CN1035619A

CN1035619A - 人类松弛素配方

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Publication number: CN1035619A
Application number: CN89100947A
Authority: CN
Inventors: 大卫·C·西普拉; 吐·H·古扬; 斯蒂芬·J·喜儿
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-25
Publication date: 1989-09-20
Anticipated expiration: 2004-02-25
Also published as: DE68906153D1; PT89835B; AU626840B2; IL89276A; JP2815649B2; EP0407401A1; WO1989007945A1; US5451572A; NZ228012A; IE63208B1; US5945402A; AU3183389A; ES2013394A6; CN1052655C; ATE88352T1; PT89835A; CA1336403C; DE68906153T2; JPH03502794A; IL89276A0

Abstract

本发明提供一种人类松弛素的药物组合物，其特征为该组合物的酸度为pH4左右至7左右的范围。用于引产或阻止早产的该组合物包括：可将该组合物维持于所需pH范围的缓冲剂及可使该组成物成为等渗的药剂，必要时还可加入稳定剂。作为一个特例，本发明提供了一种溶于柠檬酸盐的缓冲液(pH5.0左右)的人类松弛素配方，其中存在氯化钠，离子强度大约为0.15μ。

Description

本发明涉及一种稳定的、均质的、具有生物学活性的人类松弛素的配方及将该配方用于治疗哺乳动物的方法。

成熟的人类松弛素为一种卵巢激素肽，分子量大约为6，000道尔顿，已知与分娩前的产道改变有关，因而可以促进生育过程。参见：Hisaw，F.L.，Pros.Soc.Exp.Biol.Med.，23，661-663（1926）;Schwabe，C.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，75：503-570（1977）;James，R.et al.，Nature，267：544-546（1977）.该蛋白质似乎是调整靶器官的结缔组织的变化的，使在妊娠期及分娩中引起所需的器官结构的变化。作为妊娠激素，松弛素所起的作用包括抑制早产及分娩时的子宫颈催熟。

虽然松弛素主要是妊娠激素，然而在非妊娠妇女及男性体内亦可测出它的存在。参见：Bryant-Greenwood，G.D.，Endocrine Reviews.3：62-90（1982）及Weiss，G.，Ann.Rev.Physiol.，46：43-52（1984）。

松弛素已从许多种生物中被提纯，包括：猪、鼠、马、鲨、虎、大鼠、角鲨及人类，并且显示出与胰岛素及类胰岛素生长因子至少在一级结构及二级结构上有同源性。对于人类，经发现妊娠期黄体（CL）中含量最丰富。

两种人类基因型，通过采用猪松弛素基因探针进行基因组克隆而被确定，尽管人们发现在这两种基因型中仅有一种（H2）在CL中被转录。参见：（Hudson，P.et al.，Nature，301：628-631（1984）and Hudson，P.et al.，The EMBO Journal，3：2333-2339（1984）。目前还不清楚，究竟另一种基因在另一个组织位点被表达呢，还是这只是一个拟基因。这两种人类松弛素基因相互之间在核苷酸及氨基酸方面显示了明显的同源性，尤其是在B及C肽中。然而，亦存在若干显著的序列分歧区域，尤其在A及B链中的氨基末端区域中。

与所测试的所有物种类似，H2松弛素的初级转译产品为一种前松弛素原，它是包括24个氨基酸的信号序列，在其后接着大约29个氨基酸的B链有104-107个氨基酸的联接肽，以及大约有24个氨基酸的A链所组成。

H2松弛素是在卵巢中合成并被表达的这一事实寓意着，该松弛素为一个参与妊娠生理过程的蛋白顺序。在对合成的人类松弛素（H2）及某些人类松弛素类似物就其生物学活性进行测试时发现，存在一个松弛素核心，对于生物学活性是必需的，同时还发现了蛋氨酸上的某些取代氨基酸不影响生物学活性。参见：Johnston et al.，in Peptides：Structure and Function，Proc.Ninth American Peptide Symposium，Deber，C.M.et al.（des.）（Pierce Chem.Co.1985）。

有许多应用或引入猪松弛素作为药物的方法，包括采用静脉及肌肉输注，已经被发表。参见：Birnberg and Abitol，Obstet.& Gynecol.，10：366-370（1957）;Eichner et al.，Am.J.Obstet.Gyn.，71：1035-1048（1956）.

此外，猪松弛素的局部应用已用于人类临床试验，以催熟子宫颈及进行引产。参见：MacLennan et al.，Obstetrics & Gynecology，68：598-601（1986）;MacLennan et al.，The Lancet，i：220-223（1989）;MacLennan et al.，Obstetrics & Gynecology，58：601-604（1981）;MacLennan et al.，Aust.NZJ.Obstet.Gynaec.，25：68-71（1985）.在这些研究中，是将溶于蒸馏水的猪松弛素混以水溶性甲基纤维素颗粒以产生粘滞的凝胶。已发现2mg的剂量可以改善子宫颈的状态。参见：MacLennan etal.（1981），supra.

此外，猪松弛素还可用聚1，2-亚乙基二醇模压成丸药，用以催熟人类子宫颈。参见：Evans et al.，Am.J.Obstet.Gynecol.，147：410-414（1983）.猪松弛素也可采用悬浮于灭菌的K-Y凝胶及磷酸盐缓冲的食盐水进行配制，采用一个灭菌的授精管以使之输入子宫颈口。在子宫颈口输入3，000单位的松弛素之后的8小时之内，子宫颈的扩张不断增加。参见：Perezgrovas and Anderson，Biology of Reproduction，26：765-776（1982）。

公开于1983年8月24日的公开号为86，694的欧洲专利揭示了如何制备猪的前松弛素原、猪松弛素原及猪松弛素。发表于1987年8月26日的澳大利亚第561，670号专利及公开于1983年1月5日的公开号为68，375的欧洲专利及文献Haley et al.，DNA，1：155-162（1982）揭示了如何制备猪松弛素。

公开于1984年2月22日的公开号为101，309的欧洲专利及发表于1988年7月19日的第4，758，516号美国专利分别地揭示了对人类H1-松弛素及H2松弛素及其类似物编码的基因序列进行的分子克隆及特性鉴定。公开于1988年3月16日的公开号为260，149的欧洲专利揭示了人类松弛素原的配方。发表于1981年5月12日的美国专利第4，267，101号揭示了一种自胎膜获得人类松弛素的方法。公开于1988年1月7日的公开号为251，615的欧洲专利揭示使还原的人类松弛素A链或其类似物与还原的人类松弛素B-链或其类似物在某些条件（包括pH值大于7.0）下进行结合的方法。

美国专利第4，267，101号揭示了一种自胎膜制取人类松弛素的方法。文献Sherwood，in The Physiology of Reproduction，ed.by Knobil and Neill，（New York，Raven Press，（1988），p.585-673，于第587页揭示了藉助松弛素于酸性溶剂中的稳定特性而进行的提取及分离的方法的几乎所有的操作方法。此外，在第588页上还指出，在松弛素提取过程中采用强酸性介质，从低pH值本身及使高分子量蛋白酶沉淀这两方面使蛋白水解减少至最低程度。文献Eldridge and Fields，Endocrinology，117：2512-2519（1985）报道免的松弛素具有一个等电点，经等电聚焦测定，为6.5左右。这是与文献Fields et al，Ann.NY Acad.Sci，380：75（1982）的发现相违背，该文献作者发现的兔松弛素等电点远远地高于此。

另外，发表于1960年12月13日的第2，964，448号美国专利揭示了可注射的松弛素组合物，包括溶于注射用油中的松弛素（最好为低酸度的），及铝的脂肪酸盐。

本发明的一个目的是，提供一种可用于治疗的即通过局部或非肠胃道给药的具有生物学活性的、稳定的、人类松弛素的均质配方。本发明的另一个目的是，提供一种在液态可以允许长期贮藏，而便于在施用前的存放及运输。本发明的另外一个目的是减少人类松弛素的凝聚及降解从而提供一种可抵抗因温度的波动而引起降解的配方。本发明的又一个目的是提供一种用于子宫颈的凝胶人类松弛素。本发明的再一个目的是提供一种具有附加的治疗及物理学/化学优点的人类松弛素配方。

如从整体来考虑本发明说明书，本发明的这些目的及其它的目的将成明显的。

由上可知，本发明提供一种具有生物学活性的药物组合物，可用于调节哺乳动物的生殖生理，包括：一种溶于可将该组成物pH保持于大约4-7、较佳为4.5-5.5的缓冲液的有效数量的人类松弛素。另外，该配方最好是等渗的。

该组合物可以为液态、冻干状态、冷冻液体或凝胶形态。如果组合物是凝胶形态的，最为进一步包括水溶性的多糖或聚1，2-亚乙基二醇，最好是包括甲基纤维素。

在另一个实施例中，本发明涉及一种使哺乳动物调节生殖生理的方法，包括：对哺乳类生物施以治疗学上有效数量的该组合物。

直至本发明提出之时，才令人满意地在酸性境遇下使人类松弛素的降解率当用HPLC测试时达到最低的水平。因而，可以减低配方的免疫原性，从而提高了它的安全度。由于此项发现，使人类松弛素的配方经制备后可保持其生物学活性，并具有较长的贮存寿命期，而且既可以在冷冻干燥的情况下也可以不通过冷冻干燥而施于人类达到治疗目的。该松弛素较好的是在pH5左右进行配制，这样的情况下，在5℃下的贮存寿命期至少长达2年（假定位于HPLC主峰区面积中可接受的衰减量为10%）。

附图的简要说明：

图1a-1e表示在3种不同温度下，pH自3至7.5的范围内，对应于五种不同的配方的人类松弛素所作的反相高效液相色谱（RP-HPLC）主峰组分随时间变化的函数曲线图。

