CN105861441B - 一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系stl-c1及其建系方法 - Google Patents

一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系stl-c1及其建系方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105861441B
CN105861441B CN201610202256.XA CN201610202256A CN105861441B CN 105861441 B CN105861441 B CN 105861441B CN 201610202256 A CN201610202256 A CN 201610202256A CN 105861441 B CN105861441 B CN 105861441B
Authority
CN
China
Prior art keywords
liver cancer
cell
liver
cancer
cell lines
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610202256.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105861441A (zh
Inventor
王红阳
鄢和新
王明达
吴晗
傅恭博
周徐
曾敏
黄伟健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Military Medical University SMMU
Original Assignee
Second Military Medical University SMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Military Medical University SMMU filed Critical Second Military Medical University SMMU
Priority to CN201610202256.XA priority Critical patent/CN105861441B/zh
Publication of CN105861441A publication Critical patent/CN105861441A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105861441B publication Critical patent/CN105861441B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明涉及微生物动物细胞领域，具体是一种来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL‑C1，其保藏编号为CCTCC No：C201630。本发明还提供这一细胞系的构建方法和应用。本发明建立的肝癌细胞系STL‑C1是从人肝细胞癌的癌旁组织中取材的，在体外可以长期培养并能够稳定传代，体内实验显示该细胞系仍具有很好的致瘤性，同目前现存并建系的常见肝癌细胞系乃至肝癌癌栓细胞系完全不同，对研究原发性肝癌的卫星灶形成以及复发转移等生物学行为有重要的利用和参考价值，是肝癌基础和临床研究的新的细胞模型，具有较为广泛的应用前景。

