CN104774266A - 白介素-13结合蛋白 - Google Patents

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C.A.卡夫
P.R.欣顿
S.库马
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Abstract

本发明涉及白介素-13结合蛋白。本发明包括IL-13结合蛋白。具体而言，本发明涉及嵌合抗体、CDR移植抗体和人源化抗体。优选的抗体对hIL-13具有高亲和力并且在体外和体内中和hIL-13活性。本发明的抗体可为全长抗体或其抗原结合部分。还提供了本发明抗体的制备方法和使用方法。本发明的抗体或抗体部分适用于例如在患有其中hIL-13活性起有害作用的病症的人类个体中检测hIL-13和抑制hIL-13活性。

Description

白介素-13结合蛋白
本申请是国际申请日为2007年9月7日的国际申请PCT/US2007/019660进入中国、申请号为200780033285.7的题为“白介素-13结合蛋白”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求于2006年9月8日提交的US临时申请60/843,249的优先权。
技术领域
本发明涉及IL-13结合蛋白，且具体而言涉及其在预防和/或治疗包括哮喘、过敏、COPD、纤维化和癌症在内的各种疾病的用途。
共同研究协议介绍
本申请的内容服从Protein Design Labs，Inc.与Abbott Laboratories于2005年12月14日签订的共同研究协议，且涉及IL-13的重组工程化抗体。
背景技术
人类IL-13是从活化T细胞克隆的17-kDa糖蛋白(Zurawski与deVries 1994Immunol Today 15 19-26)，且由Th2谱系的活化T细胞产生，尽管Th0和Th1CD4+T细胞、CD8+T细胞和几个例如肥大细胞的非-T细胞群体也产生IL-13(Zurawski和de Vries 1994Immunol Today 1519-26)。IL-13的功能包括在人类B细胞中转变成IgE(Punnonen，Aversa等人1993Proc Natl Acad Sci U S A 90 3730-4)且抑制人和小鼠炎性细胞因子产生(de Waal Malefyt，Figdor等人，1993J Immunol 151 6370-81；Doherty，Kastelein等人，1993J Immunol 151 7151-60)的免疫球蛋白同种型。IL-13与其细胞表面受体IL-13Rα1和IL-13Rα2结合。IL-13Rα1以低亲和力(KD约10nM)与IL-13相互作用，接着募集IL-4Ra以形成高亲和力(KD约0.4nM)信号传导异二聚受体复合体(Aman，Tayebi等人，1996J Biol Chem 271 29265-70；Hilton，Zhang等人，1996Proc Nat1Acad Sci U S A 93 497-501)。IL-4R/IL-13Rα1复合体在例如B细胞、单核细胞/巨噬细胞、树状细胞、嗜伊红性粒细胞、嗜碱性细胞、成纤维细胞、内皮细胞、气管上皮细胞和气管平滑肌细胞的许多细胞类型上表达(Graber，Gretener等人，1998Eur J Immunol 28 4286-98；Murata，Husain等人，1998Int Immunol 10 1103-10；Akaiwa，Yu等人，2001Cytokine 13 75-84)。IL-13Rα1/IL-4R受体复合体的结扎使得包括信号转导蛋白和转录活化因子(STAT6)和胰岛素受体底物-2(IRS-2)途径的各种信号转导途径活化(Wang，Michieli等人，1995Blood 86 421-27；Takeda，Kamanaka等人，1996J Immunol 157 3220-2)。单独的IL-13Rα2链对.IL-13具有高亲和力(KD约0.25-0.4nM)，且起反向调节IL-13结合的诱饵受体的作用(Donaldson，Whitters等人，1998J Immunol 161 2317-24)和诱导巨噬细胞和可能地其它细胞类型中TGF-b经由AP-1途径合成和纤维化的信号传导受体的作用(Fichtner-Feigl，Strober等人，2006NatMed 12 99-106)。
临床前哮喘动物模型中进行的几个研究指示IL-13在哮喘中起重要作用。这些数据包括IL-13基因剔除小鼠的哮喘抗性以及各种小鼠模型中IL-13拮抗剂(可溶性IL-13受体、抗IL-13mAbs等)的哮喘表型抑制作用(Sela 1999Harefuah 137 317-9；Wills-Karp和Chiaramonte 2003Curr Opin Pulm Med 9 21-7；Wills-Karp 2004Immunol Rev 202 175-90)。多个研究已证明向小鼠和豚鼠的肺部药理学施用重组IL-13诱导气管粘液高度分泌、嗜酸粒细胞增多和AHR(Grunig，Warnock等人，1998Science 282 2261-3；Wills-Karp，Luyimbazi等人，1998Science 2822258-61；Kibe，Inoue等人，2003Am J Respir Crit Care Med 167 50-6；Vargaftig和Singer 2003Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284L260-9；Vargaftig和Singer 2003Am J Respir Cell Mol Biol 28 410-9)。IL-13的这些效应在构成型或诱导型表达IL-13的转基因小鼠系统中重新产生(Zhu，Homer等人，1999J Clin Invest 103 779-88；Zhu，Lee等人，2001Am J Respir Crit Care Med 164S67-70；Lanone，Zheng等人，2002J Clin Invest 110 463-74)。IL-13的慢性转基因过度表达也诱导上皮下纤维化和气肿。缺乏IL-13(和IL-14)信号传导分子STAT6的小鼠未能发展过敏原诱导的AHR和粘液过度产生(Kuperman，Huang等人，2002Nat Med 8 885-9)。使用可溶性IL-13受体融合蛋白(sIL-13Rα2Fc)的研究已证明此细胞因子在实验性过敏原卵白蛋白(OVA)诱导的气管疾病中的关键作用(Grunig，Warnock等人，1998Science 282 2261-3；Wills-Karp，Luyimbazi等人，1998Science 282 2258-61；Taube，Duez等人，2002J Immunol 169 6482-9)。也在鼠类哮喘慢性模型中证明了抗IL-13治疗的效力。除表现出粘液高度分泌和AHR的特征外，慢性哮喘的此模型证明了更急性模型中缺乏的几个人类疾病的特点。这些包括位于上皮间空间的肺组织嗜酸粒细胞增多以及如由胶原沉积增加所测定的平滑肌纤维化。用OVA在OVA敏化小鼠中每周1次重复气溶胶攻击，历时总计4周诱导慢性哮喘模型。最后2周OVA攻击中施用抗IL-13抗体(自第36天开始，在研究的第53天评估效力读出值)显著地抑制了AHR，肺炎、杯状细胞增生、粘液高度分泌和气管纤维化(Yang，Li等人，2005J Pharmacol Exp Ther)。此外，在灵长类哮喘模型中也证明IL-13拮抗剂的治疗作用抑制AHR[摘要，American ThoracicSociety 2005]。
由于已在哮喘患者的肺检测到升高含量的IL-13mRNA和蛋白，其与疾病的严重程度相互有关，因此IL-13牵涉于人类哮喘的发病机制中(Huang，Xiao等人，1995J Immunol 155 2688-94)。另外，已鉴定出导致升高的IL-13水平的人类IL-13遗传多态性，且其与哮喘和特异反应性皮炎相关(Heinzmann，Mao等人，2000Hum Mol Genet 9 549-59；Hoerauf，Kruse等人，2002Microbes Infect 4 37-42；Vercelli 2002CurrOpin Allergy Clin Immunol 2 389-93；Heinzmann，Jerkic等人，2003JAllergy Clin Immunol 112 735-9；Chen，Ericksen等人，2004J AllergyClin Immunol 114 553-60；Vladich，Brazille等人，2005J Clin Invest)，且在哮喘患者的肺中已检测到升高的IL-13水平(Huang，Xiao等人，1995J Immunol 155 2688-94；Arima，Umeshita-Suyama等人，2002JAllergy Clin Immunol 109 980-7；Berry，Parker等人，2004J Allergy ClinImmunol114 1106-9)。由于具有导致较高血浆IL-13水平的IL-13基因多态性的个体对于特异反应性和哮喘具有增加风险性，因此已也证明IL-13与哮喘之间的遗传联系(Wills-Karp 2000Respir Res 1 19-23)。
由于人类IL-13在各种人类病症中的作用，因此治疗策略已经设计以抑制或抵消IL-13活性。尤其已寻找结合与中和IL-13的抗体作为抑制IL-13活性的手段。然而，在现有技术中需要能够结合IL-13的改善的抗体。优选地，抗体结合人类IL-13。优选地，抗体能够中和人类IL-13。本发明提供了新的结合蛋白、CDR移植抗体、人源化抗体和其片段的家族，其能够结合人类IL-13，以高亲和力结合，以及结合且中和人类IL-13。
发明内容
本发明涉及IL-13结合蛋白。本发明的结合蛋白包括但不限于抗体、抗原结合部分和其它能够结合人类IL-13的抗原结合蛋白。另外，本发明提供了IL-13结合蛋白的制备和使用方法。
本发明的一个方面涉及能够结合IL-13的结合蛋白。在一个优选的实施方案中，结合蛋白结合人类IL-13。优选地，所述结合蛋白能够调节IL-13的生物学功能。所述结合蛋白更优选能够中和IL-13。
在本发明的一个方面中，所述结合蛋白能够结合IL-13，且阻止IL-13与IL-13α1受体结合。在本发明的另一个方面中，所述结合蛋白能够结合IL-13，且阻止IL-13与IL-13α2受体结合。在一个优选的实施方案中，所述结合蛋白能够结合IL-13，且阻止IL-13与IL-13α1受体和IL-13α2结合。
本发明的一个实施方案提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，且在基于细胞表面的受体结合测定中以下述IC50抑制所述IL-13与IL-13α2受体结合，其中IC50选自约1.5×10-8至1×10-8M、1×10-8至1×10-9M、10-9至10-10M和10-10至10-11M；或在基于ELISA的受体结合测定中以下述IC50抑制所述IL-13与IL-13α2受体结合，其中IC50选自约1.8×10-8至1×10-8M、1×10-8至1×10-9M、10-9至10-10M和10-10至10-11M。优选地，抗体结合人类IL-13且在基于细胞表面的受体结合测定中以2.7×10-9M的IC50抑制所述IL-13与IL-13α2受体结合，且在基于ELISA的受体结合测定中以1.1×10-9M的IC50抑制所述IL-13与IL-13α2受体结合。优选地抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，且在基于细胞表面的受体结合测定或在基于ELISA的受体结合测定中在100nM的浓度下将所述IL-13与IL-13α2受体的结合抑制约70-100％。抗体优选为13C5.5。抗体更优选不为BAK502G9、mAbl3.2或MJ2-7。
在另一个方面中，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，且在人类IL-13诱导的哮喘模型中将AHR抑制约50％、60％、70％、80％、90％或100％。在人类IL-13诱导的哮喘模型中所述抗体优选将AHR抑制大于86％。在另一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，且在人类IL-13诱导的哮喘模型中将AHR抑制约50％、60％、70％、80％、90％或100％，并且将粘液产生抑制约40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抗体优选为13C5.5。抗体更优选不为BAK502G9、mAbl3.2或MJ2-7。
在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振所测定本发明的结合蛋白对IL-13具有以下结合速率常数(on rate constant)(kon)：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1；或至少约106M-1s-1。优选地，如通过表面等离子体共振所测定本发明的结合蛋白对IL-13具有介于102M-1s-1与103M-1s-1之间；介于103M-1s-1与104M-1s-1之间；介于104M-1s-1与105M-1s-1之间；或介于105M-1s-1与106M-1s-1之间的结合速率常数(kon)。
在另一个实施方案中，如通过表面等离子体共振所测定，本发明的结合蛋白对IL-13具有至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；或至多约10-6s-1的分解速率常数(off rate constant)(koff)。优选地，如通过表面等离子体共振所测定，本发明的结合蛋白对IL-13具有10-3s-1至10-4s-1；10-4s-1至10-5s-1；或10-5s-1至10-6s-1的分解速率常数(koff)。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白对IL-13具有至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M；或至多10-13M的解离常数(dissociation constant)(KD)。优选地，本发明的结合蛋白对IL-13具有10-7M至10-8M；10-8M至0-9M；10-9M至10-10M；10-10至10-11M；10-11M至10-12M；或10-12M至10-13M的解离常数(KD)。
优选地，抗体或其抗原结合片段以选自下列的结合特征结合IL-13：a)介于约105M-1s-1至106M-1s-1或约106M-1s-1至107M-1s-1的结合速率常数(kon)；或b)如通过表面等离子体共振所测定的约10-4s-1至10-5s-1；或约10-5s-1至10-6s-1的分解速率常数(koff)；或c)约1.5×10-10至1×10-10M或约10-10至10-11M的解离常数(KD)。优选地，抗体或其抗原结合片段对IL-13具有选自下列的结合速率常数(kon)：6.68×105M-1s-1、7.86×105M-1s-1、8.35×105M-1s-1、8.69×105M-1s-1、9.15×105M-1s-1、1.26×106M-1s-1、1.7×106M-1s-1和2.51×106M-1s-1。优选地，如通过表面等离子体共振所测定的，所述抗体或其抗原结合片段对IL-13具有选自下列的分解速率常数(koff)：1.23×10-4s-1；.1.76×10-4s-1；4.74×10-4s-1；1.91×10-5s-1；2.14×10-5s-1；3.82×10-51s-1；8.81×10-5s-1；和9.65×10-5s-1。优选地，抗体或其抗原结合片段对IL-13具有选自下列的解离常数(KD)：1.05×10-10M；7.10×10-10M；1×10-11M；2.20×10-11M；2.72×10-11M；4.17×10-11M；5.68×10-11M；7.01×10-11M；7.10×10-11M；和9.79×10-11M。
本发明的一个方面涉及能够结合IL-13上的特定表位的结合蛋白。优选地，所述特定表位包含人类IL-13的C末端螺旋D区。更优选地，所述特定表位包含氨基酸序列VRDTK IEVAQ FVKDL LL HLK KLFREGR，对应于SEQ ID NO.1的氨基酸104-130。在另一个方面中，所述抗体或抗原结合部分结合包含人类IL-13的C末端螺旋D区和N末端螺旋A区的表位。优选地，所述抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，使得具有所述抗体或其抗原结合片段的IL-13被抑制而不能与IL-13受体结合，所述抗体或其抗原结合片段与由SEQ ID No.1的局部区域Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38与Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130界定的表位结合。优选地，所述抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，使得具有所述抗体或其抗原结合片段的IL-13被抑制而不能与IL-13受体结合，所述抗体或其抗原结合片段与由SEQ ID No.1的局部区域Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38和Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127界定的表位结合。优选地，所述抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，使得具有所述抗体或其抗原结合片段的IL-13被抑制而不能与IL-13α2受体结合，所述抗体或其抗原结合片段与由SEQ ID No.1的局部区域Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38和Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130界定的表位结合。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，使得具有所述抗体或其抗原结合片段的IL-13被抑制而不能与IL-13α2受体结合，所述抗体或其抗原结合片段与由SEQ ID No.1的局部区域Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38和Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130界定的表位结合，条件是所述抗体不是BAK502G9或MJ2-7。所述抗体最优选为13C5.5。
在一个方面中，分离的抗体或其抗原结合片段结合IL-13且阻止IL-13与IL-13α2受体结合，其结合特征选自：与IL-13上包括螺旋A和D的表位结合；结合速率常数(kon)介于约105M-1s-1至106M-1s-1或约106M-1s-1至107M-1s-1之间；如通过表面等离子体共振所测定分解速率常数(koff)为约10-4s-1至10-5s-1；或约10-5s-1至10-6s-1；且解离常数(KD)为约1.5×10-10至1×10-10M或约10-10至10-11M。在另一个方面中，分离的抗体或其抗原结合片段结合变体IL-13且阻止变体IL-13与IL-13α2受体结合，其结合特征选自：与IL-13上包括螺旋A和D的表位结合；结合速率常数(kon)介于约105M-1s-1至106M-1s-1或约106M-1s-1至107M-1s-1之间；如通过表面等离子体共振所测定分解速率常数(koff)为约10-4s-1至10-5s-1；或约10-5s-1至10-6s-1；且解离常数(KD)为约1.5×10-10至1×10-10M或约10-10至10-11M。
在一个方面中，本发明结合蛋白能够结合IL-13，所述抗原结合域包含至少一CDR，所述CDR包含选自下列的氨基酸序列：
CDR-H1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：64)其中：
X1为T、D、G或S；
X2为S；
X3为D；
X4为M、S、Y、L或H；
X5为G、W、Y、A、S或N；
X6为V、I或M；且
X7为D、H、S、Y、N或G；
CDR-H2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO：65)，其中：
X1为M、E、H、R、S、G或L；
X2为I或不存在；
X3为H、Y、A、D、S或W；
X4为P、S、W或G；
X5为S、G、E或D；
X6为D、G、S、E或N；
X7为S、Y或G；
X8为E、N、Y、V或R；
X9为T、I或K；
X10为R、Y、I、D或A；
X11为L、Y、D或F；
X12为N、P、S或D；
X13为Q、E、D、P或S；
X14为K、M、S、T、A或V；
X15为F、L、V或M；
X16为K、R或Q；且
X17为D、G或S；
CDR-H3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14(SEQ IDNO：66)，其中：
X1为W、T、G、Y、D或I；
X2为R、A、S、G或V；
X3为T、F、Y或S；
X4为S、T或Y；
X5为Y、F或G；
X6为F或Y；
X7为S、Y、I或F；
X8为D、L、Y或P；
X9为Y；
X10为G；
X11为Y、A、P或E；
X12为F、M、S、L或I；
X13为D、V、N或K；且
X14为Y或F；
CDR-L1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQ ID NO：67)其中：
X1为K或R；
X2为S或A；
X3为S或T；
X4为Q、K或I；
X5为N、S、T、G或E；
X6为L、T或S；
X7为L、Q或V；
X8为Y、N、H、D或T；
X9为S、I或T；
X10为S、D、N、H或Y；
X11为N或G；
X12为Q；
X13为K、F、N、E或S；
X14为N、T或S；
X15为Y或F；
X16为L、A或M；且
X17为A、D、E、H或N；
CDR-L2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：68)，其中：
X1为L、S、K、T、W或Y；
X2为V、T或A；
X3为S或N；
X4为N、K、T、M或R；
X5为R、K或L；
X6为F、D、E、H、P或A；且
X7为S、R或P；
和
CDR-L3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：69)，其中：
X1为F、W、Q或A；
X2为Q或L；
X3为H、G、Y、W或N；
X4为N、S、T、L或Y；
X5为Y、T、S、E或H；
X6为L、V、F、Y、N、G、P或D；
X7为P或H；
X8为L、F、Y、W或R；且
X9为T或V。
优选地，所述抗原结合域包含至少一个CDR，所述CDR包含选自下列的氨基酸序列：
SEQ ID NO：32的残基31-35；     SEQ ID NO：46的残基52-67；
SEQ ID NO：32的残基50-66；     SEQ ID NO：46的残基100-112；
SEQ ID NO：32的残基99-105；    SEQ ID NO：47的残基24-34；
SEQ ID NO：33的残基24-39；     SEQ ID NO：47的残基50-56；
SEQ ID NO：33的残基55-61；     SEQ ID NO：47的残基89-97；
SEQ ID NO：33的残基94-102；    SEQ ID NO：48的残基31-37；
SEQ ID NO：34的残基31-35；     SEQ ID NO：48的残基52-67；
SEQ ID NO：34的残基50-66；     SEQ ID NO：48的残基100-112；
SEQ ID NO：34的残基99-105；    SEQ ID NO：49的残基24-34；
SEQ ID NO：35的残基24-39；     SEQ ID NO：49的残基50-56；
SEQ ID NO：35的残基55-61；     SEQ ID NO：49的残基89-97；
SEQ ID NO：35的残基94-102；    SEQ ID NO：50的残基31-37；
SEQ ID NO：36的残基31-35；     SEQ ID NO：50的残基52-67；
SEQ ID NO：36的残基50-66；     SEQ ID NO：50的残基100-112；
SEQ ID NO：36的残基99-109；    SEQ ID NO：51的残基24-34；
SEQ ID NO：37的残基24-39；     SEQ ID NO：51的残基60-66；
SEQ ID NO：37的残基55-61；     SEQ ID NO：51的残基89-97；
SEQ ID NO：37的残基94-102；    SEQ ID NO：52的残基31-35；
SEQ ID NO：38的残基31-35；     SEQ ID NO：52的残基50-66；
SEQ ID NO：38的残基50-66；     SEQ ID NO：52的残基99-107；
SEQ ID NO：38的残基99-109；    SEQ ID NO：53的残基23-36；
SEQ ID NO：39的残基31-35；     SEQ ID NO：53的残基52-58；
SEQ ID NO：39的残基50-66；     SEQ ID NO：53的残基91-99；
SEQ ID NO：39的残基99-112；    SEQ ID NO：54的残基31-35；
SEQ ID NO：40的残基24-39；SEQ ID NO：54的残基50-65；
SEQ ID NO：40的残基55-61；SEQ ID NO：54的残基98-107；
SEQ ID NO：40的残基94-102；SEQ ID NO：55的残基24-38；
SEQ ID NO：41的残基31-35；SEQ ID NO：55的残基54-60；
SEQ ID NO：41的残基50-66；SEQ ID NO：55的残基93-101；
SEQ ID NO：41的残基99-112；SEQ ID NO：56的残基31-35；
SEQ ID NO：42的残基31-35；SEQ ID NO：56的残基50-65；
SEQ ID NO：42的残基50-66；SEQ ID NO：56的残基98-107；
SEQ ID NO：42的残基99-100；SEQ ID NO：57的残基24-38；
SEQ ID NO：43的残基24-39；SEQ ID NO：57的残基54-60；
SEQ ID NO：43的残基55-61；SEQ ID NO：57的残基93-101；
SEQ ID NO：43的残基94-102；SEQ ID NO：58的残基31-35；
SEQ ID NO：44的残基31-35；SEQ ID NO：58的残基50-65；
SEQ ID NO：44的残基50-65；SEQ ID NO：58的残基98-107；
SEQ ID NO：44的残基98-106；SEQ ID NO：59的残基24-38；
SEQ ID NO：45的残基24-40；SEQ ID NO：59的残基54-60；
SEQ ID NO：45的残基56-62；SEQ ID NO：59的残基93-101；
SEQ ID NO：45的残基95-103；SEQ ID NO：60的残基31-35；
SEQ ID NO：46的残基31-37；SEQ ID NO：60的残基50-65；
SEQ ID NO：60的残基98-107；SEQ ID NO：62的残基98-107；
SEQ ID NO：61的残基24-38；SEQ ID NO：63的残基24-38；
SEQ ID NO：61的残基54-60；SEQ ID NO：63的残基54-60；
SEQ ID NO：61的残基93-101；和
SEQ ID NO：62的残基31-35；SEQ ID NO：63的残基93-101。
SEQ ID NO：62的残基50-65；
在一个优选的实施方案中，结合蛋白包含至少3个CDR，其是选自下列的可变域CDR组：
结合蛋白优选包含至少两个可变域CDR组。优选地，至少两个可变域CDR组选自：
VH 25C8 CDR组&VL 25C8 CDR组；
VH 9C11 CDR组&VL 9C11 CDR组；
VH 21D9 CDR组&VL 21D9 CDR组；
VH 22D10 CDR组&VL 22D10 CDR组；
VH 5F1 CDR组&VL 5F1 CDR组；
VH 5G1 CDR组&VL 5G1 CDR组；
VH 3H7 CDR组&VL 3H7 CDR组；
VH 14B2 CDR组&VL 14B2 CDR组；
VH 13C5 CDR组&VL 13C5 CDR组；
VH 29G5 CDR组&VL 29G5 CDR组；
VH 33C3 CDR组&VL 33C3 CDR组；
VH 4A8 CDR组&VL 4A8 CDR组；
VH 1B6 CDR组&VL 1B6 CDR组；
VH 3E5CDR组&VL 3E5 CDR组；
VH 6C8 CDR组&VL 6C8 CDR组；
VH 5D3 CDR组&VL 5D3 CDR组；和
VH 8B6 CDR组&VL 8B6 CDR组。
在另一个实施方案中，上文公开的结合蛋白还包含人类接纳体(acceptor)框架。人类接纳体框架优选的包含选自下列的氨基酸序列：
在一个优选的实施方案中，结合蛋白为能够结合IL-13的CDR移植抗体或其抗原结合部分。CDR移植抗体或其抗原结合部分优选的包含一个或多个上文公开的CDR。CDR移植抗体或其抗原结合部分优选包含人类接纳体框架。所述人类接纳体框架更优选为上文公开的人类接纳体框架的任一个。
在一个优选的实施方案中，结合蛋白为能够结合IL-13的人源化抗体或其抗原结合部分。人源化抗体或其抗原结合部分优选的包含一个或多个上文所公开掺入人类接纳体框架的人类抗体可变域的CDR。人类抗体可变域优选为共有人类可变域。人类接纳体框架更优选包含至少一关键残基的框架区域氨基酸取代，其中所述关键残基是选自以下各物：邻近于CDR的残基；糖基化位点残基；稀有残基；能够与人类IL-13相互作用的残基；能够与CDR相互作用的残基；规范残基；重链可变区域与轻链可变区域之间的接触残基；Vernier区中的残基；在Chothia定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重链框架之间重叠的区域中的残基。人类接纳体框架优选的包含至少一框架区域氨基酸取代，其中所述框架的氨基酸序列与所述人类接纳体框架的序列至少65％一致且包含至少70个与所述人类接纳体框架一致的氨基酸残基。优选地，关键残基的框架区域氨基酸取代选自2L、15L、22L、41L、42L、44L、49L、50L、51L、62L、71L、73L、10H、44H、46H、48H、67H、68H、70H、72H、74H、76H、83H、84H、86H、87H和97H。
在一个优选的实施方案中，结合蛋白为能够结合IL-13的人源化抗体或其抗原结合部分。人源化抗体或其抗原结合部分优选的包含一个或多个上文公开的CDR。人源化抗体或其抗原结合部分更优选包含三个或三个以上上文公开的CDR。人源化抗体或其抗原结合部分最优选包含六个上文公开的CDR。
在本发明的另一个实施方案中，人源化抗体或其抗原结合部分包含至少一可变域，其具有选自选自下列的氨基酸序列：
人源化抗体或其抗原结合部分更优选包含两个选自上文公开的的可变域。结合蛋白更优选包含两个可变域，其中所述两个可变域具有选自下列的氨基酸序列：
