CN1070946A - 高等真核细胞中引入核酸复合物的组合物 - Google Patents

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Abstract

用于转染高级真核细胞的组合物，该组合物由核 酸复合物。与核酸具有亲和作用的物质及选择性内 在化因子组成。该组合物含核内体溶解剂如病毒或 病毒组分，这些组分可被结合在一起。核内体溶解剂 (可为核酸复合物的一部分)与复合物一起内在化到 细胞内，并将核内体中物质释放到细胞质中。借此提 高基因转移能力。还公开了药物制剂，转染剂和通过 用本发明组合物处理细胞将核酸引入到高级真核细 胞的方法。

Description

本发明涉及DNA技术领域，具体的讲是一种将核酸引入高等真核细胞的新组合物。
随着分子生物学的发展，特别是在基因治疗中，需要非常有效的体系将核酸引入活细胞。基因转入细胞后可在体内合成具有治疗作用的基因产物，例如：取代遗传缺损性疾病的缺损基因。“常规”的基因治疗理论上是通过单一的治疗可得到持续的效果。但是也需要一些方法将具有治疗效果的DNA象普通药物一样用于疾病的治疗（基因治疗剂），也就是说在需要的时候一次或重复服用。具有良好的基因治疗前景的代表性遗传病有：血友病、β-地中海贫血和严重的免疫缺损综合症-一种遗传性的腺嘌呤脱胺酶缺少引起的综合症。其它有可能的应用是免疫调节，其中体液或细胞内免疫都可通过服用功能性核酸（标码分泌性蛋白抗原或非分泌蛋白抗原）而达到，这可以作为一种接种方法。其它的基因缺陷（这些编码基因的序列可被控制，比如为适应某种需要而进行的剪接过程）包括肌内营养不良（营养障碍基因），胆囊纤维化（胆囊纤维化跨膜传导调节基因），胆汁醇增多（LDL受体基因）。基因治疗在激素，生长因子， 及具有细胞毒或免疫调节活性的蛋白质的体内合成中有潜在的应用价值。
应用所谓的“癌疫苗”对癌症进行基因治疗也显示出良好的前景。为增加癌细胞的免疫性，可使得它更具有抗原性或者使它产生相应的免疫调节物质，如细胞活素，以激起免疫应答。在都可通过将标码细胞活素的DNA转染细胞来实现，如IL-2，IL-4，IFN-ν，TNF-α。到目前为止，已有许多基因通过逆转录病毒载体转入自体肿瘤细胞。
到目前为止，最先进的将核酸用于基因治疗的技术仍是利用逆转录病毒将基因转入细胞（Wilson    et    al.，1990，Kasid    et    al.，1990）。但是，应用逆转录病毒存在着问题，因为有带来（至少很少的程度上）副反应的危险，如病毒感染（通过与内源性病毒重组或者被助病毒感染而继发突变成致病型）或形成癌症。另外，由逆转录病毒可使病人体细胞得到稳定的转让，这并不是在任何情况下都必须的，因为这种治疗难以逆转，如副反应发生。再者，用这种治疗形式很难得到高效价的细胞转染。
核酸作为有效的基因治疗剂还用于抑制特殊的细胞功能，如反义RNA和DAN已显示出选择性抑制特殊基因序列表达的功能。这种活性使得它们能够作为治疗剂在体内阻断相应基因的表达（如 降低癌基因或病毒基因的表达）。短链反义寡核苷酸也被转运至细胞并发挥它们的抑制活性（Zamecnik    et    al.，1986），虽然因为核酸的负电荷而影响了细胞膜对它的吸收，而使得它们在细胞内的浓度较低。另一种选择性抑制基因表达的途径是核酸酶。同样需要保证在细胞内的活性核酸酶有尽可能高的浓度，因此，核酸向细胞内的转运成为限制其应用的因素之一。
应用基因治疗法获得细胞内免疫包括为防止病毒而采用的基因转导，就是所说的“保护基因”，如病毒蛋白编码基因的反转显示突变，或者可产生所谓诱饵RNA的DNA分子。
这些方法都需要一种手段使得DNA转移至细胞内表达。
在体外已有多种技术可使基因转移至哺乳细胞，但在体内的应用受到限制（包括用脂质体引入DAN，电穿孔，显微注射，细胞融合，DEAE-葡聚糖或磷酸钙沉淀法）。
最近，重组病毒载体已应用于基因的转移，它是靠母体病毒的入侵通道而引起目的基因的。这种方法用于构建重组逆转录病毒或腺病毒载体以得到在体内外都有高效率的转移（Berkner，1988）。除效率外，载体还受到大小及要转移的DNA的结构的限制。另外，这一载体具有安全危险，伴随着原始病毒多种基因单元的同期转移。
为避免这些限制，另外一种基于细胞对大分子转移吸收的基因 转运方法已研究成功，其中的一个例子是通过有效的受体介导胞饮作用将基因转移至细胞（Wu    and    Wu，1987，Wagner    et    al.，1990    and    EP-AL    0388758，本文将涉及该发现）。这一途径用一双功能分子偶联体，包括DNA结合区和被细胞表面受体专一性识别的区域（Wu    and    Wu，1987，Wagner.et    al.，1990）。如果识别区被细胞表面受体识别，共聚体就通过受体介导胞饮作用而内吞，连接在共聚体上的DNA也同时被转移。用这种方法进行基因转移至少可获得与经典方法同样的速度（Zenke    et    al.，1990）。而且已证明核酸的生物活性（如核酸酶的抑制活性）在转运体系中不受损失。
PCT专利WO    91/17773介绍的是一种对T细胞专门识别的转运核酸体系。这一体系利用了T细胞系细胞表面蛋白，如CD4（HIV病毒所用受体）。被转运的核酸与带有多个正电荷的蛋白质相连形成偶联物，本复合体中所用蛋白（即结合识别区）能够与T细胞表面蛋白结合（如CD4），并使得表达这种表面蛋白的细胞与所形成的多聚正电荷蛋白质/核酸复合体接触。结果发现用这种体系转运至细胞的DNA可在细胞内表达。
两个发明的共同特点是他们都利用了特殊的细胞功能使核酸能够或者有利于进入细胞内。包括本发明在内，每一体系都有叫做“内吞分子”的识别区参与细胞吸收机制。所谓内吞因子是指能够与细胞表面结合并能变为细胞内物质的配体，它有较窄或较宽的专属细胞型，有可能需要其它一些因子的协作（如细胞表面蛋白）。（在以 上所提两发明中，内吞因子是转铁蛋白或能与T细胞表面抗原结合的蛋白，如抗CD4抗体）。内吞因子与一个具有核酸亲合性质的多聚正电荷物质偶联起来，形成一个核酸与内吞因子之间的强力结合。（这类物质本文以后均指“与核酸有亲合性的物质”或者对DNA来说，“DNA结合部位”。如果这类物质在核酸和内吞因子间形成价键，后文称之为“结合因子”）。
在以上两发明中，当共聚体与核酸的比率使得所形成的多聚正电荷内吞因子/核酸复合体接近电中性时，细胞对核酸有最佳吸收。从这一观点出发，可提高内吞因子-结合因子/核酸复合体将核酸转入真核细胞的效率。
Wagner等介绍了一种提高本体系效率的方法，他们是利用内吞因子来转运核酸的（Wagner    et    al.，1991a）。在这种方法中，如果部分多聚正电荷转铁蛋白偶联体被非共价结合的（“自由”）多聚正电荷体取代，细胞对核酸的吸收量并不减少;在某些情况下，这种方法还可以增加对DNA的吸收。对有最佳的DNA/偶联体比率所形成的转铁蛋白-多聚正电体-质粒DNA复合体的分子状态进行研究，发现在偶联体存在下质粒DNA卷缩成直径约80-100nm的扭曲结构（象是面团）。
用T细胞结合蛋白作为内吞因子进行实验，得到同样的结果。
当用其它的结合因子时，假如对核酸有亲合性的“自由”物质也使得导入体系的效率增加。
Wagner等所建立的复合物可以通过内吞因子经胞饮作用被高等真核细胞吸收，包括与内吞因子偶联体和结合因子复合的核酸。连外，复合体包含有与核酸有亲合性的一种或多种与结合因子相同的物质，在非共价结合的形式下通过共聚体可使核酸的细胞内吞或表达增加，这说明主要的原因是卷缩效应，当然也有可能是其它的机理。
即使是这种方法使得转运核酸的表达速率有所增加，它仍然受到许多限制。这种体系的应用不单是由与体系有关的细胞表面受体决定，DNA-复合物进入细胞后有可能遇到溶菌体而被酶解，这就会限制这种体系的应用。为增加到达细胞核并能在核中表达的核酸比例，在本发明之前曾进行多种努力，在能抑制溶菌体酶活性的物质（溶菌体转义物）存在下进行细胞转染，可增加转移DNA的表达，但是，所产生的反应因所用物质不同而差异很大;所选溶菌体转义物使得基因转移增加，而其余物质则起抑制作用。例如，DNA的有效转移依赖于弱碱氯喹的存在，这种氯喹引起的效应可能不是，或不单是因为氯喹使得溶菌体的PH增加，在许多不同的实验中我们发现其它能调节PH值的物质，如金叶树苷，氯化铵或甲胺，都不能取代氯喹，甚至有些实验中这些物质起抑制作用。这进一步说明不同的靶细胞对具有溶菌体转义活性的同一物质会产生不同的应答。
由于通过生理途径进行基因转移（如所描述的用核酸复合体时 受体介导的胞饮作用）有很大优点，如：非毒性机制穿透细胞膜;生物活性核酸（如专一性抑制基因表达的核酸，或者重复或连续影响细胞功能的核酸）的控制;可能有细胞专属性靶点;大量生产偶联物的可能性等。所以需要使得这一体系更加完善。
图示注释：
图.1：通过转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体进行基因转移的腺病毒感染结果
图.2：偶联体-DNA复合物的剂量影响结果
图.3：通过受体介导的胞饮作用，腺病毒使得转铁蛋白-多聚赖氨酸介导的基因转移增强
A）复合体DNA的结果
B）受体结合DNA的结果
C）由转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体途径进行基因转移结果
图.4：在选定细胞系中，通过转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体方式进行腺病毒感染基因转移结果
图.5：基因转移或活化转移对基因表达增减的研究
A）K562细胞系
B）可表达虫荧光素酶的细胞系K562    10/6
图.6：四半乳糖肽-多聚赖氨酸偶联体。
图.7：腺病毒参与的HepG2细胞转染
图.8：腺病毒参与的HepG2细胞转染
图.9：TIB73细胞的转染
A）氯喹对照值
B）腺病毒存在
图.10：腺病毒参与的T细胞系转染
A）H9细胞
B）初级淋巴细胞
图.11：腺病毒的紫外灭活
A）在HeLa细胞中，紫外灭活病毒使得基因转移增强
B）紫外灭活与基因转移效果的比较
图.12：甲醛法使腺病毒灭活
图.13：莫洛尼病毒（Moloney    virus）参与的NIH3T3细胞转染
图.14：研究由转铁蛋白-多聚赖氨酸DNA复合体进行的基因转染结果是否由莫洛尼（Moloney）病毒引起
图.15：转铁蛋白与其受体间的相互作用参与与莫洛尼（Moloney）病毒的基因转移效果
图.16：PH值对逆转录病毒基因转移的影响
图.17：流感-血细胞凝集素肽;脂质体渗漏试验
图.18：流感肽-多聚赖氨酸偶联体P16L参与的K562细胞转染
图.19：流感肽-多聚赖氨酸偶联体P16L参与的Hela细胞转染
图.20：流感肽-多聚赖氨酸偶联体P41PL参与的转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体对Hela细胞的转染
图.21：在腺病毒参与下Hela细胞转染后就地观察β-半乳糖苷酶的表达
图.22：在腺病毒存在下用48kb重组质粒转染细胞
A）Hela细胞
B）成神经细胞瘤细胞
图.23：化学偶合制备腺病毒-多聚赖氨酸偶联体
图.24：化学偶合的腺病毒偶联体参与的K562细胞转染
图.25：化学偶合的腺病毒偶联体进行Hela细胞转染
图.26：转谷氨酰酶使多聚赖氨酸与腺病毒结合
图.27：转谷氨酰酶偶合的腺病毒偶联体参与的鼠肝细胞转染
图.28：转谷氨酰酶偶合的偶联体使转染效率增加
图.29：生物素-链抗生物素蛋白偶合的腺病毒偶联体转染Hela细胞
图.30：生物素-链抗生物蛋白偶合的腺病毒偶联体转染K562细胞
图.31：生物素-链抗生物素蛋白偶合的腺病毒将48kb的质粒转染成神经细胞瘤细胞
图.32：腺病毒或氯喹参与的肝细胞转染
图.33：各种细胞内涵体溶解剂参与的k562细胞转染
图.34：各种细胞内涵体溶解剂存在下用β-半乳糖苷酶为受体基因进行转染的方法比较
图.35：在融合的未分化干细胞中，虫荧光素酶表达长期保持
图.36：由鸡胚致死因子孤生病毒（CELO）在自由壮态下和通过生物素-链抗生物素蛋白与多聚赖氨酸连接时进行Hela细胞转染的表达结果对照
图.37：DNA/转铁蛋白多聚赖氨酸复合体在自由状态和生物素-链抗生物素蛋白偶合的腺病毒存在下进行浆细胞和myotubes转染的比较
图.38：DNA向鼠初级浆细胞和myotubes培养基中运输
图.39：在Hela细胞和C2C12浆细胞转染中腺病毒d1312和CELO病毒的比较分析
图.40：外源凝集素配体提高CELO病毒向浆细胞的运输
图.41：在C2C12浆细胞和myotube培养基中全长因子Ⅷ    CDNA的表达
图.42：腺病毒蛋白使DNA转运增加
A）Hela细胞
B）成纤维细胞
图.43：半乳糖-流感肽偶联体将DNA转至肝细胞
图.44：半乳糖-腺细胞偶联体将DNA转至肝细胞
图.45：鼻病毒参与的转铁蛋白-多聚赖氨酸转移DNA
图.46：含有腺病毒偶联体在内的组合复合体转染人初级黑素瘤细胞
图.47：两性肽的脂质体渗漏试验
图.48：两性肽的红细胞渗漏试验
图.49：两性肽参与的BNL    CL.2细胞转染
图.50：两性肽参与的NIH3T3细胞转染
图.51：α-干扰素在各种细胞内涵体溶解剂转染的Hela细胞中的表达
本发明的目的是提高核酸向高等真核酸细胞的转运（本发明中所提的转运包括：核酸复合体透过细胞膜导入细胞，复合体的运输及复合体进入细胞后所释放出的核酸到达表达部位的运输等）。高等真核细胞为常见的并不包括酵母。参见Molecular    Biology    of    the    gene，James    D.Watson    et    al.，the    Benjamin/Cummings    Publishing    Company，Inc.pp.676-677（1987）。
很多病毒在进入真核宿主时受到对应于受体介导的胞饮机理的影响。病毒通过这种机理进行感染时通常从病毒颗粒与细胞膜受体结合开始。随后，病毒进入细胞成为细胞内物。这一内吞过程遵循普通的路径，与生理配体或大分子进入细胞相对应：首先在细胞膜上的受体自己分组，然后目向内反转形成被笼状外衣包裹的运 载工具。这种运载体除去包裹层后，被膜上的氢泵酸化。这样就使得病毒从细胞内涵体中释放出来。根据病毒是否有脂层包围，细胞内涵体释放病毒有两种形式：就所谓的“裸露”病毒而言（腺病毒、鼻病毒、灰质病毒），推测低PH值引起病毒蛋白构型的改变，从而使得不易在生理PH值条件下显露的疏水区暴露出来，这一区域与细胞内涵体膜相互作用引起病毒基因组从细胞内涵体中释放出来而进入胞浆。对有脂层膜的病毒（泡状口炎病毒，Semiliki    Forest病毒，流感病毒）来说，推测低PH值修饰了某些病毒的结构或构型，促进了病毒膜与细胞内涵体膜的融合。通过这种机制穿透细胞膜的病毒含有某些特殊的分子，使得它们打破细胞内涵体的膜而进入胞浆。
其余病毒，如有色膜的病毒Sendai，HIV和Moloney    Leukaemia病毒的部分品种，或非色膜病毒SV40和多瘤病毒，都不需低PH条件就可穿透细胞;它们或者能够直接与细胞表面进行膜融合（Sendai病毒，HIV也有可能），或者能够激活打破细胞膜机制而通过。推测不依赖与PH值的病毒也能够利用胞饮路径（Mc    Clure    et    al.1990）。
解决发明中这些难题的前提是使得一些病毒穿透真核细胞的机制得以应用，以增加核酸复合体进入细胞并在细胞内表达的能力。
曾有人试图将蛋白质和病毒一起转入细胞（Otero    and    Carrasco，1987）。发现由病毒引起的细胞渗透可以运输生物大分子，这一过程可能是靠液相吸收机制进行的。
实验发现，连有毒素的表皮生长因子（EGF）这一天然配体与它的受体结合后，可以通过胞饮作用被细胞吸收。将同样的细胞内涵体与腺病毒放在一起也可以由受体介导的胞饮作用而被细胞吸收，并从细胞内涵体中释放出来，与病毒一起进入胞液（Fitz    Gerald    et    al.，1983）。
本发明惊奇地发现具有某些病毒进入真核细胞机制特点的试剂（病毒、病毒组分或其它化合物）可以作为复合体的一部分运入细胞，增加核酸的表达。更惊奇的是，进入细胞的核酸复合体是很大的。
所以本发明所涉及的是转染高等真核细胞的复合体组合物，这一组合物含有核酸和核酸有亲和性物质，其中的核酸亲和物以适当的方式与内吞因子相偶合，使它成为一种能够被所转染细胞内吞因子的试剂（或者只作为一种方式或者是核酸复合物的一个组分），并且能够在进入细胞后使包含有复合体的细胞内含物的组分释放到细胞浆中。
这种试剂在后文中均指“细胞内涵体溶液剂”。
内涵体溶液剂的这种被细胞吸收并在进入细胞后释放出内涵体内组分的能力在后文中叫作“吸收功能”，这种吸收功能包括主动或被动内吞能力，主动内吞通过受体依赖的胞饮作用机制，被动内 吞则是通过液相或作为核酸复合体的一个组分;还包括打破细胞内涵体的能力，也就是通常所说的内涵体溶解。
在本发明的一个实例中所用的内涵体溶解剂是病毒，另一实例所用的内涵体溶解剂是病毒组分。发明实例中所用的病毒或病毒组分在后文中均指“自由病毒（组分）”。
在本发明中，以虫荧光素酶基因作为受体基因，研究了在Hela细胞中增加自由腺病毒的剂量对常量铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体转移基因能力的影响。增加自由腺病毒的量会引起基因转移的增加，并在每个细胞中含有1X104个病毒颗粒时达到一个峰值，这一数字与每个Hela细胞中腺病毒受体的数目相近。与单独加入转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体相比，当有较高剂量的病毒参加时，可使虫荧光素酶的表达增加2000倍。在另外一组实验中，研究了常剂量自由病毒存在下，改变偶联体-DNA复合体的量产生的影响。结果发现，在很宽的DNA剂量范围内，病毒吸入细胞后都使转铁蛋白-多聚赖氨酸介导的基因转移增加。当用腺病毒增加转染效率后，要达到基因表达的最大量时所加的DNA的量比单独加入偶联体-DNA复合物时所需量少100倍。
本文分别研究了腺病毒感染对非复合DNA和多聚赖氨酸或转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体复合的DNA的基因转移所产生的影响进行了研究（图.3A）。由此分析，在转染过程中，腺病毒感染不能使裸露的、非复合DNA的转移有明显增加。与之成明显对照，腺 病毒感染可使多聚赖氨酸或转铁蛋白-多聚赖氨酸复合的DNA的转移增加。这种效应对转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联物来说特别明显。因为偶联物分子中的多聚正电荷部分不仅使DNA与转铁蛋白连接起来，还使DNA的结构发生明显改变（折叠成扭曲结构，Wagner    et    al.，1991a），这些实验开始不能区分所观察的结果是由于多聚正电荷缩合的DNA的液相运输得到加强，还是因为病毒增加了受体结合的偶合体-DNA复合体的运输。为区分这些可能，进行了如下结合实验（图.3B）。在腺病毒感染以前，使转铁蛋白-多聚赖氨酸-DNA或多聚赖氨酸-DNA复合体在不发生内吞条件下结合，使得在溶液中除去过量的复合体（Fitz    Gerald    et    al.，1983）。当用这种形式给药时，受体结合的转铁蛋白-多聚赖氨酸-DNA复合体的转运在腺病毒颗粒加入后有明显增加，而多聚赖氨酸-DNA复合体则没有增加。所以，是受体介导的胞饮作用增加了DNA的进入。
另外，本文对带来受体介导的基因转移增加的特殊腺病毒的功能进行了分析（图.3C）。温和加热处理病毒例子不改变它们结合靶细胞膜的能力，但影响它们内吞后破坏细胞内涵体的能力（Defer    et    al.，1990）。所以，这种病毒结合和病毒侵入的不同效果可分别提高。在这个分析中，腺病毒加热灭活后完全失去了它增加受体介导的基因转移能力。这说明，腺病毒破坏细胞内涵体的能力参与了基因转运机理，使得转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体进行的基因转运 效果增加。一种有复制缺陷的病毒也能引起基因表达的增加，这一事实证实了这种假设：这一现象不应归因于病毒的复制功能而是归因于病毒粒子的吸收功能。
为排除病毒转运基因的活性转化引起基因表达增加这种可能，用能表达RSV-LTR虫荧光素酶基因的细胞系进行了实验：腺病毒对这种细胞系不产生影响，而对转铁蛋白-多聚赖氨酸转移基因后的细胞系中基因的表达有明显的增强效应。这一发现表明，腺病毒的影响发生在细胞转录之前，所以腺病毒对基因转移的增强效应发生在基因转移水平，而不是在基因表达水平（图.5）。
本发明还研究了在选定的细胞系中由转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体进行基因转移时，自由腺病毒所起的作用。结果发现由转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体转入基因时，靶细胞表面需要有转铁蛋白受体，但并不是在每种情况下都是如此。在这种方法中，与内涵体内吞偶联体-DNA复合体的结局有关的细胞专属性因子是非常重要的决定基因转移水平的因子。为此，研究了在选定的细胞系中有转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体进行的基因转移和腺病毒对基因转移的增加效应（图.4）。转铁蛋白-多聚赖氨酸-DNA复合体处理胆囊纤维化细胞（CFT1）后，有中等水平的虫荧光素酶基因表达。当用腺病毒d1312处理后，这一表达水平大大提高。KB细胞经转铁蛋白-多聚赖氨酸-DNA复合体处理后，其虫荧光素酶基因表达水平不高于对照组水平，尽管存在有转铁蛋白受体。但是这些细 胞用腺病毒d1312处理后，很快可检测出虫荧光素酶活性。用腺病毒处理Hela细胞得到类似的结果，但是这种效应要强的多。因为Hela细胞和KB细胞拥有几乎相等数量的腺病毒受体，所以这种基因转移增强效应的不同可能反应了不同型细胞的转铁蛋白受体的数量。尽管如此，与这些结果成鲜明对照，对很不容易被腺病毒感染的细胞系WI-38和MRC-5来说，d1312的加入与单独使用偶联体-DNA复合体相比，基因的表达几乎没有变化。在下列情况下用偶联体-DNA复合物进行基因转移时，自由病毒（如腺病毒）的加入可使效果增加：（1）受体介导的胞饮作用参与基因转移，如CFT1细胞;（2）某些看来用受体介导的胞饮路径不能有效进行基因转移的情况，如Hela细胞和KB细胞。效果增加的多少因靶细胞类型的不同而有很大区别，表明这一效应是某些细胞型中病毒受体的数量（如腺病毒受体）和转铁蛋白受体的数量共同影响的结果。
在利用自由病毒时，核酸亲合性物质（最好是有机多聚正电体）最好与内吞因子偶联。但是，根据本发明，只含有DNA亲合性物质的DNA复合体（如不含内在化因子）在适当的条件下若有自由病毒存在，也可以导入细胞。我们还发现，当含有核酸和核酸亲合性物质复合体的浓度足够高时，它可以通过液相方法被某些细胞系吸收。从本发明及前一发明所进行的实验中可以发现，核酸复合体具有吸收能力的必要条件是复合体的紧密结合，这可通过核酸亲合性 物质对核酸的缩合来实现。如果核酸亲合性物质有足够的能力与细胞表面结合而与病毒一起进入细胞，也能使复合体成电中性而将核酸缩合成紧密结构，那么也许没有必要将核酸亲合性物质与一个细胞内吞因子共价结合起来以增加入侵能力，再通过受体介导的胞饮作用将复合体转入细胞。许多细胞对核酸亲合性物质有相当高的亲合性，所以在不需内吞因子的条件下，核酸偶合体和结合因子可以直接被细胞吸收。事实就是这样，如本发明发现肝细胞可以吸收DNA-多聚赖氨酸复合体。
在本发明提供的一个实例中，细胞内涵体溶解剂是病毒，它与核酸亲合性物质连在一起，能作为偶联体/核酸复合体的一部分协助细胞吸收，并在复合体进入细胞后使细胞内涵体中的组分释放到胞浆中。
在另外一个实例中，细胞内涵体溶解剂是病毒组分，它与核酸亲合性物质连在一起，能作为偶联体/核酸复合体的一部分协助细胞吸收，并在复合体进入细胞后使细胞内涵体中的组分释放到胞浆中。连接在核酸结合区的病毒或病毒组分不管结合形式怎样，后文均称之为“病毒偶联体”。
病毒偶联体是本发明的主体，病毒或病毒组分是他们功能性结构必不可少的部分。它根据病毒载入内吞因子偶联体的优点来建造或组合载体系统的优点。
再者，从本发明实验中可以发现病毒偶联体还有一个优点，它 可以避开所熟知的大分子偶联体体系本身所具有的基本的限制，不象受体介导的细胞内吞作用机制进行基因转移时所用的偶联体那样，它们可经由特殊的机制使自己从细胞运载体系中释放出来。
病毒偶联体所采用的载体系统从基本概念上区别于重组病毒媒体，在病毒偶联体系中，待转运的外来DNA在病毒颗粒的外部。因此，根据本发明的实例，病毒偶联体可将很大结构的基因转入细胞，而不受其序列的限制。
所采用自由或结合病毒或作为病毒组分的部分病毒的适合性由它们的吸收功能来决定。换句话说，合适的病毒粒子是那些能够在核酸复合体转染细胞时通过受体介导的胞饮作用而进入细胞，并且能够从细胞内涵体中释放到胞浆中-因此核酸也释放出来。这样的病毒粒子除本文提到的那些外，还包括其它的能被特殊的细胞吸收并引起细胞内涵体组分释放到胞浆中的病毒。
这类病毒和能被穿透的高等真核细胞的例子，请参看Fields，B.N.and    Knipe，D.M（1990）。在一个病毒作为“自由”病毒促进偶联体转运导入细胞时，所选定细胞的易感性依赖于靶细胞表面病毒受体的存在及数目的多少。Svensson，1990，and    Defer    1990给出了确定Hela和KB细胞中腺病毒细胞表面受体数目的方法。推测腺病毒受体是普遍存在的。
另一方面，合适的病毒粒子包括那些用核酸复合体进行细胞转染时，可通过受体介导的胞饮作用穿透细胞，并能使它们从细胞内 涵体在释放至胞浆中-所以核酸也被释放。抛开这种理论，这种细胞内涵体溶解活性，就选用自由病毒来说，能够有利于核酸复合体转入细胞，直到这一复合体与病毒一起从细胞内涵体转移到胞浆中，假设它们在病毒内吞时到达同一细胞内涵体。当复合体包括有结合形式的病毒时，它们得益于病毒的细胞内涵体溶解活性而从内涵体内转至胞浆中。这就避免了细胞内涵体与溶酶体的融合，因此也就避免了在这些细胞器中经常发生的酶解反应。
具体地说，适合于本发明组成的病毒（在感染一开始就具有吸收功能，通过受体介导的胞饮作用实现）一方面包括没有脂质膜包裹的病毒，如腺病毒、灰质病毒、鼻病毒，另一方面也包括脂层包裹的Semlki    Forest病毒、口炎病毒、流感病毒;PH值依赖性的Moloney病毒也适合。在本发明的实际应用中可被优先选用的病毒包括：腺病毒C亚组、5型、Semliki    Forest病毒、泡状口炎病毒、鼻病毒、灰质病毒和Moloney白细胞病毒。
在本发明中，应用不含逆转录酶的RNA病毒有明显的优点，用这种病毒进行细胞转染时不会在被转染细胞中产生病毒DNA。鼻病毒HRV2（细小核糖核酸病毒组中的一个代表），可增加报道基因的表达。本文对自由形式和病毒偶联体状态的鼻病毒的功效都进行了研究。
本发明中所说的病毒-假设它们能被细胞吸收并在到达细胞 内释放出细胞内涵体内的组分-除包括野生型的外，还包括失去某些野生型功能的突变性，可以是一个或多个突变，特别是它们的复制能力，但不能是它们的吸收功能。
