CN104163864A - 经修饰fgf-21多肽和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供经修饰FGF-21多肽和其用途以及产生方法，所述经修饰人类FGF-21多肽包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的多肽序列，且在SEQ ID NO：1的108位置处或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的相应位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代。

Description

经修饰FGF-21多肽和其用途
分案说明
本申请案是申请日为2008年3月19日，申请号为200880009653.9(国际申请号为PCT/US2008/057563)，发明名称为经修饰FGF-21多肽和其用途的专利申请的分案申请。
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2007年3月30日申请的美国临时专利申请案第60/921,297号和2007年11月14日申请的美国临时专利申请案第60/988,060号的优先权和权利，所述申请案的说明书和揭示内容以全文并入本文中。
技术领域
本发明涉及视情况经至少一个非天然编码氨基酸修饰的FGF-21多肽。
背景技术
成纤维细胞生长因子是广泛表达于发育和成熟组织中的大的多肽(Baird等人,Cancer Cells,3:239-243,1991)，并且在包括血管生成、有丝分裂发生、模式形成、细胞分化、代谢调节和组织损伤修复的多种生理学功能中起关键作用(McKeehan等人,Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.59:135-176,1998；Burgess,W.H.等人,Annu.Rev.Biochem.58:575-606(1989))。原型成纤维细胞生长因子(FGF)FGF-1和FGF-2最初是从作为成纤维细胞有丝分裂原的大脑和垂体中分离。FGF-3经鉴别为由小鼠乳腺肿瘤病毒活化的常用标靶(Dickson等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.638:18-26(1991))；FGF-4到FGF-6经鉴别为致癌基因产物(Yoshida等人,Ann.NY Acad.Sci.638:27-37(1991)；Goldfarb等人,Ann.NY Acad.Sci 638:38-52(1991)；Coulier等人,Ann.NY Acad.Sci.638:53-61(1991))。FGF-10是通过基于同源性的聚合酶链反应(PCR)从大鼠肺中鉴别(Yamasaki等人,J.Biol.Chem.271:15918-15921(1996))。FGF-11到FGF-14(FGF同源因子(FHF)1到4)是通过随机cDNA测序、数据库搜索和基于同源性的PCR的组合从人类视网膜中鉴别(Smallwood等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9850-9857(1996))。FGF-15经鉴别为嵌合体同源结构域癌蛋白的下游标靶(McWhirter等人,Development124:3221-3232(1997))。FGF-16、FGF-17和FGF-18分别是通过基于同源性的PCR从大鼠心脏和胚胎中鉴别(Miyake等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.243:148-152(1998)；Hoshikawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.244:187-191(1998)；Ohbayashi等人,J.Biol.Chem.273:18161-18164(1998))。FGF-19是通过数据库搜索从人类胎儿大脑中鉴别(Nishimura等人,Biochim.Biophys.Acta1444:148-151(1999))。其具有氨基酸一致性为约30％到60％的约120个保守氨基酸残基的核。
天然存在突变的动物模型、过度表达和分析使成纤维细胞生长因子和其受体牵涉于多种疾病中(例如Wilkie等人,Current Biology,(1995)5:500-507；Pugh-Humphreys等人,The Cytokine Handbook,A.Thomson编,第2版,Academic Press,Harcourt Brace&co.出版社,London,第525-566页)，表明活性调节可用于治疗。举例来说，化合物苏拉明(Suramin)对成纤维细胞生长因子-2的抑制作用会预防小鼠的新血管形成和肿瘤生长(Pesenti等人,British Journal of Cancer,66:367-372)。成纤维细胞生长因子在血管生成(Lyons,M.K.,等人,Brain Res.(1991)558:315-320)、伤口愈合(Uhl,E.,等人,Br.J.Surg.(1993)80:977-980,1993)、星形胶质细胞增生(astrogliosis)、胶质细胞增生和分化(Biagini,G.等人,Neurochem.Int.(1994)25:17-24)、脑血管舒张(Tanaka,R.等人,Stroke(1995)26:2154-2159)和神经营养/神经调节过程中也起作用。
成纤维细胞生长因子也具有多种积极作用，包括改善血流和防止钙毒性以改善脑缺血的后果(Mattson,M.P.等人,Semin.Neurosci.(1993)5:295-307；Doetrocj.W.D.等人,J.Neurotrauma(1996)13:309-316)。基础FGF治疗促进缺血心肌中的新血管生成(Schumacher等人,Circulation(1998)97:645-650)。基础FGF增强功能恢复，并促进局灶性脑梗塞后的神经元萌生(Kawamata等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)94(15):8179-84)。根据公开文献，FGF家族由至少22个成员组成(Reuss等人,Cell TissueRes.313:139-157(2003))。
已报导成纤维细胞生长因子21(FGF-21)优先表达于肝脏中(Nishimura等人,Biochimica et Biophysica Acta,1492:203-206(2000)；WO 01/36640；和WO 01/18172，其以引用的方式并入本文中)，并且将其描述为缺血性血管疾病、伤口愈合和与肺、支气管或肺泡细胞或功能损失相关的疾病以及众多其它病症的治疗方法。FGF-21主要表达于肝脏、肾脏和肌肉组织中(参看美国专利公开案第20040259780号的实例2，所述专利以全文引用的方式并入本文中)。FGF-21基因由3个外显子构成并且位于染色体19上。与其它FGF不同，FGF-21不具有增殖和致瘤作用(Genome Biol.2001；2(3):REVIEWS3005)。
美国专利公开案第20010012628号(其以全文引用的方式并入本文中)描述人类FGF-21的核苷酸和蛋白质序列(分别参看美国专利公开案第20010012628号的SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2)。上述公开案中的SEQ ID NO:2(称作sbgFGF-19)为209个氨基酸长，并且在N末端含有28个氨基酸的前导序列。本文中呈现为SEQ ID NO:3的人类FGF-21序列是与美国专利公开案第20010012628号的SEQ ID NO:2相同的序列。这个序列具有关于位置174的脯氨酸(P)的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)，下文中称作“FGF-21的209个氨基酸P形式”。
美国专利第6,716,626号(其以全文引用的方式并入本文中)论述人类FGF-21和其它哺乳动物(尤其小鼠和大鼠)中的同源蛋白。以美国专利第6,716,626号的SEQ ID NO:1表示的小鼠FGF高度表达于肝脏中并且表达于睾丸和胸腺中，并且表明人类FGF-21可能在肝病和/或睾丸功能或源自胸腺的细胞的功能的病症发展和恢复中起作用。美国专利第6,716,626号的SEQ ID NO:4为209个氨基酸长，并且在N末端含有28个氨基酸的前导序列。本文中呈现为SEQ ID NO:6的人类FGF-21序列是与美国专利第6,716,626号的SEQ ID NO:4相同的序列。这个序列具有关于位置174的亮氨酸(L)的单核苷酸多态性(SNP)，下文中称作“FGF-21的209个氨基酸L形式”。
美国专利公开案第20040259780号(其以全文引用的方式并入本文中)论述人类FGF-21，并且呈现208个氨基酸长(美国专利公开案第20040259780号的SEQ ID NO:2)并且在N末端含有27个氨基酸的前导序列的序列。本文中呈现为SEQ ID NO:7的人类FGF-21序列是与美国专利公开案第20040259780号的SEQ ID NO:2相同的序列。这个序列具有关于位置173的亮氨酸(L)的单核苷酸多态性(SNP)，下文中称作“FGF-21的208个氨基酸L形式”。
已显示FGF-21在胰岛素存在和不存在下刺激小鼠3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取，并且以剂量依赖性方式降低ob/ob和db/db小鼠以及8周龄ZDF大鼠的餐后和空腹血糖、甘油三酯和胰高血糖素水平，因此，为使用FGF-21作为治疗糖尿病和肥胖症的疗法提供了基础(以引用的方式并入本文中的WO 03/011213，和Kharitonenkov等人,J Clin Invest.2005年6月；115(6):1627-35)。Kharitonenkov等人,J Clin Invest.2005年6月；115(6):1627-35也显示表达人类FGF-21的转基因小鼠血糖过低，对胰岛素敏感并抵抗饮食诱发的肥胖症。Kharitonenkov等人,Endocrinology(待出版)也显示FGF-21降低糖尿病猕猴(Rhesus monkey)的葡萄糖、甘油三酯、胰岛素和胰高血糖素。
另外，已显示FGF-21可有效降低危重患者的死亡率和发病率(WO 03/059270，其以引用的方式并入本文中)。美国专利申请案20050176631(其以引用的方式并入本文中)中已描述FGF-21，其影响总体代谢状况，并且可对抗在身体对败血症以及由非感染性病理原因引起的全身炎症反应综合症(SIRS)的应激反应期间可能出现的消极副作用。因此，可使用FGF-21来降低危重患者中出现的死亡率和发病率。危重患者包括需要连续、协同的医师、看护和呼吸护理的生理不稳定患者。这类护理尤其需要详加注意以提供持续监控和疗法滴定。危重患者包括处于生理代偿失调风险中的患者，并因此需要持续监控以使得加强护理团队可提供立即干预以防止不利情况发生。危重患者特别需要须由可提供连续滴定护理的团队提供的监控和生命支持。
聚乙二醇化FGF-21多肽描述于以引用的方式并入本文中的WO 2005/091944中。WO 2005/091944中描述的FGF-21多肽是181个氨基酸的多肽。以WO 2005/091944的SEQ ID NO:1表示的成熟、野生型或天然人类FGF-21序列缺乏前导序列。这个人类FGF-21与小鼠FGF-21(约79％氨基酸一致性)和大鼠FGF-21(约80％氨基酸一致性)高度一致。本文中呈现为SEQ ID NO:5的人类FGF-21序列是与WO 05/091944的SEQ IDNO:1相同的序列。这个序列具有关于位置146的亮氨酸(L)的单核苷酸多态性(SNP)。所属领域的技术人员可容易地使用替代性哺乳动物FGF-21多肽序列或类似物、突变蛋白或与人类FGF-21序列具有足够同源性的衍生物来达成本文所述的用途。
本文中呈现为SEQ ID NO:1的人类FGF-21序列具有关于位置146的脯氨酸(P)的单核苷酸多态性(SNP)。SEQ ID NO:1的N末端His标签型式在本文中展示为SEQ IDNO:2。
WO 2005/091944描述一个或一个以上PEG分子与FGF-21化合物的特定残基的共价连接。与天然FGF-21相比，所得化合物是消除半衰期延长并且清除率降低的具有生物活性的聚乙二醇化FGF-21化合物。PEG分子是与半胱氨酸或赖氨酸残基共价连接。在半胱氨酸的多个位置处进行取代以允许连接至少一个PEG分子。描述一个或一个以上赖氨酸残基(56、59、69和122)处的聚乙二醇化。
聚乙二醇化FGF-21化合物可适用于治疗具有包括(但不限于)以下病症的个体：2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症和代谢综合症。服用可通过达成较长循环半衰期而增大功效并且将需要较少剂量的聚乙二醇化FGF-21化合物将为尤其有利的，其增加需要此疗法的个体的方便性与个体顺应给药要求的可能性。代谢综合症可定义为以下征候中至少三种的群集：腹部肥胖，在大多数男性中，腰围为40英寸或更大；高血糖，空腹后为至少110毫克/分升(mg/dL)；高甘油三酯，血流中为至少150mg/dL；低HDL，小于40mg/dL；以及血压为130/85或更高。
与亲水性聚合物聚乙二醇(缩写为PEG)共价连接是对许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间的方法。PEG已广泛用于药物、人工植入物，以及生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其它应用中。为最大化PEG的所需性质，连接到生物活性分子上的一种或一种以上PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加的水溶性和循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。
PEG衍生物通常通过例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端以及碳水化合物部分等反应性化学官能团与生物活性分子连接。已存在关于形成治疗性FGF-21化合物的研究，但因多种原因而存在问题，其中一个原因是因为蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适于通过聚合物连接来修饰的位点在受体结合中起重要作用，并且对于分子的生物活性保持来说是必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点的杂乱连接通常导致聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.Clark等人,(1996),J.Biol.Chem.,271:21969-21977。为形成具有足够聚合物分子量以赋予标靶分子以所需优点的接合物，先前技术方法通常涉及多个聚合物臂与分子的随机连接，从而增大母体分子的生物活性降低或甚至完全丧失的风险。
形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)由多个α氨基酸序列构成，所述序列具有一般结构H2N-CHR-COOH。一个氨基酸的α氨基部分(H2N-)与相邻氨基酸的羧基部分(-COOH)连接形成酰胺键联，其可表示为-(NH-CHR-CO)n-，其中下标“n”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有关于蛋白质生物活性和用于连接PEG衍生物的反应性位点。
举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位存在-NH2部分。ε-NH2在碱性pH值条件下不反应。用PEG进行蛋白质衍生领域中的许多技术是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε-NH2部分的PEG衍生物。"Polyethylene Glycol andDerivatives for Advanced PEGylation",Nektar Molecular Engineering Catalog,2003,第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有常见限制：其不能在蛋白质表面上存在的通常众多赖氨酸残基之间进行选择性安装。在赖氨酸残基对于蛋白质活性较为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下或在赖氨酸残基在介导蛋白质与其它生物分子的相互作用中起作用(如在受体结合位点的情况下)的情况下，这可能是一个重要限制。
蛋白质聚乙二醇化的现有方法的又一个同样重要的复杂情况在于PEG衍生物可能经历与除所需残基以外的残基发生的不需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分(其结构表示为-N(H)-)，但许多与ε-NH2反应的化学反应性物质也可与-N(H)-反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有自由巯基，其结构表示为-SH。在一些情况下，针对赖氨酸的ε-NH2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可以产生PEG衍生的生物活性分子的复杂的异质混合物，并且存在破坏所靶向生物活性分子的活性的风险。将需要开发出允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物，其随后将使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质表面上确定以及可预测的特定位点处的生物活性分子选择性偶合。
除赖氨酸残基之外，所属领域中也已作出相当大的努力来开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活化PEG试剂。例如，参看以引用的方式并入本文中的美国专利第6,610,281号，以及"Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation",Nektar Molecular Engineering Catalog,2003,第1-17页。可使用定点诱变和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且所得自由巯基部分可与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法的复杂之处在于引入自由巯基可能使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，将需要获得一种将化学官能团引入FGF-21中的方法，其使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质选择性偶合，同时可与巯基和蛋白质中通常可见的其它化学官能团相容(即，不会发生不需要的副反应)。
从所属领域中的取样来看，在已开发的用于连接蛋白质侧链(具体来说，赖氨酸氨基酸侧链上的-NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分)的这些衍生物中，已证实许多衍生物的合成和使用存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键联，其经历水解并因此分解、降解或以其它方式在水性环境中(例如在血流中)不稳定。一些衍生物形成较稳定的键联，但在形成所述键联之前经历水解，这表示PEG衍生物上的反应性基团可能在可连接蛋白质之前已失活。一些衍生物稍有毒性并且因此不太适于活体内使用。一些衍生物因反应过慢而不能实际使用。一些衍生物因与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物在其将连接的位点中不具特异性，这也可能导致所需活性丧失并缺乏结果的再现性。为克服与用聚乙二醇部分修饰蛋白质相关的挑战，已开发出更稳定(例如，美国专利6,602,498，其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6,610,281，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。所属领域中无疑需要在要求选择性反应形成稳定化学键之前在生理环境中呈化学惰性的PEG衍生物。
近年来，已报导蛋白质科学中的全新技术，其有希望克服众多与蛋白质的位点特异性修饰相关的限制。具体来说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)(例如，L.Wang等人,(2001),Science292:498-500)以及真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae；S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人,Science301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机制中，其使得能够在活体内将非遗传编码氨基酸并入蛋白质中。使用此方法，已回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的许多新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光致异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参看Chin,J.W.等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,99:11020-11024；和Chin,J.W.等人,(2002)J. Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮基氨基酸、含重原子氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中。例如，参看J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem3(11):1135-1137；J.W.Chin等人,(2002),PNAS United States of America99:11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11。所有参考文献都是以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证实有可能选择性地并且常规地引入蛋白质中不存在的化学官能团(例如酮基、炔基和叠氮部分)，所述官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的所有官能团都呈化学惰性并且可用于有效并选择性地反应形成稳定共价键联。
在蛋白质中并入非遗传编码氨基酸的能力允许引入可能提供天然存在的官能团(例如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的官能团呈惰性，但完全并有效地反应形成稳定键联。举例来说，所属领域中已知叠氮基和乙炔基在催化量的铜存在下在水性条件下经历休斯根(Huisgen)[3+2]环加成反应。例如，参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。举例来说，通过在蛋白质结构中引入叠氮部分，能够并入对蛋白质中存在的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分平稳并有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮化物在其它蛋白质侧链存在下在生理条件下仍保持化学惰性并且不反应。
本发明尤其涉及与FGF-21多肽的活性和制备相关的问题，并且也涉及具有改良的生物或药理学性质(例如改良的治疗半衰期)的FGF-21多肽的制备。
发明内容
本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的FGF-21多肽。
在一些实施例中，FGF-21多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，FGF-21多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，FGF-21多肽是与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它FGF-21多肽连接。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸是利用连接子与水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，聚乙二醇分子是双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物是与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是FGF-21多肽。
在一些实施例中，FGF-21多肽包含至少两个与包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入SEQ ID NO:34-36中从位置1(即，在N末端)之前到C末端的一个或一个以上位置中。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：10、52、77、117、126、131、162(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：87、77、83、72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸并入SEQ ID NO:3、4、6、7或其它FGF-21序列的前导序列或信号序列中。在一些实施例中，前导序列可能选自SEQ ID NO:39、40、41、42、43或44。在一些实施例中，将FGF-21分泌构筑体克隆到具有选自SEQ ID NO:39、40、41、42、43、44的前导序列的pVK7ara(Nde/Eco)中。
在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116，117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将SEQ ID NO:34-36中从位置1(即，在N末端)之前到C末端的一个或一个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：10、52、77、117、126、131、162(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：87、77、83、72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将SEQ ID NO:3、4、6、7、39、40、41、42、43、44的前导序列或信号序列或者其它FGF-21序列中的一个或一个以上非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，将SEQ ID NO:3、4、6、7的前导序列或信号序列或者其它FGF-21序列中的一个或一个以上非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接。
在一些实施例中，FGF-21多肽包含调节FGF-21多肽对FGF-21多肽受体或结合搭配物(包括(但不限于)蛋白质、多肽、小分子或核酸)的亲和性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的稳定性相比增加FGF-21多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的免疫原性相比调节FGF-21多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的血清半衰期或循环时间相比调节FGF-21多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的水溶性相比增加FGF-21多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的溶解性相比增加宿主细胞中产生的FGF-21多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的表达或合成相比增加FGF-21多肽在宿主细胞中的表达或增加活体外合成的取代、添加或缺失。包含这种取代的FGF-21多肽保持激动剂活性并且保持或提高在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的蛋白酶抗性相比增加FGF-21多肽的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。美国专利第6,716,626号指出可经取代以改变蛋白酶裂解的潜在位点包括(但不限于)脯氨酸的2个残基内的单碱位点。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与在与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21多肽相互作用后受体的活性相比调节FGF-21受体的信号转导活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21多肽的结合相比调节其与另一分子(例如受体)的结合的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，FGF-21多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应FGF-21的相容性相比增加FGF-21多肽与医药防腐剂(例如，间甲酚、苯酚、苄醇)的相容性的取代、添加或缺失。这一增加的相容性将使得能够制备在存储期间保持蛋白质的生理化学性质和生物活性的防腐医药调配物。以全文引用的方式并入本文中的WO 2005/091944论述具有增强的医药稳定性的FGF-21突变蛋白的以下实例：用带电和/或极性但不带电的氨基酸取代一个以下氨基酸：WO 05/091944的SEQ ID NO:1的甘氨酸42、谷氨酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、赖氨酸122、组氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、异亮氨酸152、丙氨酸154、谷氨酰胺156、甘氨酸161、丝氨酸163、甘氨酸170或丝氨酸172。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代，且/或可包括一个或一个以上其它取代、添加或缺失。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处进行取代：甘氨酸42、谷氨酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、赖氨酸122、组氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、脯氨酸/亮氨酸146、异亮氨酸152、丙氨酸154、谷氨酰胺156、甘氨酸161、丝氨酸163、甘氨酸170、丝氨酸172(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处进行取代：谷氨酸91、精氨酸131、谷氨酰胺108、精氨酸77、精氨酸72、组氨酸87、亮氨酸86、精氨酸126、谷氨酸110、酪氨酸83、脯氨酸146、精氨酸135、精氨酸96、精氨酸36(SEQ ID NO:1或在SEQ IDNO:2-7中的相应氨基酸)。
WO 05/091944描述具有增强的医药稳定性的其它FGF-21突变蛋白。这些突变蛋白包括用半胱氨酸取代FGF-21中两个或两个以上的以下氨基酸(参看WO 05/091944的SEQ ID NO:1)：精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、苏氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷氨酰胺27、谷氨酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、异亮氨酸35、亮氨酸37、缬氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷氨酰胺54、亮氨酸58、缬氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、赖氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷氨酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、丝氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、丝氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、丝氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、组氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、赖氨酸122、丝氨酸123、脯氨酸124、组氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代，且/或可包括一个或一个以上其它取代、添加或缺失。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处进行取代：精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、苏氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷氨酰胺27、谷氨酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、异亮氨酸35、亮氨酸37、缬氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷氨酰胺54、亮氨酸58、缬氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、赖氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷氨酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、丝氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、丝氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、丝氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、组氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、赖氨酸122、丝氨酸123、脯氨酸124、组氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
WO 05/091944进一步描述除在Cys75-Cys93处天然存在的二硫键之外还具有工程改造过的二硫键的特定FGF-21突变蛋白(经半胱氨酸取代的氨基酸)，如下：Gln76Cys-Ser109Cys、Cys75-Ser85Cys、Cys75-Ala92Cys、Phe73Cys-Cys93、Ser123Cys-His125Cys、Asp102Cys-Tyr104Cys、Asp127Cys-Gly132Cys、Ser94Cys-Glu110Cys、Pro115Cys-His117Cys、Asn121Cys-Asp127Cys、Leu100Cys-Asp102Cys、Phe95Cys-Tyr107Cys、Arg19CysPro138Cys、Tyr20Cys-Leu139Cys、Tyr22Cys-Leu137Cys、Arg77Cys-Asp79Cys、Pro90Cys-Ala92Cys、Glu50Cys-Lys69Cys、Thr23Cys-Asp25Cys、Ala31Cys-Gly43Cys、Gln28Cys-Gly43Cys、Thr23Cys-Gln28Cys、Val41Cys-Leu82Cys、Leu58Cys-Val62Cys、Gln54Cys-Leu66Cys、Ile35Cys-Gly67Cys、Gly67Cys-Arg72Cys、Ile35Cys-Gly84Cys、Arg72Cys-Gly84Cys或Arg77Cys-Ala81Cys，其中编号是根据WO 05/091944的SEQ ID NO:1。其它具有工程改造过的二硫键的突变蛋白为Tyr22Cys-Leu139Cys；Asp24Cys-Arg135Cys；Leu118Cys-Gly132Cys；His117Cys-Pro130Cys；His117Cys-Ala129Cys；Leu82Cys-Pro119Cys；Gly80Cys-Ala129Cys；Gly43Cys-Pro124Cys；Gly42Cys-Arg126Cys；Gly42Cys-Pro124Cys；Gln28Cys-Pro124Cys；Gln27Cys-Ser123Cys；Ala26Cys-Lys122Cys；或Asp25Cys-Lys122Cys，其中编号是根据WO 05/091944的SEQ ID NO:1。其它具有工程改造过的二硫键的突变蛋白为Leu118Cys-Ala134Cys；Leu21Cys-Leu33Cys；Ala26Cys-Lys122Cys；Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys，其中编号是根据WO05/091944的SEQ ID NO:1。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代，且/或可包括一个或一个以上其它取代、添加或缺失。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽可包括在SEQ ID NO:34-36中从位置1(即，在N末端)之前到C末端的相应位置处的一个或一个以上所述取代。
WO 05/091944描述聚乙二醇化的其它FGF-21突变蛋白。这些突变蛋白具有一种以下取代：D25C、D38C、L58C、K59C、P60C、K69C、D79C、H87C、E91C、E101C、D102C、L114C、L116C、K122C、R126C、P130C、P133C、P140C。本发明的FGF-21多肽可包括在多肽中的相应位置处的一个或一个以上所述取代，且/或可包括一个或一个以上其它取代、添加或缺失。在一些实施例中，一个或一个以上非天然氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处进行取代：25、38、58、59、60、69、79、87、91、101、102、114、116、122、126、130、133、140(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽可包括在SEQ ID NO:34-36中从位置1(即，在N末端)之前到C末端的相应位置处的一个或一个以上所述取代。
WO 05/091944描述在以下位置处的半胱氨酸取代：19、21、26、28、29、30、36、39、42、50、56、61、64、65、68、70、71、77、81、85、86、90、92、94、98、107、108、112、113、123和124。WO 05/091944说明在以下位置处的半胱氨酸取代：24、27、37、40、44、46、49、57、88、89、106、110、111、115、120和139。WO 05/091944也描述在以下位置处的半胱氨酸取代：18、45、47、48、78、83、99、103、125、128、131、132和138。WO 05/091944也描述在以下位置处的半胱氨酸取代：25、38、58、59、60、69、79、87、91、101、102、114、116、122、126、130、133和140。
在一些实施例中，一个或一个以上工程改造过的键是由一个或一个以上非天然氨基酸产生。分子内的键可以多种方式产生，包括(但不限于)蛋白质中两个氨基酸(一个或两个氨基酸可能为非天然氨基酸)在合适条件下的反应；两个氨基酸(其各自可能为天然编码或非天然编码)与连接子、聚合物或其它分子在合适条件下的反应等。
在一些实施例中，FGF-21多肽中的一个或一个以上氨基酸可经一个或一个以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些实施例中，FGF-21多肽中的氨基酸可经天然存在或非天然存在氨基酸取代，条件是至少一个经非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，FGF-21多肽中的一个或一个以上氨基酸可经一个或一个以上天然存在氨基酸取代，并且另外至少一个经非天然编码氨基酸取代。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；并且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，并且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中，多肽为FGF-21多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，FGF-21多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，FGF-21多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码氨基酸以及一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
本发明也提供包含在严格条件下与SEQ ID NO:8-14杂交的多核苷酸的分离核酸。本发明也提供包含在严格条件下与SEQ ID NO:8-14杂交的多核苷酸的分离核酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。本发明也提供包含编码以SEQ ID NO:1-7表示的多肽的多核苷酸的分离核酸。本发明也提供包含编码具有一个或一个以上非天然编码氨基酸的以SEQ ID NO:1-7表示的多肽的多核苷酸的分离核酸。所属领域的技术人员显而易见，多种不同的多核苷酸可编码本发明的任何多肽。
在一些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子(opalcodon)、独特密码子、稀有密码子、五碱基密码子和四碱基密码子组成的群组。
本发明也提供制造与水溶性聚合物连接的FGF-21多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离FGF-21多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入FGF-21多肽中的非天然编码氨基酸反而可与不与20种常见氨基酸中的任一种反应的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，并入FGF-21多肽中的非天然编码氨基酸反而可与不与20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。
在一些实施例中，通过使包含含羰基的氨基酸的FGF-21多肽与包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物连接的FGF-21多肽。在一些实施例中，氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基是通过酰胺键联与聚乙二醇分子连接。
在一些实施例中，通过使包含羰基的聚乙二醇分子与包含包括氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备与水溶性聚合物连接的FGF-21多肽。
在一些实施例中，通过使包含含炔的氨基酸的FGF-21多肽与包含叠氮部分的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物连接的FGF-21多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基是通过酰胺键联与聚乙二醇分子连接。
在一些实施例中，通过使包含含叠氮基的氨基酸的FGF-21多肽与包含炔部分的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物连接的FGF-21多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基是通过酰胺键联与聚乙二醇分子连接。
在一些实施例中，聚乙二醇分子具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚乙二醇分子具有介于0.1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。在一些实施例中，聚乙二醇分枝聚合物的各支链具有介于1kDa与100kDa之间或介于1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中，与FGF-21多肽连接的水溶性聚合物包含聚烷二醇部分。在一些实施例中，并入FGF-21多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入FGF-21多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，并且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入FGF-21多肽中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分，并且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入FGF-21多肽中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，并且水溶性聚合物包含炔部分。
本发明也提供组合物，其包含包括非天然编码氨基酸的FGF-21多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明也提供包含编码包含选择密码子的FGF-21多肽的多核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述细胞包含用于将非天然编码氨基酸取代到FGF-21多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明也提供制造包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许FGF-21多肽表达的条件下培养包含一种或一种以上编码FGF-21多肽的多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；以及从细胞和/或培养基纯化FGF-21多肽。
本发明也提供增加FGF-21多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明也提供调节FGF-21多肽的免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在FGF-21多肽中的任何一个或一个以上氨基酸和/或将FGF-21多肽与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
本发明也提供用有效量的本发明的FGF-21分子治疗需要这种治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含向患者投与治疗有效量的医药组合物，所述医药组合物包含包括非天然编码氨基酸的FGF-21多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明也提供包含以SEQ ID NO:1-7表示的序列或任何其它FGF-21多肽序列的FGF-21多肽，但其中至少一个氨基酸是由非天然编码氨基酸取代。本发明也提供包含以SEQ ID NO:1、2、4和5表示的序列的FGF-21多肽。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
本发明也提供医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和包含以SEQ ID NO:1-7表示的序列或任何其它FGF-21多肽序列的FGF-21多肽，其中至少一个氨基酸是经非天然编码氨基酸取代。本发明也提供医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和包含以SEQ ID NO:1-7表示的序列的FGF多肽。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物通过糖部分与多肽连接。在一些实施例中，连接子、聚合物或生物活性分子通过糖部分与FGF-21多肽连接。
本发明也提供包含在单一氨基酸处通过共价键连接的水溶性聚合物的FGF-21多肽。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，与水溶性聚合物共价连接的氨基酸为多肽中存在的非天然编码氨基酸。
本发明提供包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的FGF-21多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过经由核糖体并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与多肽连接。在一些实施例中，多肽是经单聚乙二醇化。本发明也提供包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子的FGF-21多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在预选位点处经由核糖体并入多肽中。
本发明范围内包括与FGF-21编码区连接的FGF-21前导序列或信号序列，以及与FGF-21编码区连接的异源信号序列。所选异源前导序列或信号序列应为识别和处理过的序列，例如由宿主细胞分泌系统分泌并可能由宿主细胞经由信号肽酶裂解。本发明的前导序列可选自以下：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6的三个亮氨酸的前导序列(氨基酸位置1-28)、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7的两个亮氨酸的前导序列(氨基酸位置1-27)、SEQ ID NO:2的His标签(氨基酸位置1-10)、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44。用本发明的FGF-21治疗病状或病症的方法意指用具有或不具有信号肽或前导肽的FGF-21治疗。
本发明也提供诱导脂肪细胞中的葡萄糖摄取增加的方法，所述方法包含向所述细胞投与可有效诱导葡萄糖摄取增加的量的FGF-21。所述葡萄糖摄取增加可通过更快并且更有效的葡萄糖利用而引起能量消耗的增加。
在另一实施例中，由于用于接合非天然氨基酸的独特化学反应，包含一个或一个以上非天然存在氨基酸的FGF-21多肽与另一分子(包括(但不限于)PEG)的接合提供实质上经纯化的FGF-21。可能在利用其它纯化技术的情况下执行包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的FGF-21与另一分子(例如PEG)的接合，其中纯化技术是在接合步骤之前或之后进行，以提供实质上纯的FGF-21。
附图说明
图1：展示FGF-21与FGF-19中的相应位点中的琥珀突变。
图2：展示人类FGF-19的结构。
图3：展示FGF-21与FGF-2中的相应位点中的琥珀突变。
图4：展示人类FGF-19的结构。
图5：展示N末端His标记的FGF-21的表达和7个琥珀位点处的抑制。
图6：展示来自N末端His标记的FGF-21的表达和7个琥珀位点处的抑制的BPER上清液样品。
图7a：计算FGF21变异体30K PEG-391、30K PEG-477、30K PEG-R131、30KPEG-Q108、HIS-FGF21(His标记的野生型)的连续稀释液的EC50值的SigmaPlot图。
图7b：展示所列的各聚乙二醇化FGF21变异体的活性的平均损失倍数的表。
图8：在大肠杆菌中表达的非His标记FGF-21的SDS-PAGE分析。
图9：(A)FGF-21-Y83pAF洗提部分的SDS-PAGE分析；(B)未经标记FGF-21-Y83pAF的Q HP洗提的色谱图；(C)FGF-21-Y832pAFQ HP洗提池的SDS-PAGE分析。
图10：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图11：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图12：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图13：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图14：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图15：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图16：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图17：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图18：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图19：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图20：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图21：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图22：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图23：来自实例28的数据，FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质。
图24：pVKl0-FGF21载体图。
图25：pVK10-FGF21载体序列。
图26a：三种剂量的N-6His WT FGF21在大鼠中的血清浓度-时间曲线。经皮下向大鼠提供测试物的单次投与。每组N＝4只动物。符号表示所测量血清浓度的平均值，误差条表示标准误差。
图26b：以0.25mg/kg经皮下或经静脉内给予的N-6His WT FGF21的血清浓度-时间曲线。经皮下向大鼠提供测试物的单次投与。每组N＝4只动物。符号表示所测量血清浓度的平均值，误差条表示标准误差。总生物可用性为约87％。
图27a：在Cmax下测试物的剂量与血清浓度的关系。以观测值而非理论值报导Cmax值。每个治疗组N＝4只动物。线性回归值为0.59，斜率为348.5±91.22。
图27b：测试物的剂量与末期半衰期的关系。每个治疗组N＝4只动物。由于表观清除饱和(apparent saturation of clearance)高于0.25mg/kg，所以无法计算线性回归值。
图27c：剂量与血清浓度AUC的关系。以推至无限大计算的观测值报导AUC值。每个治疗组N＝4只动物。线性回归值为0.75，斜率为1079±194.1。
图28a：三种剂量的PP WT FGF21在大鼠中的血清浓度-时间曲线。经皮下向大鼠提供测试物的单次投与。每组N＝4只动物。符号表示所测量血清浓度的平均值，误差条表示标准误差。
图28b：以0.25mg/kg经皮下或经静脉内给予的PP WT FGF21的血清浓度-时间曲线。经皮下向大鼠提供测试物的单次投与。每组N＝4只动物。符号表示所测量血清浓度的平均值，误差条表示标准误差。总生物可用性为约65％。
图29a：在Cmax下测试物的剂量与血清浓度的关系。以观测值而非理论值报导Cmax值。每个治疗组N＝4只动物。线性回归值为0.92，斜率为454.2±42.42。
图29b：测试物的剂量与末期半衰期的关系。每个治疗组N＝4只动物。由于表观清除饱和高于0.125mg/kg，所以无法计算线性回归值。
图29c：剂量与血清浓度AUC的关系。以推至无限大计算的观测值报导AUC值。每个治疗组N＝4只动物。线性回归值为0.93，斜率为1585±137.1。
图30a：大鼠中PP与以0.5mg/kg经皮下给予的N6-His WT FGF21化合物的计算末期半衰期的比较。使用双尾t测试(two-tailed t-test)计算的p值为0.7715。每组N＝3-4只动物。
图30b：大鼠中PP与以0.5mg/kg经皮下给予的N6-His WT FGF21化合物的Cmax值的比较。使用双尾t测试计算的p值为0.7652。每组N＝3-4只动物。
图30c：大鼠中PP与以0.5mg/kg经皮下给予的N6-His WT FGF21化合物的AUCinf的比较。使用双尾t测试计算的p值为0.4372。
图31a：十种聚乙二醇化N6-His标记的FGF21异构体的PK曲线。
图31b：聚乙二醇化FGF21异构体在0.25mg/kg皮下注射后的吸收曲线。
图31c：聚乙二醇化FGF21异构体在0.25mg/kg皮下注射后的消除曲线。
图32：20kDa与30kDa聚乙二醇化的药物动力学比较。
图33：经静脉内或经皮下给予0.25mg/kg 20KPEG-pAF91(N6-His)FGF21的大鼠的血浆浓度时间曲线。向各动物投与单一剂量。每组N＝4只动物。符号表示所测量血浆浓度的平均值，条线表示标准偏差。总生物可用性为约30％。
图34：两种凝胶展示FGF21在大肠杆菌中的分泌并且展示所用前导序列OmpA、MalE和StII的作用效果极好，如由第二凝胶中的周质释放可溶性部分所证实。
具体实施方式
定义
应了解，本发明并不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，并且同样可改变。也应了解，本文中使用的术语只是为了达成描述特定实施例的目的，而并不打算限制本发明的范围，所述范围应仅由随附权利要求加以限制。
除非上下文另外明确指出，否则如本文和随附权利要求中所使用，单数形式“一”和“所述”包括多个提及物。因此，举例来说，对“FGF-21”或“FGF-21多肽”的提及是对一个或一个以上所述蛋白质的提及，并且包括所属领域的技术人员已知的其等效物等。
除非另外定义，否则本文中使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所了解的含义相同的含义。虽然可将与本文中所述类似或等效的任何方法、装置和材料用于本发明的实践或测试中，但现仅对优选方法、装置和材料加以描述。
本文中所提及的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中，以达到描述和揭示例如所述公开案中所述的可能与当前所述的发明结合使用的构筑体和方法的目的。本文中所讨论的公开案仅提供本申请案的申请日期之前的揭示内容。本文决不应解释为承认发明者无权由于先前发明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。
术语“实质上经纯化”是指可实质上或基本上不含通常伴随天然存在环境(即天然细胞，或者在重组产生FGF-21多肽的情况下为宿主细胞)中存在的蛋白质或与天然存在环境中存在的蛋白质相互作用的组分的FGF-21多肽。可实质上不含细胞物质的FGF-21多肽包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当FGF-21多肽或其变异体是由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或1％以下存在。当FGF-21多肽或其变异体是由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重计约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约lg/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或1mg/L以下存在于培养基中。因此，由本发明方法产生的“实质上经纯化”的FGF-21多肽可具有如通过适当方法(例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，特定来说至少约75％、80％、85％的纯度水平，并且更特定来说至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％或99％以上的纯度水平。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指不管何种方法用于插入(例如，直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知用于产生重组宿主细胞的其它方法)，包括外源多核苷酸的细胞。外源多核苷酸可保持非整合载体(例如，质粒)形式，或者可整合到宿主基因组中。
如本文中所用，术语“培养基”包括可支撑或容纳任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞和细胞内含物。因此，所述术语可涵盖已生长宿主细胞的培养基，例如已分泌FGF-21多肽的培养基，包括在增殖步骤之前或之后的培养基。例如，在FGF-21多肽已在细胞内产生并且宿主细胞已溶解或破裂以释放FGF-21多肽的情况下，所述术语也可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂。
如本文中关于蛋白质再折叠所用的“还原剂”是定义为使巯基保持还原状态并还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。合适的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)以及还原型谷胱甘肽。所属领域的技术人员显而易见，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
如本文中关于蛋白质再折叠所用的“氧化剂”是定义为能够从所氧化的化合物移除电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇和氧。所属领域的技术人员显而易见，多种氧化剂适用于本发明的方法中。
术语“抗糖尿病药”应表示可用于治疗、预防任何葡萄糖代谢病症或其任何并发症(包括本文中所述的任何病状、疾病或并发症)或以其它方式降低其严重性的任何药物。抗糖尿病药包括胰岛素、噻唑烷二酮、磺酰脲、苯甲酸衍生物、α-葡糖苷酶抑制剂等。可为本发明组合物的一部分的其它一般种类的抗糖尿病药包括(引号中定义的术语)：美国官方药典(official United States Pharmacopoeia)或美国官方国家处方集(officialNational Formulary)(或其任何附录)中所认可的“药物”；美国FDA所批准的“新药”和“新兽药”，这些术语用于美国法典第21篇(Title 21of the United States Code)中；在美国或海外需要政府实体批准的任何药物(“批准药”)；必需获得规章批准以遵守21U.S.C.§355(a)的任何药物(“规章批准药”)；作为人用药申请(根据21U.S.C.§379(g))或正进行人用药申请(根据21U.S.C.§379(g))的任何药剂(“人用药”)。(所有对关于这种定义的法定代号的提及都是指本申请案的原始申请日期的代号。)其它抗糖尿病药揭示于本文中，并且已为所属领域的技术人员所知。如本文中所用的本发明的抗糖尿病组合物优选能够使HbAlc水平降低至少10％(相比于基线的变化)，并且如本文中所用的本发明的抗糖尿病组合物更尤其优选能够使HbAlc水平降低至少50％(相比于基线的变化)。抗糖尿病药包括胰岛素增强剂，例如包括(但不限于)小分子胰岛素增强剂，即牛磺酸(Taurine)、α硫辛酸(Alpha Lipoic Acid)、桑椹提取物、铬、谷氨酰胺、龙胆草(Enicostemma littorale Blume)、冰糖草(Scoparia dulcis)、龙蒿(Tarragon)提取物、穿心莲(Andrographis paniculata)、异麦芽酮糖醇(Isomalt)、海藻糖或D-甘露糖，其可进一步增强胰岛素的分泌或活性。
如本文中所用的“变性剂”是定义为会造成蛋白质可逆展开的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的性质和浓度决定。合适的变性剂可为离液剂(chaotrope)、清洁剂、有机溶剂、水可混溶溶剂、磷脂或两种或两种以上所述试剂的组合。合适的离液剂包括(但不限于)尿素、胍和硫氰酸钠。适用的清洁剂可包括(但不限于)强清洁剂，例如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清洁剂)、Sarkosyl；温和非离子型清洁剂(例如，毛地黄皂苷(digitonin))；温和阳离子型清洁剂，例如N->2,3-(二油烯基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵；温和离子型清洁剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子型清洁剂，包括(但不限于)硫代甜菜碱(Zwittergent)、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)以及3-(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。可使用例如乙腈、低碳烷醇(尤其C2-C4烷醇，例如乙醇或异丙醇)或低碳烷二醇(尤其C2-C4烷二醇，例如乙二醇)等有机、水可混溶溶剂作为变性剂。适用于本发明中的磷脂可为天然存在磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变异体，例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
如本文中所用，“再折叠”描述将含有二硫键的多肽从不当折叠或展开状态转化为二硫键的天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。
如本文中所用，“共折叠”特定是指使用至少两种彼此相互作用的多肽并使得展开或不当折叠的多肽转化为天然、适当折叠多肽的再折叠过程、反应或方法。
如本文中所用，“FGF-21多肽”、“成纤维细胞生长因子21”或“FGF-21”和其非连字符形式应包括具有成纤维细胞生长因子21以及FGF-21类似物、FGF-21亚型、FGF-21模拟物、FGF-21片段、杂合FGF-21蛋白、其融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体和突变蛋白的至少一种生物活性的多肽和蛋白质，而不管所述物质的生物活性如何，并且更不管其合成或制造方法(包括(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式的核酸产生)、活体外、活体内、核酸分子的显微注射、合成、转基因和基因活化方法)如何。术语“FGF-21多肽”和“FGF-21”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的FGF-21多肽。
已描述天然存在FGF-21中多个氨基酸位置处的取代。取代包括(但不限于)调节医药稳定性、增加激动剂活性、增加蛋白酶抗性、将多肽转化成拮抗剂等的取代，并且涵盖在术语“FGF-21多肽”或“FGF-21”中。
关于缺乏前导序列的FGF-21序列，参看本文中的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5。关于具有前导序列的FGF-21序列，参看本文中的SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽与SEQID NO:1-7或FGF-21多肽的任何其它序列实质上一致。已鉴别FGF-21的多种多形体。美国专利公开案第20010012628号和美国专利第6,716,626号中已描述在相同位置处的亮氨酸或脯氨酸。美国专利第6,716,626号和美国专利公开案第20040259780号中展示相差1个氨基酸(亮氨酸)的N末端前导序列或信号序列。编码FGF-21和FGF-21多肽(包括突变体)的核酸分子以及表达和纯化FGF-21多肽的方法已众所周知，并且包括(但不限于)美国专利第6,716,626号；美国专利公开案第2005/0176631号、第2005/0037457号、第2004/0185494号、第2004/0259780号、第2002/0164713号和第2001/0012628号；WO 01/36640；WO 03/011213；WO 03/059270；WO 04/110472；WO05/061712；WO 05/072769；WO 05/091944；WO 05/113606；WO 06/028595；WO06/028714；WO 06/050247；WO 06/065582；WO 06/078463中所揭示者，所述专利是以全文引用的方式并入本文中。
术语“FGF-21多肽”也包括天然存在FGF-21的医药学上可接受的盐和前药，以及盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在FGF-21和其多肽融合体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体。术语“FGF-21多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或两个末端处包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)：例如，由缺乏前导肽或信号肽的FGF-21的成熟形式或其部分重组表达所产生的使蛋氨酸与FGF-21的N末端连接的蛋氨酰基FGF-21(蛋氨酸与FGF-21的N末端连接，由重组表达产生)；出于纯化目的而形成的融合体(包括(但不限于)与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合)；与血清白蛋白结合肽形成的融合体；和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。美国专利第5,750,373号(其以引用的方式并入本文中)描述一种选择新颖蛋白质(例如生长激素)和对各别受体分子的结合性质已改变的抗体片段变异体的方法。所述方法包含将编码所关注蛋白质的基因与丝状噬菌体M13的基因III外壳蛋白的羧基末端域融合。可产生包含FGF-21和一个或一个以上其它分子(包括但不限于角化细胞生长因子(KGF))的嵌合分子(Reich-Slotky,R.等人,J.Biol.Chem.270:29813-29818(1995))。嵌合分子可含有FGF-21与KGF分子中一种或两种分子的特定区域或片段。可通过标准生物化学方法由蛋白质制备任何所述片段，或通过表达编码所述片段的多核苷酸来制备所述片段。FGF-21或其片段可以包含人类血清白蛋白(HSA)或其部分的融合蛋白形式产生。所述融合构筑体适于增强FGF-21或其片段在真核宿主细胞中的表达。如美国专利第5,766,883号和PCT公开案WO 97/24445(其以引用的方式并入本文中)中所揭示，例示性HSA部分包括N末端多肽(氨基酸1-369、1-419，以及由氨基酸1开始的中间长度)。其它嵌合多肽可包括具有与HSA的C末端和N末端各自连接的FGF-21或其片段的HSA蛋白。所述HSA构筑体揭示于以引用的方式并入本文中的美国专利第5,876,969号中。FGF-21的哺乳动物细胞表达描述于以引用的方式并入本文中的WO 2005/091944中。
