CN1117763C

CN1117763C - 抗αV－整合素单克隆抗体

Info

Publication number: CN1117763C
Application number: CN95120901A
Authority: CN
Inventors: F·密特詹斯; J·琵友拉兹; E·罗塞尔; J·阿丹; S·古德曼; D·哈胡
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1995-12-19
Publication date: 2003-08-13
Anticipated expiration: 2015-12-19
Also published as: BR9505980B1; DE69531187T2; HU221061B1; KR960022562A; NO955167L; NO955167D0; ES2202336T3; BR9505980A; FI956112A; HU9503638D0; EP0719859A1; SI0719859T1; ZA9510806B; CZ290477B6; CA2165573C; HUT74828A; AU4042195A; FI118536B; DK0719859T3; DE69531187D1

Abstract

本发明涉及一种新的单克隆抗体，生产所述抗体的杂交瘤细胞系，编码所述抗体的DNA序列，和氨基酸序列。该单克隆抗体的一个优选的实施例命名为17E6，具有下列特征：仅与人αV整合素的αV链反应；抑制携带αV整合素的细胞附着到整合素底物上；触发αV整合素引起的已形成的细胞基质相互作用的逆转；抑制肿瘤发展；不显示出细胞毒性。

Description

抗αV-整合素单克隆抗体

本发明涉及一种新的单克隆抗体和产生所述抗体的杂交瘤细胞系。该单克隆抗体的一个优选实施例称为17E6，具有以下特征：

—仅与人αV-整合素的αV链发生反应；

—抑制携带αV-整合素的细胞附着到整合素底物上；

—触发由αV整合素引起的已形成的细胞基质相互作用的逆转；

—抑制肿瘤发展；和

—不表现出细胞毒性。

因此，本发明的目的是一种具有所述特征的单克隆抗体。

此外，本发明的目的是一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系以及一种单克隆抗体，该细胞系命名为272-17E6，并以保藏号DSM ACC2160进行了保藏，单克隆抗体具有上面给出的特征并能从所说的杂交瘤细胞系得到。

另外，本发明还涉及DNA序列和氨基酸序列。该DNA序列编码抗体或其部分。此序列在图17a、17b和所附的序列方案中给出。

最后，本发明的目的是含有上面限定的抗体的药用组合物。

整合素是细胞表面附着受体的一个超家族，它控制细胞与固态细胞外环境(细胞外基质(ECM)和其它细胞)的粘着。粘着对细胞来说是十分重要的，它提供锚着点、迁移路线，和生长及分化的信号。整合素与大量正常和病理状态直接相关，并作为治疗干预的原始靶。整合素是整合的跨膜蛋白质，它是一种杂合二聚体，其结合特异性取决于14种α链中的某种与8种β链中的某种相结合。整合素分为四个重叠的亚家族：分别包含β1，β2，β3或αV链，特定的细胞可能表达各亚家族中的几种不同整合素。最近十年已证实整合素是与细胞粘着相关的主要受体。例如，E.Ruoslahti(J.Clin.Invest.，1991.87)和R.O.Hynes(Cell，1992.69)提供了关于整合素的报道，因此，它可能是治疗干预的一种合适的靶。

除红细胞外，所有的人细胞表达一种或多种整合素。在许多水平上其功能受到调节，但首先，其配体特异性取决于杂合二聚体α链与β链的联结，并取决于整合素的活化状态(Hynes.1992；Di-amond and Springer，1994)。整合素发挥作用的细胞环境(Chanand Hemler，1993)和所用的整合素剪接变异体形式(Delwel etal.，1993)也可影响其特异性。由于存在这些复杂性，整合素特异性的一个可靠的指征是直接干扰整合素功能并分析其中受到影响的细胞反应。整合素研究的历史表明：能特异性抑制整合素功能的试剂在功能分析中是决定性因素，这些试剂从功能抑制的CSAT抗体(它首先定义了整合素β1链(Neff et al.，1982))到后来的大最重要的例子(例如P1D6，P1B5(Wayner and Carter，1987))P4C10(Carter et al.，1990)，AIIB2(Hall et al.，1990)，3A3(Turner et al.，1989).GOH3(Sonnenberg et al.，1987)，和LM609(Cheresh and Spiro，1987))：该领域完全依赖于这些试剂。

现在发现αV-系列整合素是一个主要的亚家族，具有经典的和新的功能。除了经典的介导细胞附着和扩散(Pytela et al.，1985，Cheresh，1991)外，αV整合素还涉及细胞运动(Seftor etal.，1992)，受体内在化(Panetti and Mckeown Longo，1993a；Panetti and Mckeown Longl，1993b)、作为病毒联合受体(Wickham et al.，1993)、细胞外蛋白酶级联的操纵(de Boer et al.，1993)和作为肿瘤进展的调节物(Felding-Habermann et al.，1992)。5种已知的αV系列整合素(αVβ1(Zhang et al.，1993)，-β3(Pytela et al.，1985；Cheresh et al.，1987)，-β5(Chereshet al.，1989)，-H6(Busk et al.，1992)和-β8(Moyle et al.，1991))的特异性已部分明确，它们似乎特异性地识别带有RGD-(NH₂-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-COOH)三肽序列的配体。包括Vitronectin(αVβ1，αVβ3，αVβ5)，纤维连接蛋白(αVβ1，αVβ3，αVβ5，αVβ6)，和Von Willebrand因子，纤维蛋白原和Os-teopontin(αVβ3)(例如：1991；Busket al.，1992；Zhang et al.，1993；Denhardt and Guo，1993；Smith and Cheresh，1993；).具有相关特异性的二聚体可在相同细胞上共同表达(例如，识别Vit-ronectin的αVβ3和αVβ5都在M21细胞上)(Wayner et al.，1991)，但可能控制独立的功能。然而，在αV家族本身内部和在αV-及β1系列整合素之间配体特异性的重叠意味着将某一功能归因于特定细胞环境中确定的受体是成问题的。功能抑制性抗体在澄清αVβ3(Cheresh and Sptro，1987；Chuntharapai et al，1993)和αVβ5(Wayner et al.，1991)的功能中是十分重要的。然而，对于其它的αV-整合素，还不知道具有特异性地识别复合体和干扰功能的抗体。尤其是很少能得到识别复合体的αV链并干扰全家族整合素功能的试剂。Lehmann et al.(1994)公开了一种αVβX抗体，它不表现出逆转细胞基质相互作用且没有抑制肿瘤发展的活性。

因此，在肿瘤发展中αV-系列整合素的功能具有永恒的兴趣。人恶性黑色素瘤是一种不断增加的流行侵袭性皮肤瘤。整合素α2β1(Danen et al.，1993；Etoh et al.，1992)、α3β1(Natali etal.，1993；Yoshinang et al.，1993)、α4β1(Hart et al.，1991)和α6β1(Hart et al.，1991)水平的外离分别与黑色素瘤的进展有关，但最密切相关的整合素是αV-系列的整合素。特别是原发性肿瘤和远距离转移瘤的侵袭在组织学上都可通过αVβ3整合素(亲玻粘连蛋白受体)表达的增加来鉴定。原发性非侵袭性肿瘤和非恶性黑色素痣很少表达可检测的αβ3，在健康成人组织中受体表达罕见(Brooks et al.，1994；Buck et al.，1990；Pignatelli et al.，1992；Lessey et al.，1992；Korhonen et al.，1991；Nesbitt et al.，1993)渐进性肿瘤和转移瘤的免疫组织化学表明随着侵袭阶段αVβ3逐渐升高((Albelda et al.，1990；Si and Herse.1994)。黑色素瘤细胞系的筛选同样揭示了αV-系列整合素的高水平表达(Sanders etal.，1992；Gehlsen et al.，1992；Marshall et al.，1991)，而且在肿瘤血管形成期间生长的毛细血管表达αVβ3(Brooks et al.，1994)。

体内研究也表明αVβ3与黑色素瘤发展有关。在鼠B16-F10黑色素瘤系统中，实验性肺转移可被高水平的RGD肽抑制(Hardan et al.，1993；Humphries et al.，1986).RGD肽是αV-整合素功能的有效抑制剂。最近，Felding-Habermann和同事们证实αV-系列整合素促进免疫缺陷型小鼠中M21人黑色素瘤的皮下肿瘤生长。M21系统是优选的、由一组表达不同αV-系列整合素的细胞组成(Kieffer et al.，1991；Felding-Habermann et al.，1992；Cheresh and Spiro.1987)亲本M21表达αVβ3和αVβ5(Wayner et al.，1991).它附着到亲玻粘连蛋白(Vutronectin)上并生长成皮下肿瘤。M21-L是M21的体细胞变异体。检测不到αV(Cheresh and Spiro，1987).它不能接合亲玻粘连蛋白(Vit-roncctin)且发展成慢速生长的肿瘤。M21-L4是M21-L的转染子。重新稳定地表达全长αV-链，它结合亲玻粘连蛋白(Vit-ronectin)并迅速生长成皮下肿瘤(Felding-Habermann et al.，1992)。因此，细胞表面αV-整合素的存在与M21的皮下生长直接相关。

然而，在建立变异细胞系M21-L和M21-L4的过程中，M21经受极大的选择压力。本发明发现在天然M21种群中αV-整合素的功能可被抑制并发现对细胞行为和肿瘤发展具有惊人的影响。肽颉抗剂易于合成，但由于其生物利用率低，体内半衰期短且迅速从动物体内清除(Humphries et al.，1988)。因而其使用受到限制。同源抗体给肽提供了一种令人感兴趣的选择。它们体内半衰期长(Tao and Morrison，1989；Haba et al.，1985)且使用标准技术易于证实其结合特异性。遗憾的是，尽管存在极好的αV特异性抗体(如LM142)(Cheresh and Spiro，1987)，但较少能有效地抑制αV-整合素功能。

αV-家族成员的特异性和生物学功能很有很大争议，首先是因为还没有试剂能破坏全部类型的功能(不存在有效抑制αV的抗体)。整合素家族经典的附着受体具有其它非常规的生物学功能这一新发现加强了对其作用的分子机制的探索，这类探索揭示了在整合素上有一些没预料到的区域，这些区域空间上产生了活化状态，或者连接后，能自身活化整合素功能。与此相反，整合素功能抑制剂一般封闭活性位点，优选的例子是RGD肽，它重复αV系列和α5β1整合素许多配体的整合素识别位点。

本发明描述了一种用于抗人αV整合素链的新功能抑制抗体，命名为17E6。许多报道讨论了αVβ3和其配体例如亲玻粘连蛋白之间相互作用的不可逆性。本文揭示了17E6能迅速触发αV系列整合素和其底物之间所谓的不可逆相互作用的逆转，并建议了其治疗应用。本发明分析了17E6的作用机制，发现它是与αVβ3结合的配体的一种极弱的竞争剂，而亲玻粘连蛋白(Virtonectin)和以RGD活性位点为基础的探针是相互间竞争性极强的受体。其它的抗体极强地竞争17E6。因此，17E6充当了一种异位抑制剂。交联实验揭示了αVβ3(而不是αVβ1或αVβ5)需要形成二聚体后17E6才能抑制。这一发现揭示17E6功能由涉及整合素诱导的信号传导途径来操纵的新抗制产生。根据本发明的抗体抑制肿瘤发展，而且没有细胞毒性。一般材料，图，表，缩写：

本申请所提及的微生物，细胞系、质粒、噬菌体载体、启动子、抗性标记、复制起点或其它载体片段一般以商品形式买到或可用其它的一般途径得到。在有些情况下，上述材料不能直接买到。然而本文仅用它们作为实施例以证实根据本发明的物质的特性或效果，且它们对于满足公开需要是非必需的。它们可按常规用其它合适的、一般可得到的用具和生物学材料来替代。