突变体经由常规的诱变方法，通过负责复制功能并可在包装线上得到补充的病毒蛋白区的突变而产生。这些包括（如就腺病毒而言），ts-突变体（温度敏感突变体），E1A和E1B突变体，MLP-驱动基因发生突变的突变体（Berkner，1988）以及某些衣壳蛋白区发生突变的突变体。具有相应的自发突变的病毒株也是适合的。病毒的复制能力可以被检验出来，例如可采用文献上介绍的斑点试验法，在细胞培养基中覆盖上各种浓度的病毒悬浮液，通过记录斑点就可观察到溶解细胞的数量（Dulbecco    1980）。
其余的可适于本发明应用的病毒体包括所谓的缺损病毒，如在一个或多个基因中缺少必要的自身复制功能的病毒，它在复制时需要由助病毒参加。这类例子有DI-微粒（缺损性干扰性微粒），它可从传染性的标准病毒衍生得到，与标准病毒有相同结构的蛋白质，含有突变并且需要标准病毒作为助病毒进行复制（Huang，1987;Holland，1990）。这类例子还包括卫星病毒（Holland，1990）。另一组是一类叫做腺苷-相关性病毒的微小病毒（Berns，K.I.1990）。
因为许多病毒的入侵循环还不完全清楚，看来还有其它的一些病毒具有细胞内涵体溶解活性，这也适合在本发明中运用。
衰减的活疫苗（Ginsberg，1980）或接种体也可适于本发明。
本发明所指的病毒也包括灭活的病毒，如化学处理（如甲醛处理），UV照射化学处理和UV照射，相结合（如补骨脂素/紫外线照射），γ-照射或中子轰击等方法灭活的病毒。灭活病毒（一些也用作疫苗）可以按照文献（Davis    and    Dulbecco，1980，Hearst    and    Thiry，1977）通过标准的方法进行制备并检验它们是否适用于增加DNA复合体的转移能力。在本发明所进行的实验中，腺病毒的制备用常规的紫外消毒灯或者甲醛进行灭活处理。我们惊奇地发现，病毒的灭活程度比腺病毒加入转染介质后引起的基因转移降低效应大的多。我们用补骨脂素/紫外法灭活的生物素化腺病毒与链抗生物素蛋白偶联的多聚赖氨酸联合起来进行实验，同样发现病毒灭活率比基因转移能力降低的迅速。这些结果清楚地表明，可以破坏活泼病毒的正常复制功能而不影响它的基因转移效能。
所谓“病毒组分”指的是病毒的一部分，如不含核酸的蛋白质部分（可用重组方法获得的空的病毒外壳，Ansardi    et    al.，1991;U-rakawa    et    al.，1989），具有完整病毒细胞内涵体溶解功能的蛋白质（由分馏得到）或多肽。这些病毒组分可用化学法得到，根据其大小的不同可用多肽合成法或重组法。在本发明中，腺病毒蛋白通过生物素/链抗生物素蛋白与多聚赖氨酸偶联起来，显示有增强基因转移活性。内吞所必需的碎片或蛋白质除来自腺病毒外，还包括流感病毒血细胞凝集素（HA）。血细胞凝集素的HA2亚单位的N-末端 序列负责使病毒从细胞内涵体中释放出来。我们发现这个序列含有20个氨基酸的多肽能使脂质膜融合，从而使膜部分打开或破坏（Wharton    et    al.，1988）。在本发明中，很多实例都成功地运用了原始的或修饰的流感肽。另外的例子有逆转录缤纷度的外壳蛋白，如HIV    gp    41（Rafalski    et    al.，1990），或这些病毒蛋白质的一部分。
具有穿透细胞能力的病毒作为内吞因子进行应用，这仅仅是本发明的一个方面。
病毒或病毒组分本身没有结合细胞并进入细胞的能力，而是常常象上文定义的那样作为一个病毒偶联体进行应用。病毒与DNA结合区相偶联（如多聚赖氨酸）以保证能获得DNA分子亲合性并与之复合，随后作为核酸复合体的一个组分转运至细胞内，其中核酸复合体的组分还包括内吞因子偶联体和DNA结合区。除了可提高转移效果外，病毒（组分）与核酸结合区的结合也可以提高它的细胞内涵体溶解活性。
若选用这里描述的其它内吞因子，实践证明任何高等真核细胞都可用本发明的组合物进行转染。
每人都可通过简单的筛选试验确定给定的病毒（组分）是否有吸收功能并可在本发明的实践中采用。在这种试验中，如检查一种病毒作为自由病毒的实用性，将靶细胞与DNA复合体在有或无这种病毒存在下进行紧密结合。释放到胞浆中的DNA复合体的数量 可以通过检测标准基因产物（如虫荧光素酶）来确定。如果与没有病毒相比，病毒存在时使DNA复合体的吸收和向胞浆中释放水平高出很多，那么可以将这归因于病毒的吸收功能。可以比较所测病毒对DNA复合体吸收水平的影响，并与另外已知具有合适吸收功能的病毒相对照，如腺病毒C亚组，5型。这类检验方法也可用于病毒偶联体，另外的参量（如各种数量下的不同的内吞因子偶联体）也易于本法检验。另外，技术熟练者能容易地运用本试验，并选择性地与另外的检测方法相结合，如脂质体渗漏试验，来检测病毒组分或具有细胞内涵体溶解活性的其它试剂增强基因表达的能力。
当应用完整的病毒时，应进行检查实验，首先应初步检验病毒增加基因转移的能力，观察病毒是否能够复制。检验病毒的复制能力可选用斑点试验（见上文）或CPE试验或者晚期基因表达的确定（适于细胞病病毒或者对宿主细胞的生长有明显损害作用的病毒）。对于另外的病毒，根据具体的病毒而选用相应的方法，如血细胞凝集试验或化学-物理方法，如电子显微镜。
适于本发明的最佳病毒，特别是用作自由病毒的病毒，是那些可以产生高的效价，性质稳定，在原始状态有低的致病性并且复制功能可以靶向消除的病毒，特别是腺病毒。如果转染一个特殊的细胞种群，则选用专门对该种群进行感染的病毒。如果转染不同细胞型的细胞，则可选用对很多细胞型有感能力的病毒。
对自由病毒组成部分的要求是制备的病毒需要尽可能纯化，并 应选取与具体的病毒相匹配的缓冲液。
在任何情况下，本发明用于疾病治疗时，可选用的病毒或病毒组分要尽可能减少安全危险，特别是病毒在靶细胞内复制以及病毒DNA与宿主DNA重组。
非常有利的是，病毒感染动物（不包括人）的入侵机制可用来增加高等真核细胞对DNA的吸收及释放，只要病毒在高等真核细胞中显示有破坏细胞内涵体的能力。已经从鸟类，两栖类或其它的许多动物在分离得到腺病毒家族中的一些成员。例子参见，Laver，W.G.et    al.，1971;Bragg，R.R.    et    al.，1991;Akopian，T.A.    et    al.，1991;Takase，K.    et    al.，1990;Khang，C.    and    Nagaraji，K.V.，1989;以及Reece，R.L.    et    al.，1987。两栖动物，鸟，牛，狗，鼠，羊，猪以及猴腺病毒都可从美国马里兰州American    Type    Culture    Collection，Rockville，Maryland得到（见American    Type    Culture    Collection    Catalogue    of    Animal    Viruses    and    Antisera，Chlamydae    and    Rickettside，Sixth    Edition，1990，C.Buck    and    G.Paulino    eds.pp.1-17）。
选用从远属动物中得到的病毒（如一种腺病毒）的一个潜在的优点是可以降低对靶细胞的毒性（如鸡或蛙腺病毒在哺乳动物细胞中不太可能复制或开始早期的基因表达），与人腺病毒相比，远属腺病毒可以减小对制备者的毒性，可降低人或鼠抗体对靶有机体的干 扰。在选用病毒进行人或鼠的基因治疗时，没有人或鼠抗体的干扰是非常重要的。
鸡腺病毒CELO（鸡胚离体致死病毒，chick    emlry    lethal    orphen    virus）对识别感染哺乳动物细胞的腺病毒的多组抗原决定基的抗体没有反应活性。但是CELO可以在受精卵中生长而产生很高水平的病毒（0.5mg/egg;Laver    at    al.，1971）。正象实例中所示，CFLO-多聚赖氨酸偶联体可以增加DNA向Hela细胞的转运，其水平与人腺病毒d1312相当。因此，选用CFLO偶联体来增加DNA的转运在人的基因治疗实验中有很大的前途。
正象本文所述，在组合复合体时，应优先选取远属品种的病毒作为病毒偶联体的组分。
在本发明含有病毒的偶联体中，病毒与核酸结合区的结合可以是共价键或者非共价键，如生物素-链抗生物素蛋白桥或离子键结合，（假设病毒表面蛋白有-酸性区，所以能与多聚正电荷体结合）。
在本发明的实践中，首先由腺病毒和多聚赖氨酸在允许离子间相互作用的条件下形成复合体，然后再与DNA复合。进行对照实验时，首先用DNA将多聚赖氨酸中和，因此也就不能自由地与腺病毒结合。这些实验中，由离子键结合腺病毒的复合体的效果好。
在本发明中，用于细胞内涵体溶解偶联体的病毒组分是空的病毒衣壳或病毒多肽。病毒组分与核酸结合区的结合可以是共价的（如病毒肽与多聚赖氨酸的化学偶合）或者非共价的（如离子键，假设病毒组分含有酸性残基去结合多聚正电荷体）。
病毒或病毒组分与核酸亲合性物质的比率可能很大差别。就流感血细胞凝集素肽-多聚赖氨酸偶联体来说，当偶联体中病毒肽的量较高时有较高的增强效应。
本发明的另一部分是制备病毒偶联体的方法。
制备病毒或病毒组分与核酸亲合性物质偶联体（类似内吞因子-多聚正电体偶联体），可通过化合物结合法（假设是病毒组分，且核酸亲合性部分是多肽）或重组法;具体制备方法可参阅文献EP388758。
病毒或病毒组分或多肽与多氨基化合物连接时可象多肽偶合那样用化学方法偶合，必要的情况下，如果单体组分不含有适合偶联的功能基（如疏基或醇羟基），在偶合前要先经连接臂样的物质修饰。连接臂是一双功能基化合物，先与单体组分的功能基进行反应，再将修饰的单体组合偶联。
进行偶联可通过：
a）二硫化物桥，在还原条件下可重新断裂（如用琥珀酰胺基-吡啶基二硫代丙酸，Jung    et    al;1981）。b）在生理条件下比较稳定 的化合物（如通过马来酰亚胺连接臂与连接在另一个组分上的连接臂的硫氢基反应形成硫醚）。c）在生理条件下不稳定的桥，如：酯键，缩醛或缩酮键等在微酸性条件下不稳定。
在本发明的实验中，用化学方法通过琥珀酯亚胺基吡啶基二硫代丙酸（SPDP）将细胞内涵体溶解性的流感-学细胞凝集素HA2-肽与多聚赖氨酸偶合起来。实验发现，多肽经多聚赖氨酸修饰后，细胞内涵体溶解活性增加。转染实验表明，如果有流感肽-多聚赖氨酸偶联体存在，会大大增加由转铁蛋白-多聚赖氨酸介导的基因转移效率。
还有，本发明用多种不同的方法将腺病毒与多聚赖氨酸结合，偶联腺病毒与多聚赖氨酸的一种途径是先将腺病毒d1312用杂原子双功能试剂修饰，然后用类似于生产转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体的方法进行联接。没结合的多聚赖氨酸用离心法除去。DNA结合容量可用放射性标记的DNA进行结合实验来测定。（在没有氯喹存在的K562细胞中，实验发现用由DNA，腺病毒-多聚赖氨酸和转铁蛋白-多聚赖氨酸组成的复合体比用不与DNA结合的未修饰腺病毒进行基因转移效果明显提高。实验还发现用多聚赖氨酸修饰的腺病毒时，在5X105个Hela细胞中加入0.0003μg DNA就可发生明显的基因表达）。
如果病毒或病毒组分（或其它的内吞因子，如转铁蛋白）包含有 合适的糖链，它们可由糖蛋白的一个或多个糖链与核酸亲合性物质连接起来。
本发明制备病毒偶联体的另一个好方法是用酶偶合法将病毒或病毒组分与核酸亲合性物质偶联起来，特别适于多氨基体，选用转谷氨酰胺酶。
转谷氨酰胺酶的种类很多，特别是存在于表皮（表皮转谷氨酰胺酶），血液（因子ⅩⅢ），和不同的组织细胞中（组织转谷氨酰胺酶，如肝转谷氨酰胺酶）（Folk，1985）。转谷氨酰胺酶在Ca++存在下催化ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸的形成，并伴随有NH3放出。这一反应的先决条件是蛋白质中存在有相对应的能被酶反应的谷氨酰胺和赖氨酸。除了赖氨酸的ε-氨基外，象乙醇胺，腐胺，精胺，精脒等（多）胺也可做为（Clarke et al.，1959）。到目前为止还不知道是什么关键性因子决定了酶是否催化蛋白质中的谷酰胺或赖氨酸或多胺进行反应。已经明确知道的是多胺可用转谷氨酰胺酶结合到很多细胞蛋白上，如细胞角蛋白（Zatloukal et al.，1989），微管蛋白，细胞膜蛋白以及流感病毒的表面蛋白（Iwanij，1977）。
在本发明中，发现可以用转谷氨酰胺酶将多聚赖氨酸与腺病毒结合。实验发现这一偶合反应可在甘油存在下进行。这就有个病毒制备的优点，在制备病毒（如腺病毒）时，缓冲液中加入甘油作稳定剂，所得病毒可直接用于偶合。用腺病毒-多聚赖氨酸偶联物复合的质粒-DNA与转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体一起，与在非多聚 赖氨酸偶合的腺病毒存在下用转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体相比，可得到增强很多倍的基因表达。
本发明的另一个制备偶联体的好方法是通过生物素-蛋白质桥（生物素-链抗生物素，蛋白较好）将病毒或病毒组分与多聚正电荷偶联。
用生物素修饰腺病毒，化学方法将链抗生物蛋白与多聚赖氨酸相连（类似于制备转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联物，Wagner，et    al，1990），然后利用生物素与链抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的强的亲和力将腺病毒和多聚赖氨酸偶联。即便在较低的DNA浓度下，复合体（包括DNA，链抗生物素蛋白-多聚赖氨酸及结合的生物素修饰的病毒，任意量的非共价结合的多聚赖氨酸）有非常高的转染效能。特别是，如果生物素修饰的病毒先与链抗生物素蛋白-多聚赖氨酸结合，由此而得的复合体效果最佳。
如果需要的话，也可用抗生物素蛋白与生物素结合，同样有效。
也可以选用标准的商用多克隆或单克隆抗生物素体建立病毒组分和多聚赖氨酸间的结合：首先生物素化病毒，再进行抗生物素抗体与多聚赖氨酸的偶合，最后依靠生物素/抗体间的结合将病毒和多聚赖氨酸结合起来。
病毒与多聚赖氨酸间的结合也可通过对病毒表面糖蛋白有亲合性的植物凝血素偶合多聚赖氨酸而得到，这一偶联体的结合受植物凝血素和糖蛋白之间结合的影响。如果病毒本身不含有合适的 糖侧链，可进行适当的修饰。
也可以首先用病毒相异性抗原（如毛地黄毒苷DIG，得至Boehringer    Mannheim，或生物素）。对病毒的表面进行修饰，通过结合该抗原的抗体建立起修饰病毒与核酸亲合性物质间的联系。本文选择产生偶联体的具体方法依赖于不同的标准。生物素介导的偶合是最不具特异性的，所以是最广泛应用的方法，只要生物素介导的结合形成非常强的非共价键结合。用转谷氨酰胺酶进行酶反应的优点是在量非常小时仍能进行。化学方法通常在大量合成偶联体时选用，而且通常是偶合病毒蛋白或多肽的最佳方法。如果要用灭活病毒，灭活反应通常在偶合前进行，（假如偶合不受灭活的影响）。
如果病毒（如腺病毒）或这里所说的细胞内涵体溶解组分有易于结合的结合区，（如结合多聚正电荷体的酸性区），病毒（组分）与多聚正电荷体的结合也可以是离子键。在这种情况下，多聚正电荷体（可任意地与内吞因子相结合）的部分正电荷被病毒的酸性区域中和，剩余的正电和必须用来中和核酸。
如果核酸亲合性物质是一插入剂，它要被一个适合具体的病毒偶合方法的连接臂修饰，例如，用转谷氨酰酶偶合时选用精胺修饰，用法偶合时选用双方功能基臂修饰，如活泼酯。
病毒（组分）/核酸结合物的比率可能是不一样的，这通常在实验中建立，例如通过固定量的病毒（组分）与不同量的多聚赖氨酸偶联和选择最佳的偶联体进行转染实验。
在本发明的另一实例中，病毒组分（如细胞内含体溶解性病毒肽）可以被修饰以便能直接与DNA结合。结果使这一多肽本身包含有一个DNA结合区，该区可在制备多肽过程中形成，并提供一个带正电荷氨基酸组成的长链，优选通过多肽的延长，更优选在C-末端。
在本发明的另一实例中，细胞内含体溶解剂是非病毒-选择性合成的多肽。这种类型的多肽通过离子键与核酸和性物质（如，多聚赖氨酸，假设是DNA-内吞因子一多聚赖氨酸复合体）结合而包含在本发明的组合物中。所以，细胞内涵体溶解肽进入核酸复合体是靠它本身的氨基酸残基与正电性的核酸结合区（选用多聚赖氨酸）的结合来实现的。
根据多肽的化学结构，特别是它的末端基团，多肽与多聚赖氨酸的结合也可用本文描述的连接多肽和多聚赖氨酸的方法来实现。为此，如果选用天然产生的多肽，可能需要用适当的末端氨基酸（作为偶联的把柄）进行修饰。
另一种将非病毒性细胞内涵体溶解肽组合到DNA中的途径是在肽上装备具有DNA结合能力的序列。该序列引入后必须不影响肽本身的内涵体溶解活性。因此，举例来说，如果多肽的N-末端延伸出DNA结合序列。可将这一范围扩大至同序列或不同序列正电荷寡肽，如寡聚赖氨酸尾部，或天然的DNA结合区（如有组蛋白分得的多肽）。通常这些DNA结合序列作为内涵体溶解肽必不可 少的一部分，约由10-40个氨基酸组成。这种方法有可能使内涵体溶解序列与DNAⅩⅣ结合序列的比率增高，而要得到复合体的高效率，则需在多肽偶联体中有很大比例的多聚正电体。
非病毒性溶解肽应满足下列要求：
就内涵体溶解活性而言，由多肽引起的脂质膜渗漏在低PH值（5-6）应当比在PH＝7时高。而且膜的破损面积应当足够大，以使较大体积的DNA复合物通过（小细孔是不够的），为确定一个多肽是否满足这些要求，可以用自由状态或结合形式和/或结合在DNA复合体的多肽进行体外试验。这些试验包括脂质体渗漏试验，红细胞渗漏试验和细胞培养实验（该实验可测定基因表达的增强）。这些检验方法在实例中都有描述。可以通过初步的检查基因转移效率的滴定试验而确定多肽的最佳用量。但我们必须牢记病毒肽的效率和复合体的最佳组成可能依赖病毒类型。
具有膜破损活性的多肽通常包含有两个序列，也就是可以与脂质膜相互作用的疏水面，及在膜破损部位稳定水相的亲水面。
在自然界中有几个膜破损性肽的例子，通常是小肽或大分子肽的肽区，这些肽可根据自然状态下的功能进行分类，可分为膜破坏性肽（如裸露病毒的肽）和/或膜融合性肽（如包裹病毒）。为使合成肽具有内涵体破坏活性，两类肽序列都是有用的。很多天然的肽可以形成两性α-螺旋体（amphipathic    a-hetics）
如果在一个假设的两性α-螺旋体的亲水面结合上酸性残基， 则可以获得PH专属性。在这种情况下螺旋体只能在酸性条件下形成，而在PH为中性是，因带负电荷的酸性残基间的静电斥力阻碍螺旋体形成。实验发现自然产生的序列也有这种性质（如流感HA-2N-末端）。
一个合理设计并完全合成的具有PH专一性膜破坏性质的两性肽已被应用（Subbarao    et    al，1987;parente    et    al，1990）。实验表明该肽（自由状态）只能在膜上形成小孔洞，只能允许小分子化合物释放出来（Perente    et    al    1990）。
根据本发明应用非病毒的，选择性合成肽的具体情况，通常进行下列步骤：从自然产生或人工修饰的肽中选出两性肽序列。这类肽可用实验技术检测，一些例子总结在表2中。如有必要，在肽上引入酸性残基（谷氨酸，天冬氨酸），以增加肽的膜破损活性的PH专属性（如流感血细胞凝集素肽的双酸突变，参见实例33）。
如有必要，也可引入酸性残基以利于肽与多聚赖氨酸的结合。装备这种多聚正电荷体结合区的一种方法是在C-末端进行酸性延伸，如寡聚谷氨酸尾巴。适于本发明的内涵体溶解肽也可通过天然序列和人工修饰序列的相互融合而得到。在本发明中，用从合成肽GALA（Parente    et    al.，1990）衍生出的各种肽进行了实验。本发明实验中所用的一些衍生物通过GALA或其修饰物和流感肽或其修饰物的序列组合得到，如例33中所给出的EALA-Inf和EALA-P50等肽。
肽链的长度可能是两性螺旋体稳定性的关键因素;可以通过螺旋的延长来增加从天然蛋白质中得到的缺乏稳定蛋白功能的短链肽区的稳定性。
为增加肽的内涵体溶解活性，可以形成均一二聚体、不均一二聚体或寡聚体;本发明的有关实验表明P50二聚体比单体有较高的活性。
本发明已经表明合成肽对转铁蛋白-多聚赖氨酸偶联体介导的DNA吸收的影响。有许多不同的肽被合成，它们的脂质体和红细胞渗漏试验以及它们对虫荧光素酶在TIB73细胞和NIH3T3细胞中表达的影响都被检验。
本发明的另一个实例，内涵体溶解剂可以是非肽物质。适于本发明应用的这类物质必须具备的条件与两性肽基本相同，即结合到DNA复合体中去的能力，PH专属性，等等。
本发明的另一方面设计可被高等真核细胞吸收并将核酸导入高等真核细胞的复合体，它由核酸和能与核酸形成复合体的偶联体组成。复合体的特点是：偶联体由核酸亲和性物质和与核酸亲和性物质想结合的内涵体溶解剂组成，可作为偶联体/核酸复合体的一部分被细胞内吞，并在复合体进入细胞后使内涵体内的组分释放至胞浆中。
具体地说，本发明中所用的内涵体溶解剂最好是与多聚正电荷体共价结合的病毒或病毒组分。
本发明所说的内涵体溶解偶联体还包括（内涵体溶解剂与DNA结区靠离子键结合的偶联体除外）那些内涵体直接与DNA相结合的物质，（如经过它们适当的延伸），虽然严格地讲这类“偶联体”不是经过偶联（两个化合物相互结合）得到的。这种类型的内涵体溶解剂（在本发明中作为组成复合体的化合物）的功能与他们是怎样形成（通过内涵体溶解剂和DNA结合区的偶联合成，或者内涵体本身就含有DNA结合区）的无关。
本发明的另一个实例是复合体包含另外一个偶联体（内涵体溶解偶联体除外），该偶联体由核酸亲和性物质（假设内涵体溶解性多聚正电荷偶联体通常作为偶联体有一样的正电荷）与对靶细胞有亲和性的内吞因子偶合而得。该实体尤其适用于没有或很少有病毒（被用做内涵体溶解偶联体的一部分）受体的靶细胞。该实体另外也适用与靠自己本身不能穿透被感染细胞的病毒组分（如，自然发生的，选择性修饰的肽，非病毒性，选择性合成的内涵体溶解性肽或从远属动物中分离得到的病毒等）。在附加的内吞因子-结合因子偶联体存在下，内涵体溶解性偶联体通过与核酸及第二个偶合体的复合，作为所得到复合体的一部分得益于第二个偶联体的内吞能力而被细胞吸收，该复合体在以下称为“组合复合体”或“三元复合体”。如果不受这一理论的限制，该组合复合体可以通过与对附加内吞因子特异性的受体结合，或者，如果选用病毒或病毒组分，通过与病毒受体的结合，或者通过与两个受体的结合，然后通过受体介导的胞 饮作用而被细胞内吞。当内涵体溶解剂从内涵体中释放出来后，复合体中所包含的DNA也同时被释放到胞浆中，这样就逃避了溶酶体的降解。
在本发明的实验中，几乎所有的Hela细胞都能被自由腺病毒转染。当用三元DNA复合体（DNA与多聚赖氨酸-转铁蛋白偶联体复合并与腺病毒相连接）时，对肝细胞的转染功效还能进一步提高。在这里，内涵体溶解性病毒和配体受体复合体同时存在于内涵体中，确保实践中的所有细胞都产生转染，例如BNL.CL2和HepG2细胞等很多细胞。在这种情况下，细胞表面的病毒和转铁蛋白受体都可用来捕捉三元DNA复合体。然而，我们也可以设想DNA三元复合体只通过细胞的配体/受体间的联系而被细胞内吞。这种情况类似于实验中用包含有转铁蛋白的三元DNA复合体进入K562细胞时，主要通过转铁蛋白受体途径而不是腺病毒受体。
出乎意料的是，即使在很低的水平进行DNA转移，三元复合体都能将DNA转移。这样，在投入30pgDNA/3×105个细胞时，得到1.8×104光单位（得自虫荧光素酶编码质粒的表达）。在这种投药水平，每个细胞中只含有60个DNA分子和1PEU病毒。这相当于低效率钙离子沉淀法每个细胞2×105个DNA分子的水平（Molecular Cloning，Sambrook，J，et.al.（Eds），2nd Edition，Vol.3，pp.16.39-16.40（1989））。因此，本发明在技术上提供了 一个很大的改进，因为可以用很少量的DNA对高等真核细胞进行有效的转移。
病毒，病毒组分或非病毒性内涵体溶解剂在DNA复合体中作为内涵体溶解性偶联体的组分存在具有以下优点：
1）使核酸复合体进行基因转移技术的应用范围增宽，因为内涵体溶解剂本身（特别是若选用病毒或病毒组分时）可以构成内吞因子或者也可以与内吞因子（如转铁蛋白或唾液酸缺乏胎球蛋白（asialofetuin），一起形成DNA复合体。用这种方法可以使病毒对那些即使不含有该病毒受体的细胞也有可能产生正的效应。
2）提高基因转移效率，因为内涵体溶解性偶联体与DNA的结合确保了它们能够一起被细胞吸收。病毒及DNA的协同吸收及释放也有可能降低进行有效的基因转移所必需的DNA和病毒的用量，这点对体内应用是非常重要的。
本发明所采用的术语“内吞因子”指的是一些配体或碎片（当它们与细胞结合后可通过胞饮作用被细胞内吞）或因子（它们通过与细胞膜的融合作用而被细胞内吞或结合）。
比较适用的内吞因子包括配体转铁蛋白（Klausner，R.D.et.al.，1983），伴白蛋白（Sennett，c.et    al.，1981），唾液酸缺乏糖蛋白（如唾液酸缺乏转铁蛋白，aialorsomucoid，或唾液酸缺乏胎球蛋白（Ashwell，G.et    al.，1982），植物凝集素（Goldstein    et    al.，1980，Shardon，1987）或者包含有半乳糖塘并能被唾液酸缺乏塘 蛋白受体内吞的物质;甘露糖苷糖蛋白（Sly，W.et    al.，1982），LDL（Goldstein，J.L.et    al.，1982），修饰的LDL（Goldstein，J.L.et    al，1979），脂蛋白等可经受体（apo    B100/LDL）被细胞吸收的物质;病毒蛋白（如HIV蛋白gp120）;抗细胞表面抗原抗体（Mellman，I.S.et    al.，1984;Kuhn，L.C.et    al.，1982，Abrahamson，D.R.    et    al.，1982），或者其碎片，如抗-CD4，抗-CD7;细胞激素，如白细胞介素-1（Mizel，S.R，et    al.，1987），白细胞介素-2（Smith，K.A.et    al.，1985），TNF（Imamure，K.et    al.，1987），干扰素（Anderson，P.et    al.，1982），克隆促进因子（Walker，F.et    al.，1987）;因子和生长因子，如胰岛素（Marshall，S.，1985），EGF（Carpenter，G.，1984），血小板驱动生长因子（Heldin，C.-H.    et    al.，1952），转移生长因子β（Massague，J.et    al.，1986），神经生长因子（Hosang，M.et    al.，1987），胰岛素样生长因子I（Schalch，D.S.et    al.，1986），LH，FSH，（Ascoli，MN.et    al.，1978），生长激素（Hizuka，N.，et    al.，1981），催乳激素（Posner，B.I.et    al.，1982），高血糖素（Asada-kubota，M.et    al.，1983），甲状腺激素（cheng，S-Y.et    al.，1980）;α-2-巨球蛋白蛋白酶（Kaplan，J.et    al.，1979）;以及“解除武装”的毒素。另外的例子还有免疫蛋白或其碎片作为Fc受体或抗免疫球蛋白抗体（与SIgs，表面免疫球蛋白结合）的配体。这些配体可以是天然的也可以是合成得到的。参见Trends    Pharmacol.Sci. 10：458-462（1989），以及这里引用的一些文献。
适于本发明应用的这些因子应满足下列要求，
a）它们能被要导入核酸的特殊的细胞型内吞，且如果它们与结合因子相结合，其内吞能力不受或很少受影响，并且
