CN1041974A

CN1041974A - 稳定的冻干哺乳动物细胞及其制备方法

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Publication number: CN1041974A
Application number: CN89107981A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·H·雷纳; 史蒂文·F·小希利; 肯尼思·H·科特莱特
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1988-10-20
Filing date: 1989-10-20
Publication date: 1990-05-09
Anticipated expiration: 2004-10-20
Also published as: JP2912400B2; ES2019727A6; DE68929286D1; IL92057A0; AU633029B2; ZA897924B; NO911533L; MX166481B; DE68929286T2; NO911533D0; NO301596B1; JPH04501112A; IE893341L; AU4411889A; US5059518A; EP0444159A4; ATE199625T1; EP0444159B1; CN1038691C; CA1335362C

Abstract

一种冻干哺乳动物细胞，以产生保藏的人细胞、杂交瘤细胞、组织细胞及免疫检测和其它血液学检验所需之对照细胞的方法。在冷冻和冻干之前，将已制备的哺乳动物细胞沉淀团块悬浮于以特定最适浓度制成的海藻糖等渗溶液内，并于室温下保温一定时间。当重新水化后，冻干的细胞保留了其适于用作分析对照的最佳生理学特性，并可在于2-8℃下储存超过5个月之后仍然保留上述特性。

Description

一般地讲，本发明涉及冻干生物学材料的技术，更具体地讲涉及冻干哺乳动物细胞以制备可储存的人体细胞、杂交瘤细胞系、组织细胞以及用于免疫检测及其它血液学分析之对照细胞的新方法，所有这些冻干细胞均具有良好的稳定性和长储存寿命，而且与新鲜细胞相比，其基本上具有等同的生理学参数。

冻干储存含有生物学活性分子的脂质体及细菌培养物的方法是已知的。用冻干方法制作药物片剂也是已知的。美国专利4678812公开了一种使用海藻糖化赋形剂和稳定剂制备诊断用药片的方法。美国专利4712310则描述了一种制备在诊断检测中用作试剂和稳定剂制备诊断用药片的方法。美国专利4712310则描述了一种制备在诊断检测中用作试剂载体的片剂的方法。

现有专利已描述过在脂质体内包裹药物、核酸、蛋白质、指示分子（reporter molecules）、酶等材料的方法。这类专利有如美国专利4515736和4411894。美国专利3261761、4206200和4246349则介绍了冻干细菌的方法。1988年3月16日公开的欧州专利申请0259739涉及同一研究领域，其题目为“改善冻干培养物的稳定性”。

同类现有技术提到糖在冻干应用中具有稳定功能。上面提到的海藻糖也具有这种功能。1986年7月17日公开的国际专利申请（PCT）WO86/03938号中公开了在冷冻干燥期间使用海藻糖在脂质体内和脂质体外（溶液中）作为保护剂的方法。在脂质体内或脂质体外使用海藻糖是已引起注意的优选方法。

已述及的现有技术均未涉及保存哺乳动物细胞，特别是人体细胞。人细胞如血液细胞的膜结构不同于细菌或脂质体的膜结构。就细菌来说，其细胞壁是很厚的非脂质壁，其作用在于保护细胞的液体内容物免受热、渗透压改变及在无保护剂（如糖）存在时进行冷冻干燥所引起的不利影响。因为有很坚实的细胞壁，所以许多细菌菌株都能在没有某一种储存保护剂或被包裹的情况下耐受冷冻和干燥的冲击。

就脂质体来说，其液体内容物被单层或多层脂质囊泡包围。囊泡的壁是由一种或多种有极性头部和非极性尾部之脂质成分的一层生物分子形成的。在水溶液中，排成一层的极性头部朝向周围介质，而脂质分子的非极性部分则彼此相互联接，从而在囊泡的壁中形成了一个极性表面和一种非极性核心。单层脂质体只有一层生物分子，而多层脂质体一般有许多基本上同轴心的生物分子层。因此，当将含有或不含类固醇的磷脂混合物于水溶液中分散时，即可形成一圆形的微球结构。可以想象用其包裹某种试剂，就能在体内以识别的方式运送到某一部位。

