CN1038035C

CN1038035C - 聚乙二醇蛋白质结合物的制备方法

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Publication number: CN1038035C
Application number: CN92101994A
Authority: CN
Inventors: J·哈基米; P·基利恩; P·罗森
Original assignee: Setters
Current assignee: Setters; F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1991-03-25
Filing date: 1992-03-24
Publication date: 1998-04-15
Anticipated expiration: 2007-03-24
Also published as: KR920018079A; RO109543B1; IL101348A0; AU657311B2; GR3030049T3; ZA922110B; HU9200955D0; EP0510356A1; HUT60512A; MW1892A1; EP0510356B1; MX9201298A; AU1316092A; US5849860A; US5559213A; IE920936A1; CN1108814C; ZW4392A1; BR9201015A; JP2637010B2

Abstract

本发明涉及具有生理活性的、基本上无免疫原性的水溶性聚乙二醇蛋白质结合物，它具有至少一部分形成结合物的蛋白质的生物活性，而不产生所述蛋白质的不利免疫反应。

Description

聚乙二醇蛋白质结合物的制备方法

本发明涉及新的、蛋白质的聚乙二醇(PEG)结合物。

各种天然的和重组的蛋白质都具有医药有用性。一旦它们被纯化、分离和配制后，它们便可经非经胃肠途径给药来用于各种治疗适应征。然而，非经胃肠道途径给药的蛋白质可能具有免疫原性，可能是相对不溶于水的，也可能具有短的药理学半寿期。因此，要在病人体内使蛋白质达到有治疗作用的血液水平，可能是困难的。

将蛋白质与聚合物如聚乙二醇结合，可以克服这些问题。Davis等人在美国专利4,179,337中公开了将聚乙二醇(PEG)与蛋白质如酶和胰岛素结合以得到结合物，其中的蛋白质免疫原性较小并保留了大部分生理活性。Nakagawa等人在美国专利4,791,192中公开了将PEG与胰岛活化蛋白质结合以降低其副作用和免疫原性。Veronese等人在Applied Biochem.and Biotech，11，141-152(1985)中公开了用氯甲酸苯酯类化合物活化聚乙二醇以修饰核糖核酸酶和过氧化物歧化酶。Katre等人在美国专利4,766,106和4,917,888中还公开了通过聚合物结合作用而使蛋白质增溶。将PEG和其它聚合物与重组蛋白质结合可降低免疫原性，增大半寿期。参见Nitecki等人的美国专利4,902,502；Enzon，Inc.的国际申请PCT/US 90/02133；Nishimura等人的欧洲专利申请154,316以及Tomasi的国际申请PCT/US 85/02572。King等人在Int.Archs.Allergy appl.Immun.66，439-446(1981)中描述了一种用O-(RO-PEG)-S-甲酰氨基甲基-二硫代碳酸酯中间体使蛋白质与PEG键合的方法。

形成PEG-蛋白质结合物的先有方法和由所述方法产生的结合物存在着一些问题。其中包括，形成这些蛋白质-PEG结合物的某些方法可能会使蛋白质失活，使得产生的结合物生物活性可能很差。此外，在形成这些PEG-蛋白质结合物时所用的某些键合剂可能易于发生体内水解裂解。如果给药后发生这样的裂解，这些结合物便失去了由PEG提供的有益性质。

本发明通过使用独特的键合剂提供了新的PEG-蛋白质结合物，所述键合剂使蛋白质中的各个游离氨基与PEG连接起来，这样就避免了蛋白质与PEG形成结合物时带来的问题。

具体讲，本发明提供了具有生理活性的下式所示的蛋白质结合物：式中R¹为低级烷基；R²为-O-或-NH-；R³为＝N-R⁴、＝S或＝O；R⁴为低级烷基或环烷基；m和n选自≥1的整数，并要使结合物具有至少一部分非结合蛋白质的生物活性；条件是，

当R²为-O-时，R³不是＝N-R⁴；

当R²为-O-、R³是＝O时，蛋白质为α-干扰素、白细胞介素-1或白细胞介素-1ra；以及

当R²为-O-、R³为＝S时，蛋白质不是得自豚草花粉或牛血浆清蛋白的E抗原。

更具体地讲，本发明提供了下列各式所示的蛋白质结合物：式中R¹、R⁴、m、n和蛋白质如上所述。

根据本发明，我们还首次提供了与PEG结合的蛋白质白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)和白细胞介素-1(IL-1)。

根据本发明，式I的蛋白质结合物通过使活化的PEG(即其中一个羟基已被活化的键合剂置换了的PEG)与蛋白质中的一个或多个游离氨基缩合来产生。用来生成结合物的活化PEG化合物具有下列各式结构：

II-A R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-N＝C＝N-R⁴

II-B R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-

II-C R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-NH

II-D R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂-CH₂-N＝C＝S

II-E R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-NH

II-F R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-

II-G R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O- 式中R¹为低级烷基，R⁴为低级烷基或环烷基，R⁵为低级烷基或H，n为1～1000的整数。

根据本发明，通过使用式II-A、II-B、II-C、II-D、II-E、II-F或II-G的活化PEG化合物产生结合物，在蛋白质的游离氨基和PEG之间形成了连接键，结果使所形成的结合物保持了蛋白质的至少一部分生物活性，同时降低了其免疫原性。此外，通过使用式II-A～II-G所示的任何一种活化聚乙二醇在本发明的结合物中形成的连接基团，所产生的蛋白质结合物都不易发生体内水解裂解，并且没有在先有技术的PEG-蛋白质结合物中存在的许多缺点。

根据本发明，R¹和R⁵可以是任何低级烷基，优选甲基。“低级烷基”一词意指含有1～6个碳原子的低级烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基等。通常，优选的烷基是含有1～4个碳原子的低级烷基，最优选的是甲基。

根据本发明，m和n可以选自≥1的任何整数，并要使产生的蛋白质结合物具有至少一部分形成结合物的蛋白质的生物活性。显然，m和n的总和与结合物保持的蛋白质生物活性的量成反比。n的数值关系到形成结合物的聚乙二醇中乙二醇单元的数目，为1～1000。m涉及与活化PEG反应的蛋白质中所含的游离氨基的数目。m优选为1～5，最优选为1。m+n的值越大，结合物的分子量就越大。本技术领域中的专业人员可容易地测得式II-A～II-G的聚乙二醇聚合物的分子量及式I和式I-A～I-E的蛋白质结合物的分子量。从测得的分子量可以推算出m和n的值。“蛋白质”一词不仅包括多肽，而且也包括生理上可接受的加成盐。

当式II-A～II-G任何一式所示的化合物与蛋白质反应，而蛋白质含有一个以上游离氨基时，所得到的结合物为各种蛋白质-PEG结合物的混合物。在蛋白质含有两个游离氨基的情况下，活化的PEG既可以与其中一个游离氨基反应，也可以与两个游离氨基都反应。在这种情况下，混合物含有两种结合物，其中一种是由两个游离氨基与PEG反应形成的，而另一种是仅有一个游离氨基与PEG反应形成的。由于该混合物中的各种结合物具有不同的分子量，所以可以通过诸如层析法之类的常规方法分离这些结合物。为了确定m和n选择得是否合适，可以对分离出的结合物进行生物活性筛选，以确定该结合物是否仍保持有一部分形成该结合物所用的蛋白质的生物活性，筛选方法与筛选母体蛋白质时所用的方法相同。这样，便可以以任何所希望的方式调整m和n的数值，得到所希望的活性。

根据本发明的优选实施方案，m和n可为任何整数，只要结合物的分子量(不包括蛋白质的分子量)为大约300至大约30,000道尔顿。根据该优选实施方案，m为1。如果m为1，那么即使存在两个或更多个游离氨基，也可以得到该结合物。活化的PEG化合物首先与蛋白质中所含的游离氨基之一进行反应。通过调节各试剂如蛋白质的浓度和反应条件，按照一般的胺缩合方法，便可以调节蛋白质中所含的游离氨基的聚乙二醇化(pegylation)的程度。在含有一个或多个游离氨基的蛋白质中，如果游离氨基中的一个比其它的游离氨基活泼，那么可以选择条件使蛋白质与活化的PEG化合物反应形成其中m为1的式I化合物。然后通过延长缩合反应或使用其它更剧烈的反应条件，可以使形成蛋白质的氨基酸中所含的其它游离氨基与PEG反应。根据m为1的优选实施方案，n可为任何整数，只要使形成结合物的聚乙二醇的分子量为300～30,000道尔顿，这相应于n为大约6～680。更优选地，n为大约28、112和225，这分别相应于分子量为1325、5000和10000，而最优选的是n为112左右。由于通常由其平均分子量而不是其自重复单元限定的起始PEG化合物的潜在不均一性，优选用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整数n表示PEG聚合物中的自重复单元。各种分子量的起始PEG化合物可以通过本领域中的已知方法制备或者可以从商业来源得到。

在通过测定分子量而得到的m和n的值不是整数的情况(往往就是这样一种情况)下，必须按通常的方法对这些值进行舍入。

当R⁴为低级烷基时，R⁴可以是含有1-6个碳原子的任何低级烷基，如上面所述的低级烷基。当R⁵为环烷基时，R⁵优选为含有3-7个碳原子的环烷基，如环丙基、环戊基、环丁基和环己基。优选的环烷基为环己基。