单克隆抗体17E6是由命名为272-17E6的杂交瘤细胞系产生的一种抗体。该细胞系以保藏号DSM ACC2160，保存于DeutscheSammlung fiir Mikroorganismen，Buaunschweig.FRG。

根据本发明必需的技术和方法在说明书中进行了详细描述。其它未详细描述的技术涉及本领域的技术人员熟知的已知标准方法，或在引用的参考文献、专利申请和标准文献中更详细地进行了描述。

DNA和氨基酸序列也包括轻微变化或改变的序列，如可用化学或物理方法有目的地或随机地获得的突变体和变异体。一般来说，所有表现出所述特性和功能的突变体和变异体均被包括。

按常规，抗体概念还包括抗体片段，如Fab′、F(ab′)₂或单链Fvs。这些片段可用通常的标准技术生产。缩写：αIIbβ3 整合素αVβ1 整合素αVβ3 整合素αVβ5 整合素αVβ6 整合素αVβ8 整合素10G2 Mab14.18G2a Mab14D9、F8 Mab14E2 Mab17E6 Mab20A9 Mab23G5 Mab3A3 Mab9、2、27 MabADCC 抗体控制的细胞毒性AECM 抗体和效应物细胞依赖性细胞抑制AIIB2 MabAP3 MabATCC 美国典型培养物保藏中心B16F10 细胞系CP8 MabCSAT MabCRGDfV 环肽：Arg-Gly-Asp-Dphe-ValCRGDfK 环肽：Arg-Gly-Asp-Dphe-LysEMM31 细胞系GOH3 MabGRGDSPK 肽：Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-LysLM142 MabLM609 MabM21 细胞系M21-L 细胞系M21-L-IIb 细胞系M21-L4 细胞系MAb 单克隆抗体MTT 3-(4-5-二甲基噻唑-2-YL)-2-5-二

苯-四唑生物胺NBT-BCIP 氮蓝四唑-溴氯吲哚磷酸盐NP18 细胞系OG 辛基-糖苷-(去污剂)PID6 MabP1II6 MabP4C10 MabP5II9 MabPMSF 苯甲基-磺酰-氟化物RGD 肽：NH₂-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-COOH SDS-PAGE 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。UCLAP-3 细胞系WM164 细胞系WM793 细胞系V+B2 细胞系表1

比较了ELISA和细胞ELISA中的抗体。正文中充分讨论了试利和特异性。“+”表示阳性反应，“-”表示不发生反应。关键：- 抗体：本试验中鉴定的抗体(黑体字)，标准试剂(斜体字)。- 免疫原：αVβ3＝固相人胎盘整合素αVβ3。 M21＝完整的M21细胞。- 纯化的 αVβ3和 αIIbβ3固着在96孔板上进行ELISA。-细胞系 M21、 M21-L和 M21-L-IIb、 UCLAP3在板上生长并固定，在CELISA中测定抗体反应性。一特异性：(见正文)αV＝哺乳动物整合素的αV链。200KDa＝未知的黑色素瘤细胞200,000MW表面蛋白质。αVβ5＝整合素αVβ5。β1＝整合素β1链。β3＝整合素β3链。表2

与对照(仅含第二抗体)相对应的反应性水平分极如下：1-2(-)，2-4(+)，4-9(++)，＞9(+++)。例如，对于M21，对照的相对荧光强度一般是30-50单位，LM142结合的是300-500单位，给出平均相对反应性，大约为10(400/40)。(*)用70％乙醇在-20℃渗透M21-L。(@)M21-L具有VNR整合素β3链的细胞内贮存库。表3

用胰蛋白酶LEDTA收获M21和M21-L细胞，与17E6抗体或对照抗体一起温育，洗涤后注射入裸鼠尾静脉。7周后处死动物，检查肺表面肿瘤病灶。用17E6预处理后降低了形成的病灶数。当注射M21-L细胞(细胞表面缺点αV)时形成相同的病灶数。“*”表示与对照相比：非抗体依赖性。

图1

用荧光激活细胞分类器(FACS)分析αV组抗体和对人黑色素瘤细胞M21和M21L的控制。用10μg/ml第一抗体与细胞进行温育，用荧光标记的第二抗体染色，用Propidium iodide复染以去掉坏死细胞，每个样品分析10,000个细胞，空心峰代表单独的第二层抗体强度。实心峰代表识别的第一和第二抗体共同的强度。纵轴代表每个波道的细胞，横轴代表该波道上荧光强度的对数值。M21携带表面αV整合素、M21-L不携带。α-V组抗体的染色方式与LM142(αV特异性)和LM609(αVβ3特异性)染色密切相配。特别是它们与M21反应但很少与M21-L反应。抗体9、2、27与表面蛋白多糖反应。14E2和21H6识别一种另外的未确定的200KDa黑色素瘤表面蛋白质。它们的染色方式与αV组的染色方式有差异，尤其是它们与M21和M21-L的反应相似。图2αV组抗体免疫沉淀相似的蛋白质。用生物素标记活的M21黑色素瘤(A)细胞表面，用去污剂提取并在非还原性7.5％SDS-OAGE上进行免疫沉淀和分辨。标准品在泳道a上电泳，分子量以KDa在左边显示。用对照抗体LM142(抗αV：泳道b)和LM609(抗αVβ3：泳道c)，21H6(泳道d)，10G2(泳道e)，20A9(泳道f)，23G5(泳道g)，17E6(泳道h)，14D9(泳道i)，和14E2(泳道i)进行沉淀。LM142和LM609沉淀相同形式的蛋白质10G2，20A9，23G5和17E6，而21H6和14E2沉淀大约200KDa的带。14D0两种形式都沉淀。M21黑色素瘤(B)，M21-LαV-缺陷型黑色素瘤(C)，和VULAP-3细胞(D)用生物素标记细胞表面，并按在(A)中所述的方法免疫沉淀。用抗体LM142(抗αV、泳道b)，LM609(抗-αVβ3：泳道c)，17E6(泳道d)，AP3(抗β3：泳道e)，和20A9(泳道f)进行沉淀。分子量标记物在泳道a电泳分子量以KDa显示在左边。显示了αV，β1，β3，β5斑带的位置。图317E6干扰原始细胞附着到亲玻粘连蛋白(Vitronectin)上。

以FACS筛选一系列黑色素瘤细胞系(Mels.)和瘤细胞系与17E6 Mab的反应。FACS强度如表2所述。在来自17E6(空心)或L4E2(实心)的杂交瘤上清液存在的条件下，使细胞附着到亲玻粘连蛋白(Vitronectin)封闭的底物上(0.5μg/ml封闭)。洗涤后，按材料和方法中所述计数附着的细胞，当抗体存在时并将粘附资料标准化。注意到除了B16F10(鼠黑色素瘤)外，所有的细胞都起源于人类。Malme 3是一种成纤维细胞系。在不存在抗体的条件下，附着细胞的绝对百分数为M21(70％0、WM164(68％)、A375(75％)、EMM31(67％)、WM793(65％)、MalMe 3(67％)、B16F10(70％)、VCLA-P3(76％)、NP-18(65％)、SW1116(68％)、HT29(65％)。横轴：对照的细胞附着％数。图417E6干扰由αVβ3和αVβ5整合素介导的附着

在细胞附着到亲玻粘连蛋白(Vitronectin)封闭的底物上(5mg/ml)的过程中，将纯化的单克隆抗体(Mab)或小鼠腹水共同温育。细胞系是(A，B)M21；(C，D)UCLAP-3；(E，F)WM-793。代表下列抗体(特异性)的符号：(●)＝17E6(αV)；(▲)＝LM609(αVβ3)；(◆)＝14D9F8(αV)；(○)＝(β1)；(□)＝P5H9(αVβ5)；()＝P5H9+LM609(从10μg/ml开始稀释)(αVβ3+αVβ5)。纵轴：附着的细胞(％)。横轴：左侧：Mab(μg/ml)，右侧：腹水稀释度(1/x)。图517E6干扰对亲玻粘连蛋白(Vitronectin)的附着但不干扰对其它基质成份的附着。研究了17E6(αV，●)和P4C10(β1，○)对细胞附着到亲玻粘连蛋白(Vitronectin)(A)，层粘连蛋白(Laminin)(B)或胶原蛋白I型(C)上的影响。仅在VN封闭的表面17E6才抑制细胞附着。仅在胶原蛋白I型和层粘连蛋白(Laminin)上P4C10抑制细胞附着。横轴：P4C10稀释度(1/x)(上轴)和Mab(μg/ml)(下轴)；纵轴：结合的细胞％。图617E6逆转已形成的细胞-亲玻粘连蛋白(Vitronectin)连接

将M21黑色素瘤与用亲玻粘连蛋白(Vitronectin)(VN-上排)或纤维连接蛋白(fibronectin)(FN-下排)封闭的表面接触24小时。当17E6加到培养基(b，f)中时在30分钟内细胞附着并充分铺开，到24小时(a，e)进行增殖。30分钟后在亲玻粘连蛋白(Vitronectin)(b)上细胞变圆，而在纤粘连蛋白(fi-bronectin)(f)上它们保持铺开。LM609(c，g)和14E2(d，h)对两种底物的影响较小。抗体浓度：-(b)：0.1μg/ml。(c，d、fh)：100μg/ml。图7人黑色素M21在BALB/c裸鼠中的发展受αV整合素的调控。A.B.17E6对皮下M21发展的影响。

0.5×10⁶个M21(A.)或M21-L与缓冲液(○)，17E6(●)或14E2(△)抗体温育并经皮下注射到裸鼠体内。随时测量肿瘤的大小并将其体积作图表示。本图显示了典型的实验。误差线表示每组8只动物的s.e.m.。纵轴：肿瘤体积(mm³)，横轴：注射后的天数。C.αV对M21实验性转移的影响。

0.32×10⁶个( ■)或1×10⁶个(◇，□)M21(◆，◇)或M21L(■，□)细胞注射到裸鼠尾静脉内。在所示的时间处死各组动物并检查肺肿瘤。在第42天全部M21小鼠被处死。对于M21-L小鼠，每点处死3-6只小鼠。6周后，M21小鼠的肿瘤太多，难以计数(每肺＞＞250)。T绝计显示的假设为：在第42天，M21-L组与对照M21组来自相同的种群，水平＜0.001(**)或＜0.02(*)。其中较高和较低注射组具有相同的显著性，仅一个被显示出来。线段表示各组的平均肿瘤数。纵轴：转移瘤/肺；横轴：注射后的天数。图817E6不具有细胞毒性。 A.17E6对M21细胞增殖的影响

5×10⁴个M21接种到含有载体(○)或存在50μg/ml17E6(●)或14E2(△)抗体的DMEM/FCS中，每天计数细胞数。增殖的动力学和饱和密度不受抗体的影响。纵轴：细胞数；横轴：天数。B.以小神经胶质细胞对M21细胞的17E6依赖型裂解。胸苷标记的M21细胞与源于BALB/C的小胶质脑巨噬细胞混合，加入系列稀释的抗体，培养后测定胸苷的释放。对照：(△)单独的M21细胞；(◆)M21+17E6(100nM)；(◇)M21+14.18G2a；(▲)M21+小神经胶质细胞。平均值±s.d.(n＝6)。实验：(●)M21+小神经胶质细胞+17E6；(□)M21+小神经胶质细胞+14.18G2a。17E6不诱导抗体依赖性细胞裂解。均数±s.d(N＝3)。纵轴：细胞毒性(％)；横轴：抗体浓度(M)。C.以小胶质细胞对M21细胞的17E6依赖性细胞抑制。M21细胞与小胶质细胞和系列稀释的抗体培养，然后用[H³]-胸苷脉冲以测量DNA合成。测量胸苷的掺入([H³]-thy)。符号如B中所述。注意单独的效应细胞的细胞抑制活性( )。试验的显微镜观察表明：当14.18G2a≥10^-10M时在同源的小胶质细胞区域无M21细胞存活。纵轴：[H³]-胸苷的掺入(cpm×10^-3)；横轴：抗体浓度(M)。图917E6不影响M21细胞的DNA合成