本发明的一个实施方案提供了抗体构建体，其包含上文所公开结合蛋白的任一个和接头(linker)多肽或免疫球蛋白。在一个优选的实施方案中，抗体构建体选自免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、单域抗体、双功能抗体(diabody)、多特异性抗体、双重特异抗体(dual specific antibody)和双特异性抗体(bispecific antibody)。在一个优选的实施方案中，抗体构建体包含重链免疫球蛋白恒定域，其选自人类IgM恒定域、人类IgG1恒定域、人类IgG2恒定域、人类IgG3恒定域、人类IgG4恒定域、人类IgE恒定域和人类IgA恒定域。抗体构建体更优选包含SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；和SEQ ID NO：5。在另一个实施方案中，本发明提供了抗体缀合物，其包含上文公开的抗体构建体和选自以下的试剂：免疫粘附分子、造影剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个优选的实施方案中，所述造影剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。更优选，造影剂为选自3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm的放射性标记。在一个优选的实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂选自抗代谢物、烷基化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，抗体构建体是糖基化的。优选的，所述糖基化为人类糖基化模式。
在另一个实施方案中，上文公开的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物以晶体形式存在。优选的所述晶体为无载体的药物控释晶体。在一个优选的实施方案中，结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物具有比其可溶性对应物更大的体内半衰期。在另一个优选的实施方案中，结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物结晶后保留生物学活性。
本发明的一个方面涉及包含能够结合IL-13的结合蛋白的DVD结合蛋白。所述DVD结合蛋白优选能够结合IL-13和第二标靶(target)。第二标靶选自：CSF1(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、组胺和组胺受体、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR和壳多糖酶。DVD蛋白更优选能够识别IL-13和IL-1β、IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-15；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；或IL-13和ADAM8。DVD蛋白最优选能够结合IL-13和TNFα。
本发明的一个方面涉及分离的核酸，其编码任何上文公开的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物。另一个实施方案提供了包含上文所公开的分离的核酸的载体，其中所述载体选自：pcDNA；pTT(Durocher等人，Nucleic Acids Research 2002，第30卷，第2号)；pTT3(具有其它几个克隆位点的pTT)；pEFBOS(Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)Nucleic acids Research第18卷，第17号)；pBV；pJV；和pBJ。
在另一个方面中，宿主细胞用上文所公开的载体转化。宿主细胞优选为原核细胞。宿主细胞更优选为大肠杆菌(E.Coli)。在相关实施方案中，宿主细胞为真核细胞。真核细胞优选选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。宿主细胞更优选为哺乳动物细胞，其包括但不限于CHO和COS；或真菌细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；或昆虫细胞，例如Sf9。
本发明的另一个方面提供了产生结合IL-13的结合蛋白的方法，所述方法包括在培养基中在足以产生结合IL-13的结合蛋白的条件下培养任何上文公开的宿主细胞。另一个实施方案提供了根据上文所公开方法产生的结合蛋白。
一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含制剂和至少一种聚合载体，所述制剂包含如上文公开的结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物和组分。聚合载体优选是选自下列的一种或多种聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羟基丁酯)、聚(己内酯)、聚(二氧杂环己酮)；聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、顺丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇(pluronic polyols)、白蛋白、海藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、葡糖胺聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖、其混合物和共聚物。组分优选选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的上文所公开组合物的步骤。
本发明也提供了药物组合物，其包含如上文所公开的结合蛋白、抗体构建体或抗体缀合物和药物学上可接受的载体。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一用于治疗其中IL-13活性有害的病症的其它治疗剂。优选的所述其它药剂选自：治疗剂、造影剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂(包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF-trap)；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2-抑制剂)；协同刺激分子阻断剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗CD20)；粘着分子阻断剂(包括但不限于抗-LFA-1Abs、抗-E/L选择蛋白Abs、小分子抑制剂)；抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗-IL-18、抗-TNF、抗-IL-6/细胞因子接纳体抗体)；甲氨蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素(rapamycin)；FK506；可检测标记或报道基因；TNF拮抗剂；防风湿药剂；肌肉松弛剂、麻醉药、非甾类消炎药物(NSAID)、止痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、牛皮癣治疗剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、红血球生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替换药物、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病剂、刺激剂、哮喘药剂、β激动剂、经吸入甾类药物、肾上腺素或类似物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。
在另一个方面中，本发明提供了用于抑制人类IL-13活性的方法，所述方法包括使人类IL-13与上文公开的结合蛋白接触使得人类IL-13活性受抑制。在一相关方面中，本发明提供一种用于抑制患有其中IL-13活性有害的病症的人类个体的人类IL-13活性的方法，所述方法包括向所述人类个体施用上文公开的结合蛋白，使得所述人类个体的人类IL-13活性被抑制且实现治疗。
在另一个方面中，本发明提供了治疗(例如治愈、抑制、改善、延迟或阻止发作或预防反复或复发)或阻止个体的IL-13相关病症的方法。所述方法包括：向个体施用足以治疗或预防IL-13相关病症的量的IL-13结合剂(尤其拮抗剂)，例如如本文中描述的抗IL-13抗体或其片段。可单独或组合如本文中描述的其它治疗形式将IL-13拮抗剂，例如抗IL-13抗体或其片段施用个体。
在一个实施方案中，个体为哺乳动物，例如患有一种或多种IL-13相关病症的人类，这样的病症包括例如呼吸病症(例如哮喘(例如过敏性和非过敏性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)和其它病症，包括呼吸道炎症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液过量产生；特异反应性病症(例如特异反应性皮炎和过敏性鼻炎)；皮肤、胃肠器官(例如炎性肠病(IBD)，例如溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病(Crohn′s disease))和肝脏(例如硬化、纤维化)的炎性和/或自身免疫病症；硬皮病；肿瘤或癌症，例如如本文中描述的霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)。因此，公开内容包括IL-13结合剂(例如抗IL-13抗体或其本文中描述的片段)用于本文中描述的治疗的用途，和IL-13结合剂(例如抗IL-13抗体或其本文中描述的片段)用于制备用于本文中描述的治疗的药剂的用途。IL-13相关病症的实施例包括但不限于选自以下的一种或多种病症：呼吸病症，例如哮喘(例如过敏性和非过敏性哮喘(例如因(例如)呼吸道合胞病毒(RSV)感染所致的(例如)幼儿哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)和其它病症，包括呼吸道炎症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液过量产生，例如囊性纤维化和肺纤维化；特异反应性病症，例如因IL-13敏感性增加所致的特异反应性病症(例如特异反应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎和过敏性肠胃炎)；皮肤(例如特异反应性皮炎)、胃肠器官(例如炎性肠病(IBD)，例如溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病)、肝脏(例如硬化、肝细胞癌)的炎性和/或自身免疫病症和硬皮病；肿瘤或癌症(例如，软组织或实体肿瘤)，例如白血病、成胶质细胞瘤和淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤；病毒感染(例如自HTLV-1病毒感染)；其它器官纤维化，例如肝脏纤维化(例如，由B型肝炎和/或C型肝炎病毒所致的纤维化)；和如本文中描述的保护性1型免疫反应表现的抑制(例如在疫苗接种期间)。
在其它实施方案中，本申请提供了治疗(例如降低、改善)或预防一种或多种与以下病症相关的症状的方法：呼吸病症，例如哮喘(例如过敏性和非过敏性哮喘)；过敏症；慢性阻塞性肺病(COPD)；包括呼吸道炎症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液过量产生的病症，例如囊性纤维化和肺纤维化。例如，哮喘症状包括但不限于喘息、气促、支气管收缩、气管高反应性、降低的肺活量、纤维化、呼吸道炎症和粘液产生。所述方法包含向个体施用足以治疗(例如降低、改善)或预防一种或多种症状的量的IL-13拮抗剂，例如IL-13抗体或其片段。IL-13抗体可治疗性或预防性或两者性质地施用。可单独或组合如本文中描述的其它治疗形式将IL-13拮抗剂，例如抗IL-13抗体或其片段施用个体。个体优选为哺乳动物，例如患有如本文中所述的IL-13相关病症的人类。
在另一个方面中，本申请提供一种用于体外检测样品(例如生物样品，例如血清、血浆、组织、活组织切片)中IL-13的存在的方法。本方法可用于诊断例如免疫细胞相关病症的病症。所述方法包括：(i)使样品或对照样品与如本文中描述的抗IL-13抗体或其片段接触；且(ii)检测抗IL-13抗体或其片段与样品或对照样品之间复合体的形成，其中相对于对照样品，样品中复合体形成的统计上显著变化指示样品中IL-13存在。
在另一个方面中，本申请提供了用于体内检测IL-13存在的方法(例如在个体体内造影中)。本方法可用于诊断例如IL-13相关病症的病症。所述方法包括：(i)在容许抗体或片段与IL-13结合的条件下，向个体或对照个体施用如本文中描述的抗IL-13抗体或其片段；且(ii)检测抗体或片段与IL-13之间复合体的形成，其中相对于对照个体，个体中复合体形成的统计上显著变化指示IL-13存在。
在另一个方面中，本发明的结合蛋白适用于治疗选自下列的病症：关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆(Lyme)关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑性狼疮症、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物对抗宿主疾病、器官移植排斥反应、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥漫性血管内凝血、川崎氏疾病(Kawasaki′s disease)、格雷氏疾病(Grave′s disease)、肾病综合征、慢性疲劳综合征、韦格纳肉牙肿病(Wegener′sgranulomatosis)、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾微观血管炎、慢性活动型肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒症综合征、恶病质、传染性疾病、寄生疾病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿舞蹈病(Huntington′s chorea)、帕金森病(Parkinson′s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性疾病、心脏衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病(Addison′s disease)、多腺缺乏I型和多腺缺乏II型、施密特综合征(Schmidt′s syndrome)、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑形脱发、血清阴性关节病、关节病、莱特尔氏病(Reiter′s disease)、牛皮癣性关节病、溃疡性大肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体病、耶尔森氏菌(yersinia)和沙门氏菌(salmonella)相关关节病、脊椎关节病、动脉粥样化的疾病/动脉硬化、特异反应性过敏、自身免疫大疱疾病、寻常天疱疮、叶型天泡疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫溶血性贫血症、库姆(Coombs)阳性溶血性贫血症、后天性恶性贫血、幼年型恶性贫血、肌痛性脑炎/Royal Free疾病、慢性皮肤粘膜念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化型肝炎、隐性自身免疫肝炎、后天免疫缺陷疾病综合征、后天免疫缺陷相关疾病、B型肝炎、C型肝炎、常见变异免疫缺损(常见变异低丙种球蛋白血病)、扩张型心肌病、雌性不育症、卵巢衰竭、卵巢早衰、纤维化肺疾病、隐性纤维性肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质肺炎、结缔组织病相关间质性肺病、混合性结缔组织病相关肺病、全身性硬化相关间质性肺病、类风湿性关节炎相关间质性肺病、全身性红斑性狼疮症相关肺病、皮肌炎/多发性肌炎相关肺病、修格兰氏疾病(disease)相关肺病、强直性脊椎炎相关肺病、脉管炎扩散肺病、含铁血黄素沉着症相关肺病、药物诱导之间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸细胞性肺炎、淋巴细胞渗透性肺病、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫肝炎、1型自身免疫肝炎(传统的自身免疫或狼疮样肝炎)、2型自身免疫肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮病的B型抗胰岛素症、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫疾病、与器官移植相关的慢性免疫疾病、骨性关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白血球减少、自身免疫性嗜中性白血球减少症、肾病NOS、丝球体肾炎、肾微观血管炎、莱姆病(lymedisease)、盘状红斑狼疮、特发性或NOS男性不育症、精液自身免疫性、多发性硬化症(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病后继发的肺动脉高血压、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture′s syndrome)、肺多发性结节性动脉炎特征、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、斯蒂尔氏病(Still′s disease)、系统性硬化、修联氏综合征(syndrome)、高安氏疾病(Takayasu′s disease)/动脉炎、自身免疫血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿自身免疫甲状腺机能减退(桥本氏症(Hashimoto′s disease))、萎缩性自身免疫甲状腺机能减退、原发性粘液水肿、晶状体源性葡萄膜炎、原发性血管炎、白斑症急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精诱导的肝脏损伤、胆汗郁积(choleosatatis)、特质性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪变性肝炎、过敏和哮喘、B组链球菌(GBS)感染、精神错乱(例如抑郁和精神分裂症)Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性疼痛(各种疼痛)和癌症(例如肺、乳房、胃、膀胱、结肠、胰腺、卵巢、前列腺和直肠癌)和造血恶性疾病(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血病(Abetalipoprotemia)、手足发绀、急性和慢性寄生或传染性过程、急性白血病、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、空中异位搏动、AIDS痴呆并发症、酒精诱导的肝炎、过敏性结膜炎、过敏性接触性皮炎、过敏性鼻炎、同种异体移植排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞退化、抗cd3疗法、抗磷脂综合征、抗受体过敏性反应、主动脉瘤和周围动脉瘤、主动脉剥离、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房颤动(持续性或突发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植排斥反应、骨髓移植(BMT)排斥反应、房室束支传导阻滞、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′slymphoma)、灼伤、心律不整、心脏顿抑综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺旁路炎症反应、软骨移植排斥反应、小脑皮质退化、小脑病症、混乱或多灶性房性心动过速、化学疗法相关的病症、铬髓细胞性白血病(CML)、慢性醇中毒、慢性炎性病症、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心脏衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺心病、冠状动脉病、库贾氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、培养物阴性脓毒症、囊性纤维化、细胞因子治疗相关的病症、拳击员痴呆、脱髓鞘疾病、登革热出血热、皮炎、皮肤病学病症、糖尿病(diabetes)、糖尿病(diabetes mellitus)、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性雷维小体疾病、扩张型充血型心肌病、基底神经节病症、中年唐氏并发症(Down′s Syndrome)、通过药物诱发的阻断CNS多巴胺受体的药物诱发运动病症、药物过敏、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、埃-巴二氏病毒(epstein-barr virus)感染、红斑性肢痛病、锥体束外和小脑病症、家族性噬血细胞淋巴组织细胞增生症、胎儿胸腺植入排斥反应、弗里德棘希氏共济失调(Friedreich′sataxia)、功能性周边动脉病症、真菌脓毒症、气性坏疽、胃溃疡、肾小球性肾炎、任何器官或组织的移植排斥反应、革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性脓毒症、因细胞内生物而致的肉芽瘤、毛细胞白血病、霍-史氏疾病(Hallerrorden Spatz disease)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto′sthyroiditis)、枯草热、心脏移植排斥反应、血色素沉着症、血液透析、溶血尿毒症综合征/溶栓剂血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律不整(His bundle arrythmias)、HIV感染/HIV神经病、霍奇金病、多动性运动障碍、过敏性反应、过敏性肺炎、高血压、运动功能减退性运动障碍、下视丘垂体肾上腺轴评估、特发性阿狄森氏病(Addison′sdisease)、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、衰弱、婴儿脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射暴露、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、局部缺血-再灌注损伤、局部缺血性中风、青年类风湿性关节炎、幼年型脊髓性肌萎缩症、卡波西氏肉瘤(Kaposi′ssarcoma)、肾脏移植排斥反应、军团菌、利什曼病、麻疯病、脊髓皮质系统病变、脂肪水肿、肝脏移植排斥反应、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞病、恶性黑色素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢/特发性、偏头痛、线粒体多系统功能异常、混合性结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多发性系统退化(MencelDejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、胞内鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、骨髓增生异常综合征、心肌梗塞、心肌局部缺血症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经性I肌肉萎缩、嗜中性白血球低下发烧、非霍奇金淋巴瘤、腹主动脉和其旁支闭塞症、动脉闭塞症、okt3疗法、睾丸炎/副睾丸炎、睾丸炎/输精管切除术反向程序、脏器肿大、骨质疏松症、胰腺移植排斥反应、胰腺癌、肿瘤伴随综合征/恶性血钙过多、甲状旁腺移植排斥反应、骨盆炎性疾患、常年性鼻炎、心包疾病、周边动脉粥样硬化的疾病、周边血管性病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫肺炎、肺炎、POEMS综合征(多神经病、脏器肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、子痫前期、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、雷诺氏(Raynaud)现象和疾病、雷诺氏疾病、雷富孙氏病(Refsum′s disease)、常见窄QRS心动过速、肾血管高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、雷维小体型老年痴呆症、血清阴性关节病、休克、镰刀形细胞贫血症、同种移植皮肤排斥反应、皮肤变化综合征、小肠移植排斥反应、实体肿瘤、特定心律不整、脊椎共济失调、脊髓小脑退化、链状球菌肌炎、小脑结构损害、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身过敏反应、全身炎性反应综合征、全身发作青年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血管闭塞性脉管炎、血小板减少、毒性、移植、外伤/出血、III型过敏性反应、IV型过敏性反应、不稳定绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、致命脑炎/无菌性脑膜炎、生命攸关的噬血细胞综合征、韦尼克-科尔萨科夫(Wernicke-Korsakoff syndrome)综合征、威尔森氏症(Wilson′s disease)、任何器官或组织的异种移植排斥反应、急性冠状综合征、急性特发性多发性神经炎、急性炎性脱髓鞘多神经根神经病、急性局部缺血、成人斯蒂尔氏病、斑形脱发、过敏性反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、特异反应性湿疹、特异反应性皮炎、自身免疫皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫病症、自身免疫性肠病、自身免疫性耳聋、自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢早衰、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管疾病、恶性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈脊椎病、慢性局部缺血、瘢痕型类天疱疮、具有多发性硬化症风险的临床上独立的综合征(CIS)、结膜炎、儿童期发作的精神错乱、慢性阻塞性肺病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、腰椎间盘突出症(Disk herniation，Disk prolaps)、药物诱发的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、内眼炎、巩膜表层炎、多形性红斑、主要多形性红斑、妊娠期类天疱疮、古立安-白瑞综合征(Guillain-Barré Syndrome，GBS)、枯草热、休氏综合征、特发性帕金森病、特发性间质性肺炎、IgE介导的过敏、免疫性溶血性贫血、包括体肌炎、传染性眼部炎性疾病、炎性髓鞘脱失病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、角结膜干燥症、库斯毛尔氏症(Kussmauldisease)或库斯毛尔氏-梅尔症(Kussmaul Meier Disease)、兰德里麻痹(Landry′s Paralysis)、蓝氏(Langerhan)细胞组织细胞增多病、网状青斑、黄斑变性、微观多血管炎、Morbus Bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多发性器官衰竭、重症肌无力、脊髓发育不良综合征、心肌炎、神经根病症、神经病、非A非B型肝炎、视神经炎、骨质溶解、少关节型JRA、周边动脉闭塞疾病(PAOD)、周边血管疾病(PVD)、周边动脉疾病(PAD)、静脉炎、多发性结节性动脉炎(或结节性动脉周围炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、灰发症、多关节JRA、多内分泌腺缺乏综合征、多发性肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、泵后综合征、原发性帕金森氏综合征、前列腺炎、纯红细胞再生障碍性贫血、原发性肾上腺机能不全、复发性视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、SAPHO(滑膜炎、粉刺、黄水疮、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不全、聚硅氧相关结缔组织病、史年登-威金森病、强直性脊椎炎(spondilitis ankylosans)、多形糜烂性红斑(SJS)、全身炎性反应综合征、颞动脉炎、弓形体性视网膜炎、中毒性表皮坏死溶解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体、1型过敏反应、II型糖尿病、荨麻疹、常见间质性肺炎(UIP)、血管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、柳一原田综合征(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH综合征)、湿性黄斑变性和伤口愈合。