下述各实施例的标题化合物是以IUPAC命名法命名的。然而，这些化合物也可以如下命名：实施例1、2、3和4：α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦称α-〔2-〔〔(环己基氨基)亚甲基]氨基〕乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)。实施例1A、1a和1d：α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦称α-甲氧基-ω-(2-氯乙基)聚(氧-1，2-乙二基)。实施例1B、1b和1e：α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦称α-甲氧基-ω-(2-叠氮基乙基)聚(氧-1，2-乙二基)。实施例1C、1c和1f：α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦称α-甲氧基-ω-(2-氨基乙基)聚(氧-1，2-乙二基)。实施例11、11a、11b、12、12A和13-17：α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)亦称α-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)。实施例18、18a、19、19A、20、20A、21和22：α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦称α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氧基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)。实施例23-27：α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧联-1，2-乙二基)亦称α-〔甲氧基-ω-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕聚(氧-1，2-乙二基)。实施例28：α-〔(2-吡啶氧基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)亦称α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)硫代羰基〕氧基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)。

本发明还包括制备通式I或式I-A～I-E的PEG-蛋白质结合物的方法，该方法包括，使下列各通式所示的活化化合物之一与蛋白质或其盐的游离氨基反应，并从反应混合物中分离蛋白质结合物：

II-A R¹O(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-N＝C＝N-R⁴

II-B R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-

II-C R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-NH

II-D R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂-CH₂-N＝C＝S

II-E R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-NH

II-F R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-

II-G R¹O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-

式中R¹、R⁵和n如上所定义。

具体讲，用来与蛋白质偶联的各个PEG衍生物的合成以及它们与蛋白质的反应，可以如下面各段和实施例中所述的那样来进行。

为了得到其中R²为-NH-、R³为＝N-R⁴的蛋白质结合物(式I-A化合物)，可以采用下列反应式：式中R¹、R⁴、n、m和蛋白质如上所述。

在该反应式中，通过常规方法如用亚硫酰卤处理将PEG分子末端的羟基转化成卤素基团。通过常规方法如用叠氮化钠处理将所生成的PEG卤化物转化成叠氮化物。然后通过常规方法如氢化可将PEG叠氮化物转化成胺。再使PEG-胺与异硫氰酸烷基酯或环烷基酯如异硫氰酸环己酯反应形成式III的硫脲，后者用常规方法脱硫后形成了含有碳化二亚胺官能团的式II-A化合物。在将式III的硫脲转化成式II-A的PEG-碳化二亚胺时，优选的脱硫剂为三苯膦。

然后，可以在任何常规的使碳化二亚胺与胺缩合的条件下使式II-A的PEG碳化二亚胺与蛋白质缩合。通常，为了得到式I-A的结合物，在pH为7～9的一般水性缓冲液中进行该反应。该缩合反应可以产生各种分子量的PEG蛋白质结合物的混合物，这取决于蛋白质中游离氨基的数目和反应时间。然后，可通过常规方法如高效液相色谱法或凝胶电泳法将PEG蛋白质结合物分离成其各个组分。

为了得到其中R²为-O-、R³为＝S的蛋白质结合物(式I-B化合物)，可以采用下列反应式：式中R¹、m、n和蛋白质如上所述。

在该反应中，将PEG与1，1-硫代羰基二(2(1H)-吡啶酮)在高沸点烃类溶剂中回流，形成式II-B化合物。按照与式II-A化合物和蛋白质缩合制备式I-A的结合物混合物时所述的方式相同的方式，可使式II-B化合物与蛋白质的一个或多个游离氨基进行缩合，形成式I-B结合物。根据如上所述形成的产物的分子量，可以进行该混合物的分离。

此外，其中R²为-O-、R³为＝S的本发明的蛋白质结合物(式I-B化合物)也可以按照下列反应式来制备：

式中R¹、m、n和蛋白质如上所述。

按照该反应式，PEG与式VI的硫代碳酸酯在有机溶剂中反应，形成式II-F的硫代碳酸PEG酯。可以采用任何常规的使硫代碳酸酯与羟基缩合的方法来进行该反应。

通过使式II-F化合物与蛋白质的至少一个游离氨基缩合，将式II-F化合物转化成式I-B结合物。该反应按照将式II-A化合物转化成式I-A结合物时所述的方式来进行。该反应所形成的产物可以是不同分子量的结合物的混合物，这取决于所用的蛋白质中游离氨基的量。按照前文所述方法，可将这些结合物按分子量分开。

为了得到其中R²为-NH-、R³为＝O的蛋白质结合物(式I-C化合物)，可以采用下列反应式：式中R¹、R⁵、m、n和蛋白质如上所述。

用任何常规的使酰卤与醇缩合的方法，使光气与2-羟基吡啶(若R⁵为低级烷基，则为取代的形式)缩合，得到了式IV化合物。

通过在卤代烃溶剂中回流，使PEG胺与式IV化合物缩合，得到了式II-C化合物。通过蛋白质上的一个或多个游离氨基使式II-C化合物与蛋白质缩合，得到了式I-C化合物。该反应按照式II-A化合物缩合成式I-A的结合物时所述的方式进行。根据与式II-C化合物反应的蛋白质中所含的游离氨基的数目，形成的式I-C结合物可以是具有不同分子量的结合物的混合物。该结合物混合物可以按上文所述的方法分离。

为了得到其中R²为-NH-、R³为＝S的本发明的蛋白质结合物(式I-D化合物)，可以采用下列反应式：

式中R¹、m、n和蛋白质如上所述。

在该反应式中，PEG胺与硫代碳酸二(2-吡啶基)酯反应，形成了式II-D化合物。在该步中，可以使用任何常规的使胺与硫代碳酸酯缩合产生异硫氰酸酯的方法。按照将式II-A化合物转化成式I-A化合物时所述的方法，使式II-D化合物与蛋白质反应，形成了式I-D结合物。根据蛋白质中所含的游离氨基的量，式II-D化合物与蛋白质缩合，产生了各种结合物的混合物，按照前文在分离式I结合物时所述的方法，可将所产生的结合物混合物分离成其各个组分。

另外，式I-D化合物可以采用下列反应式得到：

用任何常规的使酰卤与醇缩合的方法，使硫光气与2-羟基吡啶(若R⁵为低级烷基，则为其取代形式)缩合，得到了式V化合物。然后按制备式II-C化合物时所述的方法使化合物V与PEG-胺反应，生成了式II-E化合物。式II-E化合物与蛋白质上的一个或多个游离氨基缩合后，得到了式I-D结合物。该反应按照形成结合物I-A时所述的方式进行。

为了得到其中R²为-O-、R³为O的本发明蛋白质结合物(式I-E化合物)，可以采用下列反应式：

式中，R¹、m、n和蛋白质如上所述。

在上述反应式中，碳酸二(2-吡啶基)酯与PEG反应，形成了式II-G化合物。使用醇与碳酸酯缩合时所用的常规条件进行该反应。通过式II-G化合物与蛋白质中的一个或多个游离氨基缩合，将式II-G化合物转化成式I-E化合物。按照将式II-A化合物转化成式I-A化合物时所述的相同方法进行所述反应。根据蛋白质所含的游离氨基，如此形成的反应混合物可以含有式I-E结合物的混合物。该混合物构成了不同分子量的各种结合物的混合物。按照前述方法，可从混合物中分出各种结合物。

根据本发明的优选实施方案，可以按下列反应式得到α-干扰素与PEG的结合物：式中R¹为甲基，n为大约112。该反应对于α-干扰素中的α_A-干扰素(亦称α₂-干扰素)亚型具有特殊意义。

活化PEG化合物II-C的合成如前文中就其中R²为-NH-、R³为＝O的蛋白质结合物的合成所述的那样来进行。按照与前述相似的方法或与实施例中合成蛋白质结合物I-C时所述方法相似的方法，可以得到最终的α-干扰素结合物。

具有生理活性的任何蛋白质或其盐都可用于制备与PEG的结合物，只要所述蛋白质含有至少一个可供缩合的氨基。

可用于本发明的优选蛋白质有白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、白细胞介素-2(IL-2)和各种干扰素即IFN-α(白细胞干扰素)、IFN-β(成纤维细胞干扰素)和IFN-γ(免疫干扰素)，它们的天然存在形式及其类似物、同系物或截短形式。

这里的白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)可由组织培养得到或通过重组技术得到。获得IL-1ra的一种方法是，用分化剂佛波醇十四酸乙酸复酯(PMA)培养U937人骨髓单核细胞(ATCC CRL 1594)，然后用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，可从Amgen得到)刺激它们，如Carter等人在Nature 344，633-637(1990)中所述的那样从培养上清液中分出IL-1ra并纯化之。

重组IL-1ra是指具有可与天然IL-1ra相比拟的生物活性的IL-1ra，但它们是如Carter等人在上述文献中所述的那样或如Eisenberg等人在Nature 343,341-346(1990)中所述的那样，通过重组技术制得的。

干扰素包括所有类型的干扰素如α、β、γ或ω-干扰素以及任何类型的任何亚型。干扰素可从组织或组织培养物中得到，也可以用文献如欧洲专利申请公开43980中所述的重组技术得到。产生和分离天然或重组干扰素的方法在技术上也是熟知的。

按照本发明，已经发现，本发明的蛋白质结合物与用于形成结合物的蛋白质同样有用。因此，这些结合物与形成它们的蛋白质具有相同的治疗活性，可与蛋白质本身一样使用，而不会产生服用蛋白质本身时可能引起的不希望的免疫反应。因此，本发明还包括基于式I化合物或其盐的药物组合物及其制备方法。