b）利用这种性质，能够通过它们的路径将核酸一起载入细胞。
根据本发明所进行的实验结果，内吞因子或在组合复合体中的附加内吞因子有广泛的用途，许多实验反别证实了这一结论：通过人和鼠转铁蛋白多聚氨酸（PL）偶联体，唾液酸缺乏胎球蛋白偶联体，半乳糖-PL偶联体，麦芽凝集素偶联体，T-细胞特异性的gp120-pl和抗CD7-pl偶联体等方法和通过不含任何内吞因子的DNA多聚赖氨酸复合体方法。另外，根据本发明，用DNA和多聚赖氨酸偶合的病毒（或病毒组分）所形成的复合体（不含有另外的内吞因子-结合因子偶联体）进行实验，证实了病毒偶联体的作用。
特别是可进行初步的检验以确定应用内吞因子（假设内涵体溶解剂是自由病毒）或“附加”内吞因子（假设作为内涵体溶解剂的病毒或病毒化合物或非病毒肽是内涵体溶解性共聚体的一部分）是否允许或提高核酸复合体的吸收。这些检验包括用核酸复合体进行的两组转染实验，首先在没有（附加）内吞因子存在下，（例如，假设病毒与由核酸和病毒偶联体的复合体偶联），其次，所用的复合体包含有核酸、另外一个含有附加内吞因子（靶细胞含有对应受体）的偶联体，以及核酸亲和性物质。
如果选用内吞因子或选用附加内吞因子，即选用组合复合体，她将尤其受到耙细胞的限制，如，通过对应于某一细胞型的特殊的表面抗原或受体，将允许核酸转入这类细胞中。
在本发明范围内，一些对核酸有亲和性的物质也可被采用，例如，均一有机正电荷体（如多聚赖氨酸，多聚精氨酸，多聚鸟氨酸）或含有两种或更多种不同正电性氨基酸的非均一正电荷体，这些多聚正电荷体可能含有不同的链长，也可是合成的多聚正电荷体（如多聚乙基亚胺）。其它适用的核酸亲和性物质是有多聚正电荷性质的天然DNA结合蛋白，如组蛋白或鱼精蛋白或其类似物或其碎片，也可是精胺或亚精胺。
多聚正电荷体的长度不是关键因素，只要所得复合体是电中性的。多聚赖氨酸的链长范围可以是20～1000赖氨酸单体。但是对于一个给定长度的DNA，没有关键长度的多聚正电荷体。当DNA包含有6，000碱基对和12，000负电荷时，每摩尔DNA所需多聚正电荷体的量可以是;例如：
60摩尔多聚赖氨酸200
30摩尔多聚赖氨酸400或
120摩尔多聚赖氨酸100等等
一个具有普通技术的实验者只用常规的实验就能选择其它的多聚正电荷体的长度与摩尔量的组合。
其它的可作为偶联体一部分的适用物质是插入剂，如乙锭，吖 啶或插入性肽（含有色氨酸或/和酪氨酸和/或苯丙氨酸）。
就核酸复合物的定性组成而言，通常首先确定的是要被转移的核酸。核酸主要有它在细胞中要得到的生物效应来决定，如果用于基因治疗，则有要被表达基因或基因片断，例如，用于取代缺损基因，或者要被抑制基因的靶序列来决定。在没有核苷酸序列限制的情况下，要转运至细胞内的核酸可以是DNA或RNA。
如果本发明用于肿瘤细胞，以便将它们用作癌疫苗，待转运入细胞的DNA最好编码免疫调节物质，例如细胞活素IL-2，IL-4，IFN-γ，TNF-γ等。细胞激素编码DNA的组合可能尤其有用，例如，IL-2和IFN-γ。另一个导入细胞的有用基因可以是多药抵抗基因（mdr）。
向细胞中导入两个或更多个不同的核酸序列也是可能的，如，一个质粒含有编码两种不同基因的cDNA或者两个不同的质粒结构含有不同的cDNA。
基因治疗有效的抑制性核酸（用于转入细胞以抑制特殊的基因序列）包括可转录反义RNA或核酶的基因结构。另外也可将寡核甘酸导入细胞，如反义核甘酸。反义核甘酸最好有15个或者更多个核甘酸组成。寡核甘酸可以随机成为多聚体。当核酶要被导入细胞时，它们最好作为由稳定基因成分构成的一个基因的一部分而导入细胞，如，tRNA基因成分。文献EPA0387775阐明了这种类型的基因组合物。
除了选用核酸分子以利用它们的互补作用来抑制基因（如病毒基因）外，也可选用有不同形式抑制活性的基因。例如编码有所谓反控制突变的病毒蛋白的基因（Herskowitz，1987）。这种基因在细胞中表达得到的蛋白质能够控制相应的野生型蛋白，因此可保护细胞，细胞通过抑制病毒复制而获得“细胞免疫”。
合适的是那些在病毒的复制和表达过程中都必需的病毒蛋白的反控制突变，如，Gag-，Tat和Rev突变型等都有抑制HIV复制功能（Trono    et    al.，1989;Green    et    al.，1989;Malim    et    al.，1989）
获得细胞免疫的另一机制是封闭RNA分子（包含有必要病毒蛋白结合位点）的表达，如所谓的诱饵TAR（Sullenger    et    al.，1990）。
能够用于机体的基因治疗并能用本发明的方法作为组成基因的一部分导入细胞的基因包括：因子Ⅷ（血友病A）（见，例，Wood    et    al，1984），因子Ⅸ（血友病B）（见，例，kurachi，K.et    al.，1982），腺嘌呤脱氨酶（SCID）（见，例，Valerio，D.et    al.，1984），α-1抗胰蛋白酶（肺气肿）（见，例，Ciliberto，G.et    al.，1985）或胆囊纤维跨膜转导调节基因（见，例，Riordan，J.R.et    al.，1989）等等。但这些例子不构成任何形式的限制。
就核酸的大小而言，可以有很宽的范围;约0.15kb（假设tRNA包含有核酶）到50kb或更大的基因组合物可以用本发明中的 方法转入细胞;较小的核酸可用作寡核甘酸。
很明显，本发明有广泛的应用，因为它不受基因序列的任何限制，并且非常大的基因组合物也能用本方法转运。
从核酸开始，核酸亲和性物质（最好是多聚正电荷体）可被确定，为确保核酸的复合，得到的复合体最好保持电中性。如果复合体包含有附加内吞因子偶联体和核酸亲和性物质，两个偶联体的多聚正电荷体组分都要从电中性方面考虑。
早期的发明表明，如果偶联体与核酸的比率经过选择使得内吞因子一多聚赖氨酸/核酸复合体成电中性，那么可以使核酸进入细胞的转移效果最佳。实验发现如果一些转铁蛋白一多聚赖氨酸偶联体被共价结合的多聚正电荷体取代，核酸转入细胞的量并不减少;在某些情况下甚至可以增加DNA的吸收（Wagner    et    al.，1991a）。已经发现复合体中的DNA的存在形式是缩成一个直径80-100nm的扭曲结构。因此，多聚正电荷体的量可根据电中性和得到的紧密结构这两个参数进行选择，所选多聚正电荷体的量应当使与核酸负电荷作用后，所得到的复合体呈电中性，通常也使DNA紧密堆积。
所以，在本发明的另一实施方案中，复合体也包含非共价结合形式的核酸结合物质，它可以相同或不同于结合因子。假设内涵体溶解剂是自由病毒，复合体包括核酸和内吞因子偶合体。如果选用内涵体溶解性的病毒偶联体等，核酸与该偶合体的复合，通常与附 加内吞因子偶联体一致。非共价结合的“自由”的核酸亲和性物质的选择（性质及用量两个方面）也由偶联体决定，特别是取决与偶联体中的结合因子;如果，举例来说，结合因子是一个没有或有有限DNA缩合容量的物质，为得到有效的复合体内吞作用，通常可选取有较高这种性质的DNA亲和性物质。如果结合因子本身是一个DNA缩合剂并且已经能带来DNA足够的紧密堆积以产生有效的内吞作用，可选取通过其它机制来表达增加的核酸亲和性物质。
适于本发明应用的“自由”核酸亲和性物质包括那些能缩合核酸和/或防止它在细胞中被降解的物质，特别是上文提到的有多聚正电荷体性质的物质。另一组适用的物质是那些能通过与核酸结合使核酸的转录或表达提高的物质，（通过提高核酸对细胞报答机器的易感性）。这类物质的一个例子是染色体的非组蛋白HMG1，它具有缩合DNA并提高在细胞中表达的能力。
关于复合体，当决定其中内涵体溶解剂和/或内吞内子/核酸亲和性物质的比率时，应注意核酸的复合发生，所形成的复合体能与细胞结合并被内吞，并且，通过它自己或者在溶酶体溶解剂的帮助下从内涵体中释放出来。
内吞因子/结合因子/核酸的比率依赖于多聚正电荷体的分子大小及正电性集团的分布，这仪标准与被转运核酸的大小和结构相匹配。一般来说，内吞因子/核酸亲和性物质的摩尔比率范围是10/
当构建和合成偶联体并确定有效转染时的最佳偶联体：DNA比率后，可被取代的偶联体部分（必要的话是有核酸亲和性的自由物质）的量可由滴定法确定，如果多聚正电荷体被用作结合因子和自由的核酸亲和性物质，多聚正电荷体可以是相同的或不同的。
就本发明中选用病毒偶联体这一情况而言，确定复合体中各组分比率的一个适用方法包括;首先确定要转入细胞的基因组合物，象上文所述，寻找适合具体转染的病毒或病毒组分。然后，病毒或病毒组分与多聚正电荷体结合，并且与基因组合物复合。从固定量的病毒偶联体开始，可以通过该固定量的病毒偶联体处理靶细胞，并降低或增加DNA的浓度，进行滴定试验。用这种方法，可确定DNA：病毒偶联体的最佳比率。如果选用附加内吞因子，其过程可以是，以确定最佳的病毒偶联体与内吞因子偶联体的比率为例，从固定量的DNA开始进行滴定试验。
可以将下列组分混合在一起来制备复合体：ⅰ）核酸，ⅱ）病毒偶联体，可选择性地ⅲ）内吞因子/结合因子偶联体，以及可选择性地ⅳ）非共价结合的核酸亲和性物质，所有这些组分都可存在与稀溶液中。如果多聚正电荷体同时被用作结合因子和“自由”多聚正电荷体，通常首先制备偶联体和“自由”多聚正电荷体的混合溶液，然后将该混合液与DNA组合。DNA与偶联体和多聚正电荷体的最佳比率可用滴定法确定，即用固定量的DNA和变化量的偶联体/多聚正电荷体混合液进行一系列的实验。在混合液中偶联体：多 聚正电荷体的最佳比率可由常规实验或通过比较在滴定实验中所用混合液的最佳组成来得到。
DNA复合体可在生理盐水浓度下进行制备。另一种可能是选用高盐浓度（约2MNaCl）并随后用稀释或透析法调至生理条件。
组分核酸，偶联体，及可能时，非共价结合的核酸亲和性物质的最佳混合顺序可由预实验决定。在某些情况下，也可以先将核酸与偶联体复合再加入“自由”核酸亲和性物质，如，多聚正电荷体。如，转铁蛋白-乙锭二聚体和多聚赖氨酸偶联体。
在本发明的一个较好实例中，内吞因子或附加内吞因子分别是转铁蛋白，而且结合因子是多聚正电荷体。本处的“转铁蛋白”指的是天然的转铁蛋白和那些被受体结合并转入细胞的修饰蛋白。
核酸以复合体（内吞因子-多聚正电荷体偶联体与核酸复合）的形式被细胞吸收，当含有非共价结合的核酸亲和性物质组分时，该组分优选多聚正电荷体。该第二个多聚正电荷体相同于或不同于在该偶联体或两个偶联体中的多聚正电荷体。
如果核酸以“组合复合体”的形式被内吞，该复合体由内吞因子偶联体和内涵体溶解性偶联体与核酸复合而得。
在组合复合体中，与自由病毒或病毒偶联体一起应用的内吞因子和多聚正电荷体偶联体可用化学方法（如果多聚正电荷体是多肽）或重组方法进行制备;具体制备方法参阅文献EP388758。
在本发明中，较常采用的偶合方法是糖蛋白（如转铁蛋白）和结 合因子通过糖蛋白中的一个或多个侧链相互连接起来。
不同于普通的制备偶联体的方法，这类偶联体中不含有连接臂的修饰。如果糖蛋白中只含有适合偶联的一个或几个糖基团（如转铁蛋白），这些偶联体还有一个优点，就是它们可由其糖蛋白结合因子结合部位明确确定。
适于制备糖蛋白/多聚正电荷体偶联体的一个具体方法参见德国专利German    Patent    Application    P    4115038.4;最近Wagner也对该方法进行描述（Wagner    et    al.，1991    b）。
所选用内涵体溶解剂的性质及其浓度依赖于所进行的具体转染。一般用最小量的病毒或病毒偶联体，但必须确保病毒和核酸复合体的内吞及从内涵体中释放。病毒的用量对应于具体的细胞型，而且必须首先考虑病毒对该细胞的传染性。另一标准是具体的内吞因子和结合因子偶联体，特别对于那些靶细胞有许多持有受体的内吞因子。另外，病毒（偶联体）的量依赖于要被转运的DNA的量。一般来说，对于一个只需要少量DNA的稳定转染来说，只需少量病毒就足够了，而对于一个需要大量DNA的短暂转染来说，则需要大量病毒。对于一个具体的应用来说，当所选用DNA是一个特定的基因组合物（该基因组合物的大小与具体应用的细胞相一致），并包含有用作基因转移效率早期测定的受体基因时，要用待转染细胞（可能时，用混合细胞体，和转染体系）进行预实验以确定最佳的病毒浓度（用滴定法）。在本发明范围内，发现虫荧光素酶和半乳糖甙 酶基因是进行检查实验的合适的受体基因。
本发明的另一方面涉及向高等真核细胞导入复合体（包括核酸，核酸亲核物质，有时也含有内吞因子）的方法。该方法的特点是使细胞与一有特殊能力的试剂接触，该试剂可作为核酸复合体的一部分或者经过核酸复合体被细胞内吞，并且当核酸复合体进入细胞后使得含有核酸复合体的内涵体中的组分释放到胞浆中。
一般来说，最好同时应用核酸复合体和内涵体溶解剂，但是也可以在一个用完后再加入另一个。若分开使用，使用的顺序并不是关键，只要两步间隔不长以保证各组分能同时有效接触。
如果在分步制备中用自由病毒，同时给予带有复合体的自由病毒制剂可通过让病毒制剂作为转染介质（包含有核酸复合物）。
如果自由病毒同时给药，应在给药前先将核酸复合体和病毒制备混合。
在一较好的实例中，内涵体溶解剂是一组合复合体的一个组分。
为增加基因表达，根据本发明，组合物可以重复使用。
在一较好的实例中，所用细胞是初级肿瘤细胞。在一给定的具体实例中，核酸是一含有一个或多个编码免疫调节物质（最好是细胞激素）的基因的DNA。
在另一实例中，所用细胞是成肌细胞，最好是初级成肌细胞。
在另一实例中，所用细胞是成纤维细胞，最好是初级成纤维细 胞。
在另一实例中，所用细胞是肝细胞，最好是初级肝细胞。ⅩⅣ
在另一实例中，所用细胞是初级内皮细胞。
在另一实例中，所用细胞是初级导气管上皮细胞。
表1显示用各种不同细胞型细胞进行转染实验，通过本方法都转染成功。
本发明的复合体组合物也用来转染狗血友病B成纤维细胞。虫荧光素酶和β-半乳糖甙酶可在这些细胞中成功地表达。另外，本体系也用来将1。4kb的犬因子Ⅸ    cDNA运入血友病狗的成纤维细胞。在三明治ELISA中，转染24小时后仍可检测出犬因子Ⅸ。
在某些情况下，除内涵体溶解剂外也可选用容酶体亲和性物质，例如，如果这一试剂是内涵体肽偶联体或逆转录病毒，它们的内涵体溶解活性不严格依赖与酸性PH值。
众所周知，容酶体亲和性物质抑制蛋白酶和核酸酶的活性，并能因此抑制核酸的降解（Luthmann    and    Mangusson，1983）。这些物质包括：氯喹，尼日利亚霉素，金叶树苷和甲胺等。本发明的实验表明，当用Moloney逆转录病毒时，金叶树苷（Monensin）可增强受体基团的表达。
实验表明氯喹的存在可导致受体基因的表达，可使转铁蛋白介导的DNA转移100%转染K562细胞。BNL.CL2或HepG2肝细胞不能象K562细胞那样对氯喹作用应答，但当利用加入的复制缺 损或化学灭活的自由腺病毒的内涵体溶解活性时，可被转染5-10%。
在本发明的协助下，生物载体的优点得到增加。就受体的分布结果分析，倾向于内吞因子和病毒。通过比较这两个组分对具体细胞体系的作用效果，可以得到较高的选择性，这在本发明的基因治疗应用中特别重要。
本发明的另一方面涉及药用组合物，它含有作为活性成分的一个复合体，包括有治疗活性的核酸（最好作为基因组合物的一部分），内涵体溶解剂（选择性偶联）如可选择性使用的内吞因子偶联体。任何惰性的药用载体都可采用，如盐水，或磷酸缓冲液盐水，或其它任何载体（在这些载体中DNA有合适的溶解度，以便在本发明的方法中采用）。具体的药用组合物的制备方法参见Remington's    Parmaceutical    Sciences，Mack    Publishing    Co.Easton，PA，Osol    led.）（1980）。
本发明给应用提供了一个很大的可能性范围，特别是作为药用组合物。本发明的组合物可存在于冷干状态或深冻于适当缓冲液中。也可以作为现成试剂存在于溶液中，最好包装冷藏。可供选择的是，转染所需的必要组分，即，DNA，内涵体溶解剂（任意被偶合或已经与偶联体的另一部分形成偶联体），DNA结合物质（选择性与内吞因子偶合），可选择使用的自由多聚正电荷体等，可以分置在合适的缓冲液中或者分批作为转染试剂盒的组成部分，这也是 本发明的内容。在这样一个转染试剂盒中，为使该试剂盒作为一个标准的体系，可以存在不同的DNA（如编码不同的抗原）和/或不同的内吞因子偶联体。是否将各组分配成现成的混合液或用前将各分置的组分快速混合，依赖于复合体的稳定性（除非考虑特别的应用），这可由常规的稳定性检验来确定。在一个优选的实例中，转谷氨酰胺酶偶联的腺病毒已被证明可稳定保存，它被用作试剂盒的一个组分，在另一实例中，生物素化腺病毒和链抗生物素蛋白-多聚氨酸在应用前混合。任何一个普通技术水平的实验者可以利用本发明的灵活性设计很多不同的试剂盒。
对于治疗应用，本组合物可作为药用组合物而系统地给药，最好静脉注射。适于本应用靶器官可以是;肝，脾，肺，骨髓，及肿瘤等。
局部应用的一个实例是肺组织（本发明的组合物作为药用组合物而以气雾剂被吸入或做成溶液滴入）。另外，本发明的药用组合物可通过直接注射入肝，肌肉组织，肿瘤等途径给药，或者在胃肠道局部给药。应用这一药用组合物的另一种给药途径是胆汁导流系统。这种应用方法可允许药物在胆管中直接到达肝细胞膜，避免了与血液组分的相互作用。
最近，证明了利用成肌细胞（未成熟的肌肉细胞）将基因带到小鼠肌纤维中的可行性。由于成肌细胞可分泌基因产物到血液中，所以这种方法与治疗肌肉细胞的遗传缺失如与肌肉萎缩有关的缺失的方法相比，应用范围可能要广得多。因此，可用设计的成肌细胞传送基因产物，这些基因产物或在血液中起作用或被血液转运。本发明中的实验已经表明成肌细胞和肌管培养物，甚至初级成肌细胞和肌管（myobllop）培养物，都能被高效率地转染。最成功的转染培养基含有生物素化腺病毒，转铁蛋白-多聚赖氨酸和链霉抗生物素蛋白-多聚赖氨酸的复合物。除了报道基因虫荧光素酶和β-半乳糖苷酶之外，凝血因子Ⅷ也能在肌肉细胞中得以表达。此外，在含有小麦胚芽凝集素作为附加内在化因子的复合物中使用了鸡腺病毒CELO。
治疗应用也可以是体外的，其中将处理过的细胞，例如骨髓细胞，肝细胞或成肌细胞送回体内（例如，Ponder等人，1991，Ohawan等人，1991）。本发明的另一个体外应用涉及“癌症疫苗”。这种治疗方法的原理是从病人中分离肿瘤细胞，用编码细胞分裂素的DNA转染细胞。下一步可包括细胞的失活，例如通过辐射使细胞失活，其方式是它们不再复制，但仍能表达细胞分裂素。然后，经遗传修饰的细胞作为疫苗施用于病人，这些细胞曾经是从该病人体内分离出来的。在接种部位的周围，分泌的细胞分裂素可激活免疫系统，特别是通过激活细胞毒性T细胞。这些活化的细胞能够在机体的其它部分发挥它们的作用并且也能够攻击未处理的肿瘤细胞。因此，可降低肿瘤复发和逐渐转移的危险，Rosenberg等人（1992）描述了一种适合于癌症疫苗应用的基因治疗方案。可用本发明的基因转移系统代替Rosenberg所提出的逆转录病毒载体。在本发明的 实验中，用多聚赖氨酸偶联的腺病毒和转铁蛋白-多聚赖氨酸的复合物中所含的报道基因成功地转染了初级黑素瘤细胞。
本发明也能用于测定宿主对给定抗原的免疫应答。这样的检测是基于向表达抗原的细胞方向的基因转移。
能杀伤受感染细胞的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在宿主对病毒感染或肿瘤的防御方面起重要作用。T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间的相互作用是受到HLA（人淋巴细胞抗原＝MHC，主要组织相容性分子）限制的;为了研究在体外CTL杀伤检测中CTL对表达抗原的细胞的杀伤情况，必须以正确的HLA前后关系将抗原呈递给CTL，这通常意味着在自体靶细胞上进行。
CTL杀伤检测可如下进行：用含有抗原编码序列的DNA构建物转染APC。抗原决定簇将结合到MHC    Ⅰ类分子上并在细胞表面作为特异性CTL反应的靶出现。因此，当与病人血清样品一起温育时，取决于特异性CTL的存在，APC将被溶解。通过监测例如放射性铬的释放来测定溶胞作用，放射性铬是在加入血清之前被掺入APC中的。
已确立的方案（Walker等人，1989）采用诱导的B-LCL，通过用重组牛痘病毒转染来表达抗原基因。然而，表达抗原的细胞大约1天有效，由于疫苗的溶解作用而死亡。
通过使用本发明的基因转移系统将抗原编码DNA构建物，例如编码HIV或肿瘤抗原的构建物引入成纤维细胞以使之能够表达抗原的CTL杀伤检测可克服上述困难。
初级成纤维细胞易从活检中获得，易于生长，并已证明是可用本发明的方法转染的，其效率特别高（约50～70%）。
鉴于疫苗的设计，这样的检测可用于鉴定被杀伤细胞所识别的抗原决定簇。此外，为了测定个体对给定抗原的受到HLA限制的免疫应答，使用这样的检测是有利的。
因为被转移基因的高水平表达可在实际上所有的细胞中获得，所以可用本发明生产重组蛋白质。这里，对于被转移DNA的序列和分子量都没有或少有限制。可用本发明的DNA构建物转染的细胞类型也是广泛的。因此，几乎任何细胞类型都能用来生产重组蛋白质，这可确保以如实和完全修饰的转译后加工的形式生产重组蛋白质，从而保证产物的高生物学活性。
向细胞基因转移可如虫荧光素酶和α-干扰素中所示来完成，实际上可引入任何能产生所需蛋白质产物的基因构建物。在转染后24小时至1周或更长时间，从被转染的细胞培养物（细胞上清液或适宜的细胞匀浆，按照特定蛋白质产物的方案）可回收得到所需蛋白质产物。
应用本发明的基因转移系统生产重组蛋白质有以下优点：
1）由于转染效率高（90%以上的被转染细胞能以高水平表达引入的基因），不需预选阳性的被转染细胞且不必建立稳定的细胞系。小规模的细胞培养就足够生产可用量的蛋白质。
2）可引入大的基因构建物。迄今已成功地引入了长达48Kb的基因构建物。
3）基因表达可在能保证适当的转译后加工和修饰（例如，凝血因子的维生素K依赖性羧化作用，见Armentano等人，1990，或细胞类型特异性糖基化作用）的细胞中进行。
4）靶细胞类型的选择范围较宽便于用这种方法进行基因表达。
上面已一般性地描述了本发明，以下参照以说明方式提供的实施例将更易于理解本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明。本文中所引用的所有专利和出版物均作为本文的参考。
实施例
在下列用于说明本发明的实施例中，除另有规定均使用下列材料和方法：
转铁蛋白-多聚赖氨酸/DNA复合物的制备
a）人转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物
使用Wagner等人（1991b）描述的方法，其中将多聚赖氨酸偶联到转铁蛋白的碳水化合物侧链上。
将280mg（3.5μmol）人转铁蛋白（无铁，Sigma）溶于6ml30mM乙酸钠缓冲液（PH5）中的溶液冷却至0℃并加入750μl30mM含有11mg（51μmol）过碘酸钠的30mM乙酸钠缓冲液（PH5）。将混合物置于暗处冰浴中放90分钟。
为了除去低分子产物，进行凝胶过滤，（Sephadex    G-25，Pharmacia），得到含有大约250mg氧化转铁蛋白（用茚三酮测定法测得）的溶液。（为了呈现含有醛类的氧化形式并且当用茴香醛染色时产生颜色反应，将样品滴加到硅胶薄层板上并使之干燥，将这些板浸泡到对茴香醛/硫酸/乙醇（1/1/18）中，干燥并加热。将修饰的转铁蛋白溶液迅速（在10～15分钟之内）加到含有1.5μmol荧光素标记的多聚（L）赖氨酸（其平均链长为190赖氨酸单体，于4.5ml100mM乙酸钠，PH5）的溶液中。通过加入1M碳酸氢钠缓冲液将溶液的pH调到7.5。以1小 时的时间间隔，将4批28.5mg（450μmol）氰基氢硼化钠加到混合物中。17小时后，加入2ml5M氯化钠将溶液将总浓度调到0.75M。将反应混合物载于阳离子交换柱（Pharmacia    Mono    S    HR    10/10）上并用盐梯度为0.75M-2.5M的氯化钠（25mMHEPES的恒定含量，pH7.3）洗脱。装柱时和在梯度开始时高的盐浓度是获得多聚阳离子结合物所必需的。荧光活性弱的一些转铁蛋白（约30%）被洗脱出来;大多数荧光标记的结合物以1.35M～1.9M的盐浓度洗脱，共收集3馏分。这些馏分（依其被洗脱出来的顺序）在对2125mMHEPES（pH7.3）透析两次后得到含有45mg（0.56μmol）用366nmol多聚赖氨酸修饰的转铁蛋白的馏分A（TfpL    190A），含有72mg（0.90μmol）用557nmol多聚赖氨酸修饰的转铁蛋白的馏分B（TfpL190B），和含有7mg（85nmol）用225nmol多聚赖氨酸修饰的转铁蛋白的馏分C（TfpL190C）。如果不立刻使用这些馏分、则将转铁蛋白结合物在液氮中快速冷冻并以无铁形式贮存于-20℃。在掺加铁之前，用氯化钠将样品（0.5-1mg）调到生理盐浓度（150mM）。掺和铁的方法是每mg转铁蛋白含量加4μl10mM柠檬酸铁缓冲液（含200mM柠檬酸盐，通过加入碳酸氢钠将PH调到7.8）。含铁的结合物在用于进行DNA复合之前分成几小份，然后在液氮或干冰/乙醇中快速冷冻并贮存于-20℃（曾发现反复融化和冷冻会导致结合物失去活性，这个方法证明是可取的。）
b）小鼠转铁蛋白多聚赖氨酸结合物
对于人转铁蛋白，使用相似的方法，其中借助于碳水化合物侧链 进行偶联。从4.1mg（51nmol）小鼠转铁蛋白和2.1mg（34nmol）pL290中得到15.5nmol小鼠转铁蛋白和13nmolpL290的结合物。
质粒-DNA
a）PRSVL-DNA
用Triton-X溶解标准方法（Maniatis）制备DNA质粒PRSVL（含有在Rous肉瘤病毒LTR增强子/启动子控制下的Photinus    Pyralis荧光素酶基因（Uchida等人，1977，De    Wet等人，1987）），然后进行Cscl/EtBr平衡密度梯度离心，用丁醇-1脱色并对10mM    Tris/Hcl（PH7.5，1mMEDTA）透析。为了形成复合物，一般是在加到细胞中之前30分钟，将6μgDNA质粒材料（于350μlHBS（150mM    Nacl，20mMHEPES，PH7.3）中）与12μg转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物（于150μlHBS中）混合。
b）PCMVL-DNA
通过除去质粒PSTCX    556（Severne等人，1988）的BamH1-插入物制备质粒PCMVL（含有在细胞肥大病毒启动子控制下的Photinus    Pyralis虫荧光素酶基因的报道基因构建物），用Klenvw片段和HindⅢ/Ssp    1处理该质粒并插入得自含有编码虫荧光素酶序列的质粒PRSVL的Klenow处理的片段。Macgregor和Caskey（1989）描述了PCMV    β    gal。DNA的制备方法与PRSVL的制备类似。
病毒制剂的生产
a）腺病毒制剂
使用Jones和Shenk（1979）描述的腺病毒株d1312，其在Ela区域具有一个缺失。在Ela-反向互补细胞系293中进行病毒的复制，如Davidson和Hassell（1987）所述以大规模进行纯化。将纯化的病毒浸于贮存缓冲液（100mM Tris，PH8.0 100mM NaCl，0.1%BSA，50%甘油）或HBS/40%甘油中并将试样贮存于-70℃。对提取出的病毒基因组DNA进行紫外分光光度分析测定病毒粒子浓度（1个光密度单位（OD，A260）相当于1012病毒粒子/ml;
（Chardonnet    and    Dales，1970））。
b）逆转录病毒制剂