培养细胞系(A)M21；(B)M21-L；(C)M21-L4；(D)M21-LGPIIb，以所示的浓度加入缓冲液(O)，或抗体17E6(●)，LM609(▲)或14E2(△)。在(B)和(D)中，显示了常规阳性对照紫杉酚。48小时后，甲[H³]-胸苷脉冲细胞并测量掺入的放射性。抗体对DNA合成无影响。紫杉酚完全抑制DNA合成。参见图8：90μg/ml Mab＝600nM。纵轴：[H³]-胸苷掺入(cpm×10^-3)；横轴：Mab浓度(μg/ml)。图10

17E6和片段对纯化的αVβ3的ELISA。使完整的17E6(△)，其片段F(ab′)₂(O)或F(ab′)(□)以所示的浓度结合到用1mg/ml αVβ3覆盖的平板上并检测结合的抗体。纵轴：450nm下的光密度；横轴：抗体(log10μg/ml)。图11

由αVβ1和αVβ5而不是αVβ3介导的细胞附着被17E6F(ab′)抑制。在所示浓度的17E6，其F(ab′)₂或F(ab′)片段存在的条件下，按所示使细胞附着到以5mg/ml覆盖的亲玻粘连蛋白(Vit-roncctin)上。加入的100％附着的总细胞附着率变为从大约85％(WM164)到大约50％(V+B2)。纵轴：％最大细胞附着率；横轴：抗体浓度(μg/ml)。图12

17E6F(ab′)的交联抑制M21附着到亲玻粘连蛋白(Vit-roncctin)上。在M21细胞附着到亲玻粘连蛋白(Vitronectin)的过程中(如图4，11)，0(○)，0.1()，1.0(□)，或10μg/μl(△)的17E6F(ab′)片段或完整的AP3抗体与所示浓度的交联抗小鼠第二抗体温育。交联剂显示出对17E6F(ab′)和AP3具有相同的ELISA亲合力(未示出)。纵轴：405nm下的光密度；横轴：山羊抗小鼠抗体浓度(μg/ml)。图13.

在定向竞争试验中配体活性位点类似物和亲玻粘连蛋白(Vit-roncctin)相互竞争地结合αVβ3。在αVβ3覆盖的平板上浓度增加的亲玻粘连蛋白(Vitronectin)()、或肽GRGDSPK(○，●)或cRGDfV(◆，◇)与生物素标记的亲玻粘连蛋白(Vitronectin)(μg/ml≡1.5nM)或一种生物素标记的cRGDfV衍生物(cRGDfK-bio：50nM)共同温育。用抗生物素抗体检测结合的生物素。图中假定非共价多体亲玻粘连蛋白的均数Mr为0.65MDa。纵轴：％配体结合；横轴：肽/VN(log[μM])。图14

在定向竞争试验中，17E6不与亲玻粘连蛋白竞争结合αVβ3。浓度增加的17E6(

)，其它抗-αVβ3抗体(□，◇，，△)，或配体类似物cRGDfV(◆)与生物素标记的亲玻粘连蛋白(1μg/ml)在αVβ3覆盖的平板上共同温育。用抗生物素抗体检测结合的生物素(参见在相同的αVβ覆盖的条件下17E6的饱和状态：图10)。纵轴：VN结合％；横轴：[Mab]μg/ml-[cRGD]μM。图15

在预先抑制的竞争试验中，配体和活性位点类似物不与抗体竞争结合αVβ3。浓度增加的亲玻粘连蛋白(Vitronectin)(VN，○)，纤维蛋白原(FG，)，纤维连接蛋白(FN，□)，cRGDfV(66203，△)，或所示抗体(◆)在αVβ3覆盖的平板上预先温育1小时，然后以加入(不洗涤)生物素标记的抗体(1μg/ml)进行探测，如图所示。检测了结合的生物素。100％的抗体结合值表明在所示浓度竞争物存在的条件下抗体的结合与不含竞争剂的对照一样。配体不影响抗体结合。纵轴：％探针抗体结合；横轴(左侧和右侧)：配体浓度(μg/ml)。图16

在预先抑制的竞争试验中，抗体的确互相竞争结合αVβ3。浓度增加的抗体17E6(

)，LM609()，AP3(□)或14D9.F8(△)于所示的浓度在αVβ3覆盖的平板上预先温育1小时并加入(不洗涤)生物素标记的抗体(1μg/ml)进行探测，如各组中所示。检测了结合的生物素。100％的抗体结合值表明：在所示浓度的竞争物存在的条件下抗体的结合与无竞争剂的对照一样。在交叉竞争组中抗体互相竞争。纵轴：％探针结合的抗体；横轴(左、右侧)：抗体浓度(μg/ml)。图17a，b：Mab 17E6可变(FV)区的cDNA序列

轻链：VL17E6重链(a)和重链VH17E6(b)。显示了可变区(包括先导序列)的全部核苷酸和推导出的氨基酸顺序。先导序列以黑体字标出，CDR序列以斜体字标出。根据Kabat的分类重链具有IIB型的特征结构，轻链具有K型V。图18克隆方法的示意图

从17E6杂交瘤细胞提取编码17E6抗体重链和轻链F_v区的mRNA，反转录成cDNA，用pcR扩增出可变区。然后对它们进行克隆和测序。

参考文献：

见原文P19-23αV型单克隆抗体与整合素αV链反应：

片ELISA在纯化的αVβ3和αIIbβ3上筛选抗体发现5个克隆，17E6、20A9、23G5、14D9.F8、10G2，它们与αVβ3发生特异反应(表1)。这些Mab称为“αV型”。都是IgG1的同型。在相同ELISA试验中，与抗αVβ3复合物(LM609)，αV链(LM142)，αVβ5复合物(P5H9)，αIIbβ3复合物(cp8)，β3链(AP3)，和β1链(P4C10)已知特异性的抗整合素抗体按文献预期的方式发生反应(表1)。使用表达αVβ3和αVβ5(M21)，表达αVβ5但不表达αVβ3(VCLAP3)，不表达αVβ3和αVβ5(M21-L)和表达αIIbβ3(M21-L-IIb)的细胞，在固定的细胞上进行ELISA(“CELISA”)，表明αV型的反应方式与它们对αV整合素链的识别一致，但与和β3，β5，β1或其它α链的反应明显不同(表1)。结果证实了用纯化受体得到的ELISA数据。筛选中还得到了对β3和GpIIb具有特异性的Mab(资料未显示)，其反应方式与αV型明显不同。17E6，14D9.F8，20A9和23G5类似的表面亲合力结合αVβ3。以大约10-20ng/ml(大约50-100pm、与LM609相同)的浓度可达到50％的结合率。结合的10G2与LM142相似(亲合力大约低10倍)。抗aIIbβ3的cp8，14E2(见下面)在浓度高达100nM时与αVβ3表现出最低结合。

以FACS(图1，表2)和表面标记细胞的免疫沉淀(图2)检测了αV型识别野生型αV整合素的能力。在FACS分析中(图1)，表达αV的细胞系(M21)与17E6，14D9.F8，20A9，23G5和与αV限定的抗体LM142和LM609发生强烈反应，与10G2发生中等程度的反应，也与对照Mab 14E2和21H6、Mab9.2.27发生反应。与此相反，αV缺陷型变异体(M21-L)与αV型、LM142和LM609发生微弱反应，但表现出与14E2，21H6和9.2.27的反应与M21相同。仅仅当细胞被渗透时在FACS中检测到M21-L具有β3亚单位的细胞内贮存库(表2)。在M21-L4的FACS分析中(αV再转染的M21-L细胞(Felding-Habermann et al.，1992))，αV型的反应方式与对M21一样。对照载体转染子，M21

L12和GpIIb转染子M21-L-IIb(Kieffer et al.，19991)与αV型不发生反应(表1)。VCLAP-3腺癌与αV型、LM142和P5H9反应，但不与LM609反应。VCLAP-3不表达β3(见引言)。黑色素瘤WM793的反应方式与M21相同。在筛选M21细胞的免疫沉淀中，αV型的免疫沉淀方式与LM142(抗αV)、LM609(抗αVβ3)相同(图2a)。表面标记的αVβ3和αVβ5整合素的特征带型为在～92KDa处可见一条较强的宽带，在～145KDa处有一条较弱的带，在～100KDa处伴随着一些较弱的带(Wayner et al.，1991)。与对M21-L的沉淀类型相比较，无αV型沉淀(显示了来自17E6和20A9的资料)，也没有LM142或LM609沉淀(图2c)。β1特异性抗体在两种细胞系中具有相同的沉淀类型。在M21-L中，用抗β3抗体的沉淀在～92KDa处得到一条带，这是由于在可透过的(很可能是坏死的)细胞中细胞内β3被标记产生的。VCLAP3(图2d)不产生LM609沉淀，但用αV型和LM142以～95KDa/145KDa复合物的形式被沉淀(图2d)。总之，ELISA、CELISA、FACS分析和免疫沉淀产生相同的反应方式并强有力地表明αV型Mab与人αV整合素链的细胞外功能区发生反应。Mab 17E6是一种有效的功能抑制性抗体：17E6能改变原始细胞对αV配体的附着：αV整合素能作为亲玻粘连蛋白的受体而发挥功能，因此筛选αV型是因为它可能会影响细胞附着到亲玻粘连蛋白底物上。以FACS分析整合素后，在附着试验中检测细胞(表2，图3)。在FACS中，人黑色素瘤和癌细胞系同样与αV型发生反应。与17E6的反应进行了小结(图3)。在FACS中与17E6反应的细胞对亲玻粘连蛋白的原始附着被该抗体强烈抑制，但仅受到对照抗体14E2的微弱影响(图3)。αV型的其它成员效力较弱(资料未显示)。鼠细胞N16F10对亲玻粘连蛋白的有力附着不受17E6的影响，在FACS中B16F10不与17E6发生反应。和预期的一样(Cheresh and Harper，1987)，B16F10对亲玻粘连蛋白的附着对微摩尔浓度的RGD肽较敏感，表明存在功能性表面αVβ3(SLG and B.Diefenbach)。因此，17E6和αV型与人αV反应，但不与鼠αV反应。

研究了17E6对细胞附着的影响。17E6以IC50为大约0.1μg/ml的浓度抑制M21对亲玻粘连蛋白的附着(～85％％)(图4a)。本发明证实了以前的研究(Wayner et.，1991)，表明M21的附着很少受到抗αVβ(LM609)或抗αVβ5(P5H9)的抗体单独抑制，但当两者一起加入时，则受到强烈抑制(图4a、b)。抗β1整合素抗体(P4C10)对M21附着到亲玻粘连蛋白上无影响(图4b)。细胞系VCLAP3和WM793附着到亲玻粘连蛋白上且这种附着被17E6抑制，也被补充的αVβ5特异性(P5H9/VCLAP3)或αVβ3特异性抗体(LM609/WM793)抑制(图4c-f)。对αVβ5(VCLAP3)，17E6 IC50为大约30ng/ml。对WM793，IC50为～60ng/ml，对LM609，IC50为600ng/ml。VCLAP3表达αVβ5但不表达αVβ3(Wayner et.，1991)，而WM793表达高水平的αVβ3(表1)。17E6对细胞附着于其它基质底物无影响证实了它的抑制特异性(图5)。P4C10(抗β1)阻断M21附着到层粘连蛋白和胶原蛋白上。细胞附着于这两种底物上可由β1系列整合素介导(Sonncnberg et al.，1988；Takada et al.，1987)。