脂质体囊壁是与人细胞差不多的人造双脂质膜，不过人细胞膜的组成要复杂得多。除了双脂质膜结构外，人细胞膜还有许多嵌入其脂质双层内的额外的蛋白和糖蛋白分子。特别领人感兴趣的是这些蛋白质分子提供了人造脂质体所没有的细胞表面抗原或决定基位点。人细胞表面标志的研究是进行免疫检测及它与人血液细胞有关之血液学检测的关键课题。在使用杂交瘤细胞系和单克隆抗体时，显然脂质体也存在同样差异。另外，还应考虑到哺乳动物细胞的复杂液体内容物与脂质体内容物之间的差异。在人血细胞的例子中，细胞只能存在于等渗透压液体介质中，而脂质体则可能存在于任何介质，包括非等渗溶液内。

本发明的冻干方法是独特的，其中哺乳动物细胞可在没有对细胞形态造成不利改变的情况下被冷干，而且当用于检测试验，如用作对照细胞时在与探针或标志物结合后不会使细胞膜成为可通透的。另外，所说的冻干可以稳定细胞膜的蛋白质结构及其在细胞壁内的定向性质，这样便不会使膜表面蛋白标志受到破坏。考虑到哺乳动物细胞的细胞膜的已知的脆弱特性，相信用本发明冻干方法所获得的结果是出乎预料的，就冻干的哺乳动物细胞的稳定性和储存寿命来说也是令人意想不到的，而且在其重新水化之后所保留的生理学功能特性可与新鲜细胞相比拟。

在实施本发明的方法时，作为保藏或保护性被膜包裹，只能是在哺乳动物细胞的外表面上。包裹细胞膜的内表面则是不可能作到的。所能达到的极好稳定性及长储存寿命，使得本发明的方法有不能应用于制备进行免疫学检测的对照细胞、在哺乳动物细胞的流式细胞计分析、血细胞计数、按大小分类及分析血细胞成分的亚群（如红细胞和白细胞），以及各种类型细胞的DNA分析中提供适用的样品制剂。因此，各种类型的细胞均可冻干并在其后重新水化成为适于进行生物学细胞分析的样品。

Stefi Weisburd在“脱水并不造成死亡”（Death Defying Dehydration）一文（Science News，Vol.133，No.7，pp.97-112，February 13，1988）中描述了使用国际专利申请（PCT）WO86/03938号中所述的海藻糖冷冻干燥脂质体的方法。该文献所述的研究工作是用微生物进行的，其表明海藻糖（一种低分子量糖）是在这些微生物中当它们脱水后以高浓度产生的。一般认为海藻糖可起脂质稳定剂的作用，用以增加人造细胞膜或脂质体的稳定性。该文献提请注意海藻糖并不是在所有情况下都是有用的添加物，并且应该注意海藻糖的毒理学。

必须有精确而可靠的对照物以便在检测对照和样品的同时能了解准备样品的合适技术和实验室检测设备的功能，这种要求是持续的。在流式细胞计分析中，除用于构成流式细胞计工作参数的荧光素小珠或微球外，并没有可利用的确定对照组。最适合需要的对照物质应是可作为所用试剂及适当仪器功能有关的样品准备技术对照者。因此，在进行流式细胞计分析时，保存的表达必要抗原决定基或决定簇的哺乳动物细胞与试验样品的细胞一起检测，将提供一种最适对照物。可将先前测定的对照细胞的数值与研究人员测得的试验结果相比较。

对所有有表面抗原的细胞进行流式细胞计分析的特点需要建立一种制备对照细胞的方法，以便维持细胞的光散射图型和膜的完整性，使被研究的细胞表面抗原的损伤降至最小程度。最好应是使用具有待研究之已知性质的新鲜细胞的基础上比较这些因素。然而，从商品供应角度看，在实验室环境中运送和储存新鲜对照细胞是不切实际的。

为此，使用冻干等方法保存的哺乳动物细胞可便于运送，能够储存足够长的时间，并能在使用时重新恢复冻干前状态或重新水化，同时保留其必要的特性，这样即可为进行流式细胞计分析提供合乎需要的对照。

这种冻干的哺乳动物对照细胞也应适于使用血液学分析装置，如Coulter Electronics公司（Hialeah，Florida;为Coulter公司的子公司）出售的COULTER COUNTER