将Moloney小鼠的白血病逆转录病毒N2在专宿包装系（Keller等人，1985，Armentano等人，1987）中进行包装。收集病毒表达细胞的上清液，在液氮中快速冷冻并贮存于-20℃。实施例中所用的上清液通过与NIH3T3细胞形成抗新霉素集落测得其滴度约为106cfu/ml。为了进行病毒浓度实验，在氮气压力下使上清液通过AMICON搅拌细胞浓缩器中的300KD排阻膜（FILTRON）。通常，用这种方法使10-30ml上清液浓缩10倍。
细胞和培养基
在DMEM培养基中培养Hela细胞，培养基中添加有5%热灭活胎牛血清（FCS），100IU/ml的青霉素，链霉素（100μg/ml）和2mM谷氨酰胺。在EMEM培养基（Eagle改良基本培养基）中培养WI-38，MRC-5，和KB细胞，培养基中添加有10%热灭活胎牛血清，抗生素如DMEM培养基，10mM 非必需氨基酸和2mM谷氨酰胺。在F12-7X-培养基（Willumsen等人，1989）中培养CFT1，一种呼吸系囊性纤维变性上皮细胞系（用Yankaskas等人所述的方法（1991）制备;CFT1细胞系的特征在于它对于AF508缺乏CF-突变是纯合的）。为了进行基因转移实验，在6Cm的细胞培养平板中培养细胞直到大约50%的细胞会合（5×105细胞）。除去培养基并加入1mlDMEM或EMEM/2%FCS培养基。然后加入结合物-DNA复合物，紧接着加入腺病毒d1312（0.05-3.2×104粒子/细胞）或类似体积的病毒贮存缓冲液（1-80μl）将平板放回恒温箱中放置1小时（5%CO2，37℃），然后加入3ml完全培养基。进一步温育24小时之后，收集细胞以便测定虫荧光素酶基因表达。就CFT1而言，在进行基因转移实验之前在不含人转铁蛋白的F12-7X培养基中培养细胞4小时。
下列细胞系得自ATCC，可根据所给的目录号获得;Hela细胞：CCL2，K562细胞：CCL243，HePG2细胞：HB8065，TIB-73-细胞;TIB73（BNLCL2）NIH3T3细胞：CRL1658，293细胞：CRL1573，KB细胞：CCL17，WI-38细胞：CCL75，MRCS细胞：CCL171。H9细胞得自AIDS    Research    and    Reference    Reagent    Program，U.S.Department    of    Health    and    Humen    Services，目录号87。
通过在含有EDTA的试管中浸溶25ml脐带血样品得到初级淋巴细胞。用4.5ml    Ficoll-泛影钠（Pharmacia）铺试样于底部并在2，500rpm下离心15分钟。除去上部的血浆层与澄 清的Ficoll层之间的淡棕色层（大约10ml）。加入40mlIMDM和10%FCS，将样品在1200rpm下离心15分钟，将细胞片状沉淀物悬浮于50ml新鲜的IMDM和10%FCS中（细胞密度为大约2×106细胞/ml）。加入250μl植物凝血素试样（PHA P，DIFCO），将该培养物在37℃和5%CO2下温育48小时，加入重组IL-2（BMB）（浓度：20单位/ml）。然后用IMDM/20%FCS（2单位/mlIL-2）将细胞分裂成1∶3。细胞试样含FCS及5%DMSO并深冻于液氮中。使用前，在IMDM加20%FCS（2单位/mlIL-2）中使细胞生长。
为了进行顺序结合研究，在4℃下用添加有2%FCS的1mlDMEM平衡Hela细胞。象在其它试验中一样加入结合物-DNA复合物并将平板在4℃下温育2小时。然后用冰冷的DMEM/2%FCS彻底洗涤平板，然后加入2ml该培养基。然后加入腺病毒d1312或病毒缓冲液，使细胞缓慢温热，然后置于恒温箱中进一步温育24小时，此后，收集细胞并研究这些细胞中虫荧光素酶基因表达。
虫荧光素酶测定
如Zenke等人（1990），Cotten等人（1990），和在EP388758中所述进行细胞提取物的制备，蛋白质含量的标准化和虫荧光素酶活性的测定。
实施例1-用转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物
测定腺病毒处理对基因转移的影响
首先，研究了病毒剂量的增加对限定量的结合物-DNA复合物 完成基因转移的能力的影响。为了形成复合物，将6μg质粒PRSVL与12μg人转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物（hTfpL190B）混合。将结合物-DNA复合物加上不同量的腺病毒d1312（0.05-3.2×104病毒粒子/细胞）加到Hela细胞中。这一分析的结合示于图1中。虫荧光素酶活性以50μg总细胞蛋白质的光密度单位数表示。根据这一分析，加入腺密度的量不断增加导致基因转移的相应增加。该图表明得自2～4个单独实验的平均值;条线表示标准误差。
实施例2-结合物-DNA复合物剂量影响
将按实施例1的方法制备的结合物-DNA复合物的对数稀释物加到Hela细胞中，加或不加恒定剂量的腺病毒d1312（1×104病毒粒子/细胞）。按实施例1的方法测定虫荧光素酶活性。结果示于图2中。
实施例3-通过受体介导的内吞作用，借助于腺病毒由转铁蛋白-多聚赖氨酸所影响的基因转移增强
a）腺病毒处理对复合DNA转移的影响
用下列组分进行转染：
6μg不含转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物的pRSVL-DNA（DNA）;6μgpRSVL-DNA加6μg未结合的多聚赖氨酸270（DNA+PL）;6μg pRSVL-DNA加12μg在前面的实施例中所用的转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物（DNA+hTfPL190B）。将这些转染材料加到含有或不含腺病毒d1312（d1312）（1×104病毒粒子/细胞）的Hela细胞中。按前面的实施例进行细胞提取物的制备，总蛋白质的标准化 和虫荧光素酶活性的测定。这些试验的结果示于图3A中。
b）腺病毒处理对受体结合DNA的转移的影响
结合物-DNA复合物（DNA+hTfpL190B）或多聚赖氨酸-DNA复合物（DNA+PL）不必被内在化，通过在4℃下温育与Hela细胞结合。在加入腺病毒d1312（d1312）（1×104病毒粒子/细胞）或类似体积的缓冲液之前除去未结合的复合物。随后在37℃下进行温育以使结合的DNA复合物和腺病毒内在化。按所述方法测定虫荧光素酶活性（图3B）。
c）腺病毒处理对由转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物引起的基因转移的影响
将含有6μgpRSVL-DNA加12μg转铁蛋白-多聚赖氨酸（DNA+hTfpL190B）的结合物-DNA复合物加到含有腺病毒d1312（1×104病毒粒子/细胞）或类似量的热灭活的腺病毒d1312（d1312h.i）的Hela细胞中。通过在45℃下温育30分钟进行热灭活（Defer等人，1990）。图3C显示出虫荧光素酶的活性。
实施例4-腺病毒处理对在选定的细胞系中由转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物引起的基因转移的影响
将结合物-DNA复合物（6μg PRSVL+12μg hTfPL190B）加到含有或不含腺病毒d1312（1×104病毒粒子/细胞）的细胞系CFT1，KB，Hela，WI38和MRC5的细胞中。不同细胞系的基因转移效率按前面的实施例通过虫荧光素酶测定测得（图4）。
实施例5-在基因转移水平，而不是在转活化水平上虫荧光素酶 基因表达功能的增强
通过用含有RSV-虫荧光素酶基因片段（PRSVL的Apal/pvu1片段（De    Wet等人，1987）），该片段被克隆到puCu基因座的CIa1位点（Collis等人，1990）的质粒转染细胞来制备可在组成上表达虫荧光素酶的命名为K562    10/6的细胞系。将这个质粒与转铁蛋白-多聚赖氨酸结合物复合并用这些复合物转染K562细胞，使用的方法是Cotten等人（1990）所述的方法。由于PuCu基因座质粒含有抗新霉素基因，所以可根据新霉素抗性选择虫荧光素酶表达克隆。选择K562    10/6克隆用于进一步的实验。
用12μgTfpL加6μg PRSVL或用4μgPL90加6μgPRSVL（在每种情况下均于500μlHBS中）处理亲代细胞系K562的试样（于200μlRPMI1640加2%FCS中;500，000细胞/样品）。所规定的腺病毒d1312的量（图5）在37℃下作用于细胞1.5小时，此后加入2mlRPMI和10%FCS。然后在37℃下继续温育24小时，然后制备细胞用于虫荧光素酶活性的测定。发现与腺病毒一起温育可导致虫荧光素酶活性的显著增加（图5A），这既适用于TfPL复合物（2000光密度单位-25，000光单位）又适用于PL90复合物（0-1.9×106光单位）。这表明K562细胞系具有使PRSVL多聚赖氨酸复合物内在化的能力并且这种通过虫荧光素酶的表达测定的内在化因腺病毒的存在而显著增加。
用可在组成上表达RSVL虫荧光素酶基因的K561    10/6进行类似的试验，并使用相似量的腺病毒d1312。将500，000细 胞（于200μl    RPMI加2%FCS中）与在图5B中所规定量的腺病毒d1312一起于37℃温育1.5小时。然后，象在亲代细胞系中一样，加入RPMI和10%FCS，继续温育24小时并测定虫荧光素酶活性。如图5B所示，用腺病毒处理这些细胞对虫荧光素酶活性没有可检测的影响;对照值与病毒处理样品值范围相同。
实施例6-在腺病毒的存在下用无唾液胎球蛋白-多聚赖氨酸结合物（AFpL）或用四-半乳糖肽-PL结合物（gal4pL）转染肝细胞
a）乳糖基化肽的制备
在37℃下，用7.85mg乳糖溶于40ml10mm乙酸钠水溶液所得到的溶液（pH5）处理3.5mg（1.92μmol）用Applied    Biosystems    431A肽合成仪通过Fmoc方法制得的，含有Cys的二硫代吡啶基的分支肽Lys-（Nε-Lys）Lys-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys。向该溶液中加入4等份0.6mg（10μmol）氰基氢硼化钠，时间间隔大约10小时。在37℃下总共64小时后，加入0.5mlHEPES（pH7.3）和15mg二硫代苏糖醇。在氩气下通过凝胶过滤（Sephadex    G-10，12×130mm，洗脱液：20mmNaCl）进行分级分离，得到3.6ml游离巯基形式的乳糖基化肽溶液（相当于Ellmann试验的1.74μmol;84%产率）。被修饰的肽样品呈现与茴香醛的颜色反应，但不与茚三酮发生颜色反应;这与所有4个N-末端氨基基团都被乳糖基化的设想相符。四-半乳糖肽-多聚赖氨酸结合物示于图6中。
b）3-二硫代吡啶丙酸酯修饰的多聚赖氨酸的制备
在充分混合条件下，将400μl15mmSPDP（6.0μmol）的乙醇溶液加到平均链长为290个赖氨酸单体的0.60μmol多聚-L-赖氨酸（pL290，氢溴化物，Sigma）溶于1.2ml100mmHEPES（pH7.9）中所形成的凝 胶过滤溶液中。1小时后，用100mM乙酸钠进行凝胶过滤（Serhadex    G-25），然后加入500μl1M乙酸钠（pH5），该溶液含有0.56μmolpL290，其中含5.77μmol二硫代吡啶连接子。
c）肽与多聚赖氨酸的结合
在氩气环境中，使1.5μmola）中制备的乳糖基化肽（于3ml20mM    NaCl中）与0.146μl得自b）的修饰的pL290（于620μl的100mM乙酸钠缓冲液中）混合制备结合物。加入100μl2MHEPES（pH7.9）之后，使反应混合物在室温下静置18小时。通过加入NaCl，将盐浓度调到0.66M，通过阳离子交换色谱（Pharmacha    Mono    S柱HR5/5;梯度洗脱，缓冲液A：50mMHEPESpH7.3;缓冲液B：缓冲液A加3M    NaCl）分离结合物。以大约1.2M-1.8M的盐浓度洗脱产物馏分，收集两个结合物馏分：结合物馏分被命名为gal4pl1和gal4pl2。对25mM    HEPES（pH7.3）进行透析，得到含有24nmol修饰的pL290的结合物馏分gal4pL1和含有24.5nmol修饰的pL290的gal4pL2。
d）无唾液胎球蛋白结合物的制备
根据与转铁蛋白结合物同样的原理制备结合物;Wu    and    Wu（1988）描述了一种制备无唾液血清类粘蛋白-多聚赖氨酸结合物的相似方法。
在用双官能试剂SPDP（Pharmacia）进行修饰之后通过二硫桥成键进行无唾液胎球蛋白与多聚赖氨酸的偶联。在SephadeX    G -25柱上对100mg（2.2μmol）无唾液胎球蛋白（Scgma）溶于2ml100mM    HEPES（pH7.9）中所形成的溶液进行凝胶过滤。在强搅拌下将330μl15mM    SPDP（5.0μmol）的乙醇溶液加到所得的4ml溶液中。在室温下1小时后，通过另一凝胶过滤（Sephadex    G-25）进行纯化;这样得到5ml用2.5μmol二硫代吡啶连接子修饰的1.4μmol无唾液胎球蛋白溶液。
在氩气环境中，使1.4μmol无唾液胎球蛋白（于5ml    100mM    HEPESpH7.9中）与0.33μmol修饰的pL190（含有1.07μmol巯基丙酸酯基团;所用的方法与制备转铁蛋白结合物的方法相同）（于6.5ml200mM    HEPES    pH7.6中）混合制备结合物。使反应混合物在室温下静置24小时。通过阳离子交换色谱（Pharmacia    Mono    S-柱HR10/10;梯度洗脱，缓冲液A：50mM    HEPES    pH7.9;缓冲液B：缓冲液A加3M氯化钠）从反应混合物中分离结合物，加入氯化钠直到达到0.6M的终浓度，然后装柱。以大约1.5M的盐浓度洗脱产物馏分。用HBS进行透析得到含有0.52μmol无唾液胎球蛋白（用0.24μmolpL190修饰的）结合物。
e）用pRSVL-DNA复合物转染HepG2
在T25培养瓶中的DMEM培养基（加有10%FCS，100I.U./ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺）上培养HepG2细胞。以每瓶含400，000个细胞的密度进行转染。转染之前，用4ml含有10%FCS的新鲜培养基 洗涤细胞。紧接在转染之前，加入氯喹（Sigma）以使细胞悬浮液（加上DNA溶液）的终浓度为100μm。
将溶于300μlHBS中的10μgpRSVL-DNA与溶于170μlHBS中的图7中所规定量的TfpL190B结合物（TfpL），无唾液胎球蛋白pL90结合物（AfpL）。多聚赖氨酸290（pL）或四-半乳糖肽多聚赖氨酸结合物gal4pL混合。在竟争试验中，30分钟之后加入240μg无唾液胎球蛋白（（gal）4pL+Af）或30μg乳糖基化肽（（gal）4pL+（gal）4）。将混合物加到细胞中;将细胞在37℃下温育4小时，然后用4ml加有10%FCS的新鲜DMEM培养基替换转染培养基。24小时后，收集细胞进行虫萤光素酶活性测定。图7中所给出的值表示如该图中所示的被转染细胞的总虫萤光素酶活性，pL和TfpL表示微弱的虫萤光素酶活性;（gal）4pL显示出与AfpL一样高的值;（gal）4或Af竞争无唾液糖蛋白受体并如所预期的那样使活性值降低。
f）用pCMVL-DNA复合物转染HepG2细胞
如e）中所述，在6cm平皿中使HepG2细胞生长到每个平皿含300，000个细胞的细胞密度。在转染前，用1ml含有2%FCS的新鲜培养洗涤细胞。
使溶于HBS中的6μgpCMVL-DNA与溶于170μlHBS中的图8中所规定量的TfpL10B结合物（TfpL），无唾液胎球蛋白-pL结合物（AfpL），多聚赖氨酸290（pLys290），（gal）4pL1或（gal）4pL2混合。30分钟后，将1ml含有2%FCS和50μl腺病毒原液d 1312C的DMEM加到每种DNA-结合物复合物中。在竞争实验中，按规定加入30μg乳糖基化肽（gal）4pL（（gal）4pL1+（gal）4或（gal）4pL2+（gal）4）。将混合物加到细胞中;将细胞在37℃下温育2小时，然后加入1.5ml含有10%FCS的培养基。2小时后，用4ml加有10%FCS的新鲜DMEM培养基替换转染培养基。24小时后，收集细胞进行虫萤光素酶活性测定;图8中的值表示被转染细胞的总的虫萤光素酶活性。pLys290显示出效果。（gal）4pL显示出较强的效果;竞争无唾液糖蛋白受体的（gal）4的加入使活性值降低到用多聚赖氨酸所得到的值。
g）用pCMVL-DNA复合物转染TIB73细胞
在37℃，5%CO2条件下，在装在6cm平皿中的添加有10%热灭活的FCS（含有100I.U./ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺）的“高葡萄糖”DMEM（0.4%葡萄糖）中培养胚胎小鼠的肝细胞系ATCC TIB73（BNL CL.2;Patek等人，1978）的细胞。
以每个平皿含300，000个细胞的浓度进行转染。转染前，用1ml加有2%FCS的新鲜培养基洗涤细胞。
将溶于300μlHBS中的6μgPCMVL-DNA与溶于170μL    HBS中的规定量的小腹转铁蛋白-多聚赖氨酸290结合物（mTfpL），无唾液胎球蛋白-pL结合物（AfpL），多聚赖氨酸290（pLys290），（gal）4pL1或（gal）4pL2混合。30分钟后，将1ml含有2%FCS和50μl腺病毒原液d1312的DMEM加到每种 DNA结合物复合物中。将混合物加到细胞中，将细胞在37℃下温育2小时，然后加入1.5ml含有10%FCS的培养基。2小时后，用4ml新鲜培养基替换转染培养基。24小时后，收集细胞进行虫萤光素酶活性测定;图9B中所示的值表示被转染细胞的总的虫萤光素酶活性。
作为对照，在氯喹存在下而无腺病毒进行转染：以每个平皿含300，000个细胞的细胞密度进行转染。转染前，用1ml含有2%FCS的新鲜培养基洗涤细胞。紧接在转染之前，加入氯喹（Sigma）以使细胞悬浮液（加上DNA溶液）的终浓度为100μM。使溶于330μlHBS中的6μgpCMVL-DNA与溶于170HBS中的规定量的mTfpL，AfpL，pLys290，（gal）4pL1或（gal）4pL2混合。30分钟后，将DNA复合物加到细胞中。将细胞在37℃下温育2小时。然后加入1.5ml含有10%FCS和100μM氯喹的培养基。2小时后，用4ml新鲜培养基替换转染培养基。24小时后，收集细胞用于虫萤光素酶活性的测定。所得到的虫萤光素酶活性值示于图9A中。
实施例7-将DNA引入T细胞
a）抗CD7多聚赖氨酸190结合物的制备
使1.3mg抗CD7抗体（Immunotech）溶于50mMHEPES（pH7.9）所形成的溶液与49μl1mM    SPDP（Pharmacia）的乙醇溶液混合。在室温下1小时后，使混合物经Sephadex    G-25凝胶柱（洗脱液：50mM    HEPES缓冲液pH7.9）过滤，由此得到1.19mg（7.5nmol）用 33nmol吡啶基二硫代丙酸酯基团修饰的抗CD7。用SPDP对用FITC进行了萤光标记的多聚（L）赖氨酸190进行类似的修饰并通过用二硫苏糖醇进行处理和随后进行凝胶过滤使之成为用游离巯基修饰的形式。在不含氧的情况下，使11nmol用35nmol巯基修饰的多聚赖氨酸190溶于0.2ml30mM乙酸钠缓冲液中所形成的溶液与被修饰的抗CD7（于0.5ml300mM    HEPES    pH7.9中）混合，并使之在室温下静置过夜。加入5MNaCl将反应混合物调到大约0.6M的含量。通过离子交换色谱（Mono    S，Pharmacia，50mMHEPES    pH7.3;盐梯度0.6M-3MNaCl）进行结合物的分离;对10mM    HEPES（pH7.3）进行透析之后，得到含有0.51mg（3.2nmol）用6.2nmol多聚赖氨酸190修饰的抗CD7抗体的相应的结合物。
b）gp120-多聚赖氨酸190结合物的制备
用文献中已知的方法，通过在用6-马来酰亚氨基己酸（EMCS，Sigma）修饰后进行硫醚连接（Fujiwara等人，1981）来进行偶联。
硫醚连接的gp120-多聚赖氨酸190-结合物：
使2mg重组gp120于0.45ml100mM    HEPES（pH7.9）中的溶液与17μl10mM    EMCS的二甲基甲酰胺溶液混合。在室温下1小时后，经Sephadex    G-25凝胶柱（洗脱液：100mM    HEPES缓冲液pH7.9）进行过滤。在不含氧的条件下，使产物溶液（1.2ml）与9.3nmol进行了萤光标记和用30nmol巯基修饰的多聚赖氨酸190（于 90μl30mM乙酸钠pH5.0中）立即反应，并使之在室温下静置过夜。加入5M    NaCl将反应混合物调到大约0.6M的含量。通过离子交换色谱（MOno    S，Pharmacia.50mM    HEPES    pH7.3，盐梯度0.6M-3M    NaCl）分离结合物;分级分离并对25mM    HEPES（pH7.3）进行透析之后，得到3个结合物馏分A，B和C，馏分A含有0.40mg用1.9nmol多聚赖氨酸190修饰的rgp120，馏分B含有0.25mg用2.5nmol多聚赖氨酸190修饰的rgp120，馏分C含有0.1mg用1.6nmol多聚赖氨酸190修饰的rgp120。
使pCMVL-DNA（6μg/样品）与规定量的多聚赖氨酸90或规定量的多聚赖氨酸结合物（于500μlHBS中）复合。同时，制备H9细胞（106细胞/5ml含有2%FCS的RPMI）或初级人淋巴细胞（3×106细胞/加有2%FCS的ISCOVe氏改良的Dulbecco氏培养基（IMDM））的试样。将多聚赖氨酸-DNA复合物加到每种细胞样品中。5分钟后，加入规定量的腺病毒d1312。然后将细胞在37℃下温育1.5小时，将15ml加有20%FCS的RPMI（对H9细胞而言）或IMDM（对初级淋巴细胞而言）加到每种样品中。将细胞在37℃下温育24小时，收集细胞并按其它实施例的方法进行处理，以测定虫萤光素酶活性。所进行试验的结果示于图10A（H9细胞）和图10B（初级淋巴细胞）：在H9细胞中，抗CD7结合物（图10A，7-9道）和gp120结合物（10-12道）显示出最好的结果（在用腺病毒完成的基因转移方面），而gp120结 合物甚至在无腺病毒的情况下仍完成了虫萤光素酶基因的清楚的表达。值得注意的是，在所进行的试验中，只有gp120结合物具有将DNA引入到初级淋巴细胞中的能力，而且只在缺陷性腺病毒存在下（图10B，7和8道）。
实施例8-腺病毒的灭活
a）紫外灭活
将按照实施例的引言部分中所述的方法制备和贮存的腺病毒d1312制剂置于放在冰上的细胞培养平皿的2cm直径的孔中（300μl/孔），平皿距2个紫外灯（Philips    TUV15（G15T8）灯）的距离为8cm。使病毒受到紫外线照射，辐射时间在图11A中做了规定，研究每种制剂样品的病毒滴度是为了测定它们是否能够增加多聚赖氨酸-转铁蛋白结合物向HeLa细胞中的基因转移及其程度。
细胞的培养和转染基本上按上面在“细胞和培养基”下所述的方法进行;用于进行转染的组分示于图11A中。在500μlHBS中制备pCMVL-DNA和12μgTfpL的复合物，将该复合物加到3×105个HeLa细胞中（于1mlDMEM加2%FCS中）。大约5分钟后，将54μl每种病毒制剂加到各培养物中并将培养物在37℃下温育1.5-2小时，然后将5ml的加有10%FCS的DMEM试样加到各培养物中，在37℃下继续温育24小时，收集培养物并研究虫萤光素酶活性。54μl未经辐射的病毒量不在饱和范围内，即，该试验对至少大3倍的病毒量是灵敏的。所获得的虫萤光素酶表达的结果示于图11B中（带阴影的矩形）。用Ela互补细胞素293测定每种制剂的病毒滴度。在加有 2%FCS的DMEM中制备未经辐射的和经幅射的病毒样品的系列稀释物。与之平行，在200μl加有2%FCS的DMEM中制备5×104293细胞样品（在2cm的孔中）。将每种稀释物5μl试样置于各孔中。为了使病毒结合到细胞上，在37℃下温育1.5小时，然后将加有10%FCS的DMEM置于各孔中。48小时后，检验培养物以测定细胞病理作用。在培养物中50%以下的细胞在48小时后显示出显著的细胞病理作用的上述病毒稀释物表明在每种病毒制剂中存在相对量的感染性病毒。所得结果示于图11B中（空旷的矩形）。在该实施例中所进行的试验的结果表明由紫外幅射引起的病毒滴度的4logs降低是与虫萤光素酶基因转移只减少20倍相关联的。这证明对病毒的感染性是决定性的机制可受到破坏，但不影响病毒增加基因转移的能力。
观察到在低剂量的病毒下，由病毒引起的基因转移的增加稍有下降（图11A，3-6道）并且在高剂量下这一效果更为明显（7-10道）。
b）用甲醛使腺病毒灭活
使2ml腺病毒制剂通过10mlG25柱（Pharmacia    Sephadex    G25，PD10），用150mM    NaCl，25mM    HEPES（pH7.9），10%甘油平衡柱，并将滤出的病毒制剂稀释成2.5ml的体积。在无甲醛（0），有0.01%，0.1%或1%甲醛存在下，在冰上，将经凝胶过滤的病毒制剂样品温育20小时。然后加入Tris（pH7.4）以达到100mM的浓度，然后将样品先对1升150mM    NaCl，50mM    Tris（pH7.4）和50%甘油透析2小时，再对2×1升 150mM    NaCl，20mM    HEPES（pH7.9）和50%甘油透析过夜。
然后在293细胞上检验病毒试样中的病毒滴定（CPE终点测定法或噬斑测定法，Precious and Russel，1985）。然后按在前面的实施例中所述的方法通过测定虫萤光素酶活性测定甲醛处理的病毒对向Hela细胞（300，000）中的基因转移的影响。90μl的病毒制剂所导致的DNA转移相当于18以上的光密度单位数。用0.01或用0.1%甲醛处理病毒导致基因转移活性的微小降低（在0.1%时大约降低10倍）。虽然用1%甲醛进行处理可导致基因转移活性的显著丧失，但90μl的病毒仍能产生相当于104光单位的基因表达。
在用0.1%甲醛进行处理中，病毒滴度降低到105PFU（噬斑形成单位）与只有10%的虫萤光素酶活性的降低相关联。试验结果示于表12A中。
c）用长波紫外+8-甲氧补骨脂类处理用腺病毒灭活
将纯化病毒试样调到0.33μg/μl8-甲氧补骨脂类（原浓度为33μg/μl的8-甲氧补骨脂类溶于DMSO中）并暴露于365nm紫外光源（UVP型号为TL-33），放在冰上，试样距灯滤光片的距离为4cm。暴露于紫外光的时间为15-30分钟，如在图解中所示。然后使病毒样品通过用HBS+40%甘油平衡过的Sephadex    G-25柱（Pharmacia，PD-10）并贮存于-70℃。
检测病毒制剂在增加传送到HeLa细胞中的pCMVL/hTfpL结合物方面的活性（如所得到的虫萤光素酶活性的光单位所显示的，图12B右手轴）或在293细胞中复制的能力（病毒滴度，图12B，左手轴）。
在下面的用于说明通过逆转录病毒转铁蛋白-多聚赖氨酸-DNA复合物内在化的增加的实施例中，使用下列材料和方法：
与前面的实施例类似制备转铁蛋白-多聚赖氨酸190结合物和结合物-DNA复合物。