用于控制或预防疾病的本发明的药物组合物包含通式I的蛋白质结合物和治疗上惰性的、无毒的和治疗上可接受的载体物质，所用的药物组合物可以以与优良的医学实践相一致的方式配制和给药，同时要考虑到待治疗的疾病、个体病人的状况、蛋白质结合物的释放部位、给药方法以及专业人员已知的其它因素。

下述实施例代表本发明的说明性具体实施方案，而不是限制本发明。

实施例1

α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

A.α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备(此处所用的SRU是指PEG聚合物中存在的自重复单元的数目)

从50gMPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量为5000)在700ml甲苯中的淤浆中蒸出200ml溶剂。向该回流溶液中滴加0.8ml元水吡啶和2.2ml亚硫酰氯。回流4小时后，将反应物搅拌过夜。然后减压下除去溶剂，向残留物中加入500ml CH₂Cl₂。将产生的溶液用无水K₂CO₃干燥后，通过50g碱性氧化铝(Wolem Super I)。然后减压下除去大部分CH₂Cl₂，向所得糖浆状物中加入1l乙醚。蒸馏除去醚，并加入另外的乙醚造成沉淀。将混合物在室温下搅拌2小时，然后过滤，得到45gα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。

C₃H₇ClO(CH₂CH₂O)_111.7：

分析计算值C，53.97 ；H，9.12；Cl，0.71

实测值C，54.21；H，8.70；Cl，0.71

B.α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

将20g叠氮化钠和50gα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SPU 111.7的混合物在375ml无水DMF中于120-125℃下加热。7小时后，于高真空下除去溶剂。将残留物溶于500ml CH₂Cl₂中，通过硅藻土过滤。然后蒸去大部分CH₂Cl₂并加入乙醚造成沉淀。将混合物搅拌过夜，然后过滤。将残留物在50℃下溶于最少量的甘醇二甲醚中，将所得溶液冷却，滤出沉淀产物，得到α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。

C₃H₃N₃O(CH₃CH₂O)_111.7：

分析计算值：C，53.77；H，9.09；N，0.84

实测值：C，53.61；H，9.08；N，0.89

C.α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

向25gα-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7在250ml无水甘醇二甲醚中的混合物中加入3.5g 10％Pd/C。然后将混合物置于50p.s.i.的氢气氛下并于50℃振荡18小时。将混合物过滤，用CH₂Cl₂洗涤固体物，合并有机液，减压下除去溶剂。再将残留物溶于100ml温热的甘醇二甲醚中，使产物从冷却后的溶液中沉淀出，滤出沉淀，在减压条件下温热干燥，得到23gα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。

C₃H₉NO(CH₂CH₂O)_111.7：

分析计算值：C，54.43；H，9.20；N，0.28

实测值：C，54.43；H，9.18；N，0.36

或者，将40gα-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7和6.7g(25.6mmol)三苯膦溶解在200ml无水CH₂Cl₂中，将该溶液在氩气氛下搅拌过夜。加入水(2ml)，再将混合物搅拌12小时。减压下除去大部分二氯甲烷，加入400ml乙醚。滤出沉淀，用乙醚洗涤后，溶于300ml温热(50℃)的甘醇二甲醚中。将该溶液在室温下放置过夜，滤出产生的沉淀，用2×100ml甘醇二甲醚、2×100ml乙醚洗涤，在N₂流存在下于真空烘箱中干燥，得到35gα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。

D.α-〔2-〔〔(环己基氨基)硫羰基〕氨基〕乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

向4gα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7在60ml无水甘醇二甲醚中的溶液(40℃)中加入0.1ml异硫氰酸环己基酯。将该溶液在40℃下搅拌18小时。过滤混合物，在高真空条件下除去溶剂。残留物溶于100ml温热的甘醇二甲醚中，冷却该溶液，滤出产生的沉淀，在高真空条件下干燥，得到3.5gα-〔2-〔〔(环己基氨基)硫羰基〕氨基〕乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7。

C₁₀H₂₀N₂OS(CH₃CH₂O)_111.7：

分析计算值：C，54.25；H，9.13；N，0.54；S，0.62

实测值：C，54.39；H，8.87；N，0.55；S，0.59

E.α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

将1gα-〔2-〔〔(环己基氨基)硫羰基〕氨基〕乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7、120mg三苯膦、90μl CCl₄和84μl三乙胺在5ml无水CH₂Cl₂中的溶液回流72小时。然后减压下除去溶剂，残留物溶于最少量的无水甘醇二甲醚中。冷却后，有产物沉出，过滤，减压下干燥，得到α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。

C₁₀H₁₈N₂O(CH₂CH₂O)_111.7：

分析计算值：C，54.61；H，9.15；N，0.55

实测值：C，54.95；H，9.27；N，0.50

实施例1a

α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制备

按照实施例1A中所述方法，将MPEG(分子量10,000)转化成α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SBU 225。

C₃H₇ClO(CH₃CH₂O)₂₂₅：

分析计算值：C，54.37；H，9.14；Cl，0.35

实测值：C，54.30；H，9.15；Cl，0.41

实施例1b

α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制备

按照实施例1B中所述的方法，将α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225转化成α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。

C₃H₇N₃O(CH₂CH₂O)₂₂₅：

分析计算值：C，54.34；H，9.13；N，0.42

实测值：C，54.32；H，9.28；N，0.50

实施例1c

α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制备

按照实施例1C中所述方法，将α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225转化成α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。

C₃H₉NO(CH₂CH₂O)₂₂₅：

分析计算值：C，54.48；H，9.17；N，0.14

实测值：C，54.80；H，9.21；N，0.12

实施例1d

α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3的制备

向新蒸过的草酰氯(0.5ml)在40ml无水CH₂Cl₂中的溶液(0℃)中滴加在10ml CH₂Cl₂中的0.5ml无水DMF。将所得溶液温热至室温，搅拌15分钟，然后再冷却至0℃。加入MPEG(分子量1325)(5.6g)，将所得溶液回流5小时。然后将混合物倒入水中，用CH₂Cl₂提取。干燥CH₂Cl₂溶液(MgSO₄)，减压下除去溶剂，得到107gα-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3，为白色粉末。

C₃H₇ClO(CH₂CH₃O)_28.3：

分析计算值：C，53.38；H，9.03；Cl，2.64

实测值：C，53.48；H，9.10；Cl，2.41

实施例1e

α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3的制备

按照实施例1B所述的方法，将α-(2-氯乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3转化成α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3。

C₃H₇N₃O(CH₂CH₂O)_28.3：

分析计算值：C，53.12；H，8.99；N，3.11

实测值：C，53.21；H，9.07；N，2.98

实施例1f

α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3的制备

按照实施例1C所述的方法，将α-(2-叠氮基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3转化成α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3。

C₃H₉NO(CH₂CH₃O)_28.3：

分析计算值：C，54.47；H，9.17；N，0.14

实测值：C，54.44；H，9.19；N，0.15

实施例2

用试剂α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7 制备与PEG结合的重组干扰素-α(IFN-α)

将按实施例1制得的α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基]乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl缓冲液(0.1M硼酸钠，pH9.0)中的1mg均一IFN-α中，每1摩尔IFN-α加入10摩尔试剂。将该溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)估测IFN-α衍生化(或聚乙二醇化)的量(表I)。通过用考马斯蓝染色使蛋白质显色。对60分钟反应后的产物进行分析，结果表明，新的较高分子量的蛋白质相应于PEG结合的IFN-α。由SDS-PAGE测得，IFN-α的表观分子量为15kD。未修饰的IFN-α的表观分子量保持不变，因此没有与PEG结合。经PEG修饰的IFN-α产物的表观分子量为28kD。

表I：用实施例1所述试剂对IFN-α的修饰IFN蛋白质的表观分子量(kD) 占反应中总蛋白质的百分率

15(未修饰) 80

28 20

实施例3

用试剂α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的重组白细胞介素-2(rIL-2)

将按实施例1制得的试剂α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基〕乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl缓冲液(0.1M硼酸钠，pH 9.0)中的2mgrIL-2中，每1摩尔rIL-2加入10摩尔试剂。将该溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。

用SDS-PAGE法估测蛋白质衍生化(或聚乙二醇化)的量(表II)、通过用考马斯蓝染色使蛋白质显色。对60分钟反应后的产物进行分析，结果表明，新的较高分子量的蛋白质相应于PEG结合的rIL-2。由SDS-PAGE测得，rIL-2的表观分子量为15kD。未修饰的rIL-2是从反应混合物中分离到的蛋白质，其表观分子量保持不变，因此没有与PEG结合。经PEG修饰的rIL-2主产物的表观分子量为28kD。

表II：用实施例1所述试剂对rIL-2的修饰rIL-2蛋白质的表观分子量(kD) 占反应中总蛋白质的百分率

15(未修饰) 20

28 50

33 20

43 10

用疏水性交换层析法(Bio-Rad；Biogelphenyl 5-PW)，如Katre等人〔Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，84：1483-1491，1987〕所述的那样，从反应混合物中纯化聚乙二醇化的rIL-2。在30分钟内将(NH₄)₂SO₄在50mM磷酸钠(pH7.0)中的浓度从1.53M降低至0.0M进行线性梯度洗脱以分离经PEG修饰的和未修饰的rIL-2。用SDS-PAGE法检测各等份级分，按Gillis等人所述的方法〔J.Immunology 120：2027-2032，(1978)〕对合并级分进行分析，测定其在CTLL细胞增殖试验中的比活性。通过分光光度法，用0.667的消光系数在280nm处测定rIL-2的蛋白质浓度。所分离出的rIL-2蛋白质的比活性以单位/毫克蛋白质表示，结果综述于表III中。显然，rIL-2的比活性没有由于与PEG结合而发生显著改变。

