mRNA的来源典型的是从人肿瘤或肿瘤细胞系及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如此，RNA可从多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系分离。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，那么mRNA可从例如冷冻的或归档的石蜡包埋且固定（例如福尔马林固定）的组织样品提取，所述组织样品是日常临床实践中常规制备和保存的。
在微阵列技术的一个具体实施方案中，将PCR扩增的cDNA克隆的插入物以密集阵列应用至基片。优选的是，将至少10,000种核苷酸序列应用至基片。以每个基片10,000个成分固定在微芯片上的微阵列基因适于在严格条件下杂交。荧光标记的cDNA探针可通过从目的组织提取的RNA的逆转录中掺入荧光核苷酸来生成。应用至芯片的经标记cDNA探针与阵列上的每个DNA斑点以特异性发生杂交。严格清洗以除去非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微镜检术或通过其它检测方法诸如CCD照相机扫描芯片。每种阵列成分的杂交的定量容许评估相应mRNA的丰度。凭借双重有色荧光，将从两种RNA来源生成的分开标记的cDNA探针与阵列成对杂交。如此同时测定来自对应于每种指定基因的两种来源的转录物的相对丰度。小型化规模的杂交提供了大量基因表达型式的便利且快速评估。此类方法已经显示出检测以每个细胞少数拷贝表达的罕见转录物所要求的灵敏度及可再现的检测表达水平的至少约2倍差异（Schena等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(2):106-149(1996)）。微阵列分析可使用商品化设备遵循制造商的方案进行，诸如使用Affymetrix GENCHIPTM技术或Incyte的微阵列技术。
为大规模分析基因表达而开发的微阵列方法使得有可能系统搜索多种肿瘤类型中的癌症分类和后果预测的分子标志物。
(iv)基因表达连续分析(SAGE)
基因表达连续分析(SAGE)是容许同时且定量分析大量基因转录物且不需要为每种转录物提供个别杂交探针的一种方法。首先，生成包含足以唯一鉴定一种转录物的信息的一种短序列标签（约10-14bp），倘若该标签是从每种转录物内的一个唯一位置得到的。然后，将许多转录物连接起来以形成长、连续分子，它们可测序，以同时揭示多种标签的身份(identity)。任何转录物群的表达型式可通过测定个别标签的丰度并鉴定与每种标签对应的基因来定量评估。更多详情参见例如Velculescu等,Science270:484-487(1995);Velculescu等,Cell88:243-51(1997)。
(v)MassARRAY技术
MassARRAY(Sequenom,San Diego,Calif.)技术是将质谱(MS)用于检测的一种自动化、高通量的基因表达分析方法。依照这种方法，在分离RNA、逆转录和PCR扩增之后，将cDNA进行引物延伸。将cDNA衍生的引物延伸产物纯化，并分配到预先加载了MALTI-TOF MS样品制备所需要的成分的芯片阵列上。通过分析所得质谱中的峰面积，对反应中存在的各种cDNA定量。
(vi)通过大量平行签名测序(MPSS)进行的基因表达分析
由Brenner等,Nature Biotechnology 18:630-634(2000)记载的这种方法是将不基于凝胶的签名测序与数以百万计的模板在分开的5微米直径微珠上的体外克隆联合起来的一种测序方法。首先，通过体外克隆构建DNA模板的微珠库。接着，在流动槽中以高密度（典型的是大于3x106微珠/cm2）装配含模板微珠的平面阵列。使用不要求将DNA片段分开的基于荧光的签名测序方法，同时分析每个微珠上克隆的模板的游离末端。这种方法已经显示出在单次操作中同时且精确地提供来自酵母cDNA文库的数以十万计的基因签名序列。
(vii)免疫组化
免疫组化方法也适用于检测本发明的预后标志物的表达水平。如此，使用对每种标志物特异的抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，最优选单克隆抗体来检测表达。所述抗体可通过直接标记抗体自身来检测，例如用放射性标记物、荧光标记物、半抗原标记物诸如生物素、或酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。或者，未标记一抗与经标记二抗联合使用，包括对一抗特异的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组化方案和试剂盒是本领域众所周知的，而且可通过商业途径获得。
(viii)蛋白质组学
术语“蛋白质组”定义为某一时间点样品（例如组织、生物体或细胞培养物）中存在的蛋白质的全体。蛋白质组学包括研究样品中蛋白质表达的全局变化（也称为“表达蛋白质组学”）等。蛋白质组学典型地包括下列步骤：(1)通过二维凝胶电泳(2-D PAGE)将样品中的各种蛋白质分开；(2)鉴定从凝胶中回收的各种蛋白质，例如通过质谱或N-末端测序；及(3)使用生物信息学分析数据。蛋白质组学方法是其它基因表达制谱方法的有用补充，可以单独使用或联合其它方法，用于检测本发明的预后标志物的产物。
(ix)mRNA分离、纯化和扩增的一般性描述
多份发表的期刊论文给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源用于基因表达制谱的代表性方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增（例如Godfrey等,J.Molec.Diagnostics2:84-91(2000);Specht等,Am.J.Pathol.158:419-29(2001)）。简单的说，一种代表性方法由切出石蜡包埋的肿瘤组织样品的约10微米厚切片开始。然后，提取RNA，并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，在必要时可包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异启动子逆转录RNA，随后是PCR。最后，根据在所检验肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达型式，分析数据以鉴定对患者有用的最佳处理选项。
在一个实施方案中，在以某水平表达HER3和/或以某水平表达HER2:HER3之外，本文中所治疗的患者不进一步地过表达HER2。可通过IHC来分析HER过表达，例如使用
Figure BDA0000374590340000811
(Dako)。可将来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并对照如下HER2蛋白质染色强度标准：