Description

一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1及其建 系方法
技术领域
本发明涉及微生物动物细胞领域，具体地说，是一种从人肝细胞癌癌旁组织样本中分离得到并建系的肝癌细胞系STL-C1以及其构建方法和应用。
背景技术
原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤相关死亡中仅仅次于肺癌，位居第二，患者预后极差。虽然手术切除原发病灶仍是目前最有效的肝癌治疗措施，但大部分患者就诊时已到中晚期并发生肝内外转移，所以手术切除率低、复发率高，临床效果仍不理想。因此，深入研究原发性肝癌发生、发展及转移的分子机制并针对肝癌生物学特性寻找有效的治疗干预靶点显得尤其迫切和重要。
对于肝癌的转移途径，最常见的是肿瘤细胞通过肝内肝窦和窦旁间隙直接扩散到肝脏其他部位，因此转移灶呈现卫星状分布，也可远离原发灶。而临床手术中，外科医生在尽可能完整切除肿瘤(切缘阴性)的前提下也会尽量保留剩余肝脏，避免对患者肝功能造成太大的影响。也有文献认为，癌旁组织主要指距病变2cm的肝脏组织，但在实际病理组织中癌旁组织和癌组织往往有一定的交叉，并不能以很明确的界限来区分。所以，即使手术可以切除原发灶也并不能保证原发灶周围范围内所谓“肉眼无明显卫星灶”的癌旁组织中无肿瘤细胞的侵润。因此，这可能也是肝癌手术后仍易复发和转移的原因之一。纵观目前国内外文献，关于肝癌细胞本身各个方面的生物学特性都已进行了深入细致的研究，同样，在肝癌发病机制的基础研究中，癌旁组织也是作为肿瘤组织的阴性对照被广大科研工作者广为应用，但是对于癌旁组织中存在的肝癌细胞的生物学特性却鲜有报道。所以，也无法对原发性肿瘤细胞和癌旁组织来源的肿瘤细胞的生物学行为进行对比研究，也就难以深入揭开肝癌转移的分子机制，无法有效的寻找预防和治疗转移的临床策略。
在肝癌的研究过程中，由于原发性肝癌有较大的异质性，并且不同的肝癌细胞的生物学特性也具有较大差异，所以体外建立人肝癌细胞系和人肝癌细胞系动物模型是实验室进行肝癌研究不可或缺的技术手段。自1962年陈瑞铭建立了世界第一株肝癌细胞系之后，国内外研究人员相继建立包括HepG2, Hep3B,PLC/PRF/5等一系列人肝癌细胞株。因为其可以在体外连续传代培养并能体内接种成瘤，较好的模拟了肝癌的发生发展以及其多方面生物学行为，为肝癌发病机理的研究和临床治疗的探索奠定了良好的基础，从而得到了较为广泛的应用。但随着对肝癌研究的深入，研究人员对肿瘤的异质性以及复发、转移等生物学行为方面的研究要求也越来越高。因此，需要建立新的肝癌细胞株或者肝癌细胞系动物模型来进一步研究肝癌不同方面的生物学特性。
中国专利文献CN1338512A公开了人肝癌肺转移细胞系的建立方法，即利用人肝癌组织经原位肝内接种使裸鼠成瘤并发生肺部转移，然后进一步从肺转移癌灶中分离建立了人肝癌细胞株，为研究肝癌肺转移的发生机制和干预靶点提供了理想的细胞模型。中国专利文献CN1232874A公开了具有高转移潜能的肝癌细胞系MHCC-97的建立方法。研究人员将人肝癌高转移的裸鼠模型移植瘤作为建系的瘤源，通过采用体外培养联合裸鼠体内再接种的方式交替实施，从而建成具有高肺转移率的人肝癌细胞株。中国专利文献CN101597591A公开了利用人肝癌门静脉癌栓转移灶作为建系瘤源，通过分离和体外连续培养的方法建立了来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系，对研究肝癌门脉癌栓的形成、生长机制以及癌栓来源细胞系的生物学行为提供了重要的实验材料。而来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系及其构建方法方面仍未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1及其建系方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1，其分类命名为来源于癌旁组织的肝癌细胞株STL-C1，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2016年2月26日，保藏编号CCTCC No：C201630。
本发明的第二方面，提供上述的来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1的构建方法，包括以下步骤：
a)原发性肝细胞癌癌旁组织灌注分离并获取细胞，进行原代培养；
b)细胞岛克隆的形成和扩大培养；
c)细胞的接种传代培养。
其中，所述的原代培养、扩大培养和传代培养中使用的培养液均为含有10％v/v胎牛血清(Fetal Bovine Serum,简称FBS)的DMEM/F12培养液，所述的培养液中还含有10μg/ml重组人胰岛素、5.5μg/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠以及20ng/ml人重组bFGF干细胞生长因子。
