CN1142999C - 具有附着的分子的固相支持体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有经静电或受控场沉积而沉积其上的至少一种化合物的组合物的固相支持体，其中该化合物附着于该支持体。本发明还提供了制备该固相支持体的方法，包括产生一电磁力以吸引具有第一种电荷的粒子至固相支持体的表面，并将该表面与组成组合物的带电荷粒子接触，从而用该组合物包被表面。本发明还提供了一探针矩阵，其包括经静电或受控场沉积而沉积和附着于固相支持体上的空间分辨的探针。这些方法、支持体和探针提供了结构单元，用于核酸扩增方法和用于构建进行化学过程的装置。

Description

具有附着的分子的固相支持体
根据35U.S.C.§119(e)(l)，本申请要求1997年7月29日申请的临时申请60/054,071的权利。
本申请涉及将试剂附着于固相支持体上的改进的方法以及用附着于固相支持体的试剂进行的分析。
在分析领域，如诊断分析和其它化学过程中，经常需要将分子(特别是但不绝对是大分子)附着于固相支持体，附着的分子经常作为所需靶的捕获导管。例如，在免疫诊断中，通常将蛋白质、蛋白质衍生物或蛋白质类似物附着于固相基质上。在另一个例子中，通常将核酸、核酸衍生物或核酸类似物附着于固相基质上以支持基于核酸的分析。这些固相基质包括膜、微孔板和粒子如微粒。
形成附着的技术已非常成熟，例如通过被动吸附或共价连接附着分子。在某些情况下，将第一种化学物质附着于一固相支持体，然后用该第一种化学物质结合第二种化合物，由此后者借助第一种化合物附着于支持体。抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)一生物素结合系统已被广泛用于提供这种与固相支持体的介导的结合。例如，抗生物素蛋白一生物素结合系统可以使用与第二种化合物共价连接的生物素以及附着于固相支持体的抗生物素蛋白，从而第二种化合物通过生物素与抗生物素蛋白的强结合而附着。
但是现有技术中需要的是增加附着于固相支持体的物质的量以及增加将物质施用于固相支持体的可靠性和可重复性的方法。
本发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了具有经静电或受控场沉积而沉积其上的至少一种化合物的组合物的固相支持体，其中该化合物附着于该支持体。在另一个实施方案中，本发明提供了制备该固相支持体的方法，包括产生一电磁力以吸引具有第一种电荷的粒子至固相支持体的表面，并将该表面与组成组合物的带电荷粒子接触，从而用该组合物包被表面。
在第三个实施方案中，本发明提供了一探针矩阵，其包括经静电或受控场沉积而沉积和附着于固相支持体上的空间分辨的探针。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于核酸扩增的固相支持体，在该固相支持体上的一个或多个位置沉积了下列物质之一或两者：一或多种试剂，其可包括支持核酸扩增反应的引物；或至少一种引物，其中沉积的引物附着于固相支持体。
本发明进一步提供了核酸扩增的方法，包括：提供用于扩增的一或多种引物，其中至少一种引物附着于固相支持体；将固相支持体与预计含有靶核酸的样品材料接触，从该靶核酸可以经引物介导扩增出扩增子核酸；如果样品含有靶核酸则扩增出扩增子核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于进行化学过程的装置和相关方法。
附图的简要描述
图1示出浮动电极装置。
图2示出物质A和物质B的沉积模式。
图3A和图3B示出已沉积有物质的多孔板。
图4示出具有受控释放特征的基质。
图5示意性示出使用根据本发明制备的固相支持体的核酸酶保护分析。
图6示出作为进行化学过程的装置的一部分的叠置在一起的三层物质。
定义
为了本申请的目的，下列术语应该具有以下所示的含义。特别是，为了解释权利要求书，这些术语的定义应该控制在此处所出现的其它文献中的相反词义的任何意义之外。
●附着(Attached)
对于″attached″、″attachment″、″attaching″以及相关词汇，本申请人意指使化合物结合或吸附到具有足够强度的固相支持体表面上，以便在具有以下这样的前提下在该表面进行液固相化学过程，该前提是化合物将保持结合在固相支持体上或者至少足够量的化合物将保持结合，从而不破坏该过程的意图。例如，化学过程是以表面结合的化合物不会被提取到所接触的液体中为前提的，这是由于，例如，表面结合的化合物不会较好地存在于本化学过程的随后的液相步骤中；然而，化合物被提取到所接触的液体中的有害程度取决于特定的反应方法。类似地，化学过程是以具有足量的表面结合的化合物仍然在产生与表面相关的检测信号时起作用为前提的。在一个优选的实施方案中，至少具有大约10％(更优选的是至少大约20％，还要优选的是至少大约50％，再进一步优选的是至少大约80％，还要进一步优选的是至少大约95％)的化合物在化学反应之后仍然结合在表面上。在一个特别优选的实施方案中，有超过约99％的表面结合的化合物在化学过程之后仍然结合在表面上。
●干式沉积(Dry deposited)
材料如果在没有被加入到液体赋形剂中的情况下而发生沉积，则称作“干式沉积”。
●共价附着化合物的命名原则
其中，化合物借助共价键附着到固相支持体上，这种结合实际上意指最初沉积的化合物与最后附着到支持体上的化合物从严格的化学意义上讲是不同的。然而，为了本申请的目的，所沉积的化合物与以共价附着到固相支持体上而形成的衍生物是充分一样的，特别是感兴趣的化合物的性质保持为附着到固相支持体上的形式。
●核酸
用于本发明的核酸序列优选的是脱氧核糖核酸。然而，也可以是核糖核酸序列或核酸类似物，设计保持核酸的氢键以及碱基配对性质的有意义的化合物，但是在例如对核酸酶的敏感性方面却与天然核酸不同。