得分0：未观察到染色或者在少于10%的肿瘤细胞中观察到膜染色。
得分1+：在超过10%的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜中有染色。
得分2+：在超过10%的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+：在超过10%的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
那些HER2过表达评估得分为0或1+的肿瘤可表征为HER2未过表达，而那些得分为2+或3+的肿瘤可表征为HER2过表达。
HER2过表达的肿瘤可根据对应于每个细胞表达的HER2分子拷贝数的免疫组化得分进行定级，并且可通过生化方法测定：
0=0-10,000个拷贝/细胞，
1+=至少约200,000个拷贝/细胞，
2+=至少约500,000个拷贝/细胞，
3+=至少约2,000,000个拷贝/细胞。
导致酪氨酸激酶的配体依赖性活化的3+水平的HER2过表达(Hudziak等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7159-7163(1987))发生于约30%的乳腺癌中，而且在这些患者中，无复发存活和总体存活减少(Slamon等,Science244:707-712(1989);Slamon等,Science235:177-182(1987))。或者/另外，可对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法诸如INFORMTM(Ventana,Arizona)或PATHVISIONTM(Vysis,Illinois)以测定肿瘤中HER2扩增的程度（如果有的话）。
还可利用体内诊断测定法来评估HER3和/或HER2表达，例如通过施用结合待检测分子且标记有可检测标记物（例如放射性同位素）的分子（诸如抗体），然后对患者进行外部扫描以定位所述标记物。
IV.药物配制剂
依照本发明使用的HER抑制剂、HER二聚化抑制剂、或化疗剂的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选的药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980))混合，一般以冻干配制剂或水溶液的形式制备供贮存。还涵盖抗体晶体（参见例如美国专利申请2002/0136719）。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。冻干抗体配制剂记载于WO98/56418，通过述及明确收入本文。
用于治疗用途的优选Pertuzumab配制剂在20mM组氨酸乙酸酯、120mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯20、pH6.0中包含30mg/mL Pertuzumab。另一种Pertuzumab配制剂包含25mg/mL Pertuzumab、10mM组氨酸-HCl缓冲液、240mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯20、pH6.0。
本文中的配制剂还可含有超过一种对于所治疗的特定适应症而言必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。下文治疗部分中记载了能与HER抑制剂或HER二聚化抑制剂组合的各种药物。合适的是，此类分子以对于预定目的而言有效的量组合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊），在胶状药物投递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊），或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington′s PharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
因而，提供了一种用于制造HER抑制剂、或HER二聚化抑制剂（诸如Pertuzumab）或其药物组合物的方法，该方法包括在包装中组合所述抑制剂或药物组合物及标签，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应所述抑制剂的癌症类型（例如卵巢癌）的患者，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3和/或所述患者的癌症样品以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
另外，提供了一种用于制造化疗剂（诸如吉西他滨）或其药物组合物的方法，其中该方法包括在包装中组合所述化疗剂或药物组合物及标签，所述标签声明所述化疗剂或药物组合物指明用于治疗患有一种癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
V.使用HER抑制剂的治疗
本文中的发明提供了一种用于治疗患有能够响应HER抑制剂或HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的该抑制剂，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，和/或其中所述患者的癌症样品以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。优选地，所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达第25百分位的水平表达HER3和/或以大于该癌症类型中HER2:HER3表达水平中值（最优选大于该癌症类型中HER2:HER3表达第75百分位）的水平表达HER2:HER3。
在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患有卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的Pertuzumab，其中所述患者的癌症以小于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER3表达水平中值的水平表达HER3，和/或其中所述患者的癌症样品以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。在此实施方案中，优选地，所述患者的癌症以小于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER3表达第25百分位的水平表达HER3和/或以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达水平中值（最优选大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达第75百分位）的水平表达HER2:HER3。