综合生化资料，这些结果与17E6结合各种整合素复合物αV链并干扰它们与其配体的相互作用的理论一致。17E6触发由αV整合素介导的已建立的细胞与基质相互作用的逆转：

随后探讨了17E6是否能影响已建立的细胞—基质相互作用。当17E6以较低浓度(～0.1μg/ml)加到M21细胞中时，37℃用M21培养0.5-1小时后导致细胞普遍变圆，即使在附着24小时后也一样(图6)。这种影响是完全可逆的，在洗去17E6后，48小时内细胞又恢复其伸展状态。与此相反，抗体LM609和14W2即使在较高浓度(100μg/ml)仍仅能轻微地影响形态结构。抗体即使在100μg/ml的浓度下对纤维连接蛋白(fibronectin)覆盖的底物仍不能产生形态学上的影响(图6)。M21-L4(和其它经αV附着的细胞)同样受到17E6对其表面的亲玻粘连蛋白的影响，但对纤维连接蛋白(fibronectin)，胶原蛋白或层粘连蛋白无影响。17E6抑制在裸鼠体内M21肿瘤的发展

本发明探讨了αV抑制性抗体17E6对M21肿瘤在BALB/cnu/nu小鼠皮下发展的影响(图7)。在动物模型中，M21肿瘤在裸鼠体内的发展与细胞表面表达αV系列整合素相关(见引言)。M21细胞与无内毒素抗体经皮下共同注射给了裸鼠。17E6恒定地(4/4个实验)抑制M21肿瘤的皮下发展(图7a)。在存在17E6的条件下不发生肿瘤(0132)并且动物在另外6个月后仍无肿瘤产生。对照肿瘤的发生率为75-90％。抗αV链本身的非抑制性抗体和抗黑色素瘤细胞表面的对照抗体对肿瘤发展表现出可变的和不稳定的影响。在14E2处理过的对照中，发生肿瘤的动物依赖于实验量减少了30-60％，但剩余的动物肿瘤与未处理的对照一样地生长，并且与对照一样，当取出肺进行组织培养时发现这些动物具有小的肺转移瘤(未显示)。与此相反，17E6处理的动物当第6个月处死时既无皮下肿瘤，在肺、肝、肾、脾、结肠、胃、胸腔和腹腔中也无转移瘤。αVβ3缺陷型细胞系M21-L与M21相比皮下肿瘤生长更缓慢，且不受17E6的影响。用14E2处理过的M21-L对照与未处理的动物相比肿瘤减少，这与在M21细胞中所见的相似(图7b)。

在“实验性转移”经尾静脉注射模型中比较了M21和M21-L的生长和抗体17E6的影响。以剂量依赖性方式M21形成许多集落，而M21-L形成的集落明显较少，但以高剂量注射时，确实形成了肺肿瘤(图7c)。换句话说，在肺内肿瘤的生长也因细胞表面αV整合素的存在而增强，且用17E6预先温育M21减少(不少于9％)形成的肿瘤集落数。令人惊奇的是，肿瘤形成水平与在相同实验中由M21-L细胞得到的相同。抗体不改变生长肿瘤的动物数(表3)。

总之，在皮下和实验性转移瘤模型中细胞表面αV的存在促进M21肿瘤形成，且αV抑制性和逆转性抗体17E6强烈抑制M21的生长。在M21细胞的实验性转移模型中，M21的迅速生长和M21-L的缓慢生长与肿瘤的皮下生长方式密切对应且预先用17E6处理也抑制M21的生长。这一资料支持了αV整合素和人黑色素瘤发展间的联系。不因细胞毒性的17E6的影响

观察其对附着、形态学和肿瘤发展的有效影响后，尝试找出17E6作用的机理。试验了17E6的细胞毒性(图8)。细胞生长的动力学和获得的最终饱和密度不会受到17E6或对照抗体存在的较大影响(图8a)。

裸鼠是免疫缺陷型的。它剩下少数有免疫能力的细胞，巨噬细胞最有可能诱导细胞毒性，抗体介导应答。为试验抗体诱导细胞毒性(ADCC)的可能性，在对M21细胞的ADCC中试验了与抗体同源的鼠巨噬细胞。鼠脑巨噬细胞(小神经胶质细胞)作为效应细胞是SDCC特别有效的介导体(Sutter et al.，1991)。阳性对照：Mab 14.18G2a以＜10^-9M几乎导致M21的完全溶胞，而17E6高达10^-7M也不能介导ADCC(图8b)。

为评价在效应细胞存在的条件下17E6是否能产生细胞抑制活性，在存在抗体的条件下测定M21和小胶质细胞共同培养物的DNA合成(图8c)。在掺入[3H]-胸苷时，10^-10M 14.18G2a引起≥90％的抑制。

检查对细胞增殖，ADCC和AECM的影响后，再检测M21细胞的DNA合成水平是否受Mab的影响。0.5μM的17E6，14E2和LM609对胸苷的掺入无影响(图9)。抗体也不影响M21-L，M21-L4和M21-L-IIb与17E6和LM609都不发生反应，但与14E2发生反应(图1)。也检测了许多其它的黑色素瘤细胞系，αV型不明显地表现出影响其DNA合成(未显示)。

17E6和14E2是IgG1的同型，它们不影响对M21细胞的补体介导溶胞(未显示)。可得出的结论是17E6对αV整合素的影响是特异性的并对其它细胞系统无剧烈毒性影响。17E6对细胞的αVβ3而不是αVβ1或αVβ5发生作用需要受体交联：

在许多生物学系统中，跨膜信号传递由受体的二聚体化来起动。事实上，αVβ3的多聚体化改变了HUVEC中磷酸酪氨酸化方式(Bhattacharya et aL，1995)。因此研究了在17E6作用过程中是否涉及受体的聚体。17E6抑制细胞整合素αVβ3，αVβ5和αVβ1(图4)。在～1ng/ml下获得的50％饱和(～7PM完整Mab)的分离的αVβ3(图10)上进行ELISA表明17E6和其F(ab′)₂和F(ab′)片段具有相同的结合特征。相似的ELISA滴度曲线表明17E6与ELISA板之间单价作用。但在细胞附着试验中，片段发挥作用不同。F(ab′)₂和完整的17E6抑制由αVβ1(V+B2细胞)和αVβ5(UVLA-P3细胞)(IC50～0.1μg/ml：700pM)介导的细胞附着和αVβ3附着(WM164和M21细胞)(IC50～μg/ml：～3nM)，且F(ab′)片段对αVβ1和αVβ5的活性与二聚体抗体活性一样(图11)。然而，F(ab′)片段对αVβ1和αVβ5的活性比对αVβ3的活性至少高1×10⁴倍，其中在试验的最高浓度(50μg/ml：IC50＞＞50μg/ml：＞＞400nM)下它仅抑制25+10％，在这些水平，无关抗体也产生相同程度的抑制(未显示)，表明这一边缘效应无特异性。

具有结合能力的F(ab′)抗体片段缺乏生物学活性(如17E6F(ab′)：(图10)典型地表明二聚体化是抗体介导的功能所必需的。为证实17E6作用于αVβ3确实需要进行交联，在细胞附着试验过程经加入多克隆抗F(ab′)抗体交联17E6 F(ab′)。其中在第一和第二抗体都处于临界浓度时观察到典型的前带状影响，只有在这种情况下观察到细胞附着的强烈抑制。大量的第二层抗体或F(ab′)各自单独不影响细胞附着。而且该效果不是交联αVβ3整合素的非特异性结果。经结合交联αVβ3而无抑制性抗体AP3对细胞附着无影响(图12)。在交联实验中加入第二抗体后F(ab′)的活性浓度与αVβ3介导的附着中完整17E6的IC50一致(参见图11)。

综合这些资料表明：αVβ3整合素的交联是阻止WM164和M21附着到同源配体上所必需的，而αVβ5和αVβ1不需交联就能被灭活。在分离的受体试验中17E6是受体功能的一种弱抑制剂：

在分离的受体试验中详细研究了17E6对αVβ3的功能的不常见特性。注意到经典的活性位点抑制剂与17E6之间的对比。结合αVβ3的亲玻粘连蛋白在～5μg/ml下饱和(～10nM：假定平均亲玻粘连蛋白多聚体为10个单体大小)。(图13)，这种结合与经典的线型配体类似肽(GRGDSPK：IC50～2μM)和环化肽(cRGDfV：IC50～5nM)都发生特异性地竞争。经使用生物素标记的cRGDfV变异体(cRGDfK-生物素)可直接证实不仅抑制剂竞争亲玻粘连蛋白的结合、而且亲玻粘连蛋白也竞争抑制剂的结合(图13)，即该系统是对称的。事实上，亲玻粘连蛋白、GRGDSPK和cRGDfV互相定量且对称地竞争，其中亲玻粘连蛋白结合αVβ3复合物竞争IC50与抑制IC50对称(图13)。

17E6结合αVβ3时在0.01-0.1μg/ml(700-70pM)下饱和(参见图10)。然而，抗体仅是配体结合的一种弱抑制剂，即使抗体在70nM下对亲玻粘连蛋白结合的抑制不超过30(+10)％。LM609以相同的方式发挥作用，而αVβ3结合的非抑制性抗体(14D9.F8，20A9和WAM2-4)无影响。配体相似性环肽cRGDfV有效地抑制受体-配体相互作用(IC50～10nM)(图14)但不影响17E6结合。完整的或单价的17E6都不抑制受体-配体相互作用(未显示)。在饱和量的竞争配体存在的条件下17E6结合αVβ3：

在分离的受体试验中17E6对配体的微弱竞争和象cRGDfV一样的强竞争性抑制剂的有效性提出了17E6是怎样影响αV-功能的问题。在细胞附着试验中，17E6和其片段对αVβ3整合素的抑制活性需要进行交联，这一行为与竞争性抑制并不完全一致。接着研究了αVβ3的配体是否直接干扰17E6的结合。

配体预先结合到受体上，加入低浓度的直接标记的17E6(图15)。17E6的结合不受超出饱和αVβ3上特异性结合位点所需浓度100倍的高浓度亲玻粘连蛋白、纤维连接蛋白或纤维蛋白原(都是αVβ3的天然配体{Cheresh and Spiro，1987}的影响(抑制＜10％)。作为对照预先结合的17E6与随后加入的标记的17E6的结合进行强烈竞争(图15、16)，且αVβ3的天然配体也互相充分竞争(未显示)。这否定了17E6与亲玻粘连蛋白竞争αVβ3的活性位点这一假设。而且，活性位点的强竞争剂(如200μM的环肽cRGDfV)对17E6的结合也无影响，但以2nM的IC50抑制亲玻粘连蛋白结合αVβ3(图13)。