图2表示用RP-HPLC在三种不同的温度下测得的，配方的pH值对人类松弛素配方的降解速率的影响的曲线图。

图3a-3e表示在3种不同的温度下，pH自3至7.5的范围内，时间对五种配方的人类松弛素的活性的影响的函数曲线图。

图4表示在25℃下，在pH5的加入不同的稳定剂的柠檬酸盐配方的反相HPLC主峰的降解速率的条状图。

图5表示通过静脉、皮下及阴道内给药对妊娠期兔子进行短期施用，在血清中的浓度随时间变化的曲线图。

图6表示在苯并红紫存在与不存在的情况下通过皮下对妊娠期兔子进行短期给药，在血清中的浓度随时间变化的曲线图。

对较佳实施例的描述：

人类松弛素在这里是指一类具有特定激素功能的功能蛋白，诸如：对人类及可能的其他哺乳动物的生殖生理进行调节，包括而又不限于，维持妊娠、导致分娩及增进精子的泳动以助于受精。作为特例，包括这些用途：施用于涉及妊娠的生殖功能，同样用于其他的生物学功能如通过对耻骨联合或耻骨韧带产生影响及调整胶原丝从而使产道形成而导致生产;对于子宫肌层的阻抑作用;形成子宫内膜以便植入;在黄体水解（luteolysis）中的作用;乳腺的生长及分化;增进精子的泳动;并可能增进精子透入子宫颈的能力。人类松弛素及其类似物的功能既可通过其对于鼠的耻骨联合的作用在体外测定，也可以通过采用一个子宫细胞系在体外对cAMP水平的上升进行测定。在此特指药物组合物的术语“生物学活性”，在上文是指人类松弛素。

人类松弛素及其制备方法，包括在重组细胞培养中合成的方法，请参见：（e.g.，EP 101，309 and 112，149，supra）。

“松弛素”术语包括来自重组或天然来源的人类松弛素或松弛素的变体，诸如氨基酸序列的变体。通过采用快速原子轰击的质谱分光离子化作用，发现在黄体及血清中的人类松弛素的主要种类为H2松弛素，具有一个切除末端的B链，即，松弛素H2（B29A24），B链的四个C末端氨基酸缺失，故而B链头端在29位上有一个丝氨酸。该主要类型（在此称为“短松弛素”以对应于有含33个氨基酸的B链的“长松弛素”）在此被优先采用。

术语“人类松弛素”还包括具有其他插入、取代或缺失一个或多个氨基酸残基、糖基化变体、非糖基化的人类松弛素，及其有机及无机盐、人类松弛素共价修饰的衍生物、人类前松弛素原及人类松弛素原。通过采用重组DNA技术，松弛素变体可以通过改变基础的DNA来制备。所有因松弛素分子结构的改变而产生的变体，只要它还保持人类松弛素的生物学功能，就应该包括于本发明的范围之内。具有所述的生物学功能的那些人类松弛素可以通过上述的体外测试法而方便地加以确定。

变体可以通过将松弛素编码序列经一种或多种方法加以改变在所选基因的特定位置内引入天冬氨酸-编码密码子的方法来制备。产生的变体蛋白质可以用稀酸加以处理，以释放所需的蛋白质或肽，从而使该蛋白质更易于分离及纯化。

松弛素也可以通过制造一个松弛素链及泛激素（ubiquitin）的熔合蛋白质，并用泛激素（ubiquitin）水解酶裂解蛋白质的方法来制备。此外，利用了一个编码反活化（trans-activating）蛋白质的载体的松弛素原的酵母表达系统也可以采用。

如公开了1988年1月7日的欧洲专利第251，615号所述，这里所指的松弛素可以通过合成A及B链及将之提纯并组装而加以制备。在合成松弛素时一般采用A与B链的摩尔比为4∶1。所获产物可用本技术领域内的具有一般熟练程度的人员用任何已知的方式加以提纯，例如包括：反相HPLC，离子交换层析，凝胶过滤，渗析或其他方法或兼用以上这些操作方法。

配于组合物中的松弛素的有效数量是以若干情况为基础进行选择的，包括：治疗的特定条件，患者的病史及治疗途径或采用的治疗日程等。所述的治疗的条件包括难产、抑制早产及医治某些结缔组织的疾病诸如硬皮病等。治疗途径包括不经肠胃的给药，诸如，皮下、腹膜内、静脉及肌肉注射施用。

用于治疗有病的妊娠的平均常用（current）剂量，是按照许多对于一般熟练度的药师为公知的指征来改变的，包括施用途径及治疗日程、妊娠阶段、松弛素的类型、接受治疗的患者的状态、组合物的形式及其他的医师们知道的因素。作为举例，在临床上，局部施用的有效数量大约为5至10ml中含有大约1至3mg松弛素的凝胶是合适的。静脉注射使用的平均剂量在每公斤体重含大约0.1μg至1，500mg的范围，以达到生殖的作用，诸如形成产道等。

配方的pH维持于4至7左右，较佳为4至6左右，再佳为4.5至5.5左右，最佳为5左右。不过最佳的pH还取决于配方的离子强度及配方的贮存温度。配方最好为等渗的，且配方的离子强度至少为0.1μ左右，较佳为0.1至0.2μ左右，最佳为0.15μ左右，而配方的重量克分子渗透度（osmolality）优选为200至300mmol/kg左右，较佳为240-260mmol/kg左右。如贮存温度为40℃左右，pH较佳时为4至7左右。而如贮存温度为25℃左右，pH较佳时为4至5。

在此，配方的pH最好用一种能将pH维持在所需的范围的缓冲剂来维持。某种缓冲剂是否被采用，取决于其缓冲容量，更为具体地说，取决于其pK值。所举的例子包括某些有机酸缓冲剂及组氨酸。合适的有机酸缓冲剂（有机酸及其盐的缓冲剂）包括：（例如）柠檬酸盐缓冲剂（例如：柠檬酸一钠及二钠盐的混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠盐的混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠盐的混合物，等等），琥珀酸缓冲剂（例如：琥珀酸-琥珀酸单钠盐的混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠盐混合物，等等），酒石酸缓冲剂（例如：酒石酸-酒石酸钠盐混合物，酒石酸-酒石酸钾盐混合物，酒石酸氢氧化钠混合物，等等），苹果酸盐缓冲剂，葡糖酸盐缓冲剂（例如：葡糖酸葡糖酸钠盐混合物，葡糖酸氢氧化物混合物，葡糖酸葡糖酸钾盐混合物，等等），硼酸缓冲剂，咪唑缓冲剂，乳酸盐缓冲剂（例如：乳酸乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠，乳酸乳酸钾盐混合物，等等）及乙酸缓冲剂（例如：乙酸乙酸钠盐混合物，乙酸-氢氧化钠混合物，等等）。在此，最佳的缓冲剂为柠檬酸盐及乙酸盐缓冲剂，其中尤以柠檬酸盐为佳。值得指出的是，惯常使用的磷酸及（Tris）三羟甲基氨基甲烷缓冲剂不能将pH值保持在配方所需的水平。

在此，较佳的配方应具有适当的等渗性及重量克分子渗透度（osmolality）以利于非经肠胃的应用，尤其是静脉输注。如果离子强度及重量克分子渗透度（osmolality）不在上述的优选范围，那么就须调至此范围，某种药剂可以加入配方以调节重量克分子渗透度（osmolality）至适当。这类药剂包括：（例如）碱金属盐及碱土金属盐诸如：卤化物，例如，氯化钠及钾，溴化镁等等，及中性的多羟糖醇，诸如甘露糖醇。其中最佳试剂为氯化钠。

为了使配方稳定及冷冻干燥，配方中也还可以加入一种药物可接受的药剂。例子包括：多羟基糖醇，诸如，三元醇或高级醇，最佳的为甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇及山梨醇、甘露糖醇，此外还可用直链醇，诸如：乙醇及丙二醇。这些药剂可以单独或联合使用。该药剂在配方中所占的重量百分比优选的为1至25%左右，更好的为2至10%。以其他组成部分的重量计算。

此外，在此，该组合物中含有一种在局部使用时，可增进子宫颈及阴道吸收的药剂。这类吸收增进剂的例子包括那些具有类似于胆固醇的结构的分子，诸如甘胆酸盐例如甘胆酸钠，胆酸盐，例如胆酸钠及梭链孢酸及其衍生物，包括盐类及酯类，诸如：24，25-牛磺双氢梭链孢酸盐（tourodihydrofusidate）;非离子型表面活性剂;具有7至25左右的碳原子的脂肪酸的衍生物，诸如：油酸：烟酰胺;烟酸或水杨酸或其盐类或酯类;以及阿佐恩（azone）。

此处优选的人类松弛素溶于pH为5的10mM柠檬酸缓冲液，其中存在的氯化钠使总离子强度大约为0.15μ，具有合适的重量克分子渗透度（osmolality）。

在此的该配方可以为液态冷冻或凝胶态也可以为冻干状态并重新组成。本技术领域内人员可以确定任何附加的赋形剂的类型及数量，诸如：糖醇，可对于最利于冻干是必需的。甘露糖醇是该优选的添加剂中的一种。在此的该配方可在延长了的时间内保持稳定，并可以液态在各种温度下加以贮存。该液态配方与盛放于塑料容器相比，较理想应贮存于玻璃容器中。此外，该配方可以被冷冻、融熔、再冷冻、再融熔而不产生不良影响。优选的贮存温度位于-20至30℃范围，更为优选的温度范围为2至8℃左右。此处的液态的该配方至少可在30天内保持其生物学活性，且从1年的数据推断，可至少保持物理学上的稳定性达2年时间。

为了获得一种凝胶配方，该液态组成物将典型地混以有效数量的水溶性的多糖或聚1，2-亚乙基二醇以形成具有合适粘滞度的施于局部的凝胶。可以采纳的多糖包括：（例如）纤维素衍生物诸如：醚化了的纤维素包括烷基纤维素羟烷基纤维素，及烷羟基烷基纤维素，例如，甲基纤维素、羟乙基纤维素、羰甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及羟丙基纤维素;淀粉及分级淀粉;琼脂;褐藻酸及褐藻酸盐;阿拉伯树胶;支链淀粉;琼脂糖;角叉胶;葡萄糖;糊精;果聚糖;菊粉;甘露聚糖;木聚糖;阿刺伯聚糖（arabinans）;聚氨基葡糖;糖原;葡聚糖;及合成生物聚合物;以及胶质物诸如：苍耳烷胶;瓜耳胶;刺槐豆胶;阿拉伯树胶;黄蓍胶;刺梧桐树胶;及其衍生物及混合物。在此优选的胶剂为对于生物学系统不发生作用的，无毒的，易于制备并且并不太稀或太粘，并不使混于其中的松弛素失去稳定性者。

多糖最好为醚化的纤维素衍生物，更为理想的为明确指定的，经纯化的列于美国药典中者，例如：甲基纤维素及羟烷基纤维素衍生物，诸如：羟丙纤维素，羟乙基纤维素及羟丙甲基纤维素。在此最为优选的为甲基纤维素。

可用于形成凝胶的聚1，2-亚乙基二醇在典型的情况下为高分子量与低分子量的聚1，2-亚乙基二醇的混合物，以便获得合适的粘度。例如，当将一种分子量为400-600的聚1，2-亚乙基二醇与一种分子量为1，500的聚1，2-亚乙基二醇以适当的比例混合时，可以满意地得到一种膏浆。

