CN114107171A - 鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用。该鹅视网膜上皮细胞系，名称为鹅视网膜上皮细胞GREC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021238，目前已传至80代，形态以梭形细胞为主；病毒敏感性试验显示，该鹅视网膜上皮细胞系对禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒和禽腺病毒敏感；该细胞系可用于培养、分离、检测禽类病毒，制备禽类疫苗，筛选用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。

Description

鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
近年来，国内外禽病频频发生，在各类禽病中，传染性疾病仍是危害禽类养殖业最为严重的疾病，其中尤以病毒性传染病为甚，如H5、H7和H9等亚型禽流感为代表的高致病性禽流感对禽类养殖造成了严重影响。H5N6禽流感病毒是禽流感病毒的一种新亚型，是禽流感病毒H5N1和H6N6重配后“生”出来的流感病毒，对家禽具有高致病性。此外，在养鸡业中，鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊、鸡传染性关节炎频发，养鸭业中较为流行的鸭细小病毒病、鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病，以及鸭副粘病毒病等新型疫病也严重制约着畜禽业的发展。
疫苗免疫是目前有效预防禽病大流行的手段，国内禽类疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”工艺实现。该工艺培养周期长、操作步骤繁琐、生产成本高，大规模生产时存在鸡胚质量不稳定及潜在外源病毒污染问题，收获完成后废胚难以无害化处理，存在病毒扩散风险和污染环境问题。因此，传代细胞系取代鸡胚生产疫苗是大势所趋。随着细胞培养技术的不断发展，细胞基质成为病毒疫苗研发的重要材料。现有报道与研究用于疫苗生产的成熟细胞系，包括Vero，MDCK，Marc145等哺乳类动物细胞，然而，现有的细胞源细胞疫苗主要采用异源细胞作为细胞基质进行生产，免疫原性较差。
目前禽类细胞的研发与成果较少，尚无商品化的鹅源细胞系。而鸭和鹅类病毒的分离多是通过鹅胚或番鸭胚来分离，但是由于目前国内外尚无商品化的无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)鹅胚和番鸭胚，用其分离鹅病毒存在内源病毒干扰等情况，影响病毒的分离。为了更好有效的分离到鸭类和鹅类病毒，及早检测出病毒，预防疾病爆发，许多国内外的学者都在进行禽源细胞系的研究。因此，分离禽类原代细胞，建立可永生化的细胞系，成为突破细胞源疫苗生产的关注点。现在急需建立一株能够稳定快速传代的鹅视网膜上皮细胞系，并应用到多种禽类病毒上。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种鹅视网膜上皮细胞系。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的鹅视网膜上皮细胞系的构建方法。
本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的鹅视网膜上皮细胞系的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种培养禽类病毒的方法。
本发明第五方面的目的，在于提供一种禽类疫苗的制备方法。
本发明第六方面的目的，在于提供一种禽类疫苗。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种鹅视网膜上皮细胞系，名称为鹅视网膜上皮细胞GREC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021238。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系的构建方法，包括如下步骤：1)将鹅眼组织与胶原酶混合，进行第一次消化，得到初步消化的组织碎块，将初步消化的组织碎块与胰酶混合，进行第二次消化，得到第二组织碎块；2)将第二组织碎块研磨，固液分离，得到细胞，加入红细胞裂解液，固液分离，得到细胞沉淀，用第一培养基重悬细胞沉淀，培养，细胞贴壁生长后，更换第二培养基培养，细胞长成单层后，用胰酶消化，然后按0.1～1个细胞/孔的密度接种到培养板中，取单个细胞孔中的细胞生长成克隆团，得到鹅视网膜上皮单细胞株；3)用胰酶消化鹅视网膜上皮单细胞株，继代培养，细胞长成单层后，固液分离，得到细胞沉淀，用第三培养基培养，得到降血清驯化的鹅视网膜上皮细胞；4)用第四培养基培养降血清驯化的鹅视网膜上皮细胞，得到低血清贴壁培养型鹅视网膜上皮细胞细胞系。
