CN111434686A - 一种抗人pbx1单克隆抗体,其制备方法及其在复发性流产临床诊断中的用途 - Google Patents
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Abstract
一种单克隆抗体、其制备方法及其在复发性流产临床诊断中的用途。具体地,本发明涉及单克隆抗体,其由杂交瘤细胞株2D11分泌,可用在复发性流产疾病诊断中,特异性好,敏感性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及单克隆抗体、表达该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体在疾病诊断中的用途。
背景技术
我国约有近4500万不孕不育症患者,且每年以数十万的速度递增。解决不孕不育问题,对家庭幸福、社会和谐稳定有十分重要的意义。复发性流产已成为困扰育龄女性的一种常见的妊娠疾病,严重影响生殖健康;其中约50%患者临床难以诊断病因(乔杰(2018)中国实用妇科与产科杂志,12期1309-131页),临床表现为不明原因复发性流产,目前研究表明其主要与蜕膜NK细胞免疫功能异常相关(Fu B,Zhou Y等人(2017)Immunity.;47(6):1100-1113.e6.和Fu B,Li X等人(2013)Proc Natl Acad Sci U S A.;110(3):E231-40)。NK细胞作为母胎界面主体免疫细胞,承担着重要的生理功能,例如参与诱导免疫耐受、促进滋养层细胞侵袭、参与螺旋动脉改建过程、促进胎盘和胎儿发育等(Vento-Tormo R,Efremova M,等人(2018)Nature.;563(7731):347-353)。转录因子PBX1参与蜕膜NK细胞数量的维持,调控蜕膜NK细胞正常功能的执行。
转录因子PBX1,又称:CAKUHED,PRL。由前B细胞白血病同源盒基因(pre-B-cellleukemia homeobox 1,PBX1)编码,是同源盒基因家族的重要成员之一。转录因子PBX1由美国学者Kamps MP等人在前B细胞白血病患者中鉴定(Kamps MP等人(1990)Cell.;60(4):547-55),后研究认为其在胚胎发育、器官发生和细胞分化均发挥重要作用;与多种恶性肿瘤相关。人类PBX1的基因定位于1q23,由9个外显子和8个内含子组成。其编码蛋白相对分子量为47kD,由430个氨基酸构成,同时存在两种主要的同源异构体PBX1a(430aa,47kD)和PBX1b(347aa,38kD),其中PBX1b中第1至333个氨基酸与PBX1a完全一致,两种同源异构体结构类似,均包含C端的同源结构域,起到稳定PBX1和HOX及DNA形成的三元复合物结构的作用,N端包含两个PBC结构域,为蛋白间相互作用区域。
发明概述
本发明涉及单克隆抗体、其制备方法及其在复发性流产临床诊断中的用途。具体地,本发明的单克隆抗体由保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO.C201912的杂交瘤细胞株2D11分泌,其可应用于检测人早孕蜕膜组织NK细胞中PBX1的表达,作为蜕膜NK细胞异常相关复发性流产(不明原因复发性流产)疾病的有限临床诊断指标之一。因此,本发明的单克隆抗体对复发性流产等妊娠相关疾病的诊断及指导进一步针对性精准治疗具有重大的临床意义。
在一个方面,本发明提供单克隆抗体或其抗原结合片段,其包含:
氨基酸序列为SEQ ID No:6的重链可变区CDR-H1,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:5;
氨基酸序列为SEQ ID No:8的重链可变区CDR-H2,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:7;
氨基酸序列为SEQ ID No:10的重链可变区CDR-H3,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:9;
氨基酸序列为SEQ ID No:12的轻链可变区CDR-L1,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:11;
氨基酸序列为SEQ ID No:14的轻链可变区CDR-L2,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:13;以及
氨基酸序列为SEQ ID No:16的轻链可变区CDR-L3,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:15;
其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或dAb。
在一个方面,本发明提供如上所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其由保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.C201912的杂交瘤细胞株分泌。
在一个方面,本发明提供缀合物,其包含如上所述任一种单克隆抗体或其抗原结合片段和与其结合的允许其检测的标记,其中所述标记选自荧光团、生物素、放射性同位素、金属和酶中的一种或更多种。
在一个方面,本发明提供产生如上所述任一种单克隆抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞株。
在一个方面,本发明提供如上所述任一种单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任一种缀合物的制备方法。