优选的，所述的步骤a中采用组织断面多点穿刺联合沿门脉管道走向放射性包膜下穿刺潜行灌注的方法对癌旁组织进行处理。
优选的，所述的步骤a中的癌旁组织采用缓冲液+胶原酶灌注液两步消化的方法分离并获取癌旁组织细胞，所述的缓冲液为含0.02％(w/v)EGTA的D-Hank’s缓冲液，所述的胶原酶灌注液为含0.1％(w/v)IV型胶原酶的D-Hank’s灌注液。
本发明的第三方面，提供一种上述的来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1在制备肝癌细胞模型或动物模型中的应用。
本发明的第四方面，提供一种上述的来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1在研究肝癌卫星灶形成、肿瘤肝内外复发或转移机制中的应用。
本发明的第五方面，提供一种上述的来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1在筛选或制备抗肝癌药物中的应用。
本发明优点在于：
1、STL-C1肝癌细胞系取材于肝癌患者癌旁组织，对研究肝癌卫星灶形成机制和肿瘤肝内外复发、转移的机理有其他目前肝癌或癌栓细胞系无法比拟的优势；在体外可以长期培养并能够稳定传代，体内实验显示该细胞系仍具有很好的致瘤性，同目前现存并建系的常见肝癌细胞系乃至肝癌癌栓细胞系完全不同，对研究原发性肝癌的卫星灶形成以及复发转移等生物学行为有重要的利用和参考价值；
2、流式细胞术检测显示该细胞系STL-C1有大约4％左右的细胞亚群可以稳定表达肝癌干细胞样细胞亚群较为特异的表面标志物CD133和EpCAM，提示有一定比例的细胞亚群可能具有肝癌干细胞样的特性。因此，本发明对研究肝癌卫星灶形成以及肝内外转移过程中肝癌干细胞的作用与机制有一定的参考意义和应用前景；
3、本发明细胞在原代培养时期，由于体外胶原酶灌注联合物理机械的分离方法对细胞状态有较大影响，同时由于体内到体外接种培养带来的微环境变化使细胞处于应激状态，存活不易，传代更是十分困难。本发明中通过使用适 量胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(Insulin-Transferrin-Selenium,ITS)和人重组bFGF干细胞生长因子的DMEM/F12培养液(含10％v/v胎牛血清)，成功的维持了肿瘤细胞体外的存活，并逐渐使其可以稳定扩增生长并传代，获得永生化的可能大大增加。目前该细胞已稳定传至20代左右，因此，采用这样组合的条件培养基可以有效的在体外促进分离细胞的增殖和扩增，并明显提高了建系的效率；
4、本发明稳定建立的细胞系在显微镜下观察形态特征主要表现为大小异型性明显，呈多角形贴壁生长，在体外能够长期培养并稳定传代，裸鼠体内成瘤实验显示其具有较强的成瘤性，说明该细胞系仍保留肝癌细胞的生物学特性，是肝癌基础和临床研究的新的理想细胞模型，具有较为广泛的应用前景。
5、目前分离原代肝细胞主要通过门静脉Seglen两步灌流法，而本发明是通过缓冲液+胶原酶消化液两步灌注的方法在体外对手术后取下的癌旁组织进行灌注，并最终成功分离所需的细胞。不同于原位肝脏有固定的门静脉以及完整的管道系统可以用来进行封闭的灌注，人体外癌旁组织由于手术取材原因所以存在多个断面，并且管道较多、完整性较差。根据这样的情况，本发明对现有的两步灌注法进行了一定程度的改良和调整。虽然在灌注液以及缓冲液的选择上同seglen法中所涉及的灌注液体差别不大，但本发明通过分离大量组织样本总结经验并逐渐摸索出组织断面多点穿刺联合沿门脉管道走向放射性包膜下穿刺潜行灌注的方法对癌旁组织进行处理，并且有较好的效果，细胞分离效果佳、所得细胞活性好。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)
地址：中国武汉武汉大学
保藏日期：2016年2月26日
保藏编号：CCTCC No：C201630
分类命名：人肝癌细胞株STL-C1
附图说明
图1A-B:单层贴壁生长的STL-C1肝癌细胞在显微镜下观察的正常形态图(200x和400x)。
图2：在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液(添加ITS和bFGF)中STL-C1肝癌细胞的生长曲线图。
图3：STL-C1肝癌细胞接种后贴壁率随时间变化曲线图。
图4：STL-C1肝癌细胞平板克隆形成实验图。
图5：STL-C1肝癌细胞(第15代)中CD133+和EpCAM+的细胞亚群流式图。
图6：STL-C1肝癌细胞接种至裸鼠皮下后成瘤情况。
图7：STL-C1肝癌细胞染色体核型分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、实验试剂与材料
1、实验试剂