术语“水溶性”用于多糖及聚1，2-亚乙基二醇系指包括胶溶液及悬浮液等等。一般地，纤维素的水溶性取决于醚基取代的程度，在此适用的稳定的衍生物应在纤维素链的每个葡糖酐单位具有足够数量的这类醚基，以使该衍生物具有水溶性。在一般情况下，每个葡糖酐单位至少有0.35醚基的取代程度是足够的。此外，纤维素取代物可以为碱金属盐的形式，例如，Li、Na、K或Cs盐。

如果在凝胶中采用了甲基纤维素，较好情况下，含量大约为凝胶的2-5%，而松弛素的含量为每毫升凝胶含100-1，000μg左右，更好地，甲基纤维素含量为凝胶的3%，松弛素含量为每毫升300-1000μg。

当然，如果配方为一种光敏性的凝胶，理想情况下，应含有一种或多种药剂，诸如：抗氧化剂（优先用维生素C，最好至少0.5%），及/或助溶剂（优先用甘油及/或乙醇，最好在20%左右的含量，而最理想的为甘油）用于当凝胶暴露于光线之下时抑制或防止光氧化作用。例如，可将甲基纤维素凝胶贮存于用锡箔遮盖的，或有色的管状瓶，以阻止光线射入。

以下的实施例对本发明加以描述，而并不对本发明的范围加以限制。

实施例1

用pH值自3至10范围的几个10mM的缓冲液对人类松弛素的稳定性加以研究（研究1）。同时也对离子强度的增加对于配方的稳定性的影响加以研究（研究2）。

样品的制备

对于研究1及2，人类的长松弛素（H2型，具有33个氨基酸的B链）是通过固相合成法合成A及B链（上述欧洲专利第112，149号对之加以揭示）来获得的。参见文献：Barany，G.and Merrifield et al.，（1980）in The Peptides，2：1-284，Gross，E.and Meienhofer，J.，eds.，Academic Press，New York.

A及B链经HPLC提纯（三氟乙酸（TFA）/乙腈梯度），在pH为10.2左右的0.2-1M CAPS缓冲液（3-[环己基氨基]丙磺酸，Calbiochem出品）、0.75M盐酸胍、10%（V/V）甲醇（Burdick及Jackson）形成的体系中，在总蛋白质含量在0.25-2.0mg/ml的条件下，以A∶B链为4∶1重量比例组装A及B链。该溶液经冲入氮气并于20℃下搅拌过液（12-18小时）。将该样品经渗析至合适的缓冲液（磷酸盐缓冲的盐水、0.01%吐温20，或0.1%乙酸），随后用Vydac C-4 HPLC进行上柱，采用TFA/乙腈梯度洗脱。松弛素组份用HPLC确定，随后真空除去样品中的TFA缓冲液。将由此获得的松弛素进行真空冷冻干燥。

将124mg（大约作为肽的含量为80%重量比例）长松弛素用于研究1而将20mg（大约作为肽的含量为67重量%）用于研究2。两种样品均用白色的冷冻干燥粉末含有高至15%重量比的三氟乙酸（TFA）制成的样品。加入充足的Milli-Q水（通过由Millipore公司制造的由活性炭及离子交换剂的水净化系统的去离子水）以使溶液中肽的浓度为1mg/ml。通过在5℃下使用Spectrapor7（截留3500MW）的透析管，将溶于Milli-Q水中的长松弛素转入合适的配方缓冲系统。将该透析管预先在含有1ml β-巯基乙醇、3.36g EDTA及4.2gNa HCO₃的2升Milli-Q水中洗涤，随后在60至70℃下在2升Milli-Q水中洗涤四次。之后将该透析管于5℃贮存于50%（w/v）的乙醇中，在透析之前再反复洗涤。

所有样品在透析之后立即用紫外吸收分光光度仪对其浓度进行测定，采用消光系数2.18（mg/ml）^-1cm^-1，以定量分析胺基酸的方法测定对蛋氨酸残基为赖氨酸所取代的松弛素类似物的测定，用以校正受光线散射影响的浓度。将各个样品在层流橱（hood）中经0.2μMillex GV-4（0.01平方英寸表面积）无菌过滤滤器过滤，注入灭菌的100μL、300μL或1.5ml硼硅酸盐玻璃瓶（wheaton），盖上用聚四氟乙烯衬底的螺旋盖子，并将之分别贮存于5、25及40℃。浓度可准确地指明所需物已滤入小瓶，因为各个单独的实验表明在1mg/ml进行过滤，并不使蛋白质的浓度发生显著的下降。

在研究1中将每一缓冲液的三只小瓶贮存在每一个温度下，以期可对误差进行估测，并为了确定样品是否因多次从同一小瓶中取样而遭污染。

对于研究3，采用松弛素H2（B33A24）A^pyro-Glu′，其中H2指在人类卵巢中表达的人类基因，A及B指人类松弛素各自的链，A或B之后的数字是指链的长度，即为包括A或B链的氨基酸数字，氨基酸之前的下标，注明了氨基酸所在的链为A链或是B链，而氨基酸之后的上标标明了在链中所处的位置。上述的公开号为251，615的欧洲专利对于这种类似物的制备及链的重组作了一般性地描述。蛋白质按上述方法提纯并用于研究1及2。

按上述方式将36ml浓度大约为4.65mg/ml的人类焦glu松弛素配制于pH5.0的10mM柠檬酸盐中，并加入Na Cl以使之成为等渗。将该蛋白质稀释成1mg/ml（用分光光度计测定，采用消光系数为2.18）。将总量为1.4ml的每个配方灭菌地在层流橱中滤入1.5ml的备有盖子的经高压消毒的玻璃瓶中。在对于冷冻及冻融作用的研究中，蛋白质也被稀释成为2mg/ml并在冷冻后进行研究。

稳定性的研究方案

研究1：

将溶于水中的浓度大约为1mg/ml的20ml的长松弛素20ml份通过透析转入10mM甘氨酸（pH3）、10mM柠檬酸盐（pH5）、10mM乙酸盐（pH5）、10mM组氨酸（pH6）及10mM Tris缓冲剂（pH7.5）的由表Ⅰ提供的准确的配方中，并计算柠檬酸盐缓冲剂成份含量以使pH为5.0。在所有缓冲剂补充Na Cl以使溶液达到等渗（0.154μ）。浓度按前述方式测定，样品经灭菌过滤，并按表Ⅱ所列的方案装瓶。将所获的135只100-μL-微型瓶及90只1.5-ml-小瓶放置于5、25及40℃进行稳定性测试。样品在0、7、21及30天时用反相高效液相色谱（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）及环AMP进行测定。除这些测试之外，样品还用近紫外圆二色性分析及用分析型超离心在0及30天时进行测定。此外，在5℃对于柠檬酸配方用反相HPLC进行五个目的分析，在-20℃进行六十天的分析。

研究2：

将浓度大约为1mg/ml的溶于水中的1ml的长松弛素，通过透析转移入由10mM乙酸盐、柠檬酸盐及琥珀酸盐缓冲剂形成的pH为5的不添加盐的或添加0.1M或0.5M Na Cl的溶液中（缓冲剂组成列于表Ⅰ）。将所获的九种样品分别地灭菌过滤，分成三份相同的体积并存于灭菌的300μL玻璃微型瓶中。所得大约含量为9mg的27只小瓶在5、25及40℃下，进行长至40天时间的稳定性测试。样品用ELISA及C4反相HPLC测定进行并用在第0、7、14、28及40天进行C4反相HPLC测试。将剩下的3mg松弛素在5℃下放入Milli-Q水中，用作对照材料。研究1及连续的稳定性研究表明，在5℃下用反相HPLC测得至少可稳定五个月。这些观察结果是在接下的稳定性研究中对各参考样品进行重复的观察得到的。

表Ⅰ

1.0mg/ml的松弛素液体实验性的配方

研究1配方

配方每ml组成

10mM甘氨酸，pH3.0 0.74mg甘氨酸-HCl（6.66mM）

0.25mg甘氨酸（3.34mM）

8.87mgNa Cl（0.152M）

10mM乙酸盐，pH5.0 0.25mg乙酸钠（2.96mM）

7.0uL 1.0M乙酸（7.04mM）

8.60mg Na Cl（0.147M）

10mM柠檬酸盐，pH5.0 0.69mg柠檬酸单水合物（3.3mM）

1.97mg柠檬酸钠二水合物（6.7mM）

7.25mg Na Cl（0.124M）

10mM组氨酸，pH6.0 1.12mg组氨酸-HCL（5.32mM）

0.73mg组氨酸（4.68mM）

8.66mg Na Cl（0.148M）

10mM Tris，pH7.5 1.32mg Tris-HCl（8.36mM）

0.20mg Tris碱（1.64mM）

8.52mg Na Cl（0.146mM）

＊所有配方均为等渗的（0.154μ，加入Na Cl补足后的离子强度）。

研究2配方

配方每ml组成10mM乙酸，pH5.0 0.54mg乙酸钠（3.42mM）

3.42μL 1.0M乙酸（6.58mM）

10mM琥珀酸，pH5.0 0.51mg琥珀酸（4.25mM）

1.55mg琥珀酸二钠六水合物（5.75mM）

10mM柠檬酸，pH5.0 0.53mg柠檬酸（2.78mM）

2.12mg柠檬酸钠二水合物（7.22mM）

所有的三种缓冲液+0.1M Na Cl 5.84mg Na Cl

所有的三种缓冲液+0.5M Na Cl 29.22mg Na Cl

表Ⅱ

用于松弛素稳定性研究1的每次测试所需之小瓶中配方的体积（μL）

时间 ELISA UV HPLC 环AMP 近UVCD UC

0天 10 100 10 10 500 50

7天 10 - 10 10 - -

14天 10 - 10 10 - -

21天 10 - 10 10 - -

1个月 10 100 10 10 500 50

2个月 10 100 10 10 500 50

3个月 10 100 10 10 500 50

4个月 10 100 10 10 500 50

5个月 10 100 10 10 500 50

6个月 10 100 10 10 500 50

将配制的用于7、14及21天ELISA、HPLC及环AMP测试的配制的蛋白质100μl置于灭菌的100μl的微型瓶（3瓶/每次测试×5种配方×3种温度＝45瓶）中。将1、2及3个月的样品按相似方式分组（45瓶），4、5及6个月的样品类似地于另外的45瓶中分组，因而对于这三种测定共用了一百三十五只100μl微型瓶。将剩下的配制成的蛋白质分盛于1.5ml小瓶中，使每瓶含有0.9ml，该量对于CD、UV及UC测定是足够的。这样，总共为90个1.5ml小瓶（5种配方×3种温度×6个时间点）。