在一个方面,本发明提供如上所述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任一种缀合物在检测PBX1a和/或PBX1b的蛋白表达中的用途。
在一个方面,本发明提供免疫检测试剂盒,其含有如上所述任一种单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任一种缀合物。
在一个方面,本发明提供如上所述任一种单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任一种缀合物在制备用于辅助诊断不明原因复发性流产的诊断剂中的用途。
在一个方面,本发明提供用于辅助诊断不明原因复发性流产的试剂盒,其中含有根如上所述任一种单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任一种缀合物。
附图简要说明
图1.原核重组表达载体pET21a-PBX1b及真核重组表达载体pPBX1b的构建流程图。图1A显示基于pET21a质粒构建原核重组表达载体pET21a-PBX1b的流程图;图1B显示基于pEGFP-N1质粒构建真核重组表达载体pPBX1b的流程图。
图2.人转录因子PBX1b重组蛋白表达、纯化和测定。图2A显示PBX1b重组蛋白诱导表达结果;图2B显示PBX1b重组蛋白的镍琼脂糖亲和层析前后结果;图2C显示纯化后PBX1b重组蛋白的免疫印迹鉴定结果。
图3.PBX1b重组蛋白免疫大鼠前后血清ELISA检测结果。
图4.2D11单克隆抗体纯度鉴定结果。
图5.2D11单克隆抗体特异性鉴定结果。图5A显示免疫印迹法鉴定2D11单克隆抗体特异性;图5B显示流式细胞术鉴定2D11单克隆抗体特异性。
图6.ALEXA FLUORTM488标记的2D11单克隆抗体应用于流式细胞术检测正常人早孕蜕膜组织NK细胞转录因子PBX1的表达。图6A显示2D11单克隆抗体可以分别结合蜕膜组织单个核细胞和外周血单个核细胞中PBX1a和PBX1b。图6B显示使用2D11单克隆抗体,应用流式细胞术检测人蜕膜组织NK(dNK)细胞和外周血NK(pNK)细胞中转录因子PBX1的表达情况;图6C显示PBX1+NK细胞分别在dNK和pNK细胞中比例的统计图。
图7.ALEXA FLUORTM488标记的2D11单克隆抗体应用于流式细胞术诊断不明原因复发性流产。图7A显示流式细胞术检测复发性流产患者(RSA)蜕膜组织NK细胞中转录因子PBX1的表达情况,以正常人dNK细胞为对照;图7B显示复发性流产患者和正常人PBX1+dNK细胞比例(上)和数量(下)的统计图。图7C显示荧光定量PCR检测复发性流产患者蜕膜组织中PBX1基因表达;图7D显示PBX1表达降低在不明原因复发性流产和胚胎染色体异常复发性流产中的受试者工作特征曲线;图7E显示PBX1表达降低在复发性流产中的受试者工作特征曲线。
材料保藏
以下材料已经保藏于:中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌区八一路299号)(CCTCC):
材料:大鼠抗人PBX1抗体杂交瘤细胞株2D11
保藏号:C201912
保藏日:2019年1月8日
发明详述
除非另有说明,本文所使用的所有技术和科学术语都具有如本领域普通技术人员所通常理解的含义。一般来说,本文所使用的术语是公知的并且常规使用于本领域。
本发明所使用的主要术语定义如下:
如本文中所使用的,术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指全长抗体的一个或多个片段,通常指所述全长抗体的抗原结合区或可变区。所述片段保持结合抗体所结合的相同抗原(例如,PBX1)的能力,与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合片段。在一些情况下,抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如,scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”是指均一的仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型地包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的普通多克隆抗体制剂相比,每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征,不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体优选通过单一的杂交瘤产生,所述杂交瘤产生自脾细胞与骨髓瘤细胞的融合。
可以修饰编码抗体的DNA以生成“嵌合或融合抗体多肽”,例如通过用人重链和轻链恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列(US 4816567;及Morrison等人(1984)Proc.NatlAcad.Sci.USA.;81:6851),或者通过融合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域,或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域以创建嵌合二价抗体,其包含对一种抗原具有特异性的抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中,将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言,人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的所有两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的,该区还是受到在某些类型的细胞上找到的Fc受体(FcR)所识别的部分(Jones等人(1986)Nature.;321:522-525;Riechmann等人(1988)Nature.;332:323-329;Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.;2:593-596;Verhoeyen,等人(1988)Science,;239:1534-1536)。