CN113025574B - 一种大口黑鲈脑细胞系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大口黑鲈脑细胞系及其应用，所述大口黑鲈脑细胞系已于2021年03月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202166。本发明所述的大口黑鲈脑细胞系MSBr传代稳定，目前已成功传代超过65代且生长状态良好，且该细胞系适用范围广泛，不仅可用于病毒分离鉴定、病原功能研究、环境污染物检测、基因筛选和功能分析及鱼类肿瘤研究等，同时还可用于水产动物病毒性疾病的监测、诊断及流行病学调查研究，相关病毒性疾病的诊断试剂盒开发和疫苗研制等，具有较大的应用价值和社会经济价值。

Description

一种大口黑鲈脑细胞系及其应用
技术领域
本发明属于水生生物细胞与水产养殖病害防控技术领域，具体涉及一种大口黑鲈脑细胞系及其应用。
背景技术
水生动物(主要为鱼类)的细胞培养研究晚于哺乳动物，始于20世纪60年代。1962年，Woft和Quimby建立了世界上第一个鱼类细胞系，即虹鳟鱼生殖腺细胞系。此后，鱼类细胞培养研究十分迅速，全世界已报道的鱼类细胞系有275株。我国鱼类细胞的培养始于20世纪70年代末，张念慈等建立的草鱼吻端组织二倍体细胞株是我国首个鱼类细胞系。目前建立的鱼类细胞系大约有70多株，多数来自于海水鱼类。细胞株作为具有生物活性的体外材料，有着活体鱼无法比拟的优点:细胞的培养和维持不需要大型的养殖设备，成本低；细胞个体大小均一，遗传背景极为相似，实验条件可以精确控制，重现性好。因此鱼类的细胞系是进行病毒学研究、环境毒物检测、生理学、免疫学、基因功能分析、细胞工程育种和种质保存等研究的重要材料和模型。目前鱼类原代细胞的建立技术虽然较为成熟，但是要获得针对病毒敏感的传代细胞系仍存着较大的偶然性和困难性，所以建立一株目标鱼类细胞系需要制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系，这是一项费时耗力的工作。
大口黑鲈(Micropterus salmoides)又名加州鲈，隶属于鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属，原产地为美国加利福尼亚州密西西比河水系，由于其肉质鲜嫩美味、抗疾病能力强、生长迅速、易起捕、适合温度广的特点被世界各地相互引进。我国于1983年在广东佛山引进加州鲈，并在1985年人工繁育成功。经过40多年的发展，加州鲈已经成为我国重要的经济养殖品种。然而，随着人工集约化程度不断提高，养殖密度持续升高，加州鲈病害层出不穷，尤其是病毒性疾病。弹状病毒以及虹彩病毒是加州鲈病毒性疾病的主要病原。近年来，加州鲈弹状病毒病已在加州鲈苗种培育过程中大量暴发，严重时80％池塘发病，死亡率短时间内可高达90％，用药效果不佳，经济损失巨大。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供了一种大口黑鲈脑细胞系及其应用，该细胞系传代稳定，目前已成功传代超过65代且生长状态良好，且该细胞系适用范围广泛，不仅可用于病毒分离鉴定、病原功能研究、环境污染物检测、基因筛选和功能分析及鱼类肿瘤研究等，同时还可用于水产动物病毒性疾病的监测、诊断及流行病学调查研究，相关病毒性疾病的诊断试剂盒开发和疫苗研制等，具有较大的社会经济价值。
本发明的目的之一在于提供了一种大口黑鲈脑细胞系，该细胞系已于2021年03月25日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，所述大口黑鲈脑细胞系的保藏编号为：CCTCC NO:C202166。
进一步的，所述大口黑鲈脑细胞系的培养温度为28℃。
进一步的，所述大口黑鲈脑细胞系的培养过程中，胎牛血清的体积浓度为10％或15％。
本发明的目的之二在于提供了上述大口黑鲈脑细胞系的构建方法，所述方法包括：
S1、取大口黑鲈麻醉后，抽干血液后在75％酒精中浸泡2min，然后在无菌条件下取大口黑鲈的脑组织；
S2、将脑组织经无菌PBS缓冲液漂洗后，置于AIM培养液中浸泡30min；