(1)细胞培养试剂：DMEM/F12(1:1)培养液(Gibco,USA)，10％(v/v)胎牛血清(Biochrom AG,USA)；100U/L青霉素和0.1mg/L链霉素(上海博光生物公司)最终工作浓度分别为100U/mL和0.1mg/mL；人重组bFGF干细胞生长因子(Peprotech,USA)；胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS Lipid Media Supplement,100×)(Sigma，USA)，由1.0mg/ml重组人胰岛素、0.55mg/ml人转铁蛋白和0.5μg/ml亚硒酸钠组成，使用时以1:100的比例添加到含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养液中；
(2)其他细胞培养和细胞分离所需材料：D-Hank’s平衡盐溶液(pH值为7.2-7.4)，IV型胶原酶(Sigma,USA)，肝素注射液，50μm孔径细胞尼龙网筛(BD Biosciences,USA)，Percoll液，磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)，含0.5mM EDTA的0.25％(w/v)胰酶(0.25g胰酶融到100ml PBS中)，细胞冻存液(DMEM:FBS:DMSO以7:2:1的体积比例混合配制而成)等；
(3)其他细胞生物学实验材料：CCK-8染料(Dojindo,Japan)，甲醇溶液，结晶紫，Anti-CD133-PE抗体和Anti-EpCAM-PE抗体(Miltenyi Biotec,USA)，Matrix gel(BDBiosciences,USA)等。
2、组织来源
实施例标本取于上海东方肝胆外科医院2012-11-01手术标本(患者住院号129620)，男性，43岁，因“B超发现肝占位2天”入院。既往慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化病史。CT检查提示：肝右前叶见结节状低密度灶，直径约2cm，增强后动脉期病灶斑片状强化、门脉期和延迟期密度减低，考虑原发性肝癌。术前征得患者本人同意并签署知情同意书，术中探查见：肝脏呈小结节性肝纤维化改变。肿瘤位于右叶V段，大小约1.5×1cm，位于肝实质内，质地硬；肿块主体边界尚清、无明显包膜，外周未见明显子灶，余肝未触及肿块。予以切除癌肿及部分癌旁组织标本，切缘阴性。术后病理诊断为肝细胞癌，粗梁型，II-III级；慢性肝炎C1S3。
3、实验动物
BALB/c裸鼠，鼠龄为6-8周，购自中国科学院上海斯莱克实验动物中心，饲养于东方肝胆医院信号转导实验室清洁级动物房，自由进食、进水。细胞接种均在净化级工作台中。
二、实验方法
我们从该例肝癌患者的癌旁组织标本取材，采用“缓冲液+胶原酶灌注”两步消化的方法分离并获取癌旁组织细胞，通过原代培养、细胞岛克隆的形成和扩大培养、以及细胞的接种传代培养等步骤建立一株能够在体外稳定传代的细胞系，具体方法如下：
1、标本获取：上述患者肝癌切除手术时用手术刀从切除的标本中取新鲜的癌旁组织约4g，切取时尽量保证断面整齐。样品置于预先准备好的50ml进口离心管中(管内预装20ml无血清的DMEM培养液)，冰上放置，带至实验室；
2、肝癌癌旁细胞的分离及原代培养：
用含有双抗(500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素)的D-Hank’s缓冲液清洗肝癌癌旁组织表面的血块，并将多余结缔组织剪除，置于培养皿中。先用针头注射器沿组织断面现有肉眼可见的管道入口反复灌注38℃预温的含0.02％(w/v)EGTA和50U/mL肝素注射液的D-Hank’s液以冲出组织内部血块，然后采用组织断面多点穿刺联合沿门脉管道走向放射性包膜下穿刺潜行灌注的方法，予以含0.02％(w/v)EGTA的预温D-Hank’s液灌注，直至组织块由暗红色变为灰白色且流出的灌注液体变清亮为止；随后换成含0.1％(w/v)IV型胶原酶的D-Hank’s灌注液继续按照上述方法进行灌注，胶原酶灌注液可回收循环使用，直至癌旁组织块逐渐失去弹性且灌注液变浑浊，伴有被消化下来 的细胞冲出，肉眼可见组织表面呈现龟背状裂隙、组织内结构变疏松、易离解。将组织小心置于新的培养皿中，加入10ml DMEM培养液，剪开组织包膜并轻柔的钝性分离组织块，将已经消化完全的细胞剥离下来，并去除最后残存的包膜及纤维组织。随后将消化物吹打为悬液，用50μm孔径的尼龙筛网(Nylon cellstrainer)过滤至50mL离心管中。除去未消化组织后，在滤液中再加入10mL DMEM培养基混悬，700rpm离心1min，弃上清，轻轻重悬沉淀物并加入10ml DMEM培养液和5mL Percoll混匀，4℃低温下2500rpm离心5min。弃上清后再次用培养基重悬并700rpm离心1min，所得细胞沉淀悬浮于含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基中，添加ITS和bFGF之后接种于10cm培养皿，放入37℃恒温、饱和湿度和5％CO2的细胞培养孵箱中，并在12h观察细胞贴壁情况，并换液以除去未贴壁及死亡细胞，继续培养。
3、分离细胞的克隆扩大培养