其它方法使用自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区(Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.;89:4285;Presta等人(1993)J.Immunol.;151:2623)。
如本文中所使用的,术语“序列同一性”是指在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后,氨基酸序列变体中同样的残基的百分比。比对的方法和计算机程序是本领域公知的。
如本文中所使用的,术语“特异结合”或“特异性结合”特定分子靶或感兴趣抗原或特定分子靶或感兴趣抗原上的表位对其“特异性的”意味着可测量的不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来测量,所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如,特异性结合可通过与对照分子的竞争来测定,所述对照分子与靶物相似,例如过量的未标记靶物。在这种情况中,若经标记靶物与探针的结合受到过量未标记靶物的竞争性抑制,则指示特异性结合。通常,抗体以小于大约10-6M,例如小于大约10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合抗原表位。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,在用于本文时,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢的地结合抗原且趋于容易解离,而高亲和力抗体通常更快速的地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法,其中任一种都可用于本发明的目的。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体的特异性”是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或者抗原决定簇并与之结合的性质。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体的反应性”是指在合适的反应条件下,单克隆抗体与抗原结合的能力。
如本文中所使用的,术语“杂交瘤”,其不仅包括杂交瘤亲本细胞还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的,术语“细胞株”是指通过筛选或者有限稀释方法,从原代培养物或细胞系中获得的单细胞培养物。
如本文中所使用的,术语“试剂盒”可以包括多种适于使用的存在形式,例如可以为盒装、瓶装、袋装等。
如本文中所用的,术语“PBX1”在本文中指PBX1a和PBX1b。
在一方面,本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合片段,其包含:
氨基酸序列为SEQ ID No:6的重链可变区CDR-H1,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:5;
氨基酸序列为SEQ ID No:8的重链可变区CDR-H2,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:7;
氨基酸序列为SEQ ID No:10的重链可变区CDR-H3,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:9;
氨基酸序列为SEQ ID No:12的轻链可变区CDR-L1,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:11;
氨基酸序列为SEQ ID No:14的轻链可变区CDR-L2,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:13;以及
氨基酸序列为SEQ ID No:16的轻链可变区CDR-L3,优选地,其编码序列为SEQ IDNo:15;
其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或dAb。
在一方面,本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合片段,其包含:
氨基酸序列为SEQ ID No:18的重链可变区,优选地,其编码序列为SEQ ID No:17;以及
氨基酸序列为SEQ ID No:20的轻链可变区,优选地,其编码序列为SEQ ID No:19;
其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或dAb。