多个参考文献揭示通过聚合物接合或糖基化对多肽进行修饰。术语“FGF-21多肽”包括与例如PEG等聚合物接合的多肽，并且可包含一种或一种以上由半胱氨酸、赖氨酸或其它残基进行的其它衍生。另外，FGF-21多肽可包含连接子或聚合物，其中与连接子或聚合物接合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸，或可利用所属领域中已知的技术(例如与赖氨酸或半胱氨酸偶合)使连接子或聚合物与天然编码氨基酸接合。
已报导FGF-21和其它多肽的聚合物接合。例如，参看WO 2005/091944，其以引用的方式并入本文中。美国专利第4,904,584号揭示聚乙二醇化的赖氨酸缺失多肽，其中至少一个赖氨酸残基已缺失或由任何其它氨基酸残基置换。WO 99/67291揭示一种使蛋白质与PEG接合的方法，其中蛋白质上的至少一个氨基酸残基已缺失并且在足以实现与蛋白质接合的条件下使蛋白质与PEG接触。WO 99/03887揭示属于生长激素超家族的多肽的聚乙二醇化变异体，其中半胱氨酸残基已由位于多肽指定区域中的非必需氨基酸残基取代。WO 00/26354揭示一种制备具有降低的变应原性的糖基化多肽变异体的方法，所述变异体与相应母体多肽相比包含至少一个其它糖基化位点。美国专利第5,218,092号(其以引用的方式并入本文中)揭示对粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽的修饰，以引入至少一个其它碳水化合物链(与天然多肽相比)。
术语“FGF-21多肽”也包括糖基化FGF-21，例如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、多肽的N连接或O连接糖基化形式。含有单一核苷酸变化的变异体也被视为FGF-21多肽的生物活性变异体。另外，也包括剪接变异体。术语“FGF-21多肽”也包括由化学方式连接或以融合蛋白形式表达的任何一种或一种以上FGF-21多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配体或任何类型的其它生物活性分子的FGF-21多肽异质二聚物、同型二聚物、异质多聚物或同型多聚物，以及含有例如特定缺失或其它修饰但仍保持生物活性的多肽类似物。
除非另外说明(即，当说明基于SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或其它FGF-21序列进行比较时)，否则所有对本文中所述的FGF-21中氨基酸位置的提及都是基于SEQ IDNO:1中的位置。举例来说，SEQ ID NO:1的位置77处的氨基酸是精氨酸，并且相应精氨酸位于SEQ ID NO:2中的位置87处。所属领域的技术人员应了解，在任何其它FGF-21分子(例如SEQ ID NO:2、3、4、5、6和7)中可容易地鉴别对应于SEQ ID NO:1中的位置的氨基酸位置。所属领域的技术人员应了解，在任何其它FGF-21分子(例如FGF-21融合体、变异体、片段等)中可容易地鉴别对应于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或任何其它FGF-21序列中的位置的氨基酸位置。举例来说，可使用例如BLAST等序列比对程序来比对并鉴别与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或其它FGF-21序列中的位置一致的特定蛋白质位置。本文中关于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或其它FGF-21序列所述的氨基酸取代、缺失或添加也打算指代本文中所述或所属领域中已知的FGF-21融合体、变异体、片段等的相应位置中的取代、缺失或添加，并且由本发明明确涵盖。
术语“FGF-21多肽”或“FGF-21”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的FGF-21多肽。本发明的FGF-21多肽可包含一个或一个以上天然氨基酸修饰以及一个或一个以上非天然氨基酸修饰。已描述在天然存在FGF-21多肽中的多个氨基酸位置中的例示性取代，其包括(但不限于)调节医药稳定性的取代、调节FGF-21多肽的一种或一种以上生物活性(例如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、降低蛋白酶敏感性、将多肽转化成拮抗剂等)的取代，并且术语“FGF-21多肽”涵盖所述取代。在一些实施例中，FGF-21拮抗剂包含与FGF-21分子的受体结合区域中存在的水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，FGF-21多肽进一步包含调节FGF-21多肽的生物活性的添加、取代或缺失。举例来说，添加、取代或缺失可调节FGF-21的一种或一种以上性质或活性。举例来说，添加、取代或缺失可调节对FGF-21多肽受体的亲和性，调节循环半衰期，调节治疗半衰期，调节多肽的稳定性，调节由蛋白酶进行的裂解，调节剂量，调节释放或生物可用性，促进纯化，或改良或改变特定投药途径。类似地，FGF-21多肽可包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括但不限于FLAG或poly-His)或其它基于亲和性的序列(包括但不限于FLAG、poly-His、GST等)或改良多肽的检测(包括但不限于GFP)、纯化或其它特性的连接分子(包括但不限于生物素)。
术语“FGF-21多肽”也涵盖所连接的同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物和异质多聚物，其包括(但不限于)通过非天然编码氨基酸侧链与相同或不同的非天然编码氨基酸侧链、与天然编码氨基酸侧链直接连接或通过连接子间接连接者。例示性连接子包括(但不限于)小的有机化合物、各种长度的水溶性聚合物(例如聚乙二醇或葡萄聚糖)或各种长度的多肽。
“非天然编码氨基酸”是指并非20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语“非天然编码氨基酸”同义使用的其它术语为“非天然氨基酸”、“非天然存在氨基酸”。术语“非天然编码氨基酸”也包括(但不限于)通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而存在，但本身无法通过翻译复合物天然并入正在生长的多肽链中的氨基酸。这些非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸以及O-磷酸酪氨酸。
“氨基末端修饰基”是指可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基”是指可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(例如血清白蛋白)，或增加肽的血清半衰期的其它部分。
术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基”、“反应性位点”、“化学反应性基团”和“化学反应部分”在所属领域和本文中是用于指代分子中独特的可限定部分或单元。这些术语在化学领域中在一定程度上同义，并且在本文中是用于指示执行某种功能或活性并可与其它分子反应的分子部分。
术语“键联”或“连接子”在本文中用于指通常由于化学反应而形成并且通常为共价键联的基团或键。水解稳定键联意思是所述键联在水中实质上稳定并且在适用的pH值下(包括但不限于在生理条件下)长时间(或许甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解的键联意思是所述键联可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解的键联意思是所述键联可由一种或一种以上酶降解。所属领域中应了解，PEG和相关聚合物在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中可包括可降解键联。举例来说，由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键联通常在生理条件下水解以释放所述生物活性剂。其它水解可降解的键联包括(但不限于)碳酸酯键联；由胺与醛反应所产生的亚胺键联；由醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键联；作为酰肼与醛的反应产物的腙键联；作为醛与醇的反应产物的缩醛键联；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键联；由包括(但不限于)例如PEG等聚合物的末端的胺基与肽的羧基形成的肽键联；以及由包括(但不限于)聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键联。
术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”在用于本文中时意思是可影响与生物体(包括但不限于病毒、细菌、噬菌体、转位子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物以及人类)有关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学性质的任何物质。具体来说，如本文中所用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或用于以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康状况的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、疫苗、免疫原、硬药(hard drug)、软药(soft drug)、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、类毒素、毒素、原核和真核细胞、病毒、多糖、从病毒、细菌、昆虫、动物或任何其它细胞或细胞类型、脂质体、微粒和胶束获得或得到的核酸和其部分。适用于本发明的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎药、抗肿瘤药、心血管药、抗焦虑药、激素、生长因子、类固醇药、微生物产生的毒素等等。
“双官能聚合物”是指包含两个能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键联的不连续官能团的聚合物。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接子可用于形成包括第一生物活性组分、双官能连接子以及第二生物活性组分的接合物。已知使各种化合物与肽连接的众多程序和连接分子。例如，参看欧洲专利公开案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号，其是以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键联的不连续官能团的聚合物。双官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需长度或分子量，并且可经选择以在与FGF-21连接的一个或一个以上分子与其受体或FGF-21之间提供特定所需间隔或构象。
当由从左向右书写的常规化学式表示取代基时，同样涵盖由从右向左书写的结构得到的化学上相同的取代基，例如，结构-CH2O-等同于结构-OCH2-。
术语“取代基”包括(但不限于)“无干扰取代基”。“无干扰取代基”为产生稳定化合物的基团。合适的无干扰取代基或基团包括(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C1-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中各m为1到8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其盐等。如本文中所用，各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另外说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是直链或支链或环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和的并且可包括具有指定碳原子数目(即C1-C10意思是1到10个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另外说明，否则术语“烷基”还打算包括下文更详细定义的烷基的衍生物，例如“杂烷基”。只限于烃基的烷基被称作“同系烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由烷烃衍生的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括下文描述为“亚杂烷基”的基团。通常，烷基(或亚烷基)将具有1到24个碳原子，其中具有10个或10个以下碳原子的基团为本文中所述的方法和组合物的特定实施例。“低碳烷基”或“低碳亚烷基”为通常具有8个或8个以下碳原子的较短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)是以其常规意义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的烷基。
除非另外说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合时意思是由指定数目的碳原子以及至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成的稳定直链或支链或环状烃基或其组合，并且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置或位于烷基与分子的其余部分连接的位置。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可相邻，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“亚杂烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由杂烷基衍生的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基来说，相同或不同的杂原子也可占据链的一端或两端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团来说，连接基团的化学式所书写的方向并不表示连接基团的定向。举例来说，式-C(O)2R'-表示-C(O)2R'-与-R'C(O)2-。
除非另外说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合时分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和和完全不饱和的环键联。另外，对于杂环烷基来说，杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，术语“亚杂环烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由杂环烷基衍生的二价基团，并且术语“亚环烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由环烷基衍生的二价基团。
如本文中所用，术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与FGF-21多肽的连接可产生以下改变，其包括(但不限于)相对于未经修饰形式增加或经调节的血清半衰期或者增加或经调节的治疗半衰期、经调节的免疫原性、经调节的物理缔合特性(例如聚集和多聚物形成)、改变的受体结合、改变的与一种或一种以上结合搭配物的结合，以及改变的受体二聚或多聚。水溶性聚合物可能具有或可能不具有其本身的生物活性，并且可用作连接FGF-21与其它物质(包括(但不限于)一种或一种以上FGF-21多肽或一种或一种以上生物活性分子)的连接子。合适的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，所述专利是以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚以及α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文中所用，术语“聚烷二醇”或“聚(烷二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷二醇”涵盖线性和分枝聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它例示性实施例列于(例如)商业供应商目录中，例如Shearwater Corporation的目录“Polyethylene Glycol and Derivatives for BiomedicalApplications”(2001)。
除非另外说明，否则术语“芳基”意思是可为单环或稠合在一起或共价连接的多环(包括(但不限于)1到3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子视情况经氧化，并且氮原子视情况经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一者的取代基都选自下文所述的可接受取代基的群组。
为了简便起见，当与其它术语组合使用时(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)，术语“芳基”包括如上文所定义的芳基与杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”打算包括芳基与烷基连接的基团(包括(但不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经(例如)氧原子置换的烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。
以上术语(包括(但不限于)“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”)各自打算包括指定基团的经取代与未经取代形式。各类型基团的例示性取代基提供如下。
烷基和杂烷基(包括通常被称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基的基团)的取代基可为选自(但不限于)以下的多种基团中的一种或一种以上基团：-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")＝NR""、-NR-C(NR'R")＝NR'"、-S(O)R'、S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN以及-NO2，其数目在0到(2m'+1)的范围内，其中m'为此类基团中碳原子的总数。R'、R"、R'"和R""各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(其包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团是独立地经选择，而当存在R'、R″、R″'和R″″基团中的一者以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与对于烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基存在改变且选自(但不限于)：卤素、-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R″'、-OC(O)R'、C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R″、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")＝NR""、-NR-C(NR'R")＝NR"'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN和-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数目在0到芳环系统上开放价态的总数的范围内；并且其中R'、R"、R'"和R""独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团是独立地经选择，而当存在R'、R″、R″'和R″″基团中的一者以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。
如本文中所用，术语“经调节的血清半衰期”意思是经修饰FGF-21的循环半衰期相对于其未经修饰形式的正变化或负变化。通过在投与FGF-21后的各个时间点取血样并测定每一样品中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期的增加理想地为至少约两倍，但例如当较小增加能够促成令人满意的给药方案或避免毒性作用时，较小增加也可适用。在一些实施例中，所述增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。
如本文中所用，术语“经调节的治疗半衰期”意思是治疗有效量的FGF-21的半衰期相对于其未经修饰形式的正变化或负变化。通过在投与后的各个时间点测量分子的药物动力学和/或药效性质来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期理想地能够促成特定有益的给药方案、特定有益的总剂量或避免不需要的作用。在一些实施例中，增加的治疗半衰期是由效力增加、经修饰分子与其标靶的结合增加或降低、酶(例如蛋白酶)对分子的分解增加或降低或未经修饰分子的另一参数或作用机制增加或降低或者分子的受体介导清除增加或降低引起。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“经分离”表示所述核酸或蛋白质不含其在天然状态下缔合的细胞组分中的至少一些组分，或所述核酸或蛋白质已浓缩到高于其活体内或活体外产生浓度的程度。其可为均质状态。经分离物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液(包括(但不限于)水溶液)形式。其可为包含其它医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的组分。通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质上已经纯化。具体来说，经分离基因是从侧接所述基因并编码除所关注基因之外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上一个条带。具体来说，其意思可能是核酸或蛋白质为至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％纯或更纯。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合性质并且是以类似于天然存在核苷酸的方式代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也是指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体来说，可通过产生一个或一个以上所选(或所有)密码子的第三位置是经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述以及对蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基是通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在氨基酸，以及以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰肽主链，但仍保持与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。对氨基酸的提及包括例如天然存在的蛋白源性L-氨基酸、D-氨基酸；经化学修饰的氨基酸，例如氨基酸变异体和衍生物；天然存在的非蛋白源性氨基酸，例如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有所属领域中已知为氨基酸特征的性质的化学合成化合物。非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)α-甲基氨基酸(例如，α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、类组氨酸的氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸)、侧链中另外具有亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)，以及侧链中的羧酸官能团经磺酸基置换的氨基酸(例如，半胱氨酸)。
在本文中，氨基酸可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可由其通常接受的单字母代码来指代。
“保守性修饰变异体”适用于氨基酸与核酸序列。对于特定核酸序列来说，“保守性修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上一致的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一位置处，密码子可改变为所述相应密码子中的任一个而不会改变所编码的多肽。所述核酸变异为“沉默变异(silent variation)”，其为保守性修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每一核酸序列也描述核酸的每一种可能的沉默变异。所属领域的技术人员应认识到，核酸中的各密码子(除AUG和TGG之外，AUG通常为蛋氨酸的独特密码子，而TGG通常为色氨酸的独特密码子)都可经修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异都隐含在各所述序列中。
关于氨基酸序列，所属领域的技术人员应认识到，改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或少量氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变异体”，其中所述改变将导致氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。所属领域的技术人员已知提供功能类似氨基酸的保守性取代表。所述保守性修饰变异体除为多态变异体之外(并且不排除这些变异体)，还为种间同源物和本发明的等位基因。
所属领域的技术人员已知提供功能类似胺基酸的保守性取代表。以下八组各自含有彼此为保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(例如参看Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月))。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情形中，术语“一致”或“一致性”百分比是指相同的两个或两个以上序列或子序列。当通过比较窗比较和比对最大对应性时，或如使用下列序列比较算法(或所属领域的技术人员可用的其它算法)中的一种或通过手工比对和目测检查来测量指定区域时，如果序列具有相同(即，在指定区域上具有约60％一致性，约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致性)的氨基酸残基或核苷酸百分比，那么所述序列为“实质上一致”的。此定义也是指测试序列的互补序列。一致性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或(在未指定时)多核苷酸或多肽的整个序列上。可通过包含以下步骤的方法获得编码本发明多肽的多核苷酸(包括来自非人类物种的同源物)：在严格杂交条件下用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的经标记探针筛选文库，以及分离全长cDNA和含有所述多核苷酸序列的基因组克隆。所属领域的技术人员熟知所述杂交技术。
对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。在使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文中所用，“比较窗”包括参考选自由20到600、通常约50到约200、更通常约100到约150组成的群组的连续位置数中的任一者的区段，其中可在将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳比对后对两个序列进行比较。所属领域的技术人员已知用于比较的序列比对方法。可通过以下方法进行用于比较的最佳序列比对，所述方法包括(但不限于)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法；搜索Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似方法；所述算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或手工比对和目测检查(例如参看Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊))。
适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人,(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过经由万维网在ncbi.nlm.nih.gov上访问的美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数W、T和X将决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列来说)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62得分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对数(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。通常在“低复杂性”过滤器关闭的情况下进行BLAST算法。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(smallest sum probability，P(N))，其提供关于两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指标。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2、或小于约0.01，或小于约0.001，那么认为所述核酸与参考序列相似。
短语“与…选择性(或特异性)杂交”是指当复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、双联或杂交。
短语“严格杂交条件”是指在所属领域中已知的低离子强度和高温条件下DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列的杂交。通常，在严格条件下，探针会与其在核酸的复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中的标靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件具有序列依赖性并且在不同环境下会不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)中。通常，选择严格条件为在规定离子强度、pH值下比特异性序列的热力学熔点(Tm)低约5℃-10℃。Tm为与标靶互补的探针的50％与标靶序列杂交处于平衡(因为标靶序列过量存在，在Tm下，在平衡时占据50％的探针)时的温度(在指定离子强度、pH值以及核酸浓度下)。严格条件可为在pH值为7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01M到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)来说为至少约30℃且对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)来说为至少约60℃的条件。也可通过添加例如甲酰胺等去稳定剂来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交来说，阳性信号可为至少两倍背景、视情况10倍背景杂交。例示性严格杂交条件可如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培育；或5×SSC、1％SDS，在65℃下培育，其中在65℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
如本文中所用，术语“真核生物”是指属于系统发育域(phylogenetic domain)真核域(Eucarya)的生物体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文中所用，术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核生物体可属于真细菌(Eubacteria)(包括(但不限于)大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)系统发育域，或古生菌(Archaea)(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和嗜盐菌种NRC-1)、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发育域。
如本文中所用，术语“个体”是指动物，在一些实施例中为哺乳动物，并且在其它实施例中为人类，其为治疗、观察或实验的对象。动物可为伴侣动物(例如，狗、猫等)、家畜(例如，牛、羊、猪、马等)或实验动物(例如，大鼠、小鼠、天竺鼠等)。
如本文中所用，术语“有效量”是指所投与的经修饰非天然氨基酸多肽的量，所述量会在一定程度上减轻所治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。可投与含有本文中所述的经修饰非天然氨基酸多肽的组合物来进行预防性、增强性和/或治疗性处理。
术语“增强”意思是增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，对于增强治疗剂的作用来说，术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用的效力或持续时间的能力。如本文中所用，“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂在所需系统中的作用的量。当用于患者中时，关于此用途有效的量将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。
如本文中所用，术语“经修饰”是指对给定多肽作出的任何改变，例如多肽长度、多肽的胺基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰的改变。形式“(经修饰)”术语意思是所讨论的多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论的多肽可经修饰或未经修饰。
术语“翻译后修饰”是指在天然或非天然氨基酸已并入多肽链中之后相对所述氨基酸发生的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(例如在不含细胞的翻译系统中)、翻译后活体内修饰以及翻译后活体外修饰。
在预防应用中，将含有FGF-21多肽的组合物投与易患特定疾病、病症或病状或者处于患特定疾病、病症或病状的风险中的患者。所述量是定义为“预防有效量”。在这一用途中，精确量也视患者的健康状况、体重等而定。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述预防有效量完全在所属领域的技能范围内。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在特定反应条件下发生反应的“保护基”或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苄基或例如甲基、乙基或叔丁基等烷基。所属领域中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与所述方法和组合物一起使用，其包括例如Nvoc和MeNvoc等光不稳定基团。所属领域中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与所述方法和组合物一起使用。
仅举例来说，封端/保护基团可选自：
其它保护基描述于Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley&Sons,New York,NY,1999中，其是以全文引用的方式并入本文中。
在治疗应用中，将足以治愈或至少部分抑制疾病、病症或病状的症状的量的含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物投与已罹患所述疾病、病状或病症的患者。所述量是定义为“治疗有效量”，且将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量完全在所属领域的技能范围内。
术语“治疗”是用于指预防性和/或治疗性处理。
本文中提出的非天然编码氨基酸多肽可包括一个或一个以上原子经原子质量或质量数与自然界中通常可见的原子质量或质量数不同的原子置换的经同位素标记的化合物。可并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分别为例如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、8F、36Cl。本文中所述的某些经同位素标记的化合物(例如，合并有例如3H和14C等放射性同位素的化合物)可用于药物和/或底物组织分布检定中。此外，用例如氘(即2H)等同位素取代可提供由较高代谢稳定性产生的某些治疗优点，例如增加的活体内半衰期或降低的剂量需求。
所有异构体(包括(但不限于)非对映异构体、对映异构体和其混合物)都被视为本文中所述组合物的一部分。在另外或其它的实施例中，非天然编码氨基酸多肽在向需要产生代谢物的生物体投与之后代谢，所述代谢物随后用于产生所需作用(包括所需治疗作用)。在其它或另外的实施例中，其为非天然编码氨基酸多肽的活性代谢物。
在一些情况下，非天然编码氨基酸多肽可以互变异构体形式存在。另外，本文中所述的非天然编码氨基酸多肽可以未溶剂化形式以及与医药学上可接受的溶剂(例如水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。也认为本文中揭示所述溶剂化形式。所属领域的技术人员应认识到，本文中的一些化合物可以若干互变异构形式存在。所有这种互变异构形式都被视作本文中所述组合物的一部分。
除非另外说明，否则使用所属领域的技能范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。
具体实施方式
I.引言
本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的FGF-21分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的FGF-21多肽包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含利用所属领域的技术人员已知适用于特定反应性基团的化学方法，使包含第二反应性基团的分子与至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸连接，所述包含第二反应性基团的分子包括(但不限于)：标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼化部分、光化辐射可激发的部分、可光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传递素、放射性核苷酸、放射性传递素、中子俘获剂或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也被称作乙炔部分)，并且第二反应性基团为叠氮部分，并利用[3+2]环加成化学方法。在另一个实例中，第一反应性基团为叠氮部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，并且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰FGF-21多肽的某些实施例中，使用至少一种包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中活体内进行。连接子、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可将所述分子与多肽连接。分子可与多肽直接连接。
在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由一种宿主细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常无法通过另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常无法通过非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成(palmitate addition)、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键使寡糖与天冬酰胺连接(包括(但不限于)其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一个实施例中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、为进行细菌表达而优化5'的真核生物分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核生物)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和源自转位子的信号序列bla。任何此类序列都可经修饰以使多肽具有所需结果，包括(但不限于)用不同信号序列取代一个信号序列，用不同前导序列取代一个前导序列等。
所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。所述非天然氨基酸可相同或不同，例如，在蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，蛋白质的天然存在形式中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸是经非天然氨基酸取代。
本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的FGF-21的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入FGF-21中可允许应用涉及特定化学反应(包括(但不限于)与一个或一个以上非天然编码氨基酸反应而不与通常存在的20种氨基酸反应)的接合化学。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的FGF-21是通过非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供一种用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及回应选择密码子将非遗传编码氨基酸(包括(但不限于)含有在20种天然并入氨基酸中未发现的官能团或取代基(包括(但不限于)酮、叠氮或乙炔部分)的氨基酸)选择性并入蛋白质中，并且随后用合适的反应性PEG衍生物修饰所述氨基酸。一旦并入氨基酸侧链，就可通过利用所属领域的技术人员已知适用于非天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法适用于在本发明中将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括(但不限于)分别与(包括(但不限于))乙炔或叠氮化物衍生物进行休斯根[3+2]环加成反应(例如参看Padwa,A.Comprehensive Organic Synthesis,第4卷,(1991)Trost,B.M.编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页；以及Huisgen,R.1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)Padwa,A.编,Wiley,New York,第1-176页)。
因为休斯根[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应，所以蛋白质可在极高选择性下经修饰。通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐，可在室温下在水性条件下以优良区域选择性(1,4>1,5)进行此反应。例如，参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064；和Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599；以及WO03/101972。可通过[3+2]环加成而加成到本发明蛋白质上的分子包括具有合适的官能团或取代基(包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物)的几乎任何分子。这些分子可分别加成到具有乙炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)上。
由休斯根[3+2]环加成得到的5元环在还原性环境中通常为不可逆的，并且在水性环境中长时间对水解稳定。因此，可在苛刻水性条件下用本发明的活性PEG衍生物修饰多种物质的物理和化学特征。甚至更重要的是，因为叠氮部分和乙炔部分彼此具有特异性(并且例如不与20种常见的遗传编码氨基酸中的任一种反应)，所以可在一个或一个以上特异性位点中以极高的选择性修饰蛋白质。
本发明也提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一个或一个以上乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的叠氮部分偶合。类似地，含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的乙炔部分偶合。
更具体来说，叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包括其它取代基，只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含烷基和芳基乙炔和各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包括其它取代基，只要保持叠氮化物特异性反应性即可。
本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的接合物，所述其它物质包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子俘获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。本发明也包括具有叠氮或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的接合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可在蛋白质中含有带有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的位置处与生物活性分子偶合。使PEG与生物活性分子偶合的键联包括(但不限于)休斯根[3+2]环加成产物。
所属领域中已明确确定，PEG可用于修饰生物材料的表面(例如参看美国专利6,610,281；Mehvar,R.,J.Pharm Pharm Sci.,3(1):125-136(2000)，其是以引用的方式并入本文中)。本发明也包括包含具有一个或一个以上反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料，和通过休斯根[3+2]环加成键联与所述表面偶合的一种或一种以上本发明的含叠氮基或乙炔的聚合物。生物材料和其它物质也可通过除叠氮基或乙炔键联以外的其它键联(例如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键联)与由叠氮化物或乙炔活化的聚合物衍生物偶合以留下叠氮或乙炔部分用于后续反应。
本发明包括一种合成本发明的含叠氮基聚合物和含乙炔聚合物的方法。在含叠氮基的PEG衍生物的情况下，可使叠氮化物与聚合物的碳原子直接键结。或者，可通过将一端具有叠氮部分的连接剂与常规活化聚合物连接来制备含叠氮基的PEG衍生物，使得所得聚合物在其末端具有叠氮部分。在含乙炔的PEG衍生物的情况下，可使乙炔与聚合物的碳原子直接键结。或者，可通过将一端具有乙炔部分的连接剂与常规活化聚合物连接来制备含乙炔的PEG衍生物，使得所得聚合物在其末端具有乙炔部分。
更具体来说，在含叠氮基的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以产生具有反应性更强的部分(例如甲磺酸根、三氟乙磺酸根、甲苯磺酸根或卤素离去基)的经取代聚合物。所属领域的技术人员已知含有磺酰卤、卤素原子以及其它离去基的PEG衍生物的制备和使用。所得经取代的聚合物随后经历反应以在聚合物的末端用叠氮部分取代反应性更强的部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与一端具有叠氮基的连接剂发生反应，使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且叠氮部分位于聚合物的末端。所属领域的技术人员已知亲核和亲电子部分，其包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等。
更具体来说，在含乙炔的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以从含有乙炔部分的前体置换卤素或其它经活化的离去基。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与一端具有乙炔的连接剂发生反应，使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且乙炔部分位于聚合物的末端。所属领域的技术人员充分确定卤素部分、经活化的离去基、亲核和亲电子部分在有机合成情形中的使用以及PEG衍生物的制备和使用。
本发明也提供一种选择性修饰蛋白质以将其它物质添加到经修饰蛋白质上的方法，所述其它物质包括(但不限于)水溶性聚合物，例如PEG和含有叠氮或乙炔部分的PEG衍生物。含叠氮基和含乙炔的PEG衍生物可用于改变表面和分子的性质(其中生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性较为重要)，并同时提供一种比所属领域中先前已知的选择性更强的使PEG衍生物与蛋白质连接的方法。
II.成纤维细胞生长因子
由于FGF对于促进多种细胞和组织类型的生长、增殖、存活和分化具有有效活性，其持续被用作多种不同适应症的治疗剂，所述适应症包括伤口愈合，例如肌肉骨骼病状，例如骨折、韧带和组织修复、腱炎、滑囊炎等；皮肤病状，例如烧伤、割伤、裂口、褥疮、溃疡愈合缓慢等；用于组织保护、修复，以及在心肌梗塞和局部缺血期间诱导血管生成；用于治疗神经病状，例如神经退化性疾病和中风；用于治疗眼部疾病，包括黄斑变性等。
迄今所鉴别的成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白属于调节多种细胞类型的生长和分化的信号转导分子家族。FGF蛋白对于人类生理学和病理学的重要性在一定程度上与其在胚胎形成、血管发育和生长以及骨骼生长中的关键作用有关。活体外实验已证实FGF在调节内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞以及心脏和骨骼肌细胞的细胞生长和分裂中的作用。FGF家族的其它成员和其生物作用是描述于Crossley等人,Development,121:439-451(1995)；Ohuchi等人,Development,124:2235-2244(1997)；Gemel等人,Genomics,35:253-257(1996)；以及Ghosh等人,Cell Growth and Differentiation,7:1425-1434(1996)中。
FGF蛋白也因在癌细胞生长中的作用而对人类健康和疾病至关重要。举例来说，FGF-8经鉴别为乳癌和前列腺癌细胞中由雄激素诱发的生长因子(Tanaka等人,FEBSLett.363:226-230(1995)和P.N.A.S.89:8928-8932(1992))。
通过研究FGF受体而在一定程度上阐明FGF在正常发育中的作用。Wilke,T.等人,Dev.Dynam.210:41-52(1997)发现FGFR1、FGFR2和FGFR3转录物在鸡的胚胎发育期间定位于头部特定区域中。在柯鲁松氏综合症(Crouzon syndrome)(一种异常膜内骨形成病状)中，表达模式与受人类FGFR突变影响的区域有关。Belluardo,N.等人,Jour.Comp.Neur.379:226-246(1997)研究FGFR 1、2和3mRNA在大鼠脑中的定位，并且发现多个脑区域中的细胞特异性。此外，在脑病变后FGFR1和FGFR2mRNA在星形胶质反应性细胞中表达，从而支持特定FGF在脑疾病和损失中的作用。Ozawa,K.等人,Mol.BrainRes.41:279-288(1996)报导出生后FGF1及FGF-5表达有所增加，而FGF3、FGF-6、FGF-7和FGF-8基因显示在胚胎晚期的表达比出生后阶段高。辅因子Klotho beta(Klb)也可能与FGF-21和其受体的信号转导有关。已报导Klb增加FGFR1和FGFR4与FGF21结合的能力。Klb为单向跨膜蛋白，并且虽然还不知道完全跨膜形式的作用，但关于FGF23已显示，Klotho能增强FGF23结合并增加FGF受体的磷酸化，而Klotho beta已显示增强FGF-21结合(H.Kurosu,Y.Ogawa,M.Miyoshi,M.Yamamoto,A.Nandi,K.P.Rosenblatt,M.G.Baum,S.Schiavi,M.-C.Hu,O.W.Moe,M.Kuro-o,Regulation offibroblast growth factor-23signaling by Klotho.J.Biol.Chem.281,6120-6123(2006)，其以引用的方式并入本文中)。
Katoh等人(International Journal of Oncology(2006)29:163-168)描述FGF家族和家族成员的系统发育学分析。Katoh等人也论述胃肠道中的信号转导路径网络。
Plotnikov等人(Cell(1999)98:641-650)描述具有FGF受体1(FGFR1)的FGF2的晶体结构以及由两个此类复合物形成的两倍对称二聚物。Plotnikov等人提供受体二聚以及由FGF和肝素诱发二聚的模型。
未来可能发现FGF家族的其它成员。可通过预测蛋白质序列的计算机辅助的二级和三级结构分析并且通过设计用于鉴别与特定标靶结合的分子的选择技术来鉴别FGF家族的新成员。
因此，FGF家族的描述仅是出于说明性目的并且以举例的方式提供，且并不限制本文中所述的方法、组合物、策略和技术的范围。此外，本申请案中提及FGF-21是打算将此通称用作FGF家族的任何成员的实例。因此，应了解本文中关于FGF-21多肽或蛋白质所述的修饰和化学反应可同样适用于FGF家族的任何成员，包括本文中特定列出的成员。
III.本发明中使用的一般重组核酸方法
在本发明的众多实施例中，将使用重组方法分离、克隆并通常改变编码所关注的FGF-21多肽的核酸。所述实施例是用于(包括但不限于)蛋白质表达或用于源自FGF-21多肽的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的产生期间。在一些实施例中，编码本发明多肽的序列是可操作地连接到异源启动子上。
可以母体多肽的氨基酸序列(包括(但不限于)具有SEQ ID NO:1-7中所示的氨基酸序列)为基础来合成编码包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽的核苷酸序列，并且随后改变所述核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺失或取代)。可根据常规方法通过定点诱变来方便地修饰核苷酸序列。或者，可由化学合成来制备核苷酸序列，包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成器并且优先选择将产生重组多肽的宿主细胞中所偏好的密码子来制备核苷酸序列，其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列进行设计。举例来说，可通过PCR、连接或连接链式反应来合成并组装编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如，参看Barany等人,Proc.Natl.Acad.Sci.88:189-193(1991)；美国专利6,521,427，其是以引用的方式并入本文中。
本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示本发明中使用的一般方法的基础文章包括Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版,2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编,1994)。
描述分子生物技术的一般文章包括Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,第152卷,Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger)；Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版),第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989("Sambrook")以及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人编,Current Protocols,GreenePublishing Associates,Inc.与John Wiley&Sons,Inc.的合资企业,(1999年全年增补)("Ausubel")。这些文章描述诱变、载体和启动子的使用以及许多其它相关主题，所述相关主题涉及(包括但不限于)包括用于制备包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶以及其对的蛋白质的选择密码子的基因或多核苷酸的产生。
本发明出于多种目的使用各种类型的诱变，所述目的包括(但不限于)产生新颖合成酶或tRNA、使tRNA分子突变、使编码合成酶的多核苷酸突变、产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、在所关注的蛋白质或多肽中插入编码非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用带缺口的双螺旋DNA的诱变等、PCT介导的诱变，或其任何组合。其它合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主菌株的诱变、限制选择和限制纯化、缺失诱变、通过总基因合成进行的诱变、双链断裂修复等。(包括但不限于)涉及嵌合构筑体的诱变也包括在本发明中。在一个实施例中，可由天然存在分子或已改变或突变的天然存在分子的已知信息(包括(但不限于)序列、序列比较、物理性质、二级、三级或四级结构、晶体结构等)来指导诱变。
本文中可见的文章和实例描述这些程序。其它信息可见于以下公开案和其中引用的参考文献中：Ling等人,Approaches to DNA mutagenesis:an overview,Anal Biochem.254(2):157-178(1997)；Dale等人,Oligonucleotide-directed random mutagenesis using thephosphorothioate method,Methods Mol.Biol.57:369-374(1996)；Smith,In vitromutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985)；Botstein和Shortle,Strategies andapplications of in vitro mutagenesis,Science229:1193-1201(1985)；Carter,Site-directedmutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986)；Kunkel,The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis,Nucleic Acids&Molecular Biology(Eckstein,F.和Lilley,D.M.J编,SpringerVerlag,Berlin)(1987)；Kunkel,Rapid and efficient site-specific mutagenesis-withoutphenotypic selection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985)；Kunkel等人,Rapid andefficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Methods in Enzymol.154,367-382(1987)；Bass等人,Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities,Science242:240-245(1988)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis usingM13-derived vectors:an efficient and general procedure for the production of pointmutations in any DNA fragment,Nucleic Acids Res.10:6487-6500(1982)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors,Methods in Enzymol.100:468-500(1983)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis:asimple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template,Methods in Enzymol.154:329-350(1987)；Taylor等人,The use ofphosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA,Nucl. Acids Res.13:8749-8764(1985)；Taylor等人,The rapid generation ofoligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA,Nucl.Acids Res.13:8765-8785(1985)；Nakamaye和Eckstein,Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.14:9679-9698(1986)；Sayers等人,5'-3'Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl. Acids Res.16:791-802(1988)；Sayers等人,Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presenceofethidium bromide,(1988)Nucl.Acids Res.16:803-814；Kramer等人,The gapped duplexDNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction,Nucl.Acids Res.12:9441-9456(1984)；Kramer和Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154:350-367(1987)；Kramer等人,Improvedenzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations,Nucl.Acids Res.16:7207(1988)；Fritz等人,Oligonucleotide-directed construction of mutations:a gapped duplex DNA procedure withoutenzymatic reactions in vitro,Nucl.Acids Res.16:6987-6999(1988)；Kramer等人,Differentbase/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNAmismatch-repair system of E.coli,Cell38:879-887(1984)；Carter等人,Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3vectors,Nucl.Acids Res.13:4431-4443(1985)；Carter,Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3vectors,Methods in Enzymol.154:382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff,Use of oligonucleotides togenerate large deletions,Nucl.Acids Res.14:5115(1986)；Wells等人,Importance ofhydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin,Phil.Trans.R.Soc. Lond.A317:415-423(1986)；Nambiar等人,Total synthesis and cloning of a gene codingfor the ribonuclease S protein,Science223:1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana,Totalsynthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein(transducin),Nucl.Acids Res.14:6361-6372(1988)；Wells等人,Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations at definedsites,Gene34:315-323(1985)；Grundstrom等人,Oligonucleotide-directed mutagenesis bymicroscale'shot-gun'gene synthesis,Nucl.Acids Res.13:3305-3316(1985)；Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli:amethod for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986)；Arnold,Protein engineering for unusual environments,Current Opinion in Biotechnology4:450-455(1993)；Sieber等人,Nature Biotechnology,19:456-460(2001)；W.P.C.Stemmer,Nature370,389-91(1994)；以及I.A.Lorimer,I.Pastan,Nucleic Acids Res.23,3067-8(1995)。关于众多上述方法的其它细节可见于Methods in Enzymology第154卷中，所述文献也描述对于各种诱变方法带来的故障检修问题的有效控制。
通常根据由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862,(1981)所描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用如Needham-VanDevanter等人,Nucleic acids Res.,12:6159-6168(1984)中所述的自动合成器以化学方式合成例如用于本发明的诱变(例如，使合成酶文库突变或改变tRNA)中的寡核苷酸。
本发明也涉及通过正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。用本发明的多核苷酸或包括本发明多核苷酸的构筑体(包括(但不限于)本发明的载体，其可为例如克隆载体或表达载体)以遗传学方式工程改造(包括(但不限于)转化、转导或转染)宿主细胞。举例来说，正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生的蛋白质的编码区可操作地连接到在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件上。载体可为例如质粒、粘粒(cosmid)、噬菌体、细菌、病毒、裸多核苷酸或接合多核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(Fromm等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上由具有核酸的小粒子高速弹道渗透(Klein等人,Nature327,70-73(1987))等。