●引物
在核酸扩增反应中作为序列特异性探针的相对较短的单链核酸。在最严格意义上，引物可以是核酸聚合酶引物，其与靶核酸的一条链退火并作为起始的引物聚合物被聚合酶活性延伸，或者以一些其它方式其可以作为探针，如当其与合适的核酸退火时可以进行连接酶催化的连接反应。
●探针
探针是附着于用于介导至少一部分化学过程的固相支持体的任何化合物。
●实质上推迟
“实质上推迟”溶解到第二液体中意指充分延迟，从而只要在一特定的时间段之前将样品加入到给定的孔或其它反应容器中，对时间敏感的测试方法就可以基于第一液体加入到孔中的时刻而不是在样品加入的时刻进行。
本发明的详细描述
本发明的优点通过首先经静电或“受控场”沉积将待附着于支持体的化合物沉积而实现。这些技术使得能进行物质的可重复和受控沉积，并加快沉积过程产生附着的分子。
静电或受控场沉积技术已被用于将药物沉积在基质上。在制备药物的干粉吸入器时，希望的是使沉积后的物质相对松散地与基质结合。然而，除非特殊注意，经静电或受控场沉积而沉积的化合物随时间延长趋于与基质越来越紧密地结合。1996年6月10日申请的美国专利申请08/661,213注意到了这一问题，其是有关吸入器的一个潜在的问题(这一申请引入本文作参考)。然而，为了本发明的目的，这一结合效应是有利的，因为观察到的紧密结合有助于形成化合物与固相支持体的附着。
下文描述了用于下述目的的沉积，(a)将一或多种化学物质与固相支持体结合或者(b)沉积一层可释放的试剂，如可以支持化学过程。尽管本发明的主要方面是具有附着的化合物的固相支持体，只要例如通过加入合适的液体，能方便地在固相支持体上进一步沉积易于使用的计量量的支持化学过程的试剂，固相支持体也可以用于分析或其它化学过程中。与本申请同时递交的文档号为SAR12522、发明名称为“用于化学过程的沉积试剂”的专利申请(Loewy等人)，描述了沉积计量量的试剂以作为支持化学过程的试剂库。这一申请引入本文作参考。
A. 制备具有附着的化合物的固相支持体
1. 静电和受控场沉积
在静电沉积方法中，基质被充分电分离，从而静电荷能够聚集到基质上。聚集电荷的一种方式是利用光电效应的优势。在这种方法中，将基质暴露到对来自基质表面的条电荷(strip charges)(特别是电子)有效的电磁辐射中。其它方法包括摩擦生电、等离子处理、感应充电和电晕充电。在一个更优选的方法中，使离子发射器定向于在其上欲产生电荷的表面并运行起来。这些可控制地静电沉积带电材料(例如粉末)的离子印片(ion printing)的方法详细地记载在申请号为08/471,889(申请日：1995年6月6日)、08/659,501(申请日：1996年6月6日)和08/733,525(申请日：1996年10月18日)的美国专利申请中，这些文献在此全部作为参考文献。
应该注意到，沉积材料的带电粒子的平均荷质比例是已知的，有效沉积的粒子的质量可根据预先聚集在基质上的电荷量而相对精确地预测出来。特别是，对于所给出的基质类型，可编辑校准数据库。对于所施用的离子的给定的平均荷质比，可校准所聚集的电荷与沉积质量在一系列给定的材料和充电条件方面的关系。在生产规程中，利用诸如1996年6月10日提出的美国专利申请08/661,211和08/661,210中所述的测速仪和改进的石英晶体监测器可监测粒子的平均荷质比。这些文献在此全部作为参考文献。该直观的荷质监测器通过将电压施加到晶体(例如石英晶体)上而获得振动频率、监测当暴露给带电粒子时振动频率的变化以及使这些变化与撞击监测器的粒子质量相关来起作用。另一荷质监测器利用C.B.Schein和J.Cranch在J.Applied Phys.46：5140，1975中所述的罐笼排出方法(cage blowoff method)。由于使用了一个或多个荷质监测器，反馈回路可并入沉积装置的电控制中。在一个优选的实施方案中，使荷质监测器定位以便取样于源极(例如以下所述的源极装置)处的粒子荷质并使电荷监测器(例如用于测定带电粒子沉积物所产生的电流的装置)定位在沉积物部位的附近。在这两个部位所产生的取样值提供了沉积装置运作的诊断数据。
也可以利用许多其它方法来监测沉积在固相支持体上的材料的量。例如，光学方法能够包括利用具有宽或窄谱带宽度的激光或非准直光测定反射度、透射性或荧光度。还可利用其它定向电磁能，例如利用X射线吸收或荧光或微波吸收。可利用调谐电路来监测这样一个端点(endpoint)，即在该端点，沉积材料与能源(例如微波能源)产生共振。还可利用声吸收，其中优选的声源是超声源。另一典型的测试方法利用了表面光度计，它是一种激光装置，该装置测定被具有沉积材料的表面偏转的光束的量从而测定所沉积的材料的深度。其它电学方法包括测定与固相支持体有关的导电材料(例如掺和到固相支持体中的导电材料或其附近定位有固相支持体的导电材料)和另一导体之间的电容值，其中所沉积的材料位于两个导体之间。
可监测或控制各种其它因素从而增大由带电的沉积材料源极产生的荷质比的可重复性。例如，控制局部环境的湿度、需要沉积的材料中所结合的溶剂的性质和含量、需要沉积的材料的纯度、以及在摩擦充电过程中生效的摩擦速度是重要的。
将带电的沉积材料吸引到表面上的另一方法业已定义为“受控场沉积”，该方法特别牵涉到将一个电位施加到一个电极上，它直接或间接导致在将沉积有带电材料的表面上形成引力电场。例如，基质在沉积表面之下定位有电导体，并且施加到导体上的电位导致在表面上形成引力场。由于基质表面与导体之间的间隙相当小，因此一旦外部电位不再施加到导体上，沉积材料的电荷就会导致导体中的电荷的重新分布，从而在沉积材料与导体之间形成了静电″析象″力(electrostatic″image″force)，借此有助于稳定沉积材料对表面的粘附性。