优选地，所述胶原酶包括四型胶原酶、胎牛血清白蛋白、青霉素、链霉素和HANKS液。
优选地，步骤2)中所述第二组织碎块的大小为1～2cm3/个。
优选地，所述第一培养基为含9～11％胎牛血清的MEM培养基。
优选地，所述第二培养基为含7～9％胎牛血清的MEM培养基。
优选地，所述第三培养基为含4～6％胎牛血清的MEM培养基。
优选地，所述第四培养基为含2～3％胎牛血清的MEM培养基。
本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系的应用：
本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系在培养禽类病毒中的应用；
本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系在制备培养禽类病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系在分离禽类病毒中的应用；
本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系在制备分离禽类病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系在非诊断治疗目的地检测禽类病毒中的应用；
本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系在制备检测禽类病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系在制备禽类疫苗中的应用；
本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系在药物筛选中的应用，所述药物为用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。
优选地，所述禽类病毒为禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒和禽腺病毒中的至少一种。
优选地，所述禽流感病毒为禽流感H5亚型病毒和禽流感H7亚型病毒中的至少一种；进一步为H5-rFJ56和H7-rGD76中的至少一种。
优选地，所述法氏囊病毒为IBDV-X1。
优选地，所述鸭呼肠孤病毒为NDRV-DH13。
优选地，所述禽腺病毒为FAdV-4。
本发明的第四个方面，提供一种培养禽类病毒的方法，将禽类病毒接种至本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系，培养。
优选地，所述禽类病毒为禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒和禽腺病毒中的至少一种。
优选地，所述禽流感病毒为禽流感H5亚型病毒和禽流感H7亚型病毒中的至少一种；进一步为H5-rFJ56和H7-rGD76中的至少一种。
优选地，所述法氏囊病毒为IBDV-X1。
优选地，所述鸭呼肠孤病毒为NDRV-DH13。
优选地，所述禽腺病毒为FAdV-4。
优选地，所述培养的条件为31～39℃、4～6％CO2；进一步为33～37℃、5％CO2。
本发明的第五个方面，提供一种禽类疫苗的制备方法，将禽类病毒接种至本发明第一方面的鹅视网膜上皮细胞系，培养，灭活，得到禽类疫苗。
优选地，所述禽类病毒为禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒和禽腺病毒中的至少一种。
优选地，所述禽流感病毒为禽流感H5亚型病毒和禽流感H7亚型病毒中的至少一种；进一步为H5-rFJ56和H7-rGD76中的至少一种。
优选地，所述法氏囊病毒为IBDV-X1。
优选地，所述鸭呼肠孤病毒为NDRV-DH13。
优选地，所述禽腺病毒为FAdV-4。
本发明的第六个方面，提供一种禽类疫苗，通过本发明第五方面的制备方法得到。
本发明的有益效果是：
本发明通过发明人的大量创造性劳动，首次构建得到鹅视网膜上皮细胞系，名称为鹅视网膜上皮细胞GREC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021238，目前已传至80代，形态以梭形细胞为主；病毒敏感性试验显示，该鹅视网膜上皮细胞系对禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒和禽腺病毒敏感；该细胞系可用于培养、分离、检测禽类病毒，制备禽类疫苗，筛选用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。
附图说明
图1是实施例3中对照组中鹅视网膜上皮细胞的结果图。