可在经改良适于例如筛选步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养工程改造过的宿主细胞。这些细胞可视情况经培养并进入转基因生物体中。(包括但不限于)关于细胞分离和培养(例如，关于后续核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第3版,Wiley-Liss,New York以及其中引用的参考文献；Payne等人,(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley&Sons,Inc.New York,NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FL。
可使用将标靶核酸引入细胞中的数种熟知的方法，其中任一种方法都可用于本发明中。这些方法包括：受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法(projectile bombardment)以及经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期并且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参看Sambrook)。另外，可购得试剂盒以从细菌中纯化质粒(例如参看来自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；来自Stratagene的StrataCleanTM；以及来自Qiagen的QIAprepTM)。随后，进一步操纵分离并纯化过的质粒以产生其它质粒，使用所述质粒来转染细胞或将其并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调节特定标靶核酸的表达的启动子。载体视情况包含通用表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许所述表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体)以及用于原核系统与真核系统的选择标记。载体适于在原核细胞、真核细胞或两者中复制和整合。参看Giliman和Smith,Gene8:81(1979)；Roberts等人,Nature.328:731(1987)；Schneider,B.等人,Protein Expr.Purif.6435:10(1995)；Ausubel,Sambrook,Berger(都同上文)。适用于克隆的细菌和噬菌体的目录由(例如)ATCC提供，例如，由ATCC出版的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992),Gherna等人(编)。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑因素也可见于Watson等人(1992)Recombinant DNA第2版ScientificAmerican Books,NY中。另外，基本上任何核酸(以及实际上任何经标记核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源例如Midland Certified Reagent Company(Midland,TX，可通过万维网在mcrc.com上获得)、The Great American Gene Company(Ramona,CA，可通过万维网在genco.com上获得)、ExpressGen Inc.(Chicago,IL，可通过万维网在expressgen.com上获得)、OperonTechnologies Inc.(Alameda,CA)以及许多其它来源。
选择密码子
本发明的选择密码子扩展蛋白质生物合成机制的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特三碱基密码子、无义密码子(例如终止密码子，包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。所属领域的技术人员显而易见，可引入所需基因或多核苷酸中的选择密码子的数目范围很广，其包括(但不限于)在编码FGF-21多肽的至少一部分的单一多核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上选择密码子。
在一个实施例中，所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子以在活体内并入一个或一个以上非天然氨基酸。举例来说，产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA，并且通过O-RS利用所需非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化。此O-tRNA无法由天然存在宿主的氨酰基-tRNA合成酶识别。可使用常规定点诱变在所关注多肽中的所关注位点处引入终止密码子(包括(但不限于)TAG)。例如，参看Sayers,J.R.等人,(1988),5'-3'Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res,16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注多肽的核酸在活体内组合时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。
活体内并入非天然氨基酸可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下进行。举例来说，因为对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制因子tRNA)与真核释放因子(包含但不限于eRF)(其与终止密码子结合并起始核糖体释放正在生长的肽)之间的竞争，所以可通过(包括但不限于)增加O-tRNA和/或抑制因子tRNA的表达水平来调节抑制效率。
也可利用稀有密码子来编码非天然氨基酸。举例来说，当活体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度降低时，已证明稀有精氨酸密码子AGG有效用于通过经丙氨酸酰化的合成tRNA插入Ala。例如，参看Ma等人,Biochemistry,32:7939(1993)。在这种情况下，合成tRNA与在大肠杆菌中作为次要物质存在的天然存在tRNA Arg竞争。一些生物体不使用所有三联体密码子。已利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密码子AGA在活体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。例如，参看Kowal和Oliver,Nucl.Acid. Res.,25:4685(1997)。可产生本发明的组分以在活体内使用这些稀有密码子。
选择密码子也包含延长密码子，其包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子，例如四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的特征包括使用基于移码抑制(frameshift suppression)的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将(包括但不限于)一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在存在具有反密码子环(例如，具有至少8-10nt的反密码子环)的突变O-tRNA(包括(但不限于)特定移码抑制因子tRNA)的情况下，将四个或四个以上碱基的密码子读作单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码(包括但不限于)至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基的密码子。因为存在256种可能的四碱基密码子，所以可使用四个或四个以上碱基的密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参看Anderson等人,(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9:237-244；Magliery,(2001)Expanding the Genetic Code:Selectionof Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of"Shifty"Four-baseCodons with a Library Approach in Escherichia coli,J.Mol.Biol.307:755-769。
举例来说，使用活体外生物合成方法，已经用四碱基密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如，参看Ma等人,(1993)Biochemistry,32:7939；以及Hohsaka等人,(1999)J. Am.Chem.Soc.121:34。使用CGGG和AGGU，从而在活体外利用两个化学酰化的移码抑制因子tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生蛋白链菌素中。例如，参看Hohsaka等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:12194。在活体内研究中，Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％到26％的效率解码，其中在0或-1框架中极少解码。参看Moore等人,(2000)J.Mol.Biol.,298:195。在一个实施例中，可在本发明中使用基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子，其可减少在其它不合需要的位点处的错义通读和移码抑制。
对于给定系统来说，选择密码子也可包括一个天然三碱基密码子，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现有遗传代码。一个额外的碱基对使三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包括稳定且具有选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真性有效地酶促并入DNA中以及在合成新的非天然碱基对之后有效的持续引物延伸。可适于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括(例如)Hirao等人,(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acidanalogues into protein,Nature Biotechnology,20:177-182。也参看Wu,Y.等人,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相关公开案列于下文中。
对于活体内使用来说，非天然核苷是膜可渗透的并且经磷酸化以形成相应的三磷酸盐。另外，增加的遗传信息稳定并且不受细胞酶破坏。Benner等人先前的工作利用与规范Watson-Crick配对不同的氢键合模式，其中最值得注意的实例为iso-C:iso-G配对。例如，参看Switzer等人,(1989)J.Am.Chem.Soc111:8322；以及Piccirilli等人,(1990)Nature,343:33；Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水性堆积相互作用可代替氢键合来驱动碱基对的形成。参看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602；以及Guckian和Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身配对比天然碱基对稳定，并可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment，KF)有效地并入DNA中。例如，参看McMinn等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11585-6；以及Ogawa等人,(2000)J.Am. Chem.Soc,122:3274。可通过KF以足以用于生物功能的效率和选择性合成3MN:3MN自身配对。例如，参看Ogawa等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:8803。然而，这两种碱基都充当用于进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身配对。另外，也可复制7AI自身配对。例如，参看Tae等人,(2001)J.Am.Chem. Soc,123:7439。也已开发新颖金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)后形成稳定配对。参看Meggers等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用这一性质来产生正交tRNA以供其使用。
也可使用翻译旁路系统(translational bypassing system)将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并未将其翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跳过所述序列并在插入下游重新开始翻译的提示的结构。
在某些实施例中，在本发明的方法和/或组合物中的所关注的蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。
可使用所属领域的技术人员已知并且在本文中描述的方法来诱变所关注的蛋白质或多肽的编码基因，从而使其包括(例如)一个或一个以上选择密码子以并入非天然氨基酸。举例来说，诱变所关注蛋白质的核酸以使其包括一个或一个以上选择密码子，从而提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本发明包括(例如)包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白的任何这种变异体(包括但不限于突变体)形式。类似地，本发明也包括相应核酸，即，具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。
可容易地使编码所关注蛋白质(例如FGF-21多肽)的核酸分子突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注蛋白质上。所属领域的技术人员已知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法，例如美国专利第6,608,183号(其是以引用的方式并入本文中)中所述的方法，以及标准诱变技术。
IV.非天然编码氨基酸
多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。可将任何数目的非天然编码氨基酸引入FGF-21多肽中。一般来说，引入的非天然编码氨基酸实质上对20种常见的遗传编码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)呈化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与20种常见氨基酸中不存在的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮基、醛基以及氨氧基)有效并选择性地反应形成稳定接合物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽可与聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇)或者含有炔部分的第二多肽反应，以形成由于叠氮基与炔官能团选择性反应形成休斯根[3+2]环加成产物而引起的稳定接合物。
α-氨基酸的一般结构说明如下(式I)：
非天然编码氨基酸通常为具有以上所列结构式(其中R基团为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)的任何结构，并且可适用于本发明中。因为本发明的非天然编码氨基酸通常仅关于侧链结构与天然氨基酸存在不同，所以非天然编码氨基酸以与天然存在多肽中形成酰胺键相同的方式与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码氨基酸)形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有使其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说，R视情况包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。所关注的可适用于本发明中的其它非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、结合金属的氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或可光致异构化的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(例如糖取代丝氨酸)、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)约5个以上或约10个以上碳)的氨基酸、含碳连接的糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。
可适用于本发明中并且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物以及炔反应性基团的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例也包括氨基酸与糖之间的天然存在N-或O-键联是由自然界中通常不存在的共价键(包括(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。这些氨基酸的实例也包括天然存在蛋白质中通常不存在的糖，例如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
本文中提供的多种非天然编码氨基酸可购自(例如)Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的分公司,Darmstadt,Germany)或Peptech(Burlington,MA,USA)。不可购得的非天然编码氨基酸是视情况如本文中所提供而合成，或使用所属领域的技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon,Organic Chemistry,(1982,第2版,Willard Grant Press,BostonMass.)；March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York)；以及Carey和Sundberg,Advanced Organic Chemistry(第3版,A和B部分,1990,PlenumPress,New York)。也参看美国专利第7,045,337号和第7,083,970号，其是以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可适用于本发明中的非天然氨基酸也视情况包含经修饰的主链结构，包括(但不限于)如式II和III的结构所说明的结构：
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R'；X和Y可相同或不同，通常包含S或O；并且R和R'视情况相同或不同，通常选自上文对于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的组成部分的相同清单以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸视情况包含如式II和III所说明的氨基或羧基中的取代。这种类型的非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸盐，包括(但不限于)具有对应于20种常见天然氨基酸的侧链或非天然侧链的非天然氨基酸。另外，在α-碳上的取代视情况包括(但不限于)L、D或α-α-二取代氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，例如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；β和γ氨基酸，例如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
多种非天然氨基酸是基于例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸并且适用于本发明中。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸以及间位取代的酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含(包括但不限于)酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等。另外，也涵盖多取代芳环。可适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ-取代衍生物、环状衍生物以及酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明中的例示性苯丙氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含(包括但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘基、溴基、酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明中的非天然氨基酸的特定实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸以及对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。可适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构的实例是提供于(例如)标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO2002/085923中。关于其它蛋氨酸类似物，也参看Kiick等人,(2002)Incorporation of azidesinto recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS99:19-24，其是以引用的方式并入本文中。标题为“Compositions Containing,MethodsInvolving,and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides”的国际申请案第PCT/US06/47822号(其以引用的方式并入本文中)描述芳香族胺部分(包括(但不限于)对氨基苯丙氨酸)的还原性烷基化，和还原性胺化。
在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(例如对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的FGF-21多肽的组合物。也提供包含对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和(包括但不限于)蛋白质和/或细胞的各种组合物。一方面，包括对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结(包括(但不限于)共价键结)，其包括(但不限于)通过氨酰基键与正交tRNA共价键结、与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共价键结等。
可借助于非天然氨基酸并入蛋白质中的化学部分提供蛋白质的多种优点和操纵性。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许利用多种含肼或含羟胺试剂中的任一者在活体外以及活体内选择性修饰蛋白质。例如，重原子非天然氨基酸可适用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸进行重原子的位点特异性引入还为选择重原子的位置提供选择性和灵活性。举例来说，光反应性非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于叠氮基苯)侧链的氨基酸)允许蛋白质的活体内和活体外有效光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸以及对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后，可通过激发光反应性基团(提供时间控制)使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，(包括但不限于)在使用核磁共振以及振动光谱的情况下，可由作为局部结构和动力学的探针的经同位素标记的(包括但不限于)甲基取代非天然氨基酸的甲基。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许利用分子通过[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白质。
并入多肽的氨基末端的非天然氨基酸可由R基团(其为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)和不同于α-氨基酸(参看式I)中通常存在的NH2基团的第二反应性基团构成。类似的非天然氨基酸可在羧基末端并入不同于α-氨基酸(参见式I)中通常存在的COOH基团的第二反应性基团。
可选择或设计本发明的非天然氨基酸以提供20种天然氨基酸中不可获得的其它特性。举例来说，可视情况设计或选择非天然氨基酸以改良(例如)并有所述非天然氨基酸的蛋白质的生物性质。举例来说，可视情况通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改良以下性质：毒性、生物分布(biodistribution)、溶解性、稳定性(例如，热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、酶促降解抗性等)、纯化和加工便利性、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其它分子(例如)共价或非共价反应的能力等。
非天然氨基酸的结构与合成：羰基、羰基样基团、经掩蔽羰基、经保护羰基和羟胺 基
在一些实施例中，本发明提供通过肟键与例如PEG等水溶性聚合物连接的FGF-21。
多种类型的非天然编码氨基酸适用于形成肟键。这些氨基酸包括(但不限于)含有羰基、二羰基或羟胺基的非天然编码氨基酸。此类氨基酸是描述于美国专利公开案第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号以及标题为“Compositionscontaining,methods involving,and uses of non-natural amino acids and polypeptides”的WO2006/069246中，所述文献是以全文引用的方式并入本文中。非天然编码氨基酸也描述于美国专利第7,083,970号和美国专利第7,045,337号中，所述文献是以全文引用的方式并入本文中。
本发明的一些实施例利用在一个或一个以上位置处经对乙酰基苯丙氨酸氨基酸取代的FGF-21多肽。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人,Biochemistry42:6735-6746(2003)中，所述文献是以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员可类似地制备其它含羰基或含二羰基的氨基酸。此外，本文中所包括的非天然氨基酸的非限制性例示性合成呈现于美国专利第7,083,970号的图4、24-34和36-39中，所述专利是以全文引用的方式并入本文中。
具有亲电子反应性基团的氨基酸允许多种通过亲核加成反应连接分子的反应。所述亲电子反应性基团包括羰基(包括酮基和二羰基)、羰基样基团(其具有类似于羰基(包括酮基和二羰基)的反应性并且在结构上与羰基类似)、经掩蔽羰基(其可容易地转化为羰基(包括酮基和二羰基))，或经保护羰基(其在脱保护后具有与羰基(包括酮基和二羰基)类似的反应性)。所述氨基酸包括具有式(IV)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R″基团时，两个R"视情况形成杂环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基；
条件是当A为亚苯基并且R3各自为H时，B存在；并且当A为-(CH2)4-并且R3各自为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；并且当A与B都不存在并且R3各自为H时，R不为甲基。
另外，包括具有式(V)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
条件是当A为亚苯基时，B存在；并且当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；并且当A与B都不存在时，R不为甲基。
另外，包括具有式(VI)的结构的氨基酸：
其中：
B是选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括以下氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、羧基经保护，或为其盐。另外，以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(VII)的结构的氨基酸：
其中：
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；并且n为0到8；
条件是当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-。
另外，包括以下氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护，或为其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(VIII)的结构的氨基酸：
其中A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括以下具有式(IX)的结构的氨基酸：
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括以下氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护，或为其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(X)的结构的氨基酸：
其中B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；并且n为0到8。
另外，包括以下氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护，或为其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
除单羰基结构之外，本文中所述的非天然氨基酸也可包括例如二羰基、二羰基样基团、经掩蔽二羰基和经保护二羰基等基团。
举例来说，包括以下具有式(XI)的结构的氨基酸：
其中A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括以下具有式(XII)的结构的氨基酸：
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
其中Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括以下氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护，或为其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(XIII)的结构的氨基酸：
其中B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(O)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N＝、-C(R')＝N-、-C(R')＝N-N(R')-、-C(R')＝N-N＝、-C(R')2-N＝N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基；并且n为0到8。
另外，包括以下氨基酸：
其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护，或为其盐。另外，这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外，包括以下具有式(XIV)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1为C、S或S(O)；并且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XIV-A)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XIV-B)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XV)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1为C、S或S(O)；并且n为0、1、2、3、4或5；并且各CR8R9基团上的R8和R9是各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可合起来形成＝O或环烷基，或任何两个相邻R8基团可合起来形成环烷基。
另外，包括以下具有式(XV-A)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；并且各CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可合起来形成＝O或环烷基，或任何两个相邻R8基团可合起来形成环烷基。
另外，包括以下具有式(XV-B)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；并且各CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可合起来形成＝O或环烷基，或任何两个相邻R8基团可合起来形成环烷基。
另外，包括以下具有式(XVI)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
X1为C、S或S(O)；并且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XVI-A)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XVI-B)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括具有式(XVII)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M为 其中(a)表示与A基团键结，并且(b)表示与各自的羰基键结，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为键、C(R)(R)、O或S，并且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外，包括具有式(XVIII)的结构的氨基酸：
其中：
M为-C(R3)-、 其中(a)表示与A基团键结，并且(b)表示与各自的羰基键结，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为键、C(R)(R)、O或S，并且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(O)kR'(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中R'各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外，包括具有式(XIX)的结构的氨基酸：
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；并且
T3为O或S。
另外，包括具有式(XX)的结构的氨基酸：
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包括以下具有式(XXI)的结构的氨基酸：
在一些实施例中，以化学方式修饰包含非天然氨基酸的多肽以产生反应性羰基或二羰基官能团。举例来说，可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于接合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时，例如可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(其可正常存在，或可通过化学或酶促消化而暴露)在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如，参看Gaertner等人,Bioconjug.Chem.3:262-268(1992)；Geoghegan,K.和Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Gaertner等人,J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，所属领域中已知的方法局限于肽或蛋白质的N末端氨基酸。
在本发明中，带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为“经掩蔽”的醛官能团并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸带有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其它位点处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗环境中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号。
羰基或二羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含羟胺的试剂选择性反应，从而形成在生理条件下稳定的相应肟键联。例如，参看Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基或二羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如，参看Cornish,V.W.等人,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.等人,Science 276:1125-1128(1997)。
非天然氨基酸的结构与合成：含羟胺的氨基酸
美国临时专利申请案第60/638,418号是以全文引用的方式并入本文中。因此，美国临时专利申请案第60/638,418号中的第V章(标题为“Non-natural Amino Acids”B部分(标题为“Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids:Hydroxylamine-Containing Amino Acids”)中所提供的揭示内容完全适用于制备、纯化、表征和使用本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物(包括式I-XXXV)、技术和策略，其应用程度就如同所述揭示内容完全呈现于本文中。美国专利公开案第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号以及标题为“Compositions containing,methods involving,and uses ofnon-natural amino acid s and polypeptides”的WO 2006/069246也是以全文引用的方式并入本文中。
非天然氨基酸的化学合成
适用于本发明中的多种非天然氨基酸可购自例如Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,WI,USA)。无法购得的非天然氨基酸是视情况如本文中所提供或如各种公开案中所提供而合成，或使用所属领域的技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon,Organic Chemistry,(1982,第2版,Willard Grant Press,BostonMass.)；March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York)；以及Carey和Sundberg,Advanced Organic Chemistry(第3版,A和B部分,1990,PlenumPress,New York)。描述非天然氨基酸合成的其它公开案包括(例如)标题为“In vivoincorporation of Unnatural Amino Acids”的WO 2002/085923；Matsoukas等人,(1995)J. Med.Chem.,38,4660-4669；King,F.E.和Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis ofGlutamine and ofγ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates,J.Chem. Soc,3315-3319；Friedman,O.M.和Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives ofGlutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig,J.C.等人,(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay,M.,Vilmont,M.和Frappier,F.(1991)Glutamine analogues asPotential Antimalarials,.Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen,A.M.P.和Rapoport,H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino AcidAnalogues.J.Org.Chem.54,1859-1866；Christie,B.D.和Rapoport,H.(1985)Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org. Chem.50:1239-1246；Barton等人,(1987)Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids andDerivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-and D-alpha-Amino-Adipic Acids,L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron43:4297-4308；以及Subasinghe等人,(1992)Quisqualic acid analogues:synthesis ofbeta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novelquisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35:4602-7。也参看标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第US 2004/0198637号，其是以引用的方式并入本文中。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸允许多种通过亲核加成或醇醛缩合反应连接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)的反应。
例示性含羰基的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；并且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基并且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基并且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的间位。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人,Biochemistry42:6735-6746(2003)中，其是以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员可类似地制备其它含羰基的氨基酸。
在一些实施例中，以化学方式修饰包含非天然编码氨基酸的多肽以产生反应性羰基官能团。举例来说，可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于接合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时，例如可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(其可正常存在，或可通过化学或酶促消化而暴露)在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如，参看Gaertner等人,Bioconjug.Chem.3:262-268(1992)；Geoghegan,K.和Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Gaertner等人,J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，所属领域中已知的方法局限于肽或蛋白质的N末端氨基酸。
在本发明中，带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为“经掩蔽”的醛官能团并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸带有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其它位点处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗环境中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号，其是以引用的方式并入本文中。
羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性反应，以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲(semicarbazone)键联。例如，参看Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959)；Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如，参看Cornish,V.W.等人,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996)；Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992)；Mahal,L.K.等人,Science 276:1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团(例如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。
例示性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N或S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中，n为4，R1不存在并且X为N。在一些实施例中，n为2，R1不存在并且X不存在。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，并且氧原子位于芳环上脂肪族基团的对位。
含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸可获自商业来源。举例来说，L-谷氨酸-γ-酰肼可获自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。无法购得的其它氨基酸可由所属领域的技术人员制备。例如参看美国专利第6,281,211号，其是以引用的方式并入本文中。
含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与多种含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的分子有效并选择性地反应。例如，参看Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基以及N末端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团的反应性显著更强。
C.含氨氧基的氨基酸
含有氨氧基(也被称作羟胺)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。如同肼、酰肼以及氨基脲一样，氨氧基的增强的亲核性使其与多种含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的分子有效并选择性地反应。例如，参看Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34:727-736(2001)。尽管与肼基团反应的结果为相应腙，但氨氧基与含羰基的基团(例如酮)的反应通常产生肟。
例示性含氨氧基的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；Y＝C(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1，并且Y存在。在一些实施例中，n为2，R1和X不存在，m为0，并且Y不存在。
含氨氧基的氨基酸可由可易于获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸以及苏氨酸)制备。例如，参看M.Carrasco和R.Brown,J.Org.Chem.68:8853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸(例如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸)已从天然来源分离(Rosenthal,G.,LifeSci.60:1635-1641(1997))。其它含氨氧基的氨基酸可由所属领域的技术人员来制备。
D.叠氮化物和炔反应性基团
叠氮化物和炔官能团的独特反应性使其极适用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物(尤其是脂肪族叠氮化物)以及炔通常对常见的反应性化学条件稳定。具体来说，叠氮化物与炔官能团都对天然存在多肽中可见的20种常见氨基酸的侧链(即，R基团)呈惰性。然而，当叠氮化物和炔基团靠近时，其“弹簧加压(spring-loaded)”性质显露，并且其通过休斯根[3+2]环加成反应选择性并有效地反应产生相应三唑。例如，参看Chin J.等人,Science301:964-7(2003)；Wang,Q.等人,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。
因为休斯根环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参看Padwa,A.,COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS,第4卷,(Trost,B.M.编,1991),第1069-1109页；Huisgen,R.,1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY,(Padwa,A.编,1984),第1-176页)而非亲核取代，所以并入带有含叠氮基和含炔的侧链的非天然编码氨基酸使得所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。涉及含叠氮基或含炔的FGF-21多肽的环加成反应可在室温下在水性条件下通过在催化量的用于将Cu(II)原位还原为Cu(I)的还原剂存在下添加Cu(II)(包括(但不限于)呈催化量的CuSO4的形式)来进行。例如，参看Wang,Q.等人,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003)；Tornoe,C.W.等人,J.Org.Chem.67:3057-3064(2002)；Rostovtsev等人,Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。例示性还原剂包括(包括但不限于)抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+以及外加电位。
在一些需要叠氮化物与炔之间的休斯根[3+2]环加成反应的情况下，FGF-21多肽包含包括炔部分的非天然编码氨基酸并且欲与氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，也可进行逆向反应(即，在氨基酸上具有叠氮部分并且在水溶性聚合物上存在炔部分)。
叠氮官能团也可与含有芳基酯并且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性地反应以产生酰胺键联。芳基膦基团原位还原叠氮基，并且所得胺随后与最接近的酯键有效反应以产生相应酰胺。例如参看E.Saxon和C.Bertozzi,Science287,2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可为烷基叠氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示：
其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物并且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN以及-NO2。R'、R"、R'"和R""各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团是独立地经选择，而当存在R'、R″、R″'和R″″基团中的一者以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
叠氮官能团也可与含有硫酯并且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性地反应以产生酰胺键联。芳基膦基团原位还原叠氮基，并且所得胺随后与硫酯键有效反应以产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示：
其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。
例示性含炔的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10，R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0并且乙炔部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为1并且炔丙基氧基位于相对于烷基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为1，R1和X不存在且m为0(即，炔丙基甘氨酸)。
含炔的氨基酸在市面上有售。举例来说，炔丙基甘氨酸可购自Peptech(Burlington,MA)。或者，可根据标准方法来制备含炔的氨基酸。举例来说，例如可如Deiters,A.等人,J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783(2003)中所述来合成对炔丙基氧基苯丙氨酸，并且可如Kayser,B.等人,Tetrahedron53(7):2475-2484(1997)中所述来合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域的技术人员可制备其它含炔的氨基酸。
例示性含叠氮基的氨基酸可如下表示：
其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X不存在，m为0并且叠氮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4并且R1和X不存在，并且m＝0。在一些实施例中，n为1，R1为苯基，X为O，m为2并且β叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位。
含叠氮基的氨基酸可获自商业来源。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可获自Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)。对于无法购得的含叠氮基的氨基酸，可相对容易地使用所属领域的技术人员已知的标准方法来制备叠氮基，所述方法包括(但不限于)通过置换合适的离去基(包括(但不限于)卤离子、甲磺酸根、甲苯磺酸根)或通过打开经适当保护的内酯。例如参看March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York)。
E.氨基硫醇反应性基团
β取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其极其适用于通过形成噻唑烷来选择性修饰含有醛基的多肽和其它生物分子。例如参看J.Shao和J.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中，β取代的氨基硫醇氨基酸可并入FGF-21多肽中并且随后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物接合物或其它有效负载可通过形成噻唑烷而与包含β取代的氨基硫醇氨基酸的FGF-21多肽偶合。
F.其它反应性基团
以下专利申请案中描述可并入本发明的FGF-21多肽中的其它反应性基团和非天然编码氨基酸，所述专利申请案都是以全文引用的方式并入本文中：美国专利公开案第2006/0194256号；美国专利公开案第2006/0217532号；美国专利公开案第2006/0217289号；美国临时专利第60/755,338号；美国临时专利第60/755,711号；美国临时专利第60/755,018号；国际专利申请案第PCT/US06/49397号；WO 2006/069246；美国临时专利第60/743,041号；美国临时专利第60/743,040号；国际专利申请案第PCT/US06/47822号；美国临时专利第60/882,819号；美国临时专利第60/882,500号；和美国临时专利第60/870,594号。
非天然氨基酸的细胞摄取
细胞对非天然氨基酸的摄取为设计并选择(包括但不限于)用于并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度表明这些化合物不可能为细胞可渗透的。通过以蛋白质为基础的转运系统的集合将天然氨基酸吸收到真核细胞中。可进行快速筛选以分析哪些非天然氨基酸(如果存在)是由细胞吸收。例如，参看例如标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第US 2004/0198637号(其是以引用的方式并入本文中)以及Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Progress toward the evolutionof an organism with an expanded genetic code.PNAS United States96:4780-4785中的毒性检定。尽管通过各种检定可容易地分析摄取，但设计适用于细胞摄取途径的非天然氨基酸的替代方案为提供在活体内产生氨基酸的生物合成途径。
非天然氨基酸的生物合成
许多生物合成途径已存在于细胞中以用于产生氨基酸和其它化合物。自然界(包括(但不限于)细胞)中可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法，但本发明提供所述方法。举例来说，视情况通过添加新酶或改变现有宿主细胞途径而在宿主细胞中产生非天然氨基酸的生物合成途径。其它新酶视情况为天然存在的酶或人工开发的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如在标题为“In vivo incorporation of unnatural aminoacids”的WO 2002/085923中的实例中所呈现)依赖来自其它生物体的已知酶的组合的加入。可通过利用包含这些酶的基因的质粒转化细胞而将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时，所述基因提供合成所需化合物的酶促途径。视情况添加的酶类型的实例提供于下文实例中。其它酶序列可见于(例如)Genbank中。人工开发的酶也视情况以相同方式添加到细胞中。以此方式操纵细胞的细胞机构和资源以产生非天然氨基酸。
多种方法可用于产生用于生物合成途径中或用于发展现有途径的新颖酶。举例来说，视情况使用包括(但不限于)如Maxygen,Inc.(可通过万维网在maxygen.com上获得)所开发的递归重组来开发新颖酶和途径。例如，参看Stemmer(1994),Rapid evolutionof a protein in vitro by DNA shuffling,Nature370(4):389-391；以及Stemmer,(1994),DNAshuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecularevolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751。类似地，视情况将Genencor(可通过万维网在genencor.com上获得)所开发的DesignPathTM用于代谢途径工程改造，包括(但不限于)工程改造在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的途径。这项技术使用新基因(包括但不限于)经由功能基因组学以及分子进化和设计所鉴别的基因)的组合在宿主生物体中重建现有途径。Diversa公司(可通过万维网在diversa.com上获得)也提供快速筛选基因文库和基因途径的技术，从而包括(但不限于)建立新途径。
通常，由本发明的工程改造过的生物合成途径产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成(包括(但不限于)天然细胞量)，但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度产生。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在利用包含用于产生特定途径所需的酶的基因的质粒转化细胞并产生非天然氨基酸后，视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
可出于多种目的进行非天然氨基酸的并入，所述目的包括(但不限于)调整蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键合、疏水性、蛋白酶标靶位点的可接近性；靶向部分(包括(但不限于)，对于蛋白质阵列)；添加生物活性分子；连接聚合物；连接放射性核素；调节血清半衰期；调节组织渗透(例如肿瘤)；调节主动转运；调节组织、细胞或器官特异性或分布；调节免疫原性；调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有增强或甚至全新的催化或生物物合理质。举例来说，视情况通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改良以下性质：毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应的能力(包括(但不限于)共价或非共价)等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于(包括但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括但不限于抗体)以及(包括但不限于)蛋白质结构和功能的研究。例如参看Dougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure andFunction,Current Opinion in Chemical Biology,4:645-652。
在本发明的一方面，组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上)非天然氨基酸的蛋白质。非天然氨基酸可相同或不同，包括(但不限于)在蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同的非天然氨基酸。另一方面，组合物包括蛋白质中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的给定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于)所述蛋白质可包括两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同、不同或为相同种类的多个非天然氨基酸与至少一个不同的非天然氨基酸的组合。
所关注的具有至少一个非天然氨基酸的蛋白质或多肽为本发明的特征。本发明也包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)也可与蛋白质一起存在。
通过在真核细胞中利用至少一个非天然氨基酸来产生所关注蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常应包括真核生物翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括(包括但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键联修饰、糖基化等。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键联使寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)与天冬酰胺连接。参看表1，其列出真核生物蛋白的N-连接寡糖的一些实例(也可存在其它未绘示的残基)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键联或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。
表1：通过GlcNAc键联连接的寡糖的实例
另一方面，翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降血钙素前体、降血钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原(preproparathyroid hormone)、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工，组装成多亚单位蛋白或大分子组装物，翻译到细胞中的另一位点中(包括(但不限于)翻译到例如内质网、高尔基体(Golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等细胞器中，或通过分泌途径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。
非天然氨基酸的一个优点在于，其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核细胞或非真核细胞中活体内进行或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数反应涉及亲核与亲电子反应搭配物之间的共价键形成，包括(但不限于)α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下，选择性是由蛋白质中亲核残基的数目和可接近性决定。在本发明的蛋白质中，可在活体外以及活体内使用其它选择性更大的反应，例如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如，参看Cornish等人,(1996)J.Am.Chem.Soc,118:8150-8151；Mahal等人,(1997)Science,276:1125-1128；Wang等人,(2001)Science292:498-500；Chin等人,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027；Chin等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99:11020-11024；Wang等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61；Zhang等人,(2003)Biochemistry,42:6735-6746；以及Chin等人,(2003)Science,301:964-7，所述文献都是以引用的方式并入本文中。这允许用包括荧光团、交联剂、糖类衍生物以及细胞毒性分子的大量试剂选择性标记几乎任何蛋白质。也参看标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利第6,927,042号，其是以引用的方式并入本文中。包括(但不限于)通过叠氮基氨基酸进行的翻译后修饰也可通过施陶丁格连接反应(Staudinger ligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。例如参看Kiick等人,(2002)Incorporation of azides intorecombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS99:19-24。