在加有10%FCS，100I.U./ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中培养NIH373细胞。为了进行转染，在转染前18-24小时，对5-7×105细胞/T25进行平板培养。紧接在转染之前，将细胞置于新鲜培养基中并按下列顺序加入用于进行转染的各种组分：氯喹（100μm），多聚赖氨酸-转铁蛋白-DNA复合物和逆转录病毒制剂。然后将细胞在37℃下温育4小时，24小时后更换培养基并收集细胞。通过三次冷冻/融化循环制备提取物;使提取物中蛋白质含量标准化，按照前面的实施例中所述检验提取物样品的虫萤光素酶活性。
实施例9-用Moloney病毒转染NIH3T3细胞在规定的条件下，在100μm氯喹或无氯喹存在下用TfpL-DNA复合物进行106NIH3T3的转染（如图13所示）。发现在无氯喹存在下虫萤光素酶活性值只达到本底水平（1道），而在氯喹存在下测定出pRSVL报道基因的高表达（2道）。Moloney白血病病毒（在图中表示为RVS）与DNA复合物同时加到细胞中，其逐渐增加的量能使虫萤光素酶基因表达不断增加。
实施例10-对在用转铁蛋白-多聚赖氨酸DNA复合物转染NIH3T3细胞中的基因转移效果是否能归因于Moloney病毒的研究
在实施例9中所用的病毒制剂是逆转录病毒表达细胞的粗的、未经分级分离的上清液。为了获得用该病毒制剂完成的DNA转移的增加实际上可归于该病毒的证据，对上清液进行上述的透析/浓缩纯化，逆转录病毒上清液（在图中表示为RVS）被浓缩10倍。如果逆转录病毒能增加基因转移，则在浓缩步骤中除极不稳定的逆转录病毒的任何灭活之外，被膜保留的活性应约为原上清液活性的10倍。象在前面的实施例中一样，在图14中所给出的条件下转染106NIH3T3细胞。图14表明基因转移增加作用存在于膜保留物中（使用20-600μl，3-6道）。还发现200-600μl的10倍浓缩的制剂其活性约为2或6ml原始的、未浓缩的逆转录病毒制剂活性的一半（7和8道）。用无专宿小鼠逆转录病毒受体的人K562细胞进行平行试验。如所预期的那样。没有基因表达的增加。
实施例11-转铁蛋白与其受体之间的相互作用在Moloney病毒的基因转移效果方面起作用
为了排除TfpL/PRSVL复合物转移到细胞中能归于多聚赖氨酸与逆转录病毒的非特异性结合的可能性，并且为了进一步搞清进入细胞的机制，检验了逆转录病毒将只与多聚赖氨酸复合的质粒DNA转运到细胞中的能力。所用的多聚赖氨酸的量相当于旱期测定的最佳量，该量造成质粒DNA的完全缩合且与用于多聚赖氨酸-转铁蛋白结合物（Wagner等人，1991a）的多聚赖氨酸的量相似，试验结果示于图15中，该试验表明在无氯喹存在情况下，报道 基因不以TfpL-pRSVL复合物的形式或以pL-pRSVL复合物的形式表达（1和2道）。另一方面，在逆转录病毒存在下，作为TfpL复合物应用的报道DNA得以表达，但不以pLDNA复合物的形式表达（见3和4道以及5和6道）。再者，所做的试验表明过量游离转铁蛋白的存在导致由逆转录病毒促进的DNA转移的减少（7和8道），这些结果支持转铁蛋白与其受体之间的相互作用在增加由逆转录病毒引起的DNA吸收方面扮演一个必要的角色。
实施例12
pH值对逆转录病毒的基因转移作用的影响
该实施例的实验日的是测定pH值对逆转录病毒增加基因转移能力的影响。转移实验按前面实施例的方法进行。两种核内体pH还原作用的抑制剂莫能菌素和氯化铵被使用。实验结果如图16所示研究了两种物质对TfPL-DNA转移的影响并发现两种物质实际上都不能代替氯喹。不过，在氯化铵浓度较高的情况下，发现荧光酶基因表达稍有增加（1-5道）。如在前面的实施例中观察到的，在DNA转移中仅仅逆转录病毒显示轻微的增加（6道）。当在1μM莫能菌素存在下使用逆转录病毒时，观察到明显的增加（7道）。在氯纯铵存在下（9和10道）和较高莫能菌素浓度下（8道）影响不很有力。
实施例13借助流感血细胞凝集素HA2的N-末端核内体多肽，转铁蛋白结合获得的基因转移的增加
a）。多肽的合成。
以Fmoc（芴基甲氧基基羰基）法（Atherton等人，1979年），用AppIied    Biosystem431A多肽合成仪，合成Gly-Leu-Phe-GIu-AIa-ILe-AIa-GIy-Phe-Ile-GIu-ASn-GIy-TrP-GIu-GIy-Met-Ile-ASp-Gly-Gly-G    y-CyS序列（SEQ    ID    Nol）的多肽。CyS、GIu和ASP的侧链保护基是叔-丁基和ASn的侧链保护基是三苯甲基。偶联反应后，茚三酮试验表明每一步的偶联水平＞98%。从氨基酸19开始，双偶联被进行。用在NMP（N -甲基吡咯烷）中20%哌啶，从多肽树脂部分中除去N-末端FmOC基团。然后，以Fmoc保护的和未保护的馏份以DCM（二氯甲烷）洗涤并在真空下干燥。得到294mg无Fmoc的多肽树脂和367mg Fmoc保护的多肽树脂。111mg无Fmoc的多肽树脂在10mlTFT、0.75g苯酚、300ulEDT（乙二硫醇）、250μlEt-S-Me（甲乙硫）和500μl水的混合物中，以三氟乙酸裂解1.5小时。用烧结玻璃滤器从树脂中过滤出多肽。用DCM洗涤并将洗涤液合并入滤液中。将滤液浓缩至约2ml，然后在搅拌下滴加入40ml乙醚中。离心分离出多肽沉淀并弃去乙醚上清液。用40mi乙醚洗涤沉淀三次并在高真空下干燥。将得到的58mg粗产品溶解于3.5m含有300μl25%NH3/l的20mM NH4HCo3中。在装有ScphadX G-25柱上（Pharmacia PD-10）用同样的缓冲剂凝胶过滤所得溶液。全部物质加到MOnoQ柱（Pharmacia 100×14mm）上，梯度：0-10分100%A，10-100分0-100%B。A为20mM NH4HCO3+300μl NH3/l。B为A+3MNacl。于280nm下测定，于354nmTrp-荧光检测。流速每1ml/分。以1MNacl稀释产物。MonoQ柱上的主流份用BIORAD-H1-PoreRP304柱（250×10mm）经反相HPLC进一步提纯（梯度：12.5分钟为50-100%缓冲剂B，12.5-25分钟为100%B。A为20mMNH4HCO3+300μlNH3/l;B为在98%甲醇中的A。流速为3ml/分于237nm下测定）。产物在100%B中稀释，产物真空快速蒸 干后再溶解于缓冲剂A中并最后冷冻干燥。得到8.4mg半胱氨酸保护形成的HpLc提纯产物。该产物编号定为P16。为了得到无硫基形成的P16，用苯硫基甲烷/乙二硫醇/三氟乙酸/三氟甲硫酸（2/1/40/3;在其它组分混合后加入三氟甲磺酸）在环境温度下处理叔-丁基保护的物质30分钟。通过乙醚沉淀分离出多肽，然后，在氩气氛下用上述缓冲剂A凝胶过滤（SephadeX    G-25）。
b）。流感多肽对赖氨酸的偶联
b1），通过SPDP（二硫化丙酸-琥珀酰亚氨基吡啶鎓盐）直接键合
19.8mg多聚赖氨酸300氢溴酸盐（Sigma）在乙酸钠中PH5经SephadeX G-25柱（Pharmacia PD-10）凝胶过滤以便除去低分子量馏份。基于茚三酮试验，在凝胶过滤后PL浓缩为3.16mg/ml。以1MNaOH调节溶液的PH值为7-8。将0.64μmolSPDP（Pharmacia：40mM无水乙醇溶液）加到2.5mlPL溶液中（7.9mg PL＝0.13μmol）。这相当于5∶1摩尔比的SPDP：PL。该混合物被放置过夜，然后，在G25柱上在20mMNH4HCO3PH8.2中凝胶过滤。在一等份滤液以DTT（＝硫苏糖醇）还原后，硫代吡啶酮测定表明反应已完成。2.2ml 0.3μmolPL修饰性PDP（基于PDP的μmol）与0.35μmol硫醇形成的多肽反应。多肽与PL混合后生成的白色沉淀，经2M盐酸胍调节溶解于溶液中，继续反应过夜。通过反应混合物中硫代吡啶酮的光电测定证实反应完成。然后，所得混合物 用2升20mMHEPES/0.5M盐酸胍透析两次。所得溶液经Mono    S柱分离（0.7×6cm，Pharmacia）（梯度：0-20分钟100%A，20-140分钟0-100%B;A：20mNHEPES    PH7.3/0.5M盐酸胍，B：20mM    HEPES    PH7.3/3M盐酸胍，0.3ml/分钟。于280nm检测，于354nm荧光检测，于280nm激发）。以1.5M盐酸胍稀释后的产物馏份，用2升HBS透析。茚三酮试验测定PL的浓度为约1.14mg/ml。共轭物溶液中多肽的量由在280nm的吸收来计算，其结果是多肽：PL的摩尔比为4∶1。
b2）。通过聚乙二醇链键合
接b1）节所述方法，14.6mg    PL300氢溴酸盐（Sigma）经凝胶过滤，凝胶过滤后经茚三酮试验，PL浓度为4.93mg/ml。用1MNaoH调节溶液PH至7-8。加4.33μmolPDP（Pharmacia;30mM无水乙醇溶液）到2.7mlPL溶液中（13.3mgPL＝0.22μmol），PDP∶PL的摩尔比相当于20∶1。1.5小时后，反应混合物在0.1M乙酸钠，3M盐酸胍中经SephaeX    G-25柱凝胶过滤。1等份滤液以DTT还原后，硫代吡啶酮检定表明，产物馏份含有3.62μmolPDP。加79mgDTT于溶液中还原PDP修饰性的PL还原两小时后，溶液再经G-25柱凝胶过滤。Ellman试验表明硫醇浓度为2-224ml中。3.15μmol。
溶解17.6mg＝5μmolPOE（聚氧乙烯-双（6-氨基乙基，Sigma）于500μ120mM NaHCO3/3M盐酸 胍中，PH值为7-8，并与溶解于300l/DMF（二甲基甲酰胺）中的13.8mgEMCS（ε-马来酰亚氨基乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯，Sigma），＝44.7μmol）反应。30分钟后，溶液经G-25（20mMNaHCo3/3M盐酸胍）凝胶过滤。于300nm荧光测定马来酰亚氨基表明，在2ml溶液中6.36μmolEMCS已反应。
将2.5ml20mMNaHco3/3M盐酸胍中1.39umol硫醇式多肽滴加到1.05ml上述溶液中（相当于3.34μmolEMCS），同时在氩气流下，该混合物在旋涡搅拌下充分混合：15分钟后，经Ellman试验，无游离硫醇基检出。
还原后的硫基修饰性PL用1MNooH溶液调节至PH7-8。在旋涡搅拌充分混合下，将1.37ml该溶液加到上述反应混合物中。得到多肽-SH∶POE-EMCS∶PL-SH的摩尔比为1∶2.4∶1.4（基于EMCS和SH）的混合物。反应2.5小时后，经Ellman试验证实无游离硫醇可被检出。该反应混合物用2升20mMHEPES    PH7.3/0.6M    Nacl透析过夜，然后，经MOnO    S柱分离（梯度：0-20分钟22%A，20-150分钟22-100%B;A：20m    HEPES    PH7.3，B：A+3MNaCl）。流速0.3m/分钟。于280nmUV-测定和354nm做荧光测定。1.5-1.6MNacl洗脱的产物用2升HBS透析。用茚三酮试验测定PL浓度和在280nm光度法测定多肽浓度，在4.5ml总体积中PL浓度为0.49mg/ml，计算出PL比率为12∶1。
C）。脂质体制备
用REV法（反相蒸发）在旋转蒸发器中蒸发260μl氯仿溶液制备脂质体（Szoka和PaPahadjopoulos，1978;Straubingex和PapahadjoPouloS，1983）：水相为10mMHEPES    PH7.3）100mM钙黄绿素，150mM    NaCl;有机相为300μmolL-α-卵磷脂溶液（来自蛋黄黄，主要是棕榈酰油酰卵磷脂，Avantr极性类脂）。所得物质在高真空下干燥后再溶解于3ml乙醚中。利用涡流用乙醚彻底洗涤1ml水相并在一台近距离声波定位器浴型中于0℃下超声处理5分钟。冰冷30分钟后，再超声处理10分钟。得到的稳定的乳状液在旋转蒸发器中慢慢蒸发。在100mbar乙醚被蒸掉后，加0.75ml水相。残留的乙醚于50mbar下再蒸发30分钟。所得制剂（1.7ml）于500rpm下离心。1.0ml产物经多孔聚碳酸脂膜（0.1μm）挤压，得到0.7ml脂质体溶液。经凝胶过滤（SephadeX    G-50介质，Pharmacia;23ml凝胶，10mMHEPES    PH7.3/150mMNacl）从不掺合物质中分离出脂质体。6个馏份共500μl被收集。用Barlett法（1959）于2mM测定类脂磷。
d）。脂质体泄漏检定
脂质体含量的释放（泄漏）可用封闭钙黄绿素的出现和所导致的停止荧光淬灭的稀释方法来测定（Bondeson    et    al.1984）。钙黄绿素荧光用Kcntron    SMF25分光荧光光度测定（于490nm激发，515nm发射）。为此100μl的上述脂质体溶液用具有相应pH值（4.3，4.5，5.0，0.6，7.3） 的0.1M乙酸钠/50mNacl或10mM    HEPES/150mM    Nacl缓冲剂稀释100倍，得到1ml上述脂质体稀溶液。向在比色杯中的这些溶液中加2.5μl多肽（叔-丁基保护形式，1μg/μl的HBS溶液），同时用缓和的氩气流搅拌混合（最终浓度为400mM多肽）。在加多肽后于不同的时间测定钙黄绿素的荧光。100%泄漏值是通过加工2μl    Titon    X-100（FluKa）测定。
同样的方法用于测定加多肽-PL结合体于脂质体溶液后的钙黄绿素荧光。2.5μg结合体（基于PL量其浓度为1μg/μl）加到1ml脂质体溶液中（最终浓度为20mM修饰性多肽）。类似地，2.5μg多肽-多聚赖氨酸结合体在与5μgDNA保温15分钟后，检定其泄漏。
结果发现，多肽仅仅在酸性范围的引起脂质体的释放（图17）。多肽结合体在低pH值下是活泼的，甚至于在中性pH值下具有强的活性，且这种活性随pH值的降低而增加。结合体与DNA配合后，在中性pH值时活性消除，而在酸性pH值时具有有效的活性。
e）K562-细胞的转染
K562-细胞在RPMI1640介质（Gibco    BRI加2g碳酸氢钠/升）加10%FCS，100I。U/每升青霉素，100μg/ml链霉素和2mM谷酰胺的培养液中生长直至密度为500，000细胞/ml。在细胞被转染之前12-20小时，将其放到含50μM去铁敏的新培养液中（为了增加铁传递蛋白受体数目）。转染一天后，收集细胞并悬浮于含10%FCS加50μM去铁敏的新培养液中（250，000细胞/ml）并以2ml 1份放于24孔的培养器中。
在160μlHBS中中的6μg    PCMVL-DNA与图18指定的TfpL结合体或与在160μl    HBS中的PL300指定量混合，15分钟后，加定量的流行性感冒多肽-PL-结合体（P16PL），再过15分钟后，向该混合物中加K562细胞。在37℃下培养24小时，收获并检定虫荧光素酶。虫荧光素酶活性按照前面实施例中的方法测定。图18中的数值为感染细胞的总虫荧光素酶活性。
f）HeLa细胞的转染
HeLa细胞按“细胞和介质”一节所述方法在6cm培养皿中培养。转染作用在密度为每板300，000细胞的条件下进行。在转染之前，细胞在含2%FCS的1ml新培养液中培养。在160μl    HBS中的6μg    PCMVL-DNA与图19指定的TfpL结合体或与PL300混合，或者与这两种物质在160μμl    HBS中的混合物混合。15分钟后，加定量的流行性感冒多肽-PL结合体（P16PL），再过15分钟后，将此混合物加到细胞中。细胞于37℃下培养2小时，然后，加入2.5ml有另外10%FCS的新培养液。细胞在37℃下培养24小时，然后收获并做虫荧光素酶检定。以前面实例所述方法测定虫荧光素酶活性。图中所给数值代表转染细胞的总虫荧光素酶活性。
实施例14
以流行性感冒血细胞凝集素HA2的仲-N-未端核内体多肽方法由转铁蛋白结合体获得的基因转移的扩大
a）。流行性感冒多肽-多聚赖氨酸结合体的合成
按照实施例13a）所述多肽的合成方法合成多肽Gly-leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-GLy-Phe-Ile-Glu-ASn-Gly-TrP-Glu-Gly-Met-Ile-ASP-Gly-Gly-Gly-CyS（SEQIDNO：2，编号P41）。按照实施例Bb1）的方法经SPDP键合进行流行性感冒多肽与多聚赖氨酸的偶联。所得结合体的多肽：PL的摩尔比为4∶1。
b），HeLa细胞的感染
HeLe细胞在6cm培养皿中的PMEM介质加5%FCS，100单位/ml青霉素，100μy/ml链霉素和2mM谷氨酰胺中生长。转染在每板300000细胞密度下进行。转染前，细胞在含2%FCS的1.5ml培养中培养。在160μlHBS中的6μgPCMVL-DNA（150mMNacl，20mMHEPES'PH7.3）与160μlHBS中的6μgTfPL190B结合体混合，15分钟后，加10μg流行性感冒多肽-PL-结合体P41PL或为了比较而加18μg流行性感冒多肽-PL结合体P16PL（见实施例13）（图20）;为了确定基因转移扩大的最适宜量而试验了指定量的两种多肽结合体。15分钟后将混合物加到细胞中。在37℃下培养细胞4小时，然后，加入2ml含18%FCS的培养液。24小时后收获细胞以检定虫荧光素酶。图20中的数值代表转染细胞的总虫荧光素酶活性。
两种多肽结合体实验结果的比较表明，第二种多肽结合体P41P41PL的基因转移扩大比第一种高3.5倍多。
C），以流行性感冒多肽多聚赖氨酸结合体转染BNL    CL。 2细胞
BNL    CL。2细胞按照实施例6所述方法生长。流行性感冒多肽P41与多聚赖氨酸360按摩尔比1∶1，3∶1和8∶1偶联。将6μgPCMVL    DNA和20μg结合体的配合物加到细胞中。为了比较，使用实施例13所述方法制备的20μgPL300或20μgP16多聚赖氨酸结合体。于37℃下培养细胞4小时，然后，加2ml含18%FCS的培养液。24小时后收获细胞并做虫荧光素酶检定，其结果如图20B所示。结合体中多肽的含量与基因表达的扩大相关。在以实施例13所述方法检定脂质体泄漏时发现（图20C），结合体的活性（于PH5，等于2.5μg多聚赖氨酸）随着多肽含量的增加而增加（图中，P41标为“influ2”。
实施例15
以β-半乳糖苷酶受体基因构建物转染HeLa原位证明
β-半乳糖苷酶表达
a），细胞的培养和转染：按前面实例所述方法，
HeLa细胞在一个3Cm有盖的培养皿中（每皿有3×104个细胞），在含有5%FCS，青霉素，链霉素和谷酰胺的DMEM中生长。
为了转染，在160μl    HBS中的6μgβ-半乳糖苷酸受体基因构成物（PCMV-β-gal）与在160μlHBS中的12μgTfPL190B结合，并在环境温度下培养30分钟。
在另一个实验中，在160μlHBS中的6μgPCMV-β-gal与在80μlHBS中的6μgTfPL190B在环境 温度下培养15分钟。然后，加入在80μl    HBS中的12μg按实施例13方法制备的流行性感冒多肽结合体（P16PL），并再培养该混合物15分钟。然后，按照前面所述的方法，使这些DNA-多阳离子复合物与1ml    DMEM加到2%FCS，抗菌素和谷酰胺混合。为了证实在转染成功方面氯喹和腺病毒的作用，在另一实验中加到含有DNA多阳离子复合物的介质中，最后浓度是100μM或50μl脉病毒株溶液d1312。
为了进行感染试验，原始培养培养液从细胞中移除并加1ml有或没有氯喹或病毒的含DNA复合物的培养液。于37℃下培养2小时后，向细胞中加1ml含10%FCS，抗菌素和谷酰胺的DMEM，并再培养2小时。除去所有培养液，细胞在3ml新鲜DMEM加10%FCS，抗菌素和谷酰胺中培养。
b，β-半乳糖苷酶的检定
转染后48小时，除去培养液，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞一次，并在环境温度下用0.5%戊二醛的PBS溶液固定5分钟，然后，除去固定剂并用PBS洗细胞一次，然后，在37℃下用着色液（10mM磷酸盐缓冲剂PH7.0;150mMNaCl，1mMMgcl2，3.3mMK4Fe（CN）6.3H2O，3.3mMK4Fe（CN）6和0.2%5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷）培养20分钟至3小时（Lim and Chae，1989）。盖板在PBS，水和96%乙醇中冲洗，干燥并固定于载玻上的Mowlol中。用一台Zeiss Axiophot显微镜分析。
图21为显微放大图象（112倍）。A2用6μgPCMV-β-gal与12μgTfPL190B复合物转染的HeLa细 胞。β-半乳糖苷酶的着色反应进行3小时。图显示极少数细胞（55个细胞，用箭头指示的着色细胞组）表达β-半乳糖苷酶基因。B：用6μgPMV-β-gal与6μgTfPL190B和12μgP16PL复合物转染的HeLa细胞。着色反应3小时。一些细胞（250个细胞）表达β-半乳糖苷酶基因，然而，细胞反应比在A中更强。C：在100μM氯喹存在下，用6μgPCMV-β-gal与6μgTfPL190B和12μgP16PL复合物转染的HeLa细胞。着色反应3小时。多数HeLa细胞组显示强的阳性反应（大于1，000个细胞）。D：在腺病毒d1312存在下用6μgPCMV-β-gal与12μgTfPL190B复合物转染的HeLa细胞。着色反应20分钟。几乎所有细胞（90%以上）显示阳性反应。E：非转染的HeLa细胞（β-半乳糖苷酶反应特异性的对照）。着色反应3小时。
实施例16
在腺病毒存在下用48Kbcosmid转染HeLa细胞
a）含有虫荧光素酶编码序列的装配型质粒的制备
含有在RSV启动子控制下的单P.Pyralis荧光素酶编码序列的3.0Kb    SalI碎片从质粒P220RSVLUCa中分离出并结合于装配质粒克隆CI-7aAl的单一SalI位点以形成连环体。[Cl-7aAl包括37Kb人基因组DNA    Sau    3A破片（部分消化），编码不明显的基团，克隆入装配质粒运载体PWE15（层聚基因）的BamHI位点]。结合反应产物在试管内封装和得到的噬菌体粒子的等分试样感染入E.Coli    NM54.4并涂 于LB    amp板上。重组细胞用菌落杂交法筛选，用3.0Kb    SalI碎片（32P随机标记）作杂交探针并用限制性图谱分析阳性产物。含有SalI插入单复制的配型质粒物成物（CosLuc）在Cscl梯度上生长并提纯（分子量＝48Kb）。
小量对照装配型质粒PWELUC（12Kb）的制备由NotI化CosLuc，重结合，转化细菌制备并分离出含适当质粒的克隆。这导致12KbDNA分子缺乏人DNA插入和部分的CosLuc聚合连接子。质粒PspNeoLuc（8Kb）是含有RSV-虫荧光素酶基因碎片的实施例5所述的质粒（PRSVL的Apal/Pvul碎片克隆入PUCu基因座的Clal位点。
b）。装配型质粒输送入HeLa细胞
以1mlDMEM+2%FCS封盖的HeLa细胞（每个6cm培养皿中有3×104个细胞）用在材料和方法部分叙述的方法制备的TfpL/DNA复合物培养，培养液中含有指定量的hTfpI，不含PL和DNA。此外，细胞培养混合物包括或者100μM氯喹（1和2道）或者10μl腺病毒，其中每ml含5×1011个粒子（3-12道）。于37℃下培养2小时后，每个培养皿中加4mlDMEM+10%FCS。24小时后，收获细胞并测定虫荧光素酶活性。其结果示于图22A中。
c）。装配型质粒输送入成神经细胞瘤细胞
封盖1mlDMEM+2%FCS的编号为GI-ME-N的成神经细胞瘤细胞系细胞（Donti et al.，1988）（每个6cm培养皿中有1×106细胞）用在材料和方法部分所述方法制备的TfpL/DNA复合物培养，培养液中含定量的hTfpL，不 含PL和DNA。此外，细胞培养液混合物还包括或者100μm氯喹（3和4道）或者10μl腺病毒d1312，其中每ml含5×1011个粒子（5和6道）。于37℃下培养2小时后，每个培养皿中加4μlDMEM+10%FCS，24小时后，收获细胞并测定虫荧光素酶活性。其结果示于图22B中。
实施例17
用化学偶联腺病毒-多聚赖氨酸结合体方法基因转移
a），用化学偶联法制备腺病毒-多聚赖氨酸结合体在150mMNacl/25mMHEPES，PH7.9/10%丙三醇中的2.35mM腺病毒d1312（大约1011个粒子）丙凝胶过滤溶液（S PhadeX G-25PD10，Phar aCia）与10μl（10nol）1mM的SPDP溶液（Pharmacia）混合。在环境温度下3.5小时后，用凝胶过滤从过量的试剂中分离出修饰性病毒。在排除氧并用氩气清洗2.5ml该溶液，使该溶液与42μl（1nmol）FITC-标记的多聚赖氨酸溶液反应，得到2.3nmol巯基丙酸基修饰性的产物（制备方法如EP388，758所述）。在环境温度下反应18小时后，一半该溶液移入离心试管并用1ml氯化铯溶液（比重为1.33g/ml）小心封盖，在环境温度下以35000rPm离心2小时（Sw60转子）。以200μl氯化铯馏份收集病毒带并用HBS/50%丙三醇稀释至1ml。用300μl修饰性病毒检定DNA键合：病毒溶液用（ml HBS稀释并与100μl35s-标记的DNA（15ng PRSVL，经NiCk转译制备）混合。对照实验以同样量的未改性病毒d1312进行。30分钟后，将样品移入离心试管， 用1ml氯化溶液（比重为1.33g/ml）小心地封盖并在环境温度下以35000rPm（SW60转子）离心2小时。梯度分成5个馏份：馏份1，1ml;馏份2，0.6ml;馏份3-5，每馏份为200μl。测定每份200μl馏份的放射活性并示于图23中。含病毒的馏份3-5，特别是馏份3比对照物显示明显高的放射活性。这可能归功于多聚赖氨酸修饰的腺病毒与标记DNA的特定结合，氯化铯的存在可能引起该复合物部分的离解。
b）.K562细胞的转染
K562细胞（ATCC    CCL243）悬浮在RPMI1640培养基（GibCO    BRL，加2g碳酸氢钠/1升10%FCS，每毫升100单位青霉素，100μl/μl链霉素和2mM各酰胺）中生长至密度为500，000个细胞/ml。在转染前12-20小时，将这些细胞放入含50μM去铁敏的新培养基中（为了增加铁传递蛋白受体数目）。转染后，收集细胞并转浮于含10%FCS加50μM去铁敏的新培养基中（每ml为250，000个细胞），以2ml1份放到24孔培养皿中中。
在100μlHBS中定量的PCMVL-DNA（6，0.6，0.06μg）与50μl多聚赖氨酸腺病毒（PLadeno）或相一致量的35μl）对照的腺病毒d1312混合。20分钟后，加入在150μlHBS中的相应量（12，1.2，0.12μg）TfPL    190B结合体。再后20分钟后，将混合物加到K562细胞中。在37℃下细胞被培养24小时，然后，收获并做虫荧光素酶检定按照前面实施例中的方法测定虫荧光素酶活性。图24中的数值为感染 细胞的总虫荧光素酶活性。
C），HCla用于细胞的转染