其它产生电场的装置的例子包括利用“浮动电极”。浮动电极是一种由于浮动电极中电荷的重新分布而产生了局部场的电极，它是例如通过在一个或多个邻近的偏压电极两端施加电压而产生的。这样，例如，如图1所示，浮动电极装置10具有底板电极20、非导电层30、屏蔽电极60和浮动电极70。在这个图示的浮动电极中，在底板电极和屏蔽电极(这两个电极作为偏斜电极)两端施加的偏置电位引起浮动电极中的电荷的重新分布，从而在浮动电极中产生带电粒子引力场。关于浮动电极的其它描述以及用于受控场沉积的其它形式的产生电场的装置都记载在1996年6月10日提出的申请号为08/661,210的美国专利申请中，在此全部作为参考文献。浮动电极装置的优点是由于浮动电极中所产生的电磁场而将有效粘附的带电粒子的量取决于偏置电位的大小(对于更直接的产生电磁场的装置，只要电位施加在其上，沉积就会基本连续地进行)。
用于受控场沉积的产生电场的装置被设计成以下两种方式：(a)直接将沉积材料施加到合并有电极以便产生电场的装置上，或(b)与静电吸盘(例如场应用结构)一起使用，该吸盘与其上将施加有沉积材料的基质结合起来运作。在前一种(a)情形中，一般希望用于生产电极的敷金属法易受批量生产工艺的影响。例如，利用平版印刷技术产生敷金属，在该技术中，需要或者通过将金属层粘附或熔融到基质上而形成细微的图形电极。在(b)设计中，静电吸盘一般对将基质静电粘附到吸盘上是有效的。基质对吸盘的这种粘附性并不取决于所用的在基质上产生电荷的任何方法，而是由于响应静电吸盘产生的电场而使电荷在基质中重新分配的结果。于是，基质上的电荷能有效地用于增强静电粘附性。第三种选择是将基质设计成与提供电极的设备反向耦合，从而使基质与耦合设备形成了一个产生电场的装置。在这种方式中，决定生产成本的电极结构与其上沉积有进行化学过程的试剂的消耗品是分开的。除了以上所述的文献之外，有关电极结构和静电吸盘的其它资料可在1996年4月9日提出的申请号为08/630,012的美国专利申请中找到，此文献在此全部作为参考文献。
诸如利用等离子处理、辐射处理(包括用适当的高能电磁辐射来处理)或离子轰击可产生施加于基质上的粒子的电荷。然而，更优选的是，通过摩擦生电产生电荷，其中两种具有不同摩擦电常数的材料相互摩擦并在彼此之间迁移电荷。摩擦生电比大多数产生电荷的方法更优选，这是因为它使粒子暴露给极少量的反应加速能，从而摩擦生电方法极少会使化合物发生降解。可用于摩擦生电的材料的例子有聚四氟乙烯(″TEFLON″)和三氟氯乙烯、氯化丙烯、氯乙烯、氯化乙醚、4-氯苯乙烯、4-氯-4-甲氧基-苯乙烯、砜、表氯醇、苯乙烯、乙烯、碳酸酯、乙烯-醋酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、乙酸乙烯酯、乙烯基丁醛(vinyl butyral)、2-乙烯基吡啶苯乙烯、尼龙以及环氧乙烷的聚合物。例如，参见K.C.Frisch和A.Patsis在″聚合物的电学性质(Electrical Properties of Polymers)″(Technomic Publications，Westport，CT)上的题目为“聚合物的摩擦起电”这篇文章，此文章在此全文作为参考文献。例如，聚四氟乙烯和聚乙烯以及其它带负电荷的材料一般将在物体上产生正电荷。尼龙和其它带正电荷的材料一般将在物体上产生负电荷。摩擦生电和用于分配带电粒子的设备记载在申请号为08/659,501(1996年6月6日提出)和08/661,211(1996年6月10日提出)的美国专利申请中。特别是，申请号为08/661,211的美国专利申请描述了一种利用振动能和选通电场来分配用于沉积在基质上的带电粒子的声分配器，该文献在此全文作为参考文献。
在一些实施方案中，带电粒子可由湿的色料组成，其中使液体材料粒子或具有悬浮固体的液体材料粒子充电。诸如通过在形成粒子的那一刻进行摩擦生电、利用固体粒子和这些粒子之间的接触电位差、或者利用表面处理物质(例如表面活性剂)改进电位差可给液体粒子充电(参见L.B.Schein，″电子照相术和显影物理学(Electrophotography and Development Physics)″，Laplacian Press，1996，p.227)。通常，受欢迎的是干式沉积材料，这可以避免化学物质的溶解性和稳定性的问题。然而，另一方面，液相沉积物通常也是实用的，特别是在使用警戒程序(例如限制暴露给液相的时间以及选择合适的支持体溶剂)的情况下。例如，液相分布是有用的，在此待沉积的材料不易转化成可沉积的干燥形式，或者未沉积的干式形式没有保持诸如生物活性这样的活性。
2. 图案形式的沉积和多余粒子的消除
可利用静电或受控场沉积方法将材料的图案施加到基质上。例如，可在基质100上形成沉积材料A和沉积材料B的图形(如图2所示)。在本发明的一些实施方案中，沉积图案是高度密集的，例如每平方英寸有300、600或更多的点(dpi)。在优选的实施方案中，沉积物之间的间隙至少大约为5μm，而沉积物的宽度至少大约为10μm。
沉积过程之后，在一些实施方案中需要除去未粘附的粒子。这个消除过程在将两个分开的沉积材料图案施加到基质上的实施方案中尤为重要，这是因为在随后沉积有材料B的部位可能会发现有多余的材料A。除去这些未粘附的“背景”粒子的方法包括冲洗法(例如利用特别不导电并且不增溶的溶剂轻微冲洗)、吹拂法(例如利用惰性气体轻吹)、摇动法或者应用电子刷(electronic brush)。电子刷是任何经校准或可校准并定位以便施加一个在粒子上产生力的电场的设备，其中可机械或电子操纵电场和所产生的力，来便除去未粘附的带电粒子。
再参照图2，例如假设利用离子印片调理基质100，以便使“A”位置带有负电荷。施加了材料A的带正电荷的粒子之后，未粘附的那些粒子被除去了。然后利用离子印片调理“B”位置并施加材料B的适宜的带电粒子。正如以下所要进一步讨论的，可以将其它层施加到含有惰性物质(对于基质的作用是惰性的)的基质上，并且这些其它层通常可以被施加，而不需要图形形式的沉积，或者，用降低对沉积量的精确测量的要求来沉积。因此，经常利用静电或受控场沉积之外的方法施加这些层。例如，在A材料沉积之后，用一层材料包被基质，从而形成一个隔离层，然后利用离子印片使隔离材料的顶层处于良好状态以接收材料B。