ELISA资料(图10)表明：17E6-αVβ3的相互作用是单价的，减少了由于非常高的抗体亲合力伴随着低配体亲合力所观察到的竞争性人工制品的可能性。然而，标记了其它的αV和β3特异性抗体并用它们竞争预先结合的配体(图15)，包括抗体本身(图16)。抗体成功地互相竞争并明显属于一个交叉竞争组(图16)。β3特异性抗体AP3竞争它本身的结合但不影响它本身的结合，且不受αVβ3复合物(LM609)或单独的αV链(17E6，14D9.F8)特异性抗体的影响；LM609，17R6和14D9.F8都强烈地交叉竞争。作为对照，预先结合的配体不影响17E6结合αVβ3。可能得出的结论是17E6不经过直接竞争配体结合位点发挥功能。17E6可变区的克隆和测序：

为进行免疫球蛋白可变区的PCR扩增而设计的引物文库用于克隆富集杂交瘤17E6重链和轻链cDNA文库的免疫球蛋白。半富的可变区引物终止于先导序列的起始点。恒定区的反向引物在恒定区由30bp处终止。引物末端设计成用于克隆的Sal或Xma I限制性位点。获得预期大小的PCR产物(420-450bp(Jones andBendin，1991))并克隆和测序(图17)。17E6免疫球蛋白轻链可变区(VL17E.)长度为381bp。重链可变区(VH17E6)长度为411bp。重链可变区序列特征为Kabet IIb型免疫球蛋白，轻链序列特征为Kabat V型(Kabat et al.，1987)。克隆方法如图所示(图18)。

肿瘤发展和转移是一种传统的疾病，其中细胞脱离正常的生长和附着控制，并侵袭、移行、附着到不合适的位置进行生长。现在已知整合素控制许多细胞的附着行为，而附着又依次调节机理密切结合的行为、包括生长、分化、细胞移动和蛋白酶体系活性、以及在转移的级联过程中重复的发展行为(Liotta et al.，1991；StetlerStevenson et al.，1993；Fidler，1988)。在本试验中描述定向的抗人αV系列整合素的抗体之一，17E6，干扰最初的细胞附着，破坏稳定的αV-配体相互作用并在体内动物模型中干扰人黑色素瘤发展(Fidler，1986)。在生化分析中，αV型抗体表现出的反应方式与LM142(一种非常明确的抗人αV抗体)密切相关但与αVβ3特异性(LM609)，αVβ5特异性(P5H9)和其它明确的抗整合素抗体的反应方式不同。因此，αV型抗体很可能识别人αV整合素链。17E6免疫球蛋白的转录体的cDNA克隆揭示了其独特的、清楚的序列。重链可变序列被鉴定为Kabat IIb型免疫球蛋白，轻链序列鉴定为kabat V型(Kabat et al.，1987)。因此，该抗体被明确定义。

17E6强烈干扰αV介导的细胞相互作用。我们认为干扰功能的抗体对整合素功能是重要的，但αV类缺乏一种有效的类型特异性抑制抗体。17E6以～0.3-1nM(抗体MW150,000)的IC50抑制αV介导的细胞附着；作为比较，肽抑制剂GRGDSPK的IC50为～5μN。主要表达αVβ3(WM793)或αVβ5(VCLAP3)的细胞系受17E6的抑制，这是因为细胞也主要表达αVβ1。因此，17E6是α整合素的一种通用抑制剂。

17E6不仅阻止αV整合素与其配体最初的相互作用，而且导致已经形成的相互作用逆转，引起附着到亲玻粘连蛋白上的细胞缩回。αVβ3与亲玻粘连蛋白的相互作用曾被描述成“不可分离的”，它分两步进行，最初是可抑制的相互作用，接着是迅速的稳定反应(Orlando and Cheresh，1991)。与此相反，17E6引起M21和许多其它细胞(观察结果未公开)以亲玻粘连蛋白底物上迅速缩回和部分脱离。当去掉抗体时变圆逆转。M21最初对亲玻粘连蛋白的附着受倒17E6的不完全抑制(～90％)，但其变圆致力基本上影响所有的附着细胞。以前的研究证实M21对亲玻粘连蛋白的最初附着受抗αVβ3和抗αVβ5抗体混合物和RGDS肽的完全抑制，暗示αVβ3和αVβ5两者都涉及(Wayner et al，1991)。本研究表明，17E6抑制一些αV受体并能逆转由它们介导的稳定的相互作用。17E6对已附着和附着中的M21细胞的活性区别可能在于在每种情况下αVβ3和αVβ5的功能和位置不同。在附着中的细胞上两者都分散分布，而在已附着的细胞上，发现αVβ3集中接触而αVβ5分散分布(Wayenr et al.，1991；Zambruno et al.，1993)。进一步研究了17E6是否选择性地破坏这些接触之一。

在裸鼠体内M21肿瘤的生长强烈地依赖于αV整合素(Feld-ing-Habrtmann et al.，1992；Sander et al.，1992)。由于17E6能调节稳定的αV-配体相互作用并具有长期效力，因此检查了它对肿瘤发展的影响。发现17E6抑制皮下M21肿瘤在裸鼠体内的发展，因此有力地支持了Feleing Habermann等的研究。而且也可能表明αV促进且17E6抑制作为实验性肺转移瘤M21的发展。因此本发明独立证实了以前的重要研究并经过用17E6进行同源抗体介导的“治疗”扩展了以前的研究。这些结果强调了αV整合素在M21肿瘤发展中的重要性并排除了以前得出的作为克隆选择性人工制品这一结果的可能性。

洗去后17E6的体外效力持续时间大于24小时。假定小鼠体积为20ml，则开始的体内抗体浓度为～10nM，这一剂量超过逆转培养物中细胞-配体相互作用的IC50一个数量级。对于处理的动物BALB/c nu/nu而言，17E6是同源的，且鼠IgG1半衰期为20-200小时(Tao and Morrison，1989；Haba et al.，1985)。因此，在这一模型中，逆转M21-配体相互作用的IC50至少可超过100小时(5个半衰期)。比较17E6与RGD肽是令人感兴趣的。在N16F10-C57bIK6鼠黑色素瘤模型中共同注射的肽抑制B16-F10肺肿瘤的发展(Humphries et al.，1986；Hardan et al.，1993)。按对17E6一样的假定，提供～100μM RGD肽(Hardan et al.，1993)，这一剂量大约超过抑制细胞对亲玻粘连蛋白的附着所需剂量两个数量级。然而，SGDS的血清半衰期为8分钟(Humphrieset al.，1988)。作为一般的治疗目的，可能优选产生的长寿抑制剂来抑制肿瘤发展。

17E6怎样影响肿瘤发展？由于它不与鼠细胞反应，所以影响产生在肿瘤细胞上且该抗体对肿瘤血管形成的影响可排除(Brookset al.，1994)。可鉴定的17E6的效力只有：a)它结合αV整合素的细胞外功能区，b)具有干扰αV介导的细胞相互作用的能力。可假定对裸鼠而言大多数抗体介导可利用的杀伤力来源已消除。17E6对M21细胞的生长和存活力不产生慢性或急性影响，不介导补体固着，不影响DNA合成，不介导同源巨噬细胞介导的细胞毒性。M21细胞对ADCC敏感，因为在Mab 14.18 G2a存在下它们能被小胶质细胞有效杀死。IgG1 MAB(如17E6)有效地介导鼠巨噬细胞ADCC(Herlyn et al.，1985)。每个细胞表达的αVβ位点数可能低于产生ADCC的临界阈值。以前的研究表明ADCC的有效性与靶抗原密度相关(Rodeck et al.，1985)。巨噬细胞与其它骨髓或淋巴效应细胞相反，它表达所有3类FCR受体。这一资料不赞同以ADCC机制解释用17E6在体内观察到的肿瘤生长抑制。该抗体无内毒素。不能排除NK介导的杀伤由17E6激活，但如果这样，与所用的对照抗体相比，同源同型引起的激活更微弱。

因此，17E6很可能以损伤αV整合素的功能来发挥作用。17E6可能抑制且αV可能参与的功能包括：细胞附着，与可溶基质成份的相互作用(Seftor et al.，1992)，蛋白酶/蛋白酶抑制剂体系的调节(Gehlsen et al.，1992；de Boer et al.，1993；Preissner，1991)，刺激细胞移动(Seftor et al.，1992；Gehlsen et al.，1992)或影响受体内在化(Wickham et al.，1993；Panetti and MckeownLongo，1993a；Panettii and Mckeown Longo，1993b)。但是否涉及以上功能仍需进行进一步的实验。

17E6对αVβ3而不是对αVβ1和αVβ5的抑制作用需要靶分子形成二聚体。尽管在ELISA中结合αVβ3整合素时和在抑制由αVβ1和αVβ5介导的细胞附着中单价和双价17E6抗体片段具有相等的活性，但单价片段对αVβ3基本上无活性。而且当将交联抗体加入单价片段中时，它们又获得抑制αVβ3介导的附着，并在这一过程中表现出经典的前带效力。但单一的αVβ3交联不足以抑制活性，因为交联AP3对αVβ3介导的附着无影响，AP3结合β3链(参见图2B：e)。

从单价向双价作用的转换导致抗体对其靶分子亲合力的急剧增强(Lane and Harlow，1988)。17E6对分离的αVβ3的ELISAαVβ滴度测定并不显示这一转换，因此表明在这一构型中与17E6的单价和双价成分发生的单价相互作用都出现。在使用相同ELISA构型的配体结合受体试验中，与肽配体类似物(如EMD 66203：cRGDfV)相比，17E6是一种惊人的弱抑制剂。联系上下文，在从细胞到分离的受体试验的转换中，cRGDfV获得大约2-3个数量级活性量(IC50从～1μM到～1nM)，17E6失去至少3个数量级的明显活性(IC50从～100ng/ml到＞μg/ml)并变得基本上无活性。

用竞争实验可分辨这种异常和细胞抗体交联资料的确切性。这些结果表明：与肽抑制剂相反，17E6不直接干扰配体结合位点。由于缺乏直接证据，通常假定抑制剂功能以对配体-受体结合位点的空间堵塞来实现，在整合素领域以配体活性位点类似物，如含RGD的肽(Hynes，1992)和在亲玻粘连蛋白中经诱导该位点突变而引起的配体失活(Cherney et al.，1993)丰富了这一观点。我们的资料有力地表明，对于有效的抑制抗体17E6而言，事实并非如此。总的来说：在αVβ3整合素上：a).配体类似肽互相竞争并与配体本身竞争；b).配体竞争肽；c).肽和配体都不与17E6的结合竞争；d).17E6不与配体或配体类似物的结合竞争；e).17E6与其本身和其它αV结合抗体具有充分的竞争性。

对于与αVβ3结合的配体而言，17E6是一种极弱的竞争剂，而亲玻粘连蛋白和以RGD为基础的活性位点探针在受体上强烈地互相竞争。其他抗体强烈地竞争17E6。因此，17E6充当一种空间异位的抑制剂。交联实验揭示了在17E6抑制前，αVβ3(而不是αVβ1或αVβ5)需要形成二聚体。这一发现揭示了17E6通过与整合素诱导的信号传导途径的操纵相关的新机制，而不是简单地颉抗整合素-配体相互作用产生。