在另一个方面中，本发明的结合蛋白适用于治疗选自下列的病症：急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、脑干神经胶质瘤、大脑星形细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、视觉传导途径和下视丘神经胶质瘤、乳癌、支气管腺瘤/类癌、类癌肿瘤、类癌肿瘤、未知根源的胃肠癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、子宫颈癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性脊髓增生病症、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文(Ewing)肿瘤家族、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑素瘤成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠期滋养层瘤、神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、大脑星形细胞瘤神经胶质瘤、儿童期视觉传导途径和下视丘神经胶质瘤、毛细胞白血病、头部和颈部癌、肝细胞(肝脏)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、小岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西(Kaposi)肉瘤、肾脏(肾脏细胞)癌、喉癌、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、沃德斯姆巨球蛋白血病(Macroglobulinemia)、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、眼内(眼)黑素瘤、墨克(Merkel)细胞癌、恶性间皮瘤、具有隐蔽根源的转移性鳞状颈部癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、脊髓发育不良综合征、脊髓发育不良/骨髓和外骨髓增生疾病、粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、脊髓增生病症、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌(Oral Cancer)、口腔癌(Oral Cavity Cancer)、唇和口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、小岛细胞胰腺癌、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾脏细胞(肾脏)癌、肾盂癌和输尿管癌、移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、唾液腺癌、肉瘤、尤文肿瘤家族、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、赛谢(Sézary)综合征、皮肤癌(非黑素瘤)、皮肤癌(黑素瘤)、墨克细胞皮肤癌、小肠癌、鳞状细胞癌、具有隐蔽根源的转移性鳞状颈部癌、胃癌、幕上原始神经外胚层瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、妊娠期滋养层瘤、输尿管和肾盂癌、移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌、视觉传导途径和下视丘神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血病、胚胎性癌肉瘤。
在另一个方面中，本发明提供了治疗患有其中人类IL-13有害的病症的患者的方法，所述方法包括在施用如以上所讨论的第二药剂之前、同时或在其后施用上文所公开的任一结合蛋白的步骤。在一个优选的实施方案中，可与一种或多种IL-13拮抗剂(例如抗IL-13抗体或其片段)共施用和/或共配制的其它治疗剂包括但不限于以下的一或多者：经吸入甾类药物；口服甾类药物；β-激动剂，例如短效或长效β-激动剂；白三烯或白三烯受体拮抗剂；例如ADVAIR的组合药物；IgE抑制剂，例如抗IgE抗体(例如XOLAIR)；磷酸二酯酶抑制剂(例如PDE4抑制剂)；黄嘌呤；抗胆碱剂药物；肥大细胞稳定剂，例如色甘酸；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜酸性粒细胞趋化因子/CCR3抑制剂；组胺或其包括H1、H2、H3和H4的受体的拮抗剂；和前列腺素D或其受体(DP1和CRTH2)的拮抗剂。这样的组合可用于治疗哮喘和其它呼吸病症。可与一种或多种抗IL-13抗体或其片段共同给药和/或共配制的治疗剂的其它实施例尤其包括以下的一或多者：TNF拮抗剂(例如TNF受体的可溶性片段，TNF受体例如p55或p75人类TNF受体或其衍生物，例如75kD TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL))；TNF酶拮抗剂，例如TNF转化酶(TACE)抑制剂；蕈毒碱受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；泼氟尼东(perfenidone)；化学治疗剂，例如甲氨蝶呤、来氟米特(leflunomide)或西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))或其类似物，例如CCI-779；COX2和cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；p38抑制剂、TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂。另一第二药剂是选自以下各物：布替耐德(budenoside)；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素(cyclosporin)；柳氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪氧合酶抑制剂；马色拉嗪(mesalamine)；奥色拉嗪(olsalazine)；巴柳氮；抗氧化剂；血栓形成抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1β单克隆抗体；抗1L-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、1L-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或激动剂；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体；甲氨蝶呤；环孢菌素；FK506；雷帕霉素(rapamycin)；霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)；来氟米特(leflunomide)；NSAID；布洛芬(ibuprofen)；皮质类固醇；泼尼龙(prednisolone)；磷酸二酯酶抑制剂；腺苷激动剂；抗血栓形成剂；补体抑制剂；肾上腺素能剂；IRAK；NIK；IKK；p38；MAP激酶抑制剂；IL-1β转化酶抑制剂；TNFα转化酶抑制剂；T-细胞信号传导受体；金属蛋白酶抑制剂；柳氮磺胺吡啶；硫唑嘌呤；6-巯基嘌呤；血管紧张素转化酶抑制剂；可溶性细胞因子受体；可溶性p55TNF受体；可溶性p75TNF受体；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；消炎细胞因子；IL-4；IL-10；IL-11和TGFβ。
在一个优选的实施方案中，通过至少一种选自下列的方式将上文公开的药物组合物施用个体：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心囊内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸骨正中内、子宫内、膀胱内、快速浓注、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内和经皮。
本发明的一个方面提供了本发明的至少一种IL-13结合蛋白的至少一种IL-13独特型抗体。所述独特型抗体包括含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分或其可掺入本发明的结合蛋白的任何部分的分子的任何蛋白或肽，所述至少一部分是例如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变域、重链或轻链恒定区、框架区域。
具体实施方式
本发明涉及结合IL-13的人类IL-13结合蛋白，尤其是抗IL-13抗体或其抗原结合部分。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段和其药物组合物以及用于制备这样的抗体和片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明也包括使用本发明抗体在体外或体内检测人类IL-13、抑制人类IL-13活性和调节基因表达的使用方法。
除非另外指出，否则本文中有关本发明使用的科学和技术术语将具有本领域技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范围应为清晰的，然而若存在任何潜在歧义，本文中提供的定义优先于任何词典或外在定义。另外，除非上下文另作要求，否则单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。在本申请中，除非另作说明，否则“或”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括”以及例如“包括”和“包括的”的其它形式的使用无限制。除非上下文另作说明，否则例如“元件”或“成分”的术语也包括包含一个单位的元件和成分与包含一个以上亚单位的元件和成分。
通常有关本文中描述的细胞和组织培养物、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术为本领域中熟知且通常使用。通常，除非另有说明，否则根据在本领域中熟知且如本说明书引用且详尽探讨的各种一般和更特定参考文献中所述的习知方法进行本发明的方法和技术。如本领域中通常完成或如本文中所描述，根据制备商的说明书进行酶促反应和纯化技术。有关本文中描述的分析化学、合成有机化学和药物和药物化学使用的命名法和其实验方法和技术为本领域中熟知且通常使用。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送和患者的治疗。
本发明可更易于理解，选择术语定义如下。
如本文中所用术语“多肽”是指任何氨基酸的聚合链。术语“肽”和“蛋白”与术语多肽可交换地使用且也是指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然或人造蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可为单体或聚合多肽。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”为由于其衍生起点或来源与伴随其天然状态的天然有关组分不相关的蛋白或多肽；其基本上不含来自相同物种的其它蛋白；通过不同物种的细胞表达；或在自然界中并不存在。因此，化学上合成或于不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将自其天然有关组分分离。也可使用在本领域中熟知的蛋白纯化技术通过分离使得蛋白基本上不含天然有关组分。
如本文中所用术语″回收″是指通过分离，例如使用在本领域中熟知的蛋白纯化技术使得例如多肽的化学物种基本上不含天然有关组分的过程。
如本文中所用术语“人类IL-13”和“人类IL-13野生型”(本文中缩写为h IL-13、h IL-13wt)包括主要由T辅助2细胞分泌的人类细胞因子。该术语包括13kDa多肽的单体蛋白。人类IL-13的结构进一步描述于例如(Moy，Diblasio等人，2001J Mol Biol 310 219-30)中。术语人类IL-13意欲包括重组人类IL-13(rh IL-13)，其可通过标准重组表达方法制备。表1显示人类IL-13、SEQ ID No.1的氨基酸序列，其在本领域中是已知的。
表1：人类IL-13的序列
如本文中所用术语“人类IL-13变体”(本文中缩写为h IL-13v)包括人类IL-13的变体，其中氨基酸残基130由精氨酸变化为谷氨酰胺(R130Q)。
如本文中所用“生物学活性”是指细胞因子的所有固有生物学特性。IL-13的生物学特性包括但不限于结合IL-13受体(其它实例包括转变成人类B细胞中的IgE的免疫球蛋白同种型和抑制炎性细胞因子产生)。
如本文中关于抗体、蛋白或肽与第二化学物种相互作用所用术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指相互作用依赖于这样的化学物种上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如通常抗体识别且与特异蛋白结构而非蛋白结合。如果抗体对于表位“A”而言具有特异性，则含有标记的“A”和抗体的反应中含有表位A(或游离未标记的A)的分子的存在将降低与抗体结合的标记的A的量。
如本文中所用术语“抗体”广泛是指任何免疫球蛋白(Ig)分子，其包含4个多肽链，2个重链(H)和2个轻链(L)或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物，其保留Ig分子的基本表位结合特征。这样的突变体、变体或衍生物抗体形式在本领域中是已知的。其非限制性实施方案于下文中探讨。
在全长抗体中，各重链由重链可变域(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个域CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链可变域(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个域CL组成。VH和VL区域可进一步再分成高度可变的称为互补决定区(CDR)、散布在更保守、称为框架区域(FR)的区域中的区域。各VH和VL包括3个CDR和4个FR，按以下顺序自胺基末端排列至羧基末端：FR 1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文中所用术语抗体的“抗原结合部分”(或简称的“抗体部分”)是指抗体的保留特异结合抗原(例如hIL-13)的能力的一个或多个片段。已显示可由全长抗体的片段进行抗体的抗原结合功能。这样的抗体实施方案也可为双特异性、双重特异性或多特异性形式；与两个或两个以上不同抗原特异性地结合。抗体的术语“抗原结合部分”中包括的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH 1域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含2个在铰链区由双硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH 1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546；Winter等人，PCT公开WO 90/05144AI，以引用的方式并入本文中)，其包含单一可变域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个域VL和VH经独立基因编码，其可使用重组方法经使得其能够制成VL且VH区域配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)的合成接头连接。这样的单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原-结合部分”中。也包括单链抗体的其它形式，例如双功能抗体。双功能抗体为二价、双特异性抗体，其中VH和VL域表达于单一多肽链上，但使用过短而不允许在相同域的2个域之间配对的接头，由此迫使这样的域与另一链的互补域配对且产生2个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等人(1994)Structure 2：1121-1123)。这样的抗体结合部分在本领域中是已知的(kontermann和Dubel编，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.第790页(ISBN 3-540-41354-5)。
如本文中所用术语“抗体构建体”是指包含一个或多个与接头多肽或免疫球蛋白恒定域连接的本发明的抗原结合部分的多肽。接头多肽包含两个或两个以上由肽键连接的氨基酸残基且其用以连接一个或多个抗原结合部分。这样的接头多肽为在本领域中所熟知的(参见例如Holliger，P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等人(1994)Structure 2：1121-1123)。免疫球蛋白恒定域是指重链或轻链恒定域。人类IgG重链和轻链恒定域氨基酸序列是在本领域中所已知的且表示于表2中。
表2：人类IgG重链恒定域和轻链恒定域的序列
另外，抗体或其抗原结合部分可为较大免疫粘附分子的一部分，其通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白或肽共价或非共价缔合形成。这样的免疫粘附分子的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区域以制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6：93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标记以制备二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。可分别使用例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化全抗体的常规技术，自全抗体制备例如Fab和F(ab′)2片段的抗体部分。此外，可使用如本文中描述的标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。
如本文中所用“分离的抗体”意欲指基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如特异性结合hIL-13的分离的抗体基本上不含特异性结合除hIL-13以外的抗原的抗体)。然而特异性结合hIL-13的分离的抗体可对其他抗原(例如其它物种的IL-13分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。
如本文中所用术语“人类抗体‘意欲包括具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可在(例如)CDR和尤其CDR3中包括不由人类种系免疫球蛋白序列(例如由随机或位点特异性体外诱变或由体内体细胞突变引入的突变)编码的氨基酸残基。然而，如本文中所用术语”人类抗体“不意欲包括源自例如小鼠的另一哺乳动物物种的种系的CDR序列已移植于人类框架序列上的抗体。
如本文中所用术语“重组人类抗体“意欲包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人类抗体，例如使用转染于宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(进一步描述于下文的第二部分C中)，自重组、组合人类抗体库分离的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15：62-70；Azzazy H.，和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.，和Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.和Chames P.(2000)Immunology Today 21：371-378)、自对于人免疫球蛋白基因而言转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor，L.D.等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A和Green L.L.(2002)Current Opinion inBiotechnology 13：593-597；Little M.等人(2000)Immunology Today 21：364-370)或通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人类抗体具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而在某些实施方案中这样的重组人类抗体经受体外诱变(或当使用对于人类Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列为尽管源自且与人类种系VH和VL序列有关，但不可体内天然地存在于人类抗体种系谱(repertoire)的序列。一个实施方案提供能够结合人类IL-13的完全人类抗体，其可使用在本领域中熟知的技术使用例如但不限于人类Ig噬菌体库(例如公开于Jermutus等人，PCT公开第WO 2005/007699 A2号中的那些)产生。
术语“嵌合抗体“是指包含来自一种物种的重链和轻链可变域序列和来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人类恒定区连接的鼠类重链和轻链可变域的抗体。
术语“CDR移植抗体”是指包含来自一种物种的重链和轻链可变域序列，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区域的序列经另一物种的CDR序列替换的抗体，例如具有鼠类重链和轻链可变域的抗体，可变域中一个或多个鼠类CDR(例如CDR3)已经用人类CDR序列替换。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人类物种(例如小鼠)的重链和轻链可变域序列，但其中VH和/或VL序列的至少一部分已变更为更″类似于人类″，也即与人类种系可变序列更相似的抗体。一种类型的人源化抗体为CDR移植抗体，其中人类CDR序列经引入非人类VH和VL序列中以替换对应的非人类CDR序列。在一个实施方案中，提供人源化抗人类IL-13抗体和抗原结合部分。通过使用传统杂交瘤技术获得鼠类抗hIL-13单克隆抗体，接着使用体外遗传工程人源化来产生这样的抗体，例如那些公开于Kasaian等人PCT公开第WO 2005/123126A2号中的。
本文中术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”可交换地使用。这样的在本领域中识别的术语是指将比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变域中的其它氨基酸残基更可变(也即高度可变)的氨基酸残基编号的系统(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad，Sci.190：382-391和Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，美国卫生和人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242)。对于重链可变域，对于CDR1高变区在氨基酸位置31至35范围内，对于CDR2在氨基酸位置50至65范围内且对于CDR3在氨基酸位置95至102范围内。对于轻链可变域，对于CDR1高变区在氨基酸位置24至34范围内，对于CDR2在氨基酸位置50至56范围内且对于CDR3在氨基酸位置89至97范围内。
如本文中所用，术语“接纳体”和“接纳体抗体”是指提供或编码至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的一个或多个框架区域的氨基酸序列的抗体或核酸序列。在某些实施方案中，术语“接纳体”是指提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另一个实施方案中，术语“接纳体”是指提供或编码一个或多个框架区域和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在一特异性实施方案中，术语“接纳体”是指提供或编码至少80％、优选的至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的一个或多个框架区域的氨基酸序列的人类抗体氨基酸或核酸序列。根据此实施方案，接纳体可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5或至少10个在人类抗体的一个或多个特殊位置不出现的氨基酸残基。接纳体框架区域和/或接纳体恒定区可(例如)衍生自或由种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体(例如在本领域中熟知的抗体、发展中的抗体或市售抗体)获得。
如本文中所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在各重链和轻链可变区中存在3个CDR，对于各可变域其经命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文中所用术语“CDR组”是指单一可变域中存在的能够结合抗原的3个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同系统不同定义。Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(国家卫生研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统不仅提供可适用于抗体的任何可变域的明确残基编号系统，而也提供界定3个CDR的明确残基边界。这些CDR可称为Kabat CDR。Chothia和合作者(Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现Kabat CDR中的某些亚部分几乎采用相同肽骨架构象，尽管其氨基酸序列的水平具有极大多样性。这些亚部分经命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指示轻链和重链区域。这些区域可称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。其它界定CDR、与Kabat CDR重叠的边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。其它CDR边界定义可能不严格遵循上文系统中的一个，但仍然与Kabat CDR重叠，尽管根据预测或实验结果：特定残基或残基的组或甚至全部CDR并未显著地影响抗原结合，其可经缩短或延长。本文中使用的方法可利用根据任何这样的系统定义的CDR，尽管优选的实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。
如本文中所用，术语“规范”残基是指如Chothia等人(J.Mol.Biol.196：901-907(1987)；Chothia等人，J.Mol.Biol.227：799(1992)，两者均以引用的方式并入本文中)所定义，定义特定规范CDR结构的CDR或框架中的残基。根据Chothia等人，尽管氨基酸序列的水平的极大多样性，许多抗体的CDR的关键部分具有几乎相同肽骨架构象。各规范结构主要规定形成环的氨基酸残基的邻近片段的一组肽骨架扭转角。
如本文中所用，术语“供体”和“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，供体抗体为来自物种的抗体，其不同于获得或衍生框架区域的抗体。在人源化抗体的情况中，术语“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的非人类抗体。
如本文中所用，术语“框架”或“框架序列”是指可变域减去CDR的剩余序列。由于可通过不同系统测定CDR序列的确切定义，框架序列的含义经历相对地不同解译。6个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3和重链的CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3)也将轻链和重链上的框架区域分为各链上四个亚区域(FRl、FR2、FR3和FR4)，其中CDRl位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，且CDR3位于FR3与FR4之间。如通过其他所提及，将特定亚区域指定为FRl、FR2、FR3或FR4框架区域表示单一、天然产生的免疫球蛋白链的可变域内的组合FR。如本文中所用，FR表示四个亚区域中的一个，且FR表示构成框架区域的四个亚区域中的2个或2个以上。
人类重链和轻链接纳体序列在本领域中是已知的。在本发明的一个实施方案中，人类重链和轻链接纳体序列是选自表3和表4中描述的序列。
表3：重链接纳体序列
表4：轻链接纳体序列
如本文中所用，术语“种系抗体基因”或“基因片段”是指由非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞并未经历导致遗传重排和突变以表达特定免疫球蛋白的成熟过程。(参见例如Shapiro等人，Crit.Rev.Immunol.22(3)：183-200(2002)；Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol.484：13-30(2001))。本发明的各种实施方案提供的一优点源自以下认识：种系抗体基因在物种中比成熟抗体基因更可能保守个体的必要氨基酸序列结构特征，因此当在此物种中治疗使用时不太可能自外来源识别出。
如本文中所用，术语“关键”残基是指可变区内的对抗体、尤其人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更多影响的某些残基。关键残基包括但不限于以下的一或多者：邻近于CDR、可能的糖基化位点(可为N或O糖基化位点)的残基；稀有残基；能够与抗原相互作用的残基；能够与CDR相互作用的残基；规范残基；重链可变域与轻链可变域之间的接触残基；Vernier区中的残基；和重叠于Chothia定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重链框架之间的区域中的残基。
如本文中所用，术语“人源化抗体”为抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与所关注的抗原免疫特异结合，且其包含基本上具有人类抗体的氨基酸序列的框架(FR)区域和基本上具有非人类抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文中所用，在CDR的情况下术语“基本上”是指CDR具有与非人类抗体CDR的氨基酸序列至少80％、优选的至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。人源化抗体包含至少1个且通常2个可变域(Fab、Fab′、F(ab′)2、FabC、Fv)中的全部，其中所有或基本上所有CDR区域对应于非人免疫球蛋白(也即供体抗体)的那些CDR区域，且所有或基本上所有框架区域为人免疫球蛋白共有序列的框架区域。人源化抗体优选的也至少包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常人免疫球蛋白的一部分。在某些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变域。抗体也可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区域。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定实施方案中，人源化抗体仅含有轻链和/或人源化重链的人源化可变域。
所述人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括(而不限于)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。所述人源化抗体可包含一种以上类别或同种型的序列且特定恒定域可经选择以使用在本领域中所熟知的技术优化所需效应子功能。