血细胞。

申请人确信由于几方面的原因而一直没有成功地冻干用作对照物的哺乳动物细胞。例如，冷冻条件会对这些细胞中的蛋白质分子产生有害影响，并可破坏所有膜的完整性。

它使用各种糖类结合DMSO或甘油进行了抵削细胞内冷冻之不利影响的实验工作。另外还作了在冻干过程单独使用糖的实验，其中在对悬浮细胞进行冷冻和冻干时将糖加至冻干载体溶液，如标准的正常羊血清中。试验了含有或不含DMSO、磷酸盐缓冲的白蛋白（PBA）、胎牛血清，人AB型血清及正常羊血清的糖的各种浓度的溶液。

使用蔗糖、牛磺酸和葡萄糖，以及DMSO与糖作为载体进行实验，所得结果均不能令人满意。例如当使用果糖时，相对于新鲜细胞之某些抗原的特异性荧光的减少，超过允许范围的光散射及特异的荧光特性等情况都会出现。使用这些糖处理细胞仍不能得到令人满意的冻干细胞，即不能制得冷冻期间免受明显损伤的细胞。所说的损伤可表现于细胞膜蛋白分子水平的改变，如能影响抗原表达的构象改变。一般须使用低温保护剂（cryoprotectorants）来防止细胞冷冻期间因增加了盐浓度和结晶形成所造成的这类损伤。但申请人发现这些冷冻保护剂，如DMSO和甘油以及其它血清，均不能成功地用于冻干哺乳动物细胞。

冷冻和冻干期间，加入正常羊血清作为悬浮细胞的基质或载体并不能有效地保护细胞表面标志的活性，即血清中的蛋白质并不能使细胞膜免遭氧化作用或其它破坏。只使用海藻糖与正常羊血清及白蛋白的混合物也不能成功地解决上述问题。

此后，又使用海藻糖作为与正常羊血清和白蛋白之混合物的一部分，也未能制得适用的冻干对照细胞的介质。从而证明在冻干期间使用糖，包括海藻糖稳定膜细胞的膜脂质是不成功的。

本发明的方法已被证明可成功地制得适用的冻干哺乳动物细胞，该方法包括在等渗溶液中利用海藻糖制备冷冻和冻干的细胞。用本发明方法制得的冻干的对照细胞包括杂交瘤细胞或细胞系以及保留了便于流式细胞计分析之最适特性的外周血单核细胞。还确定了等渗溶液中海藻糖（其为最适用于本发明之方法的糖）的最佳浓度。本发明包括冻干的哺乳动物细胞及其他能用上述冻干方法制备的人体细胞。

本发明的方法可用于制备在免疫学检测、流式细胞计分析及显微镜检验中用作生物学对照的冻干的哺乳动物细胞，并用于保藏可保留其所需抗原性的人细胞系。冻干的细胞在使用时可重新恢复其含水状态或重新水化，同时使其细胞膜蛋白构象或形态学不受损伤或有害影响。据信本发明的方法能够冻干哺乳动物生理体液和组织中的所有细胞。可使用某些标准的制备方法，如由待检测的全血、培养的细胞系或组织中收集欲进一步处理的所需数目的细胞，用于一般的检测过程并经离心使之成为细胞团块。首先，将该细胞团块悬浮于磷酸盐缓冲的白蛋白中达一定时间，然后再重新使之成为细胞团块形式。冻干前，将细胞团块悬浮于含特定最适浓度之海藻糖的等渗溶液中，并于室温下保温一定时间。室温下用含一定比例海藻糖的等渗溶液重复处理该细胞悬液一定时间，然后将细胞悬液置于小瓶内，冷冻并冻干一定时间。

可用其量等于小瓶全容积的蒸馏水使如此制得的冻干细胞重新恢复其含水状态，该小瓶是特制用于原位水化冷冻细胞的。重新恢复其含水状态的细胞保留了它们用作分析对照的最适生理学特性。