由于αVβ3配体的活性形式为同源多聚体，非活性形式是单体(Preissner，KT，1991，Stockmann，A.et al.1993)，所以整合素被底物的多聚体化可能对其功能是必需的，事实上，生长因子受体家族的受体酪氨酸激酶被配体的二聚体化在启动信号转导中是关键的步骤(Dougall，WC，et al.，1994)。很明显，底物多聚体的立体化学对整合素在膜上的定位和信号传递复合物形成的规定是最重要的。事实上，对细胞附着的多聚体亲玻粘连蛋白的生物学“逻辑”可能是由这种强制引起的。亲玻粘连蛋白多聚体的大小从3到16个单位(Stockmann，A.et al，1993)，并预期可能使细胞表面的整合素产生有次序的排列且产生由多聚体相互作用产生的必然增强的亲和力。单体亲玻粘连蛋白-αVβ3相互作用的单独的寿命较短，亲和力低，而未结合的整合素在膜表面迅速转动，抗体亲和力和速率高。因此，可预料到与细胞表面一种整合素相联系的二价抗体可捕获在转动中，游离的整合素并改变其构象使其不能结合配体。这引起αVβ3分子排列和亲玻粘连蛋白连接物的逐渐削弱并使细胞-亲玻粘连蛋白相互作用不稳定(就象盖上一层分子Velcro。这可以解释在受体试验中17E6功能的缺乏，即其中的受体不能转动到允许二价结合的必要方向(由ELISA资料证明)，和解释在细胞试验中其有效性，并可解释在细胞试验中并非必然能观察到活性位点的竞争，以及解释F(ab′)片段在抑制αVβ3介导的细胞附着中无效性。

很明显，由于αVβ5和αVβ1(和αVβ6，αVβ8及α5β1)与αVβ3具有重叠的配体范围，因此可想象得到它们以直接类似于以RTK生长因子受体家族中的异型二聚受体交叉调节的方式互相交叉调节其功能(Dougall，WC，et al.，1994)。例如：αVβ5比αVβ3对亲玻粘连蛋白的亲和力更高，它能竞争该底物单个多聚体上的αVβ3结合位点，关闭产生信号或维持细胞附着所需的αVβ3同源二聚体，并用αVβ5-αVβ3异源二聚体来代替。其它的αV整合素可能以相似的交叉调节方式发挥功能，但缺乏有力的资料证实这些假设。

总之，发展了一组抗人αV整合素链的单克隆抗体。其中的一个(17E6)能抑制和逆转αV介导的体内过程。令人感兴趣的是，它也抑制αV依赖型黑色素瘤在裸鼠体内的发展。这表明αV整合素可能是肿瘤治疗的有效候选剂。

在本文的准备过程中，Lehmann等人(Lehmann et al.，1994)描述了一种某些特征与17E6相关的αV特异性抗体。了解它是否也能逆转αV介导的相互作用和干扰黑色素瘤的发展将是重要的。治疗和诊断用途

根据本发明的抗体可对病人用药以进行治疗。因此，本发明的一个目的是提供一个药用配方，包含上文和权利要求所限定的至少一种抗体或抗体片段作为活性成份，以及一种或多种药用上可按受的载体、赋形剂或其稀释剂。本发明的抗体典型地可经静脉内或肠胃处注射。一般来说，施用抗体(或其片段)的剂量范围较大并足以产生所需的抑制肿瘤和溶解肿瘤效应。剂量取决于病人的年龄、状态、性别和疾病程度，变化范围可从0.1mg/kg到200mg/kg，优选0.1mg/kg到100mg/kg/剂，每天以1份或多份剂量用药，持续1天或几天。

肠胃外用药制品包括无菌的含水或不含水的溶液，悬液和乳剂。不含水的溶剂例子子是丙二醇，聚乙二醇，植物油(如橄榄油)，可注射的有机酯(如油酸乙酯)以及其它本领域已知适用于这些用途的溶剂。本发明的抗体可用于包含一种生理学上可接受的载体的组合物中。这些可适用的载体例子是：盐水，PBS，任氏液、或乳酸任氏液。在该药用配方中还可存在保存剂和其它添加剂，如抗生素，抗氧化剂和整合剂。

该抗体(或其片段)也可根据已知方法接合细胞因子(如IL-2)以维持其细胞毒性。

本发明的药用配方适于治疗所有类型的肿瘤，包括黑色素瘤，神经胶质瘤和癌，以及循环系统的肿瘤和固体肿瘤。

为用于诊断，例如，抗体可接合一种防射线的染料或可被放射标记。优选的标记方法是lodogen方法。为达到诊断目的，抗体可优选以scFv片段的形式用药。这可提供较好的结果而不必控制背景。

表 1

用ELISA和CELISA测定Mab的反应方式

同模抗体免疫原标本	αvβ3 αIIβ3	M21 M21-L M21-L- UCLAIIb -P3	特异性
同模抗体免疫原标本	αvβ3 αIIβ3	M21 M21-L M21-L- UCLAIIb -P3	特异性	17E6 αvβ3 IgG1/κ20A9 M21 IgG1/κ23G5 M21 IgG1/κ14D9.F8 M21 IgG1/κ10G2 M21 IgG1/κ14E2 M21 IgG1/κ21H6 M21 IgG2a/κ	+ -+ -+ -+ -+ -- -- -	+ - - ++ - - ++ - - ++ - - ++ - - ++ + + -+ + + -	αVαVαVαVαV200KDa200KDa
LM609 IgG1/κLM142 IgG1/κP5H9 IgG1/κCP8 IgG1/κP4C10 IgG1/κAP3 IgG1/κ	+ -+ -- -- +- -+ +	+ - - -+ - - ++ - - +- - + -+ + + ++ - + -	αVβ3αVαvβ5αIIbβ3β1β3		+ -+ -+ -+ -+ -- -- -	+ - - ++ - - ++ - - ++ - - ++ - - ++ + + -+ + + -	αVαVαVαVαV200KDa200KDa

表 2

用流式细胞光度术测定单克隆抗体反应性小结：

		M21	M21-L	M21-L(P)	M21-L-IIb	M21-L4	M21-L12	UCLA-P3	WM793
		M21	M21-L	M21-L(P)	M21-L-IIb	M21-L4	M21-L12	UCLA-P3	WM793	抗体	特异性
αvβ3；αvβ5	(β3)^@	(β3)^@	αIIbβ3	αvβ3；αvβ5	(β3)^@	αvβ5	αvβ3；αvβ5
αvβ3；αvβ5	(β3)^@	(β3)^@	αIIbβ3	αvβ3；αvβ5	(β3)^@	αvβ5	αvβ3；αvβ5	17E620A923G514D9.F814E2	αvαvαvαv200KDa			++ - - - ++ - +++ +++++ - - - ++ - +++ +++++ - - - ++ - +++ +++++ - - - ++ - +++ +++++ ++ ++ ++ ++ ++ - +++

										LM609LM142P5H9P4C10AP3CP8	αvβ3αvαvβ5β1β3αIIbβ3	++ - - - + - - +++++ - - - ++ - ++ ++++ - - - + - +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++++ - ++ ++ + + - +- - - ++ - - - -

表 3

在BALB/C nu/nu小鼠肺集落化“实验性转移”

试验中17E6 Mab对M21肿瘤病灶发展的抑制：

细胞和处理	产生的肿瘤	肿瘤病灶数		％控制
		肿瘤病灶数			平均值±SEM	中值	(范围)
					平均值±SEM	中值	(范围)
M21(对照) 99				87+110	30	(3-378)	100
M21(对照) 99		M21+17E6 78	8±77	87+110	30	(3-378)	100	5	(0-21)	9
M21-L 56		M21+17E6 78	8±77	19±22	8.5	(0-60)	22^*	5	(0-21)	9

实施例实施例1：材料动物：用于产生抗体(雌性BALB/c；生后8周)和用作肿瘤模型(裸鼠”：雌性纯合无胸腺的BALB/c nu/nu；生后4-5周)的小鼠来自Criffa(Barcelona，Spain)。裸鼠在无菌室的小分离笼中饲养并随意提供无菌食物和水。所有操作均在层流通风橱中进行。蛋白质：纤维连接蛋白(Ruoslahti et al.，1982)，亲玻粘连蛋白(Yatohgo et al.，1988)从新鲜的冷冻人血浆中纯化，纤维蛋白原(Kazal et al.，1963)从全血中纯化。层粘连蛋白从Engelbreth-Holm-Swarm鼠肿瘤(Paulsson et al.，1987)中纯化。其中如果没有其它的说明，则所有操作均在20℃下进行，洗涤都用无钙镁PBS(“PBS”：137mM Nall，2.8mMKcl，8.1mMNa₂HPO₄，1.5mM KH₂PO₄；PH7.4)。PBS⁺⁺是含有1mM MgCl₂和1mMCaCl₂的PBS。如果没有特别说明，化学品(Merck KgaA，Darm-stadt)都具有可得到的最高纯度。环肽(如(cRGDfV和cRGDfK)根据已知的标准技术(例如：FEBS Let.291，P50-52，1991)来合成。用作比较化合物的线型肽GRGDSPK可以商品的形式买到(例如，从Bachem，Switzerland)。肿瘤细胞系和培养物：由美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供SW1116，HT29人癌和A375人黑色素瘤，下列人细胞系由同事赠送：M21黑色素瘤，其变异体M21-L和M21-L4(Cheresh andSpiro，1987)，M21-L-IIb(根据(Kieffer et al.，1991)制备)，VCLA-P3人肺腺癌(Cheresh et al.，1989)(Dr.D.A.Cheresh，Scripps)，WM793和WM164黑色素瘤(Dr.M.Herlyn；Wistar)(Herlyn et al.，1990)。NP18，胰腺癌(Dr.G.Cappella；Hospital Sant Pau；Barcelona)。最初来自于Dr.I.Fi-dler的B16F10鼠黑色素瘤(Poste et al.，1980)(Dr.S.Alino；Vniversity of Valencia)。EMM31由我们小组从肿瘤标本建立，按典型的组织学标准定义为原发黑色素瘤(Jaggle et al，观察结果未公开)。所有细胞在37℃、7.5CO₂、92.5％空气条件下在含2mML-谷氨酰胺的90％RPMI1642，10％胎牛血清(FCS)培养基中培养，并经适当的试验(Mycotect Kit；Gibco)测定为一直无支原体。抗体：除非特别说明，单克隆抗体(MAb)融合ELISA筛选，亚克隆和培养物的维持都用标准技术进行(Harlow and Lane.1988)。实施例2：免疫：以Sepharose柱缓缓层析纯化的胎盘αVβ3(200μl PBS中含80μg αVβ3和80μl Sepharoe或活的M21细胞(0.5ml PBS中含1×10⁶个细胞)每隔2周经腹膜内注射，持续12周以产生抗αVβ3的MAB。最后一次注射后第4天，用Friendly Myeloma(Ventrex)配对进行PEG诱导的融合。经免疫完整的M21细胞(1×10⁶个细胞悬于0.5ml PBS中)生产抗200KDa黑色素瘤相关的表面蛋白质的抗体。筛选：使用对受体和固定的M21细胞的ELISA。对于受体ELISA，用纯化的αVβ3(1μg/ml的PBS，16h；4℃)覆盖96孔ELISA板(Dynatech)，封闭(1.5％脱脂乳PBS溶液；1小时，4℃)后与杂交瘤上清液温育。使用对硝基苯磷酸作底物，以连接有碱性磷酸酶的抗小鼠Ig(Dako)检测结合的免疫球蛋白。对于细胞ELISA，将M21或M21-L，M21-LIIb或VCLAP-3细胞固定(4％多聚甲醛PBS溶液，15分钟，20℃)在96孔组织培养板上，在与杂交瘤上清液温育前先封闭(3％BSA；PBS，1小时，4℃)，按受体ELISA的方法检测。阳性杂交瘤以有限稀释法亚克隆3次并用RPMI培养基适应。用亚类特异重链抗体(Zymed)或轻链抗体(Promega)测定免疫球蛋白同型。