图2是实施例3中鹅视网膜上皮细胞按1‰接毒量接H5-rFJ56毒株36h后的结果图。
图3是实施例3中鹅视网膜上皮细胞按1‰接毒量接H7-rGD76毒株48h后的结果图。
图4是实施例4中鹅视网膜上皮细胞按2.5‰接毒量接IBDV-X1毒株32h后的结果图。
图5是实施例4中鹅视网膜上皮细胞按5‰接毒量接IBDV-X1毒株24h后的结果图。
图6是实施例5中鹅视网膜上皮细胞按按2.5‰接毒量接NDRV-DH13毒株44h后的结果图。
图7是实施例5中鹅视网膜上皮细胞按按5‰接毒量接NDRV-DH13毒株28h后的结果图。
图8是实施例6中鹅视网膜上皮细胞按按2.5‰接毒量接FAdV-4毒株40h后的结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中所使用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1鹅视网膜上皮细胞系的构建
1.原代鹅视网膜上皮细胞的分离、培养：
(1)取孵化至合适日龄(11d)的鹅胚蛋，选择有丰富血管和有运动的胚体，照蛋标记出气室和胚体位置；
(2)将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75％酒精棉球擦干；
(3)经75％酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；
(4)用眼科镊撕去蛋壳，暴露出鹅胚，用弯头镊轻挑起胚头，取出胚体，放入无菌平皿中，解剖取材；
(5)穿刺鹅胚头部，获得鹅眼组织样本，将样本切碎至0.5～2mm3，得到组织碎块；
(6)将步骤(5)得到的组织碎块放入胶原酶溶液(胶原酶溶液由四型胶原酶、胎牛血清白蛋白、青霉素、链霉素和HANKS液配制而成，其中，四型胶原酶的浓度为0.5mg/mL，胎牛血清白蛋白的浓度为0.5mg/mL，青霉素的为100U/mL，链霉素的浓度为0.1mg/mL)中进行消化(消化条件为37℃下、以15rpm的振动频率振动15min)，过滤，得到初步消化的组织碎块；将初步消化的组织碎块移入0.25％EDTA-胰酶中在室温(25℃)下消化20min，过滤，得到第二组织碎块；
(7)将第二组织碎块调整为1～2cm3/个后，进行研磨，过滤，离心(1000rpm下离心10min)，收集细胞；加入红细胞裂解液，吹打，室温静置，离心(1000rpm下离心10min)分离得到细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于含10％胎牛血清的MEM培养基中(细胞密度为2×103个/mL)，得到细胞悬液放置于T25细胞培养瓶中，然后转入水套式恒温二氧化碳培养箱中进行培养(培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度为5％)。
2.鹅视网膜上皮细胞的获得：步骤1中的细胞贴壁生长后，每日更换新鲜培养基(含8％胎牛血清的MEM培养基)，直至贴壁培养细胞长成单层，用0.25％EDTA-胰酶进行消化处理至单个细胞，然后，按照平均0.5个细胞/孔的密度接种到96孔板中，标记接种单个细胞的孔，待这些单个细胞孔中的细胞生长成克隆团后即可得到鹅视网膜上皮单细胞株。
3.鹅视网膜上皮细胞传代驯化：用5g/L的胰蛋白酶溶液消化成团的单细胞株30s，然后继代培养10代，获得一株形态统一的鹅视网膜上皮细胞株。
4.鹅视网膜上皮细胞降血清传代驯化：待步骤3中鹅视网膜上皮贴壁细胞长成单层，用0.25％EDTA-胰酶消化分散鹅视网膜上皮贴壁细胞，1000rpm 5min离心获得细胞沉淀，采用含5％胎牛血清的MEM培养基进行培养，培养条件为37℃，5％CO2；连续培养5代后，获得降血清驯化的鹅视网膜上皮细胞。
5.鹅视网膜上皮细胞悬浮细胞低血清驯化：用含2.5％胎牛血清的MEM培养基将步骤4中最后一代培养的鹅视网膜上皮细胞直接换液传代，继续培养10代，培养条件为37℃，5％CO2，驯化得到低血清贴壁培养型鹅视网膜上皮细胞细胞系。
上述低血清贴壁培养型鹅视网膜上皮细胞细胞系构建过程中每进行5次传代，则冻存细胞，建立细胞库。
上述低血清贴壁培养型鹅视网膜上皮细胞细胞系，名称为鹅视网膜上皮细胞GREC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021238。
实施例2鹅视网膜上皮细胞系的特性
1.形态学观察
通过倒置显微镜观察上述鹅视网膜上皮细胞细胞系第35代的细胞形态，结果如图1所示：鹅视网膜上皮细胞与成纤维细胞相似，表面平滑、饱满，形状成梭形，整体细胞大小要比正常的成纤维细胞大。
实施例3禽流感H5亚型病毒、禽流感H7亚型病毒感染鹅视网膜上皮细胞系的敏感性