本发明提供选择性修饰蛋白质的另一种极为有效的方法，其涉及回应选择密码子而将非天然氨基酸(包括(但不限于)含有叠氮基或炔基部分)遗传并入蛋白质中。然后，可通过包括(但不限于)休斯根[3+2]环加成反应(例如参见Padwa,A.,Comprehensive Organic Synthesis,第4卷,(1991)Trost,B.M.编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页；和Huisgen,R.,1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)Padwa,A.编,Wiley,New York,第1-176页)分别用包括(但不限于)炔基或叠氮衍生物来修饰这些氨基酸侧链。因为此方法涉及环加成而非亲核取代，所以可以极高选择性修饰蛋白质。可在室温下在水性条件下通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐而以极佳区域选择性(1,4>1,5)进行此反应。例如参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064；以及Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。可使用的另一方法为在双砷化合物上用四半胱氨酸基元进行配体交换，例如参看Griffin等人,(1998)Science281:269-272。
可通过[3+2]环加成而加成到本发明的蛋白质中的分子包括具有叠氮基或炔基衍生物的几乎任何分子。这些分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖类衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇的衍生物)、光交联剂、化学毒性化合物、亲和性标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、多核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。这些分子可分别加成到具有炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。
V.包含非遗传编码氨基酸的FGF-21多肽的活体内产生
可使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本发明的FGF-21多肽，以将其加成到天然存在的系统中无法编码的氨基酸中或取代所述氨基酸。
例如，使用天然存在的系统中无法编码的氨基酸来产生tRNA和tRNA合成酶的方法是描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，所述专利是以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于翻译系统的内源性合成酶和tRNA起作用(且因此有时被称作“正交”)的翻译机构。通常，翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)以及正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS在翻译系统中优先利用至少一种非天然存在氨基酸使O-tRNA氨酰化且O-tRNA识别至少一个不被系统中的其它tRNA识别的选择密码子。因此，翻译系统回应经编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入系统中所产生的蛋白质中，从而“取代”氨基酸使其进入编码多肽的某一位置中。
所属领域中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，并且其通常适用于本发明中。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶是描述于Wang,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:56-61(2003)以及Zhang,Z.等人,Biochem.42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由多核苷酸序列编码并且包括美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中所揭示的氨基酸序列，所述专利各以引用的方式并入本文中。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，所述专利是以引用的方式并入本文中。O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于WO 2005/007870、WO 2005/007624和WO2005/019415中。
叠氮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin,J.W.等人,J,Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利第7,083,970号(其以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO:46-48和61-64。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利第7,083,970号(其以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:1-3。对特定非天然编码氨基酸具特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利第7,045,337号(其以引用的方式并入本文中)中。在酿酒酵母中并入含酮基与含叠氮基的氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人,Science 301:964-967(2003)中。
已报导若干种其它正交对。已描述用于将非天然氨基酸潜在地并入大肠杆菌中的来源于酿酒酵母tRNA和合成酶的谷氨酰胺酰基(例如参看Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4780-4785)、天冬氨酰基(例如参看Pastrnak,M.等人,(2000)Helv.Chim.Acta83:2277-2286)和酪氨酰基(例如参看Ohno,S.等人,(1998)J. Biochem.(Tokyo,Jpn.)124:1065-1068；以及Kowal,A.K.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.98:2268-2273)系统。已描述用于酿酒酵母的来源于大肠杆菌谷氨酰胺酰基(例如参看Kowal,A.K.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)和酪氨酰基(例如参看Edwards,H.和Schimmel,P.(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶的系统。大肠杆菌酪氨酰基系统已用于在哺乳动物细胞中活体内并入3-碘-L-酪氨酸。参看Sakamoto.K..等人,(2002)Nucleic Acids Res.30:4692-4699。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但通常希望选择在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中很少或从未使用的密码子。举例来说，例示性密码子包括无义密码子(例如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石))、四个或四个以上碱基的密码子以及很少使用或未使用过的其它天然三碱基密码子。
可使用所属领域中已知的诱变方法(包括(但不限于)位点特异性诱变、盒式诱变、限制选择诱变等)将特定的选择密码子引入FGF-21多核苷酸编码序列的适当位置中。
用于产生可用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质生物合成机构的组分(例如O-RS、O-tRNA以及正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于Wang,L.等人,Science292:498-500(2001)；Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)；Zhang,Z.等人,Biochemistry42:6735-6746(2003)中。用于活体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利第7,045,337号中，所述专利是以引用的方式并入本文中。用于选择用于生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利第7,045,337号和美国专利第7,083,970号中，所述专利是以引用的方式并入本文中。标题为“Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins”的PCT公开案第WO04/035743号(其是以全文引用的方式并入本文中)描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。标题为“Expanding the Eukaryotic Genetic Code”的PCT公开案第WO04/094593号(其是以全文引用的方式并入本文中)描述在真核宿主细胞中并入非天然编码氨基酸的正交RS和tRNA对。
用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)自第一生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库，所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体，例如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌(T.thermophilus)等；或真核生物体；(b)在RS(视情况突变RS)的文库中选择(和/或筛选)在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的池；和/或(c)在所述池中选择(视情况通过阴性选择)在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括(但不限于)突变RS)，从而提供至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS利用非天然编码氨基酸优先使O-tRNA氨酰化。
在一个实施例中，RS为非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变而产生。举例来说，可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变为不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生非活性RS。
可使用所属领域中已知的各种技术来产生突变RS的文库，所述技术包括(但不限于)以蛋白质三维RS结构为基础的合理设计或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。举例来说，可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、合理设计以及本文中所述或所属领域中已知的其它方法产生突变RS。
在一个实施例中，在RS(视情况突变RS)的文库中选择(和/或筛选)(包括(但不限于))在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的活性成员包括：将阳性选择或筛选标记(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(视情况突变)RS的文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)琥珀、赭石或蛋白石密码子)；使所述多个细胞在存在选择剂的情况下生长；通过抑制阳性选择或筛选标记中的至少一个选择密码子来鉴别在存在选择剂和/或筛选剂的情况下存活(或显示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(视情况突变)RS的池的经阳性选择细胞的子集。视情况可改变选择剂和/或筛选剂浓度。
一方面，阳性选择标记为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因并且在CAT基因中，选择密码子为琥珀终止密码子。视情况，阳性选择标记为β-内酰胺酶基因且在β-内酰胺酶基因中，选择密码子为琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记(包括(但不限于)细胞表面标记)。
在一个实施例中，在池中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(视情况突变体)包括：将阴性选择或筛选标记与来自阳性选择或筛选的活性(视情况突变)RS的池引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，其包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；以及鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应、但在未补充非天然编码氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞。举例来说，CAT鉴别方案在适当O-RS重组体的确定中视情况充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说，视情况在存在或不存在一个或一个以上非天然编码氨基酸的情况下在含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆池。因此，认为仅在含有非天然编码氨基酸的平板上生长的菌落含有重组O-RS。一方面，改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中，第一生物体与第二生物体不同。因此，第一生物体和/或第二生物体视情况包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌(archaebacterium)、真细菌(eubacterium)、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记。
在另一实施例中，在池中筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)活性(视情况突变)RS包括：从阳性选择步骤(b)分离活性突变RS的池；将阴性选择或筛选标记和活性(视情况突变)RS的池引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的毒性标记基因，其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因)；以及鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应、但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性筛选反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。这些实施例视情况可包括所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子的情形，以及第一生物体与第二生物体不同(包括(但不限于)各生物体视情况为(包括但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外，一些方面包括阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛选标记视情况包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记的情形。在本文中的实施例中，筛选和/或选择视情况包括筛选和/或选择严格度的变化。
在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含：(d)分离所述至少一种重组O-RS；(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况突变体)；以及(f)重复步骤(b)和(c)，直到获得包含优先使O-tRNA氨酰基化的能力的突变O-RS。视情况，将步骤(d)-(f)重复(包括(但不限于))至少约两次。一方面，可通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。
在上述方法中，选择/筛选步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c))的严格度视情况包括改变选择/筛选严格度。在另一实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)包含使用报告基因，其中报告基因是通过荧光激活细胞分类(FACS)检测或其中报告基因是通过发光检测。报告基因视情况呈现于细胞表面、噬菌体呈现上等且根据涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶是呈现于细胞表面、噬菌体呈现上等。
用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括：(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制银子tRNA)的突变tRNA文库；(b)在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下由来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供tRNA(视情况突变体)的池；以及(c)在所述tRNA(视情况突变体)池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且无法由来自第二生物体的RS有效识别且通过O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制因子tRNA和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中，O-tRNA无需修饰而视情况从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中，第一生物体与第二生物体相同或不同并且视情况选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是由非天然编码氨基酸视情况氨酰基化，其中非天然编码氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操纵生物合成。视情况将非天然编码氨基酸添加到至少第一生物体或第二生物体的生长培养基中。
一方面，在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选通过氨酰基-tRNA合成酶氨酰基化的(视情况突变)tRNA(步骤(b))包括：将毒性标记基因和(视情况突变)tRNA文库引入来自第二生物体的多个细胞中，其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(static agent)的基因或生物体必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)；以及选择存活细胞，其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变)tRNA的池。举例来说，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。
另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可包括两个或两个以上琥珀密码子。
在一个实施例中，在(视情况突变)tRNA的池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可包括：将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(视情况突变)tRNA的池引入来自第二生物体的多个细胞中，其中阳性标记基因包含药物抗性基因(其包括(但不限于)β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，例如至少一个琥珀终止密码子)或生物体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；以及鉴别在存在选择剂或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)的情况下生长的存活或筛选细胞，从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞池，其中所述至少一种重组tRNA是通过O-RS氨酰基化且回应所述至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，改变选择剂和/或筛选剂的浓度。
提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括：(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下通过来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供(视情况突变)tRNA池；(c)在(视情况突变)tRNA池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子并且无法由来自第二生物体的RS有效识别且通过O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)由第三生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库；(e)在所述突变RS文库中选择或筛选在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS池；和(f)在所述池中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(视情况突变)RS，从而提供至少一个特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一个特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对(例如mutRNATyr-SS12TyrRS对)、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外，所述方法包括第一与第三生物体相同(其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)的情形。
本发明中也包括选择用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括：将标记基因、tRNA和从第一生物体分离或获得的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的复制细胞组中；以及选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组是在存在选择剂或筛选剂的情况下生长，其中存活或筛选细胞包含用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括活体内互补检定。可改变选择剂或筛选剂的浓度。
本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说，本发明方法的第一生物体与第二生物体可能相同或不同。在一个实施例中，生物体视情况为原核生物体，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，生物体视情况包含真核生物体，包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，例如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一个实施例中，第二生物体为原核生物体，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、嗜盐菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，第二生物体可为真核生物体，包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等。在各个实施例中，第一生物体与第二生物体不同。
VI.非天然存在氨基酸在FGF-21多肽中的位置
本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入FGF-21多肽中。可将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入特定位置处而不破坏多肽活性。这可通过进行“保守”取代来实现，所述取代包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸、用庞大氨基酸取代庞大氨基酸、用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸和/或在活性不需要的位置中插入非天然存在氨基酸。
可使用多种生物化学和结构方法来选择FGF-21多肽内供非天然编码氨基酸取代的所需位点。所属领域的技术人员显而易见，多肽链的任何位置都适于选择以并入非天然编码氨基酸，并且选择可基于合理设计或通过随机选择来进行以实现任何目的或无特定需要的目的。所需位点的选择可用于产生具有任何所需性质或活性的FGF-21分子(包括(但不限于)激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂)、二聚物或多聚物形成、与天然分子相比不改变活性或性质，或操纵多肽的任何物理或化学性质(例如溶解性、聚集或稳定性)。举例来说，可使用所属领域中已知的点突变分析、丙氨酸扫描或同源物扫描方法来鉴别FGF-21多肽中为生物活性所需的位置。对FGF-21生物活性至关重要的残基、与医药稳定性有关的残基、抗体抗原决定基或受体或肝素结合残基可发生突变。美国专利第5,580,723号、第5,834,250号、第6,013,478号、第6,428,954号和第6,451,561号(其是以引用的方式并入本文中)描述通过用标靶物质鉴别影响多肽活性的活性域来系统分析多肽(例如FGF-21)的结构和功能的方法。除通过丙氨酸或同源物扫描诱变被鉴别为对生物活性至关重要的残基之外的残基可视多肽所追求的所需活性而为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。或者，经鉴别为对生物活性至关重要的位点也可视多肽所追求的所需活性而为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。另一替代方法将为在多肽链上的各个位置中利用非天然编码氨基酸简单地进行连续取代并且观察对多肽活性的影响。所属领域的技术人员显而易见，在任何多肽中选择供非天然氨基酸取代的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。
如本说明书中稍后提供的实例中所述，已使用本申请案中呈示的方法收集许多数据，并且已发现并成功地测试潜在和有益的突变位点。发现关于突变体的结构和活性的其他信息，甚至包括实例中未特定描述的关于调配和/或测试的一些细节的信息，也可研究含有缺失的FGF-21多肽的信息以确定可能允许用非天然编码氨基酸进行取代的蛋白质区域。可以类似方式使用蛋白酶消化和单克隆抗体来鉴别负责结合FGF-21受体的FGF-21区域。在排除可能不允许经非天然编码氨基酸取代的残基后，可研究所提出的取代在各剩余位置处的影响。可根据其它FGF家族成员和FGF受体的三维晶体结构产生模型。蛋白质数据库(Protein Data Bank；PDB，通过万维网在rcsb.org上获得)是含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的集中数据库。如果无法获得三维结构数据，那么可建立模型来研究多肽的二级和三级结构。因此，所属领域的技术人员可容易地鉴别可经非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。
在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽包含位于不破坏多肽的结构的蛋白质区域中的一个或一个以上非天然存在氨基酸。
并入非天然编码氨基酸的例示性残基可能为潜在受体结合区中不包括的残基，可能完全或部分暴露在溶剂中，与附近残基具有最小或无氢键合相互作用，可能最低程度地受到附近的反应性残基影响，可能位于一个或一个以上暴露面上，可能为一个或一个以上与第二FGF-21或其它分子或其片段并列的位点，可能处于如根据与受体结合或未结合或者与另一生物活性分子偶合或未偶合的FGF-21多肽的三维、二级、三级或四级结构所预测的高度可挠性或结构呈刚性的区域中，或可能通过按需要改变完整结构的可挠性或刚性来调节FGF-21本身或包含一个或一个以上FGF-21的二聚物或多聚物的构象。
如由结晶学所鉴别，FGF蛋白质家族具有常见的β-三叶形结构或β-片状结构(Harmer等人,Biochemistry43:629-640(2004))。所属领域的技术人员认识到，这种对FGF-21的分析使得能够确定哪些氨基酸残基相比于隐藏在蛋白质三级结构内的氨基酸残基来说是表面暴露的。因此，用非天然编码氨基酸取代作为表面暴露残基的氨基酸是本发明的一个实施例。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21中的任何位置中：SEQ ID NO:1的1-181或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108和110(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：10、52、77、117、126、131和162(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：87、77、83、72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的91位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的131位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的108位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的77位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的72位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的87位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的86位置(SEQID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的126位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的110位置(SEQ ID NO:1或在SEQID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的83位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的146位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的135位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的96位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一个实施例中，非天然存在氨基酸位于FGF-21中的36位置(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在另一个实施例中，在位置91处存在非天然存在氨基酸并且在一个以下位置处存在另一个非天然存在氨基酸：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置91处存在非天然存在氨基酸并且在一个以下位置处存在另一个非天然存在氨基酸：131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置91和位置131(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置91和位置77(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置91和位置108(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置131和位置108(SEQ ID NO:1或在SEQ IDNO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置131和位置77(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置131(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置108(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置77(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置87(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置86(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在所连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置126(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置83(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸。
在另一个实施例中，在位置91处存在非天然存在氨基酸并且在以下位置中的一个或一个以上位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置91处存在非天然存在氨基酸并且在以下位置中的一个或一个以上位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸：131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在另一个实施例中，在位置131处存在非天然存在氨基酸并且在以下位置中的一个或一个以上位置处存在另一个非天然存在氨基酸：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ IDNO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置131处存在非天然存在氨基酸并且在以下位置中的一个或一个以上位置处存在另一个非天然存在氨基酸：131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在另一个实施例中，在位置108处存在非天然存在氨基酸并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置108处存在非天然存在氨基酸并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸：131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在另一个实施例中，在位置77处存在非天然存在氨基酸并且在以下位置中的一个或一个以上位置处存在另一个非天然存在氨基酸：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ IDNO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置77处存在非天然存在氨基酸并且在以下位置中的一个或一个以上位置处存在另一个非天然存在氨基酸：131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
关于FGF-21或FGF家族成员的晶体结构以及其与FGF受体的相互作用的研究可指示哪些特定氨基酸残基具有可完全或部分接近溶剂的侧链。这些位置处的非天然编码氨基酸侧链可远离蛋白质表面并进入溶剂中。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的两个或两个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：10、52、77、117、126、131、162(SEQ ID NO:1或在SEQ IDNO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：87、77、83、72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，这些位置中的一个或一个以上位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：91、131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，当非天然存在氨基酸存在于氨基酸91(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处时，所述非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接。
在另一个实施例中，在位置91处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在另一个非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置91处存在非天然存在氨基酸并且在一个以下位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸，并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置91处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置91处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且存在一个或一个以上与水溶性聚合物连接的其它非天然存在氨基酸：131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置91处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置91处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：131、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在另一个实施例中，在位置131处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在另一个非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置131处存在非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：91、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置131处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置131处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且存在一个或一个以上与水溶性聚合物连接的其它非天然存在氨基酸：91、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置131处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置131处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：91、108、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在另一个实施例中，在位置108处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在另一个非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置108处存在非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：91、131、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置108处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置108处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且存在一个或一个以上与水溶性聚合物连接的其它非天然存在氨基酸：91、131、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置108处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置108处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：91、131、77、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在另一个实施例中，在位置77处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在另一个非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置77处存在非天然存在氨基酸并且在一个以下位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸，并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：91、131、108、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置77处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在一个以下位置处存在一个或一个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置77处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且存在一个或一个以上与水溶性聚合物连接的其它非天然存在氨基酸：91、131、108、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置77处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在另一个实施例中，在位置77处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸，并且在以下位置中的两个或两个以上位置处存在两个或两个以上其它非天然存在氨基酸并且这些非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：91、131、108、72、87、86、126、110、83、146、135、96和36(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
在另一个实施例中，在位置91和位置131(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸并且这些位置中的一个或一个以上位置与水溶性聚合物连接。在另一个实施例中，在位置91和位置77(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸并且这些位置中的一个或一个以上位置与水溶性聚合物连接。在另一个实施例中，在位置91和位置108(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸并且这些位置中的一个或一个以上位置与水溶性聚合物连接。在另一个实施例中，在位置131和位置108(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸并且这些位置中的一个或一个以上位置与水溶性聚合物连接。在另一个实施例中，在位置131和位置77(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在非天然存在氨基酸并且这些位置中的一个或一个以上位置与水溶性聚合物连接。在另一个实施例中，在位置91(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置131(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置108(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置77(SEQ ID NO:1或在SEQ IDNO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置87(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置86(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置126(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。在另一个实施例中，在位置83(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处存在与水溶性聚合物连接的非天然存在氨基酸。
可用多种非天然编码氨基酸取代FGF-21多肽中的给定位置，或可将多种非天然编码氨基酸并入FGF-21多肽中的给定位置中。一般来说，根据对FGF-21多肽或其它FGF家族成员与其受体的三维晶体结构的研究来选择供并入的特定非天然编码氨基酸，其中优选保守取代(即，用基于芳基的非天然编码氨基酸(例如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)取代Phe、Tyr或Trp)以及希望引入FGF-21多肽中的特异性接合化学(例如，如果需要利用具有炔部分的水溶性聚合物来实现休根斯[3+2]环加成，或需要利用具有芳基酯(其又并入膦部分)的水溶性聚合物来形成酰胺键，那么引入4-叠氮基苯丙氨酸)。
在一个实施例中，所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；以及使蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼化部分、光化辐射可激发的部分、可光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传递素、放射性核苷酸、放射性传递素、中子俘获剂或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以使分子通过[3+2]环加成与非天然氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮部分，并且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中)并且第二反应性基团为叠氮部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)并且第二反应性基团为炔基部分。
在一些情况下，将非天然编码氨基酸取代与FGF-21多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响FGF-21多肽的其它生物特性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加FGF-21多肽的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解降解的抗性)或增加FGF-21多肽对其受体的亲和性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加FGF-21多肽的医药稳定性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加FGF-21多肽的溶解性(包括(但不限于)在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，添加、取代或缺失可增加在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达之后的多肽溶解性。在一些实施例中，除并入非天然氨基酸的位点外还选择另一位点以供天然编码或非天然氨基酸取代，这使得在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后多肽溶解性增加。在一些实施例中，FGF-21多肽包含另一添加、取代或缺失，其调节对FGF-21多肽受体、结合蛋白或缔合配体的亲和性，调节与FGF-21受体结合后的信号转导，调节循环半衰期，调节释放或生物可用性，促进纯化或改良或改变特定投药途径。在一些实施例中，FGF-21多肽包含增加FGF-21变异体对其受体的亲和性的添加、取代或缺失。类似地，FGF-21多肽可包含改良多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或活化、FGF-21尺寸减小或其它特性的化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和性的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或连接分子(包括(但不限于)生物素)。
在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代产生FGF-21拮抗剂。在一些实施例中，在与受体结合有关的区域中取代或添加非天然编码氨基酸。在一些实施例中，在与肝素结合有关的区域中取代或添加非天然编码氨基酸。在一些实施例中，FGF-21拮抗剂包含至少一个使FGF-21充当拮抗剂的取代。在一些实施例中，FGF-21拮抗剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸，其存在于FGF-21分子的受体结合区中。
在一些情况下，用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上氨基酸。在一些情况下，FGF-21多肽进一步包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上用一个或一个以上非天然编码氨基酸对天然存在氨基酸的取代。举例来说，在一些实施例中，用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代FGF-21中的一个或一个以上残基。在一些情况下，将一个或一个以上非天然编码残基与一个或一个以上较低分子量的线性或分枝PEG连接，从而相对于与单一较高分子量PEG连接的物质增强结合亲和性并且具有可相当的血清半衰期。
在一些实施例中，FGF-21的以下残基中有至多两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代。
VII.非真核细胞和真核细胞中的表达
为获得克隆FGF-21多核苷酸的高水平表达，通常将编码本发明的FGF-21多肽的多核苷酸亚克隆到含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(如果就编码蛋白质的核酸来说)供翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。所属领域的技术人员已知合适的细菌启动子，并且其例如描述于Sambrook等人以及Ausubel等人中。
用于表达本发明的FGF-21多肽的细菌表达系统可在(包括但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌(Salmonella)中获得(Palva等人,Gene 22:229-235(1983)；Mosbach等人,Nature302:543-545(1983))。用于这些表达系统的试剂盒在市面上有售。所属领域的技术人员已知哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统，并且其也在市面上有售。在使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上述)来表达本发明的FGF-21多肽的情况下，用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力进行选择。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(Gram-positive bacteria)(包括(但不限于)短小芽孢杆菌(B.brevis)、枯草杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)，以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述，可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，组合物视情况包括(包括但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上包含非天然氨基酸的蛋白质，或可通过活体内蛋白质制备方法所实现的量的所述蛋白质(关于重组蛋白制备和纯化的细节提供于本文中)。另一方面，所述蛋白质视情况以在(包括但不限于)细胞溶菌液、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括但不限于体积(包括但不限于)约为约1nl到约100L或100L以上)中(包括但不限于)每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质或每升至少10毫克或10毫克以上蛋白质的浓度存在于组合物中。在真核细胞中产生大量(包括但不限于大于用其它方法(包括但不限于活体外翻译)通常可能获得的量)包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质是本发明的特征。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，可在细胞提取物、细胞溶菌液、培养基、缓冲液等中产生蛋白质浓度为(包括但不限于)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的包含非天然氨基酸的蛋白质。
I.表达系统、培养和分离
FGF-21多肽可在任何数目的合适表达系统(例如包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。例示性表达系统的描述提供于下文中。
酵母：如本文中所用，术语“酵母”包括能够表达编码FGF-21多肽的基因的各种酵母中的任一种。所述酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenous)和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，即裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属)、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、脂酵母亚科(Lipomycoideae)以及酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属和酵母菌(Saccharomyces)属)。担孢子酵母包括白冬孢酵母(Leucosporidium)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、锁掷酵母(Sporidiobolus)属、线黑粉酵母(Filobasidium)属和香灰拟锁担菌(Filobasidiella)属。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，掷孢酵母(Sporoholomyces)属和布勒掷孢酵母(Bullera)属)和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母(Candida)属)。
尤其受关注的供本发明使用的物种为毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种，其包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白假丝酵母菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)。
适用于表达FGF-21多肽的酵母的选择是在所属领域的技术人员的技能范围内。在选择用于表达的酵母宿主时，合适的宿主可包括显示具有(例如)良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白质产生以及总体坚固性的酵母宿主。酵母通常可获自多种来源，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(Yeast Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California,Berkeley,CA)和美国典型菌种保藏中心(American Type CultureCollection,“ATCC”)(Manassas,VA)。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的酵母。所述术语包括已接受重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全一致。与将要以相关性质(例如存在编码FGF-21多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
已开发包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体以将其转化到多种酵母宿主中。举例来说，已开发用于以下各酵母的表达载体：酿酒酵母(Sikorski等人,GENETICS(1989)122:19；Ito等人,J.BACTERIOL.(1983)153:163；Hinnen等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1978)75:1929)；白假丝酵母菌(Kurtz等人,MOL.CELL.BIOL.(1986)6:142)；麦芽糖假丝酵母(Kunze等人,J.BASIC MICROBIOL.(1985)25:141)；汉森酵母(Gleeson等人,J.GEN.MICROBIOL.(1986)132:3459；Roggenkamp等人,MOL.GENETICSAND GENOMICS(1986)202:302)；脆壁克鲁维酵母(Das等人,J.BACTERIOL.(1984)158:1165)；乳酸克鲁维酵母(De Louvencourt等人,J.BACTERIOL.(1983)154:737；Van denBerg等人,BIOTECHNOLOGY(NY)(1990)8:135)；谷勒氏酵母(Kunze等人,J.BASICMICROBIOL.(1985)25:141)；巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；和第4,837,148号；Cregg等人,MOL.CELL.BIOL.(1985)5:3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach等人,NATURE(1982)300:706)；以及解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)；构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人,BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.(1983)112:284-89；Tilburn等人,GENE(1983)26:205-221；和Yelton等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81:1470-74)；黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes,EMBO J.(1985)4:475-479)；里氏木霉(T.reesia)(EP 0244234)；和丝状真菌，例如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO 91/00357)，其中各文献是以引用的方式并入本文中。
所属领域的技术人员已知用于酵母载体的控制序列，并且所述序列包括(但不限于)来自以下基因的启动子区域：例如，醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044)；烯醇酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供适用的启动子序列(Miyanohara等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它合适的启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人,J.BIOL.CHEM.(1980)255:12073)和其它糖解酶(例如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(Holland等人,BIOCHEMISTRY(1978)17:4900；Hess等人,J.ADV.ENZYME REG.(1969)7:149))的启动子。具有由生长条件控制的转录的其它优点的可诱导酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 0 073 657中。
酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区域连接，从而产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区域连接的ADH调节序列。参看美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其是以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调节序列连接糖解酶基因(例如GAP或PyK)的转录活化区域所组成的启动子。参看EP 0164 556。此外，酵母启动子可包括具有与酵母RNA聚合酶结合并起始转录的能力的非酵母来源的天然存在启动子。
可构成酵母表达载体的一部分的其它控制元件包括(例如)来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(Holland等人,J.BIOL.CHEM.(1981)256:1385)。另外，来自2μ质粒来源的复制起点适用于酵母。适用于酵母的选择基因为酵母质粒中存在的trp1基因。参看Tschumper等人,GENE(1980)10:157；Kingsman等人,GENE(1979)7:141。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变菌株提供选择标记。类似地，由带有Leu2基因的已知质粒补充Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)。
所属领域的技术人员已知将外源DNA引入酵母宿主中的方法，并且所述方法通常包括(但不限于)转化原生质球状体或经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据Hsiao等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76:3829和Van Solingen等人,J.BACT.(1977)130:946中所述的方法来进行酵母的转化。然而，也可如Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:A LAB.MANUAL(2001)中通常所述来使用将DNA引入细胞中的其它方法(例如通过核注射、电穿孔或原生质体融合)。随后，可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。
所属领域的技术人员已知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法。通常参看美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/07862；WO 98/37208；和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0 946 736；EP 0 732 403；EP 0 480 480；WO 90/10277；EP 0 340 986；EP 0 329 203；EP 0 324 274；和EP 0 164 556。也参看Gellissen等人,ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992)62(l-2):79-93；Romanos等人,YEAST(1992)8(6):423-488；Goeddel,METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185:3-7，其各自以引用的方式并入本文中。
在使用所属领域的技术人员已知的标准进料分批发酵方法进行的扩增阶段期间，可使酵母宿主菌株在发酵罐中生长。所述发酵方法可适用于解释特定酵母宿主的碳利用途径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复杂氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相反，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料，但仅需要简单铵(氮)盐以进行最佳生长和表达。例如，参看美国专利第5,324,639号；Elliott等人,J.PROTEIN CHEM.(1990)9:95；和Fieschko等人,BIOTECH.BIOENG.(1987)29:1113，其是以引用的方式并入本文中。
然而，所述发酵方法可具有与所用的酵母宿主菌株无关的某些常见特征。举例来说，在扩增阶段期间，可将限制生长的营养素(通常为碳)添加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法通常使用经设计成含有适量碳、氮、基本盐、磷和其它微量营养素(维生素、痕量矿物和盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其是以引用的方式并入本文中。WO2005/091944(其以引用的方式并入本文中)描述FGF-21在酵母中的表达。
感染杆状病毒的昆虫细胞：术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的昆虫。所述术语包括已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。与将要以相关性质(例如存在编码FGF-21多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
所属领域的技术人员已知适用于表达FGF-21多肽的昆虫细胞的选择。多种昆虫物种在所属领域中得到充分描述并且在市面上有售，其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主时，合适的宿主可包括显示具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。昆虫通常可获自多种来源，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(Berkeley,CA)；和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA)。
通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包括：转移载体(通常为细菌质粒)，其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入欲表达的异源基因的便利限制位点；野生型杆状病毒，其具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列(这允许将异源基因同源重组到杆状病毒基因组中)；以及适当的昆虫宿主细胞和生长培养基。所属领域中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术并且可使用描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中之后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，其中载体与病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒，并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)。所属领域的技术人员通常已知这些技术，并且所述技术全面描述于SUMMERS AND SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN,第1555期,(1987)中，其是以引用的方式并入本文中。也参看RICHARDSON,39METHODS INMOLECULAR BIOLOGY:BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)；King和Possee,THEBACULOVIRUS SYSTEM:A LABORATORY GUIDE(1992)；以及O'Reilly等人,BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)。