S3、将脑组织剪成1mm3大小，加入胰蛋白酶于28℃消化20min；
S4、利用包含体积浓度20％FBS的M199培养基终止消化后，所得的细胞悬液过细胞网筛，过滤后的细胞悬液于1000r/min离心7min；
S5、离心后去上清，利用包含体积浓度20％FBS的M199培养基重悬沉淀得到重悬混匀液，将重悬混匀液加入到细胞培养瓶中，于28℃、5％CO2培养箱中培养，得到原代大口黑鲈脑细胞，待单层细胞达到融合状态时用胰蛋白酶消化，进行传代培养得到大口黑鲈脑细胞系。
进一步的，所述步骤S4中将所得的细胞悬液过70μm细胞网筛的同时还用注射器按压细胞网筛表面残余的组织碎块。
本发明的目的之三在于提供了上述大口黑鲈脑细胞系在水产动物病毒增殖培养和/或病毒疫苗研制中的应用。
进一步的，所述水产动物病毒包括：大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoidesrhabdovirus,MSRV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(reovirus of grass carp,GCRV)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)、传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)。
本发明的目的之四在于提供了上述大口黑鲈脑细胞系在外源基因表达中的应用。
本发明的目的之五在于提供了上述大口黑鲈脑细胞系在抗水产动物病毒药物筛选中的应用。
本发明的目的之六在于提供了上述大口黑鲈脑细胞系在作为药物评价、基因筛选和功能分析、病原功能研究、细胞工程育种、和环境毒物检测的生物模型中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明所述的大口黑鲈脑细胞系传代稳定，可传代至少65代，并且对多种常见水生动物病毒如MSRV、SVCV、GCRV等敏感，可应用于病原感染机制和病原功能研究、相关诊断制剂开发和未知鱼类病毒分离鉴定等方面。
(2)本发明所述的大口黑鲈脑细胞系增殖MSRV、GCRV等病毒的滴度高，可用于相关病毒的大规模培养，或弱毒疫苗、灭活疫苗等的制备，或抗水产病毒药物的筛选和评价，进而实现对相关病毒性疾病的防控。
(3)本发明所述细胞系的细胞类型单一，培养条件可控，因此对污染物的反应均一，实验结果重复性好，误差小，便于观察、检测和记录；并且细胞直接与污染物接触，不仅相对减少了污染物的用量，避免环境污染，还可直观观察细胞反应，并结合电子显微镜等技术，可在细胞或亚细胞水平上研究环境污染物的损伤部位和毒性作用靶点，评价其毒性大小，即细胞系可代替活鱼应用于鱼类毒理学、环境污染物或毒物检测等研究领域。
(4)本发明所述的大口黑鲈脑细胞系可高效表达外源基因，因此可以该细胞系作为细胞模型，用于基因筛选与功能分析，如可筛选加州鲈抗病毒基因及基因功能的研究分析。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同生长代数下细胞形态的观察结果图，其中图1-A表示第5代大口黑鲈脑细胞，图1-B表示第10代大口黑鲈脑细胞，图1-C表示第20代大口黑鲈脑细胞，图1-D表示第60代大口黑鲈脑细胞；
图2为本发明实施例2中不同培养温度下细胞系MSBr的生长曲线；
图3为本发明实施例2中不同胎牛血清浓度下细胞系MSBr的生长曲线；
图4为本发明实施例2中细胞系MSBr的标准生长曲线；
图5为本发明实施例2中细胞系MSBr的染色体分析结果，其中图5-A为染色体数量统计结果，图5-B为核型分析结果；
图6为本发明实施例3中细胞系MSBr对7种病毒的敏感性实验结果。
图7为本发明实施例3中细胞系MSBr接种7种病毒后，细胞内相应病毒的PCR定性检测结果。
图8为本发明实施例3中细胞系MSBr敏感病毒的TCID50测定结果；
图9为本发明实施例4中细胞系MSBr转染pEGFP-N1后荧光蛋白表达检测结果图；