表III用实施例1所述的试剂将rIL-2

与PEG结合后rIL-2的生物活性rIL-2蛋白质的表观分子量(kD) 比活性(单位/毫克)

15(未修饰的IL-2) 2.0×10⁷

28 2.4×10⁷

实施例4

用试剂α-〔2-〔(环己基亚氨基亚甲基)氨基]乙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的重组白细胞介素-1α(rIL-1α)

将实施例1所述的试剂加到在1.0ml 0.1M硼酸钠(pH9.0)中的2.0mg均一rIL-1α中，每1摩尔rIL-1α加入10摩尔试剂。将所得溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。

用SDS-PAGE法估测蛋白质衍生化(或聚乙二醇化)的量(表IV)。通过用考马斯蓝染色使蛋白质显色。对60分钟反应后的产物进行分析，结果表明，新的较高分子量的蛋白质相应于PEG结合的rIL-1α蛋白质。由SDS-PAGE法测得，rIL-1α的表观分子量为17kD。未修饰的rIL-1α是从反应混合物中得到的表观分子量保持不变的蛋白质，因此它没有与PEG结合。经PEG修饰的rIL-1α产物的表观分子量为30kD。

表IV用实施例1所述试剂对rIL-1α的修饰rIL-1α蛋白质的表观分子量(kD) 占反应中总蛋白质的百分率

17(未修饰) 85

30 15

实施例5

α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

从1g(0.2mmol)MPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量5000)在15ml无水甲苯中的溶液中蒸去5ml溶剂。将所得溶液冷却，加入46.5mg(0.2mmol)1，1-硫羰基二(2(1H)-吡啶酮)。然后将该混合物在氩气氛下回流4小时。减压下除去溶剂，残留物溶于5ml无水甘醇二甲醚中，放置过夜。滤出产生的沉淀，用2×5ml无水甘醇二甲醚和5ml醚洗涤。在缓慢的氮气流下，将产物置于真空烘箱中进行干燥，得到0.96gα-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。

C₉H₁₁NO₃S(CH₂CH₂O)_111.7：

分析计算值：C，54.37；H，8.99；N，0.27；S，0.62

实测值：C，54.03；H，8.98；N，0.18；S，0.59

实施例5a

α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制备

按照实施例5所述的方法，将MPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量为10,000)转化成α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU225。

C₉H₁₁NO₃S(CH₂CH₃O)₂₂₅：分析计算值：C，54.54；H，9.08；N，0.14；S，0.32

实测值：C，54.38；H，9.16；N，0.15；S，0.31

实施例6

用试剂α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)

将按照实施例5制得的α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7加到在1.0ml缓冲液(0.1M硼酸钠，pH9.0)中的10mg均一IL-1ra中，每1摩尔IL-1ra加入5摩尔试剂。将该溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。

用SDS-PAGE法估测蛋白质衍生化(或聚乙二醇化)的量(表V)。通过用考马斯蓝染色使蛋白质显色。对60分钟反应后的产物进行分析，结果表明，新的较高分子量的蛋白质相应于PEG结合的IL-1ra蛋白质。由SDS-PAGE法测得，IL-1ra的表观分子量为19kD。未修饰的IL-1ra是从反应混合物中得到的表观分子量保持不变的蛋白质，因此它没有与PEG结合。

经PEG修饰的IL-1ra蛋白质主产物的表观分子量为26和33kD。

表V用实施例5所述试剂对IL-1ra的修饰IL-1ra蛋白质的表观分子量(kD) 占反应中总蛋白质的百分率

19(未修饰的) 36

26 33

33 21

＞33 10

用疏水性交换层析法(Bio-Rad；HRLC MP7 HIC)从反应混合物中纯化聚乙二醇化的IL-1ra。在20分钟内将(NH₄)₂SO₄在50mM磷酸钠(pH7.0)中的浓度从0.43M降至0.0M进行线性梯度洗脱以分离聚乙二醇化的IL-1ra和未修饰的IL-1ra。用SDS-PAGE法检测各等份级分。用IL-1放射性受体竞争结合测定法测定合并级分〔Kilian等人，J.Immunol.，136，4509-4514(1986)〕。简单地讲，将各种不同浓度的IL-1ra和PEG-IL-1ra与EL-4膜一起在37℃下温育30分钟。然后加入〔¹²⁵I〕IL-1α，继续温育30分钟。通过真空过滤并把与细胞结合的〔¹²⁵I〕IL-1收集在滤板上终止试验。用作图法确定抑制50％〔¹²⁵I〕IL-1的结合时IL-1ra或PEG-IL-1ra浓度(IC₅₀)。结果列在表VI中。该试验中IL-1ra的IC₅₀为1-2.0ng/ml。聚乙二醇化的IL-1ra混合物与EL-4膜上的IL-1受体结合的能力保持在未修饰IL-1ra的1/2至1/3范围内。

表VI用实施例5所述试剂结合的

IL-1ra对〔¹²⁵I〕IL-1结合的抑制IL-1ra蛋白质的表观分子量(kD) IC₅₀(ng/ml)

19K(未修饰) 2.0

26K，33K(混合物) 5.0

用IL-1ra抑制rIL-α的白细胞介素-6诱导作用的能力对IL-1ra蛋白质的药物动力学进行体内评价。从用rIL-1α处理后的小鼠得到的血清含有高浓度的IL-6〔Mc Intosh等人，Immunol.，143：162-167(1989)〕。与IL-1α一起给予未修饰的IL-1ra(0小时时间点)抑制IL-6的诱导。用该试验体系对未修饰的和经PEG修饰的IL-1ra的药物动力学性质进行比较。取若干雌性C57B 1/6小鼠，以三只为一组，对各组小鼠皮下注射0.2μg rIL-1α，在此之前48小时、24小时或6小时或与此同时(0小时)，给所述动物皮下注射200μg未修饰的IL-1ra或PEG-IL-1ra。三小时后，收集血清样品。用前人所述的改进的IL-6测定法〔Van Snick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：9679-9683(1986)〕测定IL-6浓度水平(单位)。在IL-6测定法中，在96孔微量滴定板中用受试血清的两倍系列稀释液处理B9杂交瘤细胞。在包含5％CO₂和95％空气的潮湿气氛中于37℃温育3天后，用0.5μCi的氚化胸苷对各孔进行标记，并再温育18小时。然后将细胞收集到玻璃纤维滤器上，用闪烁计数法测定氚化胸苷的掺入量。IL-6活性以U/ml表示，IL-6单位定义为与参比标准相比氚化胸苷掺入量达到最大值的一半时血清稀释度的倒数。

药物动力学数据综述在表D1中。仅用IL-1处理的小鼠，其IL-6活性为28852 U/ml。未修饰的和修饰了的IL-1ra在0小时时抑制IL-6诱导。但是，与未修饰的IL-1ra相比，聚乙二醇化的IL-1ra在给药后8小时和24小时时表现出延长的IL-6抑制作用。

表D1与实施例5所述试剂结合的

IL-1ra的药物动力学分布给予IL-1前的时间(小时) IL-6(单位/ml)

19kD 26kD

0 772 705

6 8361 1587

24 22525 9844

48 18485 21119

72 13220 21470

实施例6A

用试剂α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)

用实施例5a所述的试剂，按照实施例6所述方法，将IL-1ra结合并纯化。

主要的经PEG修饰的IL-1ra蛋白质的表观分子量为33kD和48kD它们分别占反应混合物中总蛋白质的46％和27％。

如实施例6中所述的这些蛋白质抑制IL-1结合的能力综述于表VII中。33kD的经PEG修饰的蛋白质抑制IL-1结合的能力保持在IL-1ra的1/6以上，而如对48kD的蛋白质所观察到的，用PEG对蛋白质进行更大程度的修饰导致了其与IL-1受体结合的能力显著丧失。

表VII用实施例5a所述试剂结合的IL-1ra

蛋白质对〔¹²⁵I〕IL-1结合的抑制IL-1ra蛋白质的表观分子量(kD) IC₅₀(ng/ml)

19(未修饰的) 1.6

33 9.0

48 50.0

为了测定各种PEG-IL-1ra的药物动力学分布，给C57BF/6小鼠皮下注射100μg的修饰了的或聚乙二醇化的IL-1ra。在小鼠接受了未修饰的IL-1ra后1、2、3、4和6小时和接受了PEG-IL-1ra后2、4、8、10和24小时时采集血清样品。用实施例6所述的EL4膜结合试验测定血清浓度。数据列在表D2中。与IL-1ra相比，血清样品中可检测到PEG-IL-1ra的时间更长，且浓度更高，这表明了其延长的血清时间历程。

表D2如在实施例6a中聚乙二醇化的

IL-1ra的药物动力学分布给药后经过的时间(小时) IL-1ra的血清浓度

19kD 33kD

1 400

表D2(续)如在实施例6a中聚乙二醇化的

19kD 33kD

2 130 2500

3 40

4 15 800

6 16

8 300

10 250

24 15

实施例7

用试剂α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的rIL-1α

按照实施例4所述的方法，用实施例5所述的试剂，对重组IL-1α进行聚乙二醇化。用SDS-PAGE法鉴定出反应混合物中存在有三种主要的分子量，它们的表观分子量相应于17(未修饰)、26和33kD。后两种聚乙二醇化蛋白质分别占总蛋白质的25％和55％。