取鹅视网膜上皮细胞系第35代细胞，在37℃、5％CO2下培养48h生长稳定后，在超净工作台中弃去大部分培养液，只留下1～2mL，分别加入10μL、25μL和50μL的H5-rFJ56(HA＝9Log2)毒株(已在文献：方琳,朱辉,黄皓源,彭思力,覃海康,梁昭平.不同MDCK单克隆细胞株对H5亚型禽流感病毒增殖条件和放大工艺的研究[J].动物医学进展,2020,41(04):38-41.中公开)孵育30min，弃去瓶中液体后加入10mL含2.5％胎牛血清的MEM培养基；对照组加入10mL含2.5％胎牛血清的MEM培养基。接毒24h后(接毒后培养条件为33℃、5％CO2)，每隔4h观察细胞病变情况，并收集细胞毒液做HA检测。结果如图1、图2以及表1所示：对照组中鹅视网膜上皮细胞表面平滑、饱满，形状成梭形，正常传代下48h左右能长满；接种禽流感H5亚型病毒后，出现病变现象：细胞开始边缘皱缩，细胞内部开始出现空泡，有部分细胞直接死亡漂浮在液体上方；鹅视网膜上皮细胞按1‰的接毒量接毒64h后，HA达到8Log2，按2.5‰接毒量接毒48h后、按5‰接毒量接毒28h后，HA达到9Log2；可见，鹅视网膜上皮细胞对禽流感H5亚型病毒敏感。
表1鹅视网膜上皮细胞接H5-rFJ56毒株结果
H5-rFJ56毒株接毒量 收毒时间 HA
10μL(1‰) 66h 8Log<sub>2</sub>
25μL(2.5‰) 48h 9Log<sub>2</sub>
50μL(5‰) 29h 9Log<sub>2</sub>
取鹅视网膜上皮细胞系第35代细胞，在37℃、5％CO2下培养48h生长稳定后，在超净工作台中弃去大部分培养液，只留下1～2mL，分别加入25μL H7-rGD76(HA＝9Log2)毒株(已在文献：叶贺佳,仇微红,亓文宝,万红,李敏,许利娜,胡秀美,廖明,梁昭平.H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株灭活疫苗的研制[J].动物医学进展,2019,40(08):44-48.中公开)孵育30min，弃去瓶中液体后加入10mL含2.5％胎牛血清的MEM培养基；以上述对照组作为对照，接毒24h后(接毒后培养条件为33℃、5％CO2)，每隔4h观察细胞病变情况，并收集细胞毒液做HA检测。结果如图1、3所示：对照组中鹅视网膜上皮细胞表面平滑、饱满，形状成梭形，正常传代下48h左右能长满；接种禽流感H7亚型病毒后，出现病变现象：细胞开始边缘皱缩，细胞内部开始出现空泡，有部分细胞直接死亡漂浮在液体上方；按2.5‰接毒量接毒48h后，HA达到9Log2；可见，鹅视网膜上皮细胞对禽流感H7亚型病毒敏感。
实施例4法氏囊病毒感染鹅视网膜上皮细胞系的敏感性
取鹅视网膜上皮细胞系第35代细胞，在37℃、5％CO2下培养48h生长稳定后，在超净工作台中弃去大部分培养液，只留下1～2mL，分别加入10μL、25μL和50μL的IBDV-X1(TCID50＝10-8.5/0.1mL)毒株(已在文献：[3]项瑞.鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒重组蛋白的免疫保护效果研究[D].西北农林科技大学,2021.中公开)孵育30min，弃去瓶中液体后加入10mL含2.5％胎牛血清的MEM培养基，以实施例3中对照组作为对照。接毒24h后(接毒后培养条件为37℃、5％CO2)，每隔4h观察细胞病变情况，并收集细胞毒液做TCID50检测。结果如图4、图5以及表2所示：对照组中鹅视网膜上皮细胞表面平滑、饱满，形状成梭形，正常传代下48h左右能长满；接种法氏囊病毒后，出现病变现象：细胞开始边缘皱缩，仍贴在瓶底的细胞内部开始出现空泡，大部分细胞脱落附在表面；鹅视网膜上皮细胞按1‰的接毒量接毒44h后，TCID50达到10-7.5/0.1mL，按2.5‰接毒量接毒48h后，TCID50达到10-8.0/0.1mL，按5‰接毒量接毒24h后，TCID50达到10-7.3/0.1mL；可见，鹅视网膜上皮细胞对法氏囊病毒敏感。
表2鹅视网膜上皮细胞接IBDV-X1毒株结果
IBDV-X1毒株接毒量 收毒时间 TCID<sub>50</sub>
10μL(1‰) 44h 10<sup>-7.5</sup>/0.1mL
25μL(2.5‰) 32h 10<sup>-8.0</sup>/0.1mL
50μL(5‰) 24h 10<sup>-7.3</sup>/0.1mL
实施例5鸭呼肠孤病毒感染鹅视网膜上皮细胞系的敏感性
取鹅视网膜上皮细胞系第35代细胞，在37℃、5％CO2下培养48h生长稳定后，在超净工作台中弃去大部分培养液，只留下1～2mL，分别加入25μL和50μL的NDRV-DH13(TCID50＝10-4.0/0.1mL)毒株(已在文献：杨惠湖,黄惠兰,袁生,李文俊,姚鑫炎,张玉倩,梁昭平,黄淑坚,张雪莲.新型鸭呼肠孤病毒DH13株结构蛋白σB的原核表达及免疫原性分析[J/OL].中国畜牧兽医:1-9[2021-10-25].中公开)孵育30min，弃去瓶中液体后加入10mL含2.5％胎牛血清的MEM培养基；以实施例3中对照组作为对照。接毒24h后(接毒后培养条件为37℃、5％CO2)，每隔4h观察细胞病变情况，并收集细胞毒液做TCID50检测。结果如图6、图7以及表3所示：对照组中鹅视网膜上皮细胞表面平滑、饱满，形状成梭形，正常传代下48h左右能长满；接种鸭呼肠孤病毒后，出现病变现象：细胞开始皱缩，边缘出现拉丝现象，并且主要出现了合胞体病变现象；鹅视网膜上皮细胞按2.5‰接毒量接毒52h后，TCID50达到10-3.5/0.1mL，按5‰接毒量接毒36h后，TCID50达到10-3.7/0.1mL；可见，鹅视网膜上皮细胞对鸭呼肠孤病毒敏感。