另一方面，本发明提供了一种用于为患有能够响应化疗剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择化疗剂作为疗法。在此实施方案中，优选地，所述癌症类型是卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌，包括铂抗性的卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌，以及晚期的、顽固性的和/或复发性的卵巢癌。所述化疗剂优选是抗代谢物，诸如吉西他滨。如此，在此实施方案中，高HER3与改善的对化疗剂（诸如吉西他滨）疗法的响应有关。
可以用HER抑制剂或HER二聚化抑制剂治疗的多种癌症的例子已在上文定义部分列出。优选的癌症类型包括卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌、乳腺癌包括转移性乳腺癌(MBC)、肺癌包括非小细胞性肺癌(NSCLC)、前列腺癌和直肠结肠癌。在一个实施方案中，所治疗的癌症是晚期的、顽固性的、复发性的、化疗抗性的和/或铂抗性的癌症。
HER抑制剂、HER二聚化抑制剂和/或化疗剂疗法优选延长存活，包括无进展存活(PGS)和/或总体存活(OS)。在一个实施方案中，HER抑制剂或HER二聚化抑制剂疗法使存活比通过施用针对所治疗癌症的批准的抗肿瘤剂或标准治疗而实现的存活延长至少约20%。
在优选的实施方案中，所述方法涉及治疗患有卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌的患者。该患者可患有晚期的、顽固性的、复发性的、化疗抗性的和/或铂抗性的卵巢、腹膜或输卵管癌症。对患者施用Pertuzumab可以例如使存活比对此类患者施用托泊替康或多柔比星脂质体而实现的存活延长至少约20%。
HER抑制剂、HER二聚化抑制剂和/或化疗剂依照已知方法施用于人类患者，诸如静脉内施用，例如推注或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。优选静脉内施用抗体。
对于癌症的预防或治疗，HER抑制剂、HER二聚化抑制剂和/或化疗剂的剂量将取决于如上定义的待治疗癌症的类型、癌症的严重程度和进程、施用抗体是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对药物的响应、及主治医师的判断。
在一个实施方案中，施用固定剂量的抑制剂。合适的是，固定剂量可以一次性施用或经过一系列治疗施用于患者。若施用固定剂量，则该剂量优选在约20mg到约2000mg抑制剂的范围内。例如，固定剂量可以是约420mg、约525mg、约840mg、或约1050mg抑制剂，诸如Pertuzumab。
若施用多剂，则可以是例如约每周、约每两周、约每三周、或约每四周施用，但优选约每三周施用。固定剂量可以例如持续施用直至病情进展、不良事件、或医师确定的其它时间为止。例如，可以施用约2剂、3剂、或4剂、直到约17剂或更多剂固定剂量。
在一个实施方案中，施用一个或多个加载剂量(loading dose)的抗体，随后是一个或多个维持剂量(maintenance dose)的抗体。在另一个实施方案中，对患者施用多个相同的剂量。
根据本发明的一个优选实施方案，施用约840mg（加载剂量）固定剂量的HER二聚化抑制剂（例如Pertuzumab），随后是一个或多个约420mg（维持剂量）剂量的所述抗体。所述维持剂量优选约每三周施用，总共施用至少2剂，直到17剂或更多剂。
根据本发明的另一个优选实施方案，施用一个或多个约1050mg固定剂量的HER二聚化抑制剂（例如Pertuzumab），例如每三周施用。根据该实施方案，施用一个、两个或更多个固定剂量，施用例如可长达1年（17个循环）及所需的更长时间。
在另一个实施方案中，施用约1050mg固定剂量的HER二聚化抑制剂（例如Pertuzumab）作为加载剂量，随后是一个或多个约525mg的维持剂量。根据本实施方案，每三周对患者施用约1个、2个或更多个维持剂量。
尽管可以作为单一抗肿瘤剂来施用HER抑制剂、HER二聚化抑制剂或化疗剂，但是任选用抑制剂（或化疗剂）与一种或多种（别的）化疗剂的组合来治疗患者。本文中的例示性化疗剂包括：吉西他滨、卡铂、帕利他塞、多西他塞、托泊替康、和/或多柔比星脂质体。优选的是，至少一种化疗剂是抗代谢物化疗剂，诸如吉西他滨。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用或同时施用，及任一次序的连续施用，其中优选有一段时间所有两种（或多种）活性剂同时发挥其生物学活性。如此，可在施用所述抑制剂之前或之后施用所述抗代谢物化疗剂。在此实施方案中，至少一次抗代谢物化疗剂的施用与至少一次抑制剂的施用之间的计时优选为约1个月或更短时间，最优选约2周或更短时间。或者，以单一的配制剂或分开的配制剂同时对患者施用抗代谢物化疗剂和抑制剂。化疗剂（例如抗代谢物化疗剂，诸如吉西他滨）与抑制剂（例如Pertuzumab）的联合治疗可对患者产生协同的、或者大于累加的治疗效益。
特别期望用于与抑制剂组合（例如用于卵巢癌的疗法）的化疗剂包括：抗代谢物化疗剂，诸如吉西他滨；铂化合物，诸如卡铂；类紫杉醇(taxoid)，诸如帕利他塞或多西他塞；拓扑替康；或多柔比星脂质体。
抗代谢物化疗剂，如果施用的话，通常以其已知剂量施用，或者任选由于药物的联合作用或者由于施用抗代谢物化疗剂造成的不良副作用而降低。可依照制造商的说明书使用此类化疗剂的制剂和剂量给药时间表，或者由熟练从业人员凭经验确定。若抗代谢物化疗剂是吉西他滨，优选的是，例如在三周循环的第1天和第8天以约600mg/m2至1250mg/m2之间（例如约1000mg/m2）的剂量给药。
在抑制剂和抗代谢物化疗剂之外，还可联合其它治疗方案。例如，可施用第二（第三、第四等）化疗剂，其中第二种化疗剂或是另一种不同的抗代谢物化疗剂，或是非抗代谢物的化疗剂。例如，第二种化疗剂可以是紫杉烷（诸如paclitaxel或docetaxel）、卡培他滨或基于铂的化疗剂（诸如卡铂、顺铂或奥沙利铂）、蒽环类抗生素（诸如多柔比星，包括多柔比星脂质体）、托泊替康、培美曲塞、长春花生物碱类（诸如长春瑞滨）和TLK286。可以施用不同化疗剂的“鸡尾酒”。