研究3：

用于测定含有松弛素类似物的配方如下所列：

1.10mM柠檬酸盐缓冲液，加Na Cl使为等渗。

2.10mM柠檬酸盐缓冲液，加Na Cl使为等渗，并对新配制的等渗柠檬酸盐缓冲液进行透析（将之作为对照）。

3.10mM柠檬酸盐缓冲液，加甘露糖醇（5.07%）使为等渗，对10mM柠檬酸盐、5.07%甘露糖醇缓冲液（无Na Cl）进行透析。

4.10mM柠檬酸盐缓冲液，加Na Cl使为等渗，加入5%无水乙醇。

5.10mM柠檬酸盐缓冲液，加Na Cl使为等渗，加入10%无水乙醇。

6.10mM柠檬酸盐缓冲液加Na Cl使为等渗，加入5%甘油。

7.10mM柠檬酸盐缓冲液加Na Cl使为等渗，加入10%甘油。

8.10mM柠檬酸盐缓冲液加Na Cl使为等渗，加入5%丙二醇。

9.10mM柠檬酸盐缓冲液加Na Cl使为等渗，加入10%丙二醇。

10.10mM柠檬酸盐缓冲液加Na Cl使为等渗，加入0.02% EDTA（二钠盐）。

11.10mM柠檬酸盐缓冲液加Na Cl使为等渗，加入5%甘露糖醇。

这些配方一式三份置于5、25及40℃。

此外，将1ml浓度为2mg/ml的原先的松弛素等渗（Na Cl）柠檬酸盐缓冲液注入27只1.5ml小瓶并于-20℃进行冷冻。在第0、3天将小瓶融熔并进行测定;在以后的天数中对三个小瓶进行融熔并测定。

测定方法

高效液相法（HPLC）测定：在应用下列柱条件：以1毫升/分流量，溶液A：0.1%TFA，溶液B：0.1%TFA，90%乙腈，以1%/分从20%A至50%B的梯度以一个Vydac^TMC⁴反相柱上得到包谱。

在研究1中，该色谱的总面积在测量误差范围内保持恒定，即主峰面积的减少副峰面积的增加一起计算。该HPLC柱的连续再揭示了大部分松弛素在该梯度条件下被洗脱出来。这性能与在研究2中所观察到的性能相反，研究2中由HPLC测定所决定的总面积随时间而变，当该物料被高度纯化时，由HPLC所测量的稳定性得到增加。

酶联免疫吸附法（ELISA）测定：样品被稀释至稀释用的缓冲液中用于ELISA测定，以致于所希望的浓度将落在该标准曲线的线性部分的中列数中。用于ELISA测定的初次抗体（待发性抗体）相对于合成的人类松弛素肽。其中该人类松弛素A-链在该链的1号位具有一焦-Glu的为一种亲合性-经纯化的兔的多克隆抗体。

由ELISA所决定的浓度通过与该稳定性样品一起提供的对照样品而标定。由ELISA所测定的值通常比所希望的以UV光谱为基础的值大，但在标定之后，比所希望的值小约20%。在研究1中，提供三份平行操作的样品，从三个小（玻璃）瓶的每一个中取出样品，释稀作每一时间点的测定。

环腺一磷酸（AMP）测定：在一测定细胞的缓冲液中稀释样品，并培养猕猴子宫细胞。用杜邦德耐摩斯有限公司，威尔明顿，戴尔（dupont de Nemours，Inc.，Wilmington，Del.）的生产厂的测定步骤测定所产生的细胞悬浮液的环状AMP。一标准曲线用于说明环状AMP浓度与松弛素浓度的关系。这浓度理论上为一与ELISA相反的“生物活性”浓度，它测定了免疫活性的浓度。与稳定性样品一起提供一已知浓度的对照样品，并用于标定该松弛素的已确定的浓度。

鼠的耻骨联合的测定：鼠的耻骨联合韧带在体内生物测定测量系测定松弛素使在结缔组织上的改型效应，参见史蒂耐茨，B.G.等（1960年）内分泌学，67卷：102页（Steinetz，B.G.et al.，（1962）Endoerinology 67：102）靠近UV圆二色性（CD）：以约1毫克/毫升的松弛素样品用渗析液1∶1稀释，且在20℃下在-0.5厘米光通道长度的恒温圆柱形比色杯中得到在一Aviv^TM改进的Cary60分光偏振计中的320至240毫微米的光谱。在收集CD数据之后，从该CD单元中移去该样品，并用磷酸盐-缓冲盐水稀释5倍。然后，在用UV吸收光谱法之前确定其浓度。在椭圆度（毫度）中的该CD信号，用阿德勒等，酶的方法，27卷：695页（1973年）（Adler et al.，Meth.Enzym.，27：675（1973））所述的方法，用一用于人类松弛素的平均残余重量112.9克转化为平均残余重量椭圆度。

分析用超离心法：松弛素稳定性测试用的样品用合适的渗析液稀释4倍，并装至双扇形面超速离心杯中，该杯被放至一An-F4孔分析离心管中。超速离心法是在一贝克曼模型E（Beckman Model E）分析型超速离心机中，以32，000转/分（转速），在200℃下进行18小时。在分离实验中，确定了18小时是以得到沉降平衡的时间。在该离心杯中的浓度梯度是由UV吸收的，在280毫微米下，用一光电的光学描扫器来确定。该曲线轨迹用一Macintizer^TM显迹垫板输入一Macintosh计算机中。该对应于离心杯中的浓度梯度和重量平均分子量可用（下列）等式表示（泰勒，酶的方法，27卷：346页（1972年）（Teller，Meth.Enzym.，27：346（1972））：

Mw＝2RT/[W²（1-vp）]dlnc/dr²，

其中Mw为重量平均分子量。T为温度，R为气体常数，W为以弧度表示的角速度，v为蛋白质的微分比容，p为溶液密度，c为蛋白质浓度，及r为从旋转中心至离心物的半径长度。该等式假设一理想溶液，并在选择的缓冲条件下显示出对松弛素沉积将是合适的。Inc对r的最小二乘方回归分析得到在该单元中作为一在该浓度范围的平均值的重量平均分子量。该数据也可用一三阶多项式来修正，且在该离心杯中测得的各浓度下得到用于dlnc/dr²的值。该用于松弛素的微分比容0.731毫升/克是根据科恩和爱德松，“为离子和偶极离子的蛋白质、氨基酸和肽“（海富纳：纽约，1965年），第157-175页（Cohn and Edsall，“Porteins，Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions”（Hafner：New York，1965），pp.157-175），应用用于各氨基酸残余物的值，从该氨基酸组成来计算的。

结果

研究1：作为随时间而变的松弛素的降解率可用反相HPLC来监测，当全部HPLC主峰的总面积不随时间变化时，该总面积的百分比可被用于研究松弛素的降解动力学。保持的主峰的百分率从三份样品（有效的）来计算，且确定了用于如表Ⅰ（范围从3.0克至7.5）中所示的组配方的主要的HPLC峰的降解动力学的一级降解曲线。接着该动力学通过用反相HPLC来测量松弛素主峰的消失速率来研究。图1a-1e为在这三个温度下对于5组配方的主要的HPLC峰的百分率对时间变化的图，表示降解的速率。图1a为在10毫摩尔/升甘氨酸（pH值为3.0）中的松弛素，图1b为在10毫摩尔/升柠檬酸盐（pH值为5.0）中的松弛素，图1c为在10毫摩尔/升组氨酸（pH值为6.0）中的松弛素，图1d为在10毫摩尔/升乙酸盐（pH值为5.0）中的松弛素及图1e为在10毫摩尔/升Tris（pH值为7.5）中的松弛素。在各图中，三角表示5℃，圆圈表示25℃，及方块表示40℃。这些图显示了松弛素降解可通过一一级降解速率动力学来分析。图2显示在5°（空心方块）、25°（菱形）及40℃（实心方块）下，对5组配方的用于主峰的降解的确定的一级降解速率常数对pH值变化的曲线。在图2中的该数据显示出人类松弛素在一pH值约4至6，且最好是pH值为5时最合适。

研究2：在琥珀酸盐、乙酸盐及柠檬酸盐配方中，由RP-HPLC和ELISA所测得的松弛素的稳定性不是大大地受离子强度的变化而影响，如通过应用0.01摩尔/升、0.1摩尔/升和0.5摩尔/升氯化钠而得到的影响。该蛋白质被配制为约0.15微克离子强度，重量分子渗透浓度约250毫摩尔/千克，为了可将该配方用于静脉内的以及肌肉的注射。

研究3：表Ⅲ和Ⅳ分别显示有关柠檬酸盐配方在pH值为5.0下，在5℃下贮藏1年（以1毫克/毫升松弛素的浓度）和在-20℃下60天（以2毫克/毫升松弛素的浓度）的反相HPLC数据。在表Ⅲ中的数据可用外推法推断以估计在5℃下至少2年的稳定性（即，不大于约10%降解），假设一级降解动力学。所有两表表示该配方在各温度下是稳定的。

表Ⅲ

反相HPLC

在5℃下贮藏的柠檬酸盐配方的稳定性

时间保留时间面积总面积×10 主峰

（天）（分）（主峰）×10 百分率

0 20.95 2.84 2.84 .998

0 19.85 2.96 2.98 .995

0 20.88 2.89 2.94 .985

平均值 20.6±0.6 2.90±.06 2.92±.07 .993±.007

14 19.78 2.68 2.75 .977

14 19.72 2.51 2.52 .997

平均值 19.8±.03 2.60±.09 2.64±.01 .987±.01

30 20.2 2.57 2.68 .959

30 21.8 2.36 2.47 .955

平均值 21.0±.8 2.47±.1 2.58±.1 .957±.002

97 20.2 2.62 2.69 .974

97 20.2 2.57 2.61 .984

平均值 20.2 2.60±.03 2.65±.04 .979±.005

150 20.7 2.84 2.98 .957

150 20.7 2.81 2.92 .961

150 20.7 2.82 2.96 .955

平均值 20.7 2.82±.02 2.95±.03 .958±.003

在5℃下1年以后，用于人类松弛素的主要的RP-HPLC峰的一级解降速率常数。在各时间点的数据在三份（样品）（有效的）中平均化，且适合下式：In（主峰百分率）＝A-kt