试验多聚赖氨酸-病毒结合体活性的一种方法是检验该结合体转移非常小量DNA（小于0.1μg）的能力。当腺病毒直接键合于缩合多聚赖氨酸的DNA时予期其DNA转移能力会增加，像内在要素[铁传递蛋白和腺病毒（蛋白质）]被直接给含于被转移的DNA上一样。为了证实这一设想，常量的多聚赖氨酸腺病毒结合体（2.5μl，约5×107病毒粒子）与不同量的受体质粒（3μg-0.0003μg）在475μlHBS中结合。于环境温度下培养15分钟后，相应于DNA质量的铁转移蛋白-多聚赖氨酸加到50%质粒DNA的每一样品中（选择这一量的75PL是由于这可保证使全部物质电中性）并同时保证病毒-多聚赖氨酸结合体的键合空间加TfPL后，培养该混合物15分钟，然后，将每一混合物放到1mlDMEM/2%FCS中含300，000个Hela细胞的6Cm培养皿中。于37℃下培养细胞1.5小时后，再加4mlDMEM/10%FCS。在平行试验中，等量的DNA与两倍过量的TfPL结合（全部DNA缩合所需量）并用于基因转移入HeLA细胞（一次在其本身上和一次在25μl非-多聚赖氨酸偶联腺病毒d1312制剂存在下）。24小时后收获细胞，制备提取物并进行虫荧光素酶活性检验。试验结果见图25：在无腺病毒情况下，DNA量小于0.3μg时，末检出虫荧光素酶活性。多聚赖氨酸偶联腺病毒和末偶联的腺病毒随着大量的DNA（3μg和0.3μg）存在功能发挥很好。不过，未偶联的腺病毒在0.03μg时活性降低约100倍而同样量的DNA活性 降低很小。此时多聚赖氨酸偶联病毒株的基因转移够力相当于0.003和0.0003μg的DNA。这样数量的DNA相当于每个细胞约150个DNA分子和每个细胞约1个病毒粒子。
实施例18
用腺病毒酶促偶联于多聚赖氨酸的基因转移
a），酶反应
将2ml腺病毒制剂（菌株d1312，5×160PEU/ml）加到以25ml反应缓冲剂（0.1MTriS-HCl，PH810，2mMDTT，30%丙三醇）平衡过的SephadeX    G-25凝胶过滤柱上（Pharmacia）。用3.5ml反应缓冲液洗脱。用于酶偶联的反应混合物由最终体积为1500μl的1150μl病毒洗脱流馏份、0.5nmol荷兰猪肝脏转谷氨酰胺酶（TG，Sigma），2nmol或20nmol多聚赖氨酸290，10mMCaCl2和反应缓冲剂组成。反应在37℃下进行1小时，然后，加30μl0.5MEDTA停止反应。为了监视偶合物的特异性，反应混合物也在没有转谷氨酰胺酶存在下制备。未偶联的多聚赖氨酸经CSCl-梯度离心从病毒中分离出（密度1.33g/ml;170000×g，2小时）。收集含病毒的馏份，与等体积的丙三醇混合，液氮中冷冻并于-70℃下贮存。
b），多聚赖氨酸键合于腺病毒的证实
上述反应用的多聚赖氨酸，通过Bolton-Hunler试剂以125I标记（AmerSham）。CsCl-梯度离心后，分出病毒馏份并再经CsCl-梯度法分离。梯度分馏后，用一台闪烁计数器测定每一馏份的放射活性。如图26所示，明显地在有 TG（d1312/TG-PL）的反应混合物中，放射性多聚赖氨酸在病毒馏份中累积。在无TG（d1312/PL）的对照混合物中，放射性多聚赖氨酸未在病毒馏份中累积。
C）.多聚赖氨酸修饰性的腺病毒馏份对转染效率的影响试验
ⅰ）.细胞和培养基
为了转染，在盛有10%热灭活的胎牛血清（FCS），2mM谷氨酰胺，100I.u./ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基的6Cm培养皿中接种5×105个细胞（鼠肝细胞，ATCCNO：TIB73）。
ⅱ）.病毒-DNA-转铁蛋白复合物的形成50μg多聚赖氨酸修饰性的病毒馏份与10μlHBS中的6μgDNA质粒PCMVL混合物并于环境温度下培养20分钟。8μg鼠铁转移蛋白-多聚赖氨酸290B（mTfPL）加到此混合物中并继续培养20分钟。
ⅲ）.鼠肝细胞的转染
病毒-DNA-铁转移蛋白复合物与1.5ml培养液（2%FCS，2mM谷氨酰胺和抗菌素的DMEM溶液）混合并加到细胞中。在除去旧培养液后，于37℃下培养2小时并将2ml10%FCS，谷氨酰胺和抗菌素的DMEM溶液加到细胞中。
再培养2小时后，除去全部培养液，再加2ml10%FCS，谷氨酰胺和抗菌素的DMEM溶液到细胞中。
ⅳ）.测定虫荧光素酶表达
转染24小时后的细胞被收获并按照上述方法检定虫荧光素酶，从图27可以看出，用TG和20nmol多聚赖氨酸处理腺病毒制剂（d1312/TG-20nmolPL）显示最强表达（153540000光密度单位）。有TG和2nmol多聚赖氨 酸的病毒制剂（d1312/TG-2nmolPL）具有稍小的活性（57880000光密度单位）。腺病毒用20nmol多聚赖氨酸处理但不用TG处理的对照馏份不大有效，大约为500。作为对比，使用即未用TG也未用多聚赖氨酸（d1312）处理腺病毒的最初制剂转染复合物。该制剂产生4403000光密度单位活性。
d）。多聚赖氨酸性的腺病毒与未修饰性的腺病毒特别是与小量的DNA相比，转染效率增加。
转染作用是以实施例c）所述方法，用50ml腺病毒馏份ed1312/TG-20nmolPL和6μgPCMV-Luc/8μgmTfPL，0.6μgPCMVL（＝PCMV-Luc）/0.8μg    mTfpL或0.06μgPCMV-Luc/0.08μg    mTfpL进行的。作为比较，转染作用也用6μg，0.6μg，0.06μgPCMV-Luc/mTfPL复合物和未修饰性的腺病毒（d1312）进行。已经发现，有多聚赖氨酸修饰性的腺病毒的复合物即使在有小量DNA的情况下，也产生高表达水平，而未修饰性腺病毒表达水平急剧地降低（如图28）。
实施例19
通过生物素-抗生蛋白链菌素桥的方法在腺病毒和多聚赖氨酸之间取得键合的结合体的基团转移作用
a）.腺病毒d1312的生物素基化
2.4ml 150mMNacl/5mM HEPES，pH7.9/10%丙三醇中的腺病毒d1312（约1011个粒子）的凝胶过滤溶液（Sephadex G-25 PD10，Pharmacia）与 10μl（10nmol）1mMNHS-LC生物素（Pierce21335）溶液混合。环境温度下3小时后，通过凝胶过滤从过量试剂中分离出生物素修饰性的病毒。加丙三醇（总体积为3.2ml）调节该溶液的丙三醇浓度为40%并于-25℃下贮存。病毒的生物素基化经滴加不同稀释度的产物于硝酸纤维素膜上定性检定而证实：在真空干燥器中，80℃下干燥2小时后，用BSA保护，用抗生蛋白链菌素结合的碱性磷酸酶（BRL）培养，洗涤并用显色溶液NBT/X-磷酸盐（氮蓝四唑盐/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，甲苯胺盐;Boehringer    Mannheim）培养1小时，发现为阳性显色反应。
b）.抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸结合体的制备：应用Wagner    et    al.，1990年和EP-Al388758的方法，抗生蛋白链菌素有效地偶联于多聚赖氨酸上。在1ml200mM    HEPES（PH7.9）和300mMNacl中的79nmol（4.9mg）抗生蛋白链菌素与15mMSPDP的乙醇溶液（236nmol）在环境温度下处理1.5小时后，所得修饰性蛋白质在SePhadex    G-25柱上做凝胶过滤，得到以196nmol二硫代吡啶衔接物修饰性的75nmol抗生蛋白链菌素。该修饰性的蛋白质在氩气流下与在2.6ml100mM    HEPES    PH7.9，150mMNacl中的3-巯基丙酸修饰性的多聚赖氨酸反应（75nmol，平均链长为290个赖氨酸单位，以190nmol巯基丙酸衔接物修饰）。在Mono    S    HR5柱（Phar-macia）上用阳离子交换色谱分离结合体。（梯度：20-100%缓冲剂B。缓冲剂A：50mM    HEPES    PH 7.9;缓冲剂B：缓冲剂A+3MNacl）。产物馏份在1.2M和1.7M盐浓度洗脱。对HBS透析（20mM    HEPES    PH7.3，150mM    Nacl）得到由45nmol抗生蛋白链菌素和53nmol多聚赖氨酸组成的结合体。
c）Hela细胞的转染
Hela细胞在6cm培养皿中按实施例13所述方法生长。转染在每板有300，000个细胞的密度下进行。在转染之前，这些细胞用1ml含2%FCS的新鲜培养液培养。
100μlHBS中的6μg    PCMVL-DNA与170μlHBS中的0.8μg抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸混合。20分钟后，加入在170μlEBS中的3μg多聚赖氨酸PL300。再过20分钟后，65μl生物素基化的腺病毒，或为了对照，相应量的腺病毒d1312（30μl，用于修饰性的启始病毒）被加入。这些复合物的混合物（“生物素AdV/复合物A”或“对照AdV”见图29）被继续放置20分钟。
可供选择的络合反应是通过首先在50μlHBS中混合65μl生物素基化的腺病毒与0.8μg抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸，然后在20分钟后，加在170μlHBS中的6μgPCMVL-DNA，通过20分钟后，加在200μlHBS中的3μg多聚赖氨酸PL300（络合混合物“生物素Adv/复合物B”）进行的。
在67μlHBS中的0.6μgPCMVL-DNA与在33μlHBS中的0.3抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸混合。20分钟后加入65μl生物素基化的腺病毒，或作为对照加相应量的腺病毒 d1312（30μl，为修饰性的启始病毒）。络合混合物（“生物素AdV/复合物A”或“对照的Adv”见图29）再放置20分钟，然后用HBS稀释至500μl。
另一可供选择的络合反应是通过首先在50μlHBS中混合65μl生物素基化的腺病毒与0.3μg抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸，然后在20分钟后加入在50μlHBS中的0.6μgPCMVL-DNA。络合混合物（“生物素AdV/复合物B”）再被放置20分钟后用500μlHBS稀释。
将这些混合物加到细胞中，细胞在37℃下培养2小时，然后加入含10%FCS的新鲜培养液。在37℃下培养细胞24小时，然后收获细胞做虫荧光素酶检定。虫荧光素酶活性按前面实施例中所述方法测定。图29中所给数值代表转染细胞的总虫荧光素酶活性。
在平行试验中，Hela细胞的转染是以作为结合体的病毒组分-一种用补骨脂素/UV处理灭活的生物基化的病毒进行的。灭活作用是如下进行的：200μl一批的生物素化的病毒制剂放到两孔的1.6cm组织培养板上。每个样品中加2μl（33mg/ml）8-甲氧基补骨脂素（在DMSO中），将样品板放到冰上并用紫外灯照射10分钟（365nm）UVPTL-33灯）。样品与灯间隔4cm照射后合并两个样品，通过予先用40%丙三醇的HBS溶液平衡的凝胶柱过滤（G50，NicK柱，Pharmacia）。75μl等分与0.8μg抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸络合并按上述方法用于HeLa细胞的转染。
经细胞致病端点检定证实，由于灭活作用病毒滴定度减少104以上，而转移能力在高浓度下减少近50%和低浓度下减少5倍。
d）。K562细胞的转染
K562细胞在RPMI1640培养基（Gibco    BRL，每升加2g碳酸氢钠）加10%FCS，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的培养液悬浮生长至500，000细胞/ml的密度。在转染前16小时，将细胞放到含50μM去铁敏（Sigma）的新鲜培养液中。转染早期，收集细胞并重新悬浮于含10%胎牛血清（加50μM去铁敏）的新鲜培养液中，250，000个细胞/ml，并放到24孔培养皿中，每孔2ml。
制备三种不同类型的DNA复合物。
a）在160μlHBS中的6μgPCMVL-DNA溶液（150mM    Nacl，20mM    HEPES7.3）与在160μl    HBS中的12μgTfpL190B结合体混合，30分钟后，加入20μl腺病毒d1312并将混合物加到K562细胞中。
b）.在160μl    HBS中的800ng抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸与20μl生物素基化的腺病毒混合，制备方法如a）节所述，30分钟后，加入在160μl    HBS中的6μgPCMVL-DNA溶液，再过30分钟后，该溶液与在160μlHBS中的10μg    TfpL190B结合体混合。30分钟后，加该混合物到细胞中。
c）。以b）节类似的方法制备DNA复合物，不同之处在于以3.5μg多聚赖氨酸P（Lys）290溶液代替TfpL190B结合体。
在37℃下培养细胞24小时，然后，收获细胞做虫荧光素酶检定。示于图30中的数值代表转染细胞的总虫荧光素酶活性。
实施例20
基因转移入初级骨髓细胞
a）初级骨髓细胞的分离
用装在1ml注射器上的针头（0.4mm或0.5mm直径）穿过暴露的股骨和胫骨以注满的培养液（含10%FCS，5×10-5M β-巯基乙醇，1%IL-3附加介质和抗菌素的IMDM）冲洗骨髓从大鼠收获初级骨髓细胞。这些细胞在培养介质中经100Xg离心洗涤8分钟。然后，将这些细胞以107个细胞/ml的浓度重新悬浮并接种入T25培养瓶中。4小时后，末贴壁的细胞转移入一个新的培养瓶中并在50μM去铁敏存在下培养过液。
b），腺病毒-DNA-铁转移蛋白复合物的形成
为了形成腺病毒-DNA-铁转移蛋白复合物，50μl生细胞素基化的腺病毒以在20μlHBS中的400ng抗生蛋白链菌素修饰性的多聚赖氨酸培养20分钟，然后，加入含有6μgPCMVL的20μlHBS。培养20分钟后，加入在160μlHBS中的7μg大鼠铁转移蛋白-多聚赖氨酸结合体（mTfPL）并培养该混合物20分钟。
C），转染
为了转染，在100Xg下离心8分钟从T25瓶的培养液中分离出骨髓细胞。将细胞团重新悬浮于3ml含有2%FCS和250μl腺病毒-DNA-铁转移蛋白复合物的培养液中，于37℃在一个新的T25瓶中培养3小时。加3ml含10%FCS的培养液， 2小时后再加6ml这种培养液。
d），虫荧光素酶表达的测定
转染48小时后的骨髓细胞收集后以上述方法分析虫荧光素酶的表达。转染导致相当于310×103光单位/100μg总细胞蛋白质的虫荧光素酶活性表达。
实施例21
在腺病毒的存在下用48kb装配型质转染成神经细胞瘤细胞
a），含虫荧光素酶编码序列的装配型质粒的制备
含有在RSV启动子控制下的单P.Pyralis虫荧光素酶编码序列的3.0KbSalI碎片结合于装配型质粒克隆CI-7aAl的单-SalI位点以上所形成连环体（DoWet    etal，1987）。[Cl-7aAI包括37Kb人基因组DNASau3A碎片（部分消化），编码不明显的基因，克隆入装配型质粒运载体PWE25层聚基因的BamHI位点]。结合反应产物封装于试管中和得到的噬菌体粒子的等分试样感染入E，ColiNM544并涂于LBamP板上。重组细胞用菌落杂交法筛，用3.0KbSaII碎片（经随机引发的32P标记）作杂交探针并用限制性图距分析众阳性产物。含有SalI插入单复制的装配型质粒构成物（COSLuC）在CsCl梯度上生长并纯化（分子量为48Kb）。
小量对照装配型质粒PWELuC（12Kb）由NOtI消化COSLuC，重结合，转化细菌并分离出含适当质粒的克隆来制备。这导致12KbDMA分子缺乏人DNA插入和部分CoSLuC多聚连接子。
b），装配型质粒输送入成神经细胞瘤细胞
封盖1mlDMEM+2%FCS的编号为GI-ME-N的成神经细胞瘤细胞系细胞（DOnti et al，1988）（每个6Cm培养皿中有1×106个细胞）用按照材料和方法部分所述方法制备的TfPL/DNA复合物培养，培养液中含有定量的hTfPL不含PL和DNA。如所指出的那样，此外，细胞培养混合物中还含有或者100μM的氯喹（见3和4道）或者10μl腺病毒d1312，其中每毫升含5×1011个粒子（见5和6道）。含有15μl生物素基化腺病毒d1312（1×1011个粒子）的后两种样品（StPL/生物素）在150μlHBS中用抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸（在实施例19中制得的0.8μg）培养30分钟。在室温下于30分钟内加入在150μl HBS中的6μgDNA，接着加含有6μghTfPL+1μg游离PL的150μlHBS。于室温下再培养30分钟后，将此混合物加到细胞中。在37℃下培养2小时后，每个培养皿中加4mlDMEM+10%FCS。24小时后收获细胞并测定其虫荧光素酶活性。结果示于图31中。
实施例22
应用分子共轭体媒介转移基因到初级气管上皮细胞中
应用束性纤维变性基因遣传矫正发明中的分子共轭体媒介转移基因可行性的最初研究证实，来自人气管上皮的不死细胞学对此基因转移方法呈现敏感性。为了排除这种现象是气管上皮的不死作用-诱发变化的结果，铁转移蛋白-多聚赖氨酸分子结合体也在人的初级呼吸上皮细胞（1°AE）中评价。
1°AE细胞是按照YankaSkaS，J.R.et    al. 1987所述方法，从患者的鼻息肉样品获得的，简叙之，组织在无菌盐水中漂洗，然后，于4℃下贮存在JoklikS最小必须介质（MEM）加抗菌素（青霉素50μ/ml，链霉素50μg/ml，庆大霉素40μg/ml）中并运送到实验室。软骨和过量的粘膜下层组织被剥离下，上皮层在MEM中在蛋白酶溶液（Sigma，14型，0.1mg/dl）中，于4℃下培养16-48小时（Wu，R，1985）。加胎牛血清（FBS，10%以中和蛋白酶并经缓慢振荡使细胞剥离。所得悬浮液通过10μm筛过液除去碎渣。压丸（150Xg，5分钟）和用F12+10%FBS洗涤。
1°AE细胞与作为信息基因的（L.u）含有虫荧光素酶编码装配型质粒（PRSVL）的铁传递蛋白-多聚赖氨酸结合体（hTfPL）处理。在此分析中，初级细胞对于相应不死细胞系（1°AE：本底＝429±41;+hTfPL＝543±L.u.）显示的媒介不显示灵敏性，这可能表明铁转移蛋白复体在1°AE上的相对缺乏。
为了在1°AE上使用一种可替换的靶受体，联结一种作为配位体部分的不适合复制的腺病毒构成结合体（bAdPL;见实施例19a）和b）中生物素基化的腺病毒和抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸的制备;虫荧光素酶编码装配型质粒用作受体基因。用该结合体处理过的人1°AE显示的受体基因表达的水平比本底大得多（+bAdPL＝2585753±453585L.U.）。此外，由源于其它种系的1°AE对于这类基因转移也显示出高水平的易感性（大鼠＝3230244±343153;猴＝53498880±869481L.U.）。 这样，完成了基因转移到1°AE的能力，开创了为获得体内基因传递的潜在的可利用途经。
实施例23
利用分子共轭体媒介转移基因到肝细胞
a），组织培养细胞的转移
按照实施例6所述的方法，培养鼠胚胎肝细胞系细胞BNLCL.2（ATCC TlB73）。Hela细胞和肝细胞在6Cm塑料陪替氏培养皿中生长。在每培养皿约3×105个细胞的浓度下进行转染，转染前，以1ml含2%FCS的新鲜培养基替换标准培养液。
b），二元复合物的形成
在50μlHBS中，生物素基化的腺病毒[大约109PFUS，见实施例19a）和b）]与800ng抗生蛋白链菌素基化的多聚赖氨酸反应。于室温下30分钟后，加入在170μlHBS中的6μgPCMVL-DNA，培养30分钟后，加入在200μlHBS中的3μg多聚赖氨酸PL300。再过30分钟，该溶液用于转染实验。
C），三元复合物的形成
含腺病毒和铁转移蛋白的三元DNA复合物如下方法形成：生物素基化的腺病毒（大约109个病毒粒子）与800ng抗生蛋白链菌素基化的多聚赖氨酸混合。室温下30分钟后，该溶液与在170mlHBS中的61μg装配型质粒DNA混合，培养30分钟后，加入在200μlHBS中的10μg铁转移蛋白-多聚赖氨酸TfPL190B（Wagner，H.et al，1991B）， 再过30分钟，该溶液用于转染实验。
d），β-半乳糖苷酶检验
将BNLCL.2细胞接种于盖片上并于24小时后用PCMV-β-半乳糖苷酶受体基因转染这些细胞（Lim，K.and    Chae，1989）。按照Llm和ChaC的方法48小时后检验β-半乳糖苷酶。
二元转移复合物。生物素基化的腺病毒与抗生蛋白链菌素基化的多聚赖氨酸结合。可供选择的腺病毒通过转谷氨酰胺酶的作用与多聚赖氨酸共价连结。将腺病毒-多聚赖氨酸结合体加到DNA中，使得在DNA和多聚赖氨酸之间形成复合物，于是中和已知比值的DNA的负电荷（大约1/4）。加计算量的多聚赖氨酸以便中和剩余的电荷。包括DNA键合腺病毒-多聚赖氨酸结合体和多聚赖氨酸的复合物转为二元转移复合物。
有两种主要途径装配二元转移复合物。将DNA键合于抗生蛋白链菌素基化的多聚赖氨酸上，然后，偶联于生物素基化的腺病素上;或者首先将腺病毒偶联于多聚赖氨酸，然后与DNA络合。后一方法十分清楚地产生较好的结果，特别是在低DNA消耗的情况下，因此，这是优先选用的装配二元和三元复合物的方法。
含有铁转移蛋白的三元转递复合物。将腺病毒-多聚赖氨酸结合体加到DNA中使形成复合物中和一定比值（约1/4）的DNA负电荷。加计算蛋白铁转移蛋白-多聚赖氨酸结合体于复合物中，然后中和剩余的DNA。由DNA，腺病毒-多聚赖氨酸和铁转移蛋白-多聚赖氨酸组成的复合物叫做三元复合物，原则上，这样的三元复合物应具有结合于或者由细胞组成的腺病毒受体或者铁转移蛋白受体的 内吞能力。
DNA缩合物和腺病毒之间的结合大大提高了虫荧光素酶报导基因表达。腺病毒株d1312和多聚赖氨酸间的物理结合通过或者用谷氨酰胺酶培养这两种成分或者通过腺病毒的生物素基化作用和多聚赖氨酸的抗生蛋白链菌素基化作用而造成。在转移效率方面的结合效应在图32中被清楚地证明，在氯喹存在下或腺病毒（Adenov+TfPL）存在下，肝细胞被铁转移蛋白-多聚赖氨酸DNA复合物（TfPL）培养。在游离的腺病毒存在下，铁转移蛋白转染作用（这一术语特指铁转移蛋白中介质性转染）的提高表明铁转移蛋白-多聚赖氨酸DNA复合物释放入细胞的典型提高。利用转谷氨酰胺酶法，PLAdenoV/TPfL腺病毒与多聚赖氨酸偶联，然后与中和了负电荷部分的DNA反应。随后加铁转移蛋白-多聚赖氨酸以中和DNA的剩余电荷。由这一途经合成了腺病毒-多聚赖氨酸/铁转移蛋白-多聚赖氨酸/DNA三元复合物。可以看出，异常高的值，1.5×109虫荧光素酶光密度单位（或者每个细胞大约5000个光单位）被获得。就转谷氨酰胺酶处理来说，adenoV+PL+TfPL，腺病毒和PL被混合。然而，为了证实转谷氨酰酶酶介质结合多聚赖氨酸与病毒上的特异性，而去掉这种酶，然后，腺在PLAdenoV/TfPL中一样，将病毒制剂络合于同样量的DNA上。在这种情形下，像在AdenoV+TfPL情形中一样转染作用是中度的，这是由于在这两个实验中病毒和铁转移蛋白DNA的定位作用是随机的。与此相反，在三元复合物中由于病毒和DNA的物理结合，确保其复合内在化的PLAdenoV/TfPL产生高水平的铁转移蛋白转染作用。
K562细胞的转染作用显示出腺病毒的溶红细胞性质。人的红白血细胞系K562含有大约150，000个铁转移蛋白受体（Klausner，R.D.et    al，1983b）。如早期报告（Coteen，M.et    al，1990）指出的，在氯喹存在下，即使没有腺病毒，多聚赖氨酸-铁传移蛋白报道DNA复合物可非常高水平地铁转移蛋白转染这些细胞（TfPL，图33）;但在没有氯喹存在下，有性腺病毒的同样复合物，报道基因表达（AdenoV/TfPL）较差，这大概是由于K562细胞象其它血细胞一样（SilVer，L.etal;1988;HorVath，J.etal;1988），腺病毒受体水平较低。当腺病毒通过生物素/抗生蛋白链菌素桥连结于多聚赖氨酸上和加更多的多聚赖氨酸使报道DNA完全缩合或二元复合物时（PLAdenoV/PL），承担转染作用的腺病毒达到中等水平。大概，K562细胞上的少数腺病毒受体被有效地利用，而偶联的腺病毒-多聚赖氨酸-报道DNA由于多聚赖氨酸素-铁转移蛋白的附加而被充分缩合和中和成三元复合物PLAdenoV/TfPL和无数细胞组成的铁转移蛋白受体起作用，由于有效的铁转移蛋白结合和病毒的溶红细胞浆的性质，转染效率增加至少2个数量级（图33）。
三元DNA复合物导致几乎100%肝细胞中报道基因的表达。这些新奇的DNA转移复合物功效也在大鼠肝细胞中试验（BNL    CL.2），用我们的各种转染方案测定可达到转染的细胞百分比。由CMV启子产生的β-半乳糖苷酶基因用作报道基因。细胞定位后，按照Lim和Chae，1989的方法测定β-半乳糖苷酶活性。
图34为在a），在氯喹存在下铁转移蛋白转染;b），在游离的d1312腺病毒存在下铁转移蛋白下转染和C），三元复合物转染，对大鼠肝细胞连接（d1312）腺病毒-多聚赖氨酸-铁传递蛋白-报道DNA复合物的β-半乳糖苷酶检验结果。在无腺病毒情形下，报道DNA标准铁转移蛋白转染之后，仅少数细胞表达报道基因。转移百分比小于0.1%。当氯喹存在时，转染百分比增大到约0.2%（图34）。对于游离的腺病毒，大约5-10%的细胞表达报道基因（图34b），而有转谷氨酰胺酶修饰性病毒的三元复含物导致不是全部，也是大部分细胞表达（图34C）。由于三元复合物可以在高稀释度下使用，其毒性作用与高剂量的游离（未活化）腺病毒比不会增加;但是，值得注意的是，为了达到100%组织培养细胞而高浓度地使用三元复合物时，类似的毒性作用必须引起重视。由残留的病毒是因活性或附加病毒的核内体性质引起的毒性作用，仅仅是转染基因极高水平表达的后果。
被转染报道基因的表达是短暂的，而在不分裂的肝细胞中要维持数周。由d1312多聚赖氨酸腺病毒和d1312修饰性腺病毒制得的三元转移复合物（PLAdenov/TfPL），由于病毒与补骨脂素反应而再次失活。2/3汇合的肝细胞培养物象图34b那样用虫荧光素酶报道基因CMVL转染并于不同时间点测定虫荧光素酶活性。从图35可以看出，三天后，虫荧光素酶活性最大，这时肝细胞培养物变成汇合的和细胞的正分裂。报道基因表达继续存在于未施与维持基因的分离作用的未分裂细胞培养物中并继续存在至少6周，特别是当补骨脂素灭活的腺病素用于三元转移复合物的形成时。
实施例24
利用鸡腺病毒CELO增加DNA输送给人体细胞
在此实施例中，以类似于前面应用人腺病毒的5个实验，试验鸡腺病毒CELO增加DNA输送入人Hela细胞的能力
鸡腺病毒CELO（Phelps株，血清型FAV-1，7，鸡肾通道细胞）用于这些实验。病毒（2ml）通过用20mM    HEPES    PH7.3    150mM    Nacl，（HBS）+10%丙三醇平衡过的PD-10凝胶过滤柱，2ml洗脱液在室温下与20μl    1mM    NHS-LC-生物素反应3小时。接着，生物素基化的病毒，在4℃下用3×200ml    HBS+40%丙三醇透析并于-70℃下贮存。
Hela细胞（每6cm培养皿中5×105个细胞）在20mlDMFM+2%FCS中以6μg用多聚赖氨酸（PLys）或铁转移蛋白-多聚赖氨酸（TfPC）混合物在500μlHBS中络合的装配质粒PCMVL培养（此复合物在室温下予培养30分钟）。然后，在37℃下和定量的、图36指定的病毒存在下，将样品加到细胞中。含生物素基化的CELO病毒的样品和定量的病毒以在200μlHBS中的定量的抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸（StrPL）在室温下予培养30分钟，然后，加6μg在100μlHBS中的装配型质粒PCLue。室温下培养30分钟后，在37℃下定量的TfPL物质加到细胞中。2小时后，加5mlDMEM+10%FCS于细胞中，24小时后收获细胞并做虫荧光素酶检验。其结果示于图36中。