可以与抑制剂和/或化疗剂联合的其它治疗剂包括以下任一种或多种：第二种不同的HER抑制剂、HER二聚化抑制剂（例如生长抑制性HER2抗体诸如trastuzumab或诱导HER2过表达细胞凋亡的HER2抗体诸如7C2、7F3或其人源化变体）；针对不同肿瘤相关抗原诸如EGFR、HER3、HER4的抗体；抗激素化合物，例如抗雌激素化合物诸如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂；心脏保护剂（以预防或减轻与治疗有关的任何心肌功能障碍）；细胞因子；EGFR靶向药物（诸如
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或cetuximab)；抗血管发生剂（尤其是Genentech以商标AVASTINTM销售的bevacizumab）；酪氨酸激酶抑制剂；COX抑制剂（例如COX-1或COX-2抑制剂）；非类固醇抗炎药，celecoxib法呢基转移酶抑制剂(例如可从Johnson and Johnson购买的Tipifarnib/
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R115777或可从Schering-Plough购买的LonafarnibSCH66336)；结合癌胚蛋白CA125的抗体，诸如Oregovomab(MoAb B43.13)；HER2疫苗(诸如Pharmexia的HER2Auto Vac疫苗，或Dendreon的APC8024蛋白质疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；其它HER靶向疗法(例如trastuzumab、cetuximab、ABX-EGF、EMD7200、gefitinib、erlotinib、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8、TAK165等)；Raf和/或ras抑制剂(参见例如WO 2003/86467)；盐酸多柔比星脂质体注射液
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拓扑异构酶I抑制剂诸如托泊替康；紫杉烷；HER2与EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂诸如lapatinib/GW572016；TLK286
Figure BDA0000374590340000881
EMD-7200；治疗恶心的药物，诸如血清素拮抗剂、类固醇或苯并二氮卓；预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法，包括局部或口服抗生素；治疗或预防腹泻的药物；降体温药物，诸如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或麦啶(meperidine)；造血生长因子等。
任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可以由于该药剂与抑制剂的联合作用（协同作用）而降低。
在上述治疗方案之外，还可对患者进行手术去除癌细胞和/或放疗。
若抑制剂是抗体，优选的是，所施用的抗体是裸抗体。然而，所施用的抑制剂可以与细胞毒剂偶联。优选的是，所偶联的抑制剂和/或其结合的抗原受到细胞的内在化，导致该偶联物杀伤其所结合的癌细胞的治疗功效提高。在一个优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱类(maytansinoids)、加利车霉素(calicheamicin)、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。
本申请还涵盖通过基因疗法来施用抑制剂。参见例如1996年3月14日公布的WO 96/07321，它关注使用基因疗法来生成胞内抗体。
有两种主要方法使核酸（任选包含在载体中）进入患者的细胞，即体内(in vivo)和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗，取出患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内（参见例如美国专利第4,892,538号和第5,283,187号）。有多种技术可用于将核酸导入可存活细胞。这些技术根据是将核酸转移至体外培养细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体（诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒）和基于脂质的系统（可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol）进行的转染。在有些情况中，希望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸源，所述试剂诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中发生内在化的蛋白质的抗体、及靶向细胞内定位和延长细胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞技术记载于例如Wu等,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987);Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3410-3414(1990)。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson等,Science256:808-813(1992)。还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。
VI.制品
在本发明的另一个实施方案中提供了包含可用于治疗上文所述疾病或疾患的物质的制品。所述制品包括容器和所述容器上的或与所述容器相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口（例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶）。所述组合物中的至少一种活性药剂是HER二聚化抑制剂（诸如Pertuzumab）或化疗剂（诸如吉西他滨）。
所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药剂学可接受的稀释缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。所述制品可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、和注射器。