实际上，所属领域的技术人员已知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来制备各种异源蛋白质。例如，参看美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/02628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其是以引用的方式并入本文中。
所属领域中已知适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的载体，并且所述载体例如包括从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体，其为不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。从此系统得到的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。通常参看O'Reilly等人,BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)。
在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、所关注的编码序列和转录终止序列的上述组分组装到中间错位构筑体(intermediatetransplacement construct)(转移载体)中。中间错位构筑体通常保持在能够稳定保持在宿主(例如细菌)中的复制子(例如染色体外元件(例如，质粒))中。复制子将具有复制系统，因此使其保持在适用于克隆和扩增的宿主中。更具体来说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller,ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42:177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨比西林(ampicillin)抗性(amp)基因和复制起点。
一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也已经对所属领域的技术人员已知的多种其它载体进行设计，所述载体包括(例如)pVL985，其将多角体蛋白起始密码子从ATG改变为ATT，并且其在ATT下游32个碱基对处引入BamHI克隆位点。参看Luckow和Summers,VIROLOGY 170:31(1989)。其它市售载体例如包括PBlueBac4.5/V5-His；pBlueBacHis2；pMelBac；pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。
在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。所属领域中已知将异源DNA引入杆状病毒的所需位点中的方法。参看Summers和Smith,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN,第1555期,(1987)；Smith等人,MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156；Luckow和Summers,VIROLOGY(1989)170:31。举例来说，可通过同源双交叉重组插入例如多角体蛋白基因等基因中；也可插入所需杆状病毒基因中工程改造过的限制酶位点中。参看Miller等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91。
可通过电穿孔来实现转染。参看TROTTER和WOOD,39METHODS IN MOLECULARBIOLOGY(1995)；MANN和KING,J.GEN.VIROL.(1989)70:3501。或者，可使用脂质体以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如，参看Liebman等人,BIOTECHMQUES(1999)26(1):36；Graves等人,BIOCHEMISTRY(1998)37:6050；Nomura等人,J.BIOL.CHEM.(1998)273(22):13570；Schmidt等人,PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12:323；Siffert等人,NATURE GENETICS(1998)18:45；Tilkins等人,CELL BIOLOGY:A LABORATORYHANDBOOK 145-154(1998)；Cai等人,PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10:263；Dolphin等人,NATURE GENETICS(1997)17:491；Kost等人,GENE(1997)190:139；Jakobsson等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271:22203；Rowles等人,J.BIOL.CHEM.(L996)271(37):223/6；Reverey等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271(39):23607-10；Stanley等人,J.BIOL.CHEM.(1995)270:4121；Sisk等人,J.VIROL.(1994)68(2):766；以及Peng等人,BIOTECHNIQUES(1993)14(2):274。市售脂质体例如包括和(Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA)。另外，也可使用磷酸钙转染。参看Trotter和Wood,39METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；KITTS,NAR(1990)18(19):5667；以及Mann和King,J.GEN.VIROL.(1989)70:3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够与杆状病毒RNA聚合酶结合并起始编码序列(例如，结构基因)下游(3')转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有被称作增强子的第二域，当存在所述域时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可经调节或为组成性的。
在感染周期的末期大量转录的结构基因提供尤其适用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多面体蛋白的基因(Friesen等人,The Regulation of Baculovirus Gene Expression,THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0127839和0155476)和编码p10蛋白的基因(Vlak等人,J.GEN.VIROL.(1988)69:765)的序列。
将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中并且随后可通过所属领域的技术人员已知的技术来纯化所生长斑块。参看Miller等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91；SUMMERS和Smith,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN,第1555期,(1987)。
已开发用于感染到多种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参看Wright,Nature(1986)321:718；Carbonell等人,J.VIROL(1985)56:153；Smith等人,MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156。通常参看Fraser等人,In Vitro CELL.DEV.BIOL.(1989)25:225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(Invitrogen Corp.,目录号11497-013(Carlsbad,CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
用于异源多肽在杆状病毒/表达载体中的直接表达和融合表达的细胞和培养基在市面上有售，并且所属领域的技术人员通常已知细胞培养技术。
大肠杆菌、假单胞菌种和其它原核生物：所属领域的技术人员已知细菌表达技术。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为单拷贝或低或高的多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于关于载体的丰富文献、多种载体的商业可得性以及甚至描述载体和其限制酶图谱以及特征的手册，在本文中无需广泛讨论。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记，其提供不同特征。
细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3')转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有被称作操纵基因的第二域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许阴性调节(可诱导)转录，这是因为基因抑制蛋白可结合操纵基因并从而抑制特定基因的转录。在不存在阴性调节元件(例如操纵基因)的情况下可发生组成性表达。另外，可通过基因活化蛋白结合序列实现阳性调节，当存在所述结合序列时，所述序列通常最接近RNA聚合酶结合序列的(5')。基因活化蛋白的实例为代谢产物活化蛋白(CAP)，其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[Raibaud等人,ANNU.REV.GENET.(1984)18:173]。因此，经调节的表达可为阳性或阴性，从而增强或减弱转录。
编码代谢途径酶的序列提供尤其适用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(例如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人,NATURE(1977)198:1056]以及麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(例如色氨酸(trp))的启动子序列[Goeddel等人,Nuc.Acids Res.(1980)8:4057；Yelverton等人,NUCL.ACIDS RES.(1981)9:731；美国专利第4,738,921号；欧洲公开案第036776号以及第121775号，其是以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)"The cloning of interferon andother mistakes."Interferon 3(I.Gresser编)]、噬菌体λPL[Shimatake等人,NATURE(1981)292:128]以及T5[美国专利第4,689,406号，其是以引用的方式并入本文中]启动子系统也提供适用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子(例如T7启动子)来诱导高含量的FGF-21多肽。所属领域的技术人员已知这些载体的实例,并且其包括来自Novagen的pET29系列以及WO99/05297(其是以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量的FGF-21多肽，而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。pET19(Novagen)是所属领域中已知的另一种载体。
另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号，其是以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子是包含trp启动子与lac操纵子序列的杂合trp-lac启动子，其由lac阻遏物调节[Amann等人,GENE(1983)25:167；de Boer等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80:21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合并起始转录的能力。也可将非细菌来源的天然存在启动子与可相容的RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统是偶合启动子系统的实例[Studier等人,J.MOL.BIOL.(1986)189:113；Tabor等人,PROCNATL.ACAD.SCI.(1985)82:1074]。另外，杂合启动子也可包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区域(欧洲公开案第267851号)。
除功能启动子序列之外，有效核糖体结合位点也适用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称作Shine-Dalgarno(SD)序列并包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人,Nature(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3'端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人,"Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA",Biological Regulation and Development:Gene Expression(Ed.R.F.Goldberger,1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人,"Expression of cloned genes in Escherichia coli",Molecular Cloning:ALaboratory Manual,1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的细菌。所述术语包括已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。与将要以相关性质(例如存在编码FGF-21多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
所属领域的技术人员已知适用于表达FGF-21多肽的宿主细菌的选择。在选择用于表达的细菌宿主时，合适的宿主可包括显示具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性以及总体稳固性的宿主。细菌宿主通常可获自多种来源，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(Berkeley,CA)；以及美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA)。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株的细菌(例如W3110)或来源于B菌株的细菌(例如BL21)。这些菌株因其生长参数为人熟知且稳定而特别适用。另外，这些菌株为非病原性的，出于安全性和环境原因，其在商业上较为重要。合适的大肠杆菌宿主的其它实例包括(但不限于)BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本发明方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株，其包括(但不限于)OMP-和LON-。宿主细胞株可为假单胞菌种，包括(但不限于)荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌以及恶臭假单胞菌。已知荧光假单胞菌生物型1(命名为菌株MB101)适用于重组制备且可用于治疗性蛋白质的制备过程。假单胞菌表达系统的实例包括可以宿主菌株形式获自Dow Chemical Company的系统(Midland,MI，可通过万维网在dow.com上获得)。
在形成重组宿主细胞株(即，已将表达构筑体引入宿主细胞中并且分离出具有合适表达构筑体的宿主细胞)后，在适于产生FGF-21多肽的条件下培养重组宿主细胞株。所属领域的技术人员显而易见，重组宿主细胞株的培养方法将依赖于所利用的表达构筑体的性质以及宿主细胞的特点。通常使用所属领域的技术人员已知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳、氮以及无机盐来源并且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域的技术人员已知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不合需要的微生物和/或化合物(包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)的生长。
重组宿主细胞可以分批或连续模式培养，其中细胞收集(在FGF-21多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的收集为分批或连续模式。对于原核宿主细胞中的制备来说，优选分批培养和细胞收集。
本发明的FGF-21多肽通常是在重组系统中表达之后纯化。FGF-21多肽可通过所属领域中已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化。细菌宿主细胞中所产生的FGF-21多肽可具有弱溶解性或不可溶(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中，使用本文中揭示的方法以及所属领域中已知的方法，可容易地在FGF-21多肽中进行为增加重组产生的蛋白质的溶解性而选择的氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下，可通过离心从宿主细胞溶菌液收集蛋白质，并且其后可接着进行细胞的均质化。在具有弱溶解性的蛋白质的情况下，可添加包括(但不限于)聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白质的沉淀。随后可通过离心便利地收集沉淀的蛋白。使用所属领域的技术人员已知的多种方法，可使重组宿主细胞破裂或均质化以从细胞内部释放包涵体。可使用熟知的技术来进行宿主细胞的破裂或均质化，这些技术包括(但不限于)酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中，使用高压释放技术使大肠杆菌宿主细胞破裂以释放FGF-21多肽的包涵体。在处理FGF-21多肽的包涵体时，最好使重复过程的均质化时间最小化以使包涵体产率最大化且不会由于例如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素造成损失。
随后，可使用所属领域中已知的多种合适的增溶剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀的FGF-21多肽。可用尿素或盐酸胍溶解FGF-21多肽。应使溶解的FGF-21多肽的体积最小化，从而可使用可方便操作的批量大小来制备大批量。在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中，这个因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造FGF-21多肽时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，应避免可损害机器和容器的苛刻化学品或其蛋白质产物。本发明的方法中已展示，可使用较温和的变性剂尿素代替较苛刻的变性剂盐酸胍来溶解FGF-21多肽包涵体。尿素的使用显著降低损害在FGF-21多肽的制造和纯化过程中使用的不锈钢设备的风险，同时有效溶解FGF-21多肽包涵体。
在可溶性FGF-21蛋白的情况下，可将FGF-21分泌到周质空间或培养基中。举例来说，通过使用编码包括八个不同前导序列(包括SEQ ID NO:39-44中所列的序列)的构筑体的质粒并且将这些质粒转化到W3110-B2细胞中来使FGF-21分泌到W3110-B2细胞的周质空间中，随后使细胞在37℃下生长，直到OD达到约0.8，此时用0.01％阿拉伯糖诱导表达。5小时后，从培养物中准备周质释放样品并且在凝胶上操作(图33)，显示总体表达(全部溶菌液)和周质分泌(可溶性部分)。
另外，可溶性FGF-21可能存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓缩可溶性FGF-21。可使用所属领域的技术人员已知的标准技术从(例如)细胞溶菌液或培养基浓缩可溶性FGF-21。另外，可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来破裂宿主细胞且从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性FGF-21。
当制备呈融合蛋白形式的FGF-21多肽时，可去除融合序列。可通过酶促或化学裂解来实现融合序列的去除。可使用所属领域的技术人员已知的方法来实现融合序列的酶促去除。所属领域的技术人员将显而易见，用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的特点决定，并且反应条件将根据酶的选择进行指定。可使用所属领域的技术人员已知的试剂(包括(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂)来实现化学裂解。可通过所属领域的技术人员已知的方法从裂解的融合序列中纯化裂解的FGF-21多肽。所属领域的技术人员将显而易见，所述方法将由融合序列和FGF-21多肽的特点和性质决定。纯化方法可包括(但不限于)尺寸排阻色谱、疏水性相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
也可纯化FGF-21多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。虽然可通过所属领域中已知的任何合适的方法(例如沉淀或离子交换色谱)去除DNA，但也可通过用核酸沉淀剂(例如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可使用包括(但不限于)离心或过滤的熟知的标准方法使FGF-21多肽与沉淀的DNA分离。在将使用FGF-21多肽来治疗人类的设定中，宿主核酸分子的去除为重要因素，并且本发明的方法将宿主细胞DNA降到医药学上可接受的水平。
用于小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统以及搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可以分批、分批馈料或连续模式方法进行。
通常，可使用所属领域中的标准方法来回收本发明的人类FGF-21多肽。举例来说，可离心或过滤培养基或细胞溶菌液以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所需体积或透滤到合适的缓冲液中以调节供进一步纯化的制剂。本发明的FGF-21多肽的进一步纯化包括从完整形式中分离脱酰氨化和剪短形式的FGF-21多肽变异体。
以下例示性程序中的任一种都可用于纯化本发明的FGF-21多肽：亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAE SEPHAROSE)；硅胶色谱；高效液相色谱(HPLC)；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)；差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；SDS-PAGE；或萃取。
根据所属领域的技术人员已知并使用的标准程序，可将本发明的蛋白质(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的肽、包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)部分或实质上纯化成均质。因此，可通过所属领域的技术人员已知的多种方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽，这些方法包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、外源凝集素色谱、凝胶电泳等。在制备正确折叠的成熟蛋白质时，必要时可使用蛋白质再折叠步骤。当需要高纯度时，在最后纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它合适的方法。在一个实施例中，使用针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质或肽)形成的抗体作为纯化试剂，从而(包括但不限于)用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质或肽的以亲和性为基础的纯化。必要时，在部分纯化或纯化成均质后，视情况将所述多肽用于多种应用，包括(但不限于)用作检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或用作抗体产生的免疫原。可通过使用常规方案向动物(优选非人类动物)投与本发明的多肽或带抗原决定基的片段或细胞来获得针对本发明的多肽而产生的抗体。所属领域的技术人员可使用多种已知技术来产生抗体。此外，可使用转基因小鼠或其它生物体(包括其它哺乳动物)来表达人源化抗体。可使用上述抗体来分离或鉴别表达多肽的克隆或纯化多肽。也可使用针对本发明的多肽而产生的抗体来治疗疾病。
本发明的多肽和多核苷酸也可用作疫苗。因此，另一方面，本发明涉及一种在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，其包含使哺乳动物接种足以产生抗体和/或T细胞免疫反应(例如包括产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞)的本发明多肽以保护所述动物免患疾病，而无论个体是否已产生所述疾病。也可用以下方法诱导哺乳动物中的免疫反应，所述方法包含：在活体内通过指导多核苷酸表达并编码多肽的载体传递本发明的多肽，以诱导所述免疫反应，从而产生抗体来保护所述动物免患本发明的疾病。一种投与载体的方式是以粒子上的涂层的形式或以其它形式使其加速进入所需细胞中。所述核酸载体可包含DNA、RNA、经修饰核酸或DNA/RNA杂合体。为用作疫苗，多肽或核酸载体通常将以疫苗调配物(组合物)形式提供。调配物可进一步包含合适的载剂。因为多肽可在胃中分解，所以其可肠外(例如，皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射)投与。适于肠外投与的调配物包括：水性和非水性的无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与接收者的血液等张的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂或增稠剂。疫苗调配物也可包括所属领域的技术人员已知的用于增强调配物的免疫原性的佐剂系统。剂量将视疫苗的特定活性而定并且可通过常规实验容易地确定。
除了本文中指出的其它参考文献外，所属领域的技术人员还已知多种纯化/蛋白质折叠方法，其包括(但不限于)以下文献中列出的那些：R.Scopes,Protein Purification.Springer-Verlag,N.Y.(1982)；Deutscher,Methods in Enzymology第182卷:Guide to Protein Purification,Academic Press,Inc.N.Y.(1990)；Sandana,(1997)Bioseparation of Proteins.Academic Press,Inc.；Bollag等人,(1996)Protein Methods,第2版,Wiley-Liss,NY；Walker,(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ；Harris和Angal,(1990)Protein Purification Applications:A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England；Harris和Angal,Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press atOxford,Oxford,England；Scopes,(1993)Protein Purification:Principles and Practice第3 版Springer Verlag,NY；Janson和Ryden,(1998)Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications,第2版,Wiley-VCH,NY；以及Walker(1998),Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJ；以及其中引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生所关注的具有非天然氨基酸的蛋白质或多肽的一个优点在于，所述蛋白质或多肽通常将折叠为其天然构象。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域的技术人员应认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质或肽可能具有与相关多肽所需的构象不同的构象。在本发明的一方面，视情况使所表达的蛋白质或多肽变性并且随后使其复性。这是利用所属领域中已知的方法来实现，所述方法包括(但不限于)向所关注的蛋白质或多肽中添加伴侣蛋白(chaperonin)、将蛋白质溶解于例如盐酸胍等离液剂中、利用蛋白质二硫化物异构酶等。
一般来说，有时需要使所表达的多肽变性和还原并且随后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到所关注的翻译产物中。所属领域的技术人员已知使蛋白质还原、变性和复性的方法(参看上述参考文献以及Debinski等人,(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585；以及Buchner等人,(1992)Anal.Biochem.,205:263-270)。例如，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。可在含有(包括(但不限于))氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲剂中使蛋白质再折叠。可使再折叠试剂流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或者可使一种或一种以上多肽或其它表达产物流动或以其它方式移动以与再折叠试剂接触。
在原核制备FGF-21多肽的情况下，如此产生的FGF-21多肽可能错误折叠并且因而缺乏生物活性或者生物活性降低。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般来说，通过使用(例如)一种或一种以上离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(其中FGF-21多肽也不可溶)、展开并还原多肽链而使错误折叠的FGF-21多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，随后添加氧化剂(例如，氧、胱氨酸或胱胺)，这允许再形成二硫键。可使用所属领域中已知的标准方法使FGF-21多肽再折叠，所述方法例如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的方法，所述文献是以引用的方式并入本文中。FGF-21多肽也可与其它蛋白质共折叠以形成异质二聚体或异质多聚体。
在再折叠之后，可进一步纯化FGF-21。可使用所属领域的技术人员已知的多种技术实现FGF-21的纯化，所述技术包括疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任何组合。其它纯化也可包括干燥或沉淀经纯化蛋白质的步骤。
在纯化后，可将FGF-21交换到不同缓冲液中和/或通过所属领域中已知的多种方法(包括(但不限于)透滤和透析)中的任一种使其浓缩。以单一纯化蛋白质形式提供的FGF-21可经历聚集和沉淀。
经纯化FGF-21可为至少90％纯(如由反相高效液相色谱(RP-HPLC)或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所测量)，或至少95％纯，或至少98％纯，或至少99％或更纯。无论FGF-21的纯度的确切数值如何，FGF-21对于用作医药产品或用于进一步处理(例如与例如PEG等水溶性聚合物接合)来说都是足够纯的。
在不存在其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等之外)的情况下，某些FGF-21分子可用作治疗剂，或其可与另一种蛋白质或聚合物复合。
一般纯化方法：可以任何适当顺序对包含FGF-21多肽的细胞溶菌液、提取物、培养基、包涵体、宿主细胞的周质空间、宿主细胞的细胞质或其它材料或由任何分离步骤得到的任何FGF-21多肽混合物进行多种分离步骤中的任一种，所述任何分离步骤包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复。
用于实施本文中所述的技术的设备和其它必要材料在市面上有售。泵、馏分收集器、监控器、记录器以及整个系统都可获自(例如)Applied Biosystems(Foster City,CA)、Bio-Rad Laboratories,Inc.(Hercules,CA)以及Amersham Biosciences,Inc.(Piscataway,NJ)。包括(但不限于)交换基质材料、培养基以及缓冲液的色谱材料也可获自这些公司。
使用专用设备(例如泵)可更迅速地实现平衡以及在本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤(例如洗涤和洗提)。市售泵包括(但不限于)泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及馏分收集器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。也可使用混合器来形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
可使用任何市售监控器来监控色谱过程。这些监控器可用于收集如UV、pH值和传导率的信息。检测器的实例包括监控器UV-1、S II、监控器UV-M II、监控器UV-900、监控器UPC-900、监控器pH/C-900以及传导率监控器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。实际上，整个系统都在市面上有售，其包括来自Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)的各种系统。
在本发明的一个实施例中，例如，可通过首先在尿素中使所得的经纯化FGF-21多肽变性，接着在合适的pH值下在含有还原剂(例如DTT)的TRIS缓冲液中稀释来还原FGF-21多肽并使其变性。在另一个实施例中，使FGF-21多肽以约2M到约9M的浓度范围在尿素中变性，接着在约5.0到约8.0的范围内的pH值下在TRIS缓冲液中稀释。随后可培育这个实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，再折叠混合物在室温下培育4小时到24小时。随后，可进一步分离或纯化经还原并变性的FGF-21多肽混合物。
如本文中所述，在进行任何后续分离步骤之前，可调节第一FGF-21多肽混合物的pH值。另外，可使用所属领域中已知的技术来浓缩第一FGF-21多肽混合物或其任何后续混合物。此外，可使用所属领域的技术人员已知的技术将包含第一FGF-21多肽混合物或其任何后续混合物的洗提缓冲液交换为适用于下个分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱：在一个实施例中，并且作为可选的额外步骤，可对第一FGF-21多肽混合物进行离子交换色谱。通常参看ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY:PRINCIPLES ANDMETHODS(目录号18-1114-21,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))。市售离子交换柱包括和柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。这些柱利用强阴离子交换剂，例如QFast Flow、QHighPerformance和QXL；强阳离子交换剂，例如SPHighPerformance、SPFast Flow和SPXL；弱阴离子交换剂，例如DEAEFast Flow；以及弱阳离子交换剂，例如CMFastFlow(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。可在纯化过程的任何阶段对FGF-21多肽进行阴离子或阳离子交换柱色谱以分离实质上经纯化的FGF-21多肽。可使用任何合适的阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。适用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述物质的复合物。
阳离子交换基质可为任何合适的阳离子交换剂，包括强阳离子交换剂和弱阳离子交换剂。强阳离子交换剂可能在宽pH值范围内保持离子化，并因此可能能够在宽pH值范围内与FGF-21结合。然而，弱阳离子交换剂可能随着pH值变化而丧失离子化。举例来说，当pH值降到约pH4或pH5以下时，弱阳离子交换剂可能失去电荷。合适的强阳离子交换剂包括(但不限于)带电官能团，例如磺丙基(SP)、甲基磺酰基(S)或磺乙基(SE)。阳离子交换基质可为优选具有约2.5到约6.0的FGF-21结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可具有约pH2.5到约pH5.5的FGF-21结合pH值范围。阳离子交换基质可为具有约3.0的FGF-21结合pH值的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可为优选具有约6.0到约8.0的FGF-21结合pH值范围的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可为优选具有约8.0到约12.5的FGF-21结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可具有约pH8.0到约pH12.0的FGF-21结合pH值范围。
在装载FGF-21之前，例如可使用多个柱体积的稀弱酸(例如，4个柱体积的20mM乙酸，pH3)来平衡阳离子交换基质。平衡后可添加FGF-21并且在洗提实质上经纯化的FGF-21之前，也可使用弱酸溶液(例如弱乙酸或磷酸溶液)将柱洗涤一到数次。举例来说，可使用约2-4个柱体积的20mM乙酸(pH3)来洗涤柱。例如，使用2-4个柱体积的0.05M乙酸钠(pH5.5)或使用与0.1M氯化钠混合的0.05M乙酸钠(pH5.5)进行其它洗涤。或者，使用所属领域中已知的方法，可使用多个柱体积的稀弱酸来平衡阳离子交换基质。
或者，可通过使阳离子交换剂基质与具有足够低的pH值或离子强度的缓冲液接触而置换基质中的FGF-21来洗提实质上经纯化的FGF-21。洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH6.0的范围内。更具体来说，洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH5.5、约pH2.5到约pH5.0的范围内。洗提缓冲液可具有约3.0的pH值。另外，洗提缓冲液的量可在较大范围内改变并且通常将在约2到约10个柱体积的范围内。
在使FGF-21多肽吸附到阳离子交换剂基质上之后，可通过使基质与具有足够高的pH值或离子强度的缓冲液接触而置换基质中的FGF-21多肽来洗提实质上经纯化的多肽。适用于实质上经纯化的FGF-21多肽的高pH值洗提的缓冲液可包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约100mM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES以及MES缓冲液。
反相色谱：可根据所属领域的技术人员已知的合适方案进行RP-PIPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人,ANAL BIOCHEM.(1982)124:217-230(1982)；Rivier等人,J.CHROM.(1983)268:112-119；Kunitani等人,J.CHROM.(1986)359:391-402。可对FGF-21多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的FGF-21多肽。关于这一点，可使用含有具有多种长度(包括(但不限于)至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约C18树脂)的烷基官能团的二氧化硅衍生的树脂。或者，可使用聚合树脂。举例来说，可使用TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合树脂。此外，可用例如乙醇等溶剂洗涤RP-HPLC柱。Source RP柱是RP-HPLC柱的另一个实例。
可使用含有离子配对剂和有机改质剂(例如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗提缓冲液从RP-HPLC柱洗提FGF-21多肽。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵和乙酸三乙基铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗提，其中优选减少分离时间并降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用两种具有不同溶剂浓度范围的梯度。适用于本文中的洗提缓冲液的实例可包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水性相互作用色谱纯化技术：可对FGF-21多肽进行疏水性相互作用色谱(HIC)。通常参看HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK:PRINCIPLES ANDMETHODS(目录号18-1020-90,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))，其是以引用的方式并入本文中。合适的HIC基质可包括(但不限于)经烷基或芳基取代的基质，例如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质以及混合模式树脂(包括(但不限于)聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水性相互作用柱色谱的市售来源包括(但不限于)和柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
简单地说，在装载之前，可使用所属领域的技术人员已知的标准缓冲液(例如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。硫酸铵可用作装载HIC柱的缓冲液。在装载FGF-21多肽后，随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以去除不需要的物质，但将FGF-21多肽留在HIC柱上。可用约3到约10个柱体积的标准缓冲液(例如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗提FGF-21多肽。也可使用例如使用磷酸钾梯度的降低的线性盐梯度来洗提FGF-21分子。随后，可例如通过过滤(例如透滤或超滤)来浓缩洗出液。可使用透滤来去除用于洗提FGF-21多肽的盐。
其它纯化技术：可对第一FGF-21多肽混合物或其任何后续混合物进行使用例如凝胶过滤(GEL FILTRATION:PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1022-18,AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，其是以引用的方式并入本文中)、羟基磷灰石色谱(合适的基质包括(但不限于)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、Bio-Gel HTP羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一分离步骤，以去除任何过量盐并且用合适的缓冲液来代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最终药物产品的调配。
可使用所属领域的技术人员已知的技术来监控本文中所述的各步骤中FGF-21多肽(包括实质上经纯化的FGF-21多肽)的产率。所述技术也可用于在最后分离步骤后分析实质上经纯化的FGF-21多肽的产率。举例来说，可使用多个具有多种烷基链长度的反相高压液相色谱柱(例如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC)中的任一种来监控FGF-21多肽的产率。
在本发明的特定实施例中，在各纯化步骤后FGF-21的产率可为各纯化步骤的起始物质中的FGF-21的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
可使用例如SDS-PAGE等标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA检定测量FGF-21多肽来测定纯度。举例来说，可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质产生多克隆抗体。所述抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由硅胶粒子组成，其表面带有C4烷基链。FGF-21多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水性相互作用强度的差异。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗提。使用不锈钢柱(填充2.8到3.2升Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液并且将其装载于Vydac C4柱上。使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗涤和洗提。收集洗提部分并且立即用磷酸盐缓冲液中和。汇集在IPC限度内的FGF-21多肽洗提部分。
DEAE Sepharose(Pharmacia)材料由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。通过离子性相互作用来介导FGF-21多肽与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在这些物质被洗掉之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱并且用具有增加的离子强度的缓冲液洗提FGF-21多肽。用DEAE Sepharose fast flow填充柱。调节柱体积以确保FGF-21多肽装载量在每毫升凝胶3-10mg FGF-21多肽的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)洗涤柱。装填HPLC洗出液的汇集洗提部分并且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，用洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/钾)从柱中洗提FGF-21多肽并根据主要洗提概况将其收集成单一洗提部分。将DEAE Sepharose柱的洗出液调节到指定传导率。将所得药物无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中并储存在-70℃下。
可使用的其它方法包括(但不限于)去除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性宿主细胞(例如，大肠杆菌)的外膜上的脂多糖(LPS)。所属领域的技术人员已知用于降低内毒素含量的方法，并且所述方法包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术；反相色谱；亲和色谱；尺寸排阻色谱；阴离子交换色谱；疏水性相互作用色谱；这些方法的组合等。可能需要修改或其它方法以从所关注的多肽中去除污染物(例如共迁移蛋白质)。所属领域的技术人员已知用于测量内毒素含量的方法，并且所述方法包括(但不限于)鲎变形细胞溶菌液(Limulus Amebocyte Lysate；LAL)检定。EndosafeTM-PTS检定为利用预装载LAL试剂、发色底物和对照标准内毒素的料筒以及手持式分光光度计的比色、单管系统。替代方法包括(但不限于)测量浊度并且使用96孔形式的动力学LAL方法。
可使用多种方法和程序来分析包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的FGF-21蛋白质的产率和纯度，所述方法包括(但不限于)Bradford检定、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱(包括(但不限于)MALDI-TOF)以及所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。
其它方法包括(但不限于)：与蛋白质染色方法组合的SDS-PAGE、免疫印迹法、基质辅助激光解吸附/离子化质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。
VIII.替代系统中的表达
已使用多种策略将非天然氨基酸引入非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或不含细胞的系统中的蛋白质中。这些系统也适用于制备本发明的FGF-21多肽。例如Lys、Cys和Tyr等具有反应性侧链的氨基酸的衍生使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。通过肽片段的酶促连接和天然化学连接的新近发展，有可能制造较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem,69:923(2000)。化学肽连接和天然化学连接描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO 02/098902和WO03/042235中，所述专利是以引用的方式并入本文中。已使用将利用所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制因子tRNA添加到能够支持蛋白质生物合成的活体外提取物中的通用活体外生物合成方法将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish,D.Mendel和P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed. Engl.1995,34:621(1995)；C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,Ageneral method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science244:182-188(1989)；以及J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosynthetic site-specific incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供研究蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导。
已开发被称作选择性压力并入的活体内方法以使用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder和R.Huber,FASEB J.,13:41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株在含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中生长，而靶基因的转录受到抑制。在静止生长期开始时，天然氨基酸被耗尽并且由非天然氨基酸类似物置换。对重组蛋白表达的诱导使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，并且其在UV光谱中显示两个可容易地鉴别的特征肩峰，例如参看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal. Biochem.,284:29(2000)；已使用三氟蛋氨酸来代替噬菌体T4溶菌酶中的蛋氨酸，从而通过19F NMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek,Biochemistry,36:3404(1997)；并且已并入三氟亮氨酸来代替亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed. Engl.,40:1494(2001)。此外，将硒代蛋氨酸和碲代蛋氨酸并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson,J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBO J.,9:1665(1990)；J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda和M.Hatada,Nat.Struct.Biol.,1:283(1994)；N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn,J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995)；以及N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder和R.Huber,J.Mol. Biol.,270:616(1997)。也已有效并入具有烯或炔官能团的蛋氨酸类似物，从而允许通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBS Lett.,428:68(1998)；J.C.M.van Hest,K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000)；以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案第2002/0042097号，其是以引用的方式并入本文中。
这种方法的成功取决于氨酰基tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。一种扩展这种方法的范围的方式在于放宽氨酰基tRNA合成酶的底物特异性，这已在有限数目的情况下达成。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置换Ala294可增加底物结合袋的尺寸，并且导致对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)使tRNAPhe酰化。参看，M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸来代替苯丙氨酸。例如参看M.Ibba和H.Hennecke,FEBS Lett.,364:272(1995)；以及N.Sharma,R.Furter,P.Kast和D.A.Tirrell,FEBS Lett.,467:37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser允许氮杂酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soil和S.Nishimura,J.Biol. Chem.,275:40324(2000)。
在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略是修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶无法区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸并且因此使其活化。此错误在单独位点上得到修正，这使来自tRNA的错配氨基酸去酰化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能并且被并入。目前已用缬氨酰基tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.de Crecy-Lagard,P.Schimmel和P.Marliere,Science,292:501(2001)。ValRS可利用Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)使tRNAVal错误氨酰基化；随后，通过编辑域水解这些非同源氨基酸。在使大肠杆菌染色体随机诱变之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。因为Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团是由Abu中的-CH3置换)，所以当这种突变大肠杆菌菌株在存在Abu的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质中的各缬氨酸位置处约24％的缬氨酸由Abu置换。
固相合成和半合成方法也已允许合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参看以下公开案和其中引用的如下参考文献：Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.General nature of the genetic code for proteins.Nature,192:1227-1232(1961)；Hofmann,K.,Bohn,H.Studies on polypeptides.XXXVI,The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptidefragment,J.Am Chem,88(24):5914-5919(1966)；Kaiser,E.T.Synthetic approaches tobiologically active peptides and proteins including enyzmes,Ace Chem Res,22:47-54(1989)；Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.Peptide segment coupling catalyzed by thesemisynthetic enzyme thiosubtilisin,J Am Chem Soc,109:3808-3810(1987)；Schnolzer,M.,Kent,S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIV protease,Science,256(5054):221-225(1992)；Chaiken,I.M.Semisynthetic peptides and proteins,CRC Crit Rev Biochem,11(3):255-301(1981)；Offord,R.E.Protein engineering by chemical means？Protein Eng.,1(3):151-157(1987)；以及Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.A Designed PeptideLigasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues,Science,266(5183):243(1994)。
已使用化学修饰在活体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参看Corey,D.R.,Schultz,P.G.Generation of a hybrid sequence-specificsingle-stranded deoxyribonuclease,Science,238(4832):1401-1403(1987)；Kaiser,E.T.,Lawrence D.S.,Rokita,S.E.The chemical modification of enzymatic specificity,Annu Rev Biochem,54:565-595(1985)；Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.Chemical mutation of enyzmeactive sites,Science,226(4674):505-511(1984)；Neet,K.E.,Nanci A,Koshland,D.E.Properties of thiol-subtilisin,J Biol.Chem,243(24):6392-6401(1968)；Polgar,L.et M.L.Bender,A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc,88:3153-3154(1966)；以及Pollack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introductionof nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites,Science,242(4881):1038-1040(1988)。
或者，使用以化学方式修饰的氨酰基tRNA的生物合成方法已用于将多种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Brunner,J.New Photolabeling and crosslinking methods,Annu.Rev Biochem,62:483-514(1993)；以及Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascentpreprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl. Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。
先前已显示，可通过向利用含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中添加以化学方式氨酰基化的抑制因子tRNA而在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可使用特定氨基酸的营养缺陷型菌株，用密切结构同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参看Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins,Science,244:182-188(1989)；M.W.Nowak等人,Science268:439-42(1995)；Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into apolypeptide,J.Am Chem Soc,111:8013-8014(1989)；N.Budisa等人,FASEB J.13:41-51(1999)；Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosyntheticmethod for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins,Methods in Enz.,第202卷,301-336(1992)；以及Mendel,D.,Cornish,V.W.和Schultz,P.G.Site-DirectedMutagenesis with an Expanded Genetic Code,Annu Rev Biophvs.Biomol Struct.24,435-62(1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制因子tRNA并且用非天然氨基酸以化学方式使其氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'Exonuclease inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis,Nucleic Acids Res,16(3):791-802(1988)。当将酰基化抑制因子tRNA和突变基因组合到活体外转录/翻译系统中时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸，这得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验以及使用α-羟基酸的实验证实，在由UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白质中的任何其它位点处并入。例如参看Noren等人,同上文；Kobayashi等人,(2003)Nature Structural Biology 10(6):425-432；以及Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specific incorporation of novel backbonestructures into proteins,Science,255(5041):197-200(1992)。
可通过任何方法或技术(包括(但不限于)化学或酶促氨酰基化)利用所需氨基酸使tRNA氨酰基化。
可通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶促分子(包括(但不限于)核糖酶)来实现氨酰基化。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。Cech和同事(Cech,1987,Science,236:1532-1539；McCorkle等人,1987,Concepts Biochem.64:221-226)证实存在可充当催化剂的天然存在RNA(核糖酶)。然而，尽管仅证实这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物具有裂解和剪接作用，但关于核糖酶人工开发的新近发展已将催化谱系扩大到各种化学反应。研究已鉴别出可催化自身(2')3'末端的氨酰基RNA键的RNA分子(Illangakekare等人,1995Science 267:643-647)，以及可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个RNA分子的RNA分子(Lohse等人,1996,Nature 381:442-444)。
美国专利申请公开案2003/0228593(其是以引用的方式并入本文中)描述构建核糖酶的方法和其在利用天然编码和非天然编码氨基酸使tRNA氨酰基化中的用途。可使tRNA氨酰基化的酶分子(包括(但不限于)核糖酶)的底物固定形式使得能够有效地亲和纯化氨酰基化产物。合适的底物的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。用于氨酰基化的底物固定形式的核糖酶的制备和使用描述于Chemistry and Biology 2003,10:1077-1084以及美国专利申请公开案2003/0228593中，其是以引用的方式并入本文中。
化学氨酰基化方法包括(但不限于)避免在氨酰基化过程中使用合成酶的由Hecht和同事(Hecht,S.M.Ace.Chem.Res.1992,25,545；Heckler,T.G.；Roesser,J.R.；Xu,C；Chang,P.；Hecht,S.M.Biochemistry 1988,27,7254；Hecht,S.M.；Alford,B.L.；Kuroda,Y.；Kitano,S.J.Biol.Chem.1978,253,4517)以及由Schultz、Chamberlin、Dougherty和其它人(Cornish,V.W.；Mendel,D.；Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621；Robertson,S.A.；Ellman,J.A.；Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722；Noren,C.J.；Anthony-Cahill,S.J.；Griffith,M.C；Schultz,P.G.Science 1989,244,182；Bain,J.D.；Glabe,C.G.；Dix,T.A.；Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013；Bain,J.D.等人,Nature 1992,356,537；Gallivan,J.P.；Lester,H.A.；Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740；Turcatti等人,J.Biol.Chem.1996,271,19991；Nowak,M.W.等人,Science,1995,268,439；Saks,M.E.等人,J.Biol.Chem.1996,271,23169；Hohsaka,T.等人,J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)(其是以引用的方式并入本文中)介绍方法。所述方法或其它化学氨酰基化方法可用于使tRNA分子氨酰基化。