图10为本发明实施例5中细胞系MSBr在抗病毒药物筛选中的应用的检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1大口黑鲈脑细胞的分离和培养
1、实验试剂与材料
(1)实验动物：通过分子方法反复验证未感染水产动物病毒的健康大口黑鲈，大小约10cm，来自湖北省枝江市的大口黑鲈苗种场，养殖于在华中农业大学水产学院基地大棚养殖桶中。
(2)实验器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科镊子、70μm的细胞网筛、注射器、酒精棉和纱布等。
(3)实验试剂：AIM培养液、液体培养基M199、胰蛋白酶-EDTA、青霉素/链霉素10000U/mL、胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；两性霉素B、庆大霉素、秋水仙素购自Biosharp公司；二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司，成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)购自Peprotech公司。
(4)培养液配制：
原代培养液：80mL M199培养液、20mL FBS、1mL青霉素/链霉素(10000U/mL)、100μLEGF(10μg/mL)、100μL FGF(10μg/mL)混合，4℃保存；
传代培养液：85mL或90mL M199培养液、15mL或10mL FBS混合、1mL青霉素/链霉素(10000U/mL)，4℃保存；
PBS缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g NaHPO4，0.24g KH2PO4，溶入三蒸水，调节pH为7.2，容量瓶定容到1L，灭菌锅高压灭菌。
2、原代培养
经过检测的健康大口黑鲈，在实验室内暂养10天，经检测无疾病，开始实验，具体步骤如下：
(1)实验前，用MS-222将鱼麻醉，尽可能地将其血抽干；在75％的酒精浸泡2min，在超净台中无菌条件下取脑组织；
(2)脑组织经无菌PBS缓冲液漂洗2次后，置于适量的AIM培养液中浸泡30min；
(3)将脑组织剪成1mm3大小，加入3～5mL胰蛋白酶-EDTA，于28℃消化20min；
(4)完全培养基(体积浓度20％FBS+M199培养基)终止消化后，所得的细胞悬液过70μm的细胞网筛，并用注射器轻轻按压细胞网筛表面残余的组织碎块，随后将过滤后的细胞悬液在1000r/min的速度下离心7min；
(5)离心后去上清，利用完全培养基(体积浓度20％FBS+M199培养基)重悬沉淀得到重悬混匀液，将重悬混匀液加入到T25细胞培养瓶中，并将其置于28℃，5％CO2培养箱中培养，每天观察细胞的贴壁以及生长情况，待单层细胞达到融合状态时用胰蛋白酶消化，进行传代培养。
3、传代培养
原代细胞70％～80％铺满瓶底时，吸出培养瓶中的旧培养液；向瓶中加入1mL0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，静置消化5min；显微镜下观察，大部分细胞缩短变圆后，吸出胰蛋白酶，利用残留的胰蛋白酶继续消化并轻拍培养瓶，可见部分细胞脱落后，加入新鲜的培养基终止消化；利用玻璃弯管轻轻吹落呈白雾状的贴壁细胞，并轻轻混匀制成单个细胞悬液，加入适量培养基，记录细胞的名称、代数以及日期，置于28℃、5％CO2的培养箱培养；待细胞长满瓶底后，再次胰蛋白酶消化，依据细胞生长速率按比例扩大培养。
早期细胞传代使用原代培养液，6代后细胞较稳定使用含15％FBS的传代培养液，10代后使用含10％FBS的传代培养液。
4、冻存与复苏
细胞冻存：当T25细胞培养瓶中细胞处于对数生长期且细胞单层达到培养瓶底面的80％左右时，进行冻存。吸弃原培养基，加入1mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化，加入1mL的细胞冻存液(900μL胎牛血清+100μLDMSO)制成细胞悬液，将细胞悬液加入冻存管，做好相应标记后放入冻存盒中，于-80℃过夜后，转入液氮罐中(-196℃)保存，并做好相关记录。