3.从沉积的分子产生附着的分子
典型地，分子附着于固相支持体是通过将分子的溶液与支持体保温并经质量作用以实现与支持体的被动吸附或与支持体上的基元的共价附着。在本发明中，大量的物质包被于支持体上，从而增加了与潜在的反应位点相邻的物质的量并增加了使物质与支持体附着的过程的效率。附着过程可涉及任何物理力，如果物理力聚集体与物质(通常是化合物)的结合足以支持以这种附着为前提的预期的化学过程。这些物理力包括磁力、电力、重力、离子结合、疏水作用、堆积力(如van der Waals相互作用)和共价结合。
一旦物质沉积在固相支持体上，沉积的化合物与支持体的结合可以实现附着，因为本文中已定义该术语为不需主动施加任何进一步的处理步骤。然而在某些情况下，进一步的处理可能是需要的。增加沉积的化合物与基质之间的附着的方法可以包括：
(i)将包被的固相支持体储存一段足够的时间以增加固相支持体与沉积的化合物之间的结合强度；
(ii)在沉积的化合物或固相支持体中产生反应性基元(如自由基)以进行反应形成化合物与支持体之间的共价附着；
(iii)在表面提供掺入到支持体中的反应性基元并将化合物与反应性基元反应以将化合物与表面进行共价结合；
(iv)保持吸引带电粒子至表面支持体的场足够的时间以增加固相支持体和化合物间的结合强度；
(v)用足以溶解部分沉积的化合物的液体湿润包被的表面，但优选不加入足以将沉积的化合物从固相支持体洗脱的液体；或者
(vi)加热包被的表面。
上述第(ii)项引述了产生导致化合物和固相支持体之间的交联的反应性基元的方法，实现这种交联的一种最常见的方法是将包被的固相支持体暴露于离子辐射下如光或高能辐射以产生自由基。这种附着已被用于将核酸与固相支持体如尼龙滤膜偶联(见Ausubel等，分子生物学中的简明方案(Short Protocols In Molecular Biology)，第2版，John Wiley & Sons，1992，pp.2-29至2-30)。在一相关方法中，当暴露于离子辐射时至少一种化合物产生一反应性基元。暴露于试剂如甲醛、戊二醛和其它交联试剂(如Means and Feeney，蛋白质的化学修饰，Holden-Day，1971和Pierce化学公司，Rockford，IL的产品目录中所述)也可用于产生交联。第(iii)项的反应性基质包括例如掺入光化学反应化合物的基质。
如上所述，沉积的物质随时间而更紧密地与支持体结合。当电磁吸引力保持在原位以吸引沉积的带电粒子至固相支持体时，据信堆积过程将加速，从而支持体和在沉积的物质中的化合物之间的接触将增加。借助于这种增加的接触，附着键的形成速率将增加。吸引力可以是相对较高的电场或小的力如析象力。
第(v)项的湿润处理能使相对较大量的化合物位于表面附近，在此进行附着处理，同时也获得某些溶液处理的利益以促进包被的化合物和表面结构间的相互作用。
4. 洗涤
可以生产这样的固相支持体，其中沉积的化合物的量控制在少于固相支持体可以附着的量。在这种情况下，随后可以不需采取措施以保证在将固相支持体用于化学过程之前从固相支持体洗涤去掉过量的沉积的化合物。或者，(使用固相支持体的)化学过程所用的方案可以在非粘附化合物干扰化学过程的效率之前有效地洗掉任何非粘附化合物。然而，在某些情况下希望在将固相支持体用于化学过程之前洗脱掉弱粘附的化合物。适合这种洗涤的条件将根据固相支持体的性质及化合物的性质而变化。最低限度的洗涤条件可以包括用至少一种液体洗涤，在化学过程中固相支持体将与该液体接触。为保证只有非常紧密附着的化合物留在固相支持体上，可以选择能更有效地抽提化合物而不是在化学过程中固相支持体所暴露于的任何其它化合物的条件。然而，这些条件应该是所粘附的化合物能保存或能恢复化学过程所需的性质。例如，如果蛋白质粘附于固相支持体，这种洗涤可以包括使用去污剂如非离子型去污剂(例如烷基苯氧基聚环氧乙烷如NP-40(Sigma化学公司，St.Louis，MO))的水洗。对于许多蛋白质和分析，如果确定去污剂导致的变性是可逆的，所用的去污剂应仅仅是变性去污剂。(注意在某些情况下，蛋白质保持其天然构象对于化学过程是不重要的。)
5. 支持体、容器以及孔状盘
支持体可以是具有一定刚性的固体例如玻璃、瓷器、硅胶、塑料等。支持体也可以是柔性材料，例如塑料或其它合成材料、天然聚合物材料或其衍生物(例如纤维素或丝织品)等等。在某些实施方案中，支持体是刚硬或柔韧的多孔材料，例如烧结玻璃、包括机织织物的经纬交织的纤维、以及诸如此类。在某些实施方案中，固相支持体是多孔的珠或小丸。在一固相支持体是多孔材料的实施方案中，支持体材料在沉积物之间熔融。在这种情况下，基质上具有沉积物的部位是多孔的，但在两个沉积物区间之间的部位却是无孔的。因此基质具有使液体流过基质的限定通道。
其上沉积有试剂或附着有化合物的基质能够构成要进行化学过程的容器的一部分。特别是，基质是诸如利用塑料的模压方法或在各种材料上利用蚀刻或激光钻孔技术制成的孔状盘(例如参见1996年4月9日提出的申请号为08/630,018的美国专利申请，在此一并作为参考文献)。这种容器能够具有相关的若干导电层，这些导电层能形成用于控制场沉积的电极(其中导电层例如可与提供电位的电线相耦合)或提供一个支持有助于保留带电粒子的析像力的导电层。例如，图3A和3B示出了分别包括孔202和212的基质201和211。在孔202和212中分别沉积有沉积物204和214。在图3B中，沉积物214位于孔212底部的凹陷处(未标号)。孔202和212的下面分别是导电层203和213，这些导电层可支持用于保留带电粒子的析像力。沉积物214由两层组成(正如以颜色明暗不同示出的两层)。