本发明的试剂盒和制品还包括信息，例如包装插页或标签的形式，指明所述组合物用于治疗癌症，其中所述患者的癌症以根据药物限定的水平表达HER3和/或HER2:HER3。所述插页或标签可采取任何形式，诸如纸或在电子介质上，诸如磁记录介质（例如软盘）或CD-ROM。所述标签或插页还可包括关于所述试剂盒或制品中的所述药物组合物和剂量形式的其它信息。
一般而言，此类信息帮助患者和医师高效且安全地使用所包装的药物组合物和剂量形式。例如，所述插页中可提供关于HER二聚化抑制剂或化疗剂的下列信息：药动学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、预防、不良反应、过剂量、正确剂量和施用、如何补给、正确贮存条件、参考文献和专利信息。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种制品，包括包装在一起的药物组合物和标签，所述药物组合物在药学可接受载体中包含HER抑制剂或HER二聚化抑制剂，所述标签声明所述抑制剂或药物组合物指明用于治疗患有能够响应HER抑制剂或HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3和/或所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
在此发明方面的一个任选实施方案中，本文中的制品进一步包括装有第二药物的容器，其中HER抑制剂或HER二聚化抑制剂是第一药物，而且制品还在包装插页上包含用有效量的第二药物治疗患者的指示。第二药物可以是任何上文列出的那些药物，例示性的第二药物是另一种HER2抗体或化疗剂。
另一方面，提供了一种制品，包括包装在一起的药物组合物和标签，所述药物组合物在药学可接受载体中包含化疗剂（诸如吉西他滨），所述标签声明所述化疗剂或药物组合物指明用于治疗患有一种癌症类型的患者，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
所述包装插页在所述容器上或与所述容器相连。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗癌症类型的组合物，可以具有无菌存取口（例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶）。所述组合物中的至少一种活性药剂是HER抑制剂、HER二聚化抑制剂、或化疗剂。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗符合治疗条件的受试者中的癌症及关于所提供抑制剂和任何其它药物的给药量和间隔的具体指示。所述制品可进一步包括别的容器，其中装有药剂学可接受的稀释缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液、和/或右旋糖溶液。所述制品可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、和注射器。
在实施本发明时，本领域中已知的许多备选实验方法可成功地替代本文中具体描述的那些，例如本发明相关技术领域可得的许多优秀的手册和教科书中所记载的(例如Using Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow,E.和Lane,D.编,1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(例如ISBN0-87969-544-7);Roe B.A.等,1996,DNA Isolation and Sequencing(Essential Techniques Series),John Wiley & Sons.(例如ISBN0-471-97324-0);Methods in Enzymology:Chimeric Genes and Proteins,2000,编J.Abelson,M.Simon,S.Emr,J.Thomer.Academic Press;Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001,第3版,JosephSambrook和Peter MacCallum,(以前的Maniatis Cloning手册)(例如ISBN0-87969-577-3);Current Protocols in Molecular Biology,编Fred M.Ausubel等,John Wiley & Sons(例如ISBN0-471-50338-X);Current Protocols in ProteinScience,编John E.Coligan,John Wiley & Sons(例如ISBN0-471-11184-8);及Methods in Enzymology:Guide to protein Purification,1990,Vol.182,编Deutscher,M.P.,Acedemic Press,Inc.(例如ISBN0-12-213585-7))，或致力于描述分子生物学实验方法的许多大学和商业网站中所记载的。
VII做广告的方法
本文中的发明还涵盖一种用于为HER抑制剂、HER二聚化抑制剂（例如Pertuzumab）或其药学可接受组合物做广告的方法，其包括给目标受众宣传所述抑制剂或其药用组合物用于治疗患有一种癌症类型（诸如卵巢癌）的患者群体的用途，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3和/或所述患者的癌症样品以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种为化疗剂（诸如吉西他滨）或其药学可接受组合物做广告的方法，包括向目标受众推广该化疗剂或其药物组合物用于治疗患有一种癌症类型（诸如卵巢癌）的患者群的用途，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
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VIII.材料保藏
以下杂交瘤细胞系已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209,USA)(ATCC)：
Figure BDA0000374590340000921
下面的非限制性实施例例示了本发明的进一步细节。将说明书中所有引用的公开内容明确收入本文作为参考。
实施例
实施例1：Pertuzumab和吉西他滨用于铂抗性卵巢癌、原发性腹膜癌、或输卵管癌的治疗