图1A和1B分别是用TII-FITC和MsIgGl-FITC标记染色的按本发明冻干之T细胞系及与之完全相同的新鲜细胞系的流式细胞计直方图。

图2A和2B分别是用B1-FITC和MsIgGZa-FITC标记染色的按本发明方法冻干的B细胞系及与之完全相同的新鲜B细胞系的流式细胞计直方图。

图3是以四个编号的方框显示的复合流式细胞计直方图，其中比较了用TII和B1单克隆体双染色的新鲜外周血淋巴细胞及冻干的外周血淋巴细胞。

图4是以四个编号的方框显示的复合流式细胞计直方图，其中比较了用T4和T8单克隆抗体双染色的新鲜及冻干的外周血淋巴细胞。

图5是图解说明本发明制备冻干之对照细胞、细胞系及外周血淋巴细胞的方法。

使用某些术语来解释图1至4中各直方图所显示的比较试验的结果。本文使用的这些术语定义如下：

1.“本底荧光”是指由样品中并非从被研究的特异性荧光标记细胞，而是从任何其它的材料发出的荧光。

2.“自身荧光”是本底荧光的一种，其中由细胞发出的荧光不是由荧光化学物质如染料诱导的。

3.“非特异性结合”是指荧光化学物质附着于细胞表面的现象不是借助特异结合方式产生的。

4.“光散射”是指入射光束如由激光光源发出的光束对着细胞照射的发生在流式细胞计仪器内的现象，此时有些光束向许多不同方向反射，有的光束则穿过细胞。对散射的光，包括及由复盖于细胞外的荧光化学物质产生的荧光及其反射角度均可被测定，并用以确定细胞的特征，如细胞大小或体积，细胞表面光滑度，以及细胞浆质中的颗粒的数目和其他结构。这些特征可以与正常细胞的特征相比较。

5.“平均频道（Mean Channel [MC]）”是指对被分析的细胞发出的平均相对荧光量。

6.“百分阳性率”是指其荧光高于本底的被分析细胞的百分比。

用于完成本发明之冻干方法的成分如下：

A.磷酸盐缓冲的白蛋白溶液（PBA），为1g PBA溶于100ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）内。

B.海藻糖溶液，10g海藻糖溶于100ml等渗溶液。最好使用Coulter Electronics公司注册商标为ISOTON^Ⅲ的等渗溶液，其特点是绝对纯。

C.“FITC”，即荧光素异硫氰酸盐。

D.“RDI”，即Coulter公司使用的藻胆蛋白荧光素标记物。

下面参照图5全面地描述实施本发明方法的方法学。首先由全血或培养的细胞系，或组织中收集作为待检测细胞的哺乳动物细胞。对于一次一般的检测工作，收集30×10⁶个细胞并悬浮于4-8℃的1%PBS溶液中。室温下将悬浮的细胞以1500rpm离心约10分钟。弃去上清，将细胞团块悬浮于在等渗液（如ISOTON

）中制得的10%海藻糖溶液中，并于室温下保温10分钟，或最好于2-8℃保温10分钟。然后于4-8℃以1500rpm离心10分钟。再将所得细胞沉淀团块重新悬浮于用ISOTON

制备的10%海藻糖（如4-8℃）中。将海藻糖处理的细胞悬液置于每瓶含300μl溶液的冻干小瓶内，小瓶拧上盖并于4℃冷却，然后振荡小瓶使细胞散布均匀，再于-70℃冷冻机中至少放置1小时。到时间后将小瓶立即放入冻干机内约冻干15小时。

到时间后由冻干机内取出冻干的小瓶并保存于2-8℃下。为了使冻干品重新恢复含水状态，向小瓶内加入蒸馏水或去离子水，使其体积达到300μl。作为流式细胞光度计分析中的对照细胞，将重新悬浮的细胞染色，然后按标准的流式细胞计分析法分析。当然，这些对照细胞也可用于其他类型的检测法或其他适当的诊断试验。

下面将参考附图1至4的流式细胞计直方图对本发明的冻干方法作更详细的讨论，以从中了解按本发明方法制得的冻干细胞的实用有效性：

图1A和1B的流式细胞计直方图中，对同种新鲜的和冻干的T细胞系（定名为PB 44细胞）进行染色并使用Coulter公司（Hialeah，Florida）出售的EPICS 流式细胞计进行比较。隔两周分别制备两份PB 44 T细胞并按本发明的方法冻干。使用去离子水使细胞重新恢复含水状态或水化，并用Coulter公司出售、注册商标为COULTER CLONE

的带色的单克隆抗体MsIgGI-FITC和带色的单克隆抗体TII-TITC着染细胞表面标记。所使用的免疫荧光细胞表面染色方法详见Coulter公司分发的“Coulter Proceduces Book”一书第4页。染色后，在EPICS 流式细胞计中分析这些重新恢复含水状态的冻干细胞，以测定百分阳性率及各抗体之平均频道荧光的相对量。在进行检测分析的同一天制得新鲜培养的PB 44 T细胞，并用相似方法进行分析，以与分析染色的冻干细胞所得结果相比较。直方图所示的结果如下：