在本发明的一个实施方案中，以小丸的形式或其它被加入到要进行化学过程的部位的支持体的形式将支持体试剂加入到要进行化学过程的部位。例如，向许多容器的每一个中加入小丸，并且液体和样品材料的加入启动了化学过程。在这种情况下，选择其上沉积有试剂的初始基质以便在沉积过程之后由此构造出这些小丸(或其它支持体)。另外，初始基质可是一层能够被切成小丸或其它载体的材料。
在某些实施方案中，附着的化合物或试剂沉积在膜、纸、纸衍生物等(下文称作柔性支持体)上，在这些实施方案中，柔性支持体可被用于支持简化的化学过程如将柔性支持体浸入液体如尿或其它体液而起始的分析。由于静电或受控场沉积过程可以产生图案形式的沉积，在这一实施方案(以及任何其它沉积实施方案)中，化合物可以图案形式附着于固相支持体上。例如，如果发生阳性对照化学过程，可以使用条形沉积产生颜色反应，同时可以用第二个相交的条形沉积产生指示实验变量的颜色反应。因此，例如，阴性妊娠试验在第一个条形图案产生颜色(“-”)，阳性结果在两个相交的条形图案处均产生颜色形成“+”字形。
固相支持体可以包括Merrifield在介绍固相肽合成技术时所用的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149，1963。还参见Barany等人，“固相合成的最新进展”，固相合成中的革新和预测：肽、多肽和寡核苷酸，Roger Epton编辑，第二界国际研讨会论文集，1991年8月27-31日，Canterbury，英国，p.29。这些支持体典型地被衍生化以提供一“把手”，在其上可以可逆地附着所需产物的第一个结构单元。在肽合成领域，合适的支持体包括得自Bachem Bioscience，Inc.，King of Prussia，PA的p-烷氧基苄基醇树脂(“Wang”或PAM树脂)，得自Advanced Chemtech，Louisville，KY的取代的2-氯三苯甲游基树脂，得自PerSeptive Biosystems，Framingham，MA的或得自Rapp Polymere，德国的品名为TentaGel的聚乙二醇接枝的聚苯乙烯树脂(PEG-PS树脂)。类似的固相支持体如聚苯乙烯珠也可与寡核苷酸-起用于磷酸三酯途径。见Dhristodoulou，“寡核苷酸合成：磷酸三酯途径”，寡核苷酸缀合物方案，S.Agrawal编辑，Humana出版社，N.J.，1994；Beaucage，“寡核苷酸合成：磷酸酰亚胺途径”，寡核苷酸缀合物方案，S.Agrawal编辑，Humana出版社，N.J.，1994；Froehler，“寡核苷酸合成：H-膦酸酯途径”，寡核苷酸缀合物方案，S.Agrawal编辑，Humana出版社，N.J.，1994；Damha and Ogilvie，“寡核苷酸合成：甲硅烷基磷酸酰亚胺方法”，寡核苷酸缀合物方案，S.Agrawal编辑，Humana出版社，N.J.，1994。寡核苷酸的合适的支持体还包括得自Applied Biosystems，Foster City，CA的可控多孔玻璃(cpg)和聚苯乙烯支持体。本发明中使用的固相支持体还可包括Polymer Laboratories，Amhearst，MA出售的珠。所需的反应位点官能性包括但不限于卤素、醇、胺和羧酸基团。
产生具有反应位点的固相支持体的另一个选择是直接衍生固相支持体以使其能与化合物偶联。为此所用的化学方法可以与用于衍生可控多孔玻璃(cpg)珠和聚合物珠的方法相同或相似。典型地，这一方法的第一步是在支持体上产生羟基(如果其不存在于支持体上)或氨基基团。如果存在或已产生羟基基团，典型地其被转化成氨基基团，例如通过将其与γ-氨基丙基三乙氧基硅烷反应。用环状酸酐、与聚合的烯化氧以及现有技术中已知的其它方法可以将柔性加至氨基基团。这种方法的例子描述于Fields等人，“合成肽：用户指南”，W.H.Freeman and Co.，盐湖城，UT，1991。
产生反应位点的方法包括，特别是当固相支持体由塑料制成时，将固相支持体暴露于反应性等离子体，如在氨水或水存在下经辉光放电产生，以产生NH2基团。这种方法的描述见“聚合物的修饰”，Carraher and Tsuda编辑，美国化学协会，华盛顿特区，1980。另一种方法特别适合用于玻璃、陶瓷或聚合物基质，其是通过在低温下蒸汽沉积而沉积一层一氧化硅膜以产生羟基官能性。玻璃表面可用碱如KOH或NaOH在水或水/醇混合物中的溶液处理以暴露羟基官能性。
非退火的硅酸硼玻璃表面，包括由化学蒸汽沉积产生的非退火的硅酸硼玻璃涂层可用溶解于水中的氢氟酸蚀刻以溶解富含硼的区域，该方法产生具有大的表面积的多孔结构。这一多孔结构可用碱处理以暴露羟基基团。
另一种增加固相支持体的反应表面积的方法是产生一氧化硅的柱状结构，例如通过SiOx的热蒸发。另一种如此的方法是插入反应池织物，如非织造玻璃或塑料(优选玻璃纤维或聚丙烯纤维)织物和处理织物产生反应位点的等离子体。还有一种方法是使用spin-on玻璃，其通过热氧化从硅倍半氧烷(sil-sesquioxane)梯形聚合物结构产生一薄层近计量化学的SiO2。溶胶处理通过在混合的醇加水中首先形成聚合的有机金属结构，然后小心地干燥和烘烤而从有机金属起使材料产生玻璃样组合物薄层。当溶胶系统在溶液的临界温度和压力之上干燥时，得到气溶胶。气溶胶具有与玻璃(例如二氧化硅)类似的化学组成但具有非常多孔的微结构。它们的密度相对较低，在某些情况下，仅为约1-3％固体组合物，余量为空气。
6. 施加包被层的可供选择的方法
不用静电或受控场沉积可将其它层施加到基质上。例如，可利用喷射、刷拂、浸渍等技术施加干燥或更优选的是溶解在或悬浮于挥发性支持体中的包被材料。对于干粉沉积，经常需要机械刮擦所施加的材料的顶部，以便确保所施加的材料具有均匀的厚度。包被材料例如可含有诸如聚乙二醇这样的低熔点聚合物，它们可以用温热熔融以便更强地使所施加的包被材料层粘附到基质上。或者，也可以例如用中间粘合剂(在此，该材料是适宜的)或熔融粘附来施加材料片。熔融粘附技术包括热熔融、超声熔融、激光熔融、压力熔融等。