表3鹅视网膜上皮细胞接NDRV-DH13毒株结果
NDRV-DH13毒株接毒量 收毒时间 TCID<sub>50</sub>
25μL(2.5‰) 52h 10<sup>-3.5</sup>/0.1mL
50μL(5‰) 36h 10-<sup>3.7</sup>/0.1mL
实施例6禽腺病毒感染鹅视网膜上皮细胞系的敏感性
取鹅视网膜上皮细胞系第35代细胞，在37℃、5％CO2下培养48h生长稳定后，在超净工作台中弃去大部分培养液，只留下1～2mL，加入25μL的FAdV-4(TCID50＝10-8.0/0.1mL)毒株(已在文献：武宁.LMH细胞感染禽腺病毒血清4型早期miRNAs和mRNAs表达变化研究[D].西北农林科技大学,2020.)中公开)孵育30min，弃去瓶中液体后加入10mL含2.5％胎牛血清的MEM培养基，以实施例3中对照组作为对照。接毒24h后(接毒后培养条件为37℃、5％CO2)，每隔4h观察细胞病变情况，并收集细胞毒液做TCID50检测。结果如图8所示：对照组中鹅视网膜上皮细胞表面平滑、饱满，形状成梭形，正常传代下48h左右能长满；接种禽腺病毒后，出现病变现象：细胞皱缩，大部分细胞变圆脱落；鹅视网膜上皮细胞按2.5‰接毒量接毒42h后，TCID50达到10-7.1/0.1mL；可见，鹅视网膜上皮细胞对禽腺病毒敏感。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鹅视网膜上皮细胞系，名称为鹅视网膜上皮细胞GREC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021238。
2.权利要求1所述的鹅视网膜上皮细胞系的构建方法，包括如下步骤：1)将鹅眼组织与胶原酶混合，进行第一次消化，得到初步消化的组织碎块，将初步消化的组织碎块与胰酶混合，进行第二次消化，得到第二组织碎块；2)将第二组织碎块研磨，固液分离，得到细胞，加入红细胞裂解液，固液分离，得到细胞沉淀，用第一培养基重悬细胞沉淀，培养，细胞贴壁生长后，更换第二培养基培养，细胞长成单层后，用胰酶消化，然后按0.1～1个细胞/孔的密度接种到培养板中，取单个细胞孔中的细胞生长成克隆团，得到鹅视网膜上皮单细胞株；3)用胰酶消化鹅视网膜上皮单细胞株，继代培养，细胞长成单层后，固液分离，得到细胞沉淀，用第三培养基培养，得到降血清驯化的鹅视网膜上皮细胞；4)用第四培养基培养降血清驯化的鹅视网膜上皮细胞，得到低血清贴壁培养型鹅视网膜上皮细胞细胞系。
3.权利要求1所述的鹅视网膜上皮细胞系在(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)培养禽类病毒；
(2)制备培养禽类病毒的产品；
(3)分离禽类病毒；
(4)制备分离禽类病毒的产品。
4.权利要求1所述的鹅视网膜上皮细胞系在(5)～(6)中任一项中的应用；
(5)非诊断治疗目的地检测禽类病毒；
(6)制备检测禽类病毒的产品。
5.权利要求1所述的鹅视网膜上皮细胞系在(7)～(8)中任一项中的应用；
(7)制备禽类疫苗；
(8)药物筛选；
所述药物为用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的应用，其特征在于：
所述禽类病毒为禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒和禽腺病毒中的至少一种。
7.一种培养禽类病毒的方法，将禽类病毒接种至权利要求1所述的鹅视网膜上皮细胞系，培养。
8.一种制备禽类疫苗的方法，将禽类病毒接种至权利要求1所述的鹅视网膜上皮细胞系，培养，灭活，得到禽类疫苗。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：
所述禽类病毒为禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒和禽腺病毒中的至少一种。
10.一种禽类疫苗，通过权利要求8所述的方法得到。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350601A (zh) * 2021-12-21 2022-04-15 广东省华晟生物技术有限公司 樱桃谷鸭成纤维细胞系及其构建方法与应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5989805A (en) * 1995-10-27 1999-11-23 Board Of Trustees Operating Michigan State University Immortal avian cell line to grow avian and animal viruses to produce vaccines