PB 44 T细胞

新鲜细胞冻干细胞

MC %阳性率 MC %阳性率

TII-TITC 84 99 92 100

MsIgGI-TITC - 0 16 5

对冻干T细胞的百分反应活性等于被分析的新鲜T细胞的百分反应活性。各例中平均细胞荧光也基上相等，84与92的少许差异并不足以影响检测结果。由图1A和图1B的直方图可以看出，用新鲜T细胞和冻干T细胞测得的结果十分相似。很显然，本发明的冻干方法具有许多应归功于本发明的优点。

还使用一系列COULTER CLONE 单克隆抗体，在EPICS

流式细胞计上对PB44细胞系的新鲜和冻干T细胞进行了进一步的检测。其中制备染色细胞的方法同前所述。进一步的检测的结果如下：

PB 44 T细胞分析结果

Coulter clone 新鲜 PB 44 冻干PB 44

抗体实验序号 MC＊百分阳性率 MC 百分阳性率

IgG1-FITC 1 10 0 19 13

（同型对照） 2 12 0 16 5

IgG1-RD1 1 3 0 4 1

（同型对照） 2 6 0 5 0

TII-FITC 1 84 100 86 99

2 103 100 108 99

T8-FITC 1 86 97 96 98

2 113 100 116 100

T4-FITC 1 40 71 50 84

2 69 93 67 95

4B4-FITC 1 40 79 51 92

2 75 100 70 99

TII-RD1 1 98 100 77 95

2 120 100 105 100

T8-RD1 1 110 91 109 98

2 141 100 126 99

对于试验各种抗体来说，对冻干PB 44细胞的百分反应活性基本上等于新鲜细胞的百分反应活性。另外，用于度量染色细胞之相对荧光强度的平均频道值在冻干和新鲜细胞也大致相似。用IgG1-FITC同型对照染色证明，在某些情况下冻干细胞确实显现出较大程度的非特异性荧光。但这部分荧光因其强度不大，故不会影响对检测结果的解释。

图2A和2B所示的流式细胞计直方图中，使用B1-FITC染色并在EPICS 流式细胞计中比较了定名为PB 11的同种新鲜和冻干的B细胞系。按本发明的方法冻干相隔两周分别制备的两份PB 11B细胞。用去离子水使细胞重新水化，并用Coulter公司商标为“COULTER CLONE”的B1-FITC和B4-FITC细胞标记染色。染色方法与图1A和1B所述者相同。染色后在EPICS

仪器中分析水化的冻干细胞，以测定对各种抗体的百分阳性率及平均频道荧光相对量。在进行上述检测时也对同同一天由培养瓶中得到的新鲜PB 11 B细胞作了相似的检测和分析。对B1-FITC和B4-FITC染色之新鲜和冻干细胞的检测结果如下所示：

PB 11 B 细胞

新鲜细胞冻干细胞

MC %阳性率 MC %阳性率

B1-FITC 82 99 118 100

B4-FITC 92 100 69 99

70 99 71 99

冻干B细胞的百分反应活性和平均频道荧光与新鲜细胞相当。在同型对照中，冻干细胞出现了较大程度的非特异性荧光，但这是由于该细胞系在不同时间出现的非特异性本底染色造成的。这一程度的非特异性荧光，因其强度很低，故不会影响分析结果。

图3是以分别标明为1）、2）、3）和4）的四个方框显示的复合流式细胞计直方图，使用双色TII和B1 COULTER CLONE 单克隆抗体对新鲜外周血淋巴细胞（PBLS）和冻干的外周血淋巴细胞进行比较。用Ficoll-Hypaque

标准方法分离细胞。按上述方法冻干细胞并染色，然后作细胞分析。所得结果是：

新鲜细胞冻干细胞

MC %阳性率 MC %阳性率

B1-FITC 70 12 59 19

TII-RDI 64 77 57 67

就试验的各抗体来说，外周血淋巴细胞冻干制品的百分反应活性与新鲜PBLS基本相同。两者的平均频道荧光也大致相当。

图4是以四个编号的方框显示的复合流式细胞计直方图，其中使用双染色的T4和T8 COULTER CLONE 单克隆抗体对新鲜和冻干的外周血淋巴细胞（PBLS）进行分析比较。所用的制备方法与上述者相同。分析的结果是：