用于本研究的其它鼠MAB由我们的同事赠送，抗αVβ3的LM609和抗αV的LM142(Cheresh and Sptro，1987)(Dr.D.A.Cheresh；Scripps)，抗β1整合素的P4C10(Carter et al.，1990)(Telios)和抗αVβ5整合素复合物的P5H9(Wayner et al.，19910(Dr.E.Wayner Vniversity of Minnesota)，抗αIIbβ3复合物的CP8(Dr.Ruggieri；Scripps)，抗β3链的AP3(Furihata etal.，1987)(ATCC)，抗黑色素瘤细胞表面蛋白的多糖的9.2.27(Harel et al.，1990)(Dr.R.Reisfeld；Scripps)和抗神经节苷脂GD2和14.18G2a(Mujoo et al.，1989)。实施例3：抗体的纯化和扩增：为进行大量纯化，从在转瓶中生长的指数期培养物中收获抗体上清液，过滤(0.45μm)灭菌前在蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱上纯化的抗体用PBS透析，贮存于-70℃(Harlow and Lane，1988)。经通过Kuriover-II柱(Kurita-Vater；Tokyo)除去纯化的抗体中的内毒素。这样将Limulus试验(Metvaer and Fystro，1982)中的内毒素水平从＞250IU内毒素/mg抗体减少到＜0.2IU/mg。用标准技术制备17E6(鼠IgG1)的F(ab′)₂和F(ab′)片段，即先用胃蛋白酶切割并用蛋白A柱(Pharmacia)分离，再用木瓜蛋白酶切割并经凝胶过滤分离(Harlow and Lane，1988)。αVβ3和αIIbβ3整合素的纯化：

从人胎盘纯化αVβ3(Smist and Cheresh，1988)。绞碎分娩的胎盘并在2倍体积的冰冷的溶液A(0.05％W/N)毛地黄皂苷，2mM CaCl₂，2mM PMSF，PH7.4)中洗涤，然后过滤。剩余的材料在4倍体积的冰冷的缓冲液B(100mM辛基-β-D-吡喃半乳糖苷[OG]，1mM CaCl₂，2mM PMSF的PBS溶液)中抽提并离心(最大12000g，45分钟；4℃)。上清液在LM609抗体柱上重复循环(16小时，4℃)。用缓冲液C(0.1％NP-40的PBS溶液；～10cv)和缓冲液D(0.1％NP-40，2mM CaCl₂，10mM乙酸钠；PH4.5：～10cv)洗涤后，用缓冲液E(将缓冲液D调成PH3.1)洗脱结合的物质。洗脱剂用3M Tris(PH8.8)中和，用缓冲液C透析，并用Aquacide II(Calbiochem)浓缩10倍。纯化的受体贮存于-70℃。

从人血小板制备αIIbβ3(Pytela et al.，1986)。过期的血小板浓缩物与1体积的Tyrodes缓冲液混合，再进行沉淀(最大为1200g)，所得沉淀用裂解缓冲液(50mM OG，1mM MgCl₂，1mMCaCl₂，1μM MnCl₂，2mM PMSF，150mM NaCl，50mMTris-HCL，PH7.4)提取(1小时；20℃)。离心(最大为32000g，30分钟，4℃)后，上清液在GRGDSPK连接的CL-4B Sepharose柱上重复特环(16小时；4℃)。用裂解缓冲液(～10cv)洗涤柱并用GRGDSPK(3mg/ml 90％裂解缓冲液，10％DMSO)洗脱。将洗脱峰浓缩～5倍，用改变了的裂解缓冲液(用0.1％NP-40代替OG)透析并贮存于-70℃。用α和β链特异性单克隆抗体进行抗整合素ELISA和用SDS-PAGE判定整合素制品纯度为～95％。实施例4表面标记和免疫鉴定细胞表面生物素标记和提取：用EDTA收获指数生长的细胞，洗涤后，悬于PBS(1ml)中的5×10⁶个细胞在颠倒转动器上用生物素-N-羟基琥珀酸亚胺酯(10μg/ml；Sigma)标记表面(2小时；20℃)，洗涤后，5×10⁶个细胞/ml在提取缓冲液(100mMOG 2mM CaCl²，1mM MgCl₂和1mM PMSF的PBS溶液)中20℃溶胞1小时。离心(12000g，20分钟)后上清液用于免疫沉淀。免疫沉淀：用与Affigel-10珠(Biorad)偶联的或结合到蛋白GSepharose柱(Pharmacia)上的纯化的抗整合素MAb免疫沉淀生物素标记的细胞提取物。10mg偶联的MAb与和5E6个细胞相当量的生物素标记的细胞提取物4℃温育过夜。洗过的小珠在非还原性SDS样品缓冲液中煮沸，离心后在7.5％SDS-PAGE上分辨。电泳转移到硝酸纤维素上(Towbin et al.，1979)后，以NBT-BCIP(Biorad)作底物用山羊抗生物素碱性磷酸酶连接物(Dako)观察带型。流式细胞光度术：用EDTA收获细胞，洗涤后，悬于PBS-1％BSA溶液中的10⁶个细胞与MAb(10μg/ml；20分钟，4℃温育。洗涤并用羊抗-小鼠Ig-FITC(Becton Dickinson)标记(20分钟，4℃)后，在流式细胞光度术分析(EPICS Profile II，Coulter)前，细胞与Propidium iodide温育。以侧面合适的阀门选择活细胞并向前分散。用氩离子激光在488nm下激发荧光并记录发射的荧光(525nm)。在有些实验中，M21-L细胞经过简单固定和通透步骤(70％乙醇；5分钟，-20℃)后再染色。补体依赖性细胞毒性(CDC)：M21细胞(10,000个)与50μl完全培养基和20μl抗体在96孔板上涂板。加入兔血清(50μl，1：5；Behring)作为补体来源并培养平板(37℃：60分钟)。用MTT技术(Mosmann，1983)定量溶胞。用含1％Tween-20的孔作100％溶胞对照，不含抗体的孔作为0％溶胞对照计算溶胞百分数。实施例5：细胞生长，存活率和活化增殖试验：为检测抗体的慢性影响，在MAb存在的条件下(70μg/ml PBS；1小时；20℃)在颠倒转动器中培养106个细胞，洗涤后重悬并进一步在RPMI培养基中培养。用台盼兰排除试验评价生长和存活率。用上面所述的MTT试验测量活化，每天用细胞计数器(Coulter electronics)计算细胞数目。

消化附着的黑色素瘤细胞(0.05％胰酶/0.02％ EDTA)。洗涤后的细胞接种到96孔平底微量试验平板上(1×10⁴个细胞/孔)并在不含(对照)或存在系列稀释的抗体的条件下在含10％FCS的RPMI培养基中培养。48小时后，细胞经脉冲标记18小时(18.5KBeg[³H]-胸苷/孔)并收获细胞。测量掺入的放射活性并以每分钟的计数来表示。实施例6：抗体介导的细胞胞毒试验(ADCC)：BALB/C小神经胶质细胞的制备、ADCC的条件和抗体效应器细胞介导的细胞郁积(AECM)基本上按Sutter等(Sutter et al.，1991)所述进行。M21细胞用[³H]-胸苷(18KBg/4×10³个细胞/孔)脉冲18小时后，在抗体存在的条件下，与含BALB/c小胶质细胞(5×10⁴个细胞/孔)的200μl DMEM/FCS(10％)在96孔板上培养。48小时后，测量滞留在靶细胞核区的[³H]标记。计算MAb依赖性细胞毒性的公式为：[(实验性ccpm-自发性ccpm)/(最大ccpm-自发性ccpm)]×100。实施例7抗体和效应细胞依赖性细胞郁积(AECM)：按ADCC所用的方法，但用刚传代的未标记的M21细胞代替脉冲标记细胞。效应器-靶细胞共同培养24小时后，用[³H]胸式(18KBg/孔)再脉冲24小时，测定掺入的核[³H]标记。细胞附着试验：按以前所述(Goodman et al.，1991)进行，用氨基已糖酶活性(Landegren，1984)检测附着的细胞。稀释液和细胞悬液使用附着缓冲液(RPMI，1％BSA，25mM HEPES；PH7.4)。基质蛋白质覆盖到96或48孔平板上，用BSA封闭各孔，并向各孔中加入系列稀释的MAb，接着加入细胞(2.5×10⁴-5×10⁴)。37℃培养1小时后洗去未附着的细胞并参照平行操作的标准曲线计数附着的细胞。用未加MAb的孔作对照计算对附着的抑制。典型地所加的细胞超过70％在1小时内附着到亲玻粘连蛋白上。附着到仅覆盖有BSA的孔中的细胞一般不超过特异性附着细胞的5％。表面交联试验；和细胞附着试验一样，在存在系列稀释的17E6或其F(ab′)₂或F(ab′)片段和逐步增加量的山羊抗小鼠F(ab′)作交联试剂的条件下，使细胞附着到基质覆盖的平板上。按正常的细胞附着试验的方法洗涤和检测附着的细胞。附着逆转试验：按细胞附着试验的方法将细胞接种到覆盖和封闭的孔内的附着缓冲液中，37℃进行培养。细胞伸展后(60-75分钟)，加入系列稀释的MAb并放回培养箱。作为选择，可在加入抗体前使细胞附着24小时。在抗体存在的条件下2-3小时后，小心去掉上清液，用新鲜的，预温的附着缓冲液取代5次，使最终稀释系数21×10⁵。体内肿瘤发展：用EDTA收获指数生长的肿瘤细胞，洗涤后用台盼兰染料排除法检查存活率，存活率在96-99％之间。为产生原始肿瘤生长，将细胞(0.5×10⁶个细胞悬浮于0.2ml PBS⁺⁺中经皮下注射到裸鼠腹部两侧。肿瘤生长后用测径器测量肿瘤直径，用适于长椭圆体的公式计算肿瘤体积：

体积＝[(a·b²)/2]

其中a是肿瘤最长轴，b是肿瘤最短轴。每组最少使用8只动物。

为进行实验性肺转移，收获细胞(0.05％胰酶/0.02％EDTA)并注射到裸鼠尾静脉(0.5×10⁶个细胞悬浮于0.2ml PBS⁺⁺中)内。7周后处死动物，取出肺并在Bouins溶液中固定，计数肺表面的肿瘤病灶数。为进行抗体处理，在稀释成0.5×10⁶个细胞/0.2ml PBS和注射前，收获并洗涤后的细胞与纯化的无内毒素MAb(70μg/10⁶个细胞/0.5ml PBS⁺⁺)在颠倒转动器中20℃温育30分钟。在完成注射程序前后用台盼兰染料排除试验测定细胞存活率，结果没发现明显的差异(注射前存活率＝注射后存活率±5％)。用双尾学生T检验分析肿瘤抑制数据。实施例8：分子生物学技术：

除非另有说明，所有的分子生物学技术均按以前的详细描述(Sambrook et al.，1989)进行。RNA和cDNA制备：以硫氰酸胍提取法以17E6细胞分离学RNA并以氯化铯密度梯超离心(Chirgwin et al.，1979)分离RNA。用商品试剂盒(Pharmacia)合成第一链cDNA。合成在含5μg RNA的15μl体积中，于37℃进行1小时。第一链cDNA直接用于PCR扩增。PCR扩增：使用设计成与鼠Ig先导序列杂交的一套重复的和半变性的PCR引物扩增小鼠轻链可变区和重链可变区(Jones andBendiry，1991)。61个寡聚核苷酸的混合物用作重链可变区的5′引引物。405个寡聚核苷酸的混合物用作K链可变区的5′引物。3′引物设计成在恒定区退火：使用特异性IgG1和K小鼠引物。