产生催化性RNA的方法可涉及产生单独的随机核糖酶序列的池，对所述池进行定向演化，针对所需氨酰基化活性筛选所述池，并且选择显示所需氨酰基化活性的核糖酶序列。
核糖酶可包含促进酰化活性的基元和/或区域，例如GGU基元和富含U的区域。举例来说，已报导富含U的区域可促进氨基酸底物的识别，并且GGU基元可与tRNA的3'末端形成碱基对。GGU基元和富含U的区域的组合促进氨基酸与tRNA的同时识别，并且从而促进tRNA的3'末端的氨酰基化。
可通过使用与tRNAAsn CCCG接合的部分随机化r24mini进行活体外选择，接着系统性工程改造在活性克隆中发现的一致序列来产生核糖酶。由这种方法获得的例示性核糖酶被称作“Fx3核糖酶”并且描述于美国公开申请案第2003/0228593号(其内容是以引用的方式并入本文中)中，其充当合成各种装载有同源非天然氨基酸的氨酰基tRNA的通用催化剂。
在底物上固定可用于促成氨酰基化tRNA的有效亲和性纯化。合适的底物的实例包括(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。可利用RNA的化学结构将核糖酶固定在树脂上，例如，可用高碘酸盐氧化RNA核糖上的3'-顺式二醇以产生相应的二醛，从而促进RNA在树脂上的固定。可使用各种类型的树脂(包括廉价的酰肼树脂)，其中还原性胺化使树脂与核糖酶之间的相互作用产生不可逆键联。可通过这项柱上氨酰基化技术显著促进氨酰基tRNA的合成。Kourouklis等人,Methods 2005；36:239-4描述一种以柱为基础的氨酰基化系统。
可以多种方式实现氨酰基化tRNA的分离。一种合适的方法是用缓冲液从柱中洗提氨酰基化tRNA，所述缓冲液例如具有10mM EDTA的乙酸钠溶液、含有50mM N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH 7.0)、10mM EDTA的缓冲液或简单经EDTA缓冲的水(pH7.0)。
可将氨酰基化tRNA添加到翻译反应中以便将使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻译反应所产生的多肽中的所选位置中。可使用本发明的氨酰基化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶菌液。细胞溶菌液提供由所输入的mRNA活体外翻译多肽所必需的反应组分。所述反应组分的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始和延伸因子以及与翻译相关的其它因子。另外，翻译系统可为分批翻译或间隔翻译(compartmentalized translation)。分批翻译系统将反应组分组合到单一隔室中，而间隔翻译系统将翻译反应组分与可抑制翻译效率的反应产物分隔开。这些翻译系统在市面上有售。
此外，可使用偶合转录/翻译系统。偶合转录/翻译系统允许将所输入的DNA转录为相应mRNA，而所述mRNA又由反应组分进行翻译。市售偶合转录/翻译的实例为RapidTranslation System(RTS,Roche Inc.)。所述系统包括含有大肠杆菌溶菌液的混合物以提供例如核糖体和翻译因子等翻译组分。另外，还包括RNA聚合酶以将所输入DNA转录为mRNA模板以用于翻译。RTS可经由反应隔室(包括供应/消耗隔室和转录/翻译隔室)之间插入的膜来分隔反应组分。
可由其它试剂(包括(但不限于)转移酶、聚合酶、催化抗体、多功能蛋白质等)进行tRNA的氨酰基化。
Stephan在Scientist,2005年10月10日；第30-33页中描述将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的其它方法。Lu等人在Mol Cell.2001年10月；8(4)；759-69中描述一种以化学方式使蛋白质与含有非天然氨基酸的合成肽化学连接(经表达的蛋白质连接)的方法。
也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Science,268:439(1995)；以及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)。将爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)与活体外产生的以下两种RNA物质共同注射：在所关注的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码标靶蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制因子tRNA。随后，卵母细胞的翻译机构将非天然氨基酸插入由UAG指定的位置处。这种方法已允许通常不适用于活体外表达系统的整体膜蛋白的活体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移来测量距离，例如参看G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel和A.Chollet,J.Biol.Chem.,271:19991(1996)；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参看J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.Biol.,4:739(1997)；使用笼化的酪胺酸类似物以实时监控离子通道中的构象变化，例如参看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Neuron,20:619(1998)；以及使用α羟基氨基酸以改变用于探究其门控机制的离子通道主链。例如，参看P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Cell,96:89(1999)；以及T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz和J.Yang,Nat.Neurosci4:239(2001)。
在活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供多种优点，其包括(但不限于)突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白在治疗性治疗和诊断使用中的使用。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性以及其它性质的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展理性并系统性地操纵蛋白质结构的能力，从而探究蛋白质功能并且产生具有新颖性质的新蛋白质或生物体。
在位点特异性地并入para-F-Phe的一次尝试中，将酵母琥珀抑制因子tRNAPheCUA/苯丙氨酰基tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参看R.Furter,Protein Sci.,7:419(1998)。
使用不含无细胞的(活体外)翻译系统获得本发明的FGF-21多核苷酸的表达也为是可能的。翻译系统可为细胞或无细胞翻译系统细胞性或不含细胞，并且可为原核或真核翻译系统。细胞翻译系统包括(但不限于)其中可将所需核酸序列可经转录为mRNA并且翻译所述mRNA经翻译的全细胞制剂，例如渗透细胞或细胞培养物。不含无细胞的翻译系统在市面上有售，并且众所周知许多不同的类型和系统。不含无细胞的系统的实例包括(但不限于)原核细胞溶菌液，例如大肠杆菌溶菌液；以及真核细胞溶菌液，例如麦芽提取物、昆虫细胞溶菌液、兔网织红细胞网状细胞溶菌液、兔卵母细胞溶菌液和人类细胞溶菌液。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或以其它方式经修饰时，可优选真核细胞提取物或溶菌液，这是因为许多所述修饰只可能在真核系统中发生。一些所述提取物和溶菌液在市面上有售(Promega；Madison,Wis.；Stratagene；La Jolla,Calif.；Amersham；Arlington Heights,Ill.；GIBCO/BRL；Grand Island,N.Y.)。也可用膜提取物(例如含有微粒体膜的犬胰腺提取物)，其适用于翻译分泌蛋白。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或包括DNA作为模板(组合型活体外转录和翻译)的这些系统中，由核糖体指导活体外合成。已进行相当多的尝试来开发无细胞的蛋白质表达系统。例如参看Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,74:309-316(2001)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology Letters,22,1537-1542,(2000)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology Progress,16,385-390,(2000)；Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology andBioengineering,66,180-188,(1999)；以及Patnaik,R.和J.R.Swartz,Biotechniques 24,862-868,(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353；WO 90/05785，其是以引用的方式并入本文中。另一种可用于表达包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽的方法包括mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94:12297-12302(1997)；A.Frankel等人,Chemistry&Biology 10:1043-1050(2003)。在这种方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)连接的mRNA模板翻译为肽。如果已对一种或一种以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子之后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽接合物在活体外检定中具有引人关注的性质，那么易于由mRNA序列揭示其特性。用这种方式，可筛选包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的FGF-21多肽的文库，以鉴别具有所需性质的多肽。最近，已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100:6353(2003)。
也可使用重构翻译系统。已成功地使用经纯化翻译因子的混合物以及溶菌液或补充有经纯化翻译因子(例如起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因子T(EF-Tu)或终止因子)的溶菌液的组合将mRNA翻译为蛋白质。无细胞系统也可为偶合转录/翻译系统，其中如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,WileyInterscience,1993)(其以引用的方式特别并入本文中)中所述，将DNA引入所述系统中，转录成mRNA并翻译所述mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可为异核RNA(hnRNA)或5'端戴帽(7-甲基鸟苷)和3'端加聚腺苷酸尾的成熟mRNA的形式，其在某些翻译系统中可为优点。举例来说，在网织红细胞溶菌液系统中，以高效率翻译戴帽的mRNA。
IX.与FGF-21多肽偶合的大分子聚合物
可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上，所述官能团包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米传递素；放射性核苷酸；放射性传递素；中子俘获剂；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。作为本文中所述的组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将集中在将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽上，同时应了解，相关的组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时适当修饰，并且所属领域的技术人员可用本文中的揭示内容进行)添加其它官能团(包括(但不限于)上文列出的官能团)。
多种大分子聚合物和其它分子可与本发明的FGF-21多肽连接以调节FGF-21多肽的生物性质和/或对FGF-21分子提供新颖的生物性质。这些大分子聚合物可通过天然编码氨基酸、通过非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团与FGF-21多肽连接。聚合物的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
本发明提供实质上均质的聚合物:蛋白质接合物的制剂。如本文中所用，“实质上均质”意思是观察到聚合物:蛋白质接合物分子大于总蛋白质的一半。所述聚合物:蛋白质接合物具有生物活性并且本文中提供的本发明的“实质上均质”的聚乙二醇化FGF-21多肽制剂为足够均质以致显示均质制剂的优点(例如，易于在临床应用中预测各批次之间的药物动力学)的制剂。
也可选择制备聚合物:蛋白质接合物分子的混合物，并且本文中提供的优点在于可选择包括在素数混合物中的单一聚合物:蛋白质接合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数目的所连接的聚合物部分(即，二、三、四等)的混合物，并且将所述接合物与使用本发明的方法制备的单一聚合物:蛋白质接合物组合，并获得具有预定的单聚合物:蛋白质接合物比例的混合物。
所选聚合物可为水溶性的，以致其所连接的蛋白质在水性环境(例如生理环境)中不沉淀。聚合物可为分枝或未分枝的。对于最终产品制剂的治疗性使用来说，聚合物将为医药学上可接受的。
聚合物的实例包括(但不限于)聚烷基醚和其经烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、聚氧乙二醇/丙二醇以及其经甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其聚氧乙二醇，后者也被称作聚乙二醇(polyethyleneglycol)或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚羟基烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；聚糖和其衍生物，其包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如，羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如，羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素；几丁质和其衍生物，例如，壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如，聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，例如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；以及上述物质的衍生物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将改变，其在反应混合物中的浓度也将改变。一般来说，可通过所选聚乙二醇的分子量和可提供的可用反应性基团的数目来确定最佳比率(就存在最小过量的未反应蛋白质或聚合物的反应的效率来说)。当涉及分子量时，通常聚合物的分子量越高，可与蛋白质连接的聚合物分子的数目就越少。类似地，当优化这些参数时，应将聚合物的分枝考虑在内。通常，分子量越高(或支链越多)，聚合物:蛋白质比率就越高。
如本文中所用，并且当涵盖PEG:FGF-21多肽接合物时，术语“治疗有效量”是指使患者得到所需益处的量。所述量将随个体而变化并且将视多种因素而定，包括患者的整体身体状况和欲治疗病状的潜伏病因。用于疗法的FGF-21多肽的量提供可接受的变化速率并且将所需反应维持在有益水平上。所属领域的技术人员使用可公开获得的材料和程序可容易地确定本发明组合物的治疗有效量。
水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、分叉或分枝形式。水溶性聚合物通常为聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG))，但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG来描述本发明的某些实施例。
PEG为众所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根据所属领域的技术人员已知的方法(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,第3卷,第138-161页)通过乙二醇的开环聚合来制备。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子而不用考虑PEG的尺寸或其末端的修饰，并且可由下式表示为与FGF-21多肽连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y，
其中n为2到10,000并且X为H或末端修饰，其包括(但不限于)C1-4烷基、保护基或末端官能团。
在一些情况下，本发明中所用的PEG在一端以羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与20种常见氨基酸中所见的官能团反应的反应性基团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、活化碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、活化酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性、但与非天然编码氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意，PEG的另一端(在上式中由Y表示)将与FGF-21多肽直接连接或通过天然存在或非天然编码氨基酸间接与FGF-21多肽连接。举例来说，Y可为与多肽的胺基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N末端)连接的酰胺键联、氨基甲酸酯键联或尿素键联。或者，Y可为与硫醇基团(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基团)连接的马来酰亚胺键联。或者，Y可为与通过20种常见氨基酸通常不可接近的残基连接的键联。举例来说，PEG上的叠氮基可与FGF-21多肽上的炔基反应以形成休斯根[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮基反应以形成类似产物。在一些实施例中，强亲核试剂(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码氨基酸中存在的醛或酮基反应以形成腙、肟或缩氨基脲，在一些情况下，适当时可通过由适当还原剂处理而进一步还原腙、肟或缩氨基脲。或者，强亲核试剂可通过非天然编码氨基酸并入FGF-21多肽中并且可用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基反应。
可按照实际需要使用任何分子质量的PEG，所述分子质量视需要包括(但不限于)约100道尔顿(Dalton；Da)到100,000Da或100,000Da以上(包括(但不限于)有时为0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。PEG可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG介于约10,000Da与约40,000Da之间。也可使用支链PEG，其包括(但不限于)各链具有在1-100kDa(包括(但不限于)1-50kDa或5-20kDa)范围内的MW的PEG分子。支链PEG的各链的分子量可(包括但不限于)介于约1,000Da与约100,000Da或100,000Da之间。支链PEG的各链的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。多种PEG分子描述于(包括但不限于)Shearwater Polymers,Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，所述目录以引用的方式并入本文中。
通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，可使用具有与氨基酸侧链反应的炔基和叠氮部分的PEG衍生物来使PEG与如本文中所述的非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包含叠氮基，那么PEG通常将含有炔部分以实现[3+2]环加成产物的形成，或含有膦基的活化PEG物质(即，酯、碳酸酯)以实现酰胺键形成。或者，如果非天然编码氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有实现叠氮部分以实现[3+2]休斯根环加成产物的形成。如果非天然编码氨基酸包含羰基，那么PEG通常将分别包含有效亲核试剂(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以实现相应腙、肟和缩氨基脲键的形成。在其它替代方案中，可使用上述反应性基团的相反定向，即，可使非天然编码氨基酸中的叠氮部分与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施例中，具有PEG衍生物的FGF-21多肽变异体含有可与非天然编码氨基酸侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。
在一些实施例中，本发明提供含叠氮基和乙炔的聚合物衍生物，其包含具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚乙二醇。然而，应了解包括(但不限于)聚乙二醇和其它相关聚合物(包括聚葡聚糖和聚丙二醇)的多种水溶性聚合物也适用于实施本发明，并且术语PEG或聚乙二醇的使用打算涵盖并且包括所有这些分子。术语PEG包括(但不限于)呈任何形式的聚乙二醇，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、支链PEG、侧接PEG(即具有一个或一个以上侧接到聚合物主链上的官能团的PEG或相关聚合物)或具有可降解键联的PEG。
PEG通常为透明、无色、无味的，可溶于水中，对热稳定，对许多化学试剂呈惰性，不水解或变质，并且通常无毒。认为聚乙二醇为生物相容性的，也就是说PEG能够与活组织或生物体共存而不引起危害。更具体来说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与体内具有一些所要功能的分子(例如生物活性剂)连接时，PEG倾向于掩蔽所述试剂并且可减少或消除任何免疫反应，从而使生物体可耐受所述试剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质免疫反应或引起凝血或其它不需的作用。具有式-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-(其中n为约3到约4000，通常约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，具有约800Da到约100,000Da的分子量的PEG尤其适于用作聚合物主链。PEG的分子量可具有宽范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。PEG的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
聚合物主链可为线性或分枝的。所属领域中通常已知分枝聚合物主链。通常，分枝聚合物具有一个中心分枝核心部分和多个与中心分枝核心连接的线性聚合物链。PEG通常以分枝形式使用，所述形式可通过将氧化乙烯添加到各种多元醇(例如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇以及山梨糖醇)上来制备。中心分枝部分也可源自多种氨基酸(例如赖氨酸)。分枝聚乙二醇可以一般形式R(-PEG-OH)m表示，其中R是源自例如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇等核心部分，并且m表示臂的数目。多臂PEG分子(例如在美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596；WO 96/21469；以及WO 93/21259中所述的多臂PEG分子，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中)也可用作聚合物主链。
分枝PEG也可为由PEG(-YCHZ2)n表示的分叉PEG形式，其中Y为连接基团并且Z为通过规定长度的原子链与CH连接的活化末端基团。
另一种分枝形式侧接PEG沿PEG主链而不是在PEG链的末端处具有例如羧基等反应性基团。
除这些PEG形式之外，也可制备主链中具有弱键联或可降解键联的聚合物。举例来说，可制备聚合物主链中具有经受水解作用的酯键联的PEG。如下文所示，这一水解作用使聚合物裂解为较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
所属领域的技术人员应了解，术语聚乙二醇或PEG表示或包括所属领域中已知的所有形式，其包括(但不限于)在本文中所揭示的形式。
许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。合适的聚合物的实例包括(但不限于)其它聚烷二醇，例如聚丙二醇(“PPG”)、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等。尽管聚合物主链的各链的分子量可改变，但其通常在约800Da到约100,000Da、通常约6,000Da到约80,000Da的范围内。聚合物主链的各链的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链的各链的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
所属领域的技术人员应认识到，实质上水溶性主链的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性，并且预期具有上述性质的所有聚合物材料都适用于本发明中。
在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能的”，意思是聚合物主链具有至少两个经官能团官能化或活化的末端并且可能具有多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，其中各末端与可相同或不同的官能团键结。
在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X—A—POLY—B—N＝N＝N，
其中：
N＝N＝N为叠氮部分；
B为连接部分，其可存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原聚合物；
A为连接部分，其可存在或不存在并且其可与B相同或不同；并且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有多达18个并且可含有1-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括例如氮、氧或硫等杂原子。烷基链也可在杂原子处分枝。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有多达10个并且可含有5-6个碳原子的多官能芳基。芳基的一个或一个以上碳原子可经氮、氧或硫原子取代。合适的连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的连接基团，所述文献各自以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到，连接部分的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性，并且预期具有上述性质的所有连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(例如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。所属领域的技术人员应了解，所选X部分应与叠氮基相容以使得不与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为同双官能的，意思是第二官能团(即，X)也是叠氮部分；或为异双官能的，意思是第二官能团为不同的官能团。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下发生反应的保护基或保护部分。保护基应视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团是胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苄基或例如甲基、乙基或叔丁基等烷基。所属领域中已知的其它保护基也可用于本发明中。
文献中末端官能团的特定实例包括(但不限于)碳酸N-琥珀酰亚胺酯(例如参看美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参看Buckmann等人,Makromol.Chem.182:1379(1981)；Zalipsky等人,Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如参看Andresz等人,Makromol.Chem.179:301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯和丁酸琥珀酰亚胺酯(例如参看Olson等人,Poly(ethylene glycol)Chemistry&Biological Applications,第170-181页,Harris和Zalipsky编,ACS,Washington,D.C.,1997；也参看美国专利第5,672,662号)、琥珀酸琥珀酰亚胺酯(例如参看Abuchowski等人,Cancer Biochem.Biophys.7:175(1984)以及Joppich等人,Makromol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亚胺酯(例如参看美国专利第4,670,417号)、碳酸苯并三唑酯(例如参看美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(例如参看Pitha等人,Eur.J Biochem.94:11(1979)；Elling等人,Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧羰基咪唑(例如参看Beauchamp等人,Anal.Biochem.131:25(1983)；Tondelli等人,J.Controlled Release 1:251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看Veronese等人,Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985)；以及Sartore等人,Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991))、醛(例如参看Harris等人,J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984)；美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参看Goodson等人,Biotechnology(NY)8:343(1990)；Romani等人,Chemistry of Peptides and Proteins 2:29(1984))；以及Kogan,Synthetic Comm.22:2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(例如参看Woghiren等人,Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如参看Sawhney等人,Macromolecules,26:581(1993))、乙烯基砜(例如参看美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。
在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-N＝N＝N，
其中：
X为如上所述的官能团；并且
n为约20到约4000。
在另一个实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-W-N＝N＝N，
其中：
W为包含1-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接部分；
n为约20到约4000；并且
X为如上所述的官能团，m介于1与10之间。
可通过所属领域中已知和/或本文中所揭示的多种方法来制备本发明的含叠氮基的PEG衍生物。在下文展示的一种方法中，具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适的离去基键结的第二末端)与叠氮基阴离子(其可与多种合适的抗衡离子(包括钠、钾、叔丁基铵等)中的任一种配对)反应。离去基经历亲核置换并且由叠氮部分置换，从而得到所需的含叠氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3。
如上所示，适用于本发明的聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚乙二醇并且X为不与叠氮基反应的官能团，并且L为合适的离去基。合适的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶以及酮。合适的离去基的实例包括(但不限于)氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根以及甲苯磺酸根。
在另一种制备本发明的含叠氮基的聚合物衍生物的方法中，使具有叠氮基官能团的连接剂与具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链接触，其中连接剂具有将与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应的化学官能团，以形成含叠氮基的聚合物衍生物产物，其中叠氮基是通过连接基团与聚合物主链分隔开。
例示性反应流程展示如下：
X-PEG-M+N-连接子-N＝N＝N→PG-X-PEG-连接子-N＝N＝N，
其中：
PEG为聚乙二醇并且X为例如烷氧基等封端基团或如上所述的官能团；并且
M为不可与叠氮基官能团反应、但可与N官能团有效且选择性反应的官能团。
合适的官能团的实例包括(但不限于)：如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核基团，那么M为离去基。
可由已知方法(包括(但不限于)沉淀产物，必要时接着进行色谱)实现粗产物的纯化。
下文展示在PEG二胺的情况下的更特定实例，其中一个胺经例如叔丁基-Boc等保护基部分保护并且所得单保护的PEG二胺与具有叠氮基官能团的连接部分反应：
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N＝N＝N。
在这种情况下，可使用多种活化剂(例如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂以及N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)使胺基与羧酸基团偶合以在单胺PEG衍生物与具有叠氮基的连接部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键之后，所得经N-叔丁基-Boc-保护的含叠氮基的衍生物可直接用于修饰生物活性分子，或其可进一步经精细修饰以安装其它适用的官能团。举例来说，可通过用强酸处理使N-t-Boc基团水解以产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。可使用所得胺作为合成把手(synthetic handle)来安装其它适用的官能团(例如马来酰亚胺基团、活化二硫化物、活化酯等)以产生有价值的异双官能试剂。
当需要将不同分子与聚合物的各末端连接时，异双官能衍生物尤其有用。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG将允许具有活性亲电子基团(例如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等)的分子与PEG的一个末端连接，并且将允许具有乙炔基团的分子与PEG的另一个末端连接。
在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：
X—A—POLY—B—C≡C-R，
其中：
R可为H或烷基、烯烃、烷氧基或芳基或经取代芳基；
B为连接部分，其可存在或不存在；
POLY为水溶性非抗原性聚合物；
A为连接部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；并且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有多达18个且可含有1-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括例如氮、氧或硫等杂原子。烷基链也可在杂原子处分枝。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有多达10个并且可含有5-6个碳原子的多官能芳基。芳基的一个或一个以上个碳原子原子可经氮、氧或硫原子取代。合适的连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的连接基团，所述文献各自以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到，连接部分的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性，并且预期具有上述性质的多种连接部分适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(例如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃、酮以及乙炔。应了解，所选X部分应与乙炔基相容以使得不与乙炔基发生反应。含乙炔的聚合物衍生物可为同双官能的，意思是第二官能团(即，X)也是乙炔部分，或异双官能的，意思是第二官能团是不同的官能团。
在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：
X—CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH，
其中：
X为如上所述的官能团；
n为约20到约4000；并且
m介于1与10之间。
各异双官能PEG聚合物的特定实例展示如下。
可使用所属领域的技术人员已知和/或本文中所揭示的方法来制备本发明的含乙炔的PEG衍生物。在一种方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适的亲核基团键结的第二末端)与具有乙炔官能团和适于与PEG上的亲核基团反应的离去基的化合物反应。当具有亲核部分的PEG聚合物与具有离去基的分子组合时，离去基经历亲核置换并且由亲核部分置换，从而得到所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR'。
如上所示，用于反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚乙二醇，Nu为亲核部分并且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括(但不限于)主要通过SN2型机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基团的其它实例包括主要通过亲核加成反应来反应的官能团。L基团的实例包括氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根和甲苯磺酸根和预期经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯基和预期经历亲核试剂加成的其它亲电子基团。
在本发明的另一个实施例中，A为具有1-10个碳原子的脂肪族连接子或具有6-14个碳原子的经取代芳环。X为不与叠氮基反应的官能团，并且L为合适的离去基。
在另一种用于制备本发明的含乙炔的聚合物衍生物的方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量、在一个末端上具有经保护官能团或封端剂并且在另一个末端上具有合适的离去基的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。
例示性反应流程展示如下：
X-PEG-L+-C≡CR'→X-PEG-C≡CR'，
其中：
PEG为聚乙二醇并且X为例如烷氧基等封端基团或如上所述的官能团；并且
R'为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上文实例中，当与足够浓度的乙炔阴离子接触时，离去基L应充分反应以经历SN2型置换反应。所属领域的技术人员已知由乙炔阴离子实现离去基的SN2置换所需的反应条件。
通常可由所属领域中已知的方法(包括(但不限于)沉淀产物，必要时接着进行色谱)来实现粗产物的纯化。
水溶性聚合物可与本发明的FGF-21多肽连接。水溶性聚合物可通过并入FGF-21多肽中的非天然编码氨基酸或非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基或添加到非天然编码或天然编码氨基酸中的任何官能团或取代基连接。或者，水溶性聚合物是通过天然存在氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基)与并有非天然编码氨基酸的FGF-21多肽连接。在一些情况下，本发明的FGF-21多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)连接。在一些情况下，本发明的FGF-21多肽进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上与水溶性聚合物连接的天然编码氨基酸。在一些情况下，本发明的FGF-21多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸以及一个或一个以上与水溶性聚合物连接的天然存在氨基酸。在一些实施例中，相对于未接合形式，本发明中所用的水溶性聚合物增强FGF-21多肽的血清半衰期。
可调节与本发明的FGF-21多肽连接的水溶性聚合物的数目(即，聚乙二醇化或糖基化程度)以提供改变(包括(但不限于)增加或降低)的药理学、药物动力学或药效特征，例如活体内半衰期。在一些实施例中，FGF-21的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少约100倍。
含有强亲核基团(即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物
在本发明的一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000并且X视情况为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000。
在本发明的另一个实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的FGF-21多肽。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在一些实施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000并且X视情况为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000。
在本发明的另一个实施例中，用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的FGF-21多肽，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且可为5-20kDa的MW。
在本发明的另一个实施例中，用具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽。举例来说，在一些实施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000，并且X视情况为可存在或不存在的羰基(C＝O)。
在一些实施例中，含有氨基脲基团的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10并且n为100-1,000。
在一些实施例中，含有羟胺基团的PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10并且n为100-1,000。
水溶性聚合物与FGF-21多肽连接的程度和位点可调节FGF-21多肽与FGF-21多肽受体的结合。在一些实施例中，安置各键联，使得FGF-21多肽以通过平衡结合检定(例如在Spencer等人,J.Biol.Chem.,263:7862-7867(1988)中关于FGF-21所述)所测量约400nM或400nM以下的Kd、以150nM或150nM以下的Kd并且在一些情况下以100nM或100nM以下的Kd与FGF-21多肽受体结合。
用于聚合物活化以及肽接合的方法和化学描述于文献中并且在所属技术领域中为已知的。聚合物活化的常用方法包括(但不限于)用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物(biepoxide)、表氯醇(epichlorohydrin)、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团。(参看R.F.Taylor,(1991),PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS,Marcel Dekker,N.Y.；S.S.Wong,(1992),CHEMISTRY OFPROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING,CRC Press,Boca Raton；G.T.Hermanson等人,(1993),IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES,Academic Press,N.Y.；Dunn,R.L.等人编,POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,ACS Symposium Series,第469卷,American Chemical Society,Washington,D.C.1991)。
可获得关于PEG的官能化和接合的若干概述和专论。例如，参看Harris,Macromol.Chem.Phys.C25:325-373(1985)；Scouten,Methods in Enzymology 135:30-65(1987)；Wong等人,Enzyme Microb.Technol 14:866-874(1992)；Delgado等人,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304(1992)；Zalipsky,Bioconjugate Chem.6:150-165(1995)。
活化聚合物的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO 94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO 90/13540、美国专利第5,281,698号和WO 93/15189中，且使活化聚合物与酶接合的方法可见于以下对应不同酶的参考文献中，所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人,App.Biochem.Biotech.11:141-52(1985))。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。
通过任何便利方法来进行含有非天然编码氨基酸(例如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的FGF-21多肽的聚乙二醇化(即，添加任何水溶性聚合物)。举例来说，用经炔封端的mPEG衍生物使FGF-21多肽聚乙二醇化。简单地说，在室温下在搅拌下向含对叠氮基-L-Phe的FGF-21多肽的水溶液中添加过量固体mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH。通常，用具有接近进行反应的pH值(通常pH值约为4-10)的pKa的缓冲液缓冲水溶液。例如，适于在pH 7.5下聚乙二醇化的缓冲液的实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。必要时，连续监控并调节pH值。通常使反应持续进行约1-48小时。
随后，使反应产物经受疏水性相互作用色谱，以使聚乙二醇化FGF-21多肽变异体与游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH以及当在分子的两端使未阻断PEG活化从而使FGF-21多肽变异体分子交联时可形成的聚乙二醇化FGF-21多肽的任何高分子量复合物分离开来。疏水性相互作用色谱期间的条件应使得游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流过柱，而任何交联的聚乙二醇化FGF-21多肽变异体复合物则在实现所需形式后洗提出来，所需形式含有一个与一个或一个以上PEG基团接合的FGF-21多肽变异体分子。合适的条件视交联复合物相对于所需接合物的相对大小而改变，并且易于由所属领域的技术人员确定。通过超滤来浓缩含有所需接合物的洗出液且通过透滤使其脱盐。
必要时，可由所属领域的技术人员已知的一种或一种以上程序进一步纯化获自疏水性色谱的聚乙二醇化FGF-21多肽，所述程序包括(但不限于)亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAE琼脂糖凝胶)；硅胶色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)；差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；或萃取。可通过与球状蛋白质标准物(Preneta,AZ,PROTEIN PURIFICATION METHODS,A PRACTICAL APPROACH(Harris和Angal编)IRL Press 1989,293-306)进行比较由GPC来估算表观分子量。可通过蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)，接着质谱分析来分析FGF-21-PEG接合物的纯度。Pepinsky RB.等人,J,Pharmcol.&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)。
与本发明的FGF-21多肽的氨基酸连接的水溶性聚合物可进一步不受限制地衍生或经取代。
含叠氮基的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中，用含有叠氮部分的PEG衍生物修饰FGF-21多肽，所述叠氮部分将与非天然编码氨基酸侧链上存在的炔部分反应。一般来说，PEG衍生物将具有在1-100kDa范围内并且在一些实施例中在10-40kDa范围内的平均分子量。
在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在另一实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在本发明的另一个实施例中，用含有末端叠氮部分的分枝PEG衍生物修饰包含含炔的氨基酸的FGF-21多肽，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且可为5-20kDa的MW。举例来说，在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，并且n为100-1,000，并且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)，在各情况下，X都可存在或不存在。
含炔的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中，用含有炔部分的PEG衍生物修饰FGF-21多肽，所述炔部分将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应。
在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。
在本发明的另一个实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端叠氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽。
在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)mNH-C(O)-(CH2)p-C≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10并且n为100-1,000。
在本发明的另一个实施例中，用含有末端炔部分的分枝PEG衍生物修饰包含含叠氮基的氨基酸的FGF-21多肽，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且可为5-20kDa的MW。举例来说，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，并且n为100-1,000，并且X视情况为O、N、S或羰基(C＝O)或不存在。
含膦的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中，用含有活化官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰FGF-21多肽，所述官能团进一步包含将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的芳基膦基团。一般来说，PEG衍生物将具有在1-100kDa范围内并且在一些实施例中在10-40kDa范围内的平均分子量。
在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：
其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，并且W为水溶性聚合物。
在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：
其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物并且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN和-NO2。R'、R"、R'"和R""各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。例如，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，R基团是各自独立地经选择，而当存在R'、R"、R'"和R""基团中的一者以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
其它PEG衍生物和一般聚乙二醇化技术
例如，可与FGF-21多肽连接的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括以下文献中所述的分子和方法：美国专利公开案第2004/0001838号；第2002/0052009号；第2003/0162949号；第2004/0013637号；第2003/0228274号；第2003/0220447号；第2003/0158333号；第2003/0143596号；第2003/0114647号；第2003/0105275号；第2003/0105224号；第2003/0023023号；第2002/0156047号；第2002/0099133号；第2002/0086939号；第2002/0082345号；第2002/0072573号；第2002/0052430号；第2002/0040076号；第2002/0037949号；第2002/0002250号；第2001/0056171号；第2001/0044526号；第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号；第5,824,778号；第5,476,653号；第5,219,564号；第5,629,384号；第5,736,625号；第4,902,502号；第5,281,698号；第5,122,614号；第5,473,034号；第5,516,673号；第5,382,657号；第6,552,167号；第6,610,281号；第6,515,100号；第6,461,603号；第6,436,386号；第6,214,966号；第5,990,237号；第5,900,461号；第5,739,208号；第5,672,662号；第5,446,090号；第5,808,096号；第5,612,460号；第5,324,844号；第5,252,714号；第6,420,339号；第6,201,072号；第6,451,346号；第6,306,821号；第5,559,213号；第5,747,646号；第5,834,594号；第5,849,860号；第5,980,948号；第6,004,573号；第6,129,912；WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO 95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921131、WO 98/05363、EP 809996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605963、EP 510356、EP 400472、EP 183503和EP 154316，其是以引用的方式并入本文中。本文中所述的任一种PEG分子都可以包括(但不限于)单链、分枝链、多臂链、单官能、双官能、多官能形式或其任何组合的任何形式使用。
其它聚合物和PEG衍生物描述于以下专利申请案中，所述专利申请案都是以全文引用的方式并入本文中：美国专利公开案第2006/0194256号；美国专利公开案第2006/0217532号；美国专利公开案第2006/0217289号；美国临时专利第60/755,338号；美国临时专利第60/755,711号；美国临时专利第60/755,018号；国际专利申请案第PCT/US06/49397号；WO 2006/069246；美国临时专利第60/743,041号；美国临时专利第60/743,040号；国际专利申请案第PCT/US06/47822号；美国临时专利第60/882,819号；美国临时专利第60/882,500号；以及美国临时专利第60/870,594号。
增强对血清白蛋白的亲和性
也可使各种分子与本发明的FGF-21多肽融合以调节FGF-21多肽在血清中的半衰期。在一些实施例中，使分子与本发明的FGF-21多肽连接或融合以增强对动物中的内源血清白蛋白的亲和性。
举例来说，在一些情况下，制备FGF-21多肽与白蛋白结合序列的重组融合体。例示性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌(streptococcal)蛋白G的白蛋白结合域(例如参看Makrides等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.277:534-542(1996)；和Sjolander等人,J,Immunol.Methods 201:115-123(1997))，或白蛋白结合肽，例如在例如Dennis等人,J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)中所述的白蛋白结合肽。
在其它实施例中，用脂肪酸使本发明的FGF-21多肽酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参看Kurtzhals等人,Biochem.J.312:725-731(1995)。
在其它实施例中，本发明的FGF-21多肽是直接与血清白蛋白(包括(但不限于)人类血清白蛋白)融合。所属领域的技术人员应认识到，也可使多种其它分子与本发明的FGF-21连接以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
X.FGF-21多肽的糖基化
本发明包括并有一种或一种以上带有糖残基的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽。糖残基可为天然残基(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然残基(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。糖可通过N或O-连接的糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或相应的C或S-连接的糖苷)与非天然编码氨基酸连接。
可在活体内或活体外将糖(包括(但不限于)糖基)部分添加到FGF-21多肽中。在本发明的一些实施例中，用由氨氧基衍生的糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽，以产生通过肟键连接的相应糖基化多肽。在糖与非天然编码氨基酸连接后，可通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步精细修饰糖以产生与FGF-21多肽结合的寡糖。例如参看H.Liu等人,J.Am.Chem.Soc.125:1702-1703(2003)。
在本发明的一些实施例中，直接用以氨氧基衍生物形式制备的具有规定结构的聚糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽。所属领域的技术人员应认识到，可使用其它官能团(包括叠氮化物、炔、酰肼、肼和氨基脲)使糖与非天然编码氨基酸连接。
在本发明的一些实施例中，随后可通过(包括但不限于)休斯根[3+2]环加成反应分别用(包括但不限于)炔基或叠氮基衍生物修饰包含含叠氮基或炔基的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽。这种方法允许以极高选择性修饰蛋白质。
XI.FGF-21二聚物和多聚物
本发明也提供FGF-21和FGF-21类似物组合，例如同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物(即，三聚物、四聚物等)，其中含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的FGF-21直接与多肽主链结合，或通过连接子与另一FGF-21或其FGF-21变异体或非FGF-21或其FGF-21变异体的任何其它多肽结合。由于与单体相比分子量增加，所以FGF-21二聚物或多聚物接合物可展现新颖或所需性质，包括(但不限于)相对于单体FGF-21展现不同的药理学、药物动力学、药效学性质、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的FGF-21二聚物将调节FGF-21受体的信号转导。在其它实施例中，本发明的FGF-21二聚物或多聚物将充当FGF-21受体的拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施例中，在含有FGF-21的二聚物或多聚物中存在的一个或一个以上FGF-21分子包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。
在一些实施例中，FGF-21多肽是(包括但不限于)通过Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键直接连接。在一些实施例中，FGF-21多肽和/或连接的非FGF-21分子将包含不同的非天然编码氨基酸以促进二聚化，其包括(但不限于)第一FGF-21多肽的一个非天然编码氨基酸中的炔与第二分子的第二非天然编码氨基酸中的叠氮化物将通过休斯根[3+2]环加成接合。或者，包含含酮的非天然编码氨基酸的FGF-21和/或连接的非FGF-21分子可与包含含羟胺的非天然编码氨基酸的第二多肽接合，并且所述多肽是通过形成相应肟进行反应。
或者，两种FGF-21多肽和/或连接的非FGF-21分子是通过连接子连接。可使用任何异型双官能连接子或同型双官能连接子来连接两种分子和/或连接的非FGF-21分子，其可具有相同或不同的一级序列。在一些情况下，用于将FGF-21和/或连接的非FGF-21分子连接在一起的连接子可为双官能PEG试剂。连接子可具有各种分子量或分子长度。可使用较大或较小分子量的连接子在FGF-21与连接实体之间或在FGF-21与其受体之间或在连接实体与其结合搭配物(如果存在的话)之间提供所需空间关系或构象。也可使用具有较长或较短分子长度的连接子在FGF-21与连接实体之间或在连接实体与其结合搭配物(如果存在的话)之间提供所需空间或可挠性。
在一些实施例中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接子，所述结构包括：a)在聚合物主链的至少一个第一末端上的叠氮基、炔、肼、酰肼、羟胺或含羰基的部分；以及b)至少一个在聚合物主链的第二末端上的第二官能团。第二官能团可与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中，本发明提供包含分枝分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，分枝分子结构可为树枝状。
在一些实施例中，本发明提供通过与水溶性活化聚合物反应而形成的包含一个或一个以上FGF-21多肽的多聚物，所述水溶性活化聚合物具有以下结构：
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X，
其中n为约5到3,000，m为2-10，X可为叠氮基、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或含羰基的部分，并且R为可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基。R可为例如选自由以下组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳酸1-苯并三唑酯、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃以及酮。
XII.FGF-21多肽活性和FGF-21多肽对FGF-21多肽受体的亲和性的测量
已显示FGF-21刺激3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取并增强胰岛素敏感性，所述3T3-L1脂肪细胞是如美国专利公开案第20040259780号(其以全文引用的方式并入本文中)的实例3中所示用于研究脂肪组织代谢的活体外模型。2型糖尿病的特征在于多种组织类型(包括脂肪组织)中的葡萄糖摄取不足。因此，FGF-21因降低血糖水平而适用于治疗2型糖尿病。此外，FGF-21因通过更快并且更有效的葡萄糖利用来增加能量消耗而适用于治疗肥胖症。另外，已显示FGF-21以胰岛素依赖性方式刺激3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取，这表示其也适用于治疗1型糖尿病。参看美国专利公开案第20040259780号。美国专利公开案第20040259780号中已显示FGF-21在次最佳浓度的胰岛素(5nM)下以及在不存在胰岛素的情况下以浓度依赖性方式刺激3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取。另外，FGF-21在美国专利公开案第20040259780号中所描述的离体组织模型中诱导葡萄糖摄取。
可使用以下方法分析3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取。3T3-L1细胞是获自美国典型菌种保藏中心(ATCC,Rockville,Md.)。在杜贝卡氏改良伊格氏培养基(Dulbecco'smodified Eagle's medium)中含有富含10％铁的胎牛血清的生长培养基(GM)中培养细胞。关于标准脂肪细胞分化，在细胞达到长满(称作第0天)之后两天，使细胞暴露于含有10％胎牛血清、10μg/ml胰岛素、1μM地塞米松(dexamethasone)和0.5μM异丁基甲基黄嘌呤的分化培养基(DM)中达48小时。随后，将细胞保持在含有10％胎牛血清和10μg/ml胰岛素的分化后培养基中。可用所属领域的技术人员已知的葡萄糖摄取检定测量活体外效能。活体外效能可定义为FGF-21化合物在基于细胞的检定中的葡萄糖摄取的量度，并且为FGF化合物的生物效能的量度。其可表示为EC50，EC50为在单剂量反应实验中产生50％活性的化合物的有效浓度。