如图36所示，CELO病毒作为一个独立实体增加DNA输入Hela细胞（1-6道）。当（ELO病毒用生物素修饰和与抗生 蛋白链菌素生成复合物，且不论有或没有另外的铁转移蛋白-多聚赖氨酸时，这些病毒都增加DNA输送能力并可与应用人腺病毒d1312的水平相比。特定的Hela细胞系，在无铁转移蛋白存在下，对多聚赖氨酸/DNA复合物显示出高的结合能力（比较图36中样品1和4的虫荧光素酶活性），这样，多聚赖氨酸/DNA复合物中CELO病毒的包涵物足以引起病毒的吸收。
实施例25
成肌细胞的转染
a）.在独立腺病毒和生物素/抗生蛋白链菌素-偶联腺病毒的存在下，用DNA/铁转移蛋白-多聚赖氨酸复合物转染成肌细胞和肌管（myotube）。
C2C12成肌细胞（Blau etal.，1985;ATCC NO.：CRL1772）和G8成肌细胞（ATCCNO.：（RL1456）在高葡萄糖DMEM加10%FCS中生长。成肌细胞培养物用大约每6cm培养皿5×105个细胞在汇合前被转染。肌管培养物在6cm培养皿（每个培养皿中约5×105个细胞）中由于平皿接种成肌细胞制备和成肌细胞达到汇合时，改变培养液为高葡萄糖DMEM加2%，马血清（Barr and Lerden 1991;Dhawan etal.，1991）。转染作用进行5-7天后，按实施例19所述方法用指定量的TfPL，StrpL和生物素基化的腺病毒d1312制备转染复合物。转染20小时后收获细胞并做虫荧光素酶活性检验。图37指出对全部细胞样品以光密度单位表示的所测虫荧光素酶活性：成肌细胞和肌管培养物可以高效率的转染。由于分化成肌管，转染效率比成肌细胞C2C12小1个log单位或比 成肌细胞GB减小不大。以低频率发生GB系参与肌管形成，这部分地解释在分化培养物中缺乏可察觉的效率降低。在DNA转移到这类细胞的情况下，铁转移蛋白/铁转移蛋白受体间相互作用不起主要作用。在独立腺病毒d1312存在下，使用TfPL/DNA复合物时，在所有四种细胞制剂中仅有很好的DNA传递（1，4，7和10道）。使用偶联病毒系统，转移效率被提高（2，3，5，6，8，9，11和12道）。比较仅含病毒的结合复合物和多聚赖氨酸/StrPL缩合于含铁转移蛋白-多聚赖氨酸的复合物的转移效率，增加近一个log（例如，比较无铁转移蛋白的2道与有铁转移蛋白的3道）。不论有或无铁转移蛋白-PL存在独立病毒转移效率低而偶联病毒复合物转移效率高，这可能是由于在这些细胞中和无偶联体存在下，腺病毒起了配位基的作用，独立病毒可以进入细胞中而TfPL/DNA复合物不进入（在此实施例中用的DNA是PCMVL在图中编号为PCLuC）。
b）。在肌管中转染频率的组织化学分析
C2C12肌管培养物以a）节方法制备（成肌细胞5×105个接种于6cm培养皿中并分化成肌管）。以独立病毒样品，在500μlHBS中的8μgTfPL络合PCMVβ-galDNA（6μg）并提供给在2mlDMEM/2%FCS中有18μl腺病毒d1312（每毫升1×1012个病毒）的细胞。以PCMVLacZ DNA（6μg）与在500μl HBS中的7μgTfPL和800ng StrPL加18μl生物素基化的腺病毒d1312（每毫升1×1012个病毒）络合并提供给在2mlDMEM/2%FCS中的细胞。培养24小时后细胞着色，按实施 例15所述方法测定β-半乳糖苷酶活性。
β-半乳糖苷酶着色样式与用虫荧光素酶作报导基因的转染结果（见a）节）一致。应用独立病毒在肌管培养物中得到极低的基因表达，而偶联病毒和DNA导致高水平的基因表达。兰色的存在，多核微管表明基因成功地转移到独立腺病毒存在下的这些分化细胞中。
c）。DNA转移于小鼠初级成肌细胞和肌管培养物上。
从4周大的雄性C57B1/6小鼠的两条后腿上取下的大骨络肌在无菌条件下分离进PBS并切成约5mm的小片。组织被悬浮于20mlPBS中，沉降约2分钟并吸出悬浮物。洗涤三次后，该组织与3.5mlPBS加0.5ml胰蛋白酶/EDTA，0.5ml1%（W/V）胶原酶（Ⅱ型，Sigma）和0.5ml1%BSA（馏分V，在4mMCaCl2中）混合，并于37℃下间断地缓慢振荡下培养30分钟。30分钟后含组织的培养物被沉降，分出悬浮物并与5mlDMEM+20%FCS混合。再用蛋白酶培养3-4次直至组织被完全分散。细胞悬浮物通过细胞滤过器（Falcon）以除去任何聚集体和组织破片，以500g离心15分钟。细胞颗粒重新悬浮于10mlDMEM+20%FCS中并在一个15cm直径的未包被组织培养皿中平板培养60分钟以除去成纤维细胞。除去未附着细胞并在5昆布氨酸包被的，皿有15mlDMEM+20%FCS的10cm组织培养皿中平板培养。一旦达到汇合（大约一周后）使细胞与胰蛋白酶作用并在昆布氨酸包被的每皿约1×106个细胞的6cm培养皿上再次平板培养。为了产生肌管培养物，约5天后（当细胞达到汇合后）培养液改变成DMEM+2%马血清并一周后进行转染。在约80%汇合的6cm培养皿中，转染成肌细 胞。
按以下方面制备昆布氨酸包被细胞平板培养物。在室温下无菌水中，用0.025mg/ml多聚赖氨酸（MW30，000-70，000，Sigma）包被细胞培养皿30分钟。用无菌水冲洗平板培养物三次并空气干燥。在室温下在水中平板培养物用8μg/ml昆布氨酸（EHS，Sigma）包被。在接种细胞之前，平板培养物用无菌水洗三次。
用于转染的DNA复合物用以下方法制备：
稀释在150μlHBS中的指定量的补骨脂素/UV灭活的生物素基化的腺病毒d1312（按实施例19c）方法制备]并加在150μlHBS中的1μg    StriPL，接着在室温下培养30分钟。加含6μgPCMVL（在图中标称PCLUC）的100μl    HBS于每一样品中并在室温下再培养30分钟。最后，加在100μl    HBS中的7μgTfPL于每个样品中，在室温下再培养30分钟，然后，向含2mlDMEM+2%FCS的6cm培养皿中提供成肌细胞或者肌管培养物。培养1小时后，培养液换成5mlDMEM+20%FCS（成肌细胞）或DMEM+2%马血清（肌管培养物），48小时后收获细胞并做虫荧光素酶分析。全部细胞样品的虫荧光素酶活性示于图38中。
实施例26
用外源凝集素配体将CELO病毒引入成肌细胞的改进
a）腺病毒d1312和CELO病毒在HeLa和C2C12成肌细胞中的比较分析
用6μgpCMVL（在附图中以pCluc标出）与1μgStrpL/7μgTfpL及5μl生物素化的腺病毒d1312（见实施例19.1×1012颗粒/ml）或18μl生物素化的CELO病毒（见实施例24，0.3×1012颗粒/ml）的复合物转染HeLa细胞或C2C12成肌细胞试样（每6cm盘中有5×105细胞）。20小时温育后，收集并加工细胞以进行虫萤光素酶活性测量。附图39示出用每份全部细胞试样所得到的虫萤光素酶活性。
可用人体腺病毒d1312/StrpL/TfpL/DNA复合物或CELO病毒/StrpL/TfpL/DNA复合物转染HeLa细胞。前者可通过腺病毒受体或转铁蛋白受体进入HeLa细胞，后者可通过转铁蛋白受体进入HeLa细胞，两者的效率基本相同。但是，腺病毒d1312复合物能有效地将DNA引入C2C12成肌细胞中，而含CELO病毒的复合物在C2C12成肌细胞中的作用却不好。先前的实施例表明，转铁蛋白受体在将结合复合物引入这些细胞中的作用不大，腺病毒受体可能是主要的进入点。CELO病毒在成肌细胞中活性差的原因可能是CELO病毒和转铁蛋白与C2C12成肌细胞的结合较差。
b）从小麦胚芽凝集素作为配体用CELO病毒转染C2C12成肌细胞的改进
由于a）中的引入活性差，由一种新的配体代替转铁蛋白。
从Boehringer Mannheim购得生物素化的小麦胚芽凝集素（每摩尔蛋白质中2-4摩尔生物素）。用先前描述的方法制备生物素化的CELO病毒。按下述方法制备含6μg pCMVL以及设定量的StrpL、TfpL、生物素化的小麦胚芽凝集素（WGA-B）及CELO病毒的复合物。将病毒和WGA一起在150μlHBS中稀释。将StrpL也稀释于150μlHBS中，将上述两溶液混合，于室温下温育30分钟。将稀释于100μlHBS中的DNA加到StrpL/病毒/WGA溶液中，随后再于室温下温育30分钟。最后，将于100μlHBS中的TfpL加到混合物中，再将试样于室温下温育30分钟。将上述复合物加到于2mlDMEM（含2%FCS）中的C2C12成肌细胞（5×105细胞/6cm盘）中。1小时后，将5mlDMEM（（含10%FCS）加到细胞中，20小时后，加工细胞以进行虫萤光素酶活性测量。附图40标出了每份全部细胞试样的活性（光密度单位）。（该实施例中所用DNA为PCMVL，在附图中以pCluc示出）。
如果没有病毒，在有或没有WGA的情况下，DNA很难引入（1，6道）。在有偶合的CELO病毒存在下，得到中等程度的引入（2道），但是，如果复合物中包括WGA-B，引入增加了16倍。增加复合物中WGA的含量（从1μg到5μg），使引入轻微降低（比较3和4道）;而增加复合物中StrpL的含量（从1μg到2μg），使引入稍微提高（比较3和5道）。这些结果清楚地表明。以WGA-B为配体提高了以CELO病毒为媒介的DNA 向C2C12细胞的引入。
d）全长因子Ⅷ基因在C2C12成肌细胞和肌管培养物中的表达
按前面描述的方法制备C2C12成肌细胞和肌小管培养物。用6μg质粒编码的全长人类因子Ⅷ    cDNA（Wood等，1984;Eaton等，1986）与5或15μl生物素化的腺病毒（如上述）及0.5或1μgStrpL、7或6μgTfpL组成的标准组成复合物进行转染。
将DNA/病毒复合物加到于2%FCS/DMEM中的细胞中。于37℃温育4小时后，在每个盘中加入3ml新鲜DMEM+10%FCS。18小时后，收集培养液，用COATEST（KABI，Pharmacia）试验系统按图际标准检测存在的因子Ⅷ。以mllnits标出每24小时，每1×106细胞产生的因子Ⅷ水平（附图41）。
实施例27
用腺病毒蛋白质进行DNA引入
腺病毒wt300在HeLa细胞中生长，按上述对腺病毒d1312的提纯和生物素化的方法进行提纯和生物素化。取1.2ml病毒，对3×300ml5mM    MES和1mM    EDTA于pH6.25，4℃条件下透析18小时。然后在SW60转子上将材料于27K离心30分钟。小心地除去上清液，将沉渣再悬浮于HBS/40%甘油中。向上清液加入pH7.4的HEPES和NaCl，使其浓度达20mM和150mM。检测沉渣（含病毒 核和大量异己酮衣壳，附图42“核”）和上清液（含vertices，附图42“vertices”），以确定DNA进入Mov13小鼠成纤维细胞（（Strauss和Jaenisch，1992）或HeLa细胞的活性。
按下述方法制备DNA复合物。将预定量的每种组分、离心前破裂的病毒或完整的病毒（用由Bradford检测方法确定的微克蛋白质表示）在300μlHBS中稀释。然后加入抗生蛋蛋链菌素-多聚赖氨酸（3μg，于50μlHBS中），再于室温下温育30分钟。将6μgpCMVL（在附图中以pCluc示出）稀释于100μlHBS中，再加到上述溶液中温育30分钟。最后，加入于100μlHBS中的2μgTfpL，再温育30分钟。在仅用TfpL制备试样时，于170μlHBS中的8μgTfpL与于330μlHBS中的6μgpCMVL在室温下混合30分钟。预定量的病毒蛋白质稀释于300μlHBS中。然后加到TfpL/DNA复合物中。然后将所有的试样用1小时加到5×105细胞中（6cm盘，含2mlDMEM/10%FCS）（HeLa细胞或Mov13成纤维细胞）。然后加入5ml含10%FCS的新鲜培养液，20小时后加工细胞，测定虫萤光素酶活性。附图42标出得到的对HeLa细胞（panel A）或Mov13成纤维细胞（panel B）的虫萤光素酶活性（光密度单位）。
对两种细胞而言，DNA传送活性均随用量而增大，且均有顶馏分（Vertex    fraction）（A和B中的试样4-6）。当TfpL/DNA复合物中含等量的生物素化的病毒蛋白质但没有抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸时，观察到DNA引入接近背景水平（A 与B中的试样3）。
实施例28
用含半乳糖-配体结合体的DNA三元复合物提高基因转移
a）含流感肽结合体的三元复合物
已经发现，如果在DNA/转铁蛋白-多聚赖氨酸复合物中有含自流感病毒血细胞凝集素HA-2亚单位的N-端基衍生的序列的多聚赖氨酸结合肽的话，会显著提高以转铁蛋白-多聚赖氨酸为介质的基因转移（实施例13和14）。
按下述方法制备含四触角半乳糖配体-多聚赖氨酸结合体和多聚氨酸修饰性的流感肽InflupL（分别按实施例6或13的方法制备）的相似DNA结合复合物。向质粒DNA    pCMVL中加入配体-多聚赖氨酸结合体来中和一半的DNA电荷，用余下的电荷负载含流感肽-多聚赖氨酸结合体的复合物。
含合成配体（gal）4的这些DNA复合物进入BNL    CL2肝细胞（按实施例6的方法进行转染），得到虫萤光素酶基因表达（附图43），该表达明显高于以转铁蛋白作配体所得到的表达。该表达比用无流感肽，但含等量多基赖氨酸的DNA复合物所做的对比实验得到的表达高500多倍（附图43）。用上述DNA结合复合物得到的活性约比用在氯喹存在下与细胞温育的DNA/（gal）4pL复合物所得到的活性高30倍。
b）含腺病毒结合体的三元复合物
按下述方法制备上述复合物：将于50μlHBS中的生物素化的腺病毒d1312（按实施例19方法制备;2μl、6μl或 18μl;1012颗粒/ml）与于100μlHBS中的抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸（100ng、160ng或480ng）混合，温育30分钟后，加入由6μg pCMV-L与200μlHBS组成的溶液，再过30分钟后，加入于150μlHBS中的3.8μg（gal）4pL（按实施例6方法制备）或7μgTfpL溶液。
将DNA复合物溶液加到每份300，000细胞（ATCC    TIB73，ATCC    TIB74，ATCC    TIB75，ATCC    TIB76）中。该细胞于6cm平板上于高葡萄糖DMEM+2%FCS中生长。进一步的细胞培养步骤和虫萤光素酶估价按前述方法进行。24小时后的基因表达示于附图44。
实施例29
在游离的和结合的鼻病毒存在下用转铁蛋白-多聚赖氨酸进行DNA转移
a）鼻病毒HRV-2的制备
按已知方法制备并提纯鼻病毒HRV-2（Skern等，1984）。
用10nmol    NHS-LC-生物素（Pierce    21335）处理400μl鼻病毒（约30μg）于HBS（150mM    NaCl/5mM    HEPES，pH7.9）/10%甘油中的溶液。于室温下温育3小时后，通过于4℃下对HBS/40%甘油透析将病毒从未结合的生物素中分离出来。
将在吖啶橙存在下生长得到的光敏鼻病毒按已知的方法灭活（Madshus等，1984）。
b）DNA复合物的制备和转染
ⅰ）通过将6μg质粒DNA    pCMvL于330μl    HBS（150mM    NaCl，20mM    HEPES，pH7.3）中的溶液与8μgTfpL290于170μl    HBS中的溶液混合制备转铁蛋白-多聚赖氨酸/DNA复合物。
将DNA复合物与1.5ml培养液（DMEM+2%FCS）及0.14μg至3.5μg鼻病毒HRV-2（或灭活的HRV-2）相混合。将混合物加到NIH3T3细胞（每6cm平板300，000细胞）。4小时后，用4ml新鲜的DMEM+10%FCS来代替转染培养液。24小时后收集细胞，按上述方法测定其虫萤光素酶活性（附图45A）。
ⅱ）按下述方法制备含转铁蛋白-多聚赖氨酸和鼻病毒-多聚赖氨酸结合体的DNA结合复合物：将100μl由生物素化的鼻病毒HRV-2（3.5μl）与HBS组成的溶液与于100μl    HBS中的1μg抗生蛋白链菌素化的多聚赖氨酸混合。（按适当比例混合其他病毒浓缩液）。于室温下30分钟后，该溶液与于150μlHBS中的6μg质粒DNA混合，再于室温下温育30分钟，然后与于150μlHBS中的6μgTfpL290混合。
将DNA复合物与1.5ml培养液（DMEM+2%FCS）混合，再加到NIH3T3细胞（每6cm平板300，000细胞）中。培养物的进一步处理和虫萤光素酶活性的测定按前述（ⅰ）的方法进行（附图45B）。
实施例30
用含离子键合的腺病毒的结合复合物转染HeLa细胞
通过先将30μl腺病毒d1312（约109PFUs）与于170μlHBS中的1μg多聚赖氨酸pLys450（平均链长为450单体）混合，于室温下30分钟后，再与于170μl HBS中的6μgpCMVL-DNA混合来制备复合物（A）。再温育30分钟后，复合物与于170μlHBS中的9μgTfpL190混合。将一份复合物混合物的等分试样（10%＝50μl溶液，600ngDNA;或1%＝5μl溶液，60ngDNA）稀释于1.5ml DMEM+2%FCS中，再加到300，000HeLa细胞中。4小时后，加入2mlDMEM+20%FCS。转染24小时后收集细胞，按前述方法测定虫萤光素酶活性。与全部萃取液相应的虫萤光素酶活性为29115000光密度单位（在600ngDNA情况下）或1090000光密度单位（在60ngDVA情况下）。
对比实验：通过先将于170μlHBS中的6μg pCMVL-DNA与于170μlHBS中的1μg多聚赖氨酸pLys450（平均链长为450单体）混合，于室温下30分钟后，再与于170μlHBS中的9μg TfpL190混合来制备复合物（B）。再温育30分钟后，将复合物与30μl腺病毒d1312（约109PFUs）混合。将一份复合物混合物的等分试样（10%＝50μl溶液，600ngDNA;或1%＝5μl溶液，60ngDNA）稀释于1.5ml DMEM+2%FCS中，再加到300000HeLa细胞中。4小时后，加入2ml DMEM+2%FCS。转染24小时后收集细胞，按前面实施例所述的方法测定虫萤光素酶活性。与全部萃取液相应的虫萤光素酶活性为405000 光密度单位（在600ngDNA情况下）或200光密度单位（在60ngDNA情况下）。
实施例31
DNA/腺病毒/转铁蛋白-多聚赖氨酸结合体在大鼠肝的局部应用
a）直接注射
按实施例19所述的方法制备复合物。该复合物含有200μl生物素化的腺病毒d1312，6.4μg抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸，48μgpCMVL和48μgTfpL290，于总体积为2000μl的HBS中。用三溴乙醇麻醉一只重240g的雄性Sprague-Dawley大鼠，剖腹4cm。将复合物溶液注射入大鼠肝的左叶。然后用层状物封闭切口。注射复合物48小时后大鼠死亡，测量虫萤光素酶表达。在注射区，测得5615光密度单位/每mg肝匀浆蛋白质。注射点的总虫萤光素酶活性为370，600光密度单位。
b）通过胆汁排出系统将结合体用于肝
按下述方法制备复合物：用200μlHBS稀释的200μl生物素化腺病毒d1312与于400μlHBS中的6.4μg抗生蛋白链菌素修饰性的多聚赖氨酸一起于室温下温育30分钟。然后加入于800μlHBS中的48μgpCMV-L。温育30分钟后，再加入于900μlHBS中的48μgTfpL。为应用复合物，用三溴乙醇麻醉雄性Sprague    Dawley大鼠（体重250g），用中等切口打开腹腔。在鼠体左侧露出肠，将一根与管和1ml注射器相连的27G针插入胆管。用4分钟将复合物注入。然后 从胆管中拨出针，用纤维蛋白密封物（Immuno）密封注射点。用缝合线和金属钳封闭腹部刀口。30小时后杀死大鼠，从不同的肝叶取样并测定其虫萤光素酶基因表达。虫萤光素酶的峰值活性为19000光密度单位/mg蛋白质，全部肝的总表达的计算值约为2.7×106光密度单位。
实施例32
DNA/腺病毒/转铁蛋白-多聚赖氨酸结合体在钳住的小鼠尾静脉的局部应用
按实施例19所述的方法制备复合物。该复合物含有45μl生物素化的腺病毒d1312、0.8μg抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸、6μgpCMVL和24μgTfpL290，于总体积为150μμl的HBS中。用三溴乙醇麻醉-雄性C3H/He小鼠（两月齡），将复合物注入其尾静脉。注射后，立即从尾的两端钳住，共20分钟，以将复合物溶液限制在被注射的尾静脉段内且不能被血液冲淹。注射48小时后，小鼠死去，剥出尾静脉。在尾静脉段的匀浆中测量虫萤光素酶表达。结果为2，600光密度单位/3cm尾静脉。
实施例33
初级人类黑素瘤细胞转染
通过外科手术从病人体内取出黑素瘤，通过在RPMI1640培养液+5%FCS，2mM谷氨酰胺和抗菌素中机械地破裂黑素瘤，再用钢筛挤压组织碎片的方法从黑素瘤中分离出初级黑素瘤细胞。通过离心，随后再悬浮的方法洗涤肿瘤细胞数次，接种于T25细胞培 养瓶中。分离24小时后，用结合复合物转染肿瘤细胞。该复合物含有3μl、9μl或27μl生物素化的腺病毒d1312（1×1012病毒/ml），0.5μg抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸，6μg pCMVL和7μgTfpL290，于总体积为500μlHBS中。转染36小时后，收集细胞。测定虫萤光素酶表达。结果示于附图46。
实施例34
初级人类成纤维细胞的转染
将皮肤活组织放入一含DMEM、2mM谷氨酰胺、20%FCFCS和抗菌素的陪氏培养皿中。然后用外科手术刀充分绞碎活组织，于3ml培养液的存在下培养5天。随后，用含2mM谷氨酰胺。10%FCS和抗菌素的新鲜DMEM洗涤细胞，再培养7天。经过这段时间后，细胞被胰蛋白消化并被分培入新的陪氏培养皿中。当细胞几乎融合的时候，再次将其胰蛋白消化，冷冻贮藏直至转染。为进行转染，将细胞解冻，再接种于6cm陪氏培养皿中，并于含2mM谷氨酰胺、10%FCS和抗菌素的DMEM中培养。转染结合体按下述方法制备：将3μl、10μl、20μl和30μl生物素化的腺病毒d1312与0.1μg、0.3μg、0.5μg和0.8μg多聚赖氨酸修饰性的抗生蛋白链菌素于150μlHBS中在室温下温育30分钟。然后加入于170μlHBS中的6μg    pCMV-βgal质粒，再将混合物温育30分钟。在最后步骤，分别向含3μld1312的结合体、含10μld1312的结合体、及含20μld1312和含30μld1312的结合体中加 入于170μlHBS中的7.8μg、7μg和6μgTfpL。温育30分钟后，将结合体加到于含2mM谷氨酰胺、2%FCS和抗菌素的2mlDMEM中的细胞中，细胞于37℃温育4小时。然后除去培养液，继续用含2mM谷氨酰胺、10%FCS和抗菌素的DMEM于37℃下培养。48小时后，按前述实施例所述的方法标明β-半乳糖苷酶表达。
用3μl    d1312转染时，发现14%细胞产品β-半乳糖苷酶，用10μl    d1312转染时，得到32%阳性细胞，用20μl    d1312和30μl    d1312转染时，64%的细胞为阳性。
实施例35
使用非病毒核内体溶解剂进行基因转移
a）膜破裂肽的合成
ⅰ）肽合成：
以对烷氧基苄醇树脂（0.97mmol/g）为固体载体，用Fmoc-保护的氨基酸通过固相法在自动合成器（ABI431A）中合成肽。通过对称酐将有端羧基的氨基酸偶合到树脂上。用1-羟基苯并三唑-二环己基碳化二亚胺法将后续氨基酸偶合。使用下述侧链保护基：（Trt）Asn，（Trt）Cys[对EALA和GGLF用（t-Bu）Cys]，（t-Bu）Glu，（Trt）His.（t-Bu）Ser。
EALA:  (SEQ  ID  NO:5)  Trp  Glu  Ala  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala
Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  His  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala
Glu  Ala  Leu  Glu  Ala  Leu  Ala  Ala  Gly  Gly  Ser  Cys
GLF  (SEQ  ID  NO:6)  Gly  Leu  Phe  Gly  Ala  Leu  Ala  Glu
Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  His  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu
Ala  Glu  Ala  Leu  Glu  Ala  Leu  Ala  Ala  Gly  Gly  Ser  Cys
GLF-II  (SEQ  ID  NO:7)  Gly  Leu  Phe  Gly  Ala  Leu  Ala  Glu
Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala
Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Glu  Ala  Leu  Ala  Ala  Gly  Gly  Ser  Cys
GLF-delta  (SEQ  ID  NO:8)  Gly  Leu  Phe  Glu  Leu  Ala  Glu  Ala
Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala
Glu  Ala  Leu  Glu  Ala  Leu  Ala  Ala  Gly  Gly  Ser  Cys
EALA-Inf  (SEQ  ID  NO:9)  Gly  Leu  Phe  Gly  Ala  Ile  Ala  Gly
Phe  Ile  Glu  Asn  Gly  Trp  Glu  Gly  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala
Glu  Ala  Leu  Glu  Ala  Leu  Ala  Ala  Gly  Gly  Ser  Cys
EALA-P50  (SED  ID  NO:10)  Gly  Leu  Phe  Glu  Ala  Ile  Glu  Gly
Phe  Ile  Glu  Asn  Gly  Trp  Glu  Gly  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala
Glu  Ala  Leu  Glu  Ala  Leu  Ala  Ala  Gly  Gly  Ser  Cys
P50  (SED  ID  NO:11)  Gly  Leu  Phe  Glu  Ala  Ile  Glu  Gly
Phe  Ile  Glu  Asn  Gly  Trp  Glu  Gly  Met  Ile  Asp  Gly  Gly  Gly
Cys