为了用耐热DNA聚合酶进行扩增，将25μl含：1μl cDNA-RNA杂交物、250nM合适的5′和3′引物混合物，各200μM的dNTP、1mM MgCl₂(用于轻链)，2mM MgCl₂(用于重链)和1UTaq聚合酶(Cetus)的反应混合物，用矿物油覆盖，并从60℃到55℃的退火温度开始进行。 30次循环(1′×55℃：1.5′×72℃：45s×92℃)后，取出1/10的PCR反应液在1％琼脂糖TAE凝胶上电泳并用溴化乙锭染色观察产生的PCR产物。分子克隆和测序：每种PCR产物各1μl连接到TA载体(Invitro-gen，San Diego)上。两种DNA连接反应物(重链和轻链可变区)经热休克转化到感受态的E.coli菌株TG1细胞中以产生两种DNA文库，一个为17E6 Mab的轻链可变区，另一个为17E6Mab的重链可变区。用100μg/ml羧苄青霉素在LB平板上选择菌落并排出进行进一步的分析。经PCR筛选或用质粒酶切化(Gussowand Clackson，1989)检测阳性菌落。以转化子制备的双链质粒DNA(Wizard Prep，Promega Corp)用于测序。用双脱氧核苷酸链终止法(Sanger et al.，1977)以Taq聚合酶进行热循环测序。所用的上游和下游测序引物与TA载体互补。整合素配体结合和竞争试验：生物素标记的配体PBS溶液用5倍浓缩的连接缓冲液稀释(终浓度：1mg/ml蛋白质，100mM NaCl，100mM NaHCO₃.PH8.2)，终体积为1ml。加入新制备的N-羟基琥珀酸亚胺生物素溶液(100μl；1mg/ml于DMSO中)并混匀。在颠倒转动器内反应20℃持续2小时。经彻底透析(4℃，PBS，0.05％NaN₃)后，测定蛋白质浓度，生物素标记的配体贮存于4℃并在21天内使用。生物素标记的肽cRGDfK(环型Arg-Gly-Asp-Dphe-Lys＝N-生物素-氨基己酸)的合成已在背景技术中描述或能根据标准技术获得。直接竞争试验：按照对以前的方法(Smith et al.，1990)作出一些修改后来进行。αVβ3在缓冲液A(150mM NaCl，1mM MgCl₂，1mM CaCl₂，10μM MnCl₂，20mM Tris-HCl；PH7.4)中稀释成1μg/ml，并取出100ml用于处理96孔微量滴定板(4℃过夜)。平板用缓冲液B(3％BSA(w/v)，100mM NaCl，1mM MgCl₂，1mM CaCl₂，10μM MnCl₂，50mM Tris-HCl；PH7.4)洗涤一次并在相同的缓冲液中20℃温育2小时。

用缓冲液C(缓冲液B含0.1％(w/v)BSA漂洗后，加入含生物素标记的配体(1μg/ml终浓度)和系列稀释的试验肽或蛋白质。温育后(3小时，30℃)，用缓冲液C漂洗3次洗去平板上未结合的配体，与抗生物素-碱性磷酸酶连接的抗体(在缓冲液C中1∶10000稀释)(Sigma)再温育1小时，接着用PBS洗涤，以NBT-BCIP(Biorad)为底物测定结合的抗体。ECM分子和抗体按常规进行生物素标记并用于此实验构型中。

以一实验三份或一实验四份按常规进行试验，并重复至少3次以便以适当的未加权S形曲线得到一个IC50值。用外来对照肽与内部试验相比较使结果标准化。

按常规线型RGD肽GRGDSPK和环型肽cRGDfV作为外来标准品存在于对照孔中，在该对照孔中生物素标记的配体与被封闭但无整合素的孔结合，以及抗生物素抗体与无配体的整合素结合，测定对照孔的滴度，对照孔的信号表明特异性配体结合＜7.5％。

按直接竞争试验的方法用受体覆盖和封闭的抑制前竞争试验平板，此平板与2倍浓缩的抗体，基质分子或竞争性肽预先温育(50μl于缓冲液C中，1小时，30℃)，随后加入生物素标记的探测配体或抗体(50μl于缓冲液C中)并继续温育(3小时，30°)，接着按直接竞争试验所述的方法洗涤和检测结合的生物素。

序列表(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)姓名：Merck Patent GmbH

(B)街道：Farnkfurter Str.250

(C)城市：Darmstadt

(E)国家：德国

(F)邮编：64271

(G)电话：49-6151-727022

(H)电传：49-61510727191

(ii)发明题目：抗αV整合素单克隆抗体

(iii)序列数：17

(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent IN Releas #1.0.Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：资料：

(i)序列特征：

(A)长度：381碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：无(iv)反义：无(v)片段类型：N末端(vi)原始来源：

(A)生物体：小鼠

(B)品系：BALB/C(vii)直接来源：

(B)克隆：72-17E6(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：1..129

(D)基它资料：/功能＝“先导-和FR-1序列

(先导：1至60；FR-1：61-129)”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：130..162

(D)其它资料：/功能＝“CDR-1序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS.

(B)位置：163..207

(D)其它资料：/功能＝“FR-2序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：208..228

(D)其它资料：/功能＝“CDR-2序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：229-324

(D)其它资料：/功能＝“FR-3序列”.(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：325..351

(D)其它资料：/功能＝“CDR-3序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：352..381

(D)其它资料：/功能＝“FR-4序列”

(ix)序列描述：SEQ ID NO：1：ATG GTG TCC TCA GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA 48Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1 5 10 15GTT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT 96Val Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser

20 25 30GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ATC ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC 144Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Ile Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp

35 40 1 5ATT AGC AAT TAT TTA AGC TGG TAT CAA CAG AAG CCA GAT GGA ACT GTT 192Ile Ser Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val

10 1 5 10AAA CTC CTG ATC TTC TAC ACA TCA AAA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA 240Lys Leu Leu Ile Phe Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser

15 1 5 1AGA TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AGT 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser5 10 15 20AAC CTG GAC CAA GAA GAT ATT GCC ACT TAC TTT TGC CAA CAG GGT AAT 336Asn Leu Asp Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn

25 30 1ACG TTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACA AAG GTG GAA ATG AGA 381Thr Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Arg5 1 5 10(2)SDQ ID NO：2资料：

(i)序列特征：

(A)长度：43氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1 5 10 15Val Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser

20 25 30Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Ile Ile Ser Cys

35 40(2)SEQ ID NO：3资料：

(i)序列特征：

(A)长度：11氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser1 5 10(2)SEQ ID NO：4资料

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Phe1 5 10 15(2)SEQ ID NO：5资料：

(i)序列描述：

(A)长度：7个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser1 5(2)SEQ ID NO：6资料：

(i)序列特征：

(A)长度：32个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：L6：Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30(2)SEQ ID NO：7资料

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO：8资料：

(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Arg1 5 10(2)SEQ ID NO：9资料：

(i)序列特征：

(A)长度：411碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(v)片段类型：N末端(vi)原始来源：

(A)生物体：小鼠

(B)品系：BALB/C

(vii)直接来源：

(B)克隆：272-17E6

(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：1..57

(D)其它资料：/功能＝“先导序列”

(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：58..147

(D)其它资料：/功能＝“FR-1序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：148..162

(D)其它资料：/功能＝“CDR-1序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：163..204

(D)其它资料：/功能＝“FR-2序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：205..255

(D)其它资料：/功能＝“CDR-2序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：256..351(D)其它资料：/功能＝“FR-3资料”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：352..378

(D)其它资料：/功能＝“CDR-3序列”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：379..411

(D)其它资料：/功能＝“FR-4序列”(ix)序列描述：SEQ ID NO：9：ATG GGA TGG AGC TGG GTC TTT ATC TTC CTG TTT TCA GTA ACT GCA GGT 48Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Ile Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly

15 20 25GTC CAC TCC CAG GTC CAG CTT CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GCA GAG 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Glu

1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

15 20 25AGT AGT TTC TGG ATG CAC TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG 192Ser Ser Phe Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 1 5 1 5 10GAA TGG ATT GGA TAC ATT AAT CCT AGA TCT GGT TAT ACT GAG TGT AAT 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Cys Asn

1 5 10GAG ATA TTC AGG GAC AAG GCC ACA ATG ACT GCA GAC ACC TCC TCC AGC 288Glu Ile Phe Arg Asp Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser

15 1 5 10ACA GCC TAC ATG CAA CTG AGT GGT CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

15 20 25TAT TAC TGT GCA AGT TTT CTG GGA CGA GGG GCT ATG GAC TAC TGG GGT 384Tyr Tyr Cys Ala Ser Phe Leu Gly Arg Gly Als Met Asp Tyr Trp Gly

30 1 5 1CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 411Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

5 10(2)SEQ ID NO：10资料：

(i)序列特征：

(A)长度19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(ix)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Ile Phe Leu Phe Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser(2)SEQ ID NO：11资料：

(i)序列特征：

(A)长度：30个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(ix)序列描述：SEQ ID NO：11：Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Glu Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser

20 25 30(2)SEQ ID NO：12资料：

(i)序列特征：

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Ser Phe Trp Met His1 5(2)SEQ ID NO：13资料：

(i)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly1 5 10(2)SEQ ID NO：14资料：

(i)序列描述：

(A)长度：17个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Cys Asn Glu Ile Phe Arg1 5 10 15Asp(2)SEQ ID NO：15资料：

(i)序列特征：

(A)长度：32个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln1 5 10 15Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser

20 25 30(2)SEQ ID NO：16资料

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Phe Leu Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr1 5(2)SEQ ID NO：17资料：

(i)序列特征：

(A)长度：11个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser1 5 10

Claims

1.一种单克隆抗体，包含如SEQ ID NO：1之氨基酸21-127的轻链的构架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列，以及包含如SEQ ID NO：9的氨基酸20-137之重链，其具有下列特征：

-只与人αV整合素的αV链反应；

-抑制携带αV整合素的细胞附着到整合素底物上；

-触发由αV整合素引起的已形成的细胞基质相互作用的逆转；

-抑制肿瘤发展；和

-不显示出细胞毒性。

2.权利要求1的单克隆抗体，其中的整合素底物是亲玻粘连蛋白，纤维蛋白原，或纤维连接蛋白。

3.根据权利要求1或2的单克隆抗体，其中其生长受抑制的肿瘤是黑色素瘤。

4.具有命名为272-17E6，以保藏号DSMACC2160保藏的，能产生权利要求1-3任一项的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

5.通过杂交瘤细胞系DSMACC2160得到的单克隆抗体。

6.具有SEQ ID NO：1所列序列的氨基酸序列。

7.具有SEQ ID NO：9所列序列的氨基酸序列。

8.根据权利要求6的氨基酸序列，从21位开始。

9.根据权利要求7的氨基酸序列，从20位开始。

10.一种编码权利要求8的氨基酸序列之DNA序列。

11.一种编码权利要求9的氨基酸序列之DNA序列。

12.一种编码权利要求6的氨基酸序列之DNA序列。

13.一种编码权利要求7的氨基酸序列之DNA序列。

14.一种药用组合物，包含根据权利要求1-3或5之一的单克隆抗体和一种药学上可接受的载体。

15.生产根据权利要求1-3或5中之一的单克隆抗体的方法，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO：1之氨基酸21-127的轻链的构架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列，以及包含如SEQ ID NO：9的氨基酸20-137之重链，其包括：经过用纯化的αυβ3整合素免疫小鼠，以ELISA选择结合纯化的相关αυβ3受体的克隆，并根据标准方法生产产生所述抗体的特异性细胞系。