CN1100266C - 虫荧光素酶标记方法和标记的产物 - Google Patents

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Abstract

提供了一种将虫荧光素酶与一种化学本体结合的方法，具体地是与一类特异的结合剂如抗体，抗原或核酸，以及更具体地说是一种抗体结合的方法，它包括(a)将虫荧光素酶与一种或多种D-虫荧光素，镁离子和腺苷三磷酸混合以及(b)用共价偶联剂在虫荧光素酶和结合剂之间进行共价偶联反应，其中D-虫荧光素，镁离子和/或腺苷三磷酸的量足以保护虫荧光素酶的活性免受共价偶联剂的抑制。优选步骤(a)的操作是将虫荧光素酶与其底物在溶液中混合并优选镁和腺苷三磷酸二者以腺苷三磷酸镁的形式存在(Mg2+ATP)，可选择地与D-虫荧光素一起使用。本发明第二个方面由本发明的方法提供了一种包含与活性虫荧光素酶结合的化学本体的标记的化学本体。优选化学本体是一种适于特异的结合测试应用的结合剂，优选是抗体，抗原或核酸。当结合剂是核酸时，优选寡核苷酸，但可以是多核苷酸或单个核苷酸，并且可被用做杂交探针或链延伸引物，例如PCR引物。最好本体是一种以前曾试图用于与虫荧光素酶偶联，但结果却是无活性的抗体。另外还提供了检测试剂盒。