在一些实施方案中，其它层可溶于参与随后的化学过程的液体中。
7. 受控释放
作为本发明的一个方面，将试剂沉积下来以便直到一个延迟时间之后或条件变化(例如pH变化)之后再释放试剂。在本发明的一种形式中，利用受控释放推迟化学过程的有效阶段，直到要进行平行测试方法的所有部位都已经按配方完全配制好为止。例如，向所有部位中加入液体，然后至少使一部分部位接收来自未知样品或对照样品的材料。在一种情形中，液体的最初加入会启动开窗时间(window time)，在这段时间中加入所有未知或对照材料，这段开窗时间之后，不同的支持该过程的试剂被释放到液体中。或者，象pH变化这样简单的激发条件会使支持该过程的试剂开始释放。而且，利用多个材料层以便例如使第一沉积层提供支持第一化学过程的试剂，然后使另一沉积层释放支持第二化学过程的试剂。这种成层的多个释放层可提供给具有两个、三个或多个阶段的化学过程。
尤其是参考医药品，在控释领域或持续释放组合物方面业已进行了实质性的开发。这些组合物是由具有可变的溶胀性和不同赋形剂的聚合物的混合物构成的。其中一些组合物被设计成在酸性环境中(例如在人胃中)溶胀最少，而在碱性环境中(例如在小肠中)溶胀最快。特别是在兽医应用中，决定溶胀性的pH会倒转有利的溶胀，因此，该组合物中的活性组分在酸性环境中溶解。
以下文献记载了控释技术的例子：(1)题目为“持续释放配方”的美国专利4,012,498，申请人为Kornblum等人，Sandoz，Inc.(含有混入碱性pH的生物碱类，该碱性pH影响从以下物质中选择的控释基质：乙酸邻苯二甲酸纤维素、聚乙烯基乙酸酯邻苯二甲酸酯(polyvinyl acetate phthalate)和羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)；(2)题目为“用于根据时间控制和释放药剂的渗透系统”的美国专利4,111,202，申请人为；Feliz，Alza Corp.；(3)题目为“控释消炎痛”的美国专利4,173,626，申请人为Dempski等人，Merck & Co.，Inc.(用聚乙酸乙烯酯包覆丸剂以便减缓释放)；(4)题目为“持续释放的药物组合物”的美国专利4,178,361，申请人为Cohen等人，Union Corp.(使用含有生物结合剂的水溶性但水溶胀的基质)；(5)题目为“延长释放药物的制备”的美国专利4,221,778，申请人为Raghunathan，Pennwalt Corp.(其上吸附有药物的离子交换树脂粒子，该粒子用浸渍剂〔聚乙二醇、丙二醇、甘露糖醇、乳糖和甲基纤维素〕处理以便减缓在水中的溶胀并用扩散膜包覆)；(6)题目为“持续释放的药物组合物”的美国专利4,248,857，申请人为DeNeale等人，AmericanHome Products Corp.；(7)题目为“控释片剂”的美国专利4,252,786，申请人为Weiss等人，E.R.Squib & Sons，Inc.(用聚合的乙烯基吡咯烷酮和羧乙烯基亲水聚合物的掺合物压制成、并且用基本上水不溶但水可渗透的薄膜包覆的药物)；(8)题目为“用于制备受控的长效药物的方法和组合物”的美国专利4,259,314，申请人为Lowey；(9)题目为“控释配方和治疗方法”的美国专利4,293,539，申请人为Ludwig等人，Eli Lilly and Company(在乙醇酸和乳酸的共聚物中有效分散)；(10)题目为“持续释放的药物组合物”的美国专利4,309,404，申请人为DeNeale等人，American Home Products，Corp.；(11)题目为“持续释放的药物组合物”的美国专利4,309,405，申请人为Guley等人，American Home Products，Corp.；(12)题目为“控释配方和方法”的美国专利4,505,890，申请人为Jain等人，E.R.Squib & Sons，Inc.(含有水解胶体胶凝剂〔甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠以及这些物质的混合物〕的包核)；(13)题目为“干式持续释放的茶碱口服药剂”的美国专利4,587,118，申请人为Hsiao，Key Pharmaceuticals，Inc.(先用茶碱和聚乙烯吡咯烷酮包被、然后再用乙基纤维素和羟丙基纤维素的混合物包覆的籽粒)；(14)题目为“控释配方”的美国专利4,666,705，申请人为DeCrosta等人，E.R.Squib &Sons，Inc.；(15)题目为“包覆的多单位剂量形式的扩散体”的美国专利4,716,041，申请人为Kjornaes等人，A/S Alfred Benzon(该配方药剂被加热从而在位于外层内部的包被膜中形成一个连续相)；(16)题目为“控释片剂”的美国专利4,784,858，申请人为Ventouras，ZymaSA(核心含有水溶性药剂、水不溶性聚合的赋形剂〔例如聚氯乙烯或丙烯酸或甲基丙烯酸低级烷基酯的聚合物〕以及在接触的水面上溶胀的水不溶性物质，并且核心用弹性、水不溶的半渗透分散涂层包覆)；(17)题目为“含有齐多夫定的控释药剂”的美国专利4,917,900，申请人为Jones等人，Burroughs Wellcome Co.(用丙烯酸或甲基丙烯酸烷基酯的聚合物与乙基纤维素的混合物包覆)；(18)题目为“给药系统”的美国专利4,973,469，申请人为Mulligan等人，Elan Corp.