葡萄糖转运检定(胰岛素依赖性)：如由0.1mM 2-脱氧-D-[14C]葡萄糖的积聚所检定，如下测量己糖摄取：用升温到37℃并且含有0.2％BSA的KRP缓冲液(136mM NaCl、4.7mM KCl、10mM NaPO4、0.9mM CaCl2、0.9mM MgSO4，pH 7.4)将12孔板中的3T3-L1脂肪细胞洗涤两次，在37℃下在室内空气中在含有0.2％BSA的Leibovitz's L-15培养基中培育2小时，用含有0.2％BSA缓冲液的KRP再洗涤两次，并且在37℃下在室内空气中在不存在(仅有Me2SO)或存在渥曼青霉素(wortmannin)的情况下在KRP、0.2％BSA缓冲液中培育30分钟。随后，将胰岛素增加到100nM的最终浓度达15分钟，并且在最后4分钟测量2-脱氧-D-[14C]葡萄糖的摄取。从所有值中减去在10μM细胞松弛素B(cytochalasin B)存在下测量的非特异性摄取。用Pierce二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)检定测定蛋白质浓度。针对各实验，通常一式三份或一式四份测量摄取。可研究在胰岛素存在下用FGF-21对3T3-L1脂肪细胞进行急性和慢性预处理的效应。
葡萄糖转运检定(胰岛素依赖性)：将3T3-L1成纤维细胞涂于96孔板中并且分化成脂肪细胞达2周。在分化后，使其在不含血清的培养基中挨饿并且用FGF-21处理24小时。在处理后，随即用含有0.1％BSA的KRBH缓冲液将细胞洗涤两次。在经标记的葡萄糖(无胰岛素)存在下在KPBH缓冲液中进行葡萄糖摄取。已显示FGF-21在次最佳浓度的胰岛素(5nM)下以及在不存在胰岛素的情况下以浓度依赖性方式刺激3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取(参看美国专利公开案第2004259780号)。另外，已显示本发明的FGF-21多肽诱导离体组织模型中的葡萄糖摄取。
在离体葡萄糖转运模型中，葡萄糖转运检定描述如下：Krebs-Henseleit缓冲液储备溶液-储备液1：NaCl(1.16M)；KCl(0.046M)；KH2PO4(0.0116M)；NaHCO3(0.0253M)。储备液2：CaCl2(0.025M)；MgSO4(2H2O)(0.0116M)。BSA：使用ICN Cohn部分V，即完全未经透析的不含脂肪酸的BSA。培养基制备：向395ml dH2O中加入50ml Krebs储备液1并且用95％O2/5％CO2通气1小时。加入50ml储备液2并且用dH2O补足500ml。加入500mg ICN不含脂肪酸的BSA。预培育和培育培养基：32mM甘露糖醇、8mM葡萄糖。洗涤培养基：40mM甘露糖醇、2mM丙酮酸盐。转运培养基：39mM甘露糖醇、1mM2-DG；32mM甘露糖醇、8mM3-O-MG。胰岛素溶液：(猪胰岛素[Lilly]100,000,000μU/ml)，最终浓度为2000μU/ml或13.3nM。放射性标记培养基制备：所用比活性：2DG＝1.5mCi/ml；3-O-MG＝37μCi/ml；或甘露糖醇＝8μCi/m。每100g体重用0.1cc戊巴比妥(Nembutal)麻醉大鼠。切除肌肉组织并且用0.9％生理盐水冲洗，随后在29℃下放置到预培育培养基(2ml)中达1小时。将肌肉组织转移到培育培养基(2ml；除包括胰岛素或测试化合物之外与预培育培养基相同)中并且培育30分钟(取决于实验条件)。随后，在29℃下将肌肉组织转移到洗涤培养基(2ml)中达10分钟，随后转移到标记培养基(1.5ml)中达10分钟(3-O-MG)或20分钟(2DG)。切割肌肉组织，称重并放置到干冰上的聚丙烯管中。将1ml 1N KOH加入管中，随后将管放置到70℃水浴中达10-15分钟，每隔数分钟使管涡旋。在冰上冷却所述管并且加入1ml 1N HCl，随后充分混合。随后，将200μl上清液放置到双重复闪烁瓶中并且用闪烁计数器计数(与已知放射性标准物相比)。
关于收缩，首先将肌肉在预培育/培育培养基中培育1小时。1小时后，将各对(每只大鼠一对)中的一块肌肉钉在刺激装置上并且将另一块肌肉转移到新的培育培养基烧瓶中。用70Hz的200毫秒波列刺激收缩的肌肉，其中波列中的各脉冲为0.1毫秒。在10-15V下以每秒一次传递波列达2×10分钟，其间有1分钟休止。在刺激期结束时，从刺激装置上移除肌肉并且将其放置到洗涤培养基中达10分钟，接着放置到如上文所概述的标记培养基中。
可使用所属领域的技术人员已知的技术和方法来制备FGF受体。可使用标准或已知的活体外或活体内检定来测定FGF-21多肽活性。对于包含非天然氨基酸的非聚乙二醇化或聚乙二醇化FGF-21多肽来说，可通过使用BIAcoreTM生物传感器(Pharmacia)来测量FGF-21对其受体的亲和性。
无论使用何种方法来产生FGF-21多肽，都使所述FGF-21多肽经受生物活性检定。一般来说，生物活性测试应提供对所需结果的分析，例如生物活性的增加或降低(与经修饰的FGF-21相比)、不同的生物活性(与经修饰的FGF-21相比)、受体或结合搭配物的亲和性分析、FGF-21本身或其受体的构象或结构变化(与经修饰的FGF-21相比)或血清半衰期分析。
对于检定方法学的参考文献的上述汇编并不详尽，并且所属领域的技术人员将认可其它适用于测试所需最终结果的检定。
XIII.效能、功能性活体内半衰期和药物动力学参数的测量
本发明的一个重要方面是通过在多肽与水溶性聚合物部分接合或不接合的情况下构建FGF-21多肽而获得的延长的生物半衰期。FGF-21多肽血清浓度的投与后快速降低已使得评估对用接合和未接合FGF-21多肽和其变异体进行治疗的生物反应变得重要。在例如经皮下或静脉内投药后，本发明的接合和未接合FGF-21多肽和其变异体也可具有延长的血清半衰期，从而使通过例如ELISA方法或初步筛选检定进行测量成为可能。可使用来自商业来源的ELISA或RIA试剂盒。如本文中所述进行活体内生物半衰期的测量。
可根据所属领域的技术人员已知的方案来测定包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽的效能和功能性活体内半衰期。
可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每个治疗组N＝5只动物)中评估包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽的药物动力学参数。动物将经静脉内接受每只大鼠25μg的单剂量或经皮下接受每只大鼠50μg的单剂量，并且将根据预定时程采集约5-7个血样，对于未与水溶性聚合物接合的包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽来说，通常历时约6小时；并且对于包含非天然编码氨基酸并与水溶性聚合物接合的FGF-21多肽来说，通常历时约4天。可直接将不具有非天然编码氨基酸的FGF-21的药物动力学数据与关于包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽所获得的数据进行比较。
也可在灵长类动物(例如，食蟹猴)中评估药物动力学参数。通常，经皮下或经静脉内投与单次注射液，并且随时间监控血清FGF-21水平。
可通过所属领域中已知的各种检定来测定本发明的FGF-21多肽的比活性。可通过本文中所描述或参考或所属领域的技术人员已知的方法来测试根据本发明获得并纯化的FGF-21多肽突变蛋白或其片段的生物活性。
可使用本发明的多肽来治疗罹患非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM：2型)、胰岛素依赖性糖尿病(1型)以及肥胖症、葡萄糖清除不足、高血糖症、高胰岛素血症等的哺乳动物。如美国专利公开案第20040259780号(其以全文引用的方式并入本文中)中所示，FGF-21在糖尿病和肥胖症的动物模型中有效。因为肥胖症和糖尿病的各种动物模型的代谢概况存在不同，所以已对多个模型进行分析以区分高胰岛素血症、高血糖症和肥胖症的效应。糖尿病(db/db)和肥胖(ob/ob)小鼠的特征在于巨肥症(massive obesity)、过食症(hyperphagia)、可变性高血糖症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症和产热受损(Coleman,Diabetes 31:1,1982；E.Shafrir,Diabetes Mellitus；H.Rifkin和D.Porte,Jr.编,(ElsevierScience Publishing Co.,Inc.,New York,第4版,1990),第299-340页)。然而，在db/db模型中糖尿病更为严重(Coleman,Diabetes 31:1,1982；E.Shafrir,Diabetes Mellitus；H.Rifkin和D.Porte,Jr.编,(Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,New York,第4版,1990),第299-340页)。Zucker(fa/fa)大鼠严重肥胖、患有高胰岛素血症并且具有胰岛素抵抗(Coleman,Diabetes 31:1,1982；E.Shafrir,Diabetes Mellitus；H.Rifkin和D.Porte,Jr.编,(Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,New York,第4版,1990),第299-340页)，并且fa/fa突变可为鼠类db突变的大鼠等效突变(Friedman等人,Cell 69:217-220,1992；Truett等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7806,1991)。Tubby(tub/tub)小鼠的特征为肥胖症、中等胰岛素抵抗和高胰岛素血症，而无显著高血糖症(Coleman等人,J.Heredity 81:424,1990)。
也可研究以化学方式诱发的肥胖症的谷氨酸单钠(MSG)模型(Olney,Science164:719,1969；Cameron等人,Cli.Exp.Pharmacol.Physiol.5:41,1978)，其中肥胖症不如遗传模型中严重并且不产生过食症、高胰岛素血症和胰岛素抵抗。最终，可测试以化学方式诱发的糖尿病的链脲佐菌素(streptozotocin；STZ)模型以研究在不存在肥胖症的情况下高血糖症的效应。用STZ治疗的动物缺乏胰岛素并且严重高血糖(Coleman,Diabetes 31:1,1982；E.Shafrir,iabetes Mellitus；H.Rifkin和D.Porte,Jr.编,(ElsevierScience Publishing Co.,Inc.,New York,第4版,1990),第299-340页)。
可在ob/ob小鼠中在活体内脓毒性休克模型中评估本发明的FGF-21多肽。参看美国专利公开案第20050176631号，其是以全文引用的方式并入本文中。
XIV.投药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白质(包括(但不限于)包含一个或一个以上非天然氨基酸的FGF-21、合成酶、蛋白质等)视情况(包括但不限于)与合适的医药载剂组合用于治疗用途。例如，这些组合物包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。制备适用于投药模式的调配物。一般来说，所属领域的技术人员已知投与蛋白质的方法，并且所述方法可用于投与本发明的多肽。
根据所属领域的技术人员已知的方法，视情况在疾病的一种或一种以上适当的活体外和/或活体内动物模型中测试包含一种或一种以上本发明的多肽的治疗组合物，从而证实功效、组织代谢并且估算剂量。具体来说，最初可通过本文中的非天然氨基酸同源物相对于天然氨基酸同源物(包括(但不限于)经修饰包括一个或一个以上非天然氨基酸的FGF-21多肽与天然氨基酸FGF-21多肽的比较)的活性、稳定性或其它合适的量度(即，在相关检定中)来确定剂量。
通过通常用于引导分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径进行投药。本发明的非天然氨基酸多肽是视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起以任何合适的方式投与。可使用向患者投与本发明上下文中的所述多肽的合适方法，并且虽然可使用超过一种途径来投与特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径即时并且有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂是部分由欲投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法决定。因此，存在本发明的医药组合物的多种合适的调配物。
本发明的FGF-21多肽可通过适用于蛋白质或肽的任何常规途径来投与，所述途径包括(但不限于)肠外，例如(包括但不限于)皮下或静脉内注射或任何其它形式的注射或输液。可由多种途径投与多肽组合物，所述途径包括(但不限于)口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物也可通过脂质体投与。所属领域的技术人员通常已知所述投药途径以及适当调配物。FGF-21多肽可单独使用或与其它合适的组分(例如医药载剂)组合使用。FGF-21多肽可与其他药剂(包括(但不限于)口服抗糖尿病药)组合使用。
术语“抗糖尿病药”应表示可用于治疗、预防任何葡萄糖代谢病症或其任何并发症(包括本文中所述的任何病状、疾病或并发症)或以其它方式降低其严重性的任何药物。抗糖尿病药包括胰岛素、噻唑烷二酮、磺酰脲、苯甲酸衍生物、α-葡糖苷酶抑制剂等。可为本发明组合物的一部分的其它一般种类的抗糖尿病药包括(引号中定义的术语)：美国官方药典或美国官方国家处方集(或其任何附录)中所认可的“药物”；美国FDA所批准的“新药”和“新兽药”，这些术语用于美国法典第21篇中；在美国或海外需要政府实体批准的任何药物(“批准药”)；必需获得规章批准以遵守21U.S.C.§355(a)的任何药物(“规章批准药”)；作为人用药申请(根据21U.S.C.§379(g))或正进行人用药申请(根据21U.S.C.§379(g))的任何药剂(“人用药”)。(所有对关于这种定义的法定代号的提及都是指本申请案的原始申请日期的代号。)其它抗糖尿病药揭示于本文中，并且已为所属领域的技术人员所知。所属领域中众所周知用于控制2型糖尿病的当前药物或抗糖尿病药包括多个种类：双胍类、噻唑烷二酮、磺酰脲类、苯甲酸衍生物和葡糖苷酶抑制剂。这些药物通常具有不同的作用模式。认为双胍类(例如二甲双胍(metformin))可预防过量的肝糖原异生。认为噻唑烷二酮通过增加周边葡萄糖处理的速率而起作用。磺酰脲类(例如，甲苯磺丁脲(tolbutamide)和优降糖(glyburide))以及苯甲酸衍生物(例如瑞格列奈(repaglinide))通过刺激胰岛素分泌而降低血浆葡萄糖。α-葡糖苷酶抑制剂竞争性抑制使碳水化合物代谢的α-葡糖苷酶，从而延迟碳水化合物吸收并削弱膳食后高血糖。另外，存在多种尚未获得批准供人类使用的治疗糖尿病的建议疗法。
所属领域中众所周知用于控制糖尿病和其前身综合征(例如胰岛素抵抗)的当前药物或抗糖尿病药包括五类化合物：双胍类，例如二甲双胍；噻唑烷二酮；磺酰脲类，例如，甲苯磺丁脲和优降糖；苯甲酸衍生物，例如瑞格列奈；和葡糖苷酶抑制剂。除这些药剂之外，多种其它治疗剂也可与本发明的FGF-21多肽组合使用以改良葡萄糖控制，所述治疗剂包括(但不限于)DPP-4抑制剂。这些抗糖尿病药中的某些药物已获得批准供人类使用。临床试验中测试的前导DPP-4化合物包括维格列汀(Vildagliptin)(高维斯(Galvus))(LAF237)、西他列汀(Sitagliptin)(加鲁维亚(Januvia))、沙格列汀(Saxagliptin)和阿格列汀(Alogliptin)。美国在2006年10月17日批准加鲁维亚(西他列汀)用于治疗2型糖尿病，其用作单疗法或与二甲双胍或噻唑烷二酮组合的组合疗法。经4周时期向93个患有2型糖尿病的患者(平均HbAlc为7.4％)投与第一代诺华(Novartis)化合物1-[[[2-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-2-氰基-(S)-吡咯烷(NVP DPP728)，从而降低4周研究时期内血浆葡萄糖、胰岛素和HbAlc的水平。参看Inhibition of Dipeptidyl Peptidase IV Improves Metabolic Control Over a 4-Week StudyPeriod in Type 2Diabetes.Diabetes Care.2002年5月；25(5):869-875。也注意到接受二甲双胍的患者在建立GLP-1疗法后展现附加的葡萄糖降低益处。参看Additiveglucose-lowering effects of glucagon-like peptide-1and metformin in type 2diabetes.Diabetes Care.2001年4月；24(4):720-5。在10个肥胖的非糖尿病男性患者的研究中，二甲双胍的投与与口服葡萄糖负载后循环GLP-1的水平增加有关，并且在使用汇集人类血浆的实验中，在存在或不存在DPP-4的情况下，在37℃下培育30分钟后，二甲双胍(0.1-0.5微克/毫升)显著抑制GLP-1(7-36)酰胺的降解。所述研究的作者提出二甲双胍可在活体外与活体内抑制GLP-1的酶促分解的可能性。参看Effect of metformin onglucagon-like peptide 1(GLP-1)and leptin levels in obese nondiabetic subjects.DiabetesCare.2001年3月；24(3):489-94。使用活体外生物化学分析进行DPP-4与GLP-1降解之间的关系的分析。Demuth和同事使用多个来源的人类DPP-4发现二甲双胍对DPP-4介导的GLP-1降解并无影响。参看Metformin Effects on Dipeptidylpeptidase IV Degradationof Glucagon-like Peptide-1.Biochem Biophys Res Commun.2002年3月15日；291(5):1302-8。
在适用作糖尿病治疗剂的双胍类中，已证实二甲双胍尤其成功。二甲双胍(N,N-二甲基酰亚胺二碳二亚胺二酰胺(N,N-DIMETHYLIMIDODICARBONIMIDICDIAMIDE)；1,1-二甲基双胍；N,N-二甲基双胍；N,N-二甲基双胍；N'-二甲基鸟嘌呤基胍)是通过降低肝脏的葡萄糖产生和降低葡萄糖的肠道吸收而起作用的抗糖尿病药。也认为其改良身体中其它部位的组织的胰岛素敏感性(增加周围葡萄糖摄取和利用)。二甲双胍改良葡萄糖耐受异常(IGT)个体和2型糖尿病个体的葡萄糖耐受，降低膳食前与膳食后的血浆葡萄糖。在不存在胰岛素的情况下，二甲双胍通常无效。Bailey,Diabetes Care 15:755-72(1992)。
已在若干试验中显示二甲双胍的功效。在对中等肥胖的2型糖尿病患者进行的一项研究中，在29周的单独或与磺酰脲组合的二甲双胍疗法后，HbAlc水平从8.6％改良到7.1％。DeFronzo等人,New Engl.J.Med.333:541-49(1995)。二甲双胍也对血清脂质具有有利影响，从而降低空腹时的血清甘油三酯平均值、总胆固醇和LDL胆固醇水平并且显示对其它脂质水平无不利影响。在另一个试验中，二甲双胍以剂量相关方式改良NIDDM个体的血糖控制。14周后，每天500mg和2000mg二甲双胍使HbAlc分别降低0.9％和2.0％。Garber等人,Am J.Med.102:491-97(1997)。二甲双胍也可对胰岛素抵抗的非糖尿病患者具有有利的治疗作用。一项研究表明，用二甲双胍治疗高血压的肥胖非糖尿病女性可降低血压、空腹和葡萄糖刺激的血浆胰岛素纤维蛋白原。Giugliano等人,Diabetes Care 16:1387-90(1993)。
通常以盐酸二甲双胍形式投与二甲双胍。涵盖使这种形式以及所有其它适用形式的二甲双胍与本发明的FGF-21多肽一起使用。通常，用盐酸二甲双胍或任何其它药理试剂处理糖尿病患者中的高血糖的固定给药方案应个别地加以考虑。剂量应根据有效性和耐受性个别地加以考虑，但通常不超过2550mg的最大推荐日剂量。
打算用于本发明实施中的噻唑烷二酮包括曲格列酮(troglitazone)等。众所周知此类化合物，例如，如美国专利第5,223,522号、第5,132,317号、第5,120,754号、第5,061,717号、第4,897,405号、第4,873,255号、第4,687,777号、第4,572,912号、第4,287,200号和第5,002,953号以及Current Pharmaceutical Design 2:85-101(1996)中所述。曲格列酮是一种可能通过活化过氧化物酶体增生物活化的受体-γ(PPARγ)而增加葡萄糖转运的口服抗高血糖药物。通过此类活化，曲格列酮可增强GLUT4葡萄糖转运体的表达，从而使得胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加。曲格列酮也可能削弱糖原异生和/或糖解的活化。
HbAlc是测量糖基化的量的血液测试，当患者经历血糖增加的时期时，HbAlc通常较高。所述测试提供对患者的最后2-3个月的糖尿病控制的评估。由曲格列酮疗法产生的血糖控制使HbAlc降低约1％到2％。Mimura等人,Diabetes Med.11:685-91(1994)；Kumar等人,Diabetologia 39:701-09(1996)。在开始疗法数周后可能并未出现效果。曲格列酮也可能降低胰岛素需求。在对患有NIDDM并使用外源胰岛素的患者进行的一项试验中，对于剂量为200mg和600mg的曲格列酮来说，平均HbAlc分别降低0.8％和1.4％。胰岛素需求降低高达29％。Schwartz等人,New Engl.J.Med.338:861-66(1998)。在对使用400mg和600mg曲格列酮的NIDDM糖尿病患者进行的另一项研究中，空腹葡萄糖水平和膳食后葡萄糖水平都降低，并且高胰岛素-正葡萄糖钳夹(hyperinsulinemiceuglycemic clam)表明葡萄糖处理高于预处理水平约45％。Maggs等人,Ann.Intern.Med.128:176-85(1998)。
在一项研究中，400mg曲格列酮增加具有异常或正常葡萄糖耐受的肥胖患者的葡萄糖处理速率。Nolan等人,New Eng.J.Med 331:1188-93(1994)。在对患有IGT并具有妊娠期糖尿病史的女性进行的另一项研究中，600mg曲格列酮改良胰岛素动态平衡，包括改良胰岛素敏感性并降低循环胰岛素浓度，但葡萄糖耐受未改变。Berkowitz等人,Diabetes 45:172-79(1996)。噻唑烷二酮可供NIDDM风险性群体(例如具有POCS或GDM的女性)使用，以预防或延迟NIDDM的发作。美国专利第5,874,454号。曲格列酮单独使用时的有效量在每日剂量为约10mg到约800mg的范围内，并且可相当的范围也打算用于本发明中。除了与二甲双胍一起使用之外，曲格列酮也可与胰岛素和磺酰脲剂组合使用。例如参看美国专利第5,859,037号。
磺酰脲通常通过增加胰腺中胰岛素的释放从而降低血浆葡萄糖来起作用。具体来说，磺酰脲通过阻断ATP敏感性钾通道而起作用。磺酰脲格列美脲(glimepiride)也可通过刺激GLUT4转运体的迁移而增加胰岛素敏感性。当HbAlc高于8％时，通常用磺酰脲开处方。也参看美国专利第5,258,185号、第4,873,080号。
磺酰脲是所属领域中众所周知的一类化合物，例如，如美国专利第3,454,635号、第3,669,966号、第2,968,158号、第3,501,495号、第3,708,486号、第3,668,215号、第3,654,357号和第3,097,242号中所述。打算用于本发明的某些实施例中的例示性磺酰脲(圆括号中指示典型日剂量)包括乙酰磺环己脲(acetohexamide)(在约250mg到约1500mg范围内)、氯磺丙脲(chlorpropamide)(在约100mg到约500mg范围内)、妥拉磺脲(tolazimide)(在约100mg到约1000mg范围内)、甲苯磺丁脲(在约500mg到约3000mg范围内)、格列齐特(gliclazide)(在约80mg到约320mg范围内)、格列吡嗪(glipizide)(在约5mg到约40mg范围内)、格列吡嗪GITS(在约5mg到约20mg范围内)、优降糖(在约1mg到约20mg范围内)、微米尺寸化优降糖(在约0.75mg到约12mg范围内)、格列美脲(在约1mg到约8mg范围内)、AG-EE 623ZW等。格列美脲是此类化合物中第一个获得批准与胰岛素一起使用的抗糖尿病药，并且与其使用相关的低血糖风险减小。
多种α-葡糖苷酶抑制剂可与本发明一起使用以治疗和/或预防糖尿病。所述抑制剂竞争性抑制使碳水化合物代谢的α-葡糖苷酶，从而延迟碳水化合物吸收并削弱膳食后高血糖。Clissod等人,Drugs 35:214-23(1988)。可显示通过降低HbAlc水平来降低葡萄糖。打算用于本发明实施中的例示性α-葡糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)等。阿卡波糖与米格列醇的有效剂量都在每天约25mg到约300mg的范围内。
α-葡糖苷酶抑制剂可与本发明的多肽以及磺酰脲一起使用。已显示α-葡糖苷酶抑制剂与单独磺酰脲组合使HbAlc水平一般从约0.5％降低到1.0％。另外，已显示α-葡糖苷酶抑制剂可有效降低膳食后血糖升高。Lefevre等人,Drugs 44:29-38(1992)。
多种苯甲酸衍生物可与本发明的多肽一起使用以治疗和/或预防糖尿病。这些药剂(也称作美格列奈(meglitinide))是具有胰岛素分泌能力的非磺酰脲低血糖剂。举例来说，瑞格列奈似乎与胰腺β细胞上的ATP敏感性钾通道结合并且从而增加胰岛素分泌。打算用于本发明实施中的例示性苯甲酸衍生物包括瑞格列奈等。关于瑞格列奈，有效日剂量可在约0.5mg到约16mg范围内，并且可在每次餐前服药。
目前正在研究多种作为潜在的人类抗糖尿病药的药剂。在可用于治疗用途时，任何此类药剂都可与本发明的多肽一起使用以治疗和/或预防代谢病症，并且尤其治疗和/或预防糖尿病。
另一类抗糖尿病药为肉毒碱棕榈酰基转移酶I(CPT-I)的抑制剂(例如依托莫司(etomoxir))，其在本发明的另一个实施例中可与经修饰的FGF-21多肽一起使用以调节血糖。依托莫司不可逆地抑制肉毒碱棕榈酰基转移酶I，这对于脂肪酸氧化来说是必需的。所述抑制可降低空腹时的高血糖，这是因为脂肪酸氧化的产物刺激肝糖原异生。依托莫司可改良2型糖尿病患者的胰岛素敏感性。Hubinger等人,Hormone Metab.Res.24:115-18(1992)。
其它已知的抗糖尿病药包括：可提及胰岛素制剂(例如，从牛和猪的胰腺中提取的动物胰岛素制剂；使用大肠杆菌、酵母以遗传方式合成的人类胰岛素制剂；锌胰岛素；鱼精蛋白锌胰岛素；胰岛素的片段或衍生物(例如，INS-1)、口服胰岛素制剂)；胰岛素增敏剂(例如，吡格列酮(pioglitazone)或其盐(优选盐酸盐)、罗格列酮(rosiglitazone)或其盐(优选马来酸盐)、萘格列酮(Netoglitazone)、利格列酮(Rivoglitazone)(CS-011)、FK-614、WO01/38325中所述的化合物、替格列扎(Tesaglitazar)(AZ-242)、罗格里扎(Ragaglitazar)(N,N-622)、莫格列扎(Muraglitazar)(BMS-298585)、依格列宗(Edaglitazone)(BM-13-1258)、美格达森(Metaglidasen)(MBX-102)、那格里扎(Naveglitazar)(LY-519818)、MX-6054、LY-510929、AMG-131(T-131)、THR-0921)；α-葡糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖(voglibose)、阿卡波糖、米格列醇、乙格列酯(emiglitate)等)；双胍(例如，苯乙双胍(phenformin)、二甲双胍、丁福明(buformin)或其盐(例如，盐酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐))；胰岛素促分泌素[磺酰脲(例如，甲苯磺丁脲、格列本脲(glibenclamide)、格列齐特、氯磺丙脲、妥拉磺脲、乙酰磺环己脲、格列吡脲(glyclopyramide)、格列美脲、格列吡嗪、格列丁唑(glybuzole))、瑞格列奈、那格列奈(nateglinide)、米格列奈(mitiglinide)或其钙盐水合物]；二肽基肽酶IV抑制剂(例如，维格列汀(Vidagliptin)(LAF237)、P32/98、西他列汀(Sitagliptin)(MK-431)、P93/01、PT-100、沙格列汀(Saxagliptin)(BMS-477118)、T-6666、TS-021))；β3激动剂(例如，AJ-9677)；GPR40激动剂；类胰高血糖素的多肽(I)(glp I)、(glp2)或其它致糖尿病的肽激素；GLP-1受体激动剂[例如，GLP-1、GLP-1MR剂、N,N-2211、AC-2993(exendin-4)、BIM-51077、Aib(8,35)hGLP-l(7,37)NH2、CJC-[131]]；胰淀素(amylin)激动剂(例如，普兰林肽(pramlintide))；磷酸酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，钒酸钠)；糖原异生抑制剂(例如，糖原磷酸化酶抑制剂、葡萄糖-6-磷酸酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂)；SGLUT(钠-葡萄糖共转运体)抑制剂(例如，T-1095)；11β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂(例如，BVT-3498)；脂联素(adiponectin)或其激动剂；IKK抑制剂(例如，AS-2868)；改良瘦素(leptin)抵抗的药物；生长抑素受体激动剂(WO01/25228、WO03/42204、W098/44921、W098/45285、W099/2273.5等中所述的化合物)；葡糖激酶活化剂(例如，Ro-28-1675)；GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素肽)等。
单独或与其它合适的组分组合的包含非天然氨基酸的FGF-21多肽也可制成通过吸入投与的气雾剂调配物(即，其可“雾化”)。气雾剂调配物可放置到加压的可接受推进剂(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。
适于肠外投与(例如，通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包括水性和非水性的等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。FGF-21的调配物可在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中呈递。
肠外投药和静脉内投药为优选的投药方法。具体来说，已用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括(但不限于)通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体、FGF和/或任何其它医药学上传递蛋白的投药途径)与目前使用的调配物一起提供本发明多肽的优选投药途径和调配物。
在本发明的上下文中，视应用而定，投与患者的剂量足以随时间在患者体内产生有益的治疗反应，或其它适当活性。通过特定载体或调配物的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状以及欲治疗患者的体重或表面积来确定剂量。剂量大小也由特定患者体内伴随特定载体、调配物等的投与产生的任何有害副作用的存在、性质和程度决定。
在确定疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)的治疗或预防中欲投与的载体或调配物的有效量时，医师评价循环血浆含量、调配物毒性、疾病进展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
例如投与70公斤患者的剂量通常在等于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内，所述范围可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而进行调节。本发明的载体或医药调配物可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，所述常规疗法包括抗体投与、疫苗投与、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等。
关于投药，本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或对各种浓度的非天然氨基酸多肽的任何副作用(包括(但不限于)当关系到患者的体重和整体健康时)的观测结果所确定的速率投与。可通过单次剂量或分剂量实现投药。
如果经历调配物输液的患者出现发热、发冷或肌肉疼痛，那么他/她接受适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它疼痛/发热控制药物。在即将输液前30分钟，用阿司匹林、醋氨酚或(包括但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)对经历输液反应(例如发热、肌肉疼痛和发冷)的患者进行前驱用药。哌替啶(meperidine)是用于不能对退热剂和抗组胺剂迅速作出反应的更为严重的发冷和肌肉疼痛。视反应的严重性而减缓或停止细胞输液。
本发明的人类FGF-21多肽可直接投与哺乳动物个体。通过通常用于向个体引入FGF-21多肽的任何途径进行投药。根据本发明的实施例的FGF-21多肽组合物包括适于口服、经直肠、局部、吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、经颊(包括(但不限于)舌下)、经阴道、肠外(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面，其包括气管表面)以及透皮投与的FGF-21多肽组合物，但在任何既定情况下最合适的途径将视所治疗病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身性投药。化合物的调配物可在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中呈递。本发明的FGF-21多肽可制备为单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)与医药学上可接受的载剂的混合物。也可通过连续输液(使用(包括但不限于)微型泵，例如渗透泵)、单次团注或缓释储槽式调配物来投与本发明的FGF-21多肽。
适于投药的调配物包括水溶液和非水溶液(等张无菌溶液)，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备溶液和悬浮液。
冷冻干燥是用于从所关注的蛋白质制剂中去除水的通常用于呈现蛋白质的技术。冷冻干燥或冻干是首先使欲干燥的材料冷冻并且随后通过在真空环境中升华来去除冰或冷冻溶剂的过程。预先冻干的调配物中可包括赋形剂以增强在冷冻干燥过程中的稳定性和/或改良冻干产物在储存时的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人,Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。
所属领域的技术人员也已知药物的喷雾干燥。举例来说，参看Broadhead,J.等人,"The Spray Drying of Pharmaceuticals,"Drug Dev.Ind.Pharm,18(11和12),1169-1206(1992)。除小分子药物外，也已将多种生物材料喷雾干燥并且这些生物材料包括：酶、血清、血浆、微生物和酵母。由于喷雾干燥可将液态医药制剂以单步骤工艺转化成无粉尘或团聚的细粉，所以喷雾干燥为有用的技术。基本技术包含以下四个步骤：a)将进料溶液雾化成喷雾液；b)喷雾液-空气接触；c)干燥喷雾液；和d)使干燥产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(其是以引用的方式并入本文中)描述通过喷雾干燥来制备重组促红细胞生成素。
本发明的医药组合物和调配物可包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂是部分由欲投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法决定。因此，存在本发明的医药组合物的多种合适的调配物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)。(例如参看Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,1985)。
合适的载剂包括(但不限于)：缓冲剂，其含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括(但不限于)抗坏血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)少于约10个残基的多肽；蛋白质，包括(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、蛋氨酸、谷氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括(但不限于)EDTA和乙二胺四乙酸二钠(edentate disodium)；二价金属离子，包括(但不限于)锌、钴或铜；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，包括(但不限于)钠和氯化钠；和/或非离子型表面活性剂，包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)Tween80(聚山梨醇酯80)和Tween20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它泊洛尼克酸(pluronic acid)(包括(但不限于)泊洛尼克酸F68(泊洛沙姆188(poloxamer188)))或PEG。合适的表面活性剂例如包括(但不限于)以聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)(即，(PEO-PPO-PEO))或聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)(即，(PPO-PEO-PPO))或其组合为基础的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO以商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF Wyandotte Corp.,Wyandotte,Mich.)在市面上出售并且进一步描述于美国专利第4,820,352号中，所述专利是以全文引用的方式并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为合适的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于稳定聚乙二醇化FGF-21以抵抗一种或一种以上应力(包括(但不限于)由搅拌产生的应力)。一些上述物质可被称作“膨胀剂(bulkingagent)”。一些也可被称作“张力调节剂”。为达成产物稳定性和抗菌效率，也可应用抗菌防腐剂；合适的防腐剂包括(但不限于)苄醇、苯扎氯铵(bezalkonium chloride)、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯、甲酚和苯酚或其组合。
本发明的FGF-21多肽(包括与例如PEG等水溶性聚合物连接的FGF-21多肽)也可通过持续释放系统或作为持续释放系统的一部分来投与。持续释放组合物包括(包括但不限于)呈成形物品(包括(但不限于)薄膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包括生物可相容材料，例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-共-聚乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,22,547-556(1983))、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及硅酮。持续释放组合物也包括脂质体捕获的化合物。含有所述化合物的脂质体是由本身已知的方法来制备：DE 3,218,121；Epstein等人,Proc.Natl.Acad,Sci U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美国专利第4,619,794号；EP 143,949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。
脂质体捕获的FGF-21多肽可由以下文献中描述的方法来制备：例如，DE 3,218,121；Eppstein等人,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985)；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；美国专利第4,619,794号；EP 143,949；美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324中。脂质体的组成和尺寸为众所周知的或能够由所属领域的技术人员根据经验容易地确定。脂质体的一些实例描述于(例如)Park JW等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编):MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)；Drummond DC等人,Liposomal drug deliverySystems for cancer therapy,Teicher B(编):CANCER DRUG Discovery and Development(2002)；Park JW等人,Clin.Cancer Res.8:1172-1181(2002)；Nielsen UB等人,Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3):109-118(2002)；Mamot C等人,Cancer Res.63:3154-3161(2003)中。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。
在本发明的上下文中，向患者投与的剂量应足以随时间在个体中产生有益反应。通常，每剂肠外投与的本发明的FGF-21多肽的总的医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01微克到每公斤患者体重约100微克，或者每天每公斤体重约0.05毫克到每公斤患者体重约1毫克的范围内，但这是以治疗判断为依据。给药频率也是以治疗判断为依据，并且可以比批准用于人类的市售FGF-21多肽产品的频率更高或更低。通常，本发明的聚乙二醇化FGF-21多肽可通过上述任何投药途径投与。
在一些实施例中，本发明的经修饰FGF-21多肽调节抗糖尿病药的作用。在本发明的另一个实施例中，经修饰FGF-21多肽可与抗糖尿病药共同投与。在本发明的另一个实施例中，可在用抗糖尿病药治疗之前投与经修饰FGF-21多肽。在本发明的另一个实施例中，可在用抗糖尿病药治疗之后投与经修饰FGF-21多肽。在本发明的另一个实施例中，经修饰FGF-21多肽是与二甲双胍共同投与。在本发明的另一个实施例中，在存在或不存在胰岛素的情况下用本发明的经修饰FGF-21多肽和二甲双胍进行治疗性治疗会增加二甲双胍调节血浆葡萄糖的能力。在组合疗法中，二甲双胍已与磺酰脲、α-葡糖苷酶抑制剂、曲格列酮和胰岛素一起使用。二甲双胍与磺酰脲的组合增加胰岛素敏感性并可降低血浆葡萄糖。或者，在数月内维持血糖控制时，二甲双胍与瑞格列奈一起可比格列吡嗪更有效，并且至少与优降糖同样有效。二甲双胍与曲格列酮一起可改良葡萄糖控制，其比单独任一药剂都有效。Inzucchi等人,New.Eng.J.Med.338:867-72(1998)。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽是与Klotho beta共同投与。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽是与包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的Klotho beta共同投与。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽是与Klotho beta和抗糖尿病药共同投与。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽是与抗糖尿病药共同投与。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽是与一种或一种以上的下列药物组合使用：牛磺酸、α硫辛酸、桑椹提取物、铬、谷氨酰胺、龙胆草、冰糖草、龙蒿提取物和穿心莲。在一些实施例中，本发明的FGF-21多肽是与一种或一种以上的下列药物组合使用：胰岛素制剂(例如，从牛和猪的胰腺中提取的动物胰岛素制剂；使用大肠杆菌、酵母以遗传方式合成的人类胰岛素制剂；锌胰岛素；鱼精蛋白锌胰岛素；胰岛素的片段或衍生物(例如，INS-1)、口服胰岛素制剂)；胰岛素增敏剂(例如，吡格列酮或其盐(优选盐酸盐)、罗格列酮或其盐(优选马来酸盐)、萘格列酮、利格列酮(CS-011)、FK-614、WO01/38325中所述的化合物、替格列扎(AZ-242)、罗格里扎(N,N-622)、莫格列扎(BMS-298585)、依格列宗(BM-13-1258)、美格达森(MBX-102)、那格里扎(LY-519818)、MX-6054、LY-510929、AMG-131(T-131)、THR-0921)；α-葡糖苷酶抑制剂(例如，伏格列波糖、阿卡波糖、米格列醇、乙格列酯等)；双胍(例如，苯乙双胍、二甲双胍、丁福明或其盐(例如，盐酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐))；胰岛素促分泌素[磺酰脲(例如，甲苯磺丁脲、格列本脲、格列齐特、氯磺丙脲、妥拉磺脲、乙酰磺环己脲、格列吡脲、格列美脲、格列吡嗪、格列丁唑)、瑞格列奈、那格列奈、米格列奈或其钙盐水合物]；二肽基肽酶IV抑制剂(例如，维格列汀(LAF237)、P32/98、西他列汀(MK-431)、P93/01、PT-100、沙格列汀(BMS-477118)、T-6666、TS-021))；β3激动剂(例如，AJ-9677)；GPR40激动剂；类胰高血糖素的多肽(I)(glp I)、(glp2)或其它致糖尿病的肽激素；GLP-1受体激动剂[例如，GLP-1、GLP-1MR剂、N,N-2211、AC-2993(exendin-4)、BIM-51077、Aib(8,35)hGLP-l(7,37)NH2、CJC-[131]]；胰淀素激动剂(例如，普兰林肽)；磷酸酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，钒酸钠)；糖原异生抑制剂(例如，糖原磷酸化酶抑制剂、葡萄糖-6-磷酸酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂)；SGLUT(钠-葡萄糖共转运体)抑制剂(例如，T-1095)；11β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂(例如，BVT-3498)；脂联素或其激动剂；IKK抑制剂(例如，AS-2868)；改良瘦素抵抗的药物；生长抑素受体激动剂(WO01/25228、WO03/42204、W098/44921、W098/45285、W099/2273.5等中所述的化合物)；葡糖激酶活化剂(例如，Ro-28-1675)；GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素肽)。
在一些实施例中，本发明的多肽是与以下胰岛素增强剂组合使用：例如，包括(但不限于)牛磺酸、α硫辛酸、桑椹提取物、铬、谷氨酰胺、龙胆草、冰糖草、龙蒿提取物和穿心莲。在另一个实施例中，本发明可包含异麦芽酮糖醇、海藻糖或D-甘露糖中的一者或一者以上以进一步增强胰岛素的分泌或活性。在另一个实施例中，除另一种抗糖尿病药外还使用胰岛素增强剂和本发明的多肽。
可确定多肽和包括本发明多肽的组合疗法的治疗功效的一种方式是降低患者的HbAlc水平。在一个实施例中，本发明的多肽降低HbAlc水平，所述HbAlc水平与开始用经修饰FGF-21多肽治疗之前两个月的HbAlc水平相比、与开始用经修饰FGF-21多肽治疗之前三个月的HbAlc水平相比变化为或与基线相比变化百分比为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或至少50％。在另一个实施例中，投与也用抗糖尿病药治疗的患者的本发明多肽调节所述抗糖尿病药降低血糖的能力。在另一个实施例中，投与也用抗糖尿病药治疗的患者的本发明多肽降低HbAlc水平，所述HbAlc水平与开始用经修饰FGF-21多肽治疗之前两个月的HbAlc水平相比、与开始用经修饰FGF-21多肽治疗之前三个月的HbAlc水平相比变化为或与基线或治疗前基线相比变化百分比为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或至少50％。
在另一个实施例中，本发明的经修饰FGF-21多肽调节曲格列酮降低胰岛素需求的能力。在另一个实施例中，本发明的经修饰FGF-21多肽在投与正用曲格列酮治疗的患者时会进一步降低所述患者的胰岛素需求。在本发明的某些实施例中，与本发明组合使用的曲格列酮可用于延迟或预防2型糖尿病。
在本发明的一个实施例中，经修饰FGF-21多肽是与磺酰脲共同投与。在本发明的另一个实施例中，在用磺酰脲治疗之前投与经修饰FGF-21多肽。在本发明的另一个实施例中，在用磺酰脲治疗之后投与经修饰FGF-21多肽。在本发明的一些实施例中，用治疗剂量的经修饰FGF-21多肽治疗可调节血清葡萄糖。在另一个实施例中，本发明的FGF-21多肽是与调节所述多肽对血糖的影响的Klotho beta一起投与。在另一个实施例中，本发明的FGF-21多肽是与Klotho beta一起投与，这比单独使用经修饰FGF-21多肽更有效降低血糖。在另一个实施例中，使用HbAlc测试来测量这些变化。在另一个实施例中，将本发明的FGF-21多肽和Klotho beta投与到正用抗糖尿病药治疗的患者中，这比单独使用抗糖尿病药更有效降低血糖。
XV.本发明的FGF-21多肽的治疗用途
本发明的FGF-21多肽适用于治疗多种病症。
可使用本发明的FGF-21多肽来治疗罹患非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM：2型)、胰岛素依赖性糖尿病(1型)以及肥胖症、葡萄糖清除不足、高血糖症、高胰岛素血症以及可由FGF-21介导的任何其它疾病或病状的哺乳动物。葡萄糖耐受不良可定义为对葡萄糖的敏感性异常。高血糖症是定义为血液中的糖(葡萄糖)过量。高胰岛素血症是定义为血液中的胰岛素高于正常水平。胰岛素抵抗是定义为正常量的胰岛素产生低于正常的生物反应的状态。就人类个体来说，肥胖症可定义为体重比既定群体的理想体重超出20％(R.H.Williams,Textbook of Endocrinology,1974,第904-916页)。
糖尿病根据临床表现分为两大类：即，非胰岛素依赖性或成熟发作型，也称作2型；以及胰岛素依赖性或青少年发作型，也称作1型。在临床上，大多数2型成熟发作型糖尿患者者较为肥胖，通常在40岁以后出现疾病的临床症状表现。相比之下，尽管1型糖尿病可在任何年龄出现，但1型青少年发作患者相对于其年龄和身高来说并未超重，在年轻(通常30岁之前)时疾病迅速发作。
糖尿病是一种人类代谢病症，其在总群体中的发病率为约1％，其中这些群体中四分之一为1型(Foster,D.W.,Harrison's Principles of Internal Medicine,第114章,第661-678页,第10版,McGraw-Hill,New York)。所述疾病本身表现为一系列由激素诱发的代谢异常，其最终导致涉及若干器官系统(包括眼睛、肾脏、神经和血管)的严重的长期和衰弱的并发症。在病理上，所述疾病的特征为基底膜的病变，这可在电子显微镜下得到证实。
非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM：2型)是一种特征为高循环血糖、胰岛素和皮质类固醇水平的衰弱疾病。2型糖尿病的发病率较高且仍在上升，并且正变成全世界范围内死亡率、发病率和健康护理支出的主要原因(Amos等人,Diabetic Med.14:S1-85,1997)。
尚未充分了解2型糖尿病的病因。2型糖尿病的特征为尽管可使用胰岛素，但仍存在过量葡萄糖产生，并且循环葡萄糖水平因葡萄糖清除不足而仍然过高。认为标靶组织对胰岛素作用的抵抗与胰岛素分泌减少(“β细胞失效”)都发生。葡萄糖动态平衡的主要胰岛素反应性组织是肝脏，其中胰岛素刺激糖原合成并抑制糖原异生；肌肉，其中胰岛素刺激葡萄糖摄取，并且糖原刺激葡萄糖摄取并抑制脂肪分解。因此，由于糖尿病病状，血液中的葡萄糖水平升高，并且高血糖延长，这指示将造成血管和神经损伤的病状。
目前，存在多种治疗2型糖尿病的药理学方法(Scheen等人,Diabetes Care,22(9):1568-1577,1999)。其通过不同作用模式起作用：1)磺酰脲基本上刺激胰岛素分泌；2)双胍类(二甲双胍)通过促进葡萄糖利用、减少肝葡萄糖产生和减少肠葡萄糖输出而起作用；3)α-葡糖苷酶抑制剂(阿卡波糖、米格列醇)减缓碳水化合物消化并且因此减少从内脏中吸收碳水化合物，并减少膳食后高血糖；4)噻唑烷二酮(曲格列酮)增强胰岛素作用，因此促进周围组织中的葡萄糖利用；和5)胰岛素刺激组织葡萄糖利用并抑制肝葡萄糖输出。上述药理学方法可个别利用或以组合疗法形式利用。然而，各方法都具有其限制和不良作用。
肥胖症是现代社会非常流行的一种慢性疾病，并且其不仅与社会歧视有关，而且也与寿命降低以及包括不良心理发育、皮肤病学病症(例如感染)、静脉曲张、运动耐受力不足、糖尿病、胰岛素抵抗、高血压、高胆固醇血症和冠心病在内的众多医学问题有关。Rissanen等人,British Medical Journal,301:835-837(1990)。
肥胖症的现有疗法包括：标准饮食和运动；极低热量饮食；行为疗法；涉及食欲抑制剂、增加能量消耗的药物(thermogenic drug)、食物吸收抑制剂的药物疗法；机械装置，例如牙套(jaw wiring)、束腰(waist cord)和气球；以及手术。Jung和Chong,ClinicalEndocrinology,35:11-20(1991)；Bray,Am.J.Clin.Nutr.,55:538S-544S(1992)。
考虑到肥胖症在人类社会中的高流行性以及如上所述与其有关的严重后果，潜在适用于降低肥胖人员的体重的任何治疗性药物都可对其健康具有深远的有益影响。所属领域中需要将在无显著不良副作用的情况下将肥胖个体的总体重降低到其理想体重并且将有助于肥胖个体维持降低的体重水平的药物。
因此，希望提供一种适用于使肥胖个体的体重恢复到正常的理想体重的治疗方案。此外，希望提供一种肥胖症疗法，其使得长时期维持降低的体重。
在实验动物和人类中，肥胖症与胰岛素抵抗和糖尿病高度相关。实际上，肥胖症和胰岛素抵抗(其中后者通常伴随着高胰岛素血症或高血糖症或两者)是2型糖尿病的标志。另外，2型糖尿病使冠状动脉疾病的风险增加到两倍到四倍。尽管关于这些严重健康问题的研究已达数十年，但肥胖症和胰岛素抵抗的病因仍属未知。
1型糖尿患者者特征性地显示极低或不可测量的血浆胰岛素与升高的胰高血糖素。不管确切病因如何，大多数1型患者都具有针对其自身胰腺细胞的循环抗体，包括胰岛素抗体、针对胰岛细胞的细胞质的抗体和酶谷氨酸脱羧酶抗体。特异性针对β细胞(产生胰岛素的细胞)的免疫反应导致1型糖尿病。这种特异性得到上述临床图片支持，因为β细胞分泌胰岛素，而α细胞分泌胰高血糖素。
1型糖尿病的当前治疗方案包括调整饮食以最小化由于天然胰岛素缺乏而引起的高血糖，而天然胰岛素缺乏又是β细胞受损的结果。也关于胰岛素施用调整饮食以抵抗激素的低血糖作用。不管治疗形式如何，所有1型糖尿患者者都需要肠外胰岛素投与，因此称作“胰岛素依赖性”糖尿病。
因此，需要具有比可用医药方法少的副作用的有效的2型糖尿病疗法。此外，有效的胰岛素替代疗法也可适用于治疗1型糖尿病。本发明提供一种药理学疗法，其刺激葡萄糖摄取并增强周围组织中的胰岛素敏感性，并且具有比目前的2型糖尿病治疗方案少的副作用。另外，本发明提供一种1型糖尿病的替代治疗。此外，本发明因通过更快并且更有效的葡萄糖利用来增加能量消耗而适用于治疗肥胖症。
本发明提供一种治疗展现1型糖尿病、2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良或高血糖症中的一种或一种以上病症的哺乳动物的方法，其包含向需要所述治疗的所述哺乳动物投与治疗有效量的本发明的FGF-21多肽。
所述治疗方法可足以在所述哺乳动物中达到至少一种以下改变：体脂储存减少、胰岛素抵抗降低、高胰岛素血症减轻、葡萄糖耐受性增加和高血糖降低。
另一方面，本发明涉及一种治疗家畜(包括(但不限于)牛、猪、羊、马等)的方法，其包含投与有效量的FGF-21或其变异体，以减少体脂储存。家畜体内体脂储存的长期或永久性减少明显会对人类产生显著的经济利益，这尤其是因为动物供应人类饮食的大部分；并且动物脂肪可以脂肪重新堆积于人体中的形式终止。
成纤维细胞生长因子21(FGF-21)可用于降低与危重患者有关的发病率和死亡率。参看美国专利公开案第20050176631号，其是以全文引用的方式并入本文中。需要长时期加强护理的危重患者具有较高死亡风险和相当大的死亡率。接收患者进入加强护理病房(intensive care unit；ICU)的常见原因是与感染性侵袭(败血症)以及例如胰腺炎、局部缺血、多发性创伤与组织损伤、出血性休克和免疫介导的器官损伤等非感染性病理原因有关的全身性发炎反应综合症(SIRS)。本发明也涵盖一种降低罹患与感染性侵袭以及非感染性病理原因有关的全身性发炎反应综合症(SIRS)的危重患者的死亡率和发病率的方法，其包含向危重患者投与治疗有效量的FGF-21。涉及SIRS的病状的实例包括败血症、胰腺炎、局部缺血、多发性创伤与组织损伤、出血性休克、免疫介导的器官损伤、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、休克、肾衰竭和多器官功能障碍综合症(MODS)。本发明也涵盖一种降低罹患呼吸窘迫的危重患者的死亡率和发病率的方法
SIRS的常见并发症是器官系统功能障碍的发展，包括急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、休克、肾衰竭和多器官功能障碍综合症(MODS)，其全部都扩大不利结果的风险。尽管许多专家认为一些类型的营养支持对帮助危重患者恢复代谢稳定性有益，但由于缺乏良好控制的随机临床试验，所述支持的益处和详细说明仍存在争议。
因为在给予营养支持的危重患者中常见高血糖和胰岛素抵抗，所以一些ICU投与胰岛素来治疗进食的危重患者的过量高血糖。事实上，最近研究证实使用外源胰岛素将血糖维持在不高于110毫克/分升的水平可降低手术加强护理病房中危重患者的发病率和死亡率，而不管其是否具有糖尿病史(Van den Berghe等人,N Engl J Med.,345(19):1359,2001)。
本发明涵盖一种通过投与FGF-21而降低这些危重患者的死亡率和发病率的方法。本发明所涵盖的危重患者一般经历不稳定的高代谢状态。这种不稳定的代谢状态是由于基质代谢的改变，其可导致一些营养素的相对缺乏。脂肪与肌肉的氧化通常增加。
投与FGF-21可降低死亡率和发病率的风险的危重患者优选是经历全身性发炎反应综合症或呼吸窘迫的患者。发病率降低意思是降低危重患者将患上其它疾病、病状或症状的可能性或降低其它疾病、病状或症状的严重性。举例来说，发病率降低可对应于菌血症或败血症或与多器官衰竭相关的并发症的发生率降低。
全身性发炎反应综合症(SIRS)描述与大量临床病状相关的发炎过程并且包括(但不限于)以下临床表现中的一种以上表现：(1)体温高于38℃或低于36℃；(2)心率高于每分钟90次；(3)呼吸急促，表现为呼吸速率大于每分钟20次呼吸；或换气过度，如PaCo2小于32mm Hg所示；以及(4)白细胞计数的改变，例如计数大于12,000/cu mm，计数小于4,000/cu mm，或存在10％以上的不成熟嗜中性白细胞。这些生理变化应表示在不存在所述异常的其它已知原因(例如化学疗法、诱导性嗜中性粒细胞减少症和白细胞减少症)的情况下与基线相比的急性改变。
败血症是定义为由感染引起的SIRS。SIRS的非感染性致病原因可包括胰腺炎、局部缺血、多发性创伤与组织损伤(包括但不限于挤压性损伤或严重烧伤)、出血性休克、免疫介导的器官损伤，以及发炎过程中例如肿瘤坏死因子和其它细胞因子等推定介体的外源投与。
败血性休克和多器官功能障碍是ICU环境中发病率和死亡率的主要原因。败血症与多种宿主防御机制(包括细胞因子网络、白细胞和补体级联以及包括内皮的凝血/血纤维蛋白溶解系统)有关并且由其介导。与多个器官的微脉管系统内的血纤维蛋白沉积有关的弥散性血管内凝血(DIC)和其它程度的消耗性凝血病是败血症/败血性休克的表现。宿主防御反应对目标器官的下游作用是多器官功能障碍综合症(MODS)的发展中的重要介体并且造成患有败血症、严重败血症和败血症并发休克的患者的不良预后。
呼吸窘迫表示患者因一些类型的肺功能障碍而具有呼吸困难的病状。这些患者通常展现不同程度的血氧不足，其可能难以或可能不难通过用补充氧气治疗来控制。呼吸窘迫可发生在由于直接肺损伤而具有受损肺功能的患者中，或者可能由于间接肺损伤(例如在全身性过程的情形中)而发生。另外，存在多种素因性病症实质上增加风险，正如存在例如慢性酒精滥用、慢性肺病和低血清pH值等次要因素一样。
一些直接肺损伤原因包括肺炎、胃内容物误吸、肺挫伤、脂肪栓塞、近溺水、吸入损伤、高山病(high altitude)和在肺移植或肺栓子切除术后的再灌注肺水肿。一些间接肺损伤原因包括败血症、伴有休克和多供体输血的严重外伤；体外循环(cardiopulmonarybypass)、药物过量、急性胰腺炎和血制品的输注。
一类造成呼吸窘迫的肺部病症与被称作肺心病(Cor Pulmonale)的综合症有关。这些病症与慢性血氧不足有关，从而导致肺循环内压力升高(被称作肺高压)。随后的肺高压增加右心室的工作负荷，因此导致其增大或肥大。肺心病通常表现为右心衰竭，右心衰竭是定义为右心室压力持续增加并且临床证据显示回到右心的静脉减少。
慢性阻塞性肺病(COPD)(其包括肺气肿和慢性支气管炎)也造成呼吸窘迫并且以空气流动阻塞为特征。COPD是第四大死亡原因并且每年带走100,000条以上的生命。
急性呼吸窘迫综合症(ARDS)一般是进行性的并且以不同阶段为特征。所述综合症一般表现为具有所述病状的风险因子的患者中呼吸衰竭的快速发作。难以通过用补充氧气治疗来控制的动脉血氧不足是典型特征。可存在肺泡充填、固结和在相关肺区中存在的肺膨胀不全；然而，非相关区域可能具有实质炎症。所述综合症可发展为纤维性肺泡炎伴随持续血氧不足，增加肺泡死亡空间并且进一步降低肺顺应性。也可产生由肺部毛细血管床损伤而引起的肺高压。
临床肺损伤的严重性不同。本发明涵盖具有低严重性血氧不足(定义为动脉氧分压与吸入氧部分的比率为300或300以下)的患者与具有较严重的血氧不足(定义为动脉氧分压与吸入氧部分的比率为200或200以下)的患者。具有300或300以下的比率的患者一般被归类为具有急性肺损伤，而具有200或200以下的比率的患者被归类为具有急性呼吸窘迫综合症。
急性肺损伤的急性期的特征为由于肺泡毛细血管障壁的血管渗透性增大而使富含蛋白质的水肿液流入空气空间中。使渗透性发生改变的上皮完整性的丧失可以造成肺泡淹溺(alveolar flooding)，破坏正常流体输送(其影响水肿液从肺泡空间的移除)，降低表面活性剂的产生和更新，在患有细菌性肺炎的患者中导致败血性休克，并且造成纤维化。败血症与发展为急性肺损伤的最高风险有关。
在例如败血症等病状中，如果出现代谢亢进，那么蛋白质分解应加速以便维持糖原异生并且释放出蛋白质合成增加所需的氨基酸。可呈现高血糖症并且可呈现血清中高浓度的甘油三酯和其它脂质。
对于呼吸功能受损的患者，代谢亢进可影响二氧化碳产生与氧气消耗的比率。这一比率被称作呼吸商(R/Q)并且在正常个体中介于约0.85与约0.90之间。过量脂肪代谢具有降低R/Q的趋势，而过量葡萄糖代谢使R/Q升高。呼吸窘迫患者通常难以消除二氧化碳并且因此具有异常高的呼吸商。
本发明所涵盖的危重患者通常也经历特征为大多数细胞产物的短暂下调和热休克蛋白上调的特定应激反应。此外，此应激反应涉及例如胰高血糖素、生长激素、皮质醇(Cortisol)和促炎性细胞因子和消炎细胞因子等激素的活化。尽管此应激反应似乎具有保护作用，但所述反应也在这些危重患者中产生其它代谢不稳定性。举例来说，这些特定激素的活化造成血清葡萄糖升高，其导致高血糖症。另外，对心脏和其它器官的损伤可因肾上腺素能刺激而加剧。此外，可能存在对甲状腺的改变，其可能对代谢活性具有显著影响。
FGF-21的平均量可改变并且尤其应以合格医师的推荐和处方为基准。FGF-21的确切量优选受例如以下因素影响：所治疗的病状的确切类型、所治疗患者的健康状况以及组合物中的其它成分。本发明也提供投与治疗有效量的另一种活性剂。所属领域的技术人员可根据利用FGF-21的疗法容易地确定所给与的量。
可以常规方式来制造本发明的医药组合物。
实例
提供以下实例来说明(但并不限制)所主张的本发明。
实例1
本实例描述用于选择FGF-21中并入非天然编码氨基酸的位点的许多组可能的标准中的一组。
图1显示如使用载体NTI(Invitrogen；Carlsbad,CA)所测定的FGF-21(蛋白质寄存编号BCO18404)与FGF-19(蛋白质寄存编号BAA75500)之间的序列同源性。这两种分子之间用星号标明的氨基酸是类似的。这两种多肽之间加下划线的氨基酸是相同的。通过用非天然编码氨基酸取代天然编码氨基酸而产生若干种不同的FGF-21多肽。各多肽具有一种经对乙酰基苯丙氨酸取代的氨基酸(图1中用矩形标明)。所产生的多肽缺乏图1和图3中所示的前导序列，并且在N末端处由6个组氨酸残基进行His标记。SEQ ID NO.:1是不具有前导序列的人类FGF-21(P形式)的181个氨基酸的序列。SEQID NO.:2是不具有前导序列并且在N末端具有His标签的人类FGF-21(P形式)的序列。所产生的各多肽在SEQ ID NO:1的下列位置10、52、77、117、126、131和162中的一个位置处具有非天然编码氨基酸取代。
图2显示获自蛋白质数据库(Protein Data Bank；PDB)(Bernstein等人,J.Mol.Biol1997,112,第535页)(1PWA)并且使用PyMOL软件(DeLano Scientific；Palo Alto,CA)标记的人类FGF-19的结构。在本发明的FGF-21多肽中，对应于FGF-19的V34、L79、G104、S144、K155、L160和S196的氨基酸是由对乙酰基苯丙氨酸取代。虚线表示原始结构中未解析的区域。
图3显示如使用载体NTI(Invitrogen；Carlsbad,CA)所测定的FGF-21(蛋白质寄存编号BCO18404)与FGF-2(蛋白质寄存编号BAA75500)之间的序列同源性。这两种分子之间用星号标明的氨基酸是类似的。这两种多肽之间加下划线的氨基酸是相同的。图1中显示作为取代位点的7个氨基酸也位于图3的矩形中。
图4显示获自PDB(1CVS)并且使用PyMOL软件(DeLano Scientific；Palo Alto,CA)标记的人类FGF-2结构的结构。灰色结构是人类FGF受体1(FGFR1)，并且黑色结构是人类FGF2。Plotnikov,AN等人,Cell.1999年9月3日；98(5):641-50描述与FGF受体结合的FGF2的晶体结构。在本发明的FGF-21多肽中，对应于FGF-2的F21、K62、K86、V125、K134、T139的氨基酸是由对乙酰基苯丙氨酸取代。虚线表示原始结构中未解析的区域。
另一组用于选择并入非天然编码氨基酸的优选位点的标准如下。使用10种来自蛋白质数据库的晶体结构来模拟FGF-21的结构：1PWA(人类FGF-19)；1IJT(人类FGF-4)；1NUN(人类FGF10-FGF受体2b复合物)；1G82(具有FGF受体和肝素的人类FGF-9二聚物)；1IHK(人类FGF-9)；1BAR(牛FGF-1)；1QQK(大鼠FGF-7)；1K5U(人类FGF-1)；1FQ9(具有FGF受体1和肝素的人类FGF-2)；和2FDB(具有FGF受体2c的人类FGF-8b)。这些结构的坐标可获自蛋白质数据库(PDB)(Bernstein等人,J.Mol.Biol.1997,112,第535页)。核心结构中晶体结构的比较表示其都是极为类似的。然而，发现这些FGF分子的N末端和C末端极为不同，并且因此无法模拟所述末端。所述模拟鉴别出两个残基，即Y22和Y104，其高度保守并且与受体结合有关。也鉴别出两个潜在的肝素结合位点，其涉及R36和E37。关于受体结合所鉴别的氨基酸位置和肝素结合残基对应于SEQ ID NO:1。
因此，鉴别以下残基：1)其不会干扰与FGF受体或肝素的结合，2)其不会存在于蛋白质的内部，以及3)其将处于晶体结构相当一致的区域中。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在(但不限于)FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置处并入：SEQ ID NO:1的87、77、83、72、69、79、91、96、108和110或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在(但不限于)FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置处并入：SEQ ID NO:1的87、77、83、72或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸是在(但不限于)FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置处并入：SEQ ID NO:1的69、79、91、96、108和110或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸。
使用以下标准来评估用于引入非天然编码氨基酸的各FGF-21位置：(a)根据结构分析，残基不应干扰与FGF-21受体的结合；(b)残基不应受丙氨酸或同源物扫描诱变影响；(c)残基应为表面暴露的并且展现与周围残基的最小范德华力(van der Waals)或氢键合相互作用；(d)残基应在FGF-21变异体中缺失或可变；(e)残基在经非天然编码氨基酸取代后会产生保守性变化；并且(f)残基可存在于高度可挠性区域或结构呈刚性的区域中。
也可使用FGF家族成员的其它或不同的晶体结构(例如FGF-23和/或FGF-19的结构)来选择FGF-21中并入一个或一个以上非天然编码氨基酸的位点。举例来说，人类FGF-19(PDB ID 2P23)的晶体结构和/或人类FGF-19(PDB ID 2P23)和/或人类FGF-23(PDB ID 2P39)的晶体结构可提供关于选择FGF-21中并入非天然编码氨基酸的位点的其它信息。这些位点可在蛋白质的不同区域中，所述区域包括(但不限于)N末端和C末端、受体结合和肝素结合区域。另外，可利用Cx程序(Pintar等人,(2002)Bioinformatics,18,第980页)对FGF-21分子进行进一步计算以评估各蛋白质原子突出的程度。
在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：10、52、117、126、131、162、87、77、83、72、69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：10、52、77、117、126、131和162(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：87、77、83、72(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入FGF-21的以下位置中的一个或一个以上位置中：69、79、91、96、108和110(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。