通过反复消化-贴壁法去除成纤维细胞。在贴壁培养的过程中，肉眼可见大多数细胞出现凋亡，仍予以前述培养液培养，定时更换新鲜培养液，2周后培养皿局部长出致密、旺盛的细胞克隆岛，为获取较为纯种的细胞系并避免其他细胞例如成纤维细胞的污染，采用细胞克隆消化方法，即在显微镜下用记号笔对培养皿中较大的细胞克隆岛进行标记定位，然后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞三遍，将0.25％胰酶滴于细胞克隆上孵箱内消化3min，然后用新鲜培养基将消化后的克隆冲起吸出并重新接种到24孔板中，加入0.5mL含有1×ITS和20ng/mL bFGF的DMEM/F12培养液(含10％v/v胎牛血清)继续培养。
4、细胞的传代与培养
注意观察细胞生长情况和密度，隔1-2天更换2/3新鲜培养基，待细胞几乎长满24孔板以后，依次逐渐消化并传代至12孔板、6孔板、及6cm盘中。定期观察并根据细胞的状态及培养液颜色的变化，每隔1-2天换液，细胞长至培养皿底部80-90％时用0.25％胰酶消化传代，并用含10％(v/v)DMSO的冻存液对不同代数的细胞进行冻存处理。体外培养10代以后，细胞增殖稳定，对其相关指标进行检测，命名为STL-C1肝癌细胞系。分类命名为人肝癌细胞株STL-C1，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2016年2月26日，保藏编号CCTCC No：C201630。
5、细胞形态观察
在倒置相差显微镜下观察培养的活细胞形态结构和生长特点。
6、细胞生长曲线
取对数生长期状态良好的细胞，胰蛋白酶消化后用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养液(含有1×ITS和20ng/mL bFGF)重悬，以每孔100μl(细胞数量6×103)接种于96孔板中，每个样品每个拟测定的时间点重复3个复孔。选取0时刻后，每隔24小时利用CCK-8法通过酶标仪测定孔内450nm波长吸光度值，连续6天，以时间为横轴，以吸光度值为绘制纵轴绘制生长曲线。
7、细胞贴壁率
同上取对数生长期状态良好的细胞经消化后以1.2×104密度接种于24孔板中，每个拟检测的时间点均准备3个复孔。接种后每隔3小时取一组细胞(3个副孔)对其已贴壁细胞进行胰酶消化计数，直至24小时为止。以测定的时间点为横坐标，贴壁细胞数与总细胞数比值为纵坐标绘制贴壁率随时间变化图。
8、平板克隆形成实验
同上处理，细胞以1×103密度接种于6孔板中，每个样品3个复孔。培养2周后肉眼可见克隆形成，予以甲醇固定后加结晶紫染色15分钟，洗净后进行克隆计数。克隆形成率＝克隆数目/接种细胞数×100％。
9、肿瘤干细胞比例检测
同上各选取状态良好细胞约2×105，分别用200μl预冷PBS重悬后加Anti-CD133-PE和Anti-EpCAM-PE抗体4μl，充分混匀后冰上孵育30分钟，离心并用PBS洗两遍，重悬后分别进行流式细胞术分析，检测CD133和EpCAM阳性细胞亚群所占全部细胞的比例。
10、细胞接种后皮下成瘤实验
取对数生长期的STL-C1肝癌细胞，胰酶消化收集离心后用无血清DMEM和Matrixgel胶1:1重悬混合为5×107细胞/mL的细胞悬液，按照5×105和1×107两个细胞数量级分别接种在6-8周龄雄性裸鼠背部皮下，2周后观察成瘤情况，定期间隔5天测量肿瘤长径与短径，并称量裸鼠体重，肿瘤体积公式为：V＝(短径2×长径)/2mm3。第45天时取出肿瘤并拍照。
11、染色体核型分析
取对数生长期第15代STL-C1肝癌细胞送至北京百奥赛图基因生物技术 有限公司进行核型分析鉴定。
三、实验结果
1、细胞形态学观察
镜下观察细胞呈多角形贴壁生长，大小不一，形态有一定差异，排列不规则，胞浆丰富，核大、明显。见图1。
2、生长曲线
细胞在含10％(v/v)胎牛血清DMEM/F12培养液中生长曲线如图2所示，细胞稳定生长，增殖速度较快。
3、细胞贴壁率
细胞在上述培养条件下贴壁良好，种植8小时大约有60-70％贴壁，16小时基本90％细胞均可以贴壁生长。细胞贴壁率随时间变化见图3。
4、平板克隆实验
细胞在上述培养条件有一定的克隆形成能力，集落形成明显，形成率为4.5±0.8％。大体克隆形成图见图4。
5、肿瘤干细胞比例
流式细胞术结果显示STL-C1肝癌细胞中CD133阳性细胞亚群比例大约3.7％，EpCAM阳性细胞亚群比例大约为1.9％，如图5所示。
6、体内成瘤性实验
在细胞注射第45天时取瘤观察，如图6所示，5×105和1×107两个细胞数量级分别注射的三只裸鼠均成瘤，其中1×107细胞数量级接种裸鼠形成的肿瘤块显著大于低数量级细胞所形成的瘤块。
7、染色体核型分析
由于细胞系存在着复杂染色体易位、缺失、断裂等染色体变异(约占总染色体数的90％)，G显带无法做出有效的配对排序，所以实验只做染色体计数处理，结果显示细胞系为近二倍体核型。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (4)