细胞复苏：液氮罐中取出冻存的细胞，迅速转移到37℃的恒温水浴中不断摇晃使其快速融化，摇晃过程中勿让冻存管管口没入水中，以免造成细胞污染。待冻存管的冰融化后，用移液枪吸出细胞悬液转入到1.5mL的离心管中，1000r/min离心10min，弃上清以去除冻存液中的DMSO，用1mL 20％胎牛血清的完全培养基沉淀细胞轻轻吹打重悬，移到新的T25细胞培养瓶中，补足适量培养基后放置于28℃、5％CO2恒温培养箱中培养，每天观察复苏后细胞的形态和生长情况。
选取传代10次后，冻存，复苏后能够继续稳定增殖生长的细胞系。将其命名为大口黑鲈脑细胞系(Micropterus salmoides brain cells，MSBr)，并已于2021年03月25日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:C202166。按照上述方法对获得的细胞系第10代、30代进行细胞复苏，发现细胞仍具备较强的增殖能力且状态良好，
对所述脑组织细胞系MSBr每隔3天传代1次，并观察不同生长代数下细胞的形态，结果如图1，其中图1-A为第5代大口黑鲈脑细胞，图1-B表示第10代大口黑鲈脑细胞，图1-C表示第20代大口黑鲈脑细胞，图1-D表示第60代大口黑鲈脑细胞。按照上述传代培养的培养条件培养，观察发现各细胞生长旺盛，并且经过400多天的连续培养，已经成功传代超过65代，且目前生长状态良好。
实施例2大口黑鲈脑细胞的最适培养环境、生长曲线及染色体分析
1、大口黑鲈脑细胞系MSBr最适培养温度
选择16、22、28、37℃四个不同培养温度，使用添加10％FBS的M199培养液，调整细胞密度为1×105个/mL，细胞悬液按500μL/孔的量接种于12孔板并置于4个不同培养温度培养箱里。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养5d，连续计数5次，绘制其生长曲线，不同培养温度下的细胞生长曲线如图2所示。结果显示，大口黑鲈脑细胞系MSBr在四个温度下均能生长，其中28℃为MSBr细胞的最佳培养温度。
2、大口黑鲈脑细胞系MSBr最适胎牛血清浓度
分别配制含2％、5％、10％、15％体积浓度FBS的M199培养液，调整细胞密度为1×105个/mL，4种胎牛血清浓度培养基各按500μL/孔的量接种于12孔板，于28℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养5d，连续计数5次，绘制其生长曲线。不同胎牛血清浓度下的细胞生长曲线如图3所示。结果显示，在28℃培养条件下，胎牛血清比例从2％增加到15％，MSBr细胞的生长速率随胎牛血清比例的增加而增加，其中胎牛血清的体积浓度为10％或15％时最佳。
3、大口黑鲈脑细胞系MSBr的标准生长曲线
取第25代大口黑鲈脑细胞，利用Trypsin-EDTA消化后调整细胞密度为1×105个/mL，按500μL/孔的量接种于12孔板，于28℃的培养箱中培养。每天取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线并计算细胞群体倍增时间，结果如图4所示，结果显示，MSBr细胞贴壁生长的前2d为迟缓期，第2-5d为对数生长期,第5-6d为平稳期，第6d后便进入衰退期。经计算，大口黑鲈脑细胞的群体倍增时间为49.6h，表明继代培养大口黑鲈脑细胞的生长与分裂势头仍然十分旺盛。
4、大口黑鲈脑细胞系MSBr的染色体分析
向第26代MSBr细胞于对数生长期加入终浓度为15μg/mL的秋水仙素，28℃处理4h后收集细胞；6-7mL的冰水低渗处理30min，1000r/min离心7min；加入2mL固定液(V甲醇：V冰醋酸＝3:1)预固定2min，随后加至5mL，固定15min；1000r/min离心7min去上清后，加入5mL固定液，固定15min；利用冷滴片法滴片，干燥后，用5％的Giemsa染色30min。镜检，结果如图5所示。通过对80个图像清晰、分散较好的中期分裂相大口黑鲈脑细胞的染色体进行统计计数，其中图5-A为染色体数量统计结果，结果显示MSBr染色体数分布从34到62不等，其中染色体众数为48的细胞占全部计数细胞的47.5％。核型分析结果如图5-B，核型公式为2n＝48＝22m+8sm+18t，即MSBr细胞染色体有11组中部着丝点染色体(m)，4对亚中部着丝点染色体(sm)，9对端部着丝点染色体(t)。