实例2
本实例详述包括非天然编码氨基酸的FGF-21多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。本实例也描述一种分析经修饰FGF-21多肽的生物活性的方法。
所属领域的技术人员已知用于克隆FGF-21的方法。FGF-21的多肽和多核苷酸序列和将FGF-21克隆到宿主细胞中是详述于美国专利第6,716,626号；美国专利公开案第2005/0176631号、第2005/0037457号、第2004/0185494号、第2004/0259780号、第2002/0164713号和第2001/0012628号；WO 01/36640；WO 03/011213；WO 03/059270；WO 04/110472；WO 05/061712；WO 05/072769；WO 05/091944；WO 05/113606；WO06/028595；WO 06/028714；WO 06/050247；WO 06/065582；WO 06/078463中，所述文献是以全文引用的方式并入本文中。
编码不具有前导序列的FGF-21的P形式的cDNA是以SEQ ID NO:8展示。所述多肽以SEQ ID NO:1展示。
编码不具有前导序列的FGF-21的经His标记的P形式的cDNA是以SEQ ID NO:9展示。所述多肽以SEQ ID NO:2展示。
编码具有含有3个亮氨酸一起的前导序列的FGF-21的P形式的cDNA是以SEQ IDNO:10展示。所述多肽以SEQ ID NO:3展示。
编码具有含有2个亮氨酸一起的前导序列的FGF-21的P形式的cDNA是以SEQ IDNO:11展示。所述多肽以SEQ ID NO:4展示。
编码不具有前导序列的FGF-21的L形式的cDNA是以SEQ ID NO:12展示。所述多肽以SEQ ID NO:5展示。
编码具有含有3个亮氨酸一起的前导序列的FGF-21的L形式的cDNA是以SEQ IDNO:13展示。所述多肽以SEQ ID NO:6展示。
编码具有含有2个亮氨酸一起的前导序列的FGF-21的L形式的cDNA是以SEQ IDNO:14展示。所述多肽以SEQ ID NO:7展示。
使用所引入的包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的FGF-21。O-RS优先利用非天然编码氨基酸使O-tRNA氨酰基化。接着，所述翻译系统回应经编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入FGF-21中。合适的O-RS和O-tRNA序列是描述于标题为“Compositions ofAminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof”的WO 2006/068802(E9；SEQ ID NO:15)以及标题为“Compositions of tRNA and Uses Thereof”的WO 2007/021297(F13；SEQ IDNO:16)中，所述文献是以全文引用的方式并入本文中。
表2：O-RS和O-tRNA序列
用含有经修饰FGF-21基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需的非天然编码氨基酸具特异性)的质粒转化大肠杆菌允许将非天然编码氨基酸位点特异性地并入FGF-21多肽中。
使用标准方案根据cDNA合成反应通过PCR来扩增获自健康人类肝polyA+mRNA(Biochain)的野生型成熟FGF-21，并且克隆到pET30(NcoI-BamHI)中。在序列证实后，在源自大肠杆菌脂蛋白启动子序列的合成启动子(Miller,J.H.,Gene,1986)的组成性控制下将包括N末端HHHHHHSGG序列的FGF-21亚克隆到含有来自詹氏甲烷球菌的琥珀抑制因子酪氨酰基tRNATyr/CUA(Mj tRNATyr/CUA)的抑制载体中，以及在大肠杆菌GlnRS启动子控制下亚克隆到含有正交酪氨酰基tRNA合成酶(MjTyxRS)的抑制载体中。FGF-21的表达是在T7启动子的控制下。使用标准快速改变突变方案(Stratagene；La Jolla,California)引入琥珀突变。所有构筑体都经过序列验证。
用对乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)进行抑制
将质粒(pVK3-HisFGF21)转化到大肠杆菌的W3110B2菌株中，其中T7聚合酶的表达是在阿拉伯糖可诱导的启动子的控制下。将隔夜细菌培养物以1:100稀释到含有2X YT培养基的振荡烧瓶中并且在37℃下生长到OD600为约0.8。通过加入阿拉伯糖(0.2％最终浓度)来诱发蛋白质表达，并且加入对乙酰基-苯丙氨酸(pAcF)到最终浓度为4mM。将培养物在37℃下培育4小时。使细胞成球状并且再悬浮于B-PER溶解缓冲液(Pierce)100μl/OD/ml+10μg/ml脱氧核糖核酸酶中并且在37℃下培育30分钟。通过离心去除细胞物质并且去除上清液。将小球再悬浮于等量SDS-PAGE蛋白质负载缓冲液中。将所有样品都装载到具有MES和DTT的4-12％PAGE凝胶上。所属领域的技术人员已知FGF-21的纯化方法，并且所述方法由SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾-电离离子阱质谱等证实。
N末端经His标记的FGF-21的表达和7个琥珀位点处的抑制是由图5展示。用箭头标明FGF-21多肽。图5显示B-PER小球样品：1道：标记；2道：VK3-FGF21预诱导，上清液；3道：VK3-FGF21预诱导，小球；4道：VK3-FGF210.2％阿拉伯糖，上清液；5道：VK3-FGF210.2％阿拉伯糖，小球；6道：VK3-FGF21-pAcF-L10，0.2％阿拉伯糖；7道：VK3-FGF21-pAcF-L52，0.2％阿拉伯糖；8道：VK3-FGF21-pAcF-R77，0.2％阿拉伯糖；9道：VK3-FGF21-pAcF-HI17，0.2％阿拉伯糖；10道：VK3-FGF21-pAcF-R126，0.2％阿拉伯糖；11道：VK3-FGF21-pAcF-R131，0.2％阿拉伯糖；12道：VK3-FGF21-pAcF-S162，0.2％阿拉伯糖。关于氨基酸取代所指示的位置编号是根据SEQID NO:1。
图6显示B-PER上清液样品：1道：VK3-FGF21预诱导，上清液；2道：VK3-FGF21预诱导，小球；3道：标记；4道：VK3-FGF210.2％阿拉伯糖，上清液；5道：VK3-FGF210.2％阿拉伯糖，小球；6道：VK3-FGF21-pAcF-L10，0.2％阿拉伯糖；7道：VK3-FGF21-pAcF-L52，0.2％阿拉伯糖；8道：VK3-FGF21-pAcF-R77，0.2％阿拉伯糖；9道：VK3-FGF21-pAcF-H117，0.2％阿拉伯糖；10道：VK3-FGF21-pAcF-R126，0.2％阿拉伯糖；11道：VK3-FGF21-pAcF-R131，0.2％阿拉伯糖；12道：VK3-FGF21-pAcF-S162，0.2％阿拉伯糖。关于氨基酸取代所指示的位置编号是根据SEQ ID NO:1。
可使用所属领域的技术人员已知的方法来纯化经His标记的突变FGF-21蛋白。可经由制造商所提供的标准His标记蛋白纯化程序来使用ProBond镍螯合树脂(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
开发出pVK10(图24)供未经标记的FGF-21蛋白使用，其具有图25中给出的序列。此为用于制造R36am和Y83am突变体的载体并且稍后在实例中存在关于此非His标记FGF-21突变蛋白和其纯化的其它资料并且显示在整个图式中。
3T3-L1分化为脂肪细胞以及葡萄糖摄取检定
为分析FGF-21多肽的生物活性，可进行以下检定。将小鼠3T3-L1成纤维细胞(ATCC#CL-173)接种在具有含有10％牛血清的DMEM的10cm盘中。使细胞保持不高于70％的密度以进行扩充。在开始分化为脂肪细胞之前，使细胞达到100％长满；必须每隔两天更换培养基。对细胞进行计数并且以每孔25,000个细胞的密度接种到96孔板中(也可将细胞涂于Cytostar-T96孔板中)并且再培育48小时。通过在去除先前培养基后加入以下培养基来诱导分化：补充有10％FBS(胎牛血清)、1μM地塞米松(DBX)、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和5μg/mL胰岛素的DMEM。一种诱导分化的替代方式是用1μM罗格列酮处理细胞并且培育6天，随后将培养基更换为DMEM/10％FBS，因为这是一种诱导3T3-L1成纤维细胞分化成脂肪细胞的较快方式。第三种可能性是将两种程序组合以缩短分化时间。
在向细胞中加入含有DBX/IBMX/胰岛素的培养基之后，将细胞培育48小时。将培养基更换为DMEM/10％FBS/5μg/mL胰岛素，并且将细胞培育48小时。随后将培养基更换为DMEM/10％FBS并且每隔两天用新鲜培养基替换所述培养基。细胞将分化7-14天。分化细胞积累脂质液滴。可用OIL RED O将细胞染色。一旦95％脂肪细胞含有脂质液滴，所述细胞即可用于葡萄糖摄取检定。
在补充有0.1％不含脂肪酸的BSA的DMEM中用FGF-21(1μg/mL)处理分化的3T3-L1达18小时以使细胞挨饿。随后用补充有0.1％FAF-BSA的Kreb's-Ringer HEPES缓冲液(KRH＝0.118M NaCl、5mM KCl、2.54mM CaCl2、1.19mM KH2PO4、1.19mMMgSO4和20mM HEPES)将细胞洗涤3次。通过向KRH/0.1％FAF-BSA缓冲液中加入4μCi、0.1mM2-脱氧D-[1-3H]-葡萄糖来制备标记混合物。加入细胞并且在37℃下培育1小时。通过用含有20μM细胞松弛素B的冰冷PBS将细胞洗涤两次来终止反应。将板吸干以消除任何残余缓冲液。向各孔中加入闪烁液体并且用TopCounter对样品计数。
一种测量葡萄糖摄取的替代方法是用非放射性底物(2-NBDG)来负载分化的3T3-L1细胞并且用荧光板读取器读数。一种测量葡萄糖摄取的间接程序是测量GLUT1或GLUT4在细胞膜表面上的表达。GLUT1和GLUT4是在胰岛素或FGF-21刺激后从内部囊泡中转移到细胞膜表面上的葡萄糖转运体。可开发关于肝细胞的ELISA。
实例3
本实例详述含羰基的氨基酸的引入以及其与含氨氧基的PEG的后续反应。
本实例展示一种产生合并有含酮的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽的方法，所述多肽随后与约5,000MW的含氨氧基的PEG反应。在位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处的各残基分别由具有以下结构的非天然编码氨基酸取代：
用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性地并入FGF-21中的序列为SEQ ID NO:1(FGF-21)和SEQ ID NO:16或17(muttRNA，詹氏甲烷球菌)，以及在上述实例2中所述的15、29、30或31(TyrRS LW1、5或6)。
包含含羰基的氨基酸的FGF-21多肽变异体在经修饰后与以下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，
其中R为甲基，n为3并且N为约5,000MW。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化FGF-21以10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH4.5)中，与10倍到100倍过量的含氨氧基的PEG反应，并且随后在室温下搅拌10-16小时(Jencks,W.J.Am.Chem,Soc.1959,81,第475页)。随后，将PEG-FGF-21稀释于适当缓冲液中以进行立即纯化和分析。
实例4
与由通过酰胺键联与PEG连接的羟胺基组成的PEG接合。
具有以下结构的PEG试剂是使用实例3中所述的程序与含酮的非天然编码氨基酸偶合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2，
其中R为甲基，n＝4并且N为约20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。
实例5
本实例详述将两种不同的非天然编码氨基酸引入FGF-21多肽中。
本实例展示一种产生在以下残基中的两个位置处并入包含酮官能团的非天然编码氨基酸的FGF-21多肽的方法：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)。除选择密码子是在核酸内的两个不同位点处引入之外，如实例1和实例2中所述来制备FGF-21多肽。
实例6
本实例详述FGF-21多肽与含酰肼的PEG的接合以及后续的原位还原。
合并有含羰基的氨基酸的FGF-21多肽是根据实例2和实例3中所述的程序来制备。具有以下结构的含酰肼的PEG在经修饰后与FGF-21多肽接合：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2，
其中R为甲基，n＝2且N＝10,000MW，并且X为羰基(C＝O)。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化FGF-21在介于0.1-10mg/mL之间的浓度下溶解于25mM MES(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH4.5)中，与1倍到100倍过量的含酰肼的PEG反应，并且通过加入溶解于H2O中直到最终浓度为10-50mM的储备液1M NaCNBH3(Sigma Chemical,St.Louis,MO)原位还原相应腙。在黑暗环境中在4℃到室温下进行反应达18-24小时。通过加入约pH7.6的1M Tris(Sigma Chemical,St.Louis,MO)直到最终Tris浓度为50mM来终止反应或将反应稀释于适当缓冲液中以进行立即纯化。
实例7
本实例详述将含炔的氨基酸引入FGF-21多肽中以及用mPEG-叠氮化物使其衍生化。
在位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处的残基各自由以下非天然编码氨基酸取代：
用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入FGF-21中的序列为SEQ ID NO:1(FGF-21)、SEQ ID NO:16或17(muttRNA，詹氏甲烷球菌)以及在上文实例2中所述的22、23或24。在大肠杆菌中表达含有炔丙基酪氨酸的FGF-21多肽并且使用实例3中所述的条件进行纯化。
将含有炔丙基-酪氨酸的经纯化FGF-21在介于0.1-10mg/mL的浓度下溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH＝8)中并且向反应混合物中加入10倍到1000倍过量的含叠氮基的PEG。随后，将催化量的CuSO4和铜丝加入反应混合物中。在混合物经培育(包括(但不限于)在室温或37℃下约4小时，或在4℃下整夜)后，加入H2O并且通过透析膜过滤混合物。可包括(但不限于)通过实例3中所述的类似程序来分析样品的添加。
在本实例中，PEG将具有以下结构：
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3，
其中R为甲基，n为4并且N为10,000MW。
实例8
本实例详述FGF-21多肽中用炔丙基酪氨酸取代大的疏水性氨基酸。
FGF-21的以下区域中的一个位置中存在的Phe、Trp或Tyr残基：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)，是如实例7中所述由以下非天然编码氨基酸取代：
PEG在经修饰后连接到包含含炔的氨基酸的FGF-21多肽变异体上。PEG将具有以下结构：
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3，
并且偶合程序将遵循实例7中的程序。这个过程会产生FGF-21多肽变异体，其包含大致与一种天然存在的大的疏水性氨基酸等比容的非天然编码氨基酸并且在所述多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰。
实例9
本实例详述由一个或一个以上PEG连接子分隔的FGF-21多肽同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物的产生。
使实例7中产生的含炔的FGF-21多肽变异体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3，
其中n为4并且PEG具有约5,000的平均MW，以产生两个FGF-21分子由PEG物理分隔开的相应FGF-21多肽同型二聚物。FGF-21多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合以形成异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。将如同实例7和实例3中进行偶合、纯化和分析。
实例10
本实例详述糖部分与FGF-21多肽的偶合。
在位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:2-7中的相应氨基酸)处的一个残基是如实例3中所述由以下非天然编码氨基酸取代：
包含含羰基的氨基酸的FGF-21多肽变异体在经修饰后与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β-连接氨氧基类似物反应。在100mM水性乙酸钠缓冲液(pH5.5)中混合FGF-21多肽变异体(10mg/mL)与氨氧基糖(21mM)，并且在37℃下培育7小时到26小时。通过在环境温度下将接合糖的FGF-21多肽(5mg/mL)与UDP-半乳糖(16mM)和β-1,4-半乳糖基转移酶(0.4单位/毫升)在150mM HEPES缓冲液(pH7.4)中培育48小时而使第二种糖与第一种糖酶促偶合(Schanbacher等人,J.Biol.Chem.1970,245,5057-5061)。
实例11
本实例详述聚乙二醇化FGF-21多肽拮抗剂的产生。
残基(包括(但不限于)与FGF-21受体结合有关的残基)是如实例3中所述由以下非天然编码氨基酸取代：
包含含羰基的氨基酸的FGF-21多肽变异体在经修饰后与以下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应：
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2，
其中R为甲基，n为4并且N为20,000MW，以产生在多肽内的单一位点处经PEG衍生物修饰的包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽拮抗剂。如同实例3中进行偶合、纯化和分析。
实例12
直接连接FGF-21分子的FGF-21多肽同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物的产生
包含含炔的氨基酸的FGF-21多肽变异体可与另一种包含含叠氮基的氨基酸的FGF-21多肽变异体直接偶合。FGF-21多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合以形成异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。如同实例3、实例6以及实例7中进行偶合、纯化和分析。
实例13
PEG-OH+Br-(CH2)n-C≡CR'→PEG-O-(CH2)n-C≡CR'
A      B
使聚烷二醇(P-OH)与烷基卤化物(A)反应形成醚(B)。在这些化合物中，n为1到9的整数并且R'可为直链或支链、饱和或不饱和的C1到C20烷基或杂烷基。R'也可为C3到C7饱和或不饱和的环状烷基或环状杂烷基，经取代或未经取代的芳基或杂芳基，或经取代或未经取代的烷芳基(所述烷基为C1到C20饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。通常，PEG-OH为具有800道尔顿到40,000道尔顿(Da)的分子量的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例14
mPEG-OH+Br-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C≡CH
用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后，将溶解于二甲苯中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液(0.56mL，5mmol，50当量，Aldrich)和催化量的KI加入溶液中并且将所得混合物加热到回流历时2小时。随后加入水(1mL)并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)并且分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积缩减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用若干份冷乙醚洗涤并干燥，得到炔丙基-O-PEG。
实例15
mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH→mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后，将50当量的5-溴-1-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)和催化量的KI加入混合物中。将所得混合物加热到回流历时16小时。随后加入水(1mL)并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)并且分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积缩减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用若干份冷乙醚洗涤并干燥，得到相应炔。5-氯-1-戊炔可用于类似反应中。
实例16
(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH+Br-CH2-C≡CH→m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3→m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr→m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4)mPEG-OH+m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
首先向3-羟基苄醇(2.4g，20mmol)溶于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中加入粉末状氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)，并且随后加入溶解于二甲苯中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液(3.36mL，30mmol)。将反应混合物在回流下加热6小时。向混合物中加入10％柠檬酸(2.5mL)并且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥并浓缩，得到3-炔丙基氧基苄醇。
在0℃下，将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)加入化合物3(2.0g，11.0mmol)溶于CH2Cl2中的溶液中，并且将反应液放置到冰箱中达16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中并且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流历时1小时并且随后冷却到室温。向混合物中加入水(2.5mL)并在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到所需溴化物。
将mPEG-OH20kDa(1.0g，0.05mmol，Sunbio)溶解于THF(20mL)中并且在冰浴中冷却所述溶液。在强烈搅拌下历经数分钟加入NaH(6mg，0.25mmol)，接着加入上文获得的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量的KI。移除冷却浴并且将所得混合物加热到回流历时12小时。向混合物中加入水(1.0mL)并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)并且分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积缩减到约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中，产生白色沉淀物，收集所述沉淀物以得到PEG衍生物。
实例17
mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C≡CR'→mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR'
如上所示，也可通过使含有末端官能团的聚乙二醇聚合物与含有炔官能团的反应性分子偶合来获得末端含炔的聚乙二醇聚合物。n介于1与10之间。R'可为H或C1到C4的小烷基。
实例18
(1)HO2C-(CH2)2-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
将4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解于CH2Cl2(25mL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g，3.3mmol)和DCC(4.66g，3.0mmol)并且在室温下将溶液搅拌整夜。所得粗NHS酯7未经进一步纯化即用于下一反应中。
将具有5,000Da的分子量的mPEG-NH2(mPEG-NH2，1g，Sunbio)溶解于THF(50mL)中并且将混合物冷却到4℃。在强烈搅拌下逐份加入NHS酯7(400mg，0.4mmol)。将混合物搅拌3小时，同时升温到室温。随后加入水(2mL)并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(50mL)并且分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积缩减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物并在真空中干燥。
实例19
本实例表示聚乙二醇的甲烷磺酰基酯(其也可称作聚乙二醇的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯)的制备。可通过类似程序来制备相应的甲苯磺酸酯和卤化物。
mPEG-OH+CH3SO2C1+N(Et)3→mPEG-O-SO2CH3→mPEG-N3
在氮气下，将150mL甲苯中的mPEG-OH(MW＝3,400，25g，10mmol)共沸蒸馏2小时并且将溶液冷却到室温。将40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺(15mmol)加入溶液中。在冰浴中冷却所述溶液并且逐滴加入1.2mL经蒸馏的甲烷磺酰氯(15mmol)。在氮气下，在室温下，将溶液搅拌整夜，并且通过加入2mL无水乙醇来中止反应。在真空下蒸发所述混合物以移除溶剂(主要是除甲苯之外的溶剂)，过滤，再次真空浓缩并且随后在100mL乙醚中沉淀。用数份冷乙醚洗涤滤液并在真空下干燥，得到甲磺酸酯。
将甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75ml THF中并且将溶液冷却到4℃。向冷却的溶液中加入叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下，将反应加热到回流历时2小时。随后蒸发溶剂并且用CH2Cl2(50mL)稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机馏分并且用无水MgSO4干燥。将体积缩减到20ml，并通过加入150ml冷的无水乙醚中使产物沉淀。
实例20
(1)N3-C6H4-CO2H→N3-C6H4CH2OH
(2)N3-C6H4CH2OH→Br-CH2-C6H4-N3
(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3→mPEG-O-CH2-C6H4-N3
可使用美国专利第5,998,595号中所述的方法来制备4-叠氮基苄醇，所述专利是以引用的方式并入本文中。在0℃下将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)加入4-叠氮基苄醇(1.75g，11.0mmol)溶于CH2Cl2中的溶液中，并且将反应液放置到冰箱中达16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中并且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流历时1小时并且随后冷却到室温。向混合物中加入水(2.5mL)并在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到所需溴化物。
用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理mPEG-OH20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)并且向混合物中加入溴化物(3.32g，15mmol)和催化量的KI。将所得混合物加热到回流历时12小时。将水(1.0mL)加入混合物中并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)并且分离有机层，用无水Na2SO4干燥，并将体积缩减到约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中，产生沉淀物，收集所述沉淀物以得到mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
实例21
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS→N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
将NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW3,400Da，2.0g)溶解于NaHCO3饱和水溶液(10mL)中并且将溶液冷却到0℃。在强烈搅拌下加入丙酸3-叠氮基-1-N-羟基琥珀酰亚胺酯(5当量)。3小时后，加入20mL H2O并且在室温下再将混合物搅拌45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节到3并且加入NaCl直到浓度为约15重量％。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，用Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物并在真空下干燥，得到ω-羧基-叠氮化物PEG衍生物。
实例22
mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
在强烈搅拌下，向如所属领域中已知所制备并冷却到-78℃的乙炔锂(4当量)溶于THF中的溶液中逐滴加入溶解于THF中的mPEG-OMs溶液。3小时后，使反应升温到室温并通过加入1mL丁醇中止反应。随后加入20mL H2O并且在室温下再将混合物搅拌45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节到3并且加入NaCl直到浓度为约15重量％。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物，用Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物并在真空下干燥，得到1-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例23
可使用以下文献中描述的方法将含叠氮基的氨基酸和含乙炔的氨基酸位点选择性地并入蛋白质中：L.Wang等人,(2001),Science292:498-500；J.W.Chin等人,Science301:964-7(2003)；J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),Chem Bio Chem11:1135-1137；J.W.Chin等人,(2002),PNAS United States of America99:11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.1:1-11。并入氨基酸后，随即在37℃下，在存在2mM PEG衍生物、1mM CuSO4和约1mg铜丝的情况下，用磷酸盐缓冲液(PB)(pH8)中的0.01mM蛋白质进行环加成反应达4小时。
实例24
本实例描述对乙酰基-D,L-苯丙氨酸(pAF)和m-PEG-羟胺衍生物的合成。
使用先前描述于Zhang,Z.,Smith,B.A.C,Wang,L.,Brock,A.,Cho,C.和Schultz,P.G.,Biochemistry,(2003)42,6735-6746中的程序来合成外消旋pAF。
为合成m-PEG-羟胺衍生物，完成以下程序。向在室温(RT)下搅拌1小时的(N-t-Boc-氨氧基)乙酸(0.382g，2.0mmol)和1,3-二异丙基碳化二亚胺(0.16mL，1.0mmol)溶于二氯甲烷(DCM，70mL)中的溶液中加入甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NFb，7.5g，0.25mmol，Mt.30K，来自BioVectra)和二异丙基乙胺(0.1mL，0.5mmol)。将反应物在室温下搅拌48小时，并且接着浓缩到约100mL。将混合物逐滴加入冷乙醚(800mL)中。经t-Boc保护的产物沉淀出来并通过过滤收集，用乙醚(3×100mL)洗涤。通过再次溶解于DCM(100mL)中并且在乙醚(800mL)中沉淀两次使其进一步纯化。在真空中干燥产物，得到7.2g(96％)，通过NMR和茚三酮试验(Nihydrin test)加以确认。
上文获得的经保护产物(7.0g)的Boc脱除是在0℃下在50％TFA/DCM(40mL)中进行1小时并且接着在室温下进行1.5小时。在真空中移除大部分TFA后，通过向残余物中加入二噁烷(1mL)中的4N HCl而使羟胺衍生物的TFA盐转化为盐酸盐。将沉淀物溶解于DCM(50mL)中并且再次在乙醚(800mL)中沉淀。通过过滤收集最终产物(6.8g，97％)，用乙醚(3×100mL)洗涤，在真空中干燥，在氮气下储存。使用相同程序合成其它PEG(5K、20K)羟胺衍生物。
实例25
由FGF-21WT和30K PEG类似物诱导的ERK1/2磷酸化的分析：
以每孔100,000个细胞的密度(DMEM+10％FBS)将经人类Klotho beta稳定转染的293细胞接种到poly-Lys涂布板中。第二天，细胞达到100％长满，吸出培养基并且用新鲜培养基替换，并培育整夜。24小时后，使用标准FGF21WT用适当的30K PEGFGF-21类似物刺激细胞。通过在PBS/1％BSA中稀释来制备各个别化合物。在37℃下，在恒温箱中，一式三份地将细胞处理10分钟。培育10分钟后，小心地从各孔中吸出培养基，并且向各孔中加入40μl含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的冷的1×细胞信号转导溶解缓冲液(PI混合液，Na3VN4和PMSF)以产生细胞溶菌液。将96孔板放置到冰上达20分钟并且随后在4000rpm下旋转10分钟。在-80℃下冷冻细胞溶菌液。稍后使各样品解冻并且将10μl细胞溶菌液加入涂有捕获非磷酸化形式的ERK1/2与磷酸化形式的ERK1/2的抗体的经MSD处理的板中。用一级抗体培育2小时，接着用特定缓冲液将板洗涤数次，接着添加二级抗体。培育1小时后，再将板洗涤数次。将用于读数的缓冲液加入各孔中。将板转移到MSD读取机中。所产生的曲线是基于抗磷酸化ERK1/2读取单位并且使用Sigma Plot计算EC50。通过用WT的EC50除30K聚乙二醇化特定化合物的EC50来计算活性损失倍数。
实例26：细胞ERK1/2磷酸化检定(pERK)方案和MSD分析
将293βKlotho-4细胞保持在DMEM+10％FBS+P/S+0.5mg/mL遗传霉素(Geneticin)中。当细胞达到50-90％长满时，使其胰蛋白酶化，并以每孔100,000个细胞的密度接种到用poly-D-lys涂布的96孔板中的DMEM+10％FBS+P/S中。
第二天，当细胞约100％长满时，对其进行检查以确保培养基仍为红色，随后吸出培养基，将每孔200μL的FGF-21变异体的连续稀释液(稀释于PBS+1％BSA中)移入96孔板中。随后将96孔板放置到37℃、5％CO2恒温箱中，精确历时9分钟。随后完全吸出FGF-21处理物并且加入每孔40μL的新鲜制备的1×细胞信号转导溶解缓冲液+1×Sigma蛋白酶抑制剂混合液+2mM原钒酸钠+1mM PMSF+1×MSD磷酸酶抑制剂I+1×MSD磷酸酶抑制剂II+1×MSD蛋白酶抑制剂混合液+2mM MSD PMSF。将盘放置到冰上，并搁置25分钟，同时用P20吸移管对各孔进行上下吸移以混合溶菌液。使各孔混合后，在剩余时间内将整个冰桶和盘放置到4℃振荡器上。25分钟后，使板在4℃下在4000rpm下旋转10分钟。将上清液转移到冰上冷却的圆底96孔板中。
MSD分析
使用Meso Scale Discovery MULTI-SPOT检定系统全细胞溶菌液试剂盒Phospho(T/Y 202/204；185/187)/Total-ERK1/2/检定来进行这项检定。
在室温下使所有MSD试剂解冻并且根据试剂盒说明书来制备所有必需的缓冲液。将150μL阻断剂A加入phosphoERK-totalERK双联板的各孔中，并且使其在室温下在振荡器上阻断1小时。随后，用每孔160μL的1×洗涤缓冲液将板洗涤4次。加入每孔16μL的溶解缓冲液+蛋白酶和磷酸酶抑制剂(早些时候制备以进行细胞刺激)，并且将每孔10μL从冷的溶菌液上清液板中转移到MSD板的孔中(总体积随后变成每孔26μL)。将MSD板在室温下在振荡器上培育3小时，随后用每孔160μL的1×洗涤缓冲液将板洗涤4次。加入每孔25μL的检测抗体(用抗体稀释缓冲液稀释50倍)并且设定在室温下在振荡器上培育1小时。再用每孔160μL的1×洗涤缓冲液将板洗涤4次并加入每孔150μL的1×读取缓冲液T，随后立即用MSD Sector Imager 2400机对板读数。
BCA定量
使用Pierce BCA蛋白质检定试剂盒。使用1×细胞信号转导溶解缓冲液，用两倍稀释的方式沿柱向下，从2mg/mL的顶浓度开始，在96孔板中稀释BSA标准物(最后一组孔是缓冲液，无BSA)。将每孔25μL的BSA标准物一式两份地吸移到两个MaxiSorp96孔板中。用1×细胞信号转导溶解缓冲液进行溶菌液的3倍稀释并且以每孔25μL加入MaxiSorp板中。按照Pierce试剂盒说明卡来制备工作试剂，将200μL吸移到MaxiSorp板的各孔中。在室温下培育所述板并且用板读取器在λ＝562nm下读数。
数据分析
用BCA试剂盒计算所有溶菌液的浓度。如果溶菌液的浓度全部类似，那么不必关于MSD分析进行校正。对于MSD分析，对复制点取平均值，计算标准偏差和CV值。使用SigmaPlot来计算FGF-21变异体的连续稀释液的EC50值，并且使用高于WT EC50的倍数作为变异体的定级标准。结果可见于本申请案的图7a和图7b中。
实例27：未经标记的FGF-21的下游过程
包涵体制备溶解
通过混合使细胞糊状物再悬浮到4℃包涵体(IB)缓冲液I(50mM Tris，pH8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1％Triton X-100；4℃)中，达到最终10％的固体浓度。通过使再悬浮物质穿过微流化床(micro fluidizer)共计两次来溶解细胞，随后离心(10,000g；15分钟；4℃)并倾析出上清液。通过使IB小球再悬浮到另一体积的IB缓冲液I(50mM Tris，pH8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1％Triton X-100；4℃)中来洗涤IB小球，并且使再悬浮物质穿过微流化床共计两次，随后离心(10,000g；15分钟；4℃)并倾析出上清液。使IB小球再悬浮到1体积的缓冲液II(50mM Tris，pH8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；4℃)中，随后离心(10,000g；15分钟；4℃)并倾析出上清液。随后，使IB小球再悬浮到1/2体积的缓冲液II(50mM Tris，pH8.0；100mMNaCl；1mM EDTA；4℃)中。将IB等分到适当容器中，接着离心(10,000g；15分钟；4℃)并倾析出上清液。包涵体溶解(此时可将其以其它方式储存在-80℃下直到进一步使用)。
包涵体溶解
用溶解缓冲液(20mM Tris，pH8.0；8M尿素；10mMβ-ME)将包涵体溶解到最终浓度为10-15mg/mL，并且在室温下在恒定混合下将溶解的IB培育1小时。通过过滤(0.45μm PES过滤器)移除不溶性物质并且通过用其它溶解缓冲液稀释(当蛋白质浓度高时)来调节蛋白质浓度(并非总是必需的)。
再折叠
通过用20mM Tris(pH8.0；4℃)稀释到最终蛋白质浓度为0.5mg/mL来进行再折叠。使其在4℃下再折叠18小时到24小时。
纯化
通过0.45μM PES过滤器过滤再折叠反应液。用以缓冲液A(20mM Tris，pH7.5)实现平衡的Q HP柱(GE Healthcare)负载物质。用20CV到100％缓冲液B(20mM Tris，pH7.5；250mM NaCl)的线性梯度洗提FGF-21。汇集单体FGF-21。
聚乙二醇化和纯化
取Q HP池并且将缓冲液交换为20mM Tris(pH8.0)；2M尿素；1mM EDTA。用50％冰乙酸将pH值滴到4.0。将样品浓缩到4.0±1.0mg/mL。向样品中加入12:1摩尔过量的PEG和最终浓度为1％的乙酰肼(pH4.0)。在28℃下培育48-72小时。向PEG反应液中加入最终50mM的Tris碱，并用反渗透水(RO water)稀释10倍。确保传导率<1mS/cm并且pH值介于8.0-9.0之间。用以缓冲液A(20mM Tris，pH8.0)实现平衡的Source30Q柱(GE Healthcare)负载物质。用20CV到100％B(20mM Tris，pH8.0；100mM NaCl)的线性梯度洗提PEG-FGF-21。汇集PEG-FGF-21并且将缓冲液交换为20mM Tris(pH7.4)；150mM NaCl。将PEG物质浓缩到1-2mg/mL并且使用0.22μm PES过滤器进行过滤杀菌。储存在4℃下。为延长储存，快速冷冻并储存在-80℃下。
实例28
FGF-21化合物在大鼠中的药物动力学性质
使用这个方案来提供关于天然FGF-21化合物和通过Ambrx专有技术(Ambrx'sproprietary technology)产生的经PEG修饰的FGF-21化合物在导管插入大鼠中的药物动力学性质的数据(见于图11-23中)。通过对来自给药后特定时间点获得的血清样品的人类FGF-21具有特异性的ELISA来检定测试物的药物动力学。
测试物：
1.Ambrx化合物PEG-R77FGF-21将以在1×PBS中稀释的0.25mg/ml的浓度使用。
2.Ambrx化合物PEG-Y104FGF-21将以在1×PBS中稀释的0.25mg/ml的浓度使用。
3.Ambrx化合物PEG-R126FGF-21将以在1×PBS中稀释的0.25mg/ml的浓度使用。
测试物品质/调配物：
储备液浓度＝
1.0mg/mL PEG-R77FGF-21
1.16mg/mL PEG-Y104FGF-21
1.08mg/mL PEG-R126FGF-21
动物：
12只在研究开始前体重约为250-275克的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠在到达Ambrx之前应具有通过手术安置的颈静脉导管。处于良好状态的动物是从CRL得到并且在研究开始前使其适应研究场所至少3天。在测试物投与当天，对大鼠称重。将动物圈养在标准的无病原体的环境中，使其随意取食食物和水。
动物组：所有化合物都将经皮下投与。
第1组(n＝4)：PEG-R77，皮下注射(0.25mg/kg)。
第2组(n＝4)：PEG-Y104，皮下注射(0.25mg/kg)。
第3组(n＝4)：PEG-R126，皮下注射(0.25mg/kg)。
在投与测试物之前对动物称重。调配化合物以便以1X BW(以μL计)投与。将皮下投与的测试物注射到肩胛背区域中。动物将接受测试物的单次注射(时间＝0)。在特定时间点(参看下文)，从动物中取全血，采集到SST Microtainer采集管中。使血清凝结30分钟，随后进行离心。将血清转移到聚丙烯滴定管中，用微带密封，并储存在-80℃下直到用ELISA进行分析以测定FGF-21血清浓度。
数据采集/终点：
各动物都将用于完整的PK时程。从颈静脉导管中取约0.25mL的全血。在血液采集后不久，用0.1mL生理盐水冲洗导管。根据测试物的预期药物动力学概况，接受测试物材料的动物需要以下采集时间点：
采血前、给药后1、2、4、8、24、32、48、56、72和96小时。
终止：
在研究完成后，将对所有动物实施安乐死。
结果：
结果提供于下表以及本申请案随附的图式中。
FGF21PEG异构体PK性质(静脉内注射)
FGF21PEG异构体PK性质(皮下注射)
聚乙二醇化化合物的Tmax增加。
聚乙二醇化化合物的T1/2增加。
聚乙二醇化化合物的AUC增加。
聚乙二醇化位点依赖性PK属性。
实例29
聚乙二醇化FGF-21的活体内研究
将PEG-FGF-21、未经修饰的FGF-21和缓冲溶液投与小鼠或大鼠。结果将显示，本发明的聚乙二醇化FGF-21与未经修饰的FGF-21相比具有优良的活性和延长的半衰期。类似地，将经修饰的FGF-21、未经修饰的FGF-21和缓冲溶液投与小鼠或大鼠。
药物动力学分析
WO 2005/091944描述可用本发明的FGF-21化合物进行的药物动力学研究。通过静脉内或皮下途径向小鼠投与本发明的FGF-21多肽。在给药之前以及在给药后的多个时间点对动物采血。采集各样品的血浆并通过放射免疫检定进行分析。可计算消除半衰期并且在包含非天然编码氨基酸的FGF-21多肽与野生型FGF-21或本发明FGF-21多肽的各种形式之间进行比较。类似地，可向食蟹猴投与本发明的FGF-21多肽。在给药之前以及在给药后的多个时间点对动物采血。采集各样品的血浆并通过放射免疫检定进行分析。
可将本发明的多肽投与到ZDF雄性大鼠(患糖尿病的肥胖大鼠；在研究开始时8周龄，Charles River-GMI)。使大鼠随意取食Purina5008饲料。设立以下测试组：生理盐水；胰岛素，每天4U；FGF-21，每天500μg，急性(急性给药组是给药一次并且在给药后T＝0、2、4、8和24小时采血)；FGF-21，每天100μg；FGF-21，每天250μg；FGF-21，每天500μg；FGF-21(每天一次)，500μg/ml；少脂肪生理盐水；少脂肪胰岛素，每天4U；少脂肪FGF-21，每天500μg。少脂肪组表示非糖尿病性、少脂肪、ZDF大鼠。
每天两次皮下注射化合物，其中例外为第二个每天500μg的组，其在研究持续期间(7天)每天接受一次注射。向对照大鼠注射媒剂(PBS；0.1ml)。在给药7天后，使动物经受口服葡萄糖耐受性测试。在未麻醉的情况下通过尾钳采血来采集血液中的葡萄糖和甘油三酯。FGF-21多肽可以剂量依赖性方式降低血浆葡萄糖水平。此外，与投与胰岛素的大鼠相比，少脂肪ZDF大鼠在接触本发明的FGF-21多肽后可能不会变得低血糖。
ob/ob肥胖症模型
ob/ob小鼠模型是高血糖症、胰岛素抵抗和肥胖症的动物模型。可在ob/ob小鼠中测量用FGF-21多肽处理后的血浆葡萄糖水平(与媒剂和胰岛素对照组相比)。在此肥胖症模型中，在7天内向雄性ob/ob小鼠(7周龄)测试组皮下注射(0.1ml，每天两次)单独媒剂(PBS)、胰岛素(每天4U)或FGF-21多肽(每天5μg和每天25μg)。在第1天、第3天和第7天，在第一化合物注射后一小时通过尾钳采血来采集血液，并且使用标准方案来测量血浆葡萄糖水平。如果本发明的FGF-21多肽与媒剂对照组相比降低血浆葡萄糖水平，那么其刺激葡萄糖摄取。在用本发明的FGF-21多肽处理后，可比较甘油三酯水平(与其它分子相比)。可通过多种剂量、连续输注或单一剂量等向小鼠投与多肽。
实例30
FGF21类似物的药物动力学评估：在大鼠中评估具有不同的PEG接合位点的30KPEG-pAF(N6-His)FGF21类似物的药物动力学性质。所研究的其它参数是PEG MW，以及所投与化合物的剂量。测定一些30KPEG-pAF(N6-His)FGF21变异体的生物可用性百分比。
动物：按照实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)所批准的方案进行所有动物实验。雄性(175-300g)Sprague-Dawley大鼠是获自Charles River Laboratories。将大鼠个别圈养在具有12小时光照/黑暗循环的室内的笼子中，并且在实验前使其适应Ambrx饲养场所至少3天。使动物可随意取食合格的Purina啮齿动物饲料5001和水。
给药和血清采集：在运输之前，由CRL通过手术将导管安装到颈静脉中以进行血液采集。在导管成功开放后，在给药之前将动物指派到各治疗组。以1mL/kg的剂量体积经静脉内或经皮下投与单剂量的化合物。使用签发证书(Certificate of Release)中所指定的储备液浓度，通过用PBS稀释来获得化合物剂量浓度。在各个时间点，通过存在的导管采集血样并且将其放置到SST微离心管中。在离心后收集血清，并储存在-80℃下直到分析。
药物动力学分析：Ambrx Inc.,La Jolla,CA开发出在Sprague-Dawley大鼠血清中定量PEG-FGF-21的检定。使用用作捕获试剂的山羊抗人类FGF-21IgG多克隆抗体(PAb；RnD Systems，纯系AF2539)来涂布微板的孔。将标准物(STD)和品质控制(QC)样品(都是通过将PEG-FGF-21类似物添加到100％Sprague Dawley大鼠血清中来制备)以及研究样品用I-Block缓冲液1:100预处理之后装载到孔中。通过固定PAb捕获STD、QC和研究样品中的FGF-21。通过洗涤各孔来移除未结合物质。将生物素山羊抗人类FGF-21IgG PAb(RnD Systems，纯系BAF2539)加入孔中，接着进行洗涤步骤，并且加入抗生蛋白链菌素辣根过氧化物酶(SA-HRP；RnD Systems，目录号DY998)以检测捕获的PEG-FGF-21。在另一个洗涤步骤之后，将四甲基联苯胺(TMB，Kirkegaard PerryLaboratories)底物溶液加入孔中。TMB在HRP存在下与过氧化物反应并产生与在初始步骤中由捕获试剂所结合的PEG-FGF-21类似物的量成正比的比色信号。通过加入2N硫酸来终止显色并且在450nm下测量色彩强度(光密度，OD)。通过计算机软件调控的与相同板上标准曲线的比较来实现研究样品和QC的OD单位向浓度的转换，使用SOFTmax Pro v5数据简化套件根据5参数对数回归模型来进行回归。以ng/mL浓度单位报导结果。
也可通过双抗体夹层检定或所属领域的技术人员已知的其它方法来测量浓度。使用相应投与的化合物所产生的标准曲线来计算浓度。使用建模程序WinNonlin(Pharsight，4.1版)评估药物动力学参数。使用利用线性(上)/对数(下)梯形整合对个别动物数据进行的非隔室模型分析(Noncompartmental analysis)，并且一致加权浓度数据。
结论：WT N6-His FGF21的药物动力学性质符合Kharitonenkov等人,2005中所报导的性质并且与未经标记的WT FGF21蛋白相当。
与由WT(未经聚乙二醇化)FGF21获得的结果相比，通过加入30kDa PEG分子使30KPEG-pAF(N6-His)FGF21异构体的药物动力学概况显著增加。
当以0.25mg/kg剂量经皮下给药时，聚乙二醇化化合物展现显著不同的PK概况。H87和L86倾向于具有比其它异构体差的PK属性。此外，R131和Q108PEG30化合物有差别地产生优良的PK性质。更特定来说，这些化合物具有改良的AUC、Cmax和末期半衰期。深入结构-活性分析可揭示各异构体的各种PK性质的结构说明。
PEG分子量的比较显示30KPEG-pAF91(N6-His)FGF21具有比20KPEG-pAF91(N6-His)FGF21略大的循环持久性。然而，由于20kDa异构体具有较高Cmax值，因此这两种化合物的总AUCinf可相当。20kDa亚型的生物可用性比30kDa变异体略好，分别为30％与20％。
表3.以0.25mg/kg的剂量经皮下投与大鼠的化合物的药物动力学参数值
通过非隔室模型分析(Pharsight，4.1版)来评估血清浓度与时间的曲线。每种化合物N＝3-4只大鼠。ND：未进行；NE：未评估。Tmax：达到Cmax的时间；Cmax：最大浓度；末期t1/2：末期半衰期；AUC最终：最终血浆样品/时间点的浓度-时间曲线下的面积；AUCinf：外推到无穷大的浓度-时间曲线下的面积；MRT：平均滞留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；Vz/f：末期阶段内的表观分布体积。
表4.以0.25mg/kg的剂量经皮下投与大鼠的20KPEG-pAF91(N6-hHis)FGF21的药物动力学参数值
通过非隔室模型分析(Pharsight，4.1版)来评估浓度与时间的曲线。ND：未进行；NE：无法评估。Tmax：达到Cmax的时间；Cmax：最大浓度；末期t1/2：末期半衰期；AUC最终：最终血浆样品/时间点的浓度-时间曲线下的面积；AUCinf：外推到无穷大的浓度-时间曲线下的面积；MRT：平均滞留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；Vz/f：末期阶段内的表观分布体积。
实例31
包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21的安全性和/或功效的人类临床试验。
目的 为了观测经皮下投与的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类FGF-21的安全性和药物动力学。
患者 在研究中招募18名年龄介于20-40岁之间并且体重介于60-90kg之间的健康志愿者。所述个体应不会具有临床上显著异常的针对血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选和B型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液疾病史；严重肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢疾病、神经病史；贫血或癫痫病史；对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白具有已知过敏性；对含咖啡因的饮料的习惯性和重度消费者；在进入研究的30天内参与任何其它临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内曾接触FGF-21；在进入研究的7天内患病；以及在进入研究的14天内在研究前身体检查或临床实验室评估时具有显著异常。可对所有个体评估安全性，并且定时采集用于药物动力学分析的所有血液采集物。所有研究都是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。
研究设计 其应为在健康男性志愿者中的第I阶段、单一中心、开放标记、随机性、两个周期的交叉研究。将18名个体随机指派到两个治疗序列组中的一组中(每组9名个体)。使用相等剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21和所选市售产品，在大腿上部经两个分开的给药期以皮下团注形式投与FGF-21。投与市售产品的剂量和频率是按照包装标签中所指示来进行。可通过包括其它个体组而在研究中加入使用市售产品的其它剂量、给药频率或所需的其它参数。各给药期由14天的平衡期分隔开。对于两个给药期的每一时期来说，在给药之前至少12小时以及给药后72小时将个体限制在研究中心，但在给药期之间不必如此。如果也存在其它剂量、频率或其它参数，那么也可加入其它个体组来测试聚乙二醇化FGF-21。FGF-21的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21。
血液取样 在投与FGF-21之前和之后，通过直接静脉穿刺连续取血。在给药之前约30分钟、20分钟和10分钟(3个基线样品)以及在给药后大致以下时间：30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时和72小时，获得用于测定血清FGF-21浓度的静脉血样(5mL)。将各血清样品分为两个等分试样。将所有血清样品储存在-20℃下。以干冰运输血清样品。在第1天初始给药前不久、第4天早晨、第16天给药前不久以及第19天早晨进行空腹临床实验测试(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法 使用ELISA试剂盒来测定血清FGF-21浓度。
安全性测定 在每次给药(第1天和第16天)之前以及在每次给药后6小时、24小时、48小时和72小时即时记录生命特征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型以及临床实验测试与基线相比的变化。另外，评估生命体征测量结果(包括血压)和身体检查结果与研究前相比的变化。
数据分析 通过从给药后的每一个值减去通过对给药前30分钟、20分钟和10分钟时采集的三个样品的FGF-21水平取平均值而测定的平均基线FGF-21浓度而关于给药前基线FGF-21浓度来修正给药后血清浓度值。如果给药前血清FGF-21浓度低于检定的定量水平，那么其不包括在平均值的计算中。由关于基线FGF-21浓度所修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用BIOAVL软件的最新版本，通过利用Digital EquipmentCorporation VAX8600计算机系统的不依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；出现峰值血清浓度的时间(tmax)；通过使用线性梯形规则计算的从时间零时到最后血液取样时间(AUC0-72)的浓度-时间曲线(AUC)下的面积；以及根据消除速率常数计算的末期消除半衰期(t1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末期线性区域中，通过连续数据点的线性回归来估算消除速率常数。对于每一次治疗，计算药物动力学参数的平均标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存调配物/未经保存调配物)。
安全性结果 在各治疗组中，不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测试或血压相比无临床显著变化，并且身体检查结果和生命特征测量结果与研究前相比也无显著变化。两个治疗组的安全性概况看来应类似。
药物动力学结果 在各时间点，测量所有18名个体在接受包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21后的平均血清FGF-21浓度-时间曲线(未关于基线FGF-21水平进行修正)。所有个体都应具有在正常生理学范围内的给药前基线FGF-21浓度。根据关于给药前平均基线FGF-21浓度所修正的血清数据来测定药物动力学参数，并且测定Cmax和tmax。所选的任何临床比较物的平均tmax都比包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21的tmax显著更短。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21的末期半衰期相比，所测试的临床前比较物的末期半衰期的值显著更短。
尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行，但预期将在其它患者群体中出现类似的吸收特征和安全性概况；所述群体例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿童肾衰竭患者、自体预存程序中的患者或计划进行选择性手术的患者。
总之，经皮下投与的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21应为安全的，并且被健康男性个体良好耐受。根据不利事件的相对发生率、临床实验值、生命特征和身体检查结果，市售形式的FGF-21与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21的安全性概况应相当。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化FGF-21向患者和健康护理提供者潜在地提供巨大临床效用。
应了解，本文中所述的实例和实施例仅出于说明性目的且将提示给所属领域的技术人员根据其作出的各种修饰和变化且所述修饰和变化包括在本申请案的精神和权限和附加权利要求书的范围内。本申请案中所引用的所有公开案、专利、专利申请案和/或其它文献出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，引用的程度就如同已个別地将各个公开案、专利案、专利申请案和/或其它文献出于所有目的以引用的方式并入一般。
表5：所引用的序列

Claims (26)

1.一种经修饰人类FGF-21多肽，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的多肽序列，且在SEQ IDNO:1的108位置处或SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6或SEQ ID NO:7的相应位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代，其中所述非天然编码氨基酸与一个聚合物连接，所述聚合物包含聚乙二醇；所述经修饰人类FGF-21多肽具有至少一种FGF-21的生物活性，且所述非天然编码氨基酸选自对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基、炔基或对叠氮基苯丙氨酸。
3.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含对乙酰基苯丙氨酸。
4.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇具有介于0.1kDa与100kDa之间的平均分子量。
5.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇具有30kDa的平均分子量。
6.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述聚乙二醇是分枝或多臂的。
7.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述经修饰人类FGF-21多肽所具有的活体内半衰期，较未包含有所述非天然编码氨基酸以及所述聚合物的相应人类FGF-21多肽为高。
8.根据权利要求1所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述经修饰人类FGF-21多肽所具有的血清半衰期，为未包含有所述非天然编码氨基酸以及所述聚合物的相应人类FGF-21多肽的血清半衰期的至少五倍。
9.一种经修饰人类FGF-21多肽，其包含SEQ ID NO:1的多肽序列，且在SEQ ID NO:1的108位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代，其中所述非天然编码氨基酸与一个聚合物连接，所述聚合物包含聚乙二醇；所述经修饰人类FGF-21多肽具有至少一种FGF-21的生物活性，所述非天然编码氨基酸包含对乙酰基苯丙氨酸，且所述聚乙二醇具有30kDa的平均分子量。
10.根据权利要求9所述的经修饰人类FGF-21多肽，其中所述聚合物与所述多肽是以肟键连接，所述肟键是由所述对乙酰基苯丙氨酸与一个和所述聚合物相连接的氨氧基经反应而形成。
11.一种组合物，其包含医药学上可接受的载剂和根据权利要求1至10中任一项所述的经修饰人类FGF-21多肽。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述的组合物更包含第二药剂。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述的第二药剂是选自于由下列所组成之群组：双胍类、噻唑烷二酮、磺酰脲类、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂和前述物质的混合物。
14.一种根据权利要求11所述组合物的用途，用于制造供用于治疗经投与FGF-21可加以治疗或预防的病状的治疗方案中的药剂，其中所述药剂包含所述组合物的预防或治疗有效量。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述治疗方案包括投与所述组合物以及投与包含附加药物的第二药剂，其中所述投与可同时或分别进行，可依照任一次序投与。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述附加药物是选自于由下列所组成之群组：双胍类、噻唑烷二酮、磺酰脲类、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂和前述物质的混合物。
17.一种根据权利要求11所述组合物的用途，用于制造供用于经由增加脂肪细胞的葡萄糖摄取而增加葡萄糖利用或治疗、预防或缓解以下病状的治疗方案中的药剂：2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合症或前述病症的组合；其中所述药剂包含所述组合物的预防或治疗有效量。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述治疗方案包括投与所述组合物以及投与包含附加药物的第二药剂，其中所述投与可同时或分别进行，可依照任一次序投与。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述附加药物是选自于由下列所组成之群组：双胍类、噻唑烷二酮、磺酰脲类、苯甲酸衍生物、葡糖苷酶抑制剂和前述物质的混合物。
20.一种核酸，其包含編碼SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的多肽的序列，且所述核酸包含一个选择密码子，所述选择密码子編碼在下列位置处进行取代的一个非天然编码氨基酸：所述SEQ ID NO:1的108位置处或所述SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的相应位置处；其中所述核酸在当存在有正交RNA的情况下进行表达时，允许可产生包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的多肽序列的经修饰人类FGF-21多肽，其中在所述SEQ ID NO:1的108位置处或所述SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的相应位置处是以选自对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸的非天然编码氨基酸进行取代。
21.一种分离细胞，其包含根据权利要求20所述的核酸，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶。
22.一种产生经修饰人类FGF-21多肽的方法，所述方法包括：于适当的培养基中培养包含根据权利要求20所述核酸的分离细胞，所述细胞更包含有正交RNA合成酶和正交tRNA；其中当所述核酸在所述细胞中进行表达时，即可产生包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的多肽序列的经修饰人类FGF-21多肽，其中在SEQ ID NO:1的108位置处或SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的相应位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代，且所述非天然编码氨基酸选自对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法更包括：使所述经修饰人类FGF-21多肽和具有可与所述非天然编码氨基酸反应的聚乙二醇的聚合物接触反应，藉以将所述经修饰人类FGF-21多肽连接至所述具有聚乙二醇的聚合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含对乙酰基苯丙氨酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述聚合物与所述多肽是以肟键连接，所述肟键是由所述对乙酰基苯丙氨酸与一个和所述聚合物相连接的氨氧基经反应而形成。
26.一种经修饰人类FGF-21多肽，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的多肽序列，且在以下残基位置处以一个非天然编码氨基酸进行取代：SEQ ID NO:1的72、77、86、87、91、104、108、110、126、131、146位置处或SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的相应位置处，且
i)其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中R为并非存在于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的侧链的取代基，且其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代：SEQ IDNO:1的72、77、86、87、91、104、108、110、126、131、146位置处或另一人类FGF-21多肽中的相应氨基酸位置；
ii)其中所述非天然编码氨基酸为苯丙氨酸衍生物；或
iii)其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中R为并非存在于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的侧链的取代基，其中所述多肽包括有与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:5,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有95﹪一致性的序列。
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