Description

虫荧光素酶标记方法和标记的产物
本发明涉及一种标记化学物质，特别是生物物质的方法，该标记的目的是为了化学，和特别是生物测试，以及更具体地说是特定的结合测试，例如免疫测试以及杂交探针技术和在特定的扩增产物中将标记掺入，如在测试中应用PCR形式时。
虫荧光素酶介导的虫荧光素的断裂(Eqn 1)有高的产率和稳定的光输出，使之可以应用相对简单的设备检测很低浓度的酶(参见McCapra，在Turner等(编辑)生物传感器：基础和应用，Oxford University Press，(1988)：617-37中生物发光和化学发光的潜在应用)。已发展了许多应用虫荧光素酶作为间接标记的方法(参见Wanilund和DeLuca，在Deluca和McElroy(编辑)生物发光免疫测试：用于测定甲氧盐和DNP的虫荧光素酶抗原凝集，生物发光和化学发光：基础化学和分析应用。伦敦：Academic Press(1981)：693-696新的酶免疫分析的超敏感检测系统，临床化学和临床生物化学杂志(Clin.Chem.Clin.Biochem.J)(1987)25，31-28和Murakami等，在Szalay等(编辑)生物发光和化学发光：现状报告，Chichester：John Wiley and Sons，(1993)296-300中‘应用腺苷酸激酶和荧火虫虫荧光素酶的生物发光检测系统的发展’。
本发明人注意到应用虫荧光素酶作为直接标记在保持敏感性的同时可大大简化测试设计，但就需要可将其与测试结合试剂偶联而又不导致已知为非常不稳定的酶促活性灭活的方法。常规的共价偶联试剂如戊二醛，SMCC和SMPB快速且不可逆的抑制虫荧光素酶的活性。
虫荧光素酶，例如来自 Photinus Pyralis的，含有7,725-737四个半胱氨酸残基(参见Wet等(1987)分子和细胞生物学)，其中两个残基靠近活性位点或者是活性位点的一部分(参见Deluca和McElroy(1978)酶学方法，57，3-15)。本发明人确定共价偶联试剂与这些残基的结合引起了所看到的对酶的灭活并提供了一种可保护酶不被非可逆的灭活的将虫荧光素酶与测试试剂偶联的方法。
因此本发明的第一个方面即提供了一种将虫荧光素酶与化学本体，特别是一种特异的结合试剂例如抗体，抗原或核酸，更特别是一种抗体结合的方法，它包括(a)将虫荧光酶与一种或多种D-虫荧光素，镁离子和腺苷三磷酸混合和(b)用共价偶联试剂进行虫荧光素酶和结合试剂之间的共价偶联反应，其中D-虫荧光素，镁离子和/或腺苷三磷酸的量足以保护虫荧光素酶的活性免受共价偶联试剂的抑制。优选步骤(a)操作是将虫荧光素酶与其溶液形式的底物混合并且优选镁和腺苷三磷酸二者以腺苷三磷酸镁(Mg2+ATP)的形式存在，可选择地与D-虫荧光素在一起。优选只存在Mg2+ATP或D-虫荧光素之一。如果Mg2+ATP和虫荧光素三者都存在，那么优选要在反应混合物中除去氧。
在本发明的第二个方面提供了一种标记的化学本体，它包含通过本发明的方法所提供的与活性虫荧光素酶结合了的化学本体。优选化学本体是一种适于用于特定的结合测试的特异的结合试剂，优选是一种抗体，抗原或核酸。当结合试剂是核酸时优选寡核苷酸，但可以是多核苷酸或单个核苷酸，并且可被用做杂交探针或链延伸引物，例如PCR引物。最好本体是一种以前试图将抗体与虫荧光素酶偶联而结果却是几乎全部失活的抗体。
提供虫荧光素酶标记的化学本体，和特别是虫荧光素酶标记的抗体的一个具体地优点是使光导向装置相关的捕获测试成为可能。在一个优选的这类测试中，靶抗原的捕获抗体被固定到一个光导向装置上，例如一个可将照在其上的光线输入到光测量装置如光电倍增管上的光导纤维；被测抗原以液体样品形式用于光导向装置并且第二种以虫荧光素酶标记为特征的抗体在溶液中与光导向装置接触，在那里它与已被捕获并已与捕获抗体结合的抗原结合。
为了确定捕获的抗原的存在和/或其量，只需要将溶液中的D-虫荧光素和Mg2+ATP与结合有抗原-抗体复合物的光导向装置的表面相接触，并测量发射并转移到光测量装置如光电倍增管中的光的量即可。用这种方式即可进行有更高敏感性的光度(luminometric)测试，通过应用几种能分别捕获不同的抗原的光导向装置并将其放在一个样品室中以使可在同一步中加入几种不同的虫荧光素酶标记的抗体而同时进行几种不同的免疫测试而提供多种特异性。
另外电荷耦合器件(CCD)或等同物如二极管陈列成光电倍增管可被用于同时在一维或二维探测器陈列表面监测几个离散区，各自固定有对不同抗原特异的抗体，从而可通过光线发射的位置检测特定抗原的存在。同样地，将那些光导或电荷耦合器件用在已固定抗原或对靶抗体专一的抗免疫球蛋白抗体上，可对特异性抗体进行竞争性结合测试，其中当同时以样品形式加入竞争性抗体时，与光导向装置上的抗原结合的虫荧光素酶标记的抗体的量将会减少。
对样品和虫荧光素酶抗体的添取以及光导向装置与D-虫荧光素和Mg2+ATP底物溶液的接触来说，在光电倍增管上检测的光的量可能是与样品中与固定化的抗原或抗免疫球蛋白抗体特异的抗体的量相关的。
应该可以理解如果在光导向装置的表面结合了寡核酸探针(参见申请人在PCT/GB92/01698中的方法)并应用了虫荧光素酶标记的寡核苷酸，那么即可以如上所述抗体-抗原测试类似的方法对寡核苷酸和多核苷酸进行测试。而且，应用不同的光导向装置或陈列区域(arrayarea)，可从单一的样品中同时检测抗原和核酸。
在光导向装置例如平面型波导管或光导纤维(这些它倍加)的表面上进行虫荧光素酶标记的结合测试的一个特别优点是对从所感兴趣的样品即结合的样品中分离试剂的需要被减小，这是当在光导向装置表面上产生的光在几百个纳米之内时优选被探测器检测的到，但在大量的溶液中却不能。因此应用这类形式(format)的测试(通常称为消散(evanescence))不需要漂洗步骤或连续的试剂添加，并且因此可以操作迅速还可选择一种应用流动元件的液体流动形式。
本发明的标记试剂，制造它们的方法以及其使用方法，将参照下文的非限制性实施例和附图以说明的形式予以例解。
附图
图1示如实施例1所描述的各种不同量的Mg2+ATP保护下将虫荧光素酶种与共价偶联试剂温育后发光对时间的作图。
图2示如实施例1所述进行的测试中，发光对蓖麻毒蛋白量的作图。上面的图是应用1/100稀释度的IgG-虫荧光素酶组合物获得的而下面的图应用了1/1000稀释度。
方程式1：荧火虫荧光素酶反应
    