在一个实施方案中,如上所述任一种单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合至PBX1a和/或PBX1b蛋白。在一个实施方案中,如上所述任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段的Ig的亚类为IgG2a,κ。在一个实施方案中,如上所述任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段为人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双抗体。
在一个实施方案中,如上所述任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段由保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.C201912的杂交瘤细胞株2D11分泌。
在另一方面,本发明提供缀合物,其包含如上所述任一种单克隆抗体或其抗原结合片段和与其结合的允许其检测的标记,其中所述标记选自荧光团、生物素、放射性同位素、金属和酶中的一种或更多种。
在一方面,本发明提供了杂交瘤细胞株,其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.C201912。在一个实施方案中,所述杂交瘤细胞株产生抗人转录因子PBX1蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中,所述杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗人转录因子PBX1蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一方面,本发明提供了如上所述任意一种单克隆抗体或其抗原结合片或如上所述任意一种缀合物在检测PBX1a和/或PBX1b的蛋白表达中的用途。在一个实施方案中,所述检测的样品为血浆样品。在一个实施方案中,所述检测的样品为人源的。在一个实施方案中,所述检测的样品为复发性流产患者早孕蜕膜组织NK细胞,优选为不明原因复发性流产患者。在一个实施方案中,所述检测的方法为将如上所述任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任意一种缀合物作为一抗。在一个实施方案中,所述检测的方法为用免疫印迹法检测人细胞转录因子PBX1。在一个实施方案中,所述缀合物中的荧光团为标记荧光素ALEXAFLUORTM488。在一个实施方案中,所述检测的方法为用流式细胞术检测人细胞转录因子PBX1。
在另一方面,本发明提供了一种免疫检测试剂盒,其含有如上所述任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任意一种缀合物。
在另一方面,本发明提供了如上所述任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任意一种缀合物在制备用于辅助诊断不明原因复发性流产疾病的诊断剂中的用途,在一个实施方案中,所述用于辅助诊断的样品为不明原因复发性流产患者早孕蜕膜组织NK细胞。在一个实施方案中,所述缀合物中的荧光团为标记荧光素ALEXA FLUORTM488。在一个实施方案中,所述诊断的方法为用流式细胞术检测不明原因复发性流产患者早孕蜕膜组织NK细胞的转录因子PBX1,进而诊断其发病原因是否为转录因子PBX1低表达,NK细胞异常。
在另一方面,本发明提供用于辅助诊断不明原因复发性流产的试剂盒,其中含有如上所述任意一种单克隆抗体或其抗原结合片段或如上所述任意一种缀合物。
实施例
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。
实施例中的实验方法,如无特别说明,均采用本领域常规技术,实验试剂均为市售产品。
实施例一:原核重组表达载体pET21a-PBX1b及真核重组表达载体pPBX1b的构建
委托通用生物系统(安徽)有限公司人工合成人转录因子PBX1b全长基因(NCBIReference Sequence:NM_001204961.1,编码第1至347位氨基酸),其基因序列和所编码的蛋白序列分别为SEQ ID NO:1和2所示的序列,并在C端引入6His-Tag和终止密码子,并通过NdeI和XhoI酶切位点直接克隆到重组表达载体pET21a(上海生工生物公司),将所得重组表达载体转入DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定,测序结果表明重组表达载体pET21a-PBX1b构建成功。原核重组表达载体pET21a-PBX1b的构建流程如图1A所示。
人工合成人转录因子PBX1b全长基因,通过EcoRI和BamHI酶切位点直接克隆到重组表达载体pEGFP-N1(湖南科爱医疗器械有限公司(优宝生物),货号:VT1110),命名为pPBX1b,将所得重组表达载体转入DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定,测序结果表明重组表达载体pPBX1b构建成功。真核重组表达载体pPBX1b的构建流程如图1B所示。
实施例二:人转录因子PBX1b重组蛋白表达、纯化和测定
1.诱导表达重组蛋白
1.1转化
将实施例1所得到的重组表达载体pET21a-PBX1b转化到Transetta(DE3)感受态细胞中(北京全式金生物技术有限公司公司,货号CD801)中,42℃热击90秒后冰上静置2分钟后涂布在含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB固体平板上,37℃培养过夜。