人源化抗体的框架且CDR区域不必精确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR或共有框架可经取代、插入和/或删除至少一个氨基酸残基而诱变以便该位点的CDR或框架残基并不对应于供体抗体或共有框架。然而在一个优选的实施方案中，这样的突变不会为大范围突变。通常，至少80％、优选的至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些残基。如本文中所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区域。如本文中所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列的家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany1987))。在免疫球蛋白的家族中，共有序列的各位置由在所述家族中最频繁出现在该位置的氨基酸占据。若2个氨基酸以相同频率出现，则任一个可包括于共有序列中。
如本文中所用，“Vernier”区是指如由Foote和Winter 1992，J.Mol.Biol.224：487-499，其以引用的方式并入本文中)所描述可调节CDR结构且Vernier以配合抗原的框架残基的子组。Vernier区残基形成位于CDR下的层且可影响CDR的结构和抗体的亲和力。
术语“多价结合蛋白”用于此说明书以表示包含2个或2个以上抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白优选的经工程化以具有3个或3个以上抗原结合位点，且通常不为天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合2个或2个以上相关或不相关标靶的结合蛋白。如本文中所用双可变域(DVD)结合蛋白为包含2个或2个以上抗原结合位点的结合蛋白且其为四价或多价结合蛋白。这样的DVD可具有单特异性，也即能够结合一个抗原或具有多特异性，也即能够结合2个或2个以上抗原。包含2个重链DVD多肽和2个轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD Ig。DVD Ig的每一半包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽和2个抗原结合位点。各结合位点包含重链可变域和轻链可变域，每个抗原结合位点具有6个与抗原结合有关的CDR。
如本文中所用，术语“中和”是指当结合蛋白特异性结合细胞因子时，细胞因子生物学活性的中和。中和结合蛋白优选为中和抗体，其与hIL-13和/或hIL-13的结合使得hIL-13和/或hIL-13的生物学活性受到抑制。中和结合蛋白优选的结合hIL-13和/或hIL-13且将IL-13和/或hIL-13的生物学活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％或以上。可通过测定在本领域中所熟知的hIL-13和/或hIL-13生物学活性的一种或多种指示剂来评估hIL-13和/或hIL-13的生物学活性受中和结合蛋白的抑制。例如，A-549细胞的人类IL-13诱导性TARC(CCL-17)产生的抑制(参见实施例1.1.C)。
术语“活性”包括例如抗体对抗原的结合特异性/亲和力的活性，例如结合IL-13抗原和/或中和抗体效能的抗hIL-13抗体，例如与hIL-13的结合抑制hIL-13的生物学活性的抗hIL-13抗体，例如抑制TARC(CCL-17)由A-549细胞经人类IL-13诱导产生(参见实施例1.1.C)。
术语“表位”包括任何能够特异性地结合免疫球蛋白或T细胞受体的多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括化学活性表面的分子群，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方案中可具有特异性三维结构特性和/或比电荷特性。表位为由抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体优选的识别其于蛋白和/或大分子的复杂混合物中的标靶抗原时，据称其特异性地结合抗原。
如本文中所用术语“表面等离子体共振”是指通过例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden andPiscataway，NJ)检测生物传感器基质中蛋白浓度变化而允许实时分析生物特异性相互作用的光学现象。对于进一步描述，参见U.，等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；U.，等人(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，等人(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
如本文中所用术语“kon”意欲指如在本领域中是已知的抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合体的结合速率常数。
如本文中所用术语“koff”意欲指如在本领域中是已知的抗体自抗体/抗原复合体解离的分解速率常数。
如本文中所用术语“KD”意欲指如在本领域中是已知的特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
如本文中所用术语“标记的结合蛋白”是指具有经并入提供结合蛋白的鉴定的标记的蛋白。所述标记优选为可检测标记，例如并入放射性标记的氨基酸或附接至多肽的生物素基部分，其可通过标记的抗生物素蛋白检测(例如含有荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白，其可通过光学或比色法检测)。多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm)；荧光标记(例如FITC、罗丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶促标记(例如辣根过氧化物酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学荧光标记；生物素基基团；由第二报导子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链配对序列、第二抗体的结合位点、金属结合域、表位标记)；和磁性试剂，例如钆螯合物。
术语“抗体缀合物”是指结合蛋白，例如抗体，其在化学上与例如治疗或细胞毒性剂的第二化学部分连接。本文中使用术语“药剂”以表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的萃取物。治疗或细胞毒性剂优选的包括但不限于百日咳毒素、紫杉酚、细胞分裂抑素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺红菌素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和其类似物或同系物。
如本文中所用术语“晶体”和“结晶”是指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体为一种形式的固态物质，其不同于例如非晶形固态或液晶态的其它形式。晶体包括规则、重复、三维原子、离子、分子数组(例如蛋白，例如抗体)，或分子装配物(例如抗原/抗体复合体)。这些三维数组根据所述领域中充分理解的特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或建构块称作不对称单元。排列中符合给定、充分定义的晶体学对称性的不对称单元的重复提供晶体的“晶胞”。晶胞通过规则平移在所有三维空间中的重复提供晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A.Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，aPractical Approach，第二版，第20 1-16页，Oxford University Press，New York，New York，(1999)。
如本文所提及术语“多核苷酸”是指2或2个以上核苷酸的聚合形式、或核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。所述术语包括单链和双链形式的DNA，但优选双链DNA。
如本文中所用术语“分离的多核苷酸”将是指(例如染色体组、cDNA或合成起源或其某些组合的)多核苷酸，由于其起源，所述“分离的多核苷酸”：与自然界中所发现的“分离的多核苷酸”所具有的所有或部分多核苷酸不相关；与在自然界中无联系的多核苷酸可操纵地连接；或在自然界中作为较大序列的一部分并不存在。
如本文中所用术语“载体”意欲指能够运输其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其是指其它DNA片段可连接的环状双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中其它DNA片段可连接于病毒基因组中。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)自主复制。在引入宿主细胞后其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可并入宿主细胞的基因组中且由此连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够直接表达其可操纵地连接的基因。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称的“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常以质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可交换地使用，由于质粒为载体的最通常使用形式。然而，本发明意欲包括这样的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)，其提供等效功能。
术语“可操纵地连接”是指所描述元件成允许其以预定方式起作用的关系的并置。与编码序列“可操纵地连接”的控制序列经连接使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操纵地连接”的序列包括与所关注的基因邻接的表达控制序列与以反式或在一定距离作用以控制所关注的基因的表达控制序列。如本文中所用术语″表达控制序列″是指为实现其所连接的编码序列的表达和处理所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强转译效率(也即Kozak共有序列)的序列；增强蛋白稳定性的序列；和如果需要，增强蛋白分泌的序列。这样的控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常这样的控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲包括对于表达和加工而言必需存在的元件，且也可包括其它存在具有有利性的元件，例如前导序列和融合搭配序列。可使用在本领域中是已知的包括表达盒、载体、重组宿主细胞的表达载体和宿主细胞和用于重组表达的方法和自单一开放阅读框的重组聚合蛋白和预蛋白的蛋白水解过程(例如WO 2007/014162，其以引用的方式并入本文中)来表达且纯化本发明的蛋白构建体。
如本文中所定义的“转化”是指外源性DNA进入宿主细胞的任何过程。转化可在自然或人工条件下使用在本领域中所熟知的各种方法进行。转化可依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。基于经转化的宿主细胞选择方法且其可包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。这样的“转染的”细胞包括稳定转染的细胞，其中所插入DNA能够复制为自主复制质粒或宿主染色体的一部分。其也包括在有限时段瞬时表达所插入DNA或RNA的细胞。
如本文中所用术语“重组宿主细胞”(或简称的“宿主细胞”)意欲指外源性DNA已引入的细胞。应理解这样的术语不仅意欲指特定个体细胞，而也指所述细胞的子代。由于某些修饰因突变或环境影响可能存在于后继代中，因此所述子代实际上不可能与母细胞相同，但仍包括于如本文中所用的术语‘宿主细胞“范围内。宿主细胞优选的包括选自任一生命领域的原核和真核细胞。真核细胞优选的包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。宿主细胞最优选包括但不限于原核细胞系大肠杆菌(E.Coli)；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养物和转化(例如电穿孔、脂质转染)。可根据制备商的说明书或如本领域中通常完成或如本文中所描述，进行酶促反应和纯化技术。通常上述技术和程序可根据在本领域中熟知的习知方法且如各种一般和更特定参考文献(其在整个本说明书引用和探讨)中所述般进行。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y，(1989))，其出于任何目的以引用的方式并入本文中。
如在本领域中是已知的且如本文中所用“转基因生物“是指具有含有转基因的细胞的生物，其中所述引入生物(或生物的始祖)中的转基因表达不天然表达于所述生物中的多肽。”转基因“为DNA构建体，其稳定地且可操纵地整合入发展转基因生物的细胞的基因组中，引导所编码基因产物在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中的表达。
术语“调节”与“调控”可交换地使用，且如本文中所用是指所关注的分子(例如hIL-13的生物学活性)的活性变化或变更。调节可增加或降低所关注分子的某一活性或功能的大小。分子的例示性活性和功能包括但不限于结合特征、酶活性、细胞受体活化和信号转导。
相应地，如本文中所用术语“调节剂”为能够改变或变更所关注分子的活性或功能(例如hIL-13的生物学活性)的化合物。例如，与调节剂不存在条件下所观察到的活性或功能大小相比，调节剂可导致分子的某一活性或功能的大小增加或降低。在某些实施方案中，调节剂为抑制剂，其降低分子的至少一活性或功能的大小。例示性抑制剂包括但不限于蛋白、肽、抗体、肽体、糖类或小有机分子。肽体描述于例如WO 01/83525中。
如本文中所用术语“激动剂”是指当与所关注的分子接触时，与激动剂不存在情况下所观察到的活性或功能大小相比，导致分子的某一活性或功能的大小增加的调节剂。所关注的特定激动剂可能包括但不限于IL-13多肽或多肽、核酸、糖类或与hIL-13结合的任何其它分子。
如本文中所用术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指当与所关注的分子接触时，与拮抗剂不存在情况下所观察到的活性或功能大小相比，导致分子的某一活性或功能的大小降低的调节剂。所关注的特定拮抗剂包括阻断或调节hIL-13和/或hIL-13的生物或免疫活性的那些。hIL-13和/或hIL-13的拮抗剂和抑制剂可包括但不限于蛋白、核酸、糖类或与hIL-13和/或hIL-13结合的任何其它分子。
术语“抑制与受体结合”是指结合蛋白阻止IL-13与其一个或多个受体结合的能力。所述与受体结合的抑制将使得IL-13与其受体结合所介导的生物学活性减少或消除。
如本文中所用，术语“有效量”是指足以降低或改善病症或其一种或多种症状的严重程度和/或持续时间，预防病症进行，使得病症消退，预防一种或多种与病症相关的症状反复、发展、发作或进行，检测病症或增强或改善另一治疗剂(例如预防或治疗剂)的预防或治疗作用的治疗剂的量。
如本文中所用术语“样品”以其最广泛意义使用。如本文中所用“生物样品”包括但不限于任意量的来自自存活物或先前存活物的物质。这样的存活物包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其它动物。这样的物质包括但不限于血液、血清、尿、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾脏。
I.结合人类IL-13的抗体
本发明的一个方面提供了分离的鼠类单克隆抗体或其抗原结合部分，其以高亲和力、缓慢分解速率和高中和能力与IL-13结合。本发明的第二方面提供了结合IL-13的嵌合抗体。本发明的第三方面提供了结合IL-13的人源化抗体或其抗原结合部分。所述抗体或其部分优选为分离的抗体。本发明的抗体优选中和人类抗IL-13和/或人类抗IL-13抗体。
A.抗IL-13抗体的制备方法
本发明的抗体可通过在本领域中是已知的大量技术中的任一种制备。
1.使用杂交瘤技术的抗IL-13单克隆抗体
可使用在本领域中是已知的广泛各种技术制备单克隆抗体，这样的技术包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体呈现技术或其组合。例如，可使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述技术包括那些在本领域中是已知的且教导于例如于Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版1988)；Hammerling，等人，于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中(所述参考文献以引用的方式全部并入)中的。如本文中所用术语“单克隆抗体”不限于经由杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自包括任何真核、原核或噬菌体株的单一克隆抗体，且非其产生的方法的抗体。
用于使用杂交瘤技术产生且筛选特异性抗体的方法为常规且在本领域中熟知。在一个实施方案中，本发明提供产生单克隆抗体的方法以及通过包括培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞的方法产生的抗体，其中杂交瘤优选通过以下步骤产生：使从用本发明的抗原免疫的小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，且随后筛选由融合产生的杂交瘤以筛选分泌能够结合本发明的多肽的抗体的杂交瘤克隆(参见实施例1.2)。简言之，小鼠可用IL-13抗原免疫。在一个优选的实施方案中，将IL-13抗原与辅助剂一起施用以刺激免疫反应。这样的辅助剂包括完整或弗氏不完全辅助剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合体)。这样的辅助剂可通过使多肽局部沉积而保护其免于快速分散，或其可含有刺激宿主分泌对于巨噬细胞和免疫系统的其它组分而言具有趋化性的因素的物质。优选地，如果多肽正施用，则免疫计划将包括2或2次以上施用多肽，经数星期展开。
以IL-13抗原使动物免疫之后，可由动物获得抗体和/或抗体产生细胞。通过放血或处死动物由动物获得含有抗IL-13抗体的血清。当自动物获得时，可使用血清，可由血清获得免疫球蛋白部分，或可从血清纯化抗IL-13抗体。以此方式获得的血清或免疫球蛋白为多克隆的，因此具有异质组的特性。
检测免疫反应后，例如检测小鼠血清中对抗原IL-13特异性的抗体，收集小鼠脾脏且分离脾细胞。随后，通过熟知技术使脾细胞与任何适当骨髓瘤细胞，例如由ATCC获得的细胞系SP20的细胞融合。选择杂交瘤且通过限制稀释进行克隆。随后通过对于分泌能够结合IL-13的抗体的细胞而言，在本领域中是已知的方法测定杂交瘤克隆。可通过以阳性杂交瘤克隆使小鼠免疫来产生通常含有高含量的抗体的腹水液体。
在另一个实施方案中，可自免疫动物制备抗体产生永生杂交瘤。免疫后，处死动物且如在本领域中所熟知般使脾脏B细胞与永生骨髓瘤细胞融合。参见例如前述Harlow且Lane。在一个优选的实施方案中，骨髓瘤细胞并不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。融合和抗生素选择后，使用IL-13或其部分或表达IL-13的细胞筛选杂交瘤。在一个优选的实施方案中，使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)，优选ELISA进行初始筛选。ELISA筛选的实例提供于WO 00/37504中，其以引用的方式并入本文中。
如下文所进一步探讨，选择、克隆抗IL-13抗体产生杂交瘤且进一步筛选其合意特性，包括稳固杂交瘤生长、高抗体产生和合意抗体特性。杂交瘤可于同基因型动物中、于缺乏免疫系统的例如裸鼠动物中体内培养且扩增或于细胞培养物中体外培养且扩增。选择、克隆且扩增杂交瘤的方法为本领域技术人员所熟知。
在一个优选的实施方案中，杂交瘤为如上所述的小鼠杂交瘤。在另一个优选的实施方案中，于例如大鼠、羊、猪、山羊、牛或马的非人类、非小鼠物种中产生杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤为人类杂交瘤，其中人类非分泌骨髓瘤与表达抗IL-13抗体的人类细胞融合。
可通过已知技术产生识别特异性表位的抗体片段。例如，本发明的Fab和F(ab′)2片段可使用例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)的酶通过免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解产生。F(ab′)2片段含有可变域、轻链恒定区和重链的CHI域。
2.使用SLAM的抗IL-13单克隆抗体
在本发明的另一个方面中，如美国专利第5,627,052号、PCT公开WO 92/02551和Babcock，J.S.等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：7843-7848中所述，自单一、分离的淋巴细胞使用在本领域中称作选择的淋巴细胞抗体方法(SLAM)的程序产生重组抗体。在此方法中，使用抗原特异性溶血斑块测定筛选分泌所关注的抗体的单一细胞，例如源自第一部分所描述的任一免疫动物的淋巴细胞，其中使用例如生物素的接头将所述抗原IL-13、IL-13的子单元或其片段与绵羊红细胞偶联且其用以鉴定分泌对于IL-13具有特异性的抗体的单一细胞。鉴定所关注的抗体分泌细胞后，通过反转录酶PCR自细胞救援重链和轻链可变域cDNA，且这些可变域可随后表达于例如COS或CHO细胞的哺乳动物宿主细胞的适当免疫球蛋白恒定区(例如人类恒定区)环境中。可随后通过(例如)淘洗转染的细胞以分离表达IL-13的抗体的细胞，来进一步体外分析且选择源自体内选择的淋巴细胞、经扩增的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞。扩增的免疫球蛋白序列可进一步通过例如那些描述于PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中的例如体外亲和力成熟方法体外操作。
3.使用转基因动物的抗IL-13单克隆抗体
在本发明的另一个实施方案中，通过用IL-13抗原使包含某些或所有人免疫球蛋白基因座的非人类动物免疫产生抗体。在一个优选的实施方案中，所述非人类动物为XENOMOUSE转基因小鼠，包含较大人免疫球蛋白基因座片段且小鼠抗体产生不足的工程化小鼠品系。参见例如Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994)和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。也参见1991年7月25日公开的WO 91/10741、1994年2月3日公开的WO 94/02602、1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO 96/33735、1998年4月23日公开的WO 98/16654、1998年6月11日公开的WO 98/24893、1998年11月12日公开的WO 98/50433、1999年9月10日公开的WO 99/45031、1999年10月21日公开的WO99/53049、2000年2月24日公开的WO 00/09560和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠产生类似成人的全部人类抗体人类谱且产生抗原特异性人类Mab。XENOMOUSE转基因小鼠经由引入人类重链基因座和x轻链基因座的大分子量、种系构型YAC片段含有约80％的人类抗体谱。参见Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)；Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，据此将其公开内容以引用的方式并入。
4.使用重组抗体库的抗IL-13单克隆抗体
体外方法也可用于制备本发明的抗体，其中抗体库经筛选以鉴定具有所需结合特异性的抗体。所述筛选重组抗体库的方法为在本领域中所熟知且包括描述于以下各专利和参考文献中的方法：例如Ladner等人美国专利第5,223,409号；Kang等人PCT公开第WO 92/18619号；Dower等人PCT公开第WO 91/17271号；Winter等人PCT公开第WO92/20791号；Markland等人PCT公开第WO 92/15679号；Breitling等人PCT公开第WO 93/01288号；McCafferty等人PCT公开第WO92/01047号；Garrard等人PCT公开第WO 92/09690号；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人(1992)Hum Antibod Hybridomas3：81-85；Huse等人(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人(1993)EMBO J12：725-734；Hawkins等人(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Gram等人(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等人(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)NucAcid Res 19：4133-4137；和Barbas等人(1991)PNAS 88：7978-7982；美国专利申请公开20030186374和PCT公开第WO 97/29131号，将各自的内容以引用的方式并入本文中。
重组抗体库可来自用IL-13或IL-13或IL-13或IL-13的一部分免疫的个体。或者，重组抗体库可来自未实验过的个体，也即并未经IL-13免疫的个体，例如来自并未经人类IL-13免疫的人类个体的人类抗体库。通过以包含人类IL-13的肽筛选重组抗体库以由此选择那些识别IL-13的抗体来选择本发明的抗体。进行所述筛选和选择的方法为在本领域中所熟知，例如描述于前段的参考文献中。为选择本发明的对hIL-13具有特定结合亲和力的抗体，例如那些以特定koff速率常数与人类IL-13解离者，本领域中已知的表面等离子体共振法可用于选择具有所需koff速率常数的抗体。为选择本发明的对hIL-13具有特定中和活性的抗体，例如具有特定IC50的那些，可使用在本领域中是已知的评估hIL-13活性抑制的标准方法。
在一个方面中，本发明涉及结合人类IL-13的分离的抗体或其抗原结合部分。抗体优选是中和抗体。在各种实施方案中，抗体为重组抗体或单克隆抗体。
例如，本发明的抗体也可使用在本领域中是已知的各种噬菌体呈现方法产生。在噬菌体呈现方法中，功能抗体域呈现在噬菌体颗粒的表面上，其携带编码其的多核苷酸序列。详言之，可利用所述噬菌体以呈现从谱或组合抗体文库(例如人类或鼠类)表达的抗原结合域。可使用抗原选择或识别表达结合所关注的抗原的抗原结合域的噬菌体，例如使用标记抗原或结合或捕捉于固体表面或珠粒上的抗原。用于这些方法的噬菌体为典型丝状噬菌体，其包括自具有Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体域的噬菌体表达的fd和M13结合域，所述Fv抗体域重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。可用于制备本发明的抗体的噬菌体呈现方法的实例包括那些公开于以下专利和参考文献者中：Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 187 9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请案第PCT/GB91/01134号；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利第5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743、和5,969,108号；各自以引用的方式全部并入本文中。
如以上参考文献中所述，噬菌体选择后，噬菌体的抗体编码区可经分离且用以产生包括人类抗体或任何其它所需抗原结合片段且表达于任何所需宿主中的全抗体，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下文中所详述。例如，也可使用在本领域中是已知的方法采用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，这样的方法例如公开于PCT公开WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；和Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)和Better等人，Science 240：1041-1043(1988)(这样的参考文献以引用的方式全部并入)中的那些。可用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括描述于美国专利4,946,778和5,258,49；Huston等人，Methodsin Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；和Skerraet等人，Science 240：1038-1040(1988)中的那些。
替代通过噬菌体呈现筛选重组抗体库，可应用在本领域中是已知的用于筛选较大组合库的其它方法论以鉴定本发明的双重特异性抗体。一类型的替代表达系统为如Szostak和Roberts的PCT公开第WO98/31700号和Roberts，R.W.和Szostak，J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302中所述其中重组抗体库表达成RNA-蛋白融合体。在此系统中，mRNA与肽或蛋白之间产生共价融合，其通过体外翻译在3′端具有嘌呤霉素，一种肽基受体抗生素的合成mRNA编码。因此，特异mRNA可基于所编码肽或蛋白(例如抗体或其部分)的特性自mRNA(例如组合库)复杂混合物富集，例如将抗体或其部分结合至双重特异性抗原。可通过如上所述的重组方法表达自筛选这样的库中重新获得的编码抗体或其部分的核酸序列(例如在哺乳动物宿主细胞中)，且此外如上所述其可通过其它轮的mRNA肽融合筛选(其中突变已引入最初选择的序列中)，或通过其它用于重组抗体的体外亲和力成熟法的方经受进一步亲和力成熟。
在另一方法中，本发明抗体也可使用在本领域中是已知的酵母呈现方法产生。在酵母呈现方法中，遗传法用以将抗体域限定至酵母细胞壁，且将其呈现在酵母的表面上。尤其可利用所述酵母呈现从谱或组合抗体文库(例如人类或鼠类)表达的抗原结合域。可用于制备本发明的抗体的酵母呈现方法的实例包括那些公开于Wittrup等人美国专利第6,699,658号中的，将其以引用的方式并入本文中。
B.产生重组IL-13抗体