，PLC(活性成分和水溶解度与活性成分成反比的惰性物质被吸附到诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或甲基纤维素的交联聚合物上)；(19)题目为“剂量形式”的美国专利5,178,868，申请人为Malmqvist-Granlund等人，Kabi Pharmacia Aktiebolaq(用(a)氯乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇单体的共聚物和(b)可溶于水的用于产生细孔的物质的混合物包覆核心)；(20)题目为“碱性药剂盐酸盐的持续释放的制备方法”的美国专利5,234,691，申请人为Uemura等人，Sumitomo Pharmaceuticals，Co.，Ltd.(颗粒含有碱性药剂和聚阴离子例如羧乙烯基聚合物或羧甲基纤维素，并且用微溶于水的大分子物质包覆，这些大分子物质例如有聚乙酸乙烯酯、乙基纤维素、甲基丙烯酸氨烷基酯共聚物、甲基丙烯酸共聚物、乙酸纤维素、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、硬化油、蜂蜡、巴西棕榈蜡、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、硬脂酸、十八烷醇以及这些物质的混合物)；(21)题目为“具有丙烯酸聚合物涂层的稳定的控释药剂”的美国专利5,286,493，申请人为Oshlack等人，Euroceltique，S.A.((a)用氨合甲基丙烯酸酯(ammonio methacrylate)共聚物的经增塑的水分散体包覆基质，该共聚物是丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚物，并且具有少量的四价铵基丙烯酸和甲基丙烯酸酯，而其渗透性不受在胃肠道中占优势的pH条件的影响，以及(b)用比水分散体的玻璃化转变温度高的温度固化经包覆的基质)；(22)题目为“用乙基纤维素的水分散体包覆的控释药剂”的美国专利5,472,712，申请人为Oshlack等人，Euroceltique，S.A.；(23)题目为“改进控释吉非贝齐剂量形式的方法及组合物”的美国专利5,492,700，申请人为Ghebre-Sellassie等人，Warner-Lambert Co.(用控释剂〔例如纤维素邻苯二甲酸酯、乙基纤维素、聚邻苯二甲酸乙烯酯、琥珀酸纤维素、丁酸纤维素、聚(甲基)丙烯酸、部分酯化的聚(甲基)丙烯酸、以及这些物质的混合物〕粒化的单个吉非贝齐颗粒)；(24)题目为“用丙烯酸聚合物的水分散体包被的控释药剂”的美国专利5,580,578，申请人为Oshlack等人，Euroceltique，S.A.；(25)题目为“用于治疗肠炎的口服组合物”的美国专利5,643,602，申请人为Ulmius，Astra Aktiebolag(具有水溶性或水不溶性可形成薄膜的聚合物的第一涂层和含有在低pH值下难溶而在大约4-7.5的较高pH值下可溶的药物可接受的可形成薄膜的阴离子羧基聚合物的第二薄膜涂层的籽粒)；(26)题目为“控释氧可酮组合物”的美国专利5,656,295，申请人为Oshlack等人，Euroceltique，S.A.；以及(27)Ishikawa等人在Chem.Pharm.Bull.43：2215-20，1995上的文章(描述了在其侧链具有交联部分的用作控释药剂外层的聚甲基丙烯酸甲苯酯共聚物，例如通过接触氧等离子体而使共聚物交联)。
控释技术的焦点在于使感兴趣的化合物用在给定类型的液体中以预定速度溶胀的组合物包被或与之混合。该技术实质上依赖于聚合物的溶胀性。如果想要减小在酸性含水环境下的溶胀速度，所使用的聚合物经常包括在低溶解度的酸形式和较高溶解度的盐形式之间滴定的酸官能团。如果想要减小在碱性含水环境下的溶胀速度，所使用的聚合物经常包括在低溶解度的碱形式和较高溶解度的盐形式之间滴定的碱官能团。应该注意到，赋形剂或填充剂对于调节控释组合物的溶胀速度具有一定的作用。
另外，正如本领域的普通技术人员将认识到的，在随后的化学过程中起积极作用的控释药剂的组分会影响溶解现象。如果与控释组合物掺和而不是沉积在控释组合物层之下，则通常希望对溶胀现象所起的这些积极作用更大些。
在设计化学过程时可利用某些控释组合物的pH敏感性。例如，如果第一过程在低pH值下进行，而随后的过程在较高的pH值下进行，则利用在酸性环境下更具抗溶胀性的控释组合物来按时间排列支持第二反应过程的试剂。
控释的另一机制是向沉积有进入液体的化学物质的基质提供动力学/扩散屏障。例如，图4示出了基质301，在301的空穴302中已沉积了一些材料，再将膜303覆盖在其上。该基质具有下部305，向下部305上融合上部306。上部在空穴部位之上限定出若干个孔。此扩散控制机制当然可与以上讨论的溶胀速度机制结合起来。正如以上所公开的控释药剂的例子中所声称的，当将含有聚合物的薄膜覆盖内部的组合物时就形成了扩散控制。
8. 用于处理不相容试剂的方法和基质
在许多情况下，在化学过程中一起使用的若干试剂如果存放在一起则是不稳定的，特别是在溶液中。当将这些试剂以固体的形式存放，以便使试剂发生冲突的机会减到最小时，通常会削弱这种不稳定性(至少从长远的观点来看)。根据本发明，利用干式沉积法来沉积试剂，或者，如果液体用于沉积过程中，则试剂溶解或悬浮到液体中的时间会保持最短。利用上述的中间层，甚至控释组合物的插入层，还可分离这些不相容的试剂。通过在分开的沉积步骤中沉积试剂，甚至当不相容的试剂沉积在相邻的层中时，也会减小试剂之间的相互暴露。
试剂在以下情形中是不相容的，即一种试剂在液体中可以有效地处理而第二种试剂在该液体中却不溶或不稳定。本发明通过利用干式沉积法施加这两种试剂或利用干式沉积法施加第二种试剂而实现了这种可能性。
9. 避免对基质的不可接受水平的吸附