新鲜细胞冻干细胞

MC %阳性率 MC %阳性率

T4RD1 102 47 105 58

T8-FITC 119 31 99 32

对试验的各单克隆抗体来说，冻干PBLS的百分阳性率基本上与新鲜PBLS相同。两种形式PBLS的平均频道荧光也大致相同，虽然冻干PBLS上用T8染色的单克隆抗体MC稍低，但这并不影响总体分析或比较试验结果。

将冻干的哺乳动物细胞存放于2-8℃冰箱内进行保存寿命试验。所获结果表明，冻干产品的稳定性可维持5个月以上。

在EPICS

流式细胞计中测定按本发明方法冻干的两种稳定化人T和B细胞制剂，与新鲜的人T和B细胞制备相比较，以证实其结构保护作用的程度。第一份混合物由80%T细胞和20%B细胞组成;第二份混合物由各50%的T和B细胞组成。用去离子水使冻干细胞恢复含水状态并在流式细胞计上记录它们的光散射图形，即前方位角光散射（FALS）和90°光散射。同时使用EPICS 流式细胞计记录了相应新鲜T和B细胞制剂的光散射试验图形。记录的试验结果表明冻干之细胞混合物的光散射图形与相应的新鲜细胞混合物者相似，从而证实了冻干细胞的极好结构保护作用。

试验还表明细胞的细胞表示抗原性没有受到损害。使用了适当地染色的COULTER CLONE

单克隆抗体，包括T4、T8、TII、B1、B4、I2和4B4单克隆抗体。

对阳性染色的冻干细胞进行了一系列试验，并且是，将其作为DNA分析的生物学对照在EPICS 流式细胞计中进行的。染色并试验了新鲜和冻干的细胞，以分析新鲜和冻干的细胞制剂中细胞群体周期的进度。

在不同的日期并由不同供体（即PBL供体）和定名为PB11和PB44的不同培养物中得到新鲜和冻干的细胞。这些试验记录的结果证实冻干的细胞适于用作细胞周期分析的对照细胞。新鲜和冻干细胞在细胞周期分析中出现的某些差异可能是因为收集被试细胞的时间不同而导致的。

由上述对按本发明方法冻干的细胞及相应新鲜细胞所作比较分析，可以得出下列结论：

1.这些冻干的细胞可在流式细胞计分析法的质量控制中，用于体外诊断分析。

2.在用流式细胞计进行细胞表面标志分析时，这些冻干的细胞在功能上可作为阳性染色的生物学对照。从而可用于判定试剂的可靠性、样品制备技术，以及流式细胞计的正常功能。它们可作为细胞对照物，用于鉴定抗细胞活化抗原和白血病抗原的单克隆抗体。在对细胞表面抗原密度进行定量分析时，可用作标准对照。

3.进行DNA分析时，这些冻干的细胞可起阳性染色的生物学对照物的作用，以估价试剂可靠性、样品制备技术，以及流式细胞计的正常功能。另外还可在细胞群体的细胞周期分析中用作标准品。

据信，由于这些冻干的细胞保留了形态学和细胞表面抗原的完整性，故也可作为对照细胞被用于其他类型的分析检测，如用于ELISA和显微镜检验中。用本发明的冻干方法制备的细胞可用于免疫检测所有的正常或异常哺乳动物细胞（如肿瘤细胞）。只要能够得到检测介质，如单克隆抗体，是能够完成检测目的。本发明的冻干方法也可产生适于血液学颗粒分析仪使用的冻干的对照细胞。也可用本发明方法保存组织细胞。

与目前普遍使用的荧光小珠或微球相比，在流式细胞计中使用冻干的对照细胞可具有多种优点。荧光微球不适于作为对照用于样品制备，不能用于将流式或细胞计调试合适以进行细胞光散射分析，而且它们的荧光是细胞内的而不是细胞表面的。此外，用流式细胞计分析时，冻干的细胞在结构上更相似于新鲜细胞。

还应提到的是，用本发明方法冻干的储存细胞不需要绝对的储藏条件，重新水化时也不需复杂的操作程序，这与使用冷冻保护剂并在液氮温度下储存以保藏正常外周血细胞（PBL）时所遇到的情况完全不同。

值得注意的是，在不背离待批权利要求中所限定的本发明基本内容的前题下，本领域内熟练技术人员在实施本发明的方法时，可以对若干技术细节如试剂量或保温时间等作某些小的改动。