本发明的抗体可通过在本领域中是已知的大量技术中的任一个产生。例如，自宿主细胞表达，其中编码重链和轻链的表达载体经通过标准技术转染于宿主细胞中。各种形式的术语“转染”意欲包括广泛各种通常用于引入外源性DNA于原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但优选的在真核细胞中表达抗体，且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，由于所述真核细胞(且尤其哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装且分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub且Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中的，(例如)如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述其与DHFR可选择标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养所述宿主细胞历时一段足以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选抗体于宿主细胞生长的培养基中分泌的时间产生抗体。抗体可使用标准蛋白纯化法从培养基中重新获得。
宿主细胞也可用以产生功能抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应了解上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可能需以编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。DNA重组技术也可用以除去编码结合所关注的抗原所不必需的轻和重链的任一个或两者的某些或全部DNA。本发明的抗体也包括自这样的截断DNA分子表达的分子。另外可通过标准化学交联方法交联本发明的抗体与第二抗体产生二功能抗体，其中一个重链和一个轻链为本发明的抗体，和另一重链和轻链对除所关注的抗原以外的抗原具有特异性。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的优选的系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操纵地连接以驱动高水平基因转录。重组表达载体也具有DHFR基因，其使用甲氨蝶呤选择/扩增允许已经载体转染的CHO细胞的选择。培养所选择转化的宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，且从培养基中重新获得完整抗体。标准分子生物学技术用以制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化克隆，培养宿主细胞且从培养基回收抗体。另外本发明提供一种通过在适当培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的重组抗体合成，来合成本发明的重组抗体的方法。所述方法可还包括从培养基分离重组抗体。
1.抗IL-13抗体
表5为本发明的优选的抗hIL-13抗体的VH和VL区域的氨基酸序列的列表。
表5：VH和VL区域的氨基酸序列的列表
上述分离的抗IL-13抗体CDR序列确立根据本发明分离且包含包括于下表6中所列的CDR序列的多肽的IL-13结合蛋白的新颖家族。为产生且选择本发明的关于hIL-13和或hIL-13具有优选的IL-13结合和/或中和活性的CDR，可使用在本领域中是已知的用于产生本发明结合蛋白且评估那些结合蛋白的IL-13和或IL-13结合和/或中和特征的标准方法，包括但不限于那些特定描述于本文中的。
表6：共有IL-13 CDR亲和配体(替代残基列于各氨基酸位置下部；-指示残基可缺失)。
2.抗IL-13嵌合抗体
嵌合抗体为其中抗体的不同部分源自于不同动物物种的分子，例如具有源自鼠类单克隆抗体的可变域和人免疫球蛋白恒定区的抗体。在本领域中是已知的用于产生嵌合抗体的方法且详细地探讨于实例2.1.中。参见例如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods125：191-202；美国专利第5,807,715、4,816,567和4,816,397号，其以引用的方式全部并入本文中。另外，可使用通过将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自适当生物学活性的人类抗体分子的基因剪接在一起，经发展用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855；Neuberger等人，1984，Nature312：604-608；Takeda等人，1985，Nature 314：452-454，其以引用的方式全部并入本文中)。
在一个实施方案中，通过以人类IgGl恒定区替换第一部分所描述的鼠类单克隆抗人类IL-13抗体的重链恒定区来产生本发明的嵌合抗体。在一特定实施方案中，本发明的嵌合抗体包含重链可变域(VH)，其包含SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46的氨基酸序列；和轻链可变域(VL)，其包含SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43或SEQID NO：47的氨基酸序列。
3.抗IL-13人源化抗体
人源化抗体为来自结合所需抗原的非人类物种抗体的抗体分子，其具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区域。已知人类Ig序列公开在例如
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Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)，各自以引用的方式全部并入本文中。如在本领域中是已知的，这样的引入序列可用于降低免疫原性或降低、增强或改进结合、亲和性(affinity)、结合速率、分解速率、亲和力(avidity)、特异性、半衰期或任何其它适当特性。
人类框架区域中的框架残基可经CDR施体抗体的对应残基取代以改变、优选的改善抗原结合。通过在本领域中所熟知的方法，例如通过将CDR与框架残基的相互作用建立模型以鉴定对于抗原结合和序列比较而言重要的框架残基，以鉴定特定位置的特殊框架残基，来鉴定这些框架取代。(参见例如Queen等人，美国专利第5,585,089号；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，将其以引用的方式全部并入本文中)三维免疫球蛋白模型通常可获得且为本领域技术人员所熟知。可获得说明且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。这样的显示的检视允许分析残基对候选免疫球蛋白序列的功能的可能作用，也即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，FR残基可自共有区选择且组合且引入序列以便获得所需抗体特征，例如对靶标抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接且极基本上与影响抗原结合有关。可使用在本领域中是已知的各种技术将抗体人源化，例如但不限于那些描述于以下参考文献和专利中的：Jones等人，Nature 321：522(1986)；Verhoeyen等人，Science239：1534(1988)；Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91：969-973(1994)；PCT公开WO 91/09967；PCT/：US 98/16280、US96/18978、US 91/09630、US 91/05939、US 94/01234、GB 89/01334、GB 91/01134、GB 92/01755；WO 90/14443、WO 90/14424、WO 90/14430、EP 229246、EP 592,106；EP 519,596、EP 239,400、美国专利第5,565,332、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567号，各自以引用的方式全部并入本文中，包括其所引用的参考文献。
C.产生抗体和产生抗体的细胞系
本发明的抗IL-13抗体优选的显示高降低或中和IL-13活性的能力，例如如在本领域中是已知的数种体外和体内测定的任一个所评估(例如参见实施例1.1.C)。例如，这些抗体以在至少约10-8M、约10-9M或约10-10M范围内的IC50值中和通过A-549细胞的IL-13诱导的TARC产生。
在优选的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分结合人类IL-13，其中如通过表面等离子体共振所测定，所述抗体或其抗原结合部分以约0.1s-1或更小的koff速率常数与人类IL-13解离，或其以约1×10-6M或更小的IC50值抑制人类IL-13和/或人类IL-13活性。或者，如通过表面等离子体共振所测定所述抗体或其抗原结合部分可以约1×10-2s-1或更小的koff速率常数与人类IL-13解离，或其可以约1×10-7M或更小的IC50值抑制人类IL-13和/或人类IL-13活性。或者，如通过表面等离子体共振所测定抗体或其抗原结合部分可以约1×10-3s-1或更小的koff速率常数与人类IL-13解离，或其可以约1×10-8M或更小的IC50值抑制人类IL-13和/或人类IL-13。或者，如通过表面等离子体共振所测定抗体或其抗原结合部分可以约1×10-4s-1或更小的koff速率常数与人类IL-13解离，或其可以约1×10-9M或更小的IC50值抑制IL-13和/或人类IL-13活性。或者，如通过表面等离子体共振所测定抗体或其抗原结合部分可以约1×10-5s-1或更小的koff速率常数与人类IL-13解离，或其可以约1×10-10M或更小的IC50值抑制IL-13和/或人类IL-13活性。或者，如通过表面等离子体共振所测定抗体或其抗原结合部分可以约1×10-5s-1或更小的koff速率常数与人类IL-13解离，或其可以约1×10-11M或更小的IC50值抑制IL-13和/或人类IL-13活性。
IL-13通过与细胞表面上的IL-13受体(IL-13R)，包含IL-13Rα1链(IL-13Rα1)和IL-4R链(IL-4R)的异源二聚体结合行使其作用。IL-13首先以低亲和力(KD＝2-10nM)与IL-13Rα1结合，且随后招募IL-4R至复合体，产生高亲和力受体(KD＝0.03-0.4nM)(Aman，M.J.，等人，1996J.Biol.Chem.271，29265-29270；Miloux等人，1997FEBS Lett.401，163-166；Andrews等人2002J.Biol.Chem.277，46073-46078)。IL-13R的异二聚合导致分别与IL-13Rα1和IL-4R组成型相关的Janus激酶TYK2和JAK1活化，接着导致信号转导蛋白和转录6(STAT6)的活化因子活化(Izuhara，K.和Arima，K.2004Drug News Perspect.17，91-98)。存在另一IL-13结合单元IL-13Rα2链(IL-13Rα2)，其以高亲和力(0.25-1.2nM)与IL-13结合(Caput，等人1996J.Biol.Chem.271，16921-16926；Donaldson等人1998J.Immunol.161，2317-2324)。已知无其它受体分子涉及于IL-13.TL-13R2复合体中。最初认为IL-13R2充当非信号传导“诱饵”受体。然而，后来发现其可与IL-13结合且经由AP-1途径传输信号，使得在某些包括巨噬细胞的细胞类型中TNF-β产生，其接着导致肺部纤维化(Fichtner-Feigl，2006Nat Med 12：99-106)。因此，IL-13Rα1/IL-4Ra与IL-13Rα2途径造成哮喘和其它肺炎症病症的总病理生理学。因此，阻断IL-13与两种受体结合的治疗性抗IL-13抗体将比那些仅阻断一种受体者更有效。
已分离阻断IL-13与IL-13Rα1和IL-13Rα2结合的单克隆抗体。细胞表面上基于ELISA的受体结合测定与125-I-标记的IL-13结合测定均证明鼠类形式与人源化形式(也即13C5.5)的13C5均能够有效阻断IL-13与两种受体的结合。与13C5相同谱系中的包括25C8和33C3的抗体也能够阻断IL-13与两种受体结合。13C5的表位作图指示其结合位点包括人类IL-13的C末端螺旋D区(残基VRDTK IEVAQ FVKDLLLHLK KLFRE GR，对应于SEQ ID NO 1的氨基酸104-130)。已提出c末端螺旋D区涉及于与IL-13受体的相互作用中(Zuegg等人2001Immunol Cell Biol.79：332-9)。与13C5.5抗体的Fab部分复合的人类IL-13的晶体结构指示13C5.5结合人类-13的C末端螺旋D区以及N末端螺旋A区。优选地，所述抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，使得具有所述抗体或其抗原结合片段的IL-13被抑制而不能与IL-13结合，所述抗体或其抗原结合片段与由SEQ ID No.1的局部区域Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38和Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu128-Gly129-Arg130界定的表位结合。优选地，所述抗体或其抗原结合片段结合人类IL-13，使得具有所述抗体或其抗原结合片段的IL-13被抑制而不能与IL-13α2受体结合，所述抗体或其抗原结合片段与由SEQ ID No.1的局部区域Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38和Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127界定的表位结合。
在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。重链恒定区优选为IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体可包含轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。抗体优选的包含κ轻链恒定区。或者，抗体部分可为例如Fab片段或单链Fv片段。
在本领域中是已知的替换Fc部分的氨基酸残基至改变抗体效应子功能(Winter，等人，US专利第5,648,260；5,624,821号)。抗体的Fc部分介导数种重要效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖型细胞毒性(CDC)和抗体和抗原抗体复合物的半衰期/清除率。视治疗目的而定，在某些情况下，这些效应子功能对于治疗抗体而言为合意的，但在其它情况下其可为不必要的或甚至有害的。某些人类IgG同种型，尤其IgG1和IgG3经由分别与FcγR和补体Clq结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)为决定抗体的循环半衰期的关键元件。在另一个实施方案中，抗体的恒定区(例如抗体的Fc区域)中的至少一氨基酸残基经替换，使得抗体的效应子功能改变。
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的抗体或抗体部分经衍生或与另一官能分子(例如另一肽或蛋白)连接。例如，本发明的标记的结合蛋白可通过官能性地连接本发明的抗体或抗体部分(通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以别的方式)与一种或多种其它分子实体而衍生，这样的其它分子实体例如另一抗体(例如双特异性抗体或双功能抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂和/或可介导抗体或抗体部分与另一分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区域或聚组氨酸标记)缔合的蛋白或肽。
本发明的抗体或抗体部分可衍生的适用可检测试剂包括荧光化合物。例示性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰基氯、藻红蛋白和其类似物。抗体也可经例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和其类似物的可检测酶衍生。当抗体经可检测酶衍生时，其通过添加酶用以产生可检测反应产物的其它试剂而进行检测。例如当可检测试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二胺基联苯胺得到可检测的呈色反应产物。抗体也可经生物素衍生且经由间接测定抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合而检测。
本发明的另一个实施方案提供了结晶结合蛋白。优选地，本发明涉及如本文公开的全抗IL-13抗体和其片段的晶体和包含这样的晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶结合蛋白比结合蛋白的可溶性对应物具有更大体内半衰期。在另一个实施方案中，结晶后结合蛋白保留生物学活性。
可根据在本领域中是已知的且如WO 02072636(以引用的方式并入本文中)中公开的方法产生本发明的结晶结合蛋白。
本发明的另一个实施方案提供糖基化结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个糖残基。初期体内蛋白产生可进行进一步处理，称为转译后修饰。糖(糖基)残基尤其可以酶方式，一种称为糖基化的方法添加。所得具有以共价连接的寡糖侧链的蛋白称为糖基化蛋白或糖蛋白。抗体为在Fc域以及可变域中具有一个或多个糖残基的糖蛋白。Fc域中的糖残基对Fc域的效应子功能具有重要影响，对抗体的抗原结合或半衰期具有最低影响(R.Jefferis，Biotechnol.Prog.21(2005)，第11-16页)。相反，可变域的糖基化对抗体的抗原结合活性可具有一定影响。可变域的糖基化可能因位阻而对抗体结合亲和力可具有负作用(Co，M.S.等人Mol.Immunol.(1993)30：1361-1367)或使得对抗原的亲和力增加(Wallick，S.C.，等人，Exp.Med.(1988)168：1099-1109；Wright，A.等人，EMBO J.(1991)10：2717-2723)。
本发明的一个方面涉及产生糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O或N连接的糖基化位点已突变。本领域技术人员可使用标准熟知技术产生这样的突变。保留生物学活性，但具有升高或降低的结合活性的糖基化位点突变体为本发明的另一目标。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分的糖基化经改进。例如，可制备非糖基化抗体(也即抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化以(例如)增加抗体对抗原的亲和力。可通过(例如)改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点实现这样的糖类修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，其使得一个或多个可变域糖基化位点消除以由此消除该位点的糖基化。所述非糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。所述方法进一步详细描述于PCT公开WO 003016466 A2和美国专利第5,714,350和6,350,861号中，各者以引用的方式全部并入本文中。
另外或替代地，本发明的修饰的抗体可经制备具有改变的糖基化类型，例如具有降低量的岩藻糖基残基的次岩藻糖基化的抗体或具有增加的二等分GlcNAc结构的抗体。已证明这样的改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。可通过(例如)于具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现这样的糖类修饰。在本领域中已描述具有改变的糖基化机制的细胞且其可用作表达本发明的重组抗体以由此产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。参见例如Shields，R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-1以及欧洲专利第EP 1,176,195号；PCT公开WO 03/035835；WO99/54342 80，各自以引用的方式全部并入本文中。
蛋白糖基化视所关注的蛋白的氨基酸序列以及表达蛋白的宿主细胞而定。不同生物可产生不同糖基化酶(例如糖基转移酶和糖苷酶)且具有不同可用底物(核苷酸糖)。因这样的因素，蛋白糖基化模式和糖基残基的组合物可依赖于表达特定蛋白的宿主系统而不同。适用于本发明的糖基残基可包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、N-乙酰葡萄胺糖和唾液酸。糖基化结合蛋白优选的包含糖基残基使得糖基化模式为人类。
本领域技术人员已知不同蛋白糖基化可产生不同蛋白特性。例如，与表达于例如CHO细胞系的哺乳动物细胞中的相同蛋白相比，在例如酵母的微生物宿主中产生且利用酵母内源性途径糖基化的治疗性蛋白的效力可降低。这样的糖蛋白在人类中也可具有免疫原性且施用后显示降低的体内半衰期。人类和其它动物的特异性受体可识别特异性糖基残基且促进蛋白自血流快速清除。其它不利效果可包括蛋白折叠、溶解性、蛋白酶易感性、运输、递送、区室化、分泌、由其它蛋白或因子识别、抗原性或过敏性变化。因此，实施者可优选具有特定组成和糖基化模式的治疗性蛋白，例如糖基化组成和形式等同于或至少类似于人类细胞或预定受检动物的物种特异细胞中产生的。
可通过在遗传上修饰宿主细胞以表达异源性糖基化酶来获得不同于宿主细胞的蛋白的表达糖基化蛋白。使用在本领域中是已知的技术，实施者可产生显示人类蛋白糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母株已经在遗传上修饰以表达非天然发生糖基化酶，使得在这些酵母株中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)显示与动物细胞、尤其人类细胞相同的蛋白糖基化(美国专利申请案20040018590和20020137134和PCT公开WO 2005100584 A2)。
除结合蛋白外，本发明也涉及对本发明的这样的结合蛋白具有特异性的独特型(抗-Id)抗体。抗-ID抗体为识别通常与另一抗体的抗原结合区域相关的独特决定子的抗体。可通过以结合蛋白或其含有CDR的区域使动物免疫来制备抗-ID。所免疫动物将识别和对免疫抗体的个体基因型决定子作出应答且产生抗-Id抗体。抗-Id抗体也可用作“免疫原”以诱导另一动物的免疫反应，产生所谓的抗抗Id抗体。
另外，本领域技术人员应了解可使用遗传上工程化以表达各种糖基化酶的宿主细胞的库表达所关注的蛋白，使得库的成员宿主细胞产生具有不同糖基化模式的所关注的蛋白。实施者可随后选择且分离具有特定新糖基化模式的所关注的蛋白。具有特定选择的新颖糖基化模式的蛋白优选的显示改善或改变的生物特性。
D.抗IL-13抗体的用途
考虑到结合人类IL-13的能力，本发明的抗人类IL-13抗体或其部分可用于使用例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学的习知免疫测定检测人类IL-13(例如于例如血清或血浆的生物样品中)。本发明提供一种用于检测生物样品的人类IL-13的方法，所述方法包括使生物样品与本发明的抗体或抗体部分接触，且检测与人类IL-13结合的抗体(或抗体部分)或未结合抗体(或抗体部分)，以由此检测生物样品中的人类IL-13。抗体经可检测物质直接或间接标记以促进结合或未结合抗体的检测。适当可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性物质。适当酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当辅基复合体的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；且适当放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
替代标记抗体，人类IL-13可通过竞争免疫测定，利用经可检测物质记的rhIL-13标准和未标记抗人类IL-13抗体于生物液体中测定。在此测定中，将生物样品、标记的rhIL-13标准与抗人类IL-13抗体组合，且测定与未标记抗体结合的标记的rhIL-13标准的量。生物样品中人类IL-13的量与同抗IL-13抗体结合的标记的rhIL-13标准的量成反比。类似地，人类IL-13也可通过竞争免疫测定，利用经可检测物质标记的rhIL-13标准和未标记抗人类IL-13抗体于生物液体中测定。
本发明的抗体和抗体部分优选的能够体外与体内中和人类IL-13活性。因此，本发明的这样的抗体和抗体部分可用于抑制hIL-13活性，例如在含有hIL-13的细胞培养物中、在人类个体中或在其它具有本发明的抗体交叉反应的IL-13的哺乳动物个体中抑制hIL-13活性。在一个实施方案中，本发明提供一种用于抑制hIL-13活性的方法，所述方法包括使hIL-13与本发明的抗体或抗体部分接触，使得hIL-13活性受抑。例如，在含有或怀疑含有hlL-13的细胞培养物中，本发明的抗体抗体部分可添加至培养基以抑制培养物的hIL-13活性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于降低个体的hIL-13活性的方法，有利地从患有其中IL-13活性有害的疾病或病症的个体降低hIL-13活性。本发明提供用于降低患有所述疾病或病症的个体的IL-13活性的方法，所述方法包含向个体施用本发明的抗体或抗体部分。使得所述个体的IL-13活性降低。IL-13优选为人类IL-13且所述个体为人类个体。或者，个体可为表达本发明的抗体能够结合的IL-13的哺乳动物。另外，个体可为IL-13已引入(例如通过施用IL-13或通过表达IL-13转基因)的哺乳动物。可出于治疗目的向人类个体施用本发明的抗体。此外，可出于兽医学目的或作为人类疾病的动物模型，向表达抗体能够结合的IL-13的非人类哺乳动物施用本发明的抗体。关于后者，这样的动物模型可适用于评估本发明抗体的治疗效力(例如测试施用剂量和时程)。
如本文中所用，术语“IL-13活性有害的病症”意欲包括疾病和其它病症，其中患有所述病症的个体中IL-13的存在已显示或怀疑造成所述病症或造成病症恶化的因素的病理生理学。因此，其中IL-13活性有害的病症为其中预期IL-13活性降低减轻病症的症状和/或进行的病症。这样的病症可通过(例如)增加患有所述病症的个体的生物流体中IL-13的浓度(例如个体的血清、血浆、滑液等中IL-13的浓度增加)来证明，所述浓度可使用(例如)如上所述的抗IL-13抗体检测。可以本发明的抗体治疗的病症的非限制性实例包括那些探讨于以下关于本发明抗体的药物组合物的部分的病症。
已暗示IL-13在导致与哮喘相关的病理反应中具有关键作用。然而，差示免疫学途径的其它介体也与哮喘发病机制有关，且除IL-13的外阻断这些介体可提供其它治疗益处。因此，本发明的结合蛋白可并入DVD-Ig蛋白中，其中DVD能够结合标靶对，包括但不限于IL-13和前炎性细胞因子，例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。TNF-α可扩增哮喘的炎性反应且可与疾病严重程度有关(McDonnell，等人，Progress inRespiratory Research(2001)，31(New Drugs for Asthma，Allergy andCOPD)，247-250)。此暗示阻断IL-13与TNF-α可具有有利效应，尤其在严重气管疾病中。在一个优选的实施方案中，本发明的DVD-Ig结合标靶IL-13和TNF-α且用于治疗哮喘。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白可用于产生DVD-Ig分子，其结合IL-13和IL-1β、IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13且TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；和IL-13和ADAM8。本发明也提供能够结合IL-13和一种或多种与哮喘有关的标靶的DVD-Ig，这样的标靶选自以下各物：CSF1(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、组氨酸和组氨酸受体、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR和壳多糖酶。
D.药物组合物
本发明也提供了包含本发明的抗体或其抗原结合部分和药物学上可接受的载体的药物组合物。包含本发明的抗体的药物组合物适用于但不限于诊断、检测或监控病症；预防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状和/或用于研究。在一特定实施方案中，组合物包含一种或多种本发明的抗体。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种本发明的抗体和一种或多种除本发明抗体以外的预防或治疗剂，以供治疗其中IL-13活性有害的病症。优选地，已知预防或治疗剂适用于或已或当前正用于预防、治疗、控制或改善病症或其一种或多种症状。根据这些实施方案，所述组合物可另外包括载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的抗体和抗体部分可并入适用于施用个体的药物组合物中。药物组合物通常包含本发明的抗体或抗体部分和药物学上可接受的载体。如本文中所用，“药物学上可接受的载体”包括生理上相容的任一和所有溶剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂和其类似物。药物学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲生理食盐水、葡聚糖、甘油、乙醇和其类似物中的一或多者以及其组合。在多数情况下，其在组合物中优选的包括等渗剂，例如糖，例如甘露糖醇、山梨糖醇的多元醇或氯化钠。药物学上可接受的载体可还包含微量助剂物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体或抗体部分的存放期或有效性。