1.2小试培养选择最佳的诱导条件
挑取PBX1b重组蛋白表达菌株Transetta(DE3)的单菌落于10mL LB培养基,(含50μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素)37℃,220转/分钟,振荡过夜培养。将过夜培养的菌液按1:100比例分别接种于10mL LB(含50μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素)培养基中,37℃,220转/分钟振荡培养。当OD600nm=0.6时,添加终浓度为0.5mM的IPTG,220转/分钟,振荡培养诱导表达,分别20℃诱导过夜,37℃诱导4小时,未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。离心收集菌体,菌体用超声破碎裂解,分别离心收集上清和沉淀,沉淀用500μL包涵体溶解液(8MUrea,50mM Tris-HCl,300mM NaCl,PH8.0)溶解,分别取40μL样品进行12%的SDS-PAGE电泳检测,上样量为10μL,凝胶电泳结束后,考马斯亮蓝染色20分钟,脱色后成像。如图2A所示,和其他对照条件相比,IPTG诱导菌裂解液上清在38kDa处有一明显的条带,且20℃诱导过夜条件优于37℃诱导4小时。
1.3大量诱导表达融合蛋白
根据1.2的小试结果最终确定:选择20℃诱导过夜条件,将上述1.2中小试所用的未诱导前的单克隆培养菌液按1:100比例接种于4L的LB抗性培养基中进行大量诱导表达。
2.纯化融合蛋白
离心收集上述1.3中大量诱导的菌液沉淀,冰浴中超声破碎裂解菌液沉淀,离心后收集裂解上清,采用镍琼脂糖亲和层析的方法进行纯化。取5mL Ni-IDA,用10倍柱床体积的平衡溶液(1M Tris,150mM NaCl,pH8.0)清洗平衡柱子,流速5mL/分钟。用上述实施例二步骤1.3中得到的裂解上清上柱,流速为2mL/分钟,收集穿透液,作为对照。使用10倍柱床体积的平衡溶液清洗柱子,流速5mL/分钟。再使用20/50mM咪唑洗脱液(1MTris,150mM NaCl,20/50mM Imidazole,pH 8.0)洗去杂蛋白,流速5mL/分钟,收集洗脱液,作为对照。最终使用500mM咪唑溶液(1M Tris,150mMNaCl,500mM Imidazole,pH8.0)洗脱目的蛋白,流速2mL/分钟,收集目的蛋白洗脱液。收集目的蛋白洗脱液样品进行12%SDS-PAGE检测,如图2B所示,相比对照组,500mM咪唑洗脱液中在38kDa处有一个明显的目的蛋白条带。根据鉴定结果,将500mM咪唑溶液洗脱的目的蛋白透析到透析液1(500mM L-Arginine,25mM Tris,150mMNaCl,PH7.4)中,4℃透析16h后,换为透析液2(250mM L-Arginine,25mM Tris,150mMNaCl,PH7.4)透析6h,浓缩离心,分装冻干,-80℃保存。
3.重组PBX1b蛋白的鉴定
采用非干扰型蛋白浓度测定试剂盒(上海生工生物公司,货号:C503071)测定实施例二步骤2中纯化所得的目的蛋白的浓度和纯度,最终获得蛋白纯度约为90%,浓度为0.5mg/mL。对该目的蛋白进行免疫印迹检测,即用兔抗His-tag抗体(CST公司,货号#2365)1:1000稀释作为一抗,辣根过氧化物酶(酶)标记的羊抗兔IgG(Boster公司,货号BA1054)1:5000稀释作为二抗,化学发光显色(Thermo scientific公司,货号34080)检测,如图2C显示,表明实施例二2中纯化所得的诱导表达的蛋白为重组PBX1b蛋白。
实施例三:单克隆抗体的制备
1.免疫大鼠、细胞融合及单克隆筛选
1.1大鼠免疫及脾细胞的制备
将实施例二中得到的纯化后终浓度为100μg/ml的人PBX1b重组蛋白与等体积完全福氏佐剂充分混合至油包水状,于5只8周龄雌性SD大鼠(分别标记为1#、2#、3#、4#、5#)背部皮下多点注射进行初次免疫,每只大鼠注射100μg PBX1b重组蛋白。然后每隔15天,50μg人PBX1b重组蛋白与不完全福氏佐剂混合后,皮下免疫注射一次,共重复免疫注射三次,共45天。再隔15天后,腹腔注射50μg人PBX1b重组蛋白与不完全福氏佐剂混合物。末次免疫后10天,经尾静脉取血,间接ELISA测定血清效价,如图3所示。挑选2只抗血清效价最高者在尾静脉取血后第15天进行50μg人PBX1b重组蛋白腹腔注射加强免疫。
ELISA检测抗体效价的方法:用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液,pH 9.6)稀释经实施例二所得的纯化蛋白,终浓度为10μg/ml,每孔100μl包被96孔酶标板,4℃过夜,用TBST(50mMTris-HCl,150mM NaCl,0.05%Tween20,pH 7.5)清洗3遍,1%BSA封闭,37℃孵育2小时。TBST清洗3遍,加入待测倍比稀释(1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000、1/64000、1/128000、1/256000、1/512000、1/1024000)的免疫大鼠血清(实验组),未免疫大鼠的尾静脉血清做阴性对照,100μl/孔,37℃孵育1小时。TBS清洗3遍,每孔加入100μl 1:10000稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的兔抗大鼠二抗(Boster公司,货号BA1012),37℃孵育1小时。TBST清洗3遍后加入含1mg/ml对硝基苯磷酸盐(PNPP,Thermoscientific公司,货号34045)的底物显色液,100μl/孔,避光显色10-15分钟,加入终止液(1M HCl)100μl/孔,终止后立即用酶标仪进行检测,读取波长405nm的吸光值(OD405)。