此实施例提供了在患有铂抗性卵巢癌、原发性腹膜癌、或输卵管癌的患者中评估与吉西他滨组合的Pertuzumab的安全性、耐受性、和功效的III期临床试验的结果。Pertuzumab代表了一类新的靶向剂，称作HER二聚化抑制剂(HDI)，其抑制HER2与EGFR、HER3和HER4二聚化，而且抑制经由MAP和P13激酶的信号传导。Pertuzumab在二聚体-二聚体相互作用位点处结合，对HER2作为共同受体(co-receptor)的作用具有重大影响，阻止EGFR/HER2和HER3/HER2二聚化，而且抑制多种HER介导的信号传导途径。
在所有患者中、在其肿瘤含有指示HER2活化的标志物的患者子集中评估了Pertuzumab和吉西他滨对无进展存活(PFS)和总体存活(OS)的影响。研究设计/方案显示于图9。
在接受基于铂的化疗治疗方案时或在接受基于铂的化疗治疗方案6个月内发生进展的患者符合此研究的条件。患者随机化成接受与Pertuzumab组合的吉西他滨或与安慰剂组合的吉西他滨。本文中所治疗的患者包括那些在进入研究之前从未为铂抗性疾病接受先前的补救治疗方案治疗的，及那些为铂抗性疾病接受过1种在先治疗方案的。
在每个21天循环的第1和8天以1000mg/m2施用吉西他滨。首先输注吉西他滨持续30分钟。由于毒性问题允许降低剂量。在21天循环的第1天施用安慰剂或Pertuzumab。随机接受Pertuzumab的受试者施用840mg的起始加载剂量(initial loading dose)（循环1），随后在循环2和后续循环中施用420mg。随机接受安慰剂的受试者在循环1、循环2及后续循环中以与Pertuzumab组相同的体积施用安慰剂。没有进行性疾病的受试者接受治疗，可长达17个循环或1年。由于血细胞减少，患者降低标准吉西他滨剂量和维持剂量(held doses)。针对任何第1天吉西他滨的维持剂量，Pertuzumab也维持。后续剂量是降低的剂量并且不再升高。如果超过4次需要降低剂量或维持剂量，或者如果维持剂量超过3周，那么停用吉西他滨，并且经主治医师和医疗监控者同意，继续施用盲试药物直至病情进展(disease progression)。如果第8天吉西他滨剂量是维持的，那么该第8天的剂量可省略，后续处理从下一个循环开始（前一循环的第22天）。
如下表所推荐的，维持和降低吉西他滨的剂量：
Figure BDA0000374590340000931
需要降低剂量的任何患者的后续剂量是降低的剂量。如果由于血细胞减少，维持剂量超过3周，那么推定患者具有无法接受的毒性并停用吉西他滨。如果没有其它另外的III级或IV级毒性，那么根据医师和医疗监控者的判断继续施用盲试药物。吉西他滨的血液学毒性与施药速率有关。不管总剂量如何，吉西他滨的给药都持续30分钟。根据主治医师的判断对NCI-CTC2级血细胞减少使用集落刺激剂。
提供与单一药剂Pertuzumab交换(crossover)的选项。在下一个循环时施用840mg的加载剂量，每21天的后续循环以420mg继续。
在第2、4、6、8、12和17个循环结束时评估响应。通过临床评估和CT扫描或等效手段，用实体瘤响应评估标准(Response Evaluation Criteria forSolid Tumors,RECIST)来评估可测量的疾病。根据CA-125变化及疾病的临床和放射学证据，评估患可评估疾病的受试者的响应。在最初记录响应后4-8周确认响应。
评估下列结果测量值。
主要功效终点(Primary Efficacy Endpoint)
无进展存活，根据调查人员使用RECIST或CA-125变化进行的评估确定，在各组所有受试者中开始指定的研究治疗后进行。
无进展存活，根据调查人员使用RECIST或CA-125变化进行的评估确定，在以下亚组的每个分支中开始指定的研究治疗后进行：
能检测到HER2活化标志物的受试者
检测不到HER2活化标志物的受试者
次要功效终点(Secondary Efficacy Endpoints)
客观响应（PR或CR）
响应持续时间
存活时间
4个月没有进展
在以下亚组中的和在每个分支中的所有受试者中评估这些终点：
能检测到HER2活化标志物的受试者
检测不到HER2活化标志物的受试者
为了预防或治疗可能的恶心和呕吐，对患者前驱用药血清素拮抗剂、类固醇和/或苯并二氮卓。为了预防或治疗可能的皮疹，使用标准痤疮疗法，包括局部和/或口服抗生素。其它可能的伴随药疗有任何处方药物或非处方药制剂，由受试者在间隔时间期间使用，在研究第1天之前7天开始并持续至随访期的最后一天。发生输注相关的温度升高至>38.5℃或其它输注相关症状的受试者用醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或麦啶(meperidine)进行对症处理。对NCI-CTC2级血细胞减少施用非实验性造血生长因子。
对自此临床试验得到的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织(FFPET)样品通过qRT-PCR分析EGFR、HER2、HER3、两种HER配体（双调蛋白和β细胞调节素）、和G6PDH（一种持家基因）。qRT-PCR测定法由TARGOS MolecularPathology GmbH(Kassel,Germany)使用Roche Diagnostic的实验室类型试剂盒实施。对临床样品实施qRT-PCR测定法的工作流程和分析描绘于本文中的图27和28。
EGFR、HER2、HER3、双调蛋白、和β细胞调节素的mRNA分析是一式两份进行的。为了容许定量数据分析，还分析了G6PDH，作为内部参照。引物和探针设计成只扩增mRNA，不扩增DNA。以两步规程，对每种标志物和G6PDH分开进行qRT-PCR。
在第一步中，使用AMV逆转录酶和对每种标志物和G6PDH特异性的引物，自5μl总RNA逆转录cDNA。温度谱为退火10min./25℃、逆转录60min./42℃和酶灭活5min./94℃。
在第二步中，使用
Figure BDA0000374590340000951
设备(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)自5μl cDNA扩增标志物和G6PDH mRNA的100-120bp片段。使用特异性的经标记杂交探针对通过荧光检测扩增子（荧光共振能量转移的原理）。qRT-PCR所使用的所有试剂来自Roche Applied Science,Mannheim,Germany。温度谱为初始变性10min./95°和45个循环的退火10sec./62℃、延伸9sec./72℃、变性10sec./95℃。所使用的引物/探针序列参见下表。
Figure BDA0000374590340000952
Figure BDA0000374590340000961
在每次运行中包括校准物RNA（自HT29细胞系纯化的RNA）以容许相对定量，使用阳性和阴性对照来检查工作流程和试剂。
使用
Figure BDA0000374590340000962