已知各种递送系统且其可用于施用一种或多种本发明的抗体或一种或多种本发明的抗体与适用于预防、控制、治疗或改善病症或其一种或多种症状的预防剂或治疗剂的组合，例如脂质粒封装、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、核酸作为反转录病毒或其它载体的一部分的构建等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括但不限于胃肠外施用(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、肿瘤内施用和粘膜施用(例如鼻内和口服途径)。另外，可通过使用(例如)吸入器或雾化器和与雾化剂的制剂，采用肺部施用。参见例如美国专利第6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078号；和PCT公开第WO92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903号，各自以引用的方式全部并入本文中。在一个实施方案中，使用Alkermes肺部药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass)施用本发明的抗体、组合疗法或本发明的组合物。在一特定实施方案中，肌内、静脉内、肿瘤内、经口、鼻内、肺部或皮下施用本发明的预防或治疗剂。预防或治疗剂可通过任何便利途径施用，例如通过注射或快速注射、通过经上皮或粘膜皮肤外膜(例如口腔粘膜、经直肠和肠粘膜等)吸收，且其可与其它生物活性剂一起施用。施用可为全身性或局部施用。
在一特定实施方案中，向需要治疗的区域局部施用本发明的预防或治疗剂可为合意的；此可通过(例如且不限于)局部输注、注射或借助于植入而实现，所述植入为包括薄膜和基质(例如硅橡胶(sialastic)薄膜、聚合物、纤维基质(例如)或胶原基质)的多孔或无孔材料。在一个实施方案中，将有效量的一种或多种本发明的抗体局部施用患者的受影响区域以预防、治疗、控制和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，将有效量的本发明的一种或多种抗体组合有效量的除本发明抗体外的一种或多种治疗剂(例如一种或多种预防或治疗剂)局部施用患者的受影响区域以预防、治疗、控制和/或改善病症或其一种或多种症状。
在另一个实施方案中，本发明的预防或治疗剂可在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，泵可用以实现控释或持续释放(参见前述Langer；Sefton，1987，CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14：20；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，聚合材料可用于实现本发明的治疗剂的控释或持续释放(参见例如Medical Applications ofControlled Release，Langer和Wise(编)，CRC Pres.Boca Raton，Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball(编)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；也参见Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利第5,679,377号；美国专利第5,916,597号；美国专利第5,912,015号；美国专利第5,989,463号；美国专利第5,128,326号；PCT公开第WO99/15154号；和PCT公开第WO 99/20253号。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-聚乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚乳酸交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个优选的实施方案中，用于持续释放制剂的聚合物为惰性的、不含可滤除杂质、储存稳定、无菌的与生物可降解。在另一个实施方案中，受控或持续释放系统可接近预防或治疗标靶放置，因此仅需全身剂量的一部分(参见例如前述Goodson，在Medical Applications ofControlled Release，第2卷，第115-138页(1984)中)。
控释系统论述于Langer的回顾中(1990，Science 249：1527-1533)。本领域技术人员已知的任何技术可用于产生包含一种或多种本发明的治疗剂的持续释放制剂。参见例如美国专利第4,526,938号；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning等人，1996，“IntratumoralRadioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using aSustained-Release Gel，”Radiotherapy & Oncology 39：179-189；Song等人，1995，“Antibody Mediated Lung Targeting of Long-CirculatingEmulsions，”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等人，1997，“Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGFAntibody for Cardiovascular Application，”Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等人，1997，“Microencapsulation ofRecombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery，”Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，各自以引用的方式全部并入本文中。
在一特定实施方案中，如果本发明的组合物为编码预防或治疗剂的核酸，则所述核酸可体内施用以促进其经编码的预防或治疗剂的表达，通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分且施用其以便其在细胞内，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利第4,980,286号)或通过直接注入或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)或以脂质或细胞表面受体或转染剂涂布，或通过有关已知进入核的同源异形盒样肽将其施用(参见例如，Joliot等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)。或者，可将核酸引入细胞内且并入宿主细胞DNA中以通过同源重组表达。
本发明的药物组合物经配制以与其预定施用途径相容。给药途径的实例包括但不限于胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下；口服；鼻内(例如吸入)；经皮(例如局部)；经粘膜和经直肠施用。在一特定实施方案中，根据常规程序配制组合物以作为适合于静脉内、皮下、肌内、口服、鼻内或局部施用人类的药物组合物。用于静脉内施用的组合物通常为无菌等渗水性缓冲液中的溶液。若必要，所述组合物也可包括增溶剂和例如利多卡因(lignocamne)的局部麻醉剂以缓解注射位点的痛感。
如果局部施用本发明的组合物，则所述组合物可配制成以下形式：软膏、乳膏、经皮贴片、洗剂、凝胶、香波、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳液或本领域技术人员所熟知的其它形式。参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical DosageForms第19版，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(1995)。对于非喷雾型局部剂型，通常采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂且具有优选的大于水的动态粘度的粘性半固型或固型。适当制剂包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、粉末、擦剂、油膏和其类似物，如果需要其可经灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲液或盐)混合以便影响例如渗透压的各种特性。其它适当局部剂型包括可喷雾气溶胶制剂，其中优选的与固体或液体惰性载体组合的活性组分以与受压挥发物(例如气体推进剂，例如氟利昂)的混合物形式包装或包装于塑料挤瓶中。如果需要润湿剂或保湿剂也可添加至药物组合物和剂型。这样的其它组分的实例为在本领域中所熟知。
如果本发明的方法包括鼻内施用组合物，则所述组合物可配制成气溶胶形式、喷雾剂、雾状物或以滴剂形式。根据本发明使用的预防或治疗剂尤其可在使用适当推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体)的情况下，以来自加压包或喷雾器的气溶胶喷雾呈递形式便利地递送。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门来递送经计量的量来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的胶囊和滤筒(由例如明胶组成)可经配制以含有所述化合物与例如乳糖或淀粉的适当粉末的粉末状混合物。
如果本发明的方法包括口服给药，则组合物可经配制成锭剂、胶囊、扁囊剂、胶囊锭、溶液、悬浮液、和其类似物的经口形式。可由习知方法与药物学上可接受的例如以下的赋形剂一起制备锭剂或胶囊：粘结剂(例如预先动物胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。可由在本领域中所熟知的方法涂覆这样的锭剂。口服施用的液体制剂可采用但不限于溶液、糖浆或悬浮液的形式，或其可作为用于在使用之前与水或其它合适载体组合的干燥产物存在。这样的液体制剂可由习知方法使用药物学上可接受的例如以下的添加剂来制备：悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)；和防腐剂(例如甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。这样的制剂也可视情况而定含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。口服施用的制剂可经适当配制以便缓释、控释或持续释放预防或治疗剂。
本发明的方法可包括例如通过使用吸入器或雾化器肺部施用与气雾剂一起配制的组合物。参见例如美国专利第6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078号；和PCT公开第WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO98/3l346和WO 99/66903号，各自以引用的方式全部并入本文中。在一特定实施方案中，使用Alkermes肺部药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass)施用本发明的抗体、组合疗法和/或本发明的组合物。
本发明的方法可包括施用经配制以便通过注射(例如通过快速注射或连续输液)胃肠外施用的组合物。用于注射的制剂可以单位剂型形式(例如以安瓿形式或以多剂量容器形式)与经添加的防腐剂一起提供。组合物可采用这样的如于油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式且可含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者活性组分可呈在使用之前与合适的载体(例如无菌无热原水)组合的粉剂形式。
本发明的方法可另外包括施用经配制为贮库式制剂的组合物。这样的长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此(例如)可使用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受的油剂中的乳液)或离子交换树脂来配制组合物，或其可配制为微溶性衍生物(例如微溶性盐)。
本发明的方法包括施用配制为中性或盐形式的组合物。药物学上可接受的盐包括那些与阴离子形成的盐，例如那些源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，和那些与阳离子形成的盐，例如那些源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
通常，独立地或于单位剂型中混合在一起提供组合物的组分，这样的剂型例如于例如指示活性剂数量的安瓿或药囊的密闭容器中的干燥冻干粉或无水浓缩物。如果施用形式为输注，则组合物可以含有无菌药物级水或盐水的输液瓶施配。如果施用形式为注射，则可提供无菌注射水或盐水的安瓿以便组分可在施用之前混合。
本发明也尤其规定一种或多种预防或治疗剂，或本发明的药物组合物经封装在例如安瓿瓶或药囊的指示药剂数量的密闭容器中。在一个实施方案中，一种或多种预防或治疗剂或本发明的药物组合物经提供为于密闭容器中的干燥灭菌冻干粉末或无水的浓缩物，且其可经重构(例如与水或盐水)成适当浓度以便施用个体。一种或多种预防或治疗剂或本发明的药物组合物优选的以以下单位剂量经提供为于密闭容器中的干燥无菌冻干粉末：至少5mg、更优选至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至少100mg。这样的冻干预防或治疗剂或本发明的药物组合物应于其原始容器中储存在2℃且8℃之间，且这样的预防或治疗剂或本发明的药物组合物应在重新配制后1周内、优选的5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在一替代实施方案中，一种或多种预防或治疗剂或本发明的药物组合物以于指示药剂的量和浓度的密闭容器中的液体形式提供。优选地，所施用组合物的液体形式在密闭容器中以下列量提供：至少0.25mg/ml、更优选至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml。液体形式应于其原始容器中储存在2℃与8℃之间。
本发明的抗体和抗体部分可并入适用于胃肠外施用的药物组合物中。抗体或抗体部分优选的将制备为含有0.1-250mg/ml抗体的可注射溶液。所述可注射溶液可包括于火石玻璃或琥珀色小瓶、安瓿或预填充注射器中的液体或冻干剂型。缓冲液可为L-组氨酸(1-50mM)、最优选5-10mM，pH 5.0至7.0(最优选pH 6.0)。其它适当缓冲液包括但不限于丁二酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可用于调节浓度为0-300mM(对于液体剂型最优选150mM)的溶液的毒性。对于冻干剂型，可包括低温保护剂，主要为0-10％蔗糖(，最优选0.5-1.0％)。其它适当低温保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冻干剂型可包括填充剂，主要为1-10％甘露糖醇(最优选2-4％)。稳定剂可用于液体与冻干剂型，主要为1-50mM L-甲硫氨酸(最优选5-10mM)。其它适当填充剂包括甘氨酸、精氨酸，其可以0-0.05％聚山梨醇酯-80的形式而包括(最优选0.005-0.01％)。其它表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。经制备为用于胃肠外施用的可注射溶液的包含本发明抗体和抗体部分的药物组合物可还包含适用作辅助剂的试剂，例如那些用以增加治疗蛋白(例如抗体)的吸收或分散的试剂。尤其适用的辅助剂为透明质酸酶，例如(重组人类透明质酸酶)。在可注射溶液中添加透明质酸酶可改善胃肠外施用、尤其皮下施用后的人类生物可用性。其也允许更大注射位点体积(也即大于1ml)，而疼痛和不适更少，且注射部位反应发生率最小(参见WO 2004078140、US 2006104968，其以引用的方式并入本文中)。
本发明的组合物可呈各种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射性和输注溶液)、分散液或悬浮液、锭剂、丸剂、粉末、脂质粒和栓剂。优选的形式取决于预定施用形式和治疗应用。典型优选的组合物系呈可注射或可输注溶液的形式，例如与那些用于以其它抗体被动免疫接种人类的组合物相似的组合物。施用的优选的形式为胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个优选的实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射施用。于另一个优选的实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射施用。
在制备和储存条件下，治疗组合物通常须为无菌且稳定的。组合物可配制成溶液、微乳液、分散液、脂质粒或其它适于高药物浓度的有序结构。视需要，可通过将所需量的活性化合物(也即抗体或抗体部分)与上文列举的组分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入含有基础分散介质和上文所列举的所需其它组分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和喷雾干燥，所述方法自先前经无菌滤过的溶液得到活性组分加上任何其它所需组分的粉末。可例如通过使用例如卵磷脂的涂料，在分散液情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可通过在组合物中包括延迟吸收的例如单硬脂酸盐和明胶的试剂，来实现可注射性组合物的延长吸收。
可通过在本领域中是已知的各种方法施用本发明的抗体和抗体部分，尽管对于许多治疗应用，优选的施用途径/形式为皮下注射、静脉注射或输注。如本领域技术人员所了解，施用的途径和/或形式将依赖于所需结果而变。在某些实施方案中，活性化合物可与保护化合物阻止快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴片和微囊封的传输系统。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备这样的制剂的方法已申请专利或通常为本领域技术人员所已知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可与(例如)惰性稀释剂或可吸收可食用载体一起经口施用。所述化合物(如果需要和其它组分)也可封入硬质或软壳胶囊中，压缩成锭剂，或直接并入个体的膳食中。对于口服治疗给药，所述化合物可与赋形剂一起并入且以可摄取锭剂、口含锭剂、片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂和其类似物形式使用。为通过胃肠外以外的施用方式施用本发明的化合物，可能必需以预防其失活的材料包衣所述化合物或与所述材料一起共施用所述化合物。
补充型活性化合物也可并入所述组合物中。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分与一种或多种适用于治疗其中IL-13活性有害的病症的其它治疗剂一起共配制和/或共施用。例如，本发明的抗hIL-13抗体或抗体部分可与一种或多种结合其它标靶的其它抗体(例如结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)一起共配制和/或共施用。此外，本发明的一种或多种抗体可组合2种或2种以上上述治疗剂使用。这样的组合疗法可有利地利用低剂量的所施用治疗剂，因此避免与各种单一疗法相关的可能的中毒或并发症。
在某些实施方案中，IL-13或其片段的抗体与在本领域中是已知的半衰期延长载体有关。这样的载体包括但不限于Fc域、聚乙二醇和葡聚糖。这样的载体描述于(例如)美国申请案第09/428,082号和公开的PCT申请案第WO 99/25044号中，据此出于任何目的将其以引用的方式并入。
在一个特定实施方案中，施用包含编码本发明的抗体或本发明的另一预防或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列以经由基因疗法治疗、预防、控制或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法是指通过向个体施用表达或可表达核酸而进行的治疗。在本发明的此实施方案中，核酸产生其编码抗体或介导预防或治疗效应的本发明的预防或治疗剂。
根据本发明可使用在本领域中可获得的用于基因疗法的方法中的任一个。对于基因疗法的方法的一般性综述，参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215。DNA重组技术中通常已知的可使用的方法描述于Ausubel等人(编)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，StocktonPress，NY(1990)中。基因疗法的各种方法的详细描述公开于US20050042664 A1中，其以引用的方式并入本文中。
在另一个方面中，本申请的特征在于一种治疗(例如治愈、抑制、改善、延迟或阻止发作或预防反复或复发)或阻止个体的IL-13相关病症的方法。所述方法包括：向个体施用足以治疗或预防IL-13相关病症的量的IL-13结合剂(尤其拮抗剂)，例如如本文中描述的抗IL-13抗体或其片段。可单独或组合如本文中描述的其它治疗形式将IL-13拮抗剂，例如抗IL-13抗体或其片段施用给个体。
在一个实施方案中，个体为哺乳动物，例如患有一种或多种IL-13相关病症的人类，这样的病症包括例如呼吸病症(例如哮喘(例如过敏性和非过敏性哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)，和其它病症，包括呼吸道炎症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液过量产生)；特异反应性病症(例如特异反应性皮炎和过敏性鼻炎)；皮肤、胃肠器官的炎性和/或自身免疫性病症(例如炎性肠病(IBD)，例如溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病)和肝脏的炎性和/或自身免疫性病症(例如硬化、纤维化)；硬皮病；肿瘤或癌症，例如如本文描述的霍奇金淋巴瘤。因此，公开内容包括IL-13结合剂(例如本文中描述的抗IL-13抗体或其片段)用于本文中描述的治疗的用途，和IL-13结合剂(例如本文中描述的抗IL-13抗体或其片段)用于制备用于本文中描述的治疗的药剂的用途。
IL-13相关病症的实例包括但不限于选自以下的一种或多种病症：呼吸病症，例如哮喘(例如过敏性和非过敏性哮喘(例如因(例如)呼吸道合胞病毒(RSV)感染所致的(例如)幼儿哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)和其它病症，包括呼吸道炎症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液过量产生)，例如囊性纤维化和肺纤维化；特异反应性病症，例如因IL-13敏感性增加所致的特异反应性病症(例如特异反应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎和过敏性肠胃炎)；皮肤(例如特异反应性皮炎)、胃肠器官(例如炎性肠病(IBD)，例如溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病)、肝脏(例如硬化肝细胞癌)的炎性和/或自身免疫病症和硬皮病；肿瘤或癌症(例如，软组织或实体肿瘤)，例如白血病、成胶质细胞瘤和淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤；病毒感染(例如自HTLV-1病毒感染)；其它器官纤维化，例如肝脏纤维化(例如，由B型肝炎和/或C型肝炎病毒所致的纤维化)；和如本文中描述的保护性1型免疫反应表达的抑制(例如在疫苗接种期间)。
在其它实施方案中，本申请提供了治疗(例如降低、改善)或预防一种或多种与以下病症相关的症状的方法：呼吸病症，例如哮喘(例如过敏性和非过敏性哮喘)；过敏症；慢性阻塞性肺病(COPD)；包括呼吸道炎症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液过量产生的病症，例如囊性纤维化和肺纤维化。例如，哮喘症状包括但不限于喘息、气促、支气管收缩、气管高反应性、降低的肺活量、纤维化、呼吸道炎症和粘液产生。所述方法包含向个体施用足以治疗(例如降低、改善)或预防一种或多种症状的量的IL-13拮抗剂，例如IL-13抗体或其片段。IL-13抗体可治疗性或预防性或两者性质地施用。可单独或组合如本文中描述的其它治疗形式将IL-13拮抗剂，例如抗IL-13抗体或其片段施用个体。个体优选为哺乳动物，例如患有如本文中所述的IL-13相关病症的人类。
在另一个方面中，本申请提供了用于体外检测样品(例如生物样品，例如血清、血浆、组织、活组织切片)中IL-13的存在的方法。本方法可用于诊断例如免疫细胞相关病症的病症。所述方法包括：(i)使样品或对照样品与抗IL-13抗体或其如本文中描述的片段接触；且(ii)检测抗IL-13抗体或其片段与样品或对照样品之间复合体的形成，其中相对于对照样品，样品中复合体形成的统计上显著变化指示样品中IL-13存在。
在另一个方面中，本申请提供了用于体内检测IL-13存在的方法(例如在个体体内成像中)。本方法可用于诊断例如IL-13相关病症的病症。所述方法包括：(i)在容许抗体或片段与IL-13结合的条件下，向个体或对照个体施用抗IL-13抗体或其如本文中描述的片段；且(ii)检测抗体或片段与IL-13之间复合体的形成，其中相对于对照个体，个体中复合体形成的统计上显著变化指示IL-13存在。
本发明的抗体或其抗原结合部分可单独或组合使用以治疗这样的疾病。应理解本发明的抗体或其抗原结合部分可单独或组合其它例如治疗剂的药剂使用，所述其它药剂经本领域技术人员选择用于其预定目的。例如，所述其它药剂可为本领域公认的有效于治疗本发明的抗体所治疗的疾病或病症的治疗剂。所述其它药剂也可为给治疗组合物赋予有利特征的药剂，例如影响组合物的粘度的药剂。
应进一步理解包括于本发明的组合为那些适用于其预定目的的组合。下文阐述的药剂用于说明目的且并非意欲限制。属于本发明的组合可为本发明的抗体与选自下表的至少一种其它药剂。如所述组合使得所形成组合物可进行其预定作用，则所述组合也可包括一种以上其它药剂，例如两种或三种其它药剂。
如本文中所描述，组合疗法可包括一种或多种IL-13拮抗剂，例如抗IL-13抗体或其片段，其与一种或多种其它治疗剂共配制和/或共施用，所述或这样的其它治疗剂例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、消炎剂(例如全身消炎剂)、抗纤维化剂、代谢抑制物、酶抑制剂和/或细胞毒素或细胞生长抑制剂。
可与一种或多种IL-13拮抗剂(例如抗IL-13抗体或其片段)共施用和/或共配制的其它优选的治疗剂的实例包括但不限于以下的一或多者：经吸入甾类药物；β-激动剂，例如短效或长效β-激动剂；白三烯或白三烯受体拮抗剂；例如ADVAIR的组合药物；IgE抑制剂，例如抗IgE抗体(例如XOLAIR)；磷酸二酯酶抑制剂(例如PDE4抑制剂)；黄嘌呤；抗胆碱剂药物；肥大细胞稳定剂，例如色甘酸；IL-4抑制剂；IL-5抑制剂；嗜酸性粒细胞趋化因子/CCR3抑制剂；组胺或其包括H1、H2、H3和H4的受体的拮抗剂；和前列腺素D或其受体(DP1和CRTH2)的拮抗剂。这样的组合可用于治疗哮喘和其它呼吸病症。可与一种或多种抗IL-13抗体或其片段共同给药和/或共配制的治疗剂的其它实例尤其包括以下的一种或多种：TNF拮抗剂(例如TNF受体的可溶性片段，TNF受体例如p55或p75人类TNF受体或其衍生物，例如75kDTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL))；TNF酶拮抗剂，例如TNF转化酶(TACE)抑制剂；蕈毒碱受体拮抗剂；TGF-β拮抗剂；干扰素γ；泼氟尼东；化学治疗剂，例如甲氨蝶呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物，例如CCI-779；COX2和cPLA2抑制剂；NSAID；免疫调节剂；p38抑制剂、TPL-2、MK-2和NFkB抑制剂。
其它优选的组合为细胞因子抑制性消炎药物(CSAID)；其它人类细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-31、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、EGF、PDGF和内皮素-1以及这些细胞因子和生长因子的受体。本发明的抗体或其抗原结合部分可与细胞表面分子的例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA的抗体或其包括CD 154的配体(gp39或CD40L)组合。
治疗剂的优选的组合可在不同点干扰炎性级联；优选的实例包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人类TNF抗体，D2E7(PCT公开第wO97/29131号)，CA2(RemicadeTM)，CDP 571和可溶性p55或p75TNF受体，其衍生物(p75TNFRlgG(EnbrelTM)或p55TNFRlgG(Lenercept)，以及TNF转化酶(TACE)抑制剂；类似地IL-1抑制剂(介白素-1-转化酶抑制剂、IL-1RA等)出于相同因素可为有效的。其它优选的组合包括介白素4。另一优选的组合为哮喘反应的其它关键队员参与因素，其可与IL-13功能平行，依赖于其作用或与其协同作用；尤其优选为包括IL-9抗体的IL-9拮抗剂。已显示IL-13和IL-9具有重叠但不同功能，且两者拮抗剂的组合可最有效。另一优选的组合为抗IL-5抗体。其它优选的组合包括趋化因子和趋化因子受体的拮抗剂，这样的趋化因子包括MCP-1、MCP-4、嗜酸性粒细胞趋化因子、RANTES、MDC、CCL-12和CCL-17(TARC)，这样的趋化因子受体包括CCR2、CCR3、CCR4和CXCR4。组合可包括哮喘介体的拮抗剂，这样的哮喘介体包括酸哺乳动物壳多糖酶、CRHT2、胃促胰酶、S1P1、S1P2、Tyk2、ROCKII、Stat6、p38、NFkB、磷酸二酯酶4(PDE-4)、肥大细胞类胰蛋白酶、NO、腺嘌呤核苷、IKK2、GATA3、ICAM-1、VCAM-1和ICOS。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指在剂量下且历时必要时段有效于取得所需治疗结果的量。可由本领域技术人员测定治疗有效量的抗体或抗体部分且其可根据例如个体疾病病况、年龄、性别和体重的因素和抗体或抗体部分引起所需个体反应的能力而变。治疗有效量也为治疗有利效应优于抗体或抗体部分的任何毒性或不利影响的剂量。“预防有效量”是指在剂量下且历时必要时段有效于取得所需预防结果的量。通常，由于预防剂量在疾病前或在疾病早期时用于患者，因此预防有效量将小于治疗有效量。
给药方案可经调整以提供最优选所需反应(例如治疗或预防反应)。例如，可施用单次剂量，可随时间施用几个分次剂量或所述剂量可如治疗情况的紧急状态所指示适当降低或增加。为便于给药和剂量一致性，以剂量单位形式配制胃肠外组合物尤其有利。如本文中所用剂量单位形式是指适用作用于待治疗的哺乳动物个体的单位剂量的物理上离散单位；各单位含有预定量的活性化合物，其与所需药物载体相有关经计算以产生所需治疗作用。本发明的剂量单位形式的规格由以下指示且直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗或预防作用；和(b)混配此用于治疗敏感性个体的活性化合物的技术中固有的限制。