1.一种来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1，其保藏编号为CCTCC No：C201630。
2.一种如权利要求1所述的来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1在制备肝癌细胞模型或动物模型中的应用。
3.一种如权利要求1所述的来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1在研究肝癌卫星灶形成、肿瘤肝内外复发或转移机制中的应用。
4.一种如权利要求1所述的来源于人肝癌癌旁组织的肝癌细胞系STL-C1在筛选或制备抗肝癌药物中的应用。
CN201610202256.XA 2016-04-01 2016-04-01 一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系stl-c1及其建系方法 Expired - Fee Related CN105861441B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610202256.XA CN105861441B (zh) 2016-04-01 2016-04-01 一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系stl-c1及其建系方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610202256.XA CN105861441B (zh) 2016-04-01 2016-04-01 一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系stl-c1及其建系方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105861441A CN105861441A (zh) 2016-08-17
CN105861441B true CN105861441B (zh) 2018-06-12

Family

ID=56626724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610202256.XA Expired - Fee Related CN105861441B (zh) 2016-04-01 2016-04-01 一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系stl-c1及其建系方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105861441B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795851B (zh) * 2017-04-27 2022-03-18 大连医科大学 一种人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系caf-sa的建立方法及其应用
CN108967417B (zh) * 2018-08-09 2019-05-10 爱克精医(北京)生物医药科技有限公司 一种肿瘤组织高活性储存运输液及其制备方法
CN109055302A (zh) * 2018-08-28 2018-12-21 重庆医科大学附属第医院 Hbv转基因小鼠原代肝细胞的分离、培养与鉴定的方法
CN111321119B (zh) * 2020-03-18 2022-09-20 四川大学 一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系及其建立方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597591A (zh) * 2008-06-06 2009-12-09 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法
CN101693886A (zh) * 2009-08-10 2010-04-14 北京肿瘤医院 一种肝癌细胞系及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201031916A (en) * 2009-02-20 2010-09-01 Iner Aec Executive Yuan A mammal dedicated cell lin

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597591A (zh) * 2008-06-06 2009-12-09 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法
CN101693886A (zh) * 2009-08-10 2010-04-14 北京肿瘤医院 一种肝癌细胞系及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外扩增及特性研究;江珊珊等;《中国细胞生物学学报》;20141231;第36卷(第7期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105861441A (zh) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861441B (zh) 一种来源于人肝细胞癌癌旁组织的肝癌细胞系stl-c1及其建系方法
CN102465113B (zh) 一种人肝癌细胞系及其应用
CN107022521A (zh) 壁蜕膜组织冻存、复苏及分离培养间充质干细胞的方法
CN102250840B (zh) 一种人胰腺癌细胞系及其应用
CN104531620A (zh) 肺癌干细胞条件3d培养方法
CN102161980B (zh) 用人间充质干细胞为滋养层培养诱导多能干细胞的方法
CN104694476A (zh) 一种人非小细胞肺癌细胞系及其建立方法和应用
CN103881975B (zh) 人前列腺癌细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途
CN102719403B (zh) 一种人胰腺腺鳞癌细胞系及其建立方法和应用
CN101531996B (zh) 源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法
CN101993854B (zh) 一种来源于肝转移灶的大肠癌细胞系cjf及其构建方法
CN107177551B (zh) 一种具有高成瘤能力的人肝内胆管癌细胞系及其应用
CN104195109A (zh) 一种人肺腺癌细胞系及其应用
CN102181399B (zh) 一种cd133高表达鼠肝肿瘤细胞系及制备方法
CN102329775B (zh) 一种对吉西他滨耐药的人胰腺癌细胞系及其应用
CN104745530A (zh) 一种人肝细胞癌细胞系及其建立方法和应用
CN105062973B (zh) 一株携带tp53突变的hpv阴性阴茎鳞癌细胞系及其用途
CN104419660A (zh) 制备自体造血干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用
CN103013923A (zh) 建立人卵巢癌动物模型的方法
CN109355261A (zh) 一种尿源性膀胱癌细胞培养基及尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法
CN104894052A (zh) 基于三维细胞培养的3d细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法
CN103911343A (zh) 一种多器官转移人膀胱癌细胞
CN101597591B (zh) 一种来源于人肝癌门静脉癌栓的肝癌细胞系及其建系方法
CN101824397B (zh) 一种肝癌细胞系ehbc-512及其应用
CN104894088A (zh) 消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wang Hongyang

Inventor after: Yan Hexin

Inventor after: Wang Mingda

Inventor after: Wu Han

Inventor after: Fu Gongbo

Inventor after: Zhou Xu

Inventor after: Zeng Min

Inventor after: Huang Weijian

Inventor before: Wang Hongyang

Inventor before: Yan Hexin

Inventor before: Wang Mingda

Inventor before: Wu Han

Inventor before: Fu Gongbo

Inventor before: Zhou Xu

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180612