其中LH2是虫荧光素，E是虫荧光素酶，AMP是腺苷单磷酸，PP1是无机焦磷酸，而L是氧化虫荧光素。实施例1
Multilite光度计和3.5ml的聚苯乙烯管(Biotrace Bridgend UK)被用于所有的光测定中。荧火虫虫荧光素酶(L-5256)，DTT，BSA(级分V)，ATP和蓖麻毒蛋白购自Sigma(Poole，UK)；D-虫荧光素购自Fluka(Gillingham，UK)以及磺琥珀酰胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)购自Pierce和Warriner(Chester，UK)。绵羊抗蓖麻毒蛋白抗体用常规技术制得并且其它试剂为分析纯。
虫荧光素酶底物是含0.4mmol/L D-虫荧光素，40mmol/L硫酸镁，2mmol/L ATP，2mmol/L EDTA，2mmol/L DTT，0.2％BSA和2μmol/L焦磷酸钠的10mmol/L的HEPES缓冲液，pH7.75。从贮液中当天新鲜配制底物。向3.5ml聚苯乙烯管中的200μl底物(如上所述)中加入2μl待测样品并在5秒钟之后测定发光，综合10秒钟的时间段而对虫荧光素酶活性进行测定。
底物保护方法：将4.2mmol/L虫荧光素酶与630mmol/L Sulfo-SMCC在10mmol/L，pH7.75 HEPES缓冲液混合，并将混合物在室温温育30分钟。在一定的时间点上从反应混合物中取出样品并在缓冲液中稀释100倍并测定样品的虫荧光素酶活性。向混合物中加入各种浓度的Mg2+ATP或D-虫荧光素并监测其对活性的影响以确定对抑制最有效的保护。
Sulfo-SMCC的共价偶联：将绵羊抗蓖麻毒蛋白IgG与2-巯基乙胺氢氯酸盐在37℃反应90分钟以还原释放硫羟基团(参见PierceWarriner试剂盒说明书)。在1ml含0.5mmol/L ATP和2.5mmol/L硫酸镁pH7.0的磷酸盐缓冲液中配制4mg虫荧光素酶。加入50μl20mnol/L Sulfo-SMCC磷酸盐缓冲液，pH6.0并将混合物在室温保温30分钟。用Pierce GF-5脱盐柱纯化活化的虫荧光素酶，并将pH7.0的磷酸盐缓冲液中将活化的虫荧光素酶和还原的IgG以1∶1的摩尔比结合，其中磷酸盐缓冲液包含0.25mmol/L EDTA，0.5mmol/L ATP和2.5mmol/L硫酸镁。将反应在室温进行30分钟并且然后在于Pierce.GF-5脱盐柱上纯化虫荧光素酶-抗体结合物之前加入10μl 1mol/L的半胱氨酸终止反应20分钟。在使用前将产物贮藏在4℃pH7.0含0.25mmol/LEDTA的磷酸钠缓冲液。
用如下的ELISA测试对结合的虫荧光素酶中保留的活性进行评价：
以试管为基础的生物发光ELISA：将聚乙烯管用100μl蓖麻毒蛋白的含0.2％乙基汞硫代水杨酸钠的磷酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6在4℃包被过夜。将虫荧光素酶-抗体结合物在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中稀释并在用200μl 1％BSA封闭试管之后，加入100μl标记抗体并在37℃温育1小时。将试管在含5％Tween 20的PBS中漂洗5次。向每克管中加入200μl底物并立即测定发光。结果：如图1所示为Mg2+ATP保护底物的结果，其中以光度计的读数值所示的保留活性的百分比是对时间作图的，它来自含0.63μmol/LSulfo-SMCC，4.2μmol/L虫荧光素酶和Mg2+ATP的反应混合物对样品的消耗(removal)(每个点三个重复)。作图示不含Mg2+或ATP；0.03mmol/L ATP和0.2mmol Mg2+，0.125mmol/L ATP和2.0mmol/LMg2+，0.25mmol/L ATP和2.5mmol/L Mg2+的反应。还评价了D-虫荧光素的保护作用(未出示)并且发现可保留一定的活性但明显比Mg2+ATP的作用低。测试的D-虫荧光素酶的浓度的最大值是1mmol/L并且当与Sulfo-SMCC接触30分钟可保持虫荧光素酶的活性与用Mg2+ATP的大于40％相比，它可保留11％的活性。
图2示以试管为基础的生物发光ELISA结果。使用聚苯乙烯管是为了可以直接在Multilite光度计上进行光测量，但是同样可使用微滴定板和平板光度计。结果表明活性虫荧光素酶结合物被制得并且抗体保留了其结合特征。实施例2
将抗蓖麻毒蛋白的绵羊多克隆抗体与跟光电倍增管相连的光导纤维共价偶联；带有偶联抗体的纤维的部分(段)位于一个小室中，如果需要该小室可以被各种溶液填满或也可倒空。测试按如下的循环进行：
(i)将含D-虫荧光素的底物溶液加入到小室中以使任何存在的虫荧光素酶引起光的发射；
(ii)用含蓖麻毒蛋白的测试样品替代底物溶液；
(iii)用含虫荧光素酶标记的绵羊抗蓖麻毒蛋白IgG的溶液替代测试样品溶液；
(iv)用含D-虫荧光素的底物溶液取代绵羊抗蓖麻毒蛋白溶液；
(v)用再生缓冲液取代底物溶液。
用这种形式就可能确定测试样品中的蓖麻毒蛋白的量，联系步骤(iv)中光电倍增管中相对原始信号的信号的增加并联系蓖麻毒蛋白的量，例如应用获得的已知量的蓖麻毒蛋白的信号的增加的标准曲线。
本申请所描述的结合虫荧光素酶的方法和标记的化学本体也适于对于英国申请GB 9405750.2的PCT/GB95/00629申请中描述的虫荧光素酶。同样地该方法也可适于GB 9501170.6，GB 9501172.2中所描述的虫荧光素酶并可用于GB 9414096.9中所描述的捕获测试。