用疏水性交换层析法(Bio-Bad；HRLC MP7 HIC)从60分钟后的反应混合物中纯化聚乙二醇化的rIL-1α。在20分钟内将(NH₄)₂SO₄在50mM磷酸钠(pH7.0)中的浓度从0.43降至0.0M进行线性梯度洗脱，以分离聚乙二醇化的rIL-1α和未修饰的rIL-1α。用SDS-PAGE法检测各等份级分，按照Kaye等人所述的方法〔J.Exp.Med.，158：836-854(1983)〕对合并的级分进行分析，测定其在D10细胞增殖试验中的比活性。通过分光光度法，用1.0的消光系数在280nM处测定rIL-1α的蛋白质浓度。rIL-1α的比活性为大约1.0×10⁸单位/mg。比活性结果综述在表VIII中。26kD的聚乙二醇化的IL-1α结合物的生物活性保持在IL-1α的1/2-1/3范围内。进一步修饰生成了33kD蛋白质，结果生物活性显著丧失。

表VIII用实施例5所述试剂结合的

rIL-1α的生物活性rIL-1α蛋白质的表观分子量(kD) 比活性(单位/mg)

17(未修饰的) 4.6×10⁷

26 1.9×10⁷

33 4.5×10⁶

实施例8

用α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的IFN-α

将按照实施例5制得的α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7加到在100μl缓冲液(0.1M硼酸钠，pH 9.0)中的1mg纯化的IFN-α中，每1摩尔IFN-α加入8摩尔PEG试剂。将所得溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。

用SDS-PAGE法鉴定反应混合物中的主要的分子量，它们的表观分子量为15(未修饰)和28kD。28kD的聚乙二醇化蛋白质占总蛋白质的40％。用疏水性交换层析法(Bio-Rad；Biogel-phenyl-S-PW)从60分钟反应混合物中纯化聚乙二醇化的IFN-α并进行特性鉴定。在20分钟内将(NH₄)₂SO₄在50mM磷酸钠(pH7.0)中的浓度从0.42M降至0.0M进行线性梯度洗脱，以分离聚乙二醇化的IFN-α和未修饰的IFN-α。用SDS-PAGE法检测各等份级分，按照Familletti等人所述的方法〔Methods Enzym.，78：387-394(1987)〕对合并的级分进行分析，测定其在MDBK试验中的抗病毒活性(比活性)。

通过分光光度法，用1.0的消光系数在280nM处测定1mg/ml IFN-α缓冲液的蛋白质浓度。分离的蛋白质的比活性以单位/mg蛋白质表示，结果列在表IX中。

结果表明，28kD的聚乙二醇化的IFN-α的比活性相对于IFN-α来说没有发生明显的改变。

表IX用实施例5的试剂结合的IFN-α的生物活性IFN-α蛋白质的表观分子量(kD) 比活性(单位/mg)

15(未修饰的) 1.1×10⁸

28 1.4×10⁸

实施例8A

用试剂α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的IFN-α

用实施例5a所述的试剂如实施例8那样将IFN-α聚乙二醇化。用SDS-PAGE法鉴定出60分钟反应混合物中有三种主要的分子量，它们的表观分子量相应于15(未修饰)、35和43kD。后两种聚乙二醇化的蛋白质分别占反应混合物中总蛋白质的35％和33％。

用实施例8中所述方法测得的聚乙二醇化的IFN-α的比活性列在表X中。结果表明，35kD的聚乙二醇化的IFN-α产物的生物活性保持在IFN-α的1/2-1/3范围内。43kD的结合物丧失了大部分活性。

表X用实施例5a的试剂结合的IFN-α的生物活性IFN-α蛋白质的表观分子量(kD) 比活性(单位/mg)

15(未修饰的) 3.3×10⁸

35 1.2×10⁸

43 1.5×10⁷

实施例8B

用试剂α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的rIL-2

用实施例5所述的试剂将rIL-2聚乙二醇化并用实施例3中所述方法进行纯化。

用SDS-PAGE法鉴定出60分钟反应混合物中的主要的分子量，它们的表观分子量为15(未修饰)和25kD。25kD的聚乙二醇化的蛋白质占反应中总蛋白质的60％。

如实施例3中所述的那样，测定分离出的rIL-2蛋白质的比活性，并以单位/mg蛋白质表示，结果列在表XI中。

从表XI中可以看出，与PEG结合后，IL-2的生物活性没有改变。

表XI用实施例5所述试剂制得的与PEG

结合的rIL-2的生物活性rIL-2蛋白质的表观分子量(kD) 比活性(单位/mg)

15(未修饰的) 2.0×10⁷

25 2.0×10⁷

实施例8C

用试剂α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的rIL-2

用实施例5a所述的试剂，按照实施例3中所述的方法，将rIL-2聚乙二醇化。

用SDS-PAGE法鉴定出60分钟反应混合物中的主要分子量，它们的表观分子量为15kD(未修饰)、33kD和43kD。33kD和43kD的聚乙二醇化的蛋白质分别占反应中总蛋白质的60％和20％。

实施例9

用试剂α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的IFN-α

将IFN-α与PEG结合的另一种方法如下：

用含有5mM乙酸钠(pH5.0)和120mM NaCl的缓冲液对IFN-α(5mg/ml)进行透析。向透析后的蛋白质溶液中加入硫氰酸钾固体使最终盐浓度为0.5M，加入1/10体积的1M麦黄酮-氢氧化钠(pH 11.9)调节pH值，得到pH值为10.0的最终溶液。向试样中加入α-〔(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)，每1摩尔蛋白质加入3摩尔试剂。修饰反应在室温下进行30分钟，加入1M甘氨酸(pH6.3)来停止反应，其最终浓度为20mM。加入含3.5M硫酸铵和50mM磷酸钠(pH7.0)的缓冲液至最终硫酸铵浓度为1.1M使PEG修饰的蛋白质从溶液中沉淀出来，离心(10,000×g，12分钟)收集沉淀物。用含1.1M硫酸铵和50mM磷酸钠(pH7.0)的缓冲液漂洗沉淀物后，将沉淀物重新溶于含25mM乙酸铵(pH5.0)的缓冲液中。如实施例2中所述的那样对PEG修饰的蛋白质进行纯化和特性鉴定。得到了单一的聚乙二醇化IFN产物，其表观分子量为28kD。按照实施例8中所述的方法测定修饰后蛋白质的抗病毒活性(比活性)。起始IFN-α和与PEG结合的IFN-α的比活性分别为2.6×10⁸ U/mg和1.0×10⁸U/mg，表明相对于IFN-α来说PEG结合的IFN-α的生物活性保持在1/3以上。

实施例10

按照实施例9所述的方法，将IFN-α与PEG结合。如实施例2和9所述的那样纯化和鉴定所述蛋白质。起始IFN-α的比活性为2.6×10⁸ U/mg，而与PEG结合的IFN-α的表观分子量为31kD，其比活性为1.0×10⁸U/mg，如实施例8中所述。结合的IFN-α的生物活性在IFN-α的1/3以上。

实施例11

α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

从1g(0.2mmol)α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7(如在实施例1C中制得的)在40ml无水CH₂Cl₂中的溶液中蒸出15ml溶剂。然后在0℃下向所得溶液中加入65mg(0.3mmol)碳酸二(2-吡啶基)酯，再将混合物搅拌4小时。减压下除去溶剂，残留物用乙醚研制。滤出沉淀物，依次用50ml乙醚和50ml己烷洗涤。然后在缓慢的氮气流下在真空烘箱中干燥产物，得到1gα-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7，为白色粉末。

C₉H₁₂N₂O₃(CH₂CH₂C)_111.7：

分析计算值：C，54.56；H，9.04；N，0.55

实测值：C，54.26；H，9.00；N，0.53

实施例11a

α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制备

按照实施例11所述方法，将α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225(如在实施例1c中制得的)转化成α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。

C₉H₁₂N₂O₃(CH₂CH₂O)₂₂₅：

分析计算值：C，54.54；H，9.10；N，0.28

实测值：C，54.49；H，9.27；N，0.31

实施例11b

α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3

按照实施例11所述的方法，将α-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3(如在实施例1f中制得的)转化成α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 28.3。

C₉H₁₂N₂O₃(CH₂CH₂O)_28.3

分析计算值：C，54.61；H，8.75；N，1.94

实测值：C，54.67；H，8.96；N，1.63

实施例12

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基) SRU 111.7制备与PEG结合的IL-1ra

将α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在2.5ml缓冲液(0.1M硼酸钠，pH9.0)中的25mg纯化的IL-1ra中，每1摩尔IL-1ra加入1摩尔试剂。将溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。然后按实施例6所述的方法纯化PEG修饰的IL-1ra。

从60分钟反应中得到的主要的聚乙二醇化产物的表观分子量为28kD和38kD，它们分别占反应混合物中总蛋白质的大约42％和29％。

如实施例6所述的那样测定从反应混合物中得到的纯化IL-1ra蛋白质抑制IL-1结合的能力。结果列在表XII中。28kD产物的结合性质没有发生明显改变，38kD蛋白质的结合能力保持在IL-1ra活性的1/5以上。