相对定量软件(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)依照制造商的指示进行数据分析。结果是每份患者样品的每种标志物的“校准物标准化比(calibrator normalized ratio)”。
可得到119/130名患者（92%）的qRT-PCR值。动态范围为：EGFR–约10倍，HER2–约10倍，HER3–约20倍。使用了“相对定量”的原理。样品中的基因表达（mRNA水平）是参照同一样品的持家基因表达而相对定量的（参照物=G6PDH）。然后将此相对基因表达针对校准物中的相对基因表达标准化。对于每一种标志物，如下计算“校准物标准化比”：
Figure BDA0000374590340000971
目标物=感兴趣的基因
参照物=持家基因(G6PDH)
校准物=HT29结肠直肠癌细胞系RNA
在7.1个月追踪中值（范围1.3-20.3）时评估功效结果。那时有101例无进展存活(PFS)。图10A和10B呈现了所有用吉西他滨和安慰剂或吉西他滨和Pertuzumab治疗的患者中的PFS。P值是通过随机化分层因素(randomizationstratification factor)（ECOG PS、针对铂抗性疾病的在先治疗方案的数目、和疾病可测性）使用分层Cox模型(stratified Cox model)和分层log-rank检验(stratified log-rank test)估算的。
通过预测pHER2状态得到的PFS显示于图11A和11B，比较预测为pHER2阴性的患者和预测为pHER2阳性的患者中的PFS。使用80份商品化卵巢癌样品开发了一种预测算法。HER2、HER3和双调蛋白表达组合预测30%的最高pHER样品，准确度80%。如果双调蛋白、HER2、和HER3大于和等于第70百分位，那么患者预测为pHER2阳性，其他患者认为是pHER2阴性的。
图12A和12B呈现了基于qRT-PCR EGFR截留的PFS；图13A和13B呈现了基于qRT-PCR HER2截留的PFS；而图14A和14B呈现了基于qRT-PCR HER3截留的PFS。具有低HER3的患者在PFS方面具有更好的结果。这些数据更详细地显示于图15A和15B。如那些图中所示，Pertuzumab活性在患有HER3低表达肿瘤的患者中最大，且趋向于随HER3基因表达水平降低而升高。这些图包括HER3表达的绝对值，如在qRT-PCR测定法中定量的。
图16A和16B图示了通过HER3亚组得到的PFS。这些数据显示了在具有HER3高表达的肿瘤的患者中，Pertuzumab与吉西他滨之间可能有消极的相互作用。
图17A和17B是进一步的表格，总结了对于高HER3表达和低HER3表达二者通过HER3亚组得到的PFS的数据。图18A和18B呈现了基于四种不同百分位的HER3亚组得到的PFS。HER3表达为0至小于第50百分位，特别是0至第25百分位的患者对于PFS具有改善的危害比(Hazard ratio,HR)。（根据PFS的测量，较低的HR与改善的结果相关。）
图19A和19B提供了数据，显示通过HER3qRT-PCR得到的PFS，50/50拆分。低HER3表达的患者（小于第50百分位）与高HER3表达的患者（大于和等于第50百分位）相比具有延长的PFS持续时间（以月计）。这种相关性在图20A和20B中更明显，其中低HER3表达的患者表征为那些在小于第25百分位中的，而高HER3表达的患者为那些在大于或等于第25百分位中的那些。这两个诊断亚组之间的HR差异的P值为0.0007。第25百分位等于1.19CNR。
可得到总体存活(OS)的初步数据。所有患者的此类数据提供于图21A和21B。图22A和22B比较了通过HER3 qRT-PCR得到的OS，比较低HER3表达（小于第50百分位）和高HER3表达（大于或等于第50百分位）。
图23A和23B图示了通过HER3qRT-PCR得到的PFS，50/50拆分，高对低危害比(HR)。全套PFS数据（包括自5%至95%的百分位）显示于图24A和24B。
HER3校准标准化比表达范围显示于图26A和26B。此范围是约20-80倍。
在HER2:HER3比方面进一步评估了PFS结果。这些进一步分析的结果描绘于图29A-31B。如这些图所显示的，Pertuzumab活性在具有高HER2:HER3比的患者中最大。
结论
Pertuzumab活性在患有HER3低表达癌症的患者中最大，且趋向于随HER3基因表达水平降低而升高。Pertuzumab活性还在患有高HER2:HER3表达癌症的患者中最大，且趋向于随HER2:HER3基因表达水平升高而升高。大多数响应Pertuzumab疗法的、具有低HER3表达水平的患者也具有高HER2:HER3比。
在具有HER3高表达的肿瘤的患者中，Pertuzumab与吉西他滨之间可能有消极的相互作用。
HER3表达在化疗背景上可能是预后性的，其中高表达的肿瘤较好。
上述结果是令人惊讶的、出乎意料的。
实施例2：Pertuzumab用于晚期的、顽固性的、或复发性的卵巢癌的治疗
本实施例涉及卵巢癌患者的单组(single arm)开放式(open label)多中心(multi-center)II期临床试验。用人源化HER2抗体Pertuzumab治疗患有晚期的、顽固性的、或复发性的卵巢癌的患者。
患有复发性卵巢癌的患者加入来接受“低剂量”单一药剂Pertuzumab的治疗；Pertuzumab静脉内(IV)施用840mg的加载剂量，随后是每3周420mg。
第二组患者接受“高剂量”Pertuzumab的治疗；每3周1050mg，作为单一药剂施用。
在2、4、6、8、12和16个循环后获取肿瘤评估结果。根据RECIST的响应率(response rate)(RR)是主要终点(primary endpoint)。另外评估了安全性和可耐受性。次要终点(secondary endpoint)有TTP、响应持续时间、存活持续时间、药动学(PK)和FOSI（第2组）。
对归档的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织实施qRT-PCR测定法。可得到46/117名患者的测定法数据。图25A和25B中显示了通过HER3 qRT-PCR得到的PFS和OS，其中选择了25/75作为最佳拆分。在这里，高HER3表达为大于和等于第75百分位，而低HER3表达为小于第75百分位。
同样，用Pertuzumab治疗的、具有低HER3表达的患者在PFS和OS方面展示出更好的结果。
实施例3：Pertuzumab用于铂抗性复发性卵巢癌的治疗
在此随机化、开放式II期临床研究中，在患有铂敏感性、复发性卵巢癌的患者中调查了与基于卡铂的标准化疗组合的Pertuzumab治疗的功效和安全性。目标样本容量是100-500名个体。目标样本容量是148。
选择标准：
·经组织学证实的卵巢癌、原发性腹膜癌、或输卵管癌；
·只有1种先前的治疗方案，其必须是基于铂的；
·铂敏感性疾病，其定义为在基于铂的化疗完成后大于6个月的无进展间隔。