Claims (19)

1.一种将虫荧光素酶与抗体或核酸结合的方法，它包括(a)将虫荧光素酶与一种或多种D-虫荧光素，镁离子和腺苷三磷酸混合和(b)用共价偶联试剂进行虫荧光素酶和抗体或核酸之间的共价偶联反应；前提是D-虫荧光素，镁离子和腺苷三磷酸都存在时，必须将反应中的氧去除。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)的操作是在溶液中将虫荧光素酶与D-虫荧光素，镁离子和/或腺苷三磷酸混合。
3.权利要求1的方法，其中镁离子和腺苷三磷酸二者是以腺苷三磷酸镁的形式存在。
4.权利要求1的方法，其中步骤(a)操作中为4μmol/L虫荧光素酶应用了0.2mmol/L或更多的腺苷三磷酸。
5.权利要求4的方法，其中步骤(a)的操作需要2mmol/L镁离子的存在。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中共价偶联剂包括戊二醛，琥珀酰胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯和/或琥珀酰胺基-4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯。
7.权利要求1-5任一项的方法，其中步骤(b)的操作是在虫荧光素酶已与D-虫荧光素，镁离子和/或腺苷三磷酸混合后用共价偶联试剂进行的。
8.权利要求7的方法，其中应用了0.5mmol/L腺苷三磷酸。
9.一种与活性虫荧光素酶结合的标记抗体或核酸，它由权利要求1-8任一项的方法提供。
10.一种特异的结合测试法，其特征在于它包括对权利要求9的标记抗体或核酸的应用。
11.权利要求10的特异结合测试法，其中靶化学本体的存在和/或量是通过将其特异地与权利要求9的标记抗体或核酸结合，在一定的条件下将结合的本体与D-虫荧光素接触而确定的，其中的条件是虫荧光素酶可裂解D-虫荧光素并引起发光，并且发射的光的量与靶化学本体的存在相关。
12.权利要求11的特异结合测试法，其中靶化学本体是一种抗原并且在同与权利要求9的活性虫荧光素酶结合的标记抗体结合之前被一种对其特定的捕获抗体捕获。
13.权利要求12的特定的结合测定，其中捕获抗体与可将光传向光测量装置的光导向装置结合。
14.权利要求13的特异结合测试法，其中光导向装置是光导纤维。
15.权利要求13或14的特异结合测试法，其中一个光探测装置被用于同时监测一维或二维探测器陈列表面几个不同的区域，每个区域具有固定化的分别对不同的抗原或抗体特异的抗体或抗原；从而可通过对所探测光发射的位置的检测而检测特定的抗原的存在。
16.权利要求15的特异结合测试法，其中的光探测器装置是电荷耦联器件。
17.权利要求9的与活性虫荧光素酶结合的标记抗体或核酸，其特征在于结合的虫荧光素酶具有用于制备标记抗体的虫荧光素酶活性的10％或更多的活性。
18.权利要求1的方法，该方法包括(a)将虫荧光素酶与D-虫荧光素或镁离子和腺苷三磷酸的结合物相混合，以使镁离子和腺苷三磷酸的浓度分别大于0.2mmol/L和0.05mmol/L和(b)用共价偶联试剂在虫荧光素酶和抗体或核酸之间进行共价偶联反应。
19.权利要求1的方法，该方法包括(a)在氧不存在的情况下，将虫荧光素酶与D-虫荧光素，镁离子和腺苷三磷酸混合，以使镁离子和腺苷三磷酸的浓度分别大于0.2mmol/L和0.05mmol/L和(b)用共价偶联试剂进行虫荧光素酶和抗体或核酸之间的共价偶联反应。
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