表XII用实施例11所述的试剂聚乙二醇化的

IL-1ra蛋白质对〔¹²⁵I〕-IL-1结合的抑制IL-1ra蛋白质的表观分子量(kD) IC₅₀(ng/ml)

19 (未修饰的) 2.0

28 3.0

38 10.0

如实施例6中所述的那样测定PEG-IL-1ra的药物动力学分布。数据列在表D3中。单独的IL-1诱导出27283 U/ml的IL-6。未修饰的IL-1ra在给药后6小时内对IL-1响应的抑制低于50％。相反，PEG-IL-1ra虽然在早期活性较低，但在注射后24和48小时时活性高得多。因此，PEG-IL-1ra具有延长的药物动力学分布。

表D3用实施例11所述试剂结合的

IL-1ra的药物动力学分布IL-1服用前的时间(小时) IL-6单位/ml

19kD 26kD

0 4789 23806

6 15324 10833

表D3(续)用实施例11所述试剂结合的

IL-1ra的药物动力学分布IL-1服用前的时间(小时) IL-6单位/ml

19kD 26kD

24 24841 5727

48 16348 9364

72 12067 12054

实施例12A

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的IL-1ra

将α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225(如前面在实施例11a中所述的)加到在2.5ml缓冲液(0.1M硼酸钠，pH9.0)中的25mg纯化的IL-1ra中，每1摩尔IL-1ra加入4摩尔试剂。将溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。然后按实施例6所述的方法纯化PEG修饰的IL-1ra。

从60分钟反应中得到的主要的聚乙二醇化产物的表观分子量为33kD和48kD，它们分别占反应混合物中总蛋白质的大约76％和15％。从反应混合物中得到的纯化IL-1ra蛋白质抑制IL-1结合的能力列在表XIII中。33kD的PEG修饰的蛋白质抑制IL-1结合的能力保持在IL-1ra的1/8以上。48kD产物丧失了大部分结合能力。

表XIII用实施例11a所述的试剂聚乙二醇化的

19(未修饰的) 0.8

33 6.0

48 18.0

如在实施例6A中所述的那样测定PEG-IL-1ra的药物动力学分布。数据列在表D4中。与未修饰的IL-1ra相比，血清样品中可检测到PEG-IL-1ra的时间更长，且浓度更高。

表D4用实施例11a所述试剂结合的

IL-1ra的药物动力学分布给药后时间(小时) IL-1ra的血清浓度(ng/ml)

19kD 33kD

1 220

2 33 700

3 13

4 5.3 500

6 1.5

8 150

10 83

24 5

实施例13

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的rIL-2

按照实施例3和8b中所述的方法用α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7对rIL-2进行聚乙二醇化。如实施例8所述的那样测定所述IL-2蛋白质的比活性。15kD的未修饰的rIL-2的比活性为2×10⁷单位/mg，29kD的聚乙二醇化的IL-2的比活性为2.4×10⁷单位/mg，表明，后者的生物活性没有因聚乙二醇化而显著丧失。

实施例14

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧联-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的PEG修饰的rIL-1α

按照实施例4和7所述的方法，用实施例11中所述试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7对rIL-1α进行聚乙二醇化。纯化出两种聚乙二醇化的rIL-1α蛋白质，它们的表观分子量为28kD和38kD，它们分别占60分钟反应混合物中总蛋白质的50％和25％。

实施例15

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的IFN-α

按照实施例8中所述的方法，用实施例11中所述试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7便IFN-α聚乙二醇化。60分钟后，40％的蛋白质发生了衍生化，产物的表观分子量为26kD。

实施例16

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的IFN-α(IFN-α的另一种聚乙二醇化方法)

按照实施例9所述方法，用α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU111.7使IFN-α与PEG结合。如实施例8所述的那样测定IFN-α的比活性。起始IFN-α的比活性为1.7×10⁸U/mg，用α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制得的与PEG结合的IFN-α的比活性为0.8×10⁸U/mg，该比活性在IFN-α的1/2-1/3范围内。

实施例17

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的IFN-α

按照实施例9所述的方法，用实施例11a所述的试剂对IFN-α聚乙二醇化。按照实施例8所述的方法测得的与PEG结合的IFN-α的比活性为0.4×10⁸ U/mg，表明其生物活性并未显著丧失。

实施例18

α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

从1gMPEG(分子量5000)在30ml无水CH₂Cl₂中的溶液中蒸去10ml溶剂。将溶液冷却至室温，加入132mg(0.6mM)碳酸二(2-吡啶基)酯和4mg DMAP。然后将所得溶液搅拌14小时，减压下除去溶剂。残留物用乙醚研制，滤出产生的沉淀物。将该产物溶于7ml无水甘醇二甲醚中，温热溶解，将所得溶液冷却并于室温下放置数小时。滤出产生的沉淀物，用2×5ml无水甘醇二甲醚洗涤。然后将固体物在氮气流存在下置于真空烘箱中干燥，得到0.7g α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。

C₉H₁₁NO₄(CH₂CH₂O)_111.7：

分析计算值：C，54.57；H，9.02；N，0.28

实测值：C，54.51；H，9.19；N，0.28

实施例18a

α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制备

按照实施例18所述的方法，将甲氧基聚乙二醇(分子量10,000)转化成α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。

C₉H₁₁NO₄(CH₂CH₂O)₂₂₅：

分析计算值：C，54.54；H，9.08；N，0.14

实测值：C，54.54；H，9.12；N，0.11

实施例19

用试剂α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的IL-1ra

按照实施例6和12所述的方法，用α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7将IL-1ra聚乙二醇化。主要的聚乙二醇化产物的表观分子量为26kD和33kD，它们分别占60分钟反应混合物中总蛋白质的31％和57％。如实施例6中所述那样测定从反应混合物中得到的纯化的IL-1ra蛋白质抑制IL-1结合的能力，结果列在表XIV中。26kD的聚乙二醇化的IL-1ra结合物的结合能力保持在IL-1ra的1/4以上。33kD结合物的竞争结合活性降低了15倍，这表明它丧失了大部分结合活性。

表XIV用实施例18所述试剂聚乙二醇化的

19(未修饰的) 2.0

26 8.0

33 30.0

实施例19A

用试剂α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的IL-1ra

按照实施例19所述的方法，用α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225将IL-1ra聚乙二醇化。从60分钟反应混合物中得到的聚乙二醇化的主产物的表观分子量为33kD和48kD，它们分别占反应混合物中总蛋白质的大约47％和25％。

如实施例6和12所述的那样测定从反应混合物中得到的纯化IL-1ra蛋白质抑制IL-1结合的能力，结果列在表XV中。33kD蛋白质的活性保持在IL-1ra的1/6以上。更高分子量的结合物便丧失了其大部分活性。

表XV用实施例18a所述试剂聚乙二醇化的

19(未修饰的) 1.5

33 9.0

48 40.0

如实施例6A所述的那样测定PEG-IL-1ra的药物动力学分布。数据列在表D5中。与未修饰的IL-1ra相比，血清样品中可检测到PEG-IL-1ra的时间延长，表明了其血清半寿期延长。如实施例6中所述的那样，测定PEG-IL-1ra的药物动力学分布，所不同的是给予0.05μg rIL-1α。数据列在表D6中。对单独IL-1的响应是9203单位/ml IL-6。与未修饰的IL-1ra相比，给予PEG-IL-1ra后可观察到高达72小时的延长抑制作用，表明药物动力学性质得到了改进。总之，这些数据说明，即使聚乙二醇化的蛋白质体外活性减低，它也会具有改进的体内药物动力学性质。

表D5用实施例18a所述试剂结合的

IL-1ra的药物动力学分布给药后时间(小时) 血清IL-1ra(mg/ml)

19kD 33kD

1 580

2 75 100

表D5(续)用实施例18a所述试剂结合的

IL-1ra的药物动力学分布给药后时间(小时) 血清IL-1ra(mg/ml)

19kD 33kD

3 30

4 300 60

6 8

8 12

10 17

24 10

表D6用实施例18所述试剂结合的

IL-1ra的药物动力学分布给予IL-1之前的时间(小时) IL-6(单位/ml)

19kD 26kD

0 521 454

6 2334 416

24 13486 2552

48 16577 4667

72 12800 5148

实施例20

用试剂α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的IFN-α

将试剂α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl缓冲液(0.1M硼酸钠，pH9.0)中的1mg纯化的IFN-α中；每1摩尔IFN-α加入10摩尔试剂。将溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。按照实施例8所述的方法，得到了纯化的PEG修饰的IFN-α。36％的蛋白质发生了衍生化，产物的表观分子量为28kD。

如实施例8所述的那样，测定从反应混合物中得到的纯化的IFN蛋白质的比活性，结果列在表XVI中。修饰的IFN的体外生物活性降低了5-6倍。

表XVI用实施例18所述试剂结

合的IFN-α的生物活性IFN-α蛋白质的表观分子量(kD) 比活性(单位/mg)

15(未修饰的) 1.88×10⁸

28 8.0×10⁷

实施例20A

用试剂α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的rIL-2

将实施例18中所述的试剂α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl缓冲液(0.1M硼酸钠，pH9.0)中的1mg rIL-2中，每摩尔rIL-2加入5摩尔试剂。将溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。