本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的例示性、非限制范围为0.1-20mg/kg，更优选1-10mg/kg。应注意剂量值可随待减轻的病症类型和严重程度而变。应进一步理解对于任何特定个体，特定给药方案应随时间根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业诊断而调节，且本文阐述的剂量范围仅为例示性的且不欲限制所主张组合物的范围或实践。
对于本领域技术人员易于显而易见，在不背离本发明范围或本文中公开的实施方案的情况下，本文中描述的本发明方法的其它适当改进和改适为明显的且可使用适当等效物进行。现已详细描述本发明，参考以下实例其将更清楚的理解，仅出于说明目的包括这样的实例且其不欲限制本发明。
实施例
实施例1：产生和分离抗人类IL-13单克隆抗体
实施例1.1：鉴定抗人类IL-13抗体的测定
除非另作说明，否则在整个实施例1中，以下测定用以鉴定和表征抗人类IL-13抗体。
实施例1.1.A：ELISA
筛选结合人类IL-13的抗体的酶联免疫吸附测定进行如下。
在4摄氏度用50μL/孔的在磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)中的5μg/ml特异性山羊抗小鼠IgG Fc(Pierce#31170，Rockford，IL)将ELISA平板(Corning Costar，Acton，MA)涂布过夜。以含有0.05％Tween-20的PBS将平板洗涤一次。在室温下通过添加200μL/孔的稀释为PBS(BioRad#170-6404，Hercules，CA)中2％的阻断溶液将平板阻断1小时。阻断后，以含有0.05％Tween-20的PBS将平板洗涤一次。
将50微升/孔的稀释于含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，St.Louis，MO)的PBS中的小鼠血清或杂交瘤上清液添加至如上所述制备的ELISA平板且在室温下培育1小时。以含有0.05％Tween-20的PBS将各孔洗涤3次。将稀释为含有0.1％BSA的PBS中100ng/ml的50微升生物素化重组纯化的人类IL-13变体(R110Q)添加至各孔且在室温下培育1小时。以含有0.05％Tween-20的PBS将各平板洗涤3次。于含有0.1％BSA的PBS中按1∶20000稀释链霉抗生物素蛋白HRP(Pierce#21126，Rockland，IL)；添加50μL/孔且在室温下将平板培育1小时。以含有0.05％Tween-20的PBS将各平板洗涤3次。将50微升TMB溶液(Sigma#T0440，St.Louis，MO)添加至各孔且在室温下培育10分钟。通过添加1N硫酸停止反应。在450nm波长下分光光度计读取平板。
实施例1.1.B：使用BIACORE技术的亲和力测定
BIACORE测定(Biacore，Inc，Piscataway，NJ)以动态测定结合、分解速率常数来测定抗体的亲和力。在25℃以3000测试仪(AB，Uppsala，Sweden)使用流动HBS-EP(10mM HEPES[pH7.4]，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20)通过表面等离子体共振基测定来测定抗体与重组纯化的人类IL-13或重组纯化的人类IL-13变体(R110Q)的结合。所有化学品由AB(Uppsala，Sweden)或者自文中描述的不同来源获得。使用标准胺偶联试剂盒根据制备商的指导和程序，在25μg/ml将稀释于10mM乙酸钠(pH 4.5)中的约5000RU山羊抗小鼠IgG(Fcγ)片段特异性多克隆抗体(PierceBiotechnology Inc，Rockford，IL)直接贯穿CM5研究级生物传感器芯片固定。以乙醇胺阻断生物传感器表面上未反应的部分。流动池2和4中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。流动池1和3中无山羊抗小鼠IgG的未修饰羧甲基葡聚糖用作参考表面。对于动力学分析，借助于Biaevaluation 4.0.1软件将源自1∶1朗缪尔(Langmuir)结合模型的速率方程同时拟合至8次注射的缔合和解离阶段(使用全拟合分析)。将纯化的抗体稀释于HEPES-缓冲盐水中以便通过山羊抗小鼠IgG特异性反应表面捕捉。在反应基质上以5μl/min的流动速率注射捕捉为配体的小鼠抗体(25μg/ml)。在25μl/min的连续流动速率下，测定结合和分解速率常数kon(单位M-1s-1)和koff(单位s-1)。通过在范围为10-200nM的10个不同抗原浓度下进行动力结合测定来获得速率常数。随后通过下式由动力速率常数计算小鼠抗体与重组纯化的人类IL-13或重组纯化的人类IL-13之间的反应的平衡解离常数(单位M)：KD＝koff/kon。结合记录为时间的函数且计算动力速率常数。在此测定中，可测定到快至106M-1s-1的结合速率常数和慢至10-6s-1的分解速率常数。
实施例1.1.C：抗人类IL-13抗体的功能活性
为检查本发明的抗人类IL-13抗体的功能活性，将抗体用于下列测定抗体抑制IL-13活性的能力的测定中。
实施例1.1.C1A-549生物测定
抗人类IL-13抗体抑制A-549细胞经人类IL-13诱导产生TARC(CCL-17)的能力分析如下。在第一天将A-549细胞接种于96孔平板(2E5细胞/孔)RPMI生长培养基(具有10％FBS)中。在第二天，以含有400ng/ml rhTNF的新鲜RPMI生长培养基(100μl/孔)替换介质。其间，在37℃下以于微量滴定板(U型底，96孔，Costar)中的100μLRPMI完全培养基中的10ng/ml重组纯化的人类IL-13或IL-13变体将各种浓度的免疫小鼠血清、鼠类杂交瘤上清液或纯化的抗人类IL-13抗体预培育1小时。随后向TNF处理的A-549细胞添加抗体加重组纯化的人类IL-13混合物(100μl/孔)，最终体积为200μl/孔(最终IL-13和TNF浓度分别为5ng/ml和200ng/ml)且在37℃下培育18小时。培育后，自各孔抽取150μL不含细胞的上清液且使用人类TARC ELISA(R&D Systems Cat#DDN00)测定所产生的人类TARC的含量。
A-549细胞也对包括猕猴、小鼠、大鼠和羊的其它物种的IL-13作出应答，其ED50值与人类IL-13相似。因此，其使用相同实验方案用于交叉反应分析其它物种的IL-13的抗hIL-13mAb。
实施例1.2：产生抗人类IL-13单克隆抗体
抗人类IL-13小鼠单克隆抗体获得如下：
实施例1.2.A：用人类IL-13抗原使小鼠免疫
在第1天将与完全弗氏辅助剂或免疫测定辅助剂(Qiagen，Valencia，CA)混合的20微克重组纯化的人类IL-13变体(Peprotech)皮下注射于5只6-8周龄Balb/C、5只C57B/6小鼠和5只AJ小鼠中。在第24、38和49天，将与弗氏不完全辅助剂或免疫测定辅助剂混合的20微克重组纯化的人类IL-13变体皮下注射于同一小鼠中。在第84天或第112天或第144天，以1μg重组纯化的人类IL-13变体静脉内注射小鼠。
实施例1.2.B：产生杂交瘤
根据Kohler，G.和Milstein 1975，Nature，256：495中描述的确立方法，以5∶1的比率将由实施例1.2.A描述的免疫小鼠获得的脾细胞与SP2/O-Ag-14细胞融合以产生杂交瘤。将融合产物以每孔2.5×106脾脏细胞的密度平皿接种于于96孔平板中含有重氮丝氨酸和次黄嘌呤的选择介质中。融合后7至10天，观察到肉眼可见杂交瘤集落。通过EL1SA测试来自含有杂交瘤集落的各孔上清液中IL-13变体的抗体的存在(如实施例1.1.A中所述)。随后测试显示IL-13变体特异活性的上清液的在TARC的A-549生物测定中和IL-13变体和IL-13野生型的能力(如实施例1.1.C中所述)。
实施例1.2.C：鉴定和表征抗人类IL-13单克隆抗体
按比例增加产生结合IL-13变体的抗体、根据实施例1.2.B和1.2.C产生且能够特异性地结合IL-13变体的杂交瘤和尤其在A-549生物测定中具有5nM或小于5nM的IC50值的，且通过有限稀释进行克隆。
在含有10％低IgG胎牛血清(Hyclone#SH30151，Logan，UT)的介质中扩充杂交瘤细胞。平均收集250mL各杂交瘤上清液(获自单克隆群体)、浓缩且如Harlow，E.和Lane，D.1988″Antibodies：A LaboratoryManual″中所述通过蛋白A亲和层析纯化。如实施例1.1.C中所述使用A-549生物测定测定纯化的mAb抑制IL-13活性的能力。表7显示A-549生物测定中17个单克隆抗体的IC50值。
表7：A-549生物测定中IL-13通过抗IL-13mAb的中和
如实施例1.1.B中所述使用表面等离子体共振测定单克隆抗体对重组纯化的人类IL-13变体和野生型的结合亲和力。表8显示上文所述的18种单克隆抗体对人类IL-13的亲和力。
表8：抗IL-13mAb对人类野生型和变体IL-13的亲和力
实施例1.2.C.1：鼠类单克隆抗人类IL-13抗体的物种特异性
为测定上文所述的17种单克隆抗体是否识别鼠类IL-13，通过以5μg/ml山羊抗小鼠IgG、Fc片段特异性抗体(Pierce#31170，Rockland，IL)涂布ELISA平板来设定间接ELISA。制备范围在含有0.1％BSA的PBS中0.1至100ng/ml的各种浓度的鼠类抗人类IL-13mAb；将50μl各抗体稀释添加至涂布的ELISA平板且在室温下培育1小时。以含有0.05％Tween-20的PBS将各孔洗涤3次。于含有0.1％BSA的PBS中将重组生物素化小鼠IL-13(R&D Systems)稀释为0.1μg/ml；添加50μl/孔且在室温下将平板培育1小时。以含有0.05％Tween-20的PBS将各孔洗涤3次。于含有0.1％BSA的PBS中按1∶20000稀释链霉抗生物素蛋白HRP(Pierce#21126，Rockland，IL)；添加50mL/孔且在室温下将平板培育1小时。以含有0.05％Tween-20的PBS将各平板洗涤3次。将50微升TMB溶液(Sigma#T0440，St.Louis，MO)添加至各孔且在室温下培育10分钟。通过添加1N硫酸停止反应。在450nm波长下分光光度计读取平板。间接ELISA的结果指示mAb 3H7能够结合mIL-13。在后续生物测定中显示3H7可以以剂量依赖型方式抑制mIL-13刺激的TARC产生，IC50值为2.4nM。Biacore分析也证明3H7与mIL-13阳性结合，KD为12nM。表8中的所有其它mAb并未显示与小鼠IL-13的任何阳性结合。
在A-548生物测定中也测定抗hIL-13mAb抗非人类灵长类(猕猴)IL-13和羊IL-13的中和效能。为产生犬和羊IL-13，使用基于人类IL-13序列的退化引物通过染色体组DNA模板的PCR获得各蛋白的cDNA。随后将重组犬和羊IL-13蛋白表达于瞬时转染COS细胞中。在所有功能研究中，也平行产生野生型人类IL-13作为对照。A-549细胞以与人类IL-13类似的ED50对犬和羊IL-13作出应答。多数mAb中和犬IL-13的活性，证明对犬IL-13的交叉反应性(表7)。然而，抗体皆未显示显著羊IL-13中和。
实施例1.2.C.2：鼠类单克隆抗人类IL-13抗体阻断IL-13与IL-13受体 (IL-13Rα1和IL-13Rα2)的结合
IL-13活性经由由IL-13Rα1与IL-4Rα链组成的受体复合体介导。细胞因子首先在细胞表面上与IL-13Rα1进行相对低亲和力相互作用。IL-13/IL-13Rα1复合体随后招募IL-4Rα以形成完整IL-13受体，其以高亲和力与其配体(IL-13)结合(Zurawski等人(1993)EMBO J.12：2663；Zurawski等人(1995)J.Biol.Chem.270：23869)。随后IL-13与高亲和力受体的结合经由包括转录(JAK-STAT)途径的Janus激酶信号转导蛋白和活化因子的IL-4Rα链发送下游信号，例如经由STAT6磷酸化，其可作为对IL-13的最初细胞反应的一个监控(前述Murata等人)。
存在另一IL-13结合受体IL-13Rα2链(IL-13Rα2)，其以高亲和力(0.25-1.2nM)与IL-13结合(Caput等人，1996J.Biol.Chem.271，16921-16926；Donaldson等人，1998J.Immunol.161，2317-2324)。已知无其它受体分子包括在IL-13/IL-13Rα2复合体中。最初认为IL-13Rα2充当非信号传导“诱饵”受体。然而，后来发现其可与IL-13结合且经由AP-1途径传输信号，使得在包括巨噬细胞的某些细胞类型中TGF-β产生，其接着导致肺部纤维化(Fichtner-Feigl.2006Nat Med 12：99-106)。因此，IL-13Rα1/IL-4R复合体与IL-13Rα2途径造成哮喘和其它IL-13介导的疾病的总病理生理学。例如表位作图、受体结合测定、尺寸排阻层析法(SEC)和另一BIACORE分析的数种方法用以阐明本发明的抗IL-13抗体与人类IL-13之间的相互作用。
为测定上文所述的单克隆抗体是否能够阻断IL-13与IL-13受体(IL-13Rα1和IL-13Rα2)的结合，受体结合ELISA开展如下。在4℃下以于100μl/孔涂布缓冲液(碳酸盐-碳酸氢盐缓冲剂，Pierce)中的4μg/ml重组IL-13Rα1/Fc或IL-13Rα2/Fc(R&D Systems)涂布高结合96孔ELISA平板。16小时后，通过在接收器中轻打平板内含物来除去涂布溶液，且以Superblock阻断缓冲液(240μl/孔)(Pierce)洗涤且阻断平板4次。添加抗IL13mAb(自40μg/ml 1∶4系列稀释，50μl/孔)和生物素-IL-13(50μl/孔，对于hIL-13Rα1/Fc最终浓度为5nM且对于hIL-13Rα2/Fc 0.5nM)且在室温下(RT)培育2小时。以300μ10.1％PBST将平板洗涤5次，且随后添加100μl的按1∶5000稀释的小鼠抗-生物素MAb(Jackson Immunosciences)且在RT下培育45分钟。以300μl 0.1％PBST将平板再洗涤5次，接着添加TMB底物试剂(100μl/孔，Pharmingen)；发展5min，且通过添加50μl 2M H2SO4(VWR)停止。在450nm通过分光光度测定法测定OD。
另外，也通过受体结合测定使用IL-13Rα2转染的COS细胞评估mAb的受体阻断特性。如先前所述，以125I(Amersham，ArlingtonHeights，IL)使用IODO-GEN试剂(Pierce，Rockford，IL)标记重组人类IL-13(Obiri NI等人，(1995)J Biol Chem.270：8797-8804)。据估计放射性标记的IL-13的比活性为158μCi/μg蛋白。如A-549生物测定所评估，标记的IL-13显示与未标记IL-13类似的生物活性。对于结合实验，以人类IL-13Rα2通过脂质胺2000(Invitrogen)瞬间转染COS细胞且培育48小时。在4℃在1μM未标记IL-13存在或不存在条件下，以1.0nM125I-IL-13将转染的COS细胞(5×105个细胞于100μL结合缓冲液中：含有0.2％人血清白蛋白和10mmol HEPES的RPMI 1640)培育2小时。通过离心经由邻苯二甲酸酯油梯度将细胞结合的125I-IL-13与未结合125I-IL-13分离，且以γ粒子计数管(Wallac，Gaithersburg，MD)测定放射能。对于抗体置换测定，如上所述在增加浓度(高达50μg/ml)的抗IL-13抗体存在或不存在条件下，以125I-IL-13(1.0nM)培育转染的COS细胞。2种形式的受体结合测定均证明以下：首先13C5和9C11阻断IL-13与IL-13Rα1结合；其次，13C5强烈阻断IL-13与IL-13Rα2结合(在细胞表面RBA与RBELISA中IC50值为约1-3nM)，而9C11以低效能阻断IL-13与IL-13Rα2结合(IC50值＞10nM)；且再次，5G1与3E5未能阻断IL-13与IL-13Rα1或IL-13Rα2结合。也分析3种其它抗IL-13抗体BAK.502G9(CAT PCT WO 2005/007699)、mAbl3.2(Wyeth PCT WO2005/123126 A2)和MJ2-7(Wyeth PCT WO 2006/0073148 A1)在受体结合ELISA与细胞表面RBA中阻断人类IL-13与人类IL-13Rα2结合的能力。抗体mAb 13.2并不阻断IL-13与IL-13Rα1或IL-13Rα2结合。BAK502G9和MJ2-7能够阻断IL-13与IL-13Rα1结合；然而其在以高达50μg/ml(330nM)的抗体浓度阻断IL-13与IL-13Rα2结合中显示低效能。
也在抗IL-13mAb存在下通过BIACORE分析IL-13与IL-13Rα1/α2之间的相互作用。以几个形式进行此分析。首先，在存在且缺少抗IL-13mAb条件下IL-13Rα1/Fc与Biacore芯片结合，且IL-13溢出芯片。MAb13C5和9C11尤其能够阻断IL-13与IL-13Rα1结合，而5G1和3E5未能抑制IL-13与IL-13Rα1结合，与受体结合测定一致。其次，IL-4R与BIACORE芯片结合，且与IL-13Rα1预结合的IL-13复合体溢出芯片。在无抗IL-13 mAb存在下，证明形成三分子复合体。然而，向与IL-13Rα1预结合的IL-13的混合物添加抗IL-13抗体5G1预防IL-4R结合在芯片上。此指示即使5G1不能阻断IL-13与IL-13Rα1结合，其可阻断IL-13结合至IL-4R的结合，为其IL-13中和活性提供机械基础。这些观测结果通过尺寸排阻层析法(SEC)进一步确认，而观察到5G1而非13C5的杂三聚复合体(mAb-IL-13-IL-13Rα1/Fc)。使用蛋白酶处理mAb-IL-13复合体进行后续表位作图研究，接着质量规格分析指示以下：首先5G1与包括N末端11-aa肽(GPVPPSTALRE)、覆盖已显示与IL-4R相互作用(Moy等人，2001 J Mol Biol.310：219和Horita等人，(2001)J Mol Biol.310：231)的螺旋A区域的一部分的IL-13残基结合。其次，抗体9C11与介于螺旋C与螺旋D之间的区域(VSAGQFSSLHVR)相互作用；且再次，抗体13C5与包括覆盖螺旋D(VRDTK IEVAQFVKDL LLHLK KLFRE GR，对应于SEQ ID NO 1的氨基酸104-130)的区域的IL-13残基相互作用。已显示螺旋D与IL-13受体相互作用(Moy等人，2001 J Mol Biol.310：219；Horita等人，2001 J Mol Biol.310：231；和Madhankumar等人2002JBC 277：43194)。由于13C5比猕猴IL-13(KD＝1800pM)更强烈地结合人类IL-13变体(KD＝50pM)，且在此可能的13C5表位区域中人类IL-13变体与猕猴IL-13之间的唯一序列差异为位置120处人类IL-13的L，而犬IL-13的V，吾人产生V120L突变体犬IL-13且测试此突变对13C5是否将具有相对于野生型犬IL-13增加的结合亲和力。基于Biacore和生物测定结果，13C5对V120L突变体犬IL-13的结合亲和力以及中和效能等于对野生型犬IL-13的结合亲和力以及中和效能，指示C末端区域中位置120的此V/L差异并未促进对于人类IL-13变体相对于犬IL-13的13C5亲和力差异，且C末端区域外须存在其它促进13C5对人类和犬IL-13的差示结合亲和力的残基。此与通过西方转渍分析13C5并未识别变性人类IL-13的观测结果一致，指示人类IL-13上13C5的结合表位是强烈构象的。
结合和表位作图研究指示5G1并未抑制IL-13与IL-13Rα1相互作用，而破坏IL-13/IL-13Rα1与IL-4Rα的相互作用。认为此破坏干扰功能IL-13信号传导复合体的形成。这些观测结果提供在例如A-549细胞的IL-13Rα1/IL-4R介导的系统中中和此抗体活性的理论模型。相反，13C5阻断IL-13与IL-13Rα1和IL-13Rα2结合。有趣地，即使9C11能够阻断IL-13与IL-13Rα1结合，其仅显示部分(或低效能)抑制IL-13与IL-13Rα2结合。尽管IL-13Rα1和Rα2采用类似三维折叠和IL-13结合取向，其具有低序列同一性且因此负责IL-13结合的特异性残基可变(Arima 2005 JBC 280：24915；和Madhankumar等人2002 JBC 277：43194)。因而，IL-13上的结合IL-13Rα1和IL-13Rα2的特异性残基可不同，其可解释9C11的差示受体阻断特性。
上文所述的受体结合测定、表位作图、Biacore和生物测定共同指示中和抗IL-13抗体可经由以下机制抑制IL-13相关的活性：
1)通过在与受体结合IL-13Rα1和IL-13Rα2有关的区域中与IL-13相互作用抑制IL-13与IL-13Rα1和IL-13Rα2结合。所述抗体的一实施例为13C5。这样的抗体将经由IL-13Rα1/IL-4R复合体和IL-13Rα2抑制IL-13信号传导。
2)并未抑制IL-13与IL-13Rα1或IL-13Rα2结合。然而，抗体抑制与IL-4受体的相互作用，因此抑制IL-13经由IL-13Rα1/IL-4R复合体传输信号。所述抗体不可抑制IL-13Rα2传输信号。这样的抗体的实施例为5G1和mAbl 3.2(Wyeth PCT WO 2005/123126)。
3)抑制IL-13与IL-13Rα1结合，但低效地抑制IL-13与IL-13Rα2结合。此可由于下列理由而发生：a)表位：与IL-13Rα1结合有关但与IL-13Rα2结合无关，或与IL-13Rα2结合不强烈相关的区域。一实施例为9C11；b)亲和力：由于IL-13Rα2具有比IL-13Rα1对IL-13更高的亲和力，因此在治疗抗体的生理浓度下，低亲和力抗体可能阻断IL-13与IL-13Rα1结合，而不阻断与IL-13Rα2结合。一实施例为BAK502G9，如Biacore所评估其对重组野生型人类IL-13显示2.11nM亲和力(CATPCT WO 2005/007699)。另一实例为MJ2-7，如Biacore所评估其对重组野生型人类IL-13显示1.4nM亲和力且对猴IL-13显示更高亲和力(43pM)(Wyeth PCT WO 2006/0073148 A1)。因亲和力差异，此mAb可有效地抑制猴IL-13与IL-13Rα2结合；然而其以更低效能抑制人类IL-13与相同受体结合。
mAb BAK502G9和MJ2-7具有类似表位(CAT PCT WO2005/007699和Wyeth PCT WO 2006/0073148A1)且如竞争ELISA所评估其竞争与IL-13结合。简言之，BAK502G9经固定在ELISA平板上，接着洗涤且阻断。随后在各种浓度的MJ2-7(0.2ng/ml至20μg/ml)存在下将生物素化人类IL-13(10ng/ml)添加至平板，接着洗涤且使用HRP-结合的抗生物素抗体检测。此研究证明MJ2-7剂量依赖型与BAK502G9竞争结合至人类IL-13。阴性对照IgG并未显示与BAK502G9竞争。
实施例1.2.D：测定各鼠类抗人类IL-13mAb的可变域的氨基酸序列
对于各氨基酸序列测定，通过离心分离约10×106杂交瘤细胞且遵循制备商的指导经以Trizol处理分离总RNA(Gibco BRL/Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用Superscript First-Strand Synthesis System(Invitrogen，Carlsbad，CA)按制备商的指导使总RNA经受第一链DNA合成。寡(dT)用以引发第一链合成以选择聚(A)+RNA。随后通过PCR以经设计用于扩增鼠类免疫球蛋白可变域的引物(Ig-引物组，Novagen，Madison，WI)扩增第一链cDNA产物。在琼脂糖凝胶上解析PCR产物、切除、纯化且随后以TOPO克隆试剂盒次克隆于pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中且经转化于TOP 10化学上胜任大肠杆菌(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。对转化克隆进行集落PCR以鉴定含有插入物的克隆。使用QIAprep Miniprep试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)由含有插入物的克隆分离质粒DNA。对质粒中的插入物的2股进行定序，以使用Ml3前置和Ml3反置引物(Fermentas Life Sciences，HanoverMD)测定可变重链或可变轻链DNA序列。实施例1.2.C中描述的17个单克隆抗体的可变重链和可变轻链序列描述在表5中。
实施例2：重组抗人类IL-13抗体
实施例2.1：构建且表达重组嵌合抗人类IL-13抗体
通过在细菌中同源性重组，由编码含有2个铰链区氨基酸突变的人类IgGl恒定区的cDNA片段置换编码鼠类抗人类IL-13单克隆抗体5G1、13C5、9C11、21D9和3H7的重链恒定区的DNA。这些突变为位置234(EU编号)的亮氨酸至丙氨酸改变和位置235的亮氨酸至丙氨酸改变(Lund等人，1991，J.Immunol.，147：2657)。由人类κ恒定区置换这些抗体的每一个的轻链恒定区。通过共转染连接在pBOS表达质粒中的嵌合重链和轻链cDNA，将全长嵌合抗体瞬时表达于COS细胞中(Mizushima和Nagata，Nucleic Acids Research 1990，第18卷，第5322页)。通过蛋白A琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，且通过添加酸缓冲液洗脱结合的抗体。中和抗体且透析到PBS中。
随后如实施例1.1.C2和1.1.C3中所述测试纯化的嵌合抗人类IL-13单克隆抗体的抑制A-549细胞经IL-13诱导产生TARC的能力。表12显示3种嵌合抗体的A-549生物测定的IC50值。
表9：A-549生物测定中rhIL-13wt通过抗IL-13嵌合抗体的中和
嵌合 平均IC50(M)
5G1-Chim 4.10E-11
13C5-Chim 1.91E-10
9C11-Chim 1.23E-10
实施例2.2：构建和表达人源化抗人类IL-13抗体
实施例2.2.1：选择人类抗体框架
使用载体NT1软件相对于44人免疫球蛋白种系可变重链或46种系可变轻链序列(获自NCBI Ig Blast网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.)分别比对各鼠类可变重链和可变轻链基因序列(如表3中所述)。
人源化基于氨基酸序列同源性、CDR聚类分析、表达的人类抗体的使用频率和关于人类抗体的晶体结构可得到的信息。考虑到对抗体结合、VH-VL配对和其它因素的可能的影响，若鼠类和人类框架残基不同，除数种例外，则使鼠类残基突变为人类残基。基于与鼠类抗体可变域的实际氨基酸序列具有高度同源性(也即序列相似性)人类种系抗体序列或其亚组的分析设计其它人源化策略。
使用同源性建模以鉴定经预测对于抗体组合位点(CDR)的结构关键的鼠类抗体序列的独特残基。同源性建模为计算法，藉以产生蛋白的近似三维坐标。初始坐标和其进一步细化的指导的源为第二蛋白，参考蛋白，其的三维坐标已知且其的序列与第一蛋白的序列有关。2种蛋白的序列之间的关系用以在参考蛋白与需坐标的蛋白(标靶蛋白)之间产生对应。将参考和标靶蛋白的初始序列与直接自参考蛋白转移至标靶蛋白的2个蛋白的相同部分的坐标对准。由通用结构模板建构2个蛋白的自(例如)残基突变、插入或缺失的错配部分的坐标，且精制能量以确保与已转染模型坐标一致。此计算蛋白结构可另外精制或直接用于建模研究中。自此说明应清楚模型结构的质量由参考与标靶蛋白相关且序列对比构建的精度的论点的准确度决定。
对于鼠类序列5G1、13C5和9C11，BLAST研究与视觉检查的组合用以鉴定适当参考结构。认为参考与标靶氨基酸序列之间25％的序列同一性为尝试同源性建模练习所必需的最小值。手动构建序列对比且以程序Jackal产生模型坐标(参见Petrey，D.，Xiang，Z.，Tang，C.L.，Xie，L，Gimpelev，M.，Mitros，T.，Soto，C.S.，Goldsmith-Fischman，S.，Kernytsky，A.，Schlessinger，A.等人2003.Using multiple structurealignments，fast model building，and energetic analysis in fold recognitionand homology modeling.Proteins 53(增刊6)：430-435)。
所选择抗体的鼠类与人类框架区域的初始序列具有显著同一性。不同的残基位置为在人源化序列中包括鼠类残基以保留所观察到的鼠类抗体结合效能的候选者。手动构建人类与鼠类序列之间不同的框架残基的列表。
给定框架残基将影响抗体的结合特征的可能性依赖于其与CDR残基的接近度。因此，使用模型结构，将鼠类与人类序列之间不同的残基根据其距CDR中任何原子的距离排列。那些属于任何CDR原子的的残基经鉴定为最重要残基，且推荐其为在人源化抗体中保留的鼠类残基(也即回复突变)的候选者。
对于5G1可变域的人源化，以下为本发明提供的通用方法。首先，借助于计算器程序ABMOD和ENCAD(Levitt，M.，J.Mol.Biol.168：595-620(1983))构建5G1可变域的分子模型。接着，基于相对于人类V和J片段序列的同源性调查，选择VH片段21/28(Dersimonian，H.，等人，J.Immunol.139：2496-2501(1987))和J片段JH4(Ravetch，J.V.，等人，Cell 27：583-591(1981))以提供Hu5Gl重链可变域的框架。对于5G1轻链可变域，使用VL片段HF-21/28(Chastagner，P.等人，Gene 101：305-306(1991))和J片段JK4(Hieter，P.A.等人，J.Biol.Chem.257：1516-1522(1982))。5G1VH与受体人类21/28和JH4片段之间的框架氨基酸同一性为72％，而5G1VL与受体人类HF21/28和JK4片段之间的同一性为83％。在其中计算器模型表明与CDR显著接触的框架位置，自小鼠V区域的氨基酸取代原始人类框架氨基酸。此在重链的残基48、67、68、70、72、74和97进行。对于轻链，在残基50进行替换。在对应人类V区域亚组中的个别位置仅很少出现的框架残基经那些位置的人类一致氨基酸替换。此在重链的残基44和76，和轻链的残基2、15、41、42、44和51进行。
对于13C5可变域的人源化，以下为本发明提供的通用方法。首先，借助于计算器程序ABMOD和ENCAD(Levitt，M.，J.Mol.Biol.168：595-620(1983))构建13C5可变域的分子模型。接着，基于相对于人类V和J片段序列的同源性调查，选择VH片段M60(Schroeder，Jr.，H.W.和Wang，J.Y.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6146-6150(1990))和J片段JH4(Ravetch，J.V.，等人，Cell 27：583-591(1981))以提供Hul3C5重链可变域的框架。对于Hul3C5轻链可变域，使用VL片段III-3R(Manheimer-Lory，A.等人，J.Exp.Med.174：1639-1652(1991))和J片段JK4(Hieter，P.A.等人，J.Biol.Chem.257：1516-1522(1982))。13C5VH与受体人类M60和JH4片段之间的框架氨基酸的同一性为74％，而13C5VL与受体人类III-3R和JK4片段之间的同一性为75％。
在其中计算器模型表明与CDR显著接触的框架位置，自小鼠V区域的氨基酸取代原始人类框架氨基酸。此在轻链的残基22、49和71进行。在对应人类V区域亚组中的个别位置仅很少出现的框架残基经那些位置的人类一致氨基酸替换。此在重链的残基10、46、83、84、86和87和轻链的残基62和73进行。
人源化mAb的VL和VH氨基酸序列显示于表10中。
表10：人源化mAb的氨基酸序列的列表