截距 k（天） R t.9 t1/2（年）

-0.027±0.007 -0.00008±0.00004 .746 ＞2年＞2

表Ⅳ

反相HPLC

在-20℃下贮藏的柠檬酸盐配方的稳定性

时间保留时间面积总面积×10 主峰

（天）（分）（主峰）×10 百分率

0 19.70 4.25 4.29 .990

0 19.70 4.22 4.24 .995

0 19.72 4.19 4.21 .993

平均值 19.71±.01 4.22±.03 4.25±.04 .993±.003

30 20.22 4.31 4.35 .989

30 20.20 4.29 4.32 .994

平均值 20.21±.01 4.30±.01 4.34±.02 .989±.005

60 19.82 4.76 4.86 .979

60 19.87 4.61 4.67 .991

60 19.85 4.59 4.63 .992

平均值 19.85±.03 4.65±.09 4.72±.12 .987±.007

关于松弛素的稳定性和生物活力的关系可通过应用一种测定法，测量通过松弛素与猕猴子宫细胞的相互作用引起的环状AMP的产品，来研究。该环状AMP生物的浓度对时间的生物测定曲线在图3a-3e中示出，其中图3a为在甘氨酸-盐酸（pH值为3.0）中的松弛素，图3b为在柠檬酸盐（pH值为5.0）中的松弛素，图3c为在乙酸盐（pH值为5.0）中的松弛素，图3d为在组氨酸（pH值为6.0）中的松弛素及图3e为在Tris缓冲液（pH值为7.5）中的松弛素。在各图中，空心方块为5℃，实心圆圈为25℃，及空心三角为40℃，且直线为所希望的值。在该实验的误差范围内，显示出全部样品（pH值从3至7.5）在贮藏40天之后均具有相同的生物活性。

关于松弛素的生物活性的稳定性也可用鼠的耻骨联合测定来确定。在pH值为5的柠檬酸盐缓冲液中的未降解的松弛素与在pH值为7.5的Tris缓冲液中的一高度降解的样品的生物活性的比较揭示了在该测定的误差范围内不存在生物活性的差异。

一ELISA和一圆二色性测定被用于确定该配方的蛋白质构象。该数据表明该松弛素的三维结构在贮藏1或2个月之后是不变的。

在蛋白质自身结合中可能性的变化可用沉降平衡分析型超离心法技术来研究。在10毫摩尔/升乙酸盐、pH值为5的0.1摩尔/升氯化钠中的松弛素通过载荷浓度0.1、0.2和0.4毫克/毫升下通过分析超离心法来分析。在全部三个载荷浓度下的该重量平均分子量为约10，000，表明在这些条件下松弛素形成二聚物。

将各种药物学上可接受的赋形剂加至10毫摩尔/升柠檬酸盐、pH值为5的配方中以研究它们对该配方的稳定性的影响。图4为一显示在该三种温度下对于各配方的主要的反相HPLC松弛素峰的降解速率的图。从左到右，经超滤的（实心的）和渗析的（密的影线）样品与具有如下加入的赋形剂的样品比较：一等渗量（交叉的影线）或5%（中度密度的影线）重量的甘露糖醇，5%（空心的）或10%（实心的）重量的丙三醇，5%（平线的）或10%（点状的）重量的乙醇，5%（稀的影线）或10%（空心的）重量的丙二醇，及0.02%（实心的）重量的EDTA。每一样品均在5、25或40℃下贮藏。可见，与经超过滤和渗析的对照物相比，该赋形剂在稳定性方面只有可以忽略的影响是在实验误差以内。该经超过滤程渗析的样品也显示出相互之间无区别。

另外，可制备冻干的配方，其中松弛素可作为一酸性溶液而重新组成。更具体地讲，长松弛素在最初在柠檬酸盐配方缓冲液中存在以后被渗析至10毫摩尔/升柠檬酸盐、0.507%甘露糖醇，pH值为5.0中。然后，经无菌过滤这预制物至9个3毫升管形瓶中，每瓶体积1毫升。将这些管形瓶放在一个在一Lyovac GT20冻干器中的盘上。冷却该松弛素样品至-50℃，且然后在0℃下经历第一个干燥周期25小时。这通过在25℃下第二个干燥周期17.5小时来研究。在该干冻终止时，1个管形瓶用1毫升（Milli-Q）水重新组成，且显示出非常澄清，无混浊，表明一成功的重行组成。因此，残余的管形瓶在5℃和25℃下稳定放置。

先于冻干转化至冻干缓冲液中的长（链）松弛素被用作为预冻干对照物。除了零时间重组样品之外，样品在5℃和25℃下贮藏了2周、1个月和3个月之后重组。全部样品通过前面所述的RP-HPLC用于分析降解产品。只要可能计算三份注射液的平均值。对于全部样品，不管贮藏的冻干的时间的长度，主峰百分率是不变的（见表Ⅳa），表明在25℃下3个月之后不失去稳定性。而且，全部样品的分光光度分析表明在25℃下冻干贮藏多至3个月的条件下，在光扩散百分数方面无增加。

表Ⅳa

样品主峰百分率

每个预冻干对照物：97.3%

时间无重建：97.8±0.7%2

周，5℃：98.3±0.3%2

周，25℃：98.1±0.4%

1个月，5℃：97.8%

1个月，25℃：97.6%

3个月，5℃：98.0±0.5%

3个月，25℃：98.8±0.4%

最初的冰冻-融化研究表明该蛋白质可在-20和-60℃下，以一pH值为5的2毫克/毫升的浓度，在一液态配方中冰冻而在HPLC测定中无任何可观察到的变化。而且，表Ⅴ提供了用于柠檬酸盐，pH值为5.0，冰冻的配方的RP-HPLC稳定性数据，然后用一所用的样品融化，再立即冰冻并保持冰冻30天，最后在室温下融化5小时。直至融化未观察到HPLC数据的变化。

表Ⅴ

反相HPLC（冰冻-融化）

在-20℃下贮藏的柠檬酸盐配方的稳定性

时间保留时间面积总面积×10 主峰

（天）（分）（主峰）×10 百分率

零时间样品再冰冻

30 20.18 4.50 4.54 .989

30 20.18 4.51 4.56 .989

30 20.20 4.48 4.53 .987

平均值 20.19±.01 4.50±.02 4.54±.02 .988±.001

在室温下5小时＊

0 19.82 4.76 4.86 .979

0 19.87 4.61 4.67 .991

0 19.85 4.59 4.63 .992

平均值 19.85±.03 4.65±.09 4.72±.12 .987±.007

5小时 19.88 4.60 4.65 .989

＊：在-20℃冰冻状态下放置60天的样品在室温下贮藏5小时，并再测定。

结果，由RP-HPLC所测得的人类松弛素的结构的完整性受配制时的pH值的影响，在pH值为7及再高一些的值时出现降解。该HPLC测定揭示了在被研究的5组配方中，松弛素在一pH值为5的乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液中比在其它缓冲液中稳定，且该pH值为5的柠檬酸盐缓冲液在5和-20℃下多至5个月最稳定。生物活性是不受影响的。

实施例Ⅱ

在猪的和人类的H2松弛素比较中，重量平均分子量数据显示出人类松弛素比猪的松弛素在pH值为5的溶液中的结合程度大得多。在不同的载荷浓度下所得到的用于人类松弛素的数据是相似的，提示了该聚合为一可逆的自身结合。该数据还是显示出用于人类松弛素的自身结合在pH值为3时的范围比pH值为5时的范围为小。

实施例Ⅲ

已发现松弛素的天然形式为具有一含有29个氨基酸（短松弛素）而不是33个氨基酸（长松弛素）的B链的形式。该研究的目的在于确定该短松弛素与长松弛素比较是否具有相似的稳定性和吸收性。而且，用远程UVCD比较松弛素的该两种形式在280毫微米时的消光系数和二维结构。

在这些实验中所应用的短松弛素是通过限制性长松弛素（在实施例1中合成的）的蛋白水解作用以致于在B链中得到29个氨基酸。在将长松弛素合成之后，将它应用于一个用一TFA梯度的HPLC柱，且然后应用于一个单S离子交换柱。然后，将该含有松弛素的片段通过渗析过滤至一缓冲液配方中。向该缓冲液（含200毫克松弛素）中加入胰蛋白酶[其比例为1份胰蛋白酶对2000份（重量份）松弛素]，并进行蛋白水解作用约40分钟。然后，将50微升-16.9毫克/毫升羧（基）肽酶B（70u/毫克）的溶液加至该水解液中。所产生的溶液在室温下放置1小时，然后用柠檬酸酸化，并用HPLC和单S柱纯化。将这样纯化的松弛素经渗析过滤至pH值为5，用氯化钠等渗的10毫摩尔/升柠檬酸盐中，直至1.0毫克/毫升，并在-60℃下冰冻贮藏（1毫升，在3毫升的型号为Ⅰ的玻璃管形瓶中）。这组的一部分也以液态提供，且指定为一非冰冻样品。

温度稳定性：在10毫摩尔/升pH值为5的等渗的柠檬酸盐中的松弛素的稳定性可通过研究主要的反相HPLC峰的降低的一级降解速率动力学来测定。在应用下列条件：1毫升/分流量，在30分钟内20%溶液A至50%溶液B的梯度（溶液A为0.1%三氟乙酸，及溶液B为0.1%三氟乙酸，90%乙腈）的一个Syn Chropak^TMC₄反相柱上得到高效液相色谱。

表Ⅵ表示长松弛素和短松弛素之间的动力学的比较。长松弛素的一级降解速率常数从上年的稳定性数据中来确定，且短松弛素的一级降解速率常数从冰冻-融化样品的6个月数据和非冰冻样品的二个月数据中来确定。所包括的经确定的一级降解速率常数为t.9和t1/2时的值。短松弛素的稳定性至少与长松弛素的稳定性一样好，且可能更好，因为该冰冻-融化样品在25℃下有比2年稳定性更大的稳定性。如以前对于长松弛素所观察到的，冰冻和融化不影响短松弛素的稳定性。