通过用3ml苯酚/乙二硫醇/水/三氟乙酸的0.75∶0.25∶0.5∶0.5∶10混合物于室温处理100mg载肽载体1.5小时，从树脂上取下肽并除去侧链保护基[除（t-Bu）Cys外]。粗肽于乙醚中折出，洗涤两次。将S-t-Bu保护的肽EALA和GLF溶于少量1M碳酸氢三乙铵（TEAB，pH8）中，稀释至100mMTEAB，在Nucleosil    500-5C4柱（0.1%TFA-乙腈梯度）上进行反相HPLC以进一步提纯。两种肽于约50%乙腈洗脱。通过按上述方法对Trt-Cys肽去保护基，得到游离Cys-SH型肽。将粗肽（5mg）溶于100ml100mM    TEAB（pH8，含1μlβ-巯基乙醇）中，用硅胶（Sephadex    G-25，100mMTEAB，0.5mMEDTA）过滤提纯，冷冻干燥或经离子交换色谱（Mono    Q    Pharmacia，20mMHepes，pH7.3，梯度0-3M    NaCl，肽于1.5M    NaCl洗脱）提纯。
ⅱ）用N-（羟乙基）顺丁烯二酰亚胺修饰性游离SH型肽硅胶（Sephadex    G-25，20mM    Hepes，pH7.3，0.5mMEDTA）过滤后，通过与1.3-10倍摩尔过量的N-（羟乙基）顺丁烯二酰亚胺反应（1小时，室温），将肽GLF-delta，GLF-Ⅱ、EALA-Inf、EALA-p50、P50的C-端基SH基阻断。用硅胶（Sephadex    G-25，100mM    TEAB，pH8）过滤除去过量的顺丁烯二酰亚胺，通过冷冻干燥得到以三乙铵盐形式存在的肽（GLF-delta-mal、GLF-Ⅱ-mal、EALA-Inf-mal、EALA-P50-mal、P50-mal）。
ⅲ）用2，2′-二硫代双吡啶修饰性
游离SH肽与10当量的2，2′-二硫代双吡啶（20mM    Hepes，pH7.9，0.5mMEDTA）于室温下通霄反应。通过硅胶（Sephadex    G-25，100mM    TEAB，pH8）过滤或离子交换色谱（Mono    Q    Pharmacia，20mMHepes，pH7.3，梯度0-3M    NaCl，肽于1.5M    NaCl洗脱）除去过量的反应物，得到（2-吡啶基硫代）-Cys肽（GLF-delta-SSPY、GLF-Ⅱ-SSPy、EALA-Inf-SSPy、EALA-P50-SSPy、P50-SSPy）。
Ⅳ）肽的二聚
通过使等摩尔的P50-Cys-（2-吡啶基硫代）和P50-Cys-SH在20mMHepes（pH7.3）中于室温下反应3天制备P50同型二聚体（P50dim）。用Mono    Q柱（HR-5/5Pharmacia;20mM    Hepes，pH7.3.梯度0.09M-3M    NaCl，P50-二聚体于1.1M    NaCl洗脱）分离反应混合物。用相似的方法。通过游离巯基型肽P50与吡啶基硫代-修饰性肽GLF反应制备杂二聚体。
b）脂质体渗漏测定：
通过从载有钙黄绿素自淬灭浓缩物的脂质体上释放出萤光染料来测定合成肽破裂脂质体的能力。通过于100mM钙黄绿素、375mMNa+、50mM NaCl（pH7.3）含水相中反应蒸发（Szoka和Papahadjopoulos，1978），从蛋类卵磷脂制备脂质体，并挤压通过100nm聚碳酸酯过滤器（MacDonald 等，1991），以使颗粒大小均匀分布。用等渗缓冲液（200mM    NaCl，25mM    Hepes，pH7.3）在Sephadex    G-25硅胶上过滤，从未结合材料中分离出脂质体。为进行在各种PH值下渗漏的测定，将脂质体溶液在2倍的测定缓冲液（400mM    NaCl，40mM柠檬酸钠）中稀释（6μl/ml）。将100μl等分试样加到于96井微滴板中的一素列肽于水中的稀释液中（最终脂质浓度：25μM），于室温下温育30分钟后，用微滴板萤光光度计测定于600nm的钙黄绿素萤光（于490nm激发）。通过加入1μl10%Triton    X-100溶液。得到100%渗漏的值。观察到50%渗漏[即每μg肽脂质体溶液解离至50%时脂质体溶液的体积（μl）]时肽浓度的倒数值为计算渗漏的单位，外推低于20单位的值。脂质体渗漏测定结果示于附图47。GLF和EALA具有最高的pH特异活性。
c）红细胞溶胞测定：
新鲜的人类红细胞用HBS洗涤几次，再悬浮于2倍具有适宜pH值的测定缓冲液（300mM NaCl，30mM柠檬酸钠）中，浓度为6.6×107/ml。将75μl等分试样加到于96井微滴板（锥形）中的一系列肽于水中的75μl稀释液中，于37℃温育1小时，并持续摇动。离心（1000rcf，5分钟）除去未解离的红细胞后，将100μl上清液转移到一新的微滴板中，于450nm测定血红蛋白吸收（于750nm背景校正）。离心前加入1μl10%Triton X-100溶液，以测定100%溶胞。以观察到50%渗漏[即每μg肽红细胞溶液解离至50%时红细胞溶液的体积（μl）]时肽浓度的例数值为计算溶血的单位。外 推低于3溶血单位的值。得到的数值示于附图48。可以看出，对于细胞解离和/或大分子如血红蛋白的释放来说，P50dim和EALA-P50具有最高的PH特异活性。P50单体P50mal和P50SS-Py活性较低。蜂毒素具有最高活性，但不是特异地对酸性PH。
d）制备DNA结合复合体
将于150μlHBS中的6μg pCMVL-DNA与于150μlHBS中的4μgTfpL290混合，于室温下30分钟后，与于100μlHBS中的4-20μg聚（L）赖氨酸290混合，于室温下再温育30分钟后，加入于100μlHBS中的0.3-30μg肽，再温育30分钟。通过初步滴定测定得到的基因转移效率（见表3，向BNL CL.2细胞的基因转移）来确定核内体溶解剂的最佳量。同时加入pLys和核内体溶解剂以及采用大体积制备复合物（终体积为1.5mL），得到基本相同的（或更好的）转染效率。在这些实验中，非肽亲水脂物质脱氧胆酸和油酸也可提高DNA的进入。
e）细胞转染
转染前，粘着细胞系（分别为BNL    CL.2肝细胞或NIH3T3细胞）在6cm盘中生长1-2天（DMEM培养液+10%FCS;每盘300，000细胞）。除去培养液，加入1.5mLDMEM（2%FCS）和500μLDNA复合体。也可以使用0.5mL    DMEM+6%FCS和1.5mlDNA复合物。温育4小时后，加入2mlDMEM（18%FCS）。也可以用4mLDMEM+10%FCS代替转染培养液。转染24小时后，按前述 方法收集细胞并测量虫萤光素酶活性。光密度单位值代表受转染细胞的总虫萤光素酶活性。
BNL    CL.2肝细胞转染结果列于附图49：
附图49A）
按下述方法制备DNA复合物：将于250μlHBS中的6μgpCMVL-DNA与于250μl HBS中的4μg TfpL290混合，于室温下30分钟后，再与于750μl HBS中的20μg聚（L）赖氨酸290混合，在室温下再温育30分钟后，加入于250μlHBS中的预定量的肽。
附图49B）
按下述方法制备DNA复合物：将于500μlHBS中的6μg pCMVL-DNA溶液与于250μlHBS中的4μgTfpL290混合，于室温下静置30分钟。将500μl20μg聚（L）氨酸290的HBS溶液与于250μlHBS中的预定量的肽混合，并立即加到TfpL/DNA混合物中。于室温下再温育30分钟后，将复合物与0.5mlDMEM+6%FCS混合，加到450，000细胞中。转染24小时后，按前述方法收集细胞并测定虫萤光素酶活性。
在附图50中给出了用NIH3T3细胞所做实验的结果。转染TIB73所用复合物与上述A）和B）相同。
在细胞培养实验中，发现P50dim和EALA-P50具有最高活性，EALA和GLF具有中等活性，P50单体和蜂毒素具有较低的活性。
实施例36
用有低聚赖氨酸C-端基伸展的合成非病毒肽进行基因转移
按前述实施例所述方法合成并提纯具有下列序列的肽（SEQID    NO：4）
Met  Ala
Gln  Asp  Ile  Ile  Ser  Thr  Ile  Gly  Asp  Leu  Val  Lys  Trp  Ile
Ile  Asp  Thr  Val  Asn  Lys  Phe  Thr  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys
Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys
该肽衍生自金黄色葡萄球菌（SEQ    ID    NO：3
Met  Ala  Gln  Asp  Ile
Ile  Ser  Thr  Ile  Gly  Asp  Leu  Val  Lys  Trp  Ile  Ile  Asp  Thr
Val  Asn  Lys  Phe  Thr  Lys  Lys,
的δ-毒素。已经知道，通过增加10赖氨酸残基而伸展，该金黄色葡萄球菌在酸性pH值下对膜破裂具有特异性（Thiaudiere等，1991;Alouf等，1989）。
按下述方法制备DNA复合物：将于170μlHBS中的6μgpCMVL-DNA与于170μlHBS中的4μgTfpL290混合，于室温下30分钟后，再与于170μlHBS中的约3μg肽混合。再温育30分钟后，将复合物与1.5mlDMEM+2%FCS混合，并加到450，000BNL    CL.2肝细胞中。2小时后，加入2mlDMEM+20%FCS。转染24小时后，按前述实施例所述方法收集细胞并测定虫萤光素酶活性。与全部萃取物相应的虫萤光素酶活性为481，000光密度单位。
实施例37
在有C-端基低聚Lys-尾的蜂毒素-肽的存在下转染肝细胞
按实施例36所述的方法合成具有下述序列的肽（N至C末端）（SEQ    ID    NO：12）
Gly  Ile  Gly  Ala  Val  Leu  Lys  Val  Leu  Thr  Thr
Gly  Leu  Pro  Ala  Leu  Ile  Ser  Trp  Ile  Lys  Arg  Lys  Arg  Gln
Gln  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys
（定为mel1）和
(SEQ  ID  NO:13)  Gly  Ile  Gly  Ala  Val  Leu  Glu  Val  Leu
Glu  Thr  Gly  Leu  Pro  Ala  Leu  Ile  Ser  Trp  Ile  Lys  Arg  Lys
Arg  Gln  Gln  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys  Lys
（酸性突变体，定为mel2）。
按下述方法制备DNA复合物：将于170μlHBS中的6μg    pCMVL-DNA与于170μlHBS中的4μg    TfpL290混合，于室温下30分钟后，与于170μlHBS中的约3μg肽mel1或5μgmel2混合。再温育30分钟后，将复合物与1.5mlDMEM+2%FCS混合，再加到450，000BNL    CL.2细胞中，按实施例36所述的方法培养，4小时后，加入2mlDMEM+20%FCS。转染24小时后，收集细胞并按前述方法测定虫萤光素酶活性。与全部萃取物相应的虫萤光素酶活性为9200光密度单位（对mel1）和9400光密度单位（对mel2）。
实施例38
干扰素α在HeLa细胞中表达
在CMV增强剂/促进剂控制下，用pAD-CMV1-IFN编码人类干扰素α2C转染HeLa细胞（5×105细胞/6cm盘）（如DE4021917A所述，通过再克隆HindⅢ-XbaI INF-α2C的插入pAD-CMV1来得到pAD-CMV1-INF）。将于330μlHBS中的μg DNA试样与于330μlHBS中的8μgTfpL混合，在室温下温育30分钟。试样6-10仅含4μgTfpL，且第一次温育30分钟后，将于160μlHBS中的P16pL（20μg）等分试样加到试样6和7中，将PLys290（20μg）等分试样加到试样8、9和10中。再温育30分钟后，加入含10μl（试样8）或50μl（试样9和10）游离P16的160μlHBS等分试样（关于P16和P16pL的合成，参见实施例13）。再温育30分钟后，在下述化合物的存在下，将试样加到于2mlDMEM/2%FCS中的HeLa细胞中。试样2、7和10含100μM氯喹，试样3和4含5和15μl腺病毒d1312（1×1012颗粒/ml），试样5含15μl补骨脂素不活的腺病毒d1312。为比较腺病毒对内生干扰素制造的控制，用该病毒的等分试样（与试样3、4和5相同）处理试样11、12和13。转染2小时后，向细胞中加入5ml新鲜的DMEM+10%FCS。转染48小时后，除去培养液，并用2ml新鲜DMEM+10%FCS代替。转染72小时后收集转染液，按DE40 21 917所述方法对干扰素α进行ELISA分析。干扰素α的水平（ng/ml）示于附 图51。
TfpL在将IFN基因引入上述细胞方面功能较差，这与前面用虫萤光素酶或β-gal报道基因所进行的实验相一致。氯喹的存在激发起可检测的信号（约7ng/ml，试样2），但腺病毒d1312以与剂量相关的形式促进DNA的引入（试样3和4）。在没有IFN    DNA复合物存在的情况下，用基本相同量的病毒处理上述细胞不会产生可检测的干扰素信号（试样11和12）。用合成的流感衍生的核内体溶解肽P16（见实施例13）作结合体（试样6和7）或作与TfpL/DNA复合物表面离子键合的肽（试样9、9和10，肽的结合见实施例35）进行转染产生可检测的水平的干扰素制造。在氯喹的存在下，肽结合体会使干扰素制造增长（试样7）。
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Zon，G.，1988，Pharmaceut.Research    5，No.9，539-549.
序列表
(1)一般信息:
(ii)发明题目:将核酸复合物引入高级真核细胞的组合物
(iii)序列数目:13
(iv)计算机信息:
(A)培养基类型:Floppy  disk
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Version#1.25(EPO)
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20
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(ii)分子类型:肽
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Figure 921120303_IMG2
Met  Ile  Asp  Gly  Gly  Gly  Cys
20
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(i)序列特征:
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Figure 921120303_IMG3
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20    25
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35
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Figure 921120303_IMG5
Ser  Cys
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35
(2)SEQ  ID  NO:7信息
(i)序列特征:
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Gly  Ser  Cys
35
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20
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35
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Lys  Lys  Lys  Lys
35
表1A
Figure 921120303_IMG14
Figure 921120303_IMG15
Figure 921120303_IMG17
Figure 921120303_IMG19

Claims (95)

1、用于核酸复合物和一种与核酸具有亲和性的物质该物质可与所述细胞的一种内在化因子选择性偶合转染高级真核细胞的组合物，该组合物的特性在于。所述组合物含有一种物质，其本身具有被内在化到上述细胞的能力。或具有作为核酸复合物的一个组分内在化到上述细胞的能力，并具有将核内体(进入细胞后，复合物位于此处)内容物释入细胞质的能力。
2、根据权利要求1的组合物，其特征在于，核内体溶解剂为病毒或病毒组分，该病毒或病毒组分本身为上述细胞的内在化剂。
3、根据权利要求1的组合物，其特征在于，核内体溶解剂具有核酸结合区域，或与与核酸具有亲和性的物质相连结，并具有作为结合体/核酸复合物组分被内在化到所述细胞的能力，所说该复合物还可选择性含有细胞内在化因子。
4、根据权利要求3的组合物，其特征在于，核内体溶解剂与与核酸具有亲和性的物质共价连结。
5、根据权利要求3的组合物，其特征在于，核内体溶解剂与与核酸具有亲和性的物质非共价连结。
6、根据权利要求5的组合物，其特征在于，通过生物素-抗生蛋白链菌素桥连结。
7、根据权利要求5的组合物，其特征在于，通过离子键连结。
8、根据权利要求3的组合物，其特征在于，核内体溶解剂通过核酸连结区与核酸直接相连。
9、根据权利要求3的组合物，其特征在于，核内体溶解剂为病毒或病毒组分。
10、根据权利要求2或9的组合物，其特征在于，核内体溶解剂为腺病毒。
11、根据权利要求10的组合物，其特征在于，腺病毒为突变体。
12、根据权利要求11的组合物，其特征在于，腺病毒为复制非组分性突变体。
13、根据权利要求12的组合物，其特征在于，腺病毒在ElA区有一个或多个突变和/或缺失。
14、根据权利要求10的组合物，其特征在于，腺病毒是灭活的。
15、根据权利要求14的组合物，其特征在于，腺病毒是由短波UV灭活的。
16、根据权利要求14的组合物，其特征在于，腺病毒是由UV/补骨脂素灭活的。
17、根据权利要求14的组合物，其特征在于，腺病毒是由甲醛灭活的。
18、根据权利要求9的组合物，其特征在于，病毒组分是一种或多种腺病毒蛋白质。
19、根据权利要求2或9的组合物，其特征在于，病毒是细小核糖核酸病毒，优选鼻病毒。
20、根据权利要求19的组合物，其特征在于，鼻病毒是灭活的。
21、根据权利要求3的组合物，其特征在于，核内体溶解剂本身不是细胞内在化因子，核酸复合物还含有上述细胞的内在化因子，该因子与与核酸具有亲和性的物质连结。
22、根据权利要求21的组合物，其特征在于，核内体溶解剂为病毒或病毒组分，该病毒或病毒组分不是人类细胞内在化因子。
23、根据权利要求22的组合物，其特征在于，核内体溶解剂为对非人类有感染作用的病毒。
24、根据权利要求23的组合物，其特征在于，病毒为腺病毒。
25、根据权利要求24的组合物，其特征在于，腺病毒为鸟类的腺病毒。
26、根据权利要求25的组合物，其特征在于，腺病毒为Chick  Embryo  Lethal  Orphan病毒。
27、根据权利要求21的组合物，其特征在于，核内体溶解剂为可被选择修饰核内体溶解病毒肽。
28、根据权利要求27的组合物，其特征在于，核内体溶解肽为流感-血细胞凝集毒HA2肽。
29、根据权利要求28的组合物，其特征在于，该肽具有序列
Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
30、根据权利要求29的组合物，其特征在于，该肽具有序列
Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
31、根据权利要求21的组合物，其特征在于，核内体溶解剂为非病毒，可被选择性修饰的天然或合成肽。
32、根据权利要求2或31的组合物，其特征在于，肽具有核酸结合区。
33、根据权利要求3或21的组合物，其特征在于，内在化因子为转铁蛋白。
34、根据权利要求3或21的组合物，其特征在于，内在化因子为肝细胞配体。
35、根据权利要求34的组合物，其特征在于，内在化因子为无延糖蛋白受体的配体。
36、根据权利要求35的组合物，其特征在于，内在化因子为四-半乳糖-多聚赖氨酸。
37、用作权利要求3-36中任一项所述组合物的组分的核酸复合物，该复合物含有一种或多种在细胞中表达的核酸，核内体溶解剂，该溶解剂原先具有核酸结合区或与与核酸具有亲和性的物质连结，该复合物还可含有内在化因子，该内在化因子与与核酸具有亲和性的物质连结。
38、根据权利要求37的复合物，其特征在于，所述核酸具有治疗活性。
39、根据权利要求38的复合物，其特征在于，含有一种或多种具有基因治疗活性的DNA分子。
40、根据权利要求39的复合物，其特征在于，所述DNA分子编码Cytokines。
41、根据权利要求38的复合物，其特征在于，所述核酸含有核苷酸序列，特异地抑制细胞功能的RNA分子可被该序列转录。
42、根据权利要求37的复合物，其特征在于，与核酸具有亲和作用的物质为有机聚阳离子。
43、根据权利要求42的复合物，其特征在于，聚阳离子为多聚赖氨酸。
44、根据权利要求37的复合物，其特征在于，核内体溶解剂和内在化因子均与与核酸具有亲和作用的同一物质连结。
45、根据权利要求44的复合物，其特征在于，核内体溶解剂和内在化因子与多聚赖氨酸连结。
46、根据权利要求45的复合物，其特征在于，该复合物还含有非共价键多聚赖氨酸。
47、用作权利要求37-46中任一项所述复合物的组分的结合体，其特征在于，该结合体含有与与核酸具有亲和作用的物质连结的核内体溶解剂。
48、根据权利要求47的结合体，其特征在于，核内体溶解剂与与核酸具有亲和性的物质共价连结。
49、根据权利要求47的结合体，其特征在于，核内体溶解剂与与核酸具有亲和性的物质非共价连结。
50、根据权利要求49的结合体，其特征在于，通过生物素-抗生蛋白链菌素桥连结。
51、根据权利要求49的结合体，其特征在于，通过离子键连结。
52、根据权利要求47的结合体，其特征在于，核内体溶解剂为病毒或病毒组分。
53、根据权利要求52的结合体，其特征在于，核内体溶解剂为腺病毒。
54、根据权利要求53的结合体，其特征在于，腺病毒为突变体。
55、根据权利要求54的结合体，其特征在于，腺病毒为复制-非组分突变体。
56、根据权利要求55的结合体，其特征在于，腺病毒在ELA区有一个或多个突变和/或缺失。
57、根据权利要求53的结合体，其特征在于，腺病毒是灭活的。
58、根据权利要求57的结合体，其特征在于，腺病毒是由短波UV灭活的。
59、根据权利要求57的结合体，其特征在于，腺病毒是由UV/补骨脂类灭活的。
60、根据权利要求57的结合体，其特征在于，腺病毒是由甲醛灭活的。
61、根据权利要求52的结合体，其特征在于，病毒组分为腺病毒蛋白质。
62、根据权利要求52的结合体，其特征在于，病毒是微小核糖核酸病毒，优选鼻病毒。
63、根据权利要求62的结合体，其特征在于，鼻病毒是灭活的。
64、根据权利要求47的结合体，其特征在于，核内体溶解剂本身不是被转染细胞的内在化因子。
65、根据权利要求64的结合体，其特征在于，核内体溶解剂为病毒或病毒组分，该病毒或病毒组分不是人类细胞内在化因子。
66、根据权利要求64的结合体，其特征在于，核内体溶解剂为对非人类有感染作用的病毒。
67、根据权利要求66的结合体，其特征在于，病毒为腺病毒。
68、根据权利要求67的结合体，其特征在于，腺病毒为鸟类的腺病毒。
69、根据权利要求68的结合体，其特征在于，腺病毒为Chick  Embryo  Lethal  Orphan病毒。
70、根据权利要求64的结合体，其特征在于，核内体溶解剂为可被选择性修饰的核内体溶解病毒肽。
71、根据权利要求70的结合体，其特征在于，核内体溶解肽为流感-血细胞凝集素HA2肽。
72、根据权利要求71的结合体，其特征在于，该肽具有序列
Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
73、根据权利要求71的结合体，其特征在于，该肽具有序列
Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
74、根据权利要求47的结合体，其特征在于，核内体溶解剂为非病毒，可被选择性修饰的天然或合成肽。
75、用作权利要求32所述组合物组分的核内体溶解肽，其特征在于，该肽具有核内体溶解区和核酸连结区。
76、权利要求75的核内体溶解肽，其特征在于，核酸连结区为低聚赖氨酸尾。
77、制备权利要求48所述结合体的方法，其特征在于，在转谷氨酰胺酶的存在下，将病毒或（多）肽核内体溶解剂以及聚胺酶促偶合。
78、制备权利要求48所述结合体的方法，其特征在于，将病毒或（多）肽核内体溶解剂以及聚胺化学偶合。
79、制备权利要求49所述结合体的方法，该方法包括：
（a）用生物素将病毒或病毒组分修饰性，和
（b）将从步骤（a）得到的修饰性的病毒或病毒组分与抗生蛋白链菌素偶合的聚胺连结。
80、将核酸引入高级真核细胞的方法，其特征在于，将细胞与权利要求1-36中任一项所述的组合物相接触。
81、根据权利要求80的方法，其特征在于，细胞为人类细胞。
82、根据权利要求81的方法，其特征在于，细胞为人类肿瘤细胞。
83、根据权利要求81的方法，其特征在于，细胞为人类成肌细胞。
84、根据权利要求81的方法，其特征在于，细胞为人类成纤维细胞。
85、根据权利要求81的方法，其特征在于，细胞为人类肝细胞。
86、根据权利要求81的方法，其特征在于，细胞为人类内皮细胞。
87、根据权利要求81的方法，其特征在于，细胞为人类肺上皮细胞。
88、根据权利要求81的方法，其特征在于，组合物中的核酸在基因治疗中具有DNA活性。
89、根据权利要求82和88的方法，其特征在于，肿瘤细胞在体内与组合物相接触，其特征还在于，所述DNA编码一种或多种免疫调节物质，优选Cytokines。
90、产生对高级真核细胞有重要作用的蛋白质的方法，其特征在于，用权利要求1所述组合物处理该细胞，合DNA序列的核酸编码所需的蛋白质，在适于蛋白质表达的条件下培养细胞，收集蛋白质。
91、一种药物制剂，该制剂含权利要求1-36中任一项所述的组合物，其中核酸具有治疗活性，该制剂还含有药物学上可接受的载体。
92、一种转染剂，其特征在于该转染剂分别含权利要求1所述组合物中的核酸复合物组分和/或所述组合物的核内体溶解剂或所述核内体溶解剂组分，各组分相互分离或部分分离。
93、权利要求92的转染剂，其特征在于，该转染剂含转谷氨酰胺酶偶合的腺病毒-多聚赖氨酸结合体作为单独组分。
94、权利要求92的转染剂，其特征在于，该转染剂含与核酸具有亲和性的生物素-修饰性的核内体溶解剂和抗生蛋白链菌素-修饰性物质作为单独组分，在应用前立即生成结合体。
95、权利要求92的转染剂，其特征在于，该转染剂含生物素化腺病毒和抗生蛋白链菌素-多聚赖氨酸。
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