Claims

1、能够在水中重新水化的冻干的哺乳动物细胞，用流式细胞计光散射分析法可证实其保留了与相应新鲜细胞相似的结构完整性及细胞表面抗原性，而且作为冻干细胞在其于2至8摄氏度储存几个月后仍显示其长时间的稳定性。

2、根据权利要求1的冻干细胞，其进一步的特征在于能够被阳性染色而用作流式细胞计方法学的生物学对照。

3、根据权利要求1的冻干细胞，其进一步的特征在于能够被阳性染色，在流式细胞计方法学中用作DNA分析的生物学对照。

4、根据权利要求1的冻干细胞，其进一步的特征在于能够用作细胞群体之细胞周期分析的标准对照。

5、根据权利要求1、2和3的冻干细胞，其中所说的细胞可得自人外周血细胞或培养的细胞。

6、根据权利要求1的冻干细胞，其中所说的细胞可得自其生理状态为正常或异常的人组织细胞。

7、根据权利要求1的冻干细胞，其能够被染色，因而能在免疫分析法中用作生物学对照细胞。

8、于冰冻温度下储存5个月或更长时间后能够在蒸馏水中恢复其含水状态的冻干的人细胞和培养细胞，其进一步的特征在于保留了它们原来的膜结构及细胞表面抗原性，适于继后在流式细胞计分析中用作阳性染色的生物学对照。

9、根据权利要求1的冻干细胞，其中所说的细胞携带溶于等渗液中之海藻糖的保护性衣壳，该溶液是在其冻干前加入的。

10、根据权利要求8或9的冻干细胞，其进一步的特征在于适于作为DNA分析的生物学对照。

11、根据权利要求8或9的冻干细胞，其进一步的特征在于能够用作T和B细胞群体之细胞周期分析的标准对照。

12、一种制备冻干的哺乳动物细胞的方法，该冻干细胞在重新恢复其含水状态后仍保留细胞膜结构完整性及细胞表面抗原性，所说的方法包括下列步骤：

A.收集预定数目悬浮于选定体积之磷酸盐缓冲的白蛋白中的样品细胞;

B.离心细胞悬液得到细胞沉淀团块;

C.于室温下，在含海藻糖的等渗溶液中将细胞悬液保温一定时间，得到细胞悬液;

D.将细胞悬液加入容器内，冷却到预定的低温并于约-70℃下冷冻约1小时;

E.将容器移入冻干装置，冻干预定的时间;然后，

F.将含有冻干细胞的容器储存于2-8摄氏度的冷冻温度下，以备继后于原位在蒸馏水中恢复原含水状态。

13、根据权利要求12的方法，其中得自步骤B的细胞悬液是首先按步骤B处理以产生细胞沉淀团块，并再次按步骤C的方法处理细胞团块，然后按步骤D处理所得到的细胞悬液。

14、根据权利要求12或13的方法，其中保温是在溶于等渗液的10%海藻糖中进行的。

15、根据权利要求12或13的方法，其中细胞沉淀团块于4℃下在磷酸盐缓冲的白蛋白中悬浮1小时。

16、根据权利要求14的方法，其中细胞沉淀团块于室温下在10%海藻糖等渗溶液中保温约30分钟。

17、根据权利要求12或13的方法，其中冻干周期约为15小时。

18、一种哺乳动物生理细胞的检验方法，其中为实现检验试剂和检验仪器的标准化而使用了对照介质，其改进包括用能够在水中重新恢复含水状态的冻干细胞作为生物学对照细胞，特征在于其保留了与相应的正常新鲜哺乳动物细胞相似的细胞膜结构完整性和细胞表面抗原性。

19、根据权利要求18的检验方法，其中所说的哺乳动物细胞选自于外周血细胞、培养的细胞、杂交瘤细胞系或组织细胞。

20、根据权利要求18所述的检验方法，其中检验方法是检验外周血细胞的分离的细胞群体。

21、于2至8摄氏度的低温度下储存几个月后能够在蒸馏水中重新恢复其含水状态的冻干的哺乳动物细胞，其特征在于保留了基本上与新鲜细胞相同的生理学参数。

22、根据权利要求21的冻干细胞，其进一步的特征在于功能上适于用作进行哺乳动物细胞分析的对照。