表Ⅵ

对长松弛素和短松弛素的主要的RP-HPLC

峰的降解的一级降解速率常数

三份的平均值用于以符合：

In（主峰百分率）＝A-kt

缓冲液截距 k（天¹） t.9（天） t1/2（天）

长松弛素

5℃ -0.027±0.007 -0.000082±0.000037 ＞2年＞2年

25℃ -0.028±0.010 -0.000591±0.000055 178.2 ＞2年

40℃ -0.028±0.024 -0.002603±0.000132 40.5 266.3

短松弛素（非冰冻）

5℃ -0.007±0.005 -0.000116±0.000132 ＞2年＞2年

25℃ +0.002±0.004 -0.000516±0.000106 204.1 ＞2年

40℃ -0.001±0.008 -0.003988±0.000194 26.4 173.8

短松弛素（冰冻-融化）

5℃ -0.005±0.003 -0.000037±0.000032 ＞2年＞2年

25℃ -0.005±0.006 -0.000478±0.000220 ＞2年＞2年

40℃ -0.001±0.007 -0.002773±0.000247 52.4 345.0

光稳定性：将2个短松弛素的管形瓶放在一个具有强度1600英尺烛光的光盒中7天。一个管形瓶用铝箔与光隔开，并用作为一对照物。将长松弛素的主要的松弛素峰的保留时间标定至短松弛素的保留时间，并在表Ⅶ中示出。那么，降解峰的各保留时间与这经标定的值有关系。如可见的，短松弛素和长松弛素的该经标定的保留时间非常一致，暗示在两种蛋白质中发生相似途径的降解。但是，长松弛素的降解的速率显示出要与比短松弛素的多少要大一些。

表Ⅶ

短松弛素和长松弛素的光稳定性

长松弛素短松弛素

暴露在1600英尺烛光的光中7天

Rt^＊保留主峰百分率^＊Rt^＊保留主峰百分率^＊

19.34±0.01 64.70±0.53 19.34±0.01 78.56±0.64

17.62±0.08 7.38±0.20 17.67±0.02 8.56±0.16

17.20±0.08 11.26±0.19 17.38±0.01 4.90±0.022

15.49±0.03 4.68±0.13

对照物

Rt^＊保留主峰百分率^＊Rt^＊保留主峰百分率^＊

19.33±0.02 97.16±0.37 19.33±0.02 97.09±0.26

19.33±0.02 1.88±0.15 19.02±0.02 2.03±0.16

＊该主峰的保留时间被标准化至短松弛素的，且降解峰的保留时间与该经标准化的值有关。

＊具有面积小于总面积2%的峰为清楚起见而省略。

对搅动的稳定性：在室温下，在一Glas-Col型号S-500搅拌器上调正在2.5单元处搅拌盛有短松弛素的一个管形瓶7天。一个对照物管形瓶在室温下保持不受搅动。松弛素的稳定性通过上述用于温度稳定测定的反相HPLC来测定。

表Ⅷ表示在搅拌7天之后保留的主要的松弛素峰的百分率。这些数据表明，在长松弛素或短松弛素中，当与未搅动对照物比较时，通过在该经搅动的样品中的反相HPLC检测的重大变化是不存在的。

表Ⅷ

短松弛素和长松弛素的搅动稳定性

长松弛素短松弛素

Rt保留主峰百分率 Rt保留主峰百分率

对照物

19.97±0.02 97.84±0.17 19.26±0.04 98.50±0.28

经搅拌的

19.97±0.02 98.53±0.43 19.17±0.03 98.45±0.23

吸附研究：将松弛素稀释至约10微克/毫升，在一般的盐水中通过UV分光光度测定法来确家。将硅橡胶^R管0.02英寸内径×0.037英寸外径的二端与一装有一个5毫升玻璃注射器和一根22G针的Harvard输注泵相连接。松弛素以100微升/分的速率通过管子，在开始10分钟内每分钟收集到100微升样品，接着每5分钟直至第30分钟收集到100微升样品，至900微升ELISA测定缓冲液（EAB）中。这1∶10的稀释液通过在ELISA测定用的缓冲液EAB中的二次连续稀释至被稀释到1∶4000。该1∶4000稀释液通过ELISA测定了蛋白质的浓度。

该松弛素被吸附到该管子上。但是，在通过该管子输注5分钟之后，该松弛素的浓度接近于如由ELISA所确定的所希望的浓度。在该曲线下的面积的积分显示出由于吸附至在该管子的表面上，蛋白质的总量损失约5%。显示长松弛素和短松弛素之间在吸收至硅橡胶管子方面没有发现很大的区别。

消光系数的确定：长松弛素和短松弛素的消光系数通过从两个分别确定的定量的氨基酸分析来计算，对长松弛素来讲为2.04或2.14平方厘米/毫克，及对短松弛素来讲为2.25或2.30平方厘米/毫克。经计算的长松弛素和短松弛素的摩尔消光系数为13，000±200（摩尔/升）^-1厘米^-1。这结果暗示从C-末端除去4个氨基酸对两色氨酸和一酪氨酸的瞬间环境方面的影响极小。这也昱示了松弛素的这两种形式的构象是相似的。

圆二色性（CD）以在pH值为5的10毫摩尔/升等渗的柠檬酸盐中的长松弛素（0.8毫克/毫升）和短松弛素（以1毫克/毫升）的样品，在从240至190毫微米的圆二色性光谱用一Ariv Cary60分光偏振计来测定。该样品在0.01厘米光程长度的圆柱形石英比色杯中恒温。将CD输出的毫度用一平均残余重量113和在228.4毫微米下用UV吸收所得到的松弛素浓度转化为平均残余重量椭圆度。松弛素的该浓度用对长松弛素和短松弛素分别为2.04和2.25平方厘米/毫克的消光系数来确定。二维结构的估计量通过常等，生物化分析，91卷：第13-31页（1978年）（Chang et al.，Anal.Biochem.，91：13-31（1978）的方法来确定。

通过常（chang）等supra，的方法的远程UV CD光谱的分析得出此松弛素的50%为α螺旋线形，40%为β片形和3%无规线团形，短形松弛素的50%为α螺旋线形和50%β片形。短松弛素和长松弛素在光谱中的不同是在实验误差范围之内，且明显地暗示短松弛素和长驰素的二维结构是非常相似的。结论：在液态配方中，短松弛素的热稳定性与长松弛素的热稳定性不相上下，且可能超过它。进一步讲，光暴露和搅动稳定性在该两蛋白质中也是相似的。物理性质如摩尔消光值、二维结构及表面吸收也显示出是相同的。

实施例Ⅳ

这实施例说明松弛素胶凝配方的制备和性质。

液态松弛素的制备

如在实施例Ⅲ中所述的经制备和配制的短松弛素（含有29个氨基酸β链）用于这实验。因此，该松弛素为一浓度1.0毫克/毫升，在pH值为5.0，用氯化钠的10毫摩尔/升等渗的柠檬酸盐中1毫升。这配方在管形瓶中，于-60℃下冰冻贮藏一直到刚要用时才取出。来自这些管形瓶中的松弛素通过在一个2毫升的Amicon Centricon 10微型浓缩器中以4000转/分离心浓缩1至2小时而浓缩至大于2.4毫克/毫升（如通过UV光谱学，假设e＝2.04毫升/毫克·厘米来确定）。（精确的时间取决于需浓缩的松弛素的最初的体积。）

4%甲基纤维素凝胶制备

根据下列方案，一4%甲基纤维素凝胶从甲基纤维素A4摩尔/升的甲基纤维素粉末（道氏化学（Don Chemical）中再生：

（a）在一有搅拌棒存在的40毫升烧杯中，将10毫升柠檬酸盐配方缓冲液（如在实施例Ⅰ中所述）加热至接近沸点（-90℃），然后从热源上移开。

（b）将0.8克甲基纤维素粉末加至该烧杯中，回荡几分钟以分散该颗粒。

（c）然后，在5℃的较冷的房间里，将该烧杯放在一磁性搅拌器上。在该液体开始变厚之前立即加入一附加的10毫升冷的柠檬酸盐配方缓冲液，冲洗该烧杯壁上的干颗粒。

（d）在连续搅拌20分钟之后，该液体的粘度增加直至一均相的4%甲基纤维素凝胶形成。

（e）最后两个稳定性研究，该4%甲基纤维素凝胶高压灭菌，不仅消毒该凝胶，而且除去在该凝胶中存在的任何已溶解的氧。从高压灭菌器中移开后，在液面上为氮气空间下搅拌该凝胶以再均化该凝胶而不导入任何新的氧气。

用于局部松弛素的制备

按下列方案可得到一600微克/毫升松弛素的均相的3%甲基纤维素凝胶：

（a）将2个无菌的10毫升注射器放在天平上称皮重，向一个注射器中加入3克该4%甲基纤维素凝胶。向另一个注射器中加入该凝胶的1/3体积（1毫升）2.4毫克/毫升液态松弛素配方。

（b）将活塞放回该二个注射器中，将该二个注射器和一无菌的Rainin47-FLU连接器相连，将接速器拧在该二个注射器的尾端。

（c）该松弛素溶液通过推动一个注射器，然后将另一个注射器中推进20-25次使分散至甲基纤维素中，使形成一均相凝胶。（但是，在最后二个实验中，为了易于贮藏和样品移开，可将该凝胶转移至1.5毫升埃本道夫（eppendorf）管中。）在该凝胶中的松弛素的最终浓度为600微克/毫升。该凝胶也含有3%甲基纤维素，10毫摩尔/升柠檬酸盐，pH值为5，且用氯化钠等渗。

ELISA测定

在该凝胶中的松弛素的样品连续10次用同在实施例1中所用的ELISA稀释剂按顺序地稀释以达到一浓度为6毫微克/毫升的松弛素。显示出对高至0.25%甲基纤维素凝胶，如由ELISA所确定的该松弛素浓度无影响。该ELISA测定，如上所述，揭示了以UV光谱为基础，在该凝胶中的松弛素浓度比所希望的低25%（假设一消光系数为2.04）。这结果是由于该测定用标准是全长的β-链松弛素及所提供的样品是缩短了β-链的松弛素。

局部用的松弛素的RP-HPLC分析

用于分析液态松弛素配方的，在实施例Ⅰ中所述的方法经改进后用于局部用的松弛素样品。由于该凝胶的高粘度，用水稀释样品10倍，旋转5分钟以均化该凝胶，并保持静止以让气泡上升。这些样品的分析通过在室温下注射250微升至-C₄-300 Synchropak（4.6×250毫米）柱上而完成。最初的平衡缓冲液为18%乙腈，0.1%三氟乙酸。洗脱以1%分速率进行，增加线性乙腈梯度，在30分钟后达到一最终浓度为45%乙腈。流量保持恒定，在1.0毫升/分，且在214毫米处监测吸光度。“减速”步骤（系指该粘的凝胶抽到计量装置所用的时间）从36分钟增加至270分钟。已发现在增加该“减速”步骤之前，由于其高粘度，实际上注射入大大少于250微升的凝胶。