1.2细胞融合
加强免疫3天后,无菌取实施例三所获得的加强免疫大鼠脾细胞,使用常规PEG法与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC编号CRL-1581),融合。用不完全的RPMI-1640培养基洗涤制备好的108个脾细胞和2.5×107个骨髓瘤细胞SP2/0,离心后弃上清,轻轻弹散细胞,加入0.7ml 40℃的PEG(分子量1,000-6,000)溶液,PEG的终浓度为50%(W/V),60秒之后开始加入40℃预热的不完全RPMI-1640培养基(5分钟加完),首先加1ml,1分钟后加4ml,2分钟后加入20ml。4℃300g离心10分钟收集细胞,用37℃含有2×HAT(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)的不完全RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞,使细胞终浓度为2×106/ml。将重悬细胞每孔100μl加入96孔板中,继续培养。当细胞融合后第二天补加HAT不完全RPMI-1640培养基。细胞融合一周后用RPMI-1640完全培养基换液一次,补加含HAT的RPMI-1640完全培养基,HAT选择培养基维持培养两周后,改用HT培养基培养,两周后改为RPMI-1640完全培养基。当融合细胞(即杂交瘤细胞)布满孔底1/10面积时,检测特异性抗体的产生。以人PBX1b重组蛋白包被酶标板,用间接ELISA法筛选阳性克隆。
1.3单克隆筛选
将实施例三步骤1.2中筛选出的阳性杂交瘤当即采用有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行克隆化,以正常小鼠脾细胞制备饲养细胞。多次筛选后获得杂交瘤细胞株。连续体外培养杂交瘤细胞株2个月以上或者冻存6个月之后,细胞株仍能稳定和大量分泌抗人PBX1抗体,则将该抗体命名为2D11单克隆抗体,将该杂交瘤细胞株命名为2D11并保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.C201912。
2.2D11单克隆抗体的大量制备
采用裸鼠腹腔接种法制备2D11单克隆抗体。首先给予8周龄的裸鼠腹腔注射500μl无菌的液体石蜡,一周之后腹腔注射1×106杂交瘤细胞,7-10天左右收集腹水,高速离心收集上清。通过上述方法获得的抗体,用Protein A亲和层析方法纯化2D11抗体,SDS-PAGE鉴定抗体纯度,如图4所示,经纯化的2D11单克隆抗体纯度高于95%,抗体的重链都约为45kDa,轻链约为25kDa。
实施例四:2D11单克隆抗体的鉴定
1.间接ELISA测定2D11单克隆抗体效价约为10-9。
2.竞争ELISA测定2D11单克隆抗体的亲和常数为6.37×108L/M。
用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液,pH 9.6)稀释实施例三得到的纯化PBX1单克隆抗体,终浓度为2μg/ml,100μl每孔包被96孔酶标板,4℃过夜孵育。纯化PBX1b对比稀释为2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml 0.0625μg/ml、0.03125μg/ml、0μg/ml,各取50μl,以及50μl单克隆抗体杂交瘤细胞株2D11的培养上清4℃孵育过夜制备抗原竞争的2D11单克隆抗体混合液。将各浓度抗原与杂交瘤2D11上清的孵育液100μl加入每孔,37℃孵育1小时。PBST清洗3遍,每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗大鼠二抗(1:10000稀释,Abcam公司,货号:ab97057),37℃孵育1小时。PBST清洗3遍后加入TMB(eBioscience公司,货号00-4201-56)底物,100μl/孔,避光显色10-15分钟,加入终止液(1MHCl)100μl/孔,终止后立即用酶标仪进行OD450和OD630检测。抗体亲和常数计算公式为A0/(A0-A)=1+Kd/a0,其中A0为竞争抗原为0时的OD值,A为各抗原浓度的OD值,a0为抗原总量,Kd为解离常数。根据K=1/Kd求出K,K为亲和常数,单位L/M,计算出的亲和常数为6.37×108L/M。
3.2D11单克隆抗体的Ig亚类测定,其为IgG2a,κ
采用安泰吉(北京)生物技术有限公司提供的大鼠抗体亚型快速检测卡进行测定。
4.2D11单克隆抗体的特异性鉴定
鉴定2D11单克隆抗体的特异性采用免疫印迹和流式细胞术法。
人胚肾293T细胞(ATCC编号CRL-3216)表达转录因子PBX1,通过靶向PBX1b基因的siRNA(上海吉玛公司合成),序列分别为siRNA-1(SEQ ID NO:3)和siRNA-2(SEQ ID NO:4)建立PBX1b敲低(PBX1-K.D.)293T细胞系,通过转染1μg和5μg的pPBX1b过表达质粒至PBX1-K.D.293T细胞系中以恢复表达PBX1b。通过免疫印迹(图5A)检测293T细胞、PBX1b-K.D.293T细胞、恢复表达PBX1b的PBX1b-K.D.293T细胞中PBX1b的表达量,鉴定2D11单克隆抗体的特异性。提取以上分组等量细胞的核蛋白,取20μl进行4-20%SDS-PAGE电泳,接着通过湿转法将目的蛋白转至0.22μm PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1小时后,用5%脱脂牛奶稀释2D11单克隆抗体至2μg/ml,4℃孵育过夜,TBST洗去非特异结合的抗体后,室温孵育二抗(HRP标记的羊抗大鼠抗体,1:5000稀释)1小时,TBST洗涤3次。化学发光显色。如图5A所示,经免疫印迹鉴定,在293T细胞中相对分子质量38kDa处有特异性条带,PBX1b-K.D.293T细胞该条带明显减弱,恢复表达PBX1b的PBX1b-K.D.293T细胞中该条带明显恢复。