用SDS-PAGE法鉴定从60分钟反应混合物中得到的主要分子量，它们的表观分子量为15kD(未修饰的)和25kD。25kD的聚乙二醇化蛋白质占总蛋白质的60％。

实施例21

按照实施例9所述的方法，用实施例18所述的试剂将IFN-α聚乙二醇化。

按照实施例8所述方法测得的起始未修饰的IFN-α的比活性为1.0×10⁸U/mg，与PEG结合的IFN-α的比活性为0.4×10⁸U/mg，表明生物活性没有显著丧失。

实施例22

用试剂α-〔(2-吡啶氧基)羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的IFN-α

按照实施例9的方法，用实施例18a所述试剂将PEG结合到IFN-α上。按照实施例8所述方法测得的与PEG结合的IFN-α的比活性为0.3×10⁸ U/mg。

实施例23

α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7的制备

向在100ml CH₂Cl₂中的2gα-(2-氨基乙基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7中加入94.2mg硫代碳酸二(2-吡啶基)酯。将该溶液搅拌18小时，然后用少量冷水提取。减压下除去大部分CH₂Cl₂，加入乙醚使产物沉淀，滤出产物，在高真空条件下干燥，得到α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7。

C₄H₇NOS(CH₂CH₂O)_111.7：分析计算值：C，53.88；H，9.07；N，0.28；S，0.64

实测值：C，54.45；H，8.93；N，0.28；S，0.53

实施例24

用试剂α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的IFN-α

将实施例23中所述的试剂α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在200μl缓冲液(0.1M硼酸钠，pH 9.0)中的1mg纯化的IFN-α中，每1摩尔IFN-α加入10摩尔试剂。将溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。30％的IFN-α发生了衍生化，产物的表观分子量为26kD。

实施例25

用试剂α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的rIL-2

将实施例23所述的试剂α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7加到在100μl缓冲液(0.1M硼酸钠，pH9.0)中的1.0mg重组IL-2(rIL-2)中，每摩尔rIL-2加入10摩尔试剂。将溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。按照实施例3中所述的方法，得到纯化的PEG修饰的rIL-2。衍生化结果列在表XVII中。

表XVII用实施例23所述试剂修饰rIL-2的结果rIL-2蛋白质的表观分子量占反应中得到的总蛋白质的

(kD) 百分率

15(未修饰的) 70

26 20

30 10

实施例26

用试剂α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7 制备与PEG结合的IL-1ra

按照实施例6中所述方法用α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7对IL-1ra进行聚乙二醇化。主要的聚乙二醇化产物的分子量为26、31、38和48kD，它们分别占总蛋白质的大约17％、44％、15％和10％。

按照实施例6所述方法测定从60分钟反应混合物中得到的纯化的26kD IL-1ra蛋白质对IL-1结合的抑制能力，结果列在表XVIII中。聚乙二醇化的蛋白质的结合能力保持在IL-1ra的1/2-1/3范围内。

表XVIII用实施例23所述试剂聚乙二醇化的

19 2.0

26 5.0

实施例27

用试剂α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 111.7制备与PEG结合的rIL-1α

如实施例4所述的那样，用α-〔2-(异硫氰酸根合)乙基〕-ω-甲氧基聚(氧联-1，2-乙二基)SRU 111.7对重组IL-1α进行聚乙二醇化。用SDS-PAGE法鉴定60分钟反应混合物中的两种主要分子量的聚乙二醇化产物，它们的表观分子量为26和38kD，分别占总蛋白质的46％和48％。如实施例4所述那样从反应混合物纯化聚乙二醇化的rIL-1α并进行特性鉴定。如实施例7所述那样以D10细胞增殖试验对合并的纯化级分的生物活性进行评定，结果列在表XIX中。在表中注明为混合物的样品含有一种以上未经进一步纯化的蛋白质。26kD的聚乙二醇化蛋白质的比活性基本上与IL-1相同。

表XIX用实施例23所述试剂制得的与

PEG结合的rIL-1α的生物活性rIL-1α蛋白质的表观分子量(kD) 比活性(单位/mg)

17 1.1×10⁸

26 1.7×10⁸

26，38(混合物) 2.0×10⁸

＞38(混合物) 6.0×10⁶

实施例28

α-〔(2-吡啶氧基)硫代羰基)-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225的制备

从1g(0.1mmol)MPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量为10,000)在30ml CH₂Cl₂中的溶液中蒸去10ml溶剂。冷却所得溶液，加入69.7mg(0.3mmo)硫代碳酸二(2-吡啶基)酯和2mg DMAP。然后将混合物在氩气氛下搅拌18小时。减压下除去溶剂，残留物重新溶于最少量的CH₂Cl₂中。然后加入乙醚，滤出形成的沉淀，用乙醚洗涤。将产物溶于5ml温热的甘醇二甲醚中，将所得溶液放置过夜。滤出形成的沉淀，用2×5ml甘醇二甲醚和5ml乙醚洗涤。在缓慢的氮气流下将产物置于真空烘箱中干燥，得到0.9gα-〔(2-吡啶氧基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。

C₉H₁₁NO₃S(CH₂CH₂O)₂₂₅：

分析计算值：C，54.46；H，9.04

实测值：C，54.67；H，9.30

实施例29

用试剂α-〔(2-吡啶氧基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的IL-1ra

将如实施例28所述那样制得的α-〔(2-吡啶氧基)硫代羰基〕-ω-甲氧基聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225加到在1.0ml缓冲液(0.1M硼酸钠，pH9.0)中的2.0mgIL-1ra中，每摩尔IL-1ra加入2摩尔试剂。将溶液充分混合，使聚乙二醇化反应在室温下进行60分钟。然后按照实施例6所述方法纯化PEG修饰的IL-1ra。

主要的聚乙二醇化产物的表观分子量为33kD，大约占60分钟反应混合物中总蛋白质的17％。如实施例6所述的那样，测定得自反应混合物中的纯化IL-1ra蛋白质对IL-1结合的抑制能力，结果列在表XX中。33kD蛋白质的结合能力在IL-1ra的1/3-1/4范围内。

表XX用实施例28所述试剂聚乙二醇化的

IL-1ra蛋白质对〔¹²⁵I〕-IL-1结合的抑制IL-1ra蛋白质的分子量(kD) IC₅₀(ng/ml)

19(未修饰的) 1.4

33 5.0

实施例30

硫代碳酸O，O-二(6-甲基-2-吡啶基)酯

向10g(0.09mol)6-甲基-2-羟基吡啶在250ml无水CH₂Cl₂中的溶液中加入12.7ml三乙胺。将该溶液冷却至0℃，并在氩气氛下滴加4.1ml(0.046mol)的硫光气四氯化碳溶液(85％)。再将混合物在室温下搅拌5小时，过滤，CH₂Cl₂溶液用100ml饱和NaHCO₃溶液洗涤两次。干燥有机层，减压下除去溶剂。然后将己烷(100ml)加到残留物中，所得混合物浸提过夜。滤出沉淀，用己烷洗涤，在缓慢的氮气流下于真空烘箱中干燥，得到5.7g硫代碳酸O，O-二(6-甲基-2-吡啶基)酯，m.p.155-156℃。

C₁₃H₁₂N₂O₂S：分析计算值：C，59.98；H，4.65；N，10.76；S，12.32

实测值：C，59.65；H，4.59；N，10.75；S，12.06

实施例31

α-甲基-ω-〔2-〔〔(6-甲基-2-吡啶氧基)硫代羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225

将1gα-甲氧基-ω-(2-氨基乙基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225(如实施例1c制备的)和52.7mg硫代碳酸O，O-二(6-甲基-2-吡啶基)酯(实施例30)溶解在15ml无水CH₂Cl₂中，然后将该溶液在室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂，残留物用乙醚研制。滤出沉淀，用乙醚洗涤。然后将产物溶于5ml温热的甘醇二甲醚中，通过0.75微米的微孔过滤器过滤。将溶液于室温下放置48小时。滤出产生的沉淀。在氮气氛中将产物在真空烘箱中干燥18小时，得到0.9gα-甲基-ω-〔2-〔〔(6-甲基-2-吡啶氧基)硫代羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。

C₁₀H₁₄N₂O₂S(CH₂CH₂O)₂₂₅：分析计算值：C，54.50；H，9.09；N，0.27；S，0.32

实测值：C，54.38；H，9.20；N，0.21；S，0.37

实施例32

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(6-甲基-2-吡啶氧基)硫代羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的rIL-1ra

将如实施例31所述那样制得的试剂加到在1.0ml 0.1M硼酸钠(pH9.0)中的5.0mg纯化的rIL-1ra中，每1摩尔rIL-1ra加入2.0摩尔试剂。将溶液充分混合，使该反应在室温下进行60分钟。

用实施例6所述的方法对rIL-1ra产物进行测定。表XXI给出了得自反应混合物的主要分子量的修饰百分率。

表XXI用实施例31所述试剂修饰rIL-1ra的结果rIL-1ra蛋白质的表观分子量占反应混合物中总蛋白质的

(kD) 百分率

19(未修饰的) 30.0

35 65.0

48 5.0

用实施例6所述方法纯化得自反应混合物中的rIL-1ra产物。

如实施例6中所述那样，以rIL-1放射性受体竞争结合试验对得自反应混合物的纯化级分进行测定。结果列在表XXII中。这些结果表明，就抑制IL-1结合来说，35kD蛋白质的活性比未修饰的IL-1ra低5倍，而48kD蛋白质的活性低20倍。