在这些实验的过程中，该Synchropak柱开始失去其分离出峰的能力。因此，最后几次注射是在-C₄-300 Vydac柱上进行。

在局部松弛素配方上进行三个重要的稳定性实验。第一个测量这些制剂在室温下放置5周后的稳定性。在温度和光的波动的条件下，将该样品留在原注射器中。

RP-HPLC分析揭示了该主要的、未降解的松弛素峰易于随时间而增加降解的量，如由主峰的面积的百分率的减少和早期洗脱降解峰的面积的百分率的增加所证明。

关于主峰面积的百分率，在时间零（在将该松弛素推入该凝胶之前）时，主峰的面积的百分率的减少被定量化和得到标定。经标定化的主峰百分率对时间的对数曲线揭示该局部松弛素经受了一级降解动力学降解。

从HPLC流出液分别收集主要的松弛素峰和最大的降解峰并在真空下在Savant Speed-vac中冻干^～1小时。然后，这些样品在硫甘油和乙酸中重组，并在探针上还原以分离A链和B链，且通过质谱来分析。二个样品的质谱分析揭示了二个样品的A-链的摩尔离子是一样的，且与预见的~2657相一致。但是，B-链的摩尔离子是不同的。主峰样品的摩尔离子与理论值~3314相一致。来自降解峰的B-链的摩尔离子为~3330。这16的增加数精确地说明相当于当在B-链中的残基被氧化时所预期的值。

66毫克来自猪的卵巢的猪的松弛素，被重组至柠檬酸盐酸配方缓冲液中，经旋转约^～3分钟以使某些颗粒成凝成丸状，并以3.19毫克/毫升在0.248毫升柠檬酸盐配方缓冲液中与如上所述的4%甲基纤维素混合以产生一具有600微克/毫升猪的松弛素的3%凝胶。与经缩短的B-人类松弛素相反，当经受如上所述的HPLC分析时，猪的松驰素配方的降解非常小。

第二次研究是一在5℃和25℃下，在较好的控制条件下，局部用松弛素的稳定性的测量。而且，用于该研究的甲基纤维素凝胶用高压灭菌以消毒它并从可能引起氧化的该凝胶中除去任何已溶解的氧气。将该局部用的松弛素的样品转移至4根埃本道夫管中，2根在5℃下贮藏，2根在25℃下贮藏。144小时之后，该局部用的松弛素在5℃下开始降解，同时该物料在25℃下相对来讲则未降解，如由HPLC分析确定。连续的分析揭示了当25℃的盒完全与各光源隔绝时，在5℃下较冷的房间中的光常常能照在上面。

为确定这光是否导致在5℃下该降解峰的形成，将2个样品中的一个包裹在铝箔中以与该光隔绝，在5℃下，附加360小时之后，曝光的松弛素已完全降解，而该经隔绝的松弛素以一非常低的速率续降解，如由HPCL确定。因此，光的存在显示出影响稳定性，与光隔绝完全保护了该局部用的松弛素，但暴露至光下再遮盖导致以一非常低的速率继续降解。在贮藏了672小时的该局部用的松弛素（遮盖再暴露至光下）中的宽峰的收集物的质谱揭示了A-链是不受影响的，但B-链显示出经受了第一次，然后第二次的氧化。

第3个实验是直接比较该局部用松弛素与配制的液态松弛素的稳定性，两者均暴露至光下再与光隔绝。在5℃下贮藏816小时之后，RP-HPLC谱指出当该局部用松弛素与光隔绝时，它就与配制的液态松弛素一样稳定，两者均具有96%主峰。但是，当该局部用松驰素暴露至光下时，对降解它明显比配制的液态松弛素要惊人地敏感得多。

功效的研究

该研究的目的在于确定短松弛素对兔子宫颈成熟方面的功效。选择兔子，因为经研究已提出这种动物的子宫颈的机械行为的一个相当好的模型，且因为该兔子宫颈显示出在其生理学反应方面与人类的子宫颈是类似的。

用重4，5至6.0千克的成熟的怀孕的雌的新西兰兔进行研究。在怀孕26-27天时，该兔（每组4个）用在-3%甲基纤维素凝胶中的如上所述的短的人类松弛素凝胶或猪的松弛素凝胶处理。短的人类松驰素和猪的松弛素以每个动物100，200，300，600和1000微克/毫升松驰素的剂量来配制。该二种激素通过一注射器和一导管以0.5毫升的体积注入阴道内应用。对照动物仅接受载体。在16-18小时之后，用-戊巴比妥的致死量处死该动物。该子宫，较下面的一段，及子宫颈被除去，在10%NB福尔马林中固定并用于组织学考察。切下石蜡切片，并用苏木紫/曙红和紫生草蓝PAS染色。用一般形态学测定截面切面，特别上在黏膜下层中的肌肉组织和胶原（蛋白）原纤维的分离程度，及特有的PAS阳性的巨大的细胞的存在，该细胞是在巨噬细胞源的多核细胞在生育时渗入子宫颈，该巨大的细胞的测量是用Mac Lemnan等在Am J.Obstet.Gyncecol.，152卷：第691-696页（1985年）中所述的方法进行的。

一个初步研究，其中将一浓度为300微克/毫升的人类的或猪的松弛素用于一局部用的配方中，提出在这剂量下，可使激素诱导形态的变化及并使在怀孕的子宫颈成熟。在应用该药至子宫颈18小时之后，可观察到显著的扩张和子宫颈的熟化。经染色的颈的截面切片的组织学测定显示出在插入空间中肌肉粘膜与少量累积的富有蛋白质物料明显分离，胶原（蛋白）纤维素（胶原（蛋白）密度减少），在基层物质中增加，及粘膜下层与淋巴管脉管肿胀。同样，特有的DAS阳性的巨大的细胞，它在对照动物中是稀有的，在该经处理的松弛素组中大量存在。这样细胞通常可出现在血管的周围，并在上皮的下层中，虽然在该子宫颈的整个浓度都可找到。继续研究，其中希望能决定最低的，及若可能，最高的松弛素的有效剂量，是与早期的结果相反的，在300或600微克/毫升时无有效性可见，且仅具有1毫克/毫升剂量时可见有明显的有效性。

药物动力学研究

该研究的目的在于确定在怀孕的兔中，短松弛素在单独地静脉注射施用、皮下注射施用和阴道内施用之后的生物有效性。

所用的兔为4-5千克的、16个定期怀孕的多胎产的雌新西兰白种兔（Elkhorn）。在怀孕26天时，4个动物（第Ⅰ组）通过在用Abbocath T导管经耳静脉注射浓缩药团（iv）接受100微克/千克的剂量的短松弛素。3个动物（第Ⅱ组）在股部接受-100微（克）/千克在消毒盐水中的短松弛素的皮下注射的（sc）剂量。3个动物（第5组）接受100微克/千克在1%苯并红紫中的短松弛素的皮下注射剂量。4个动物（第3组）接受-100微克/千克在3-甲基纤维中的短松弛素的阴道内给药的剂量。静脉注射及皮下注射的剂量浓度为在1mg/ml松弛素内有500微克/毫升的短松弛素的澄清液体，在盐水中，用无菌等渗盐水或1%苯并红紫进行稀释。剂量体积近似于1毫升，并分别根据下列等式计算：

剂量体积＝（100微克/千克）（千克）/（500微克/毫升）对于阴道内给药，根据上述方案，全部的3毫克甲基纤维素凝胶（4%）与0.487毫升短松弛素（如上所述）和0.513毫升柠檬酸盐配方缓冲混合，以产生-600微克/毫升短松弛素，3%甲基纤维素。阴道内给药剂量为体积为0.5毫升。

血样（1毫升）用＝

Viggo Secalon导管从耳动脉中抽出。血的取样时间为：（iv）0，1，2，3，4，5，7，10，20，40，60，80，120，180，240，300，360，420，480，540，600，660和720分钟;（皮下注射和阴道内的）0，1，2，3，5，7，10，15，20，30，40，50，60，75，90，120，180，240，300，420，\\480，540，600，660和720分钟。血样经凝结，通过离心而获得血清。样品在干冰上冰冻，并在-70℃下贮藏直至用ELISA测定。该测定范围为20至1280微微克/毫升。

对于用一供给程序的非线性曲线的三指数模型，各iv药物动力学参数是通过提供各免疫反应的血清浓度-时间数据来计算的（NONLIN84，统计咨询有限公司;莱克辛顿，肯塔基（Stati stical Consutants，Inc;Lexington，KY））。用RS-1程序（鲍尔特，伯耐克和纽曼，剑桥，马萨诸塞（Bolt，Berrak & Newman，Cambridge，MA））计算从血管外途径用的数据。在该血清浓度-时间曲线（AUC）下的面积用梯形方法，从t+0至最后可测量的血清浓度（Ct）来计算。通过外推法计算AUC，从Ct至无穷大时间：Ct除以终端消去率常数分。血清清除率（Ct）通过等式CL＝剂量/AUC（iv）来计算。分布的初始体积（Vc）从Vc＝剂量/C（O）来计算，其中C（O）为描述血清浓度-时间数据的三指数方程的系数的总和。在稳定态的分布体积（Vdss）如：CL^＊AUMC/AUC来计算，其中AUMC为在瞬间曲线，即，（血清浓度）＊（时间）对时间曲线下的面积。血清半衰期通过将0.693除以相应的处理速率常数来计算。生物有效性通过面积比例的方法：

（AUC（血管外的）AUC（iv））^＊100来确定。

100微克/千克在怀孕的兔中的短松弛素在静脉注射，皮下注射和阴道内施用之后的血清浓度＝时间分布图可在图5中示出，其中实心圆圈为静脉注射，空心方块的皮下注射，及空心圆圈为阴道内施用。图6表示的100微克/千克短松弛素，用（实心圆圈）和不用BPP皮下施用于怀孕的兔子，（空心方块）的血清浓度-时间分布的比较。表Ⅹ列出了经计算的各途径施用的药物动力学参数。在静脉注射施用后的血清清除率为2.95±0.88毫升/分/千克。分布的初始体积（Vc）和稳态体积分别（Vdss）相应为89±22和209±30毫克/千克。三指数须用于描述iv血清浓度＝时间数据，因此其半衰期（t1/2）分别为8.4±2.7，59.1±8.7及279±128分。人类的松弛素的皮下施用产生一平均峰值血清浓度，在180分钟时为76.20±17.80毫微克/毫升，及一生物有效性76.0±20.6%（用具有100%生物有效性的静脉注射松弛素）。用BPPsc皮下施用的人类松弛素产生一平均峰值血清浓度，比单独皮下施用的人类松弛素所观察到的要低（41.67±16.32毫微克/毫升）和晚（420分钟）。用BPP的生物有效性为59.4±6.7%。