实施例3大口黑鲈脑细胞系MSBr对于不同病毒的敏感性测试
1、大口黑鲈脑细胞系MSBr对不同水生动物病毒的敏感性实验
细胞经用Trypsin-EDTA消化后调整细胞密度为1×105个/mL，按1mL/孔的量接种于6孔板。当细胞刚刚长满孔板时，PBS缓冲液清洗两次后，将1MOI的不同病毒(大口黑鲈弹状病毒MSRV、鲤春病毒血症病毒SVCV、草鱼呼肠孤病毒GCRV、蛙虹彩病毒RGV、赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV、传染性造血器官坏死病病毒IHNV、传染性脾肾坏死病毒ISKNV)7种病毒接种于本发明的大口黑鲈脑细胞系MSBr，接种量是200μL。接种后观察细胞产生CPE情况，以未接种病毒的细胞作为对照(NC)，结果如图6所示；并用PCR进行定性检测，结果如图7所示。结果显示，其中接种了病毒MSRV、SVCV、GCRV、RGV、RGNNV、IHNV的细胞内出现明显的细胞病变(CPE)，并且在细胞中检测到了相应的病毒基因，而接种了病毒ISKNV的细胞无明显细胞病变也未在细胞内检测到相应的基因，说明大口黑鲈脑细胞系无法增殖病毒ISKNV，可增殖病毒MSRV、SVCV、GCRV、RGV、RGNNV、IHNV，这为水生动物病毒的相关研究提供了有力的材料。
2、敏感病毒接种MSBr细胞的TCID50测定
为了比较MSBr对MSRV、SVCV、GCRV、RGV等6种病毒的增殖效果，根据Reed-Muench法测定病毒效价的原理，取生长良好的MSBr细胞经消化后取样计数，用M199液体培养液将细胞按照1×105个/mL的浓度进行稀释，以100μL/孔的初始量接种到96孔板培养24h使细胞充分贴壁。次日，取出细胞板弃尽生长液，每孔添加100μL含5％FBS的M199维持液，然后将待检病毒样品按稀释倍数由低到高的顺序以100μL/孔分别添加到96孔板的2～11列各孔中，1、12列各添加100μL/孔，5％FBS的M199维持液作为阴性对照，该实验设2个重复。将细胞板于28℃、5％CO2培养箱中培后观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)并记录终点，根据Reed-Muench法测定病毒效价的原理，测定不同病毒的TCID50情况，结果如表1和图8所示。
表1 细胞系MSBr敏感病毒的TCID50测定结果
Figure BDA0003006370660000101
结果显示，上述6种病毒的增殖效率为104.495至107.665TCID50ml-1，其中GCRV病毒增殖效率最高为107.665TCID50ml-1，其次为病毒SVCV，增殖效率为106.665TCID50ml-1。
实施例4大口黑鲈脑细胞系MSBr的转染实验
取第28代MSBr细胞利用Trypsin-EDTA消化后调整细胞密度为1×105个/mL，按2mL/孔的量接种于6孔板，待细胞每孔铺满80～90％后，开始转染。取一个洁净无菌的离心管，加入200μL Opti-MEM培养液，加入2.0μg pEGFP-N1质粒，分别按照1：2与1：3加入4μLFishTrans或者6μL PEI转染试剂，用移液器轻轻吹打混匀，室温静置20min。将培养有细胞的6孔板每孔换成2mL新鲜培养液(含有胎牛血清)，按照六孔板每孔200μL转染试剂-pEGFP-N1混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀，按照同样操作进行PEI转染。继续培养24小时后，进行GFP荧光融合蛋白的观察，荧光蛋白表达的检测结果如图9所示。结果显示，在转染24h后，MSBr细胞能观察到强烈的绿色荧光信号，说明GFP基因可以被启动子CMV启动表达，细胞系MSBr可以表达外源基因。通过荧光显微镜观察的方法来确定转染效率，检测结果显示，转染效率可高达25％以上。