排除标准：
·先前的放疗；
·先前用抗癌疫苗或任何靶向疗法进行的治疗；
·研究4周内的重大手术或外伤性损伤；
·中枢神经系统转移的历史或证据。
结果显示于图32-35。此试验的结果进一步证实，Pertuzumab活性在患有HER3低表达的癌症的患者中最大，且趋向于随HER3基因表达水平降低而升高。Pertuzumab活性在患有高HER2:HER3表达的癌症的患者中也是最大的，且趋向于随HER2:HER3基因表达水平升高而升高。大多数响应Pertuzumab疗法的、具有低HER3表达水平的患者也具有高HER2:HER3比。
在具有HER3高表达的肿瘤的患者中，Pertuzumab与吉西他滨之间可能有消极的相互作用。
HER3表达在化疗背景上可能是预后性的，其中高表达的肿瘤较好。
实施例4：铂抗性上皮卵巢癌患者中Pertuzumab+吉西他滨相对于吉西他滨+安慰剂的II期研究中的HER途径基因表达分析
背景：在患有铂抗性(CDDP-R)上皮卵巢癌(eptithelial ovarian cancer, EOC)的患者中关于Pertuzumab+吉西他滨对比吉西他滨+安慰剂进行的一项随机化II期试验(N=130)提示，Pertuzumab能延长PFS（HR 0.66，95% CI 0.43，1.03），而且PFS持续时间可能与HER3基因表达有关（见实施例2和3）。
方法：将CDDP-R EOC患者随机化成G+P或G+安慰剂。给予治疗，直至发生进展或直至不可接受的毒性。主要终点是PFS。次要目标是在具有HER2活化相关表达序型的患者中评估功效结果。如上所述，使用归档的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织(FFPET)，实施容许进行HER途径基因的mRNA表达分析的qRT-PCR测定法，所述基因包括HER1、HER2、HER3、双调蛋白、和β细胞调节素。结果描述为低基因表达（<中值）和高基因表达（≥中值）。
结果：在所测试的5种生物标志物中，只有HER3基因表达基于低对高结果提示具有不同PFS和OS结果的患者亚组。通过qRT-PCR HER3结果获得的、所有患者的最终PFS和OS结果如下：
G+P G+安慰剂 危害比(95%CI)
PFS（中值，月）
所有患者(n=130) 2.9 2.6 0.66*(0.43,1.03)
低HER3(N=61) 5.3 1.4 0.34(0.18,0.63)
高HER3(N=61) 2.8 5.5 1.48(0.83,2.63)
OS（中值，月）
所有患者(n=130) 13.0 13.1 0.91*(0.58,1.41)
低HER3(N=61) 11.8 8,4 0.62(0.35,1.11)
高HER3(N=61) 16.1 18.2 1.59(0.8,3.2)
*所有患者分析是根据ECOG状态、疾病可测性和在先治疗方案#对CDDP-R疾病分层的。
结论：此探索性分析提示，低肿瘤HER3基因表达水平可用作CDDP-REOC患者中的预后指标。Pertuzumab治疗可增加具有低HER3基因表达肿瘤患者中的吉西他滨临床活性。这些数据提示，HER3 mRNA表达水平可用作预后性的和预测性的诊断生物标志物。
Figure IDA0000374590400000011
Figure IDA0000374590400000021
Figure IDA0000374590400000041
Figure IDA0000374590400000051
Figure IDA0000374590400000061
Figure IDA0000374590400000071
Figure IDA0000374590400000081
Figure IDA0000374590400000091
Figure IDA0000374590400000101
Figure IDA0000374590400000111
Figure IDA0000374590400000121
Figure IDA0000374590400000141
Figure IDA0000374590400000171

Claims (9)

1.一种用于治疗患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的HER二聚化抑制剂，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
2.一种用于治疗患有卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的Pertuzumab，其中所述患者的癌症以小于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
3.一种用于为患有能够响应HER二聚化抑制剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择HER二聚化抑制剂作为疗法。
4.一种用于为患有能够响应化疗剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择化疗剂作为疗法。
5.一种用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的HER抑制剂，其中所述患者的癌症以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
6.一种用于治疗患有卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌的患者的方法，包括对该患者施用治疗有效量的Pertuzumab，其中所述患者的癌症以大于卵巢癌、腹膜癌、或输卵管癌中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3。
7.一种用于为患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER2和HER3表达，并且，如果该癌症样品以大于该癌症类型中HER2:HER3表达第25百分位的水平表达HER2:HER3，那么选择HER抑制剂作为疗法。
8.一种用于治疗患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的HER抑制剂，其中所述患者的癌症以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3。
9.一种用于为患有能够响应HER抑制剂的癌症类型的患者选择疗法的方法，包括测定来自该患者的癌症样品中的HER3表达，并且，如果该癌症样品以小于该癌症类型中HER3表达水平中值的水平表达HER3，那么选择HER抑制剂作为疗法。
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