人类松弛素在阴道内施用显示出很差的有全身性吸收。全身的血清浓度非常低（0.34±0.16毫微克/毫升，在98分钟时）且结果产生的生物有效性仅为1.0±0.8%。

表Ⅹ

100微克/千克在怀孕的兔子中的的hRlx在iv，sc和阴道内施用之后的药物动力学参数。

途径 1）AUC 2）CL 3）Vc 4）Vdss

毫微克- 毫升/分/ 毫升/千克毫升/千克

分/毫升千克

iv 1a 55.21 1.81 80 179

1b 31.77 3.10 69 188

1c 25.23 3.96 120 228

1d 34.19 2.93 85 241

平均值 36.60 2.95 89 209

SD 12.97 0.88 22 30

sc 2a 24.25

2b 21.67

2c 36.47

平均值 27.46

SD 7.91

top 3a 0.20

3b 0.80

3c 0.33

3d 0.14

平均值 0.37

SD 0.30

sc⁺

BPP5a 19.01

5b 23.60

5c 23.76

平均值 22.12

SD 2.70

SD＝标准误差

top＝局部施用的

表Ⅹ（续）

途径 5）t1/2(1) 6)t1/2(2) 7)t1/2(3) 8)t1/2(Absp)

（分）（分）（分）（分）

iv la 10.1 69.3 439

ib 5.8 51.1 168

lc 11.3 52.7 184

ld 6.5 63.3 325

平均值 8.4 59.1 279

SD 2.7 8.7 128

sc 2a 45.6

2b 57.1

2c 85.9

平均值 62.9

SD 20.8

top 3a 55.8

3b 119.0

3c 37.1

3d 21.3

平均值 58.3

SD 42.9

sc+

BPP5a 75.2

5b 76.9

5c 131.0

平均值 94.4

SD 31.7

SD=标准化误差

top=局部使用的

表Ⅹ（续）

途径 9）t1/2（项）^Q10）C峰 11）T峰 12）BA^＃

（分）毫微克/毫升（分）（%）

iv 1a

1b

1c

1d

平均值

SD

sc 2a 73 95.30 120 66.4

2b 72 59.90 180 62.0

2c 176 73.40 240 99.7

平均值 107 76.20 180 76.0

SD 60 17.80 20.6

top 3a 479 0.26 240 0.6

3b 1484 0.55 75 2.2

3c 504 0.38 120 0.9

3d 582 0.18 75 0.4

平均值 762 0.34 98 1.0

SD 483 0.16 0.8

sc⁺

BPP5a 229 40.80 240 51.9

5b 266 58.40 420 61.5

5c 490 25.80 420 64.9

平均值 328 41.67 420 59.4

SD 141 16.32 6.7

平均峰值血清浓度

＊平均峰值血清浓度的平均时间＃生物有效性;

血管外剂量的表现终端t1/2

SD＝标准化误差

top＝局部施用的

在完成该药物动力学实验（12小时）之后，杀死该动物，除去其生殖系统，并作组织学考察。将该组织固定在10%NBF中，包埋在石蜡中，并用H& E和PAS/爱尔新蓝染料染色。兔子宫颈组织切片对于给药组的观察是没有了解。为了该研究的目的，所计算的主要的判别标准为（1）该自身的薄层和肌层的相对紧密度，（2）巨大细胞的存在，及（1）该子宫颈部区域的定位。该子宫颈被分为三种类型：正的，松散地排列的自身薄层，以及在肌层下面，巨大的细胞中明显增加;有问题的，有些变化存在，但以很不明显的程度或不在子宫颈部，及负结果的，子宫颈无变化。

组织学研究的结果是在治疗（或处理）和组织学变化之间无明显的联系。抗氧剂和共溶剂的影响

设计该研究以测定各种配方辅剂在甲基纤维素凝胶中稳定松弛素的能力。由可通过光氧化发生降解，因此研究使用抗氧剂如抗坏血酸和焦亚酸钠。而且，因为一可能的游离基来源为在甲基纤维素上的过氧化物，所以，采用共溶剂，如丙三醇和乙醇，采用通过减少甲基纤维素和松弛素之间的相互作用来研究，以确定它们是否能稳定该配方。最后，在将凝胶用以制备配方之前先将凝胶曝光氧化，以观察凝胶活化对松弛素氧化的影响

凝胶制备：4%（重量/体积）甲基纤维素凝胶通过将4克甲基纤维素粉末（道尔化学（Dow Chemical）加至100毫升10毫摩尔/升柠檬酸盐，pH值为5的缓冲液（用氯化钠等渗）中来制备。在85℃下，将该粉末分散至该缓冲液中之后，该溶液在121.5℃高压灭菌30分钟。完成之后，将氮气置该凝胶之上，并让它在5℃地恒温箱中放置过夜以得到水合。对含有丙三醇和乙醇的配方，将该共溶剂直接加至该配方缓冲液中。该“经活化的”凝胶通过在与松弛素混合之前，在34℃下，将该经消毒的4%凝胶放至荧光盒中24小时来制备。

研究方案：表Ⅺ列出各种的配方中的条件、成分和组成。

表Ⅺ

在该研究中所用的松弛素配方的组分

配方甲基纤维素其它成分暴露至光下

1 3% … -

2 3% … +

3 3% … +

4 3% 0.5%抗坏血酸 +

抗坏血酸（原）料

（奥尔德里奇化学公司）

5 3% 0.2焦亚硫酸盐 +

（费希尔科学公司）

6 3% 20%丙三醇（马林克罗特）

7 3% 20%乙醇（马林克罗特）

8 3%（经活化的） …

该松弛素溶液以1毫克/毫升提供，并通过-Amicon超过滤单元的浓缩至2毫克/毫升。该样品通过根据体积比1∶4混合该2毫克/毫升在pH值为5的10毫摩尔/升柠檬酸盐缓冲液中的松弛素浓缩液和4%甲基纤维素凝胶制备。将该溶液和4%凝胶分别分配至2个注射器中，且通过推动该注射器前后20次通过一碰撞连接器，如上所述来进行。在与该凝胶混合之前将抗坏血酸和焦亚硫酸盐放在该松弛素溶液中混合。将最后凝胶制剂以近于0.25毫升部分分配至经消毒的1.5毫升玻璃HPLC管形瓶中。将该管形瓶盖顶密封，并在荧光下竖直放进在5℃下的冷的房间内。在配方＃1和＃8中的样品用箔遮盖，同时将在配方＃3中的样品略微真空化，并再充满氮。

在该凝胶中的松弛素的降解通过RP-HPLC来定量。由于该凝胶的粘度阻止了该样品直接应用HPLC，因此它在注射前用配方缓冲液稀释5倍。该色谱方法的条件如下：

测试仪：HP 1090 L

柱：Vydac C₄-300，4.6×150毫米

流量：1毫升/分

波长：214毫微米

注射体积：200微升

温度：室温

流动相：（A）0.1% TFA（B）90%乙腈，0.1% TFA

梯度速率：在30分钟内从20% B增加至50% B

结果：表Ⅻ列出显示在相应的时间点检测的主峰百分率的初始结果。

表Ⅻ

在各凝胶配方中的松弛素稳定性：

在各时间点的主峰百分率

配方主峰百分率

T＝0 T＝5 T＝11（天）

对照物-光 100 97 95.9

对照放+光 98.7 33.3 0

对照物+光及

N₂压头空间 99.1 38.6 0

对照物+光+

抗坏血酸 100 73 54.4

对照物+光+20%

丙三醇 100 95.5 89.4

对照物+光+20%

乙醇 100 85 59.7

经活化凝胶-光 100 95.8 90.9

在11天之后，当暴露至光下的对照物已完全降解时，避光的对照物保持96%其主峰面积。氮压头空间没有减慢降解。0.5%抗坏血酸和20%乙醇显示出稳定松弛素接近同样的程度。在11天时，保留的松弛素的百分率在55和60%之间。得到最好的结果为具有20%丙三醇配方：在11天暴露至光下之后，得到90%主峰，该“经活化的”凝胶样品显示甚至在受保护避光时，活性蛋白质损失9%。与反的对照物（简单的受保护免于光干扰的凝胶配方）比较，证明凝胶“活化”加速了蛋白质的降解。这意味着在制备该凝胶本身时，不要过多暴露在光下。来自含有焦亚硫酸盐的结果未显示出，因为在这些样品中不能检测该松弛素峰，且它从研究开始连续下降。焦亚硫酸盐与松弛素反应，导致失去全部蛋白质是可能的。

暴露至光下含有在引发降解过程中重要作用在这些实验中是明显的。在该配方中20%丙三醇非常有效地保护松弛素免于诱导的氧化。在一较小的程度，抗坏血酸和乙醇也稳定该配方。在该分析中的乙醇的效果可能被低估，因为在甲基纤维素粉末分散时，所加入的很大部分可能已蒸去。丙三醇、乙醇和抗坏血酸的合用可提供附加的稳定性。

上面结果显示出在甲基纤维素凝胶中的松弛素的光氧化通过其中的丙三醇、乙醇或抗坏血酸的混合可有效地阻止。一具有可接受的货架寿命的最终配方可通过利用这些辅剂的优点及保护该产品免于过多暴露至光下来设计。

Claims

1、一种具有生物学活性的药物组合物，其特征在于，该组合物包括于可将该组合物的pH值维持于4至7左右的缓冲剂之中存在有效数量的人类松弛类。

2、如权利要求1所述之组合物，其特征在于，其中pH范围为自4左右至6左右。

3、如权利要求1或2所述之组合物，其特征在于，所述缓冲剂为柠檬酸盐或乙酸盐缓冲剂。

4、如权利要求1、2或3所述之组合物，其特征在于，该组合物进一步包括碱金属或碱土金属或糖醇。

5、如权利要求1至4所述之组合物，其特征在于，该组合物进一步包括多羟糖醇、乙醇或聚丙二醇（prelypropylene glycol）。

6、如权利要求1至5所述之组合物，其特征在于，该组合物为凝胶态的。

7、如权利要求6所述之组合物，其特征在于，该组合物进一步包括一种水溶性的多糖或聚1，2-亚乙基二醇。

8、如权利要求7所述之组合物，其特征在于，该组合物中所述之多糖为甲基纤维素，含量为2-5%左右，而松弛素的含量为100-1000μg/每ml凝胶左右。

9、如权利要求6至8所述之组合物，其特征在于，该组合物进一步包括抗氧剂或助溶剂或两者之混合物。

10、如权利要求9所述之组合物，其特征在于，所述之抗氧剂及/或助溶剂为抗坏血酸、乙醇或甘油或它们的混合物。