通过流式细胞术法(图5B)检测293T细胞、PBX1b-K.D.293T细胞、恢复表达PBX1b的PBX1b-K.D.293T细胞中PBX1b的表达量,鉴定2D11单克隆抗体在活细胞检测中的特异性。以上分组各106个细胞,使用eBioscience公司转录因子固定穿膜液试剂盒(货号00-5523-00),进行固定穿膜后,试剂盒洗液稀释2D11单克隆抗体至20μg/ml,4℃孵育30分钟,PBS洗去非特异结合的抗体后,4℃孵育1:500稀释的Alexa Fluor 647标记羊抗大鼠二抗(AF647)(BioLegend公司,货号405416)30分钟,PBS洗涤后使用BD公司LSR II流式细胞仪检测。
以上检测结果说明杂交瘤细胞株2D11所分泌的2D11单克隆抗体特异结合PBX1b,且2D11单克隆抗体可以用于免疫印迹检测和流式细胞术检测。
5.将纯化的2D11单克隆抗体测序
委托金唯智公司测序纯化的2D11单克隆抗体,在Sanger测序获得核酸序列的基础上,比对国际免疫遗传学数据库(IMGT),获得对应氨基酸序列。测序结果为:详见SEQ IDNO:5-20。
6.Alexa FluorTM488荧光素标记2D11单克隆抗体
使用Invitrogen公司Alexa FluorTM488抗体标记试剂盒(货号A10235)标记500μl浓度为2mg/ml 2D11单克隆抗体。标记后的洗脱液,通过测量280nm和494nm处的溶液(A280和A494)的吸光度计算抗体浓度M和标记效率C,M=[(A280-A494×0.11)]/203,000,C=A494×稀释倍数/71,000×M。通过计算,我们标记后的抗体浓度为M=1mg/ml,标记效率C=5.8,平均每个抗体上标记5.8个荧光素。
实施例五:2D11单克隆抗体的应用
1.应用于人蜕膜NK细胞转录因子PBX1的流式细胞术检测
取自愿终止妊娠,正常人早孕蜕膜组织,PBS中去除残余血块等,在培养基中剪碎组织,使用终浓度为5mg/ml的胶原酶IV(Sigma公司)消化组织至乳糜状,200目筛网过滤细胞悬液至50ml离心管,离心收集沉淀,通过人淋巴细胞分离血液(索莱宝公司,货号P8610)进行密度梯度离心,收集白膜层蜕膜组织单个核细胞。以正常人外周血单个核细胞为对照,进行免疫印迹检测,分别取5×106个蜕膜组织单个核细胞和外周血单个核细胞提取核蛋白,取20μl进行4-20%SDS-PAGE电泳,通过湿转法将目的蛋白转至0.22μm PVDF膜,免疫印迹实验操作与上述293T细胞检测方法一致。如图6A所示,经免疫印迹鉴定,蜕膜组织单个核细胞和外周血单个核细胞中相对分子质量47kDa(PBX1a)和38kDa(PBX1b)处有均有特异性条带,优势条带为38kDa,2D11单克隆抗体可以特异性结合PBX1a和PBX1b,即在本公开中,单克隆抗体可以特异性结合PBX1。
进一步通过流式细胞术检测单个核细胞中NK细胞PBX1表达。1×106个单个核细胞悬于100μl PBS中,标记鉴定人NK细胞的表面分子,包括CD3、CD45、CD56等4℃孵育30分钟,PBS洗去非特异结合的抗体后,使用eBioscience公司转录因子固定穿膜液试剂盒(货号00-5523-00),进行固定穿膜后,试剂盒洗液稀释实施例四中得到的Alexa FluorTM488标记的2D11单克隆抗体至20μg/ml,4℃孵育30分钟,PBS洗去非特异结合的抗体后,使用流式细胞仪检测。如图6B/C所示,CD3-CD45+CD56+人蜕膜组织NK细胞高表达转录因子PBX1,统计后的结果可以看出PBX1+蜕膜NK(dNK)细胞比例(96.7)显著高于外周血NK(pNK)细胞比例(1.96)。
2.应用于流式细胞术诊断不明原因复发性流产
以正常人蜕膜组织NK细胞为对照,取不明原因复发性流产患者早孕蜕膜组织,共12例,使用2D11单克隆抗体进行流式细胞术检测其转录因子PBX1表达情况。实验操作与正常人dNK细胞检测方法一致。结果如图7A/B所示,结合统计可以看出PBX1在不明原因复发性流产患者早孕蜕膜组织NK细胞中表达显著降低,表达PBX1的dNK细胞(PBX1+dNK细胞)比例和数量均在患者中显著减少。
以20例正常人蜕膜组织为对照,进一步通过荧光定量PCR检测50例复发性流产患者(其中包括27例不明原因复发性流产患者以及23例胚胎染色体异常复发性流产患者)的早孕蜕膜组织中转录因子PBX1基因表达量变化。具体步骤为,通过液氮研磨破碎组织,使用1ml Trizol(Invitrogen公司,货号:15596026)溶解研磨后的组织,200μl氯仿萃取其中总RNA,高速离心取上清,与等体积异丙醇混匀,冰上沉淀RNA 30分钟,高速离心取RNA沉淀使用75%乙醇溶液洗涤沉淀,最终溶于DEPC处理后的水中。使用M-MLV试剂盒(Invitrogen公司,货号:28025-013)将RNA反转录为cDNA,作为后续荧光定量PCR检测模板。使用染料法荧光定量试剂盒(TaKaRa公司,货号:RR820A)进行荧光定量PCR,以蜕膜组织cDNA为模板,SEQID NO:21和SEQ ID NO:22所示的序列分别为荧光定量PCR的正向和反向引物,配制20μl反应体系。以94℃预变性30秒;94℃变性15秒,60℃退火30秒,40个循环为反应条件,使用罗氏公司LightCycler96实时荧光定量PCR仪进行检测。