实施例2.2.2：构建人源化抗体
使用寡核苷酸更始构建上文所述的计算机试验构建的人源化抗体。对于各可变域cDNA，各60-80个核苷酸中的6个寡核苷酸经设计以由20个核苷酸在各寡核苷酸的5′和/或3′端彼此重叠。在退火反应中，组合所有6个寡聚物、使其沸腾且在dNTP存在下退火。随后添加DNA聚合酶I大(Klenow)片段(New England Biolabs#M0210，Beverley，MA)以填充重叠寡核苷酸之间的约40bp缺口。随后进行PCR以使用2个含有与修饰的pBOS载体中多个克隆位点互补的外伸序列的最外引物扩增整个可变区域基因(Mizushima，S.且Nagata，S.，(1990)Nucleic acidsResearch第18卷，第17号)。在琼脂糖凝胶上分离源自各cDNA组装的PCR产物，且切除并纯化对应于所预测可变域cDNA尺寸的条带。通过在细菌中同源性重组将可变重链区域于框中插至编码含有2个铰链区氨基酸突变的人类IgGl恒定区的cDNA片段上。这些突变为位置234(EU编号)的亮氨酸至丙氨酸改变和位置235的亮氨酸至丙氨酸改变(Lund等人，1991，J.Immunol.，147：2657)。通过同源性重组将可变轻链区域与人类κ恒定区一起插入框中。分离菌落且提取质粒DNA；将cDNA插入物全部定序。将对应于各抗体的正确人源化重链和轻链共转染于COS细胞中以瞬时产生全长人源化抗人类IL-13抗体。对于13C5，将含有13C5重链移植cDNA和13C5轻链移植cDNA的pBOS载体共转染于COS细胞中。通过蛋白A琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液且通过添加酸缓冲液洗脱结合的抗体。中和抗体且透析于PBS中。几个人源化抗体描述在表10中。
如实施例1.1.C中所述使用A-549生物测定测定纯化的人源化抗体抑制IL-13活性的能力。如实施例1.1.B中所述，使用表面等离子体共振测定来测定人源化抗体对重组人类IL-13的结合亲和力。表11显示A-549生物测定的IC50值和表10中描述的前6种人源化抗体对人类IL-13wt和变体的亲和力。
表11：人源化抗IL-13mAb的中和效能和亲和力
使用在本领域中是已知的技术使人源化抗体13C5.5的CDR序列进一步突变，且产生3种其它人源化抗体。如实施例1.1.C中所述使用A-549生物测定测定这些其它人源化抗体抑制人类、猕猴和恒河猴IL-13活性的能力。如实施例1.1.B中所述，使用表面等离子体共振测定来测定其它人源化抗体对重组人类、猕猴和恒河猴IL-13的结合亲和力。除结合和抑制人类IL-13外，这些3种其它抗体对猕猴和恒河猴IL-13显示增强的亲和力。表12显示A-549生物测定的IC50值，且表13显示其它人源化抗体对人类、猕猴和恒河猴IL-13的亲和力。
表12：其它人源化抗IL-13mAb的中和效能
表13：其它人源化抗IL-13mAb的结合亲和力
实施例2.2.3：人源化抗IL-13抗体的表征
已分离阻断IL-13与IL-13Rα1和IL-13Rα2结合的单克隆抗体。细胞表面上基于ELISA的受体结合测定与125-I-标记的IL-13结合测定均证明鼠类形式与人源化形式(也即13C5.5)的13C5均能够有效阻断IL-13与两种受体的结合。与13C5相同谱系中的包括25C8和33C3的抗体也能够阻断IL-13与两种受体结合。
实施例2.2.3.a：人源化抗IL-13抗体阻断IL-13与IL-13受体的结合
为测定人源化抗体13C5.5阻断IL-13与IL-13受体(IL-13Rα1和IL-13Rα2)结合的能力，使用基于ELISA的受体结合测定。在4℃下，以于100μl/孔涂布缓冲液(碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，Pierce)中4μg/ml的重组人类IL-13Rα1/Fc或IL-13Rα2/Fc(R&D Systems)涂布高结合96孔ELISA平板。16小时后，通过在接收器中轻打平板内含物来除去涂布溶液，且以Superblock阻断缓冲液(240μl/孔)(Pierce)洗涤且阻断平板4次。添加人源化抗IL-13mAb 13c5.5和对照mAb(自40μg/ml 1∶4系列稀释，50μl/孔)和生物素-IL-13(50μl/孔，对于hIL-13Rα1/Fc最终浓度为5nM，且对于hIL-13Rα2/Fc最终浓度为0.5nM)且在室温下(RT)培育2小时。以300μl 0.1％PBST将平板洗涤5次，且随后添加100μl按1∶5000稀释的小鼠抗生物素MAb(Jackson Immunosciences)且在RT下培育45min。以300μl 0.1％PBST将平板再洗涤5次，接着添加TMB底物试剂(100μl/孔，Pharmingen)；发展5min，且通过添加50μl 2MH2SO4(VWR)停止。在450nm通过分光光度测定法测定OD。结果显示于表14中。
另外，也使用IL-13Rα2转染的COS细胞通过基于细胞表面的受体结合测定评估人源化mAb的受体阻断特性。如先前所述，以125I(Amersham，Arlington Heights，IL)使用IODO-GEN试剂(Pierce，Rockford，IL)标记重组人类IL-13(Obiri NI等人，(1995)J Biol Chem.270：8797-8804)。据估计放射性标记IL-13的比活性为158μCi/μg蛋白。如A-549生物测定所评估，标记的IL-13显示与未标记IL-13类似的生物活性。对于结合实验，通过脂质胺2000(Invitrogen)将COS细胞以人类IL-13Rα2瞬时转染且培育48小时。在4℃下，在具有或无1μM未标记IL-13的情况下，以1.0nM 125I-IL-13将转染的COS细胞(于100μl结合缓冲液中5×105细胞：含有0.2％人血清白蛋白和10mmolHEPES的RPM1 1640)培育2小时。通过离心经由邻苯二甲酸酯油梯度将细胞结合的125I-IL-13与未结合125I-IL-13分离，且以γ粒子计数管(Wallac，Gaithersburg，MD)测定放射能。对于抗体置换测定，如上所述在增加浓度(高达50μg/ml)的人类抗IL-13抗体13C5.5存在或不存在条件下，以125I-IL-13(1.0nM)培育转染的COS细胞。结果显示于表14中。
表14：mAb在基于细胞表面和基于ELISA的受体结合测定中阻断人类IL-13(wt)与人类IL-13Rα2结合的效能
P.B.并未达到50％抑制的部分阻断。
表15显示人源化13C5.5抗体和其它抗IL-13抗体的结合亲和力。表15：如Biacore所评估，抗IL-13mAb的结合亲和力
在基于细胞表面和基于ELISA的受体结合测定中，13C5.5在阻断人类IL-13与人类IL-13Rα2结合中显示高效力，IC50值在1与3nM之间。BAK502G9与MJ2-7也能够降低结合信号，其效能比13C5.5低的多(参见表14)，至少部分因其对人类wt IL-13(参见表15)的低亲和力。MAb 13.2不能抑制IL-13与IL-13Rα2结合，与其表位一致。另外，在两种测定中，13C5.5在100nM(或15μg/ml)浓度下可实现100％抑制。在相同浓度下，BAK502G9和MJ2-7在基于细胞表面的受体结合测定中仅分别显示40％与70％抑制，且两者在基于ELISA的受体结合测定中仅显示60％抑制。
对于人类血清半衰期在10与20天之间的治疗性mAb，在每周或双周IV或SC 3mpk或以下的给药方案情况下血清浓度通常在5-15μg/ml之间。基于此计算，13C5.5为在单克隆抗体的习知给药方案条件下，作为治疗性mAb在100nM(或15μg/ml)的血清浓度下，当前唯一可能完全体内(100％)阻断人类IL-13与IL-13Rα2结合的抗IL-13mAb。
实施例2.2.3.b：抗IL-13抗体与IL-13上特异性表位的结合
使用表位切除技术，接着以质谱(MS)进行肽分析来将人类IL-13上抗IL-13mAb 13C5、13C5.5、9C11和5G1结合的表位作图。在表位切除中，首先使蛋白与固定的mAb结合且随后以蛋白水解酶消化。通过使用MS和MS/MS鉴定含有表位的肽来测定蛋白上的表位区域。将CNBr活化的琼脂糖珠粒(Amersham Biosciences，10mg/反应)悬浮于500μL 0.1M HCl中且平衡15min。将珠粒转染于致密反应塔(USBCorporation)中且以0.1M HCl接着以0.1M NaHCO3偶联缓冲液洗涤。将mAb(100μg)添加至悬浮液中且在缓慢旋转条件下在室温下培育2h。以约pH 8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液洗涤与mAb共价连接的珠粒。通过以约pH 8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液培育2h，实现CNBr琼脂糖珠粒上的未反应基团的阻断。通过以2种不同pH的缓冲液顺序洗涤除去未偶联的mAb：1)0.1M乙酸Na、0.5M NaCl，约pH 4.0缓冲液；和2)0.1M Tris-HCl、0.5M NaCl，约pH 8.0缓冲液。使珠粒在PBS～0.14M NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4，pH 7.2中平衡且在IL-13存在或不存在条件下在室温下培育2h。以PBS约pH 7.2洗涤珠粒后，移出悬浮液的等分试样以用于MALDI-TOF分析。
以不同蛋白酶(1∶100-1∶20酶∶底物比率)将亲和力结合蛋白消化12h。所用蛋白酶包括：胰蛋白酶、GluC、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶Y和胺基肽酶M。蛋白水解后，以500μL消化缓冲液洗涤珠粒。留下最终100μL洗涤液作为对照。将约100μL 2％TFA添加至珠粒且收集。首先在真空下将对照和酸洗涤液浓缩至约20μL。随后以C18 ziptip将肽脱盐。通过MALDI-ToF MS使用Voyager DE或Voyager DE-Pro系统分析样品。在与Sciex Q-Star Pulsar i MS系统连接的Agilent 1100Capillary HPLC系统上进行纳米-ESI-LC-MS/MS分析。
在研究13C5的表位中，2个用于连续步骤的蛋白酶得到最优选结果。以胰凝乳蛋白酶检测到由SEQ ID NO：1的氨基酸残基100-130组成的主要肽，指示其可含有表位。也检测到SEQ ID NO：1的氨基酸残基103-130和104-130的少量肽。胰凝乳蛋白酶消化后使用胺基肽酶M。所检测到的主要肽为SEQ ID NO：1的氨基酸残基104-130，暗示4N末端氨基酸残基(80-83)不为表位的一部分。以羧肽酶Y进一步消化使得亲和力损失。消化和洗涤后未观察到肽。使用纳米-ESI-LC-MS/MS确认所有肽序列。
13C5和13C5.5的表位作图指示其结合位点包括人类IL-13的C末端螺旋D区(残基VRDTK IEVAQ FVKDL LL HLK KLFRE GR，对应于SEQ ID NO：1的氨基酸104-130)。已提出C末端螺旋D区涉及于与IL-13受体的相互作用中(Zuegg等人2001Immunol Cell Biol.79：332-9)。
实施例2.3：与IL-13复合的抗IL-13的结晶
使13C5.5的Fab部分与人类IL-13复合且复合体的晶体产生如下。
实施例2.3.1：13C5.5Fab片段的制备和纯化
为制备13C5.5Fab片段，首先使用Ultrafree-15 Biomax 10kDa分子量截断(MWCO)离心过滤装置(Millipore)将于0.15M PBS缓冲液中的13C5.5IgG浓缩至2mg/ml。以1∶1体积比缓冲液A(20mM Na2HPO4、10mM EDTA、20mM半胱氨酸)预洗涤木瓜蛋白酶凝胶浆液(Pierce)且馈入2-3X。随后将浓缩的抗体与50％木瓜蛋白酶凝胶浆液混合且在37℃下在剧烈振荡下培育24小时。离心(Beckman 6KR)抗体/浆液混合物且将上清液装载于PBS预平衡的Superdex 75上。洗脱主要峰且汇集蛋白。通过以100mL PBS洗涤来制备25mL蛋白A琼脂糖4快速流动亲和柱(Amersham Pharmacia)。将所汇集抗体片段施加于亲和柱(流动速率2mL/min)上。在流出物中收集合有13C5.5Fab片段的级份(通过280nm下的UV吸光度监控)。汇集合有浓度大于0.3mg/ml的13C5.5Fab片段(通过280nm下的UV吸光度测定)的级份且冷冻于-80℃下。以SDS-PAGE评估样品纯度。
实施例2.3.2：IL-13/13c5.5Fab复合体制备
将重组人类IL-13表达于哺乳动物表达系统中且随后使用在本领域中熟知的技术纯化。以1∶1摩尔比混合重组人类IL-13与13C5.5Fab蛋白且在4℃下培育1小时。以0.5ml/min将复合体样品负载于预平衡(20mM Tris pH 7.5，150mM NaCl)的Superdex 200管柱上。将复合体汇集且使用Ultrafree-15Biomax 10kDa分子量截止(MWCO)离心过滤装置(Millipore)浓缩至24mg/ml且冷冻于-80℃下。以SDS-PAGE评估样品纯度。
实施例2.3.3：IL-13/13c5.5Fab复合体的结晶
在冰上将冷冻IL-13/13C5.5复合体储备液(约24mg/ml)解冻。使复合体(1.0μL)与1.0μL储集器溶液(1.75M硫酸铵，100mM MES，pH6.5，10mM CaCl2)混合。在约18℃下将所得滴剂混合于储液器的沈滴孔(CrysChem沉滴板)中。一周后出现菱形晶体。
实施例2.3.4：IL-13/13C5.5Fab复合体晶体的低温保护和急骤冷却
使用纤维环在母液+20％甘油中收集IL-13/13C5.5Fab复合体的晶体。随后通过投入液氮中将晶体急骤冷却。
实施例2.3.5：IL-13/13C5.5Fab复合体的X射线衍射数据收集
在IMCA光束线下在Argonne，IL的高级光子源下收集IL-13/13C5.5Fab晶体的X射线衍射数据。在数据收集期间以OxfordCryosystems Cryostream冷却器将晶体维持在100K的温度下。在1.0°的振荡范围内总计收集到180个框架。以HKL2000程序组(Otwinowski和Minor，1997)处理数据。测定晶体取向后，以DENZO整合数据且标定并以SCALEPACK合并，且置于绝对温标上并以TRUNCATE(French和Wilson，1978)减小为结构因子幅度。以随机方式将5％的独特反射指定为“自由”设定，以用于计算自由R因子(Rfree)(Brünger，1992)；剩余95％的反射构成“工作”设定，用于计算R因子(R)。X射线衍射数据概括于表16中。以下列出标定晶型的指数：(1)1L-13/13C5.5Fab：空间群P2(1)2(1)2(1)、α＝90.0°、β＝90.0°、γ＝90.0°。表17列出数据库的X射线衍射统计。
表16：IL-13/13C5.5Fab复合体的晶体学晶胞信息的总结
表17：IL-13/13C5.5Fab复合体的X射线衍射数据统计的总结
*圆括号中是最高分辨率
实施例2.3.6：IL-13/13C5.5Fab复合体晶体结构的分子替换方案和精制
使用程序PHASER(Read，2001)测定最大似然分子替换方案。在分辨率下在空间群P2(1)2(1)2(1)中解决总共六个13C5.5单体。检索模型为先前报导的Fab晶体结构(Protein Data Bank entry 1BJ1；Muller等人1998)。基于分子替换方案产生坐标。
以上文所述的分子替换方案坐标起始在空间群P2(1)2(1)2(1)中细化IL-13/13C5.5Fab复合体晶体结构。使用刚性躯体精制通过CCP4程序试剂盒(Murshudov等人，1997，Collaborative Computational Project，1994)中可获得的程序REFMAC开始精制，其在产生以下统计：R 40.00％(Rfree 39.00％)。观察到更始IL-13电子密度。以公共IL-13NMR结构1IJZ(Moy等人，2001)使用分子图形程序O(Jones等人，1991)和2Fo-Fc和Fo-Fc电子密度图检查指导6个IL-13单体的手动构建。精制程序REFMAC(Murshudov等人，1997)用于限制精制的迭代轮，产生以下统计：R 25.8％(Rfree 30.5％)。结果显示于表18中。
表18：晶体学精制统计IL-13/13C5.5Fab复合体的总结
实施例2.3.6：IL-13/13C5.5Fab复合体结构
观察到人类IL-13与几个13C5.5CDR广泛接触。抗体-抗原界面上所隐匿面积为接触由使界面稳定的关键氢键与疏水性相互作用组成。包含多数界面接触的2个最小序列片段处于IL-13螺旋A和D上(对于IL-13的结构，参见美国专利公开第2003-0013851A1号，其以引用的方式并入本文中)。这些接触使得CDR的L1与L3，且H2与H3接合。基于上述，表位13C5.5结合范围包含由SEQ ID NO.1的Ser26-Asn38、Lysl23-Argl 30界定的局部区域。表位13C5.5结合范围更优选包含由SEQ ID NO 1的Arg30-Asn38、Lys123-Arg127界定的局部区域。
实施例2.4：人源化IL-13抗体的体内效力
抗hIL-13抗体的体内效力评估如下。
实施例2.4.1：人源化IL-13抗体在人类IL-13诱导的哮喘模型中的体内 效力
在小鼠人类IL-13诱导的哮喘模型中测试抗hlL-13抗体5G1、13C5和13C5.5的效力。以剂量为50μl无菌PBS中1μg、以微型喷雾器使用啮齿动物喉镜以检验气管打开递送至气管中的重组人类IL-13激发小鼠。在研究的第1和2天，给予总计2个剂量的IL-13，且最终激发24小时后，在支气管-肺泡灌洗液体中测定气管高反应性(AHR；Hoymann，H.G.；J Pharmacol Toxicol Methods.2007年1-2月；55(1)：16-26)以及粘液、酸性哺乳动物壳多糖酶(AMC酶；Donnelly LE，BarnesPJ.，1：Trends Pharmacol Sci.2004年10月；25(10)：509-11)和胸腺和活化调节趋化因子(TARC；Bisset LR，Schmid-Grendelmeier P.，CurrOpin Pulm Med.2005 Jan；11(1)：35-42)。在以IL-13第一次激发前一天，通过腹膜内注射施用100、300和1000μg的抗体剂量，且结果概括于表19中。与PBS处理的对照动物相比，并未阻断IL-13与IL-13Rα1或IL-13Rα2结合的5G1抗体在此体内模型中不能以与使用5G1处理的动物中检测到的AHR、AMC酶和Muc5ac相当的水平中和IL-13生物活性。相反，阻断与α1和α2受体结合的13C5抗体有效于降低所有参数。以IL-13处理使得气管阻力自3.6cm H2O/ml/sec增加至5.7cmH2O/ml/sec。以13C5(1000μg)治疗将气管阻力降低至4.3cmH2O/ml/sec。在以抗体治疗情况下，如muc5ac含量所测定的粘液分泌过多自356.5单位降低至最大211U，对应于40％降低。类似地AMC酶含量自202U降低至68U，对应于66％的降低，与TARC含量所观察到的降低可比(n＝10，p＜.05，所有剂量)。重组人源化抗体13C5.5在此模型中证明类似结果。以30μg/ml乙酰甲胆碱激发后，IL-13诱导气管阻力自3.9增加至5.5cm H2O/ml/sec。抗体13C5.5在100、300和1000μg剂量分别抑制气管阻力至4.1、4.45和4.3cm H2O/ml/sec。在100、300和1000μg抗体治疗剂量下，如muc5ac含量所测定，粘液分泌过多自由IL-13处理诱导的247U分别降低至154、30.2和11.1U。此表示以此抗体粘液产生的38、88和96％抑制。IL-13处理诱导130U AMC酶活性，其通过抗体治疗(100、300和1000μg剂量)降低至113、98和55U，表示14、24和68％抑制。这些数据证明阻断IL-13与IL-Rα1和α2结合的13C5和重组人源化抗体13C5.5可中和IL-13诱导的肺中AHR、粘液和AMC酶产生反应，而并未阻断IL-13与α1和α2受体结合的抗体无法有效阻断所有这些生物反应。
表19：抗人类IL-13抗体在IL-13诱导的哮喘模型中的效力
*p＜0.05，学生T-检验，
**p＜0.05，ANOVA，Bonferroni检验，
***p＜0.01，ANOVA，Bonferroni检验
在另一研究中，在小鼠人类IL-13诱导的哮喘模型中比较抗hIL-13抗体BAK502G9、MJ2-7和13C5.5的效力。以剂量为50μl无菌PBS中1μg、在轻度镇静下经鼻递送的重组人类IL-13激发小鼠。在研究的第1和2天给予总共2剂量的IL-13，且在最终激发24小时后在支气管肺泡灌洗液体中测定气管高反应性以及粘液和AMC酶。在首次以以IL-13激发前一天通过腹膜内注射施用1000μg抗体剂量。研究的结果概括于表20中。阻断IL-13与IL-13α1和α2受体结合的13C5.5抗体有效于显著降低所有参数。以30mg/ml乙酰甲胆碱激发后，IL-13处理使得气管阻力自4.2cm H2O/ml/sec增加至7.2cm H2O/ml/sec。13C5.5(1000μg)治疗使得气管阻力降低至4.6cm H2O/ml/sec，降低86.8％。以抗体治疗情况下，如由muc5ac含量所测定的粘液分泌过多自768.2单位降低至412.9U，对应于58.8％的降低。类似地，AMC酶含量自316.5U降低至147U，对应于52％的降低(n＝10，p＜.001)。抑制IL-13与IL-13Rα1结合但并不有效地抑制IL-13与IL-13Rα2结合的BAK502G9和MJ2-7抗体在此模型中证明可比的中和IL-13诱导的AHR的能力。抗体BAK502G9和MJ2-7仅分别将气管阻力自7.2抑制至5.96cm H2O/ml/sec和5.93cm H2O/ml/sec，表示42％和41.5％的AHR降低。在1000μg抗体剂量下，如由muc5ac含量所测定的粘液分泌过多自由IL-13处理所诱导的768.2U降至627.8和380U，分别对应于BAK502G9或MJ2-7抗体的23％和64％抑制。与13C5.5或MJ2-7抗体相比，BAK502G9抗体抑制AMC酶的有效性较低。IL-13处理诱导316.5U AM酶活性，其由BAK502G9或MJ2-7抗体处理(1000μg剂量)降低至279和169U，分别表示8％和45％抑制。这些数据证明阻断IL-13与IL-13Rα1和α2结合的重组人源化抗体13C5.5最有效于中和肺中IL-13诱导的AHR、粘液和AMC产生反应，而以低亲和力阻断IL-13与IL-13α2受体结合的抗体不太有效于阻断这些造成哮喘发病机制的生物反应。
表20：IL-13诱导的哮喘模型中13C5.5、BAK502G9与MJ2-7抗体的比较
实施例2.4.2：IL-13抗体在OVA-诱导的哮喘小鼠模型中的体内效力
为测定受体阻断特性(尤其关于IL-13Rα2)是否影响mAb在哮喘小鼠模型中的体内效力，如受体结合ELISA使用mIL-13Rα1/Fc和mIL-13Rα2/Fc蛋白(R&D Systems)(参见表21)所测定，产生一组显示不同受体阻断特性的大鼠抗小鼠IL-13抗体。由于抗hlL-13 mAb 3H7与小鼠IL-13交叉反应，其抗mIL-13特性也包括在表21中。使用BIACORE测定相对于重组小鼠IL-13(R&D Systems)测定抗体对小鼠IL-13的结合亲和力，且通过A-549生物测定相对于重组小鼠IL-13测定抗体抗小鼠IL-13的效能(IC50)。51D9和48D3的可变域序列显示于表22中。
表21.抗mIL-13单克隆抗体的表征
表22.大鼠抗mIL-13mAb的VH和VL区域的氨基酸序列的列表
对于鼠类哮喘模型的体内效力研究，动物(雌性Balb/c小鼠)购自Taconic，在Abbott Bioresearch Center圈养，且在8-12周龄时使用。所有方案经IACUC批准。在第0和7天，腹膜内注射于2mg矾(Pierce)中的8μg OVA使小鼠经OVA敏化(Sigma，根据制备商的方案使用DetoxiGel(Pierce)将内毒素自卵白蛋白中移出且最终材料含有小于0.1EU/mg的蛋白)。在第14和16天，动物接受于50ml无菌PBS中的0.3mg OVA的鼻内激发。在第13天以于无菌PBS中的单一腹膜内注射形式施用抗体51D9和48D3(根据标准程序由杂交瘤克隆51D9和48D3的上清液纯化，其含有小于0.1EU/mg的蛋白且通过PCR测试对于啮齿动物病原体为阴性)。在第13-17天以3mg/kg的剂量经口每天施用一次地塞米松(Dexamethasone)(Sigma)。在第17天，第二次OVA攻击24后分析所有终点。使用全血体积描记法评估气管高反应性(AHR)。简言之，以腹膜内注射开他敏(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)诱导麻醉的手术平面。将气管套管手术插于第三与第四气管环之间。通过经颈静脉内注射泮库溴铵(pancuronium bromide)预防自发呼吸，且将动物置于全身体体积描记器(Buxco)中且以0.2ml室内空气在每分钟150次呼吸下使用体积受控通风机(Harvard Apparatus)以机械方式通风。使用变换器测定肺部压力和体积描记器内的气流，且使用Biosystem Xa软件将肺阻力计算为压力/气流。测定基线阻力以及以使用管内超音喷雾器递送的乙酰甲胆碱(3、10&30mg/ml)激发后的阻力。完成肺功能测试后，以0.5ml无菌PBS将肺灌洗4次。分析灌洗液体的TARC、AMC酶和细胞渗透。收集血清以量化研究结束时的抗体含量。
通过ELISA(R&D)根据制备商的方案测定鼠类TARC含量。在支气管肺泡灌洗(BAL)液体(在80μM 4-甲基伞形基β-D-N，N′-二乙酰基壳二糖苷(chitobioside)存在下，以0.01％BSA、30mM柠檬酸钠、60mM磷酸钠pH 5.2稀释1至10倍)中测定AMC酶活性。在室温下将反应物培育15分钟，且通过添加100μL 1M甘氨酸/NaOH pH 10.6终止。通过在460nm的荧光发射，使用在385nm的激发在Fluoroskan Ascent荧光计上测定产物形成。为评估杯状细胞增生，以10％中性缓冲的福尔马林在22cm高度下使肺膨胀15分钟以实现肺表面的区域一致。将切片嵌入石蜡中，切开且以高碘酸雪夫氏(schiff)(PAS)染色。使用ImagePro Plus软件将沿左肺的主支气管的PAS阳性细胞区域定量。通过ELISA测定Muc5ac含量。以BAL液体涂布96孔平板，干燥过夜，且随后添加生物素化抗-Muc5ac抗体且以HRP结合的链霉抗生物素蛋白检测，接着裂解比色底物TMB。
在标准型式的卵白蛋白诱导的小鼠哮喘中测试IL-13Rα1和α2对哮喘发病机制的相对贡献。通过在以卵白蛋白局部激发1天前以抗体处理动物来测试阻断IL-13与α1和α2受体结合的抗体(51D9、54D1和3H7分别以340、24和2430pM的效能)以及仅阻断IL-13与α1受体结合的抗体(48D3，效能为50pM)且结果提供于表23中。以乙酰甲胆碱激发后，OVA攻击诱导肺阻力增加，如BAL液体中增加的Muc5ac含量所测定的粘液分泌过多，以及通过组织学评估增加的上皮细胞PAS阳性染色，肺经嗜伊红性粒细胞&T细胞浸润且产生哮喘有关蛋白AMC酶和TARC。
阻断IL-13与IL-13Rα1和α2结合的抗体均证明试剂的效力和体内效能根据其体外所测定的效能变化。在100、300和1000μg/小鼠的剂量下测试51D9。与非哮喘动物的3.6cm H2O/ml/sec相比，以30mg/ml乙酰甲胆碱激发后，OVA处理导致气管阻力增加至6.2cm H2O/ml/sec。以51D9处理小鼠完全阻止肺阻力增加，其值与非哮喘对照动物中所观察到的对于剂量100、300和1000μg分别为4.1、4.0和3.5cmH2O/ml/sec(n＝8-10/组，p＜.05)的值可比。以51D9观察到的抑制的量与以类固醇处理(3.3cm H2O/ml/sec)所取得的量可比。在以1000μg 51D9处理的动物中，以51D9处理也剂量依赖型地自404单位Muc5ac降至55U抑制粘液分泌过多。通过组织学评估PAS反应性上皮细胞也观察到抑制粘液分泌过多。以300和1000μg剂量的51D9抗体，阳性细胞百分比区域自1.0％降低至0.6％和0.5％，分别表示47-65％(n＝8，p＜.01)的降低。51D9处理也抑制TARC和AMC酶。OVA攻击诱导61pg/ml的TARC，以1000μg 51D9处理其降低至7.8pg/ml(n＝10，p＜.05)。OVA攻击诱导96任意单位的AMC酶活性，以100、300和1000μg的抗体其分别以51D9剂量依赖型地降低至52、45和21U(n＝9-10，p＜.01)。具有大出10倍的体外效能(24pM)的54D1在30μg剂量以气管阻力自6.58cm H2O/ml/sec降低至4.4cm H2O/ml/sec证明AHR的抑制，且以300μg抗体处理观察到气管阻力降低至3.65cm H2O/ml/sec的值的最大抑制。对于粘液、AMC酶和TARC产生的抑制观察到类似效能。具有2.5nM的效能的第三抗体3H7证明AHR、粘液和AMC酶的抑制，但仅在1000μg抗体处理的剂量下，此与体外生物测定中所描述的效能10倍变化一致。
以抗体48D3测试仅阻断IL-13与IL-13Rα1结合的抗体效力。以30、100、300和1000μg/小鼠处理动物。与4.1cm H2O/ml/sec相比，在非哮喘PBS处理的动物中OVA攻击诱导气管阻力升至5.69cmH2O/ml/sec。以30μg 48D3处理对OVA诱导的肺阻力无效，而以100、300和1000μg 48D3处理抑制OVA诱导的肺阻力变化至4.4cmH2O/ml/sec的最大量或至OVA对照含量的～80％(n＝10，p＜.05)。与51D9所观察到的效应相对比，如Muc5ac ELISA或PAS反应性上皮细胞所测定48D3并未抑制OVA诱导的粘液分泌过多。48D3在30μg剂量处理观察到粘液的略微但统计学显著降低(30％)，而所有其它剂量等于OVA攻击的动物。PAS阳性染色的组织学定量证明OVA攻击的动物中0.6％对OVA攻击且以1000μg 48D3处理的动物中0.8％。在这些研究中，48D3在30、100、300和1000μg剂量下将OVA诱导的AMC酶表达自OVA处理的动物中检测到的196U分别抑制至63、90、87和96U。抗体含量的分析指示在抗体处理的小鼠的血清与BAL液体中可检测到可比含量的48D3和51D9。尽管与51D9抗体相比48D3抗体的7倍更大效能和2种抗体的等效暴露，48D3抗体不能抑制AHR或AMC酶至与阻断IL-13与IL-13Rα1和α2结合的抗体相同的程度，且不能减弱粘液产生。总而言的，这些数据暗示IL-13Rα2在调节OVA诱导的粘液过度分泌中起重要作用，且IL-13Rα2有助于体内调节哮喘表型。
表23：抗-小鼠IL-13抗体在卵白蛋白诱导的哮喘鼠类模型中的效力
*表示p＜.05，ANOVA

Claims (1)

1.包含抗原结合域的结合蛋白，其中所述结合蛋白结合IL-13，且其中所述抗原结合域包含6个CDRs：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中
CDR-H1是：D-Y-A-M-H(SEQ ID NO:86的残基31-35)，
CDR-H2是：W-I-N-T-Y-T-G-K-P-T-Y-A-D-D-F-K-G(SEQ ID NO:86的残基50-66)，
CDR-H3是：A-G-R-T-E-G-T-H-Y-Y-A-M-D-A(SEQ ID NO:86的残基99-112)，
CDR-L1是：R-A-S-Q-S-V-S-I-S-S-S-D-L-M-H(SEQ ID NO:87的残基23-37)，
CDR-L2是：R-T-S-N-L-V-S(SEQ ID NO:87的残基53-59)，和
CDR-L3是：Q-Q-G-R-E-S-P-W-T(SEQ ID NO:87的残基92-100)。
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