实施例5大口黑鲈脑细胞系MSBr在抗病毒药物筛选中的应用
以加州鲈弹状病毒MSRV为例，用大口黑鲈脑细胞系MSBr来验证芒果苷和牛磺酸在抑制MSRV病毒中的作用。
1、芒果苷在治疗或预防MSRV中的应用
接种大口黑鲈脑细胞系MSBr于6孔板，待长到70～80％单层后，吸弃培养液，分别加入含有0、12.5、25、50、100μg/mL芒果苷和PBS的完全培养液预处理8h，吸弃培养液，用100μL浓度为0.1MOI的MSRV病毒吸附细胞，28℃孵育1h，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度芒果苷和PBS的完全培养基，28℃、5％CO2培养箱中继续培养48h(每个浓度处理设置三个独立重复组)。48h后收集细胞提取总RNA，反转录后荧光定量检测MSRV-G基因表达水平。定量检测MSRV-G基因的引物对为：
F：CCGTCCAAACTAGCAACAT；
R：ATTCGGGTTATCGGTGGC。
定量检测结果如图10所示。结果显示，当芒果苷浓度为12.5μg/ml时MSRV-G基因的极显著降低(p＜0.01)，较对照组下降69.24％；并且随着浓度的增加，抗病毒效果更加明显，其中25μg/ml芒果苷组较对照组下降80.49％，50μg/ml芒果苷组较对照组下降89.74％，100μg/ml芒果苷组较对照组下降90.06％。
2、牛磺酸在治疗或预防MSRV中的应用
接种大口黑鲈脑细胞系MSBr于6孔板，待长到70～80％单层后，吸弃培养液，0、12.5、25、50、100μg/mL牛磺酸和PBS的完全培养液预处理6h，吸弃培养液，用100μL浓度为0.1MOI的MSRV病毒吸附细胞，28℃孵育1h，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度牛磺酸和PBS的完全培养基，28℃、5％CO2培养箱中继续培养24h(每个浓度处理设置三个独立重复组)。24h后收集细胞提取总RNA，反转录后荧光定量检测MSRV-G基因表达水平。定量检测结果如图10所示。结果显示，当牛磺酸浓度为12.5μg/ml时MSRV-G基因的表达显著降低(p＜0.05)，较对照组下降37.32％。当牛磺酸浓度为25μg/ml和50μg/ml时基因表达量极显著降低(p＜0.01)，较对照组分别下调61.34％和72.16％。但是当牛磺酸浓度为100μg/ml时，基因表达量相较于对照组仅降低46.05％，即牛磺酸可以抑制MSRV的复制，但是不具有浓度依赖性。
上述实验证实了本发明所述的大口黑鲈脑细胞系MSBr可用于抗水产动物病毒药物的筛选，即细胞系MSBr可作为动物模型筛选可抑制病毒增殖的抑制剂或药物，为水产动物病毒性疾病的诊断、抗水产病毒药物的筛选和评价提供了有力材料，以高效防控相关病毒性疾病。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种大口黑鲈脑细胞系，其特征在于，所述大口黑鲈脑细胞系的保藏编号为：CCTCCNO :C202166。
2.如权利要求1所述的大口黑鲈脑细胞系在水产动物病毒增殖培养和/或水产动物病毒疫苗研制中的应用，所述水产动物病毒为：大口黑鲈弹状病毒、鲤春病毒血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、蛙虹彩病毒、赤点石斑鱼神经坏死病毒或传染性造血器官坏死病病毒。
3.如权利要求1所述的大口黑鲈脑细胞系在外源基因表达中的应用。
4.如权利要求1所述的大口黑鲈脑细胞系在抗水产动物病毒药物筛选中的应用，所述水产动物病毒为：大口黑鲈弹状病毒、鲤春病毒血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、蛙虹彩病毒、赤点石斑鱼神经坏死病毒或传染性造血器官坏死病病毒。
5.如权利要求1所述的大口黑鲈脑细胞系在作为药物评价、基因筛选和功能分析、病原功能研究、细胞工程育种或环境毒物检测的生物模型中的应用。
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