表XXII用实施例31所述试剂结合的rIL-1ra

对〔¹²⁵I〕-IL-1结合的抑制rIL-1ra蛋白质的表观分子量(kD) IC₅₀(ng/ml)

19(未修饰的) 1.5

35 9.0

48 30.0

实施例33

α-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙基〕-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180

A.α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180的制备

从80g MPEG(聚乙二醇，分子量为8000)在750ml甲苯中的淤浆中蒸去200ml溶剂。在回流条件下向该溶液中滴加1.7ml无水吡啶和4.7ml亚硫酰氯。回流12小时后，将反应物搅拌过夜。然后加入二氯甲烷(50ml)，通过60g碱性氧化铝(Wolem Superl)过滤所得溶液。然后用500mlCH₂Cl₂洗柱，合并有机层，减压下除去溶剂。将残留物溶于300ml CH₂Cl₂中，缓慢加入乙醚，同时在蒸汽浴上除去溶剂。连续进行该步骤，直到形成混浊的悬浮液。然后将混合物在室温下搅拌数小时，滤出产物，得到73gα-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180。

C₂H₄Cl₂(CH₂CH₂O)₁₈₀：分析计算值：C，54.16；H，9.09；Cl，0.88

实测值：C，53.40；H，8.81；Cl，0.93

B.α-(2-叠氮基乙基)-ω-(2-叠氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180的制备

将72g α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180、25g叠氮化钠和700mg无水DMF的混合物在125℃下加热搅拌12小时。然后在高真空度下除去溶剂，残留物溶于1l CH₂Cl₂中，通过硅藻土过滤。然后在蒸汽浴上除去CH₂Cl₂，与此同时加入乙醚引起沉淀。将混合物搅拌过夜，然后过滤。再将沉淀溶于最少量的50℃的甘醇二甲醚中，缓慢冷却，然后过滤。在N₂气流下将产物置于真空烘箱中干燥，得到69gα-(2-叠氮基乙基)-ω-(2-叠氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180。

C₂H₄N₆(CH₂CH₂O)₁₈₀：

分析计算值：C，54.07；H，9.08；N，1.044

实测值：C，53.76；H，9.28；N，0.96

C.α-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180的制备

在氩气氛下，将69gα-(2-叠氮基乙基)-ω-(2-叠氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180和6.7g(25.6mmol)三苯膦溶解在200ml无水CH₂Cl₂中形成的溶液搅拌过夜。加入水(2ml)，再将混合物搅拌12小时。减压下除去大部分二氯甲烷，加入400ml乙醚。滤出沉淀物，用乙醚洗涤，溶于300ml温热(50℃)的甘醇二甲醚中。将该溶液在室温下放置过夜，滤出形成的沉淀，用2×100ml甘醇二甲醚和2×100ml乙醚洗涤，在氮气流下于真空烘箱中干燥，得到66gα-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180。

C₂H₈N₂(CH₂CH₂O)₁₈₀：

分析计算值：C，54.42；H，9.18；N，0.35

实测值：C，53.85；H，9.20；N，0.43

D.α-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙基〕-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180

从1gα-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180在40ml无水CH₂Cl₂中的溶液中蒸出15ml溶剂。将溶液冷却至0℃，加入85mg(6.39mmol)碳酸二(2-吡啶基)酯。然后将混合物在0℃下搅拌4小时，减压下除去溶剂。残留物用乙醚研制，滤出产物，用乙醚(2×75ml)洗涤。然后在真空下干燥产物，再将产物溶于8ml无水甘醇二甲醚(50℃)中。将该溶液冷却并于室温下放置12小时。滤出沉淀出的产物，用2×5ml甘醇二甲醚洗涤，在氮气流下于真空烘箱中干燥，得到1gα-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙基〕-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 180。

C₁₄H₁₄N₄O₄(CH₂CH₂O)₁₈₀：

分析计算值：C，54.57；H，8.99；N，0.68

实测值：C，54.32；H，8.79；N，0.77

实施例34

α-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙基〕-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452

A.α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452的制备

按照实施例33A的方法，将聚乙二醇(分子量为20,000)转化成α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452。

C₂H₄Cl₂(CH₂CH₂O)₄₅₂：

分析计算值：C，54.38；H，9.13；Cl，0.35

实测值：C，54.36；H，9.23；Cl，0.40

B.α-(2-叠氮基乙基)-ω-(2-叠氮基乙氧基)聚(氧联-1，2-乙二基)SRU 452的制备

按照实施例33B所述方法，将α-(2-氯乙基)-ω-(2-氯乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452转化成α-(2-叠氮基乙基)-ω-(2-叠氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452。

C₂H₄N₆(CH₂CH₂O)₄₅₂：

分析计算值：C，54.35；H，9.12；N，0.42

实测值：C，54.38；H，9.30；N，0.47

C.α-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452的制备

按照实施例33C所述方法，将α-(2-叠氮基乙基)-ω-(2-叠氮基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452转化成α-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452。

C₂H₈N₂(CH₂CH₂O)₄₅₂：

分析计算值：C，54.49；H，9.17；N，0.14

实测值：O，54.44；H，9.19；N，0.15

D.α-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙基〕-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452

按照实施例33D所述方法，将α-(2-氨基乙基)-ω-(2-氨基乙氧基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452转化成α-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙基〕-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452。

C₁₄H₁₄N4O₄(CH₂CH₂O)₄₅₂：

分析计算值：C，54.56；H，9.08；N，0.28

实测值：C，54.33；H，9.13；N，0.33

实施例35

用试剂α-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙基〕-ω-〔2-〔〔(2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 452制备与PEG结合的rIL-1ra

将如实施例34所述的那样制得的试剂加到在1.0ml 0.1M硼酸钠(pH9.0)中的5.0mg纯化的rIL-1ra中，每4.0摩尔rIL-1ra加1.0摩尔试剂。将溶液在室温下充分混合60分钟。

用实施例6所述的方法对rIL-1ra产物进行测定。表XXIII给出了得自反应混合物的主要分子量的修饰百分率。

表XXIII用实施例33所述试剂修饰

rIL-1ra得到的结果rIL-1ra蛋白质的表观分子量占反应混合物中总蛋白质的

(kD) 百分率

19(未修饰的) 50.0

55 35.0

75 15.0

实施例36

碳酸二(3-甲基-2-吡啶基)酯

在0℃下，将4.6g(42mmol)3-甲基-2-羟基吡啶和6ml三乙胺在20ml CH₂Cl₂中的溶液滴加到50ml CH₂Cl₂和11ml光气在甲苯(1.93摩尔)中的溶液中。将混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌2小时。用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液依次洗涤反应混合物，然后干燥(Na₂SO₄)。减压下除去溶剂，残留物用EtOAc/己烷结晶，得到3g碳酸二(3-甲基-2-吡啶基)酯，m.p.110-112℃。

C₁₃H₁₂N₂O₃：

分析计算值：C，63.93 H，4.95；N，11.47

实测值：C，63.78；H，4.86；N，11.23

实施例37

α-甲基-ω-〔2-〔〔(3-甲基-2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225

从1gα-甲氧基-ω-(2-氨基乙基)聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225在25ml CH₂Cl₂中的溶液中蒸出10ml溶剂。然后在氩气氛下向该溶液中加入49.2mg(0.2mmol)碳酸二(3-甲基-2-吡啶基)酯并将所得混合物搅拌过夜。减压下除去溶剂，向残留物中加入80ml乙醚。滤出固体，用乙醚洗涤后溶于10ml CH₂Cl₂中。然后缓慢地加入乙醚，同时蒸出溶剂直到溶液变混浊。然后将混合物在室温下放置18小时，滤出产生的沉淀。将该固体物溶于8ml温热的甘醇二甲醚中，再于室温下放置18小时。滤出产物，在氮气流下置于真空烘箱中干燥，得到0.6gα-甲基-ω-〔2-〔〔(3-甲基-2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225。

C₁₀H₁₄N₂O₃(CH₂CH₂O)₂₂₅：

分析计算值：C，54.59；H，9.09；N，0.28

实测值：O，55.64；H，9.14；N，0.22

实施例38

用试剂α-甲基-ω-〔2-〔〔(3-甲基-2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧-1，2-乙二基)SRU 225制备与PEG结合的rIL-1ra

将如实施例37所述制得的试剂加到在1.0ml 0.1M硼酸钠(pH9.0)中的5.0mg纯化的rIL-1ra中，每1摩尔rIL-1ra加入2.0摩尔试剂。将溶液充分混合，然后使反应在室温下进行60分钟。

用实施例6所述方法对rIL-1ra产物进行测定，表XXIV给出了从反应混合物中得到的主要分子量的修饰百分率。

表XXIV用实施例37所述试剂对rIL-1ra的修饰rIL-1ra蛋白质的表观分子量占反应混合物中总蛋白质的

(kD) 百分率

19(未修饰的) 45.0

35 43.0

45 12.0

如实施例6所述的那样对得自反应混合物中的rIL-1ra产物进行纯化。如实施例6所述那样以rIL-1放射性受体竞争结合试验对得自反应混合物的纯化级分进行测定。结果列在表XXV中。就抑制IL-1结合而言，35kD蛋白质的活性比未修饰的IL-1ra低4倍，45kD蛋白质的活性低30倍。

表XXV 用实施例35所述试剂结合的

rIL-1ra对〔¹²⁵I〕IL-1的抑制rIL-1ra蛋白质的表观分子量(kD) IC₅₀(ng/ml)19(未修饰的) 1.035 4.045 30.0