CN103725644A (zh) * 2013-02-06 2014-04-16 山东省滨州畜牧兽医研究院 樱桃谷鸭胚上皮细胞系及其建立方法
CN104152403A (zh) * 2014-08-19 2014-11-19 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系
CN105408469A (zh) * 2013-03-05 2016-03-16 拜欧沐恩公司 禽类胚胎细胞的制备
WO2016087560A1 (en) * 2014-12-04 2016-06-09 Intervet International B.V. Immortalised chicken embryo fibroblasts
CN109913404A (zh) * 2018-12-04 2019-06-21 哈药集团生物疫苗有限公司 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法
CN110272864A (zh) * 2019-07-25 2019-09-24 北京鼎持生物技术有限公司 一种适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法和应用
CN111662882A (zh) * 2020-06-30 2020-09-15 肇庆大华农生物药品有限公司 一种采用mdck细胞系增殖禽流感病毒的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5989805A (en) * 1995-10-27 1999-11-23 Board Of Trustees Operating Michigan State University Immortal avian cell line to grow avian and animal viruses to produce vaccines
CN103725644A (zh) * 2013-02-06 2014-04-16 山东省滨州畜牧兽医研究院 樱桃谷鸭胚上皮细胞系及其建立方法
CN105408469A (zh) * 2013-03-05 2016-03-16 拜欧沐恩公司 禽类胚胎细胞的制备
CN104152403A (zh) * 2014-08-19 2014-11-19 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系
WO2016087560A1 (en) * 2014-12-04 2016-06-09 Intervet International B.V. Immortalised chicken embryo fibroblasts
CN109913404A (zh) * 2018-12-04 2019-06-21 哈药集团生物疫苗有限公司 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法
CN110272864A (zh) * 2019-07-25 2019-09-24 北京鼎持生物技术有限公司 一种适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法和应用
CN111662882A (zh) * 2020-06-30 2020-09-15 肇庆大华农生物药品有限公司 一种采用mdck细胞系增殖禽流感病毒的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WENXIU WANG等: "Establishment and evaluationof thegooseembryoepithelial(GEE)cell line as a newmodelfor propagationof avianviruses", 《PLOS ONE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350601A (zh) * 2021-12-21 2022-04-15 广东省华晟生物技术有限公司 樱桃谷鸭成纤维细胞系及其构建方法与应用
CN114350601B (zh) * 2021-12-21 2022-12-27 广东省华晟生物技术有限公司 樱桃谷鸭成纤维细胞系及其构建方法与应用

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