使用2-ΔΔCt分析方法及非配对t检验统计方法处理数据,结果如图7C所示,结合统计可以看出PBX1基因在全部不明原因复发性流产患者(p<0.0001)和部分胚胎染色体异常复发性流产患者(p=0.0001)的早孕蜕膜组织中的表达均显著降低。通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristiccurve,简称ROC曲线)分别分析不明原因复发性流产患者蜕膜组织、胚胎染色体异常复发性流产患者及两部分复发性流产患者整体中PBX1基因相对表达量与疾病发生的相关性,结果如图7D-E所示,PBX1表达降低可以非常有效用于临床诊断不明原因复发性流产(在不明原因复发性流产组,AUC=0.941(95%置信区间=0.8601至1.021,p<0.0001),高于在胚胎染色体异常复发性流产组,AUC=0.762(95%置信区间=0.6167至0.9072,p=0.003361)),有效预测复发性流产疾病的发生(整体复发性流产,AUC=0.859(95%置信区间=0.7731至0.9439,p<0.0001))。综上,蜕膜组织PBX1表达降低可以有效用于诊断复发性流产,特别是不明原因复发性流产病例;而2D11单克隆抗体可以通过流式细胞术更进一步具体分析蜕膜组织中优势免疫细胞NK细胞转录因子PBX1表达量,为复发性流产患者,特别是多次妊娠失败的不明原因复发性流产患者提供精准诊断依据,为后续针对性治疗提供可能。
Claims (15)
1.单克隆抗体或其抗原结合片段,其包含:
氨基酸序列为SEQ ID No:6的重链可变区CDR-H1,优选地,其编码序列为SEQ ID No:5;
氨基酸序列为SEQ ID No:8的重链可变区CDR-H2,优选地,其编码序列为SEQ ID No:7;
氨基酸序列为SEQ ID No:10的重链可变区CDR-H3,优选地,其编码序列为SEQ ID No:9;
氨基酸序列为SEQ ID No:12的轻链可变区CDR-L1,优选地,其编码序列为SEQ ID No:11;
氨基酸序列为SEQ ID No:14的轻链可变区CDR-L2,优选地,其编码序列为SEQ ID No:13;以及
氨基酸序列为SEQ ID No:16的轻链可变区CDR-L3,优选地,其编码序列为SEQ ID No:15;
其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或dAb。
2.单克隆抗体或其抗原结合片段,其包含:
氨基酸序列为SEQ ID No:18的重链可变区,优选地,其编码序列为SEQ ID No:17;以及
氨基酸序列为SEQ ID No:20的轻链可变区,优选地,其编码序列为SEQ ID No:19;
其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或dAb。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其能够特异性结合至PBX1a和/或PBX1b蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其Ig亚类为IgG2a,κ。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其为人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双抗体。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其由保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.C201912的杂交瘤细胞株分泌。
7.缀合物,其包含根据权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和与其结合的允许其检测的标记,其中所述标记选自荧光团、生物素、放射性同位素、金属和酶中的一种或更多种。
8.杂交瘤细胞株,其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO.C201912。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或根据权利要求7所述的缀合物在检测PBX1a和/或PBX1b的蛋白表达中的用途。
10.免疫检测试剂盒,其含有根据权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或根据权利要求7所述的缀合物。
11.根据权利要求10所述的免疫检测试剂盒,其中所述检测的样品为血浆样品。
12.根据权利要求10或11所述的免疫检测试剂盒,其中所述检测的样品为人源的。
13.根据权利要求11-11中任一项所述的免疫检测试剂盒,其中所述检测的样品为复发性流产患者早孕蜕膜组织NK细胞,优选为不明原因复发性流产患者。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或根据权利要求7所述的缀合物在制备用于复发性流产的诊断剂中的用途,优选所述复发性流产为不明原因复发性流产或胚胎异常导致的复发性流产。
15.用于辅助诊断不明原因复发性流产的试剂盒,其中含有权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或根据权利要求7所述的缀合物。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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