在本发明的某些实施方案中，物质沉积在固相支持体上是以能溶解和从固相支持体上除去的形式进行。然而如上所述，当沉积是在基质材料(其例如在以后将要面对的液体中是不溶的)上直接进行的，至少希望一定量的沉积材料附着到基质材料上。这种作用随着基质材料对出现于沉积材料中的物质的附着程度的变化而变化。在许多例子中，被附着的材料的量与随后在化学反应过程中溶解的材料的量相比是较少的，并且所附着的百分量是完全可重复的，从而其对随后的化学反应的实际影响可忽略不计。然而，通过用可溶性材料包被基质，然后再将沉积材料施加到这个初始涂层上还可将这些吸附作用减到最小。
在某些实施方案中，需要使某些化合物附着到基质上，而其它可存在于覆盖涂层中的化合物以可溶解的形式被施加。例如，反应盘中的每个孔的底面可以附着有与测定有关的大分子(例如抗体、其它受体分子或核酸探针)。至少有关大分子的过程的第一步骤所必须的混合试剂也被施加到孔的表面上，使得增溶液体的加入就会使测试开始进行。
B. 聚合物沉积，特别是捕获试剂的沉积
在许多化学过程如分析中，方法取决于在固相支持体上附着聚合物如多肽(包括蛋白质、多肽和肽)或核酸。这些聚合物经常作为“捕获”试剂。例如，免疫学分析使用与固相支持体结合的抗体(或其重组类似物)，其中在许多情况下抗体用来结合(即“捕获”)作为分析中的靶的物质。这种免疫学分析的描述例如见Ausubel等，分子生物学简明方案，第2版，John Wiley & Sons，1992，11-1至11-54页，该文献引入本文作参考。核酸通常与固相支持体结合并用作捕获互补序列的核酸。这种技术的描述例如见Ausubel等，分子生物学简明方案，第2版，John Wiley & Sons，1992，单元2(DNA的制备和分析)，单元4(RNA的制备和分析)，单元6(筛选重组DNA文库)和单元15(聚合酶链反应)，该文献引入本文作参考。
使用本文描述的制备固相支持体的方法，聚合物的组合(如大分子)可以以确定好的比例与固相支持体结合。本文的方法比以前使用的方法如被动吸附更易自动化，如与溶液保温、印迹或超滤至膜上，任选地后接UV交联和与固相支持体上的交联组分的液相/固相反应。使用本发明的方法，据信可实现附着的聚合物的高产率，附着的聚合物具有优异的稳定性，附着方法可用于促进保持在某些化学过程中所需的天然结构的附着聚合物的百分比。
在本发明的优选的沉积方法中，聚合物以干式沉积。因此，第一步是分离干燥形式的聚合物(除非聚合物是从合成程序中以干燥形式获得的)。对于许多聚合物，这一分离步骤可通过沉淀聚合物如用酸、盐或有机溶剂(如乙醇)沉淀而进行，后接进一步的干燥过程。对于蛋白质，通常希望经冻干分离成干燥形式，因为这一方法能更好地保持干燥蛋白质的天然结构。应理解的是分子的干燥形式仅是指能以固体操作的形式。冻干的蛋白质通常含有结合的溶剂分子，许多化合物的结晶或其它沉淀形式掺入了溶剂分子。
C.探针矩阵
如上所述，本发明提供了以空间分辨形式沉积探针的能力，因此，例如附着化合物的致密图案可以沉积在固相支持体上(图2是相对简单的图案)。以这种方式“探针”如抗体或核酸的矩阵可以沉积在固相支持体上。矩阵可以包括阳性对照探针，设计用于与进行化学过程的物质产生阳性结果，以及阴性对照探针，通常不产生阳性结果。矩阵可进一步包括各种探针，例如，矩阵可包括各种抗作为微生物(如致病微生物)存在的标记的化合物的抗体或各种与核酸如衍生于微生物的核酸杂交的核酸探针。
Foder等描述了制备如可由本发明达到的空间分辨的核酸探针矩阵的技术，其是在固相支持体上进行合成时使用光敏感的基团和掩蔽基团。例如参见Foder等，1992年6月25日公开的WO92/10092或Foder等，自然364：555-556，1993。但是使用本发明的技术，过程得以简化，并且据信其可以更短的时间规模完成。
图5示出了一实施例，其中支持体401上附着了若干个探针402，探针不必是相同的。在这一示意图中，探针402掺入了可检测的标记如放射活性或荧光组分。与含核酸的样品保温后及施加核酸酶后，只有那些与样品中的核酸有效退火的探针呈双链形式并抗核酸酶的消化(核酸酶是单链特异性的)。使用核酸酶S1(特异于单链的内切核酸酶)和核糖核酸酶A(在盐条件下使用可使其特异于单链RNA的内切核糖核酸酶)的核酸酶保护分析所用的方案的例子见Ausubel等，分子生物学简明方案，第2版，John Wiley & Sons，1992，4-14至4-21，该文献引入本文作参考。通过在Ausubel等，分子生物学简明方案，第2版，John Wiley & Sons，1992，单元3，该文献引入本文作参考，中所述的条件下用外切核酸酶可进行类似的分析。
D.核酸扩增装置和方案
在本发明的某些实施方案中，优选使用本发明的沉积方法使核酸扩增方法中所需的试剂沉积在固相支持体上。这种扩增方法包括但不限于(1)聚合酶链反应(PCR，见例如美国专利4,683,202，和分子生物学简明方案(Frederick M.Ausubel等编辑，1992年)(下文称为Ausubel等)，单元15.1)；(2)连接酶链反应(LCR；见欧洲专利公开320，308和Schachter等，临床微生物学32，2540-2543(1994))；(3)链置换扩增(SDA，见Walker等，PCR方法和应用3，1-6(1993))；(4)基于核酸序列的扩增(NASBA，见van Gemen等，病毒学方法43，177-188(1993))；以及(5)转录介导的扩增(TMA，Pfyffer等，临床微生物学，34，834-841(1996))。这些扩增方法的程序例如在上述文献中描述，方法学的描述引入本文作参考。扩增方法通常使用至少一个、典型地两个“引物”，其相对较短(例如15-25个核苷酸)并能与靶核酸退火(即碱基对)以提供酶作用的起始点(如生物体复制或保持核酸所用的酶)。因此，核酸聚合酶从一个引物起始从核苷三磷酸结构单元产生“互补于”引物与之退火的链的至少一部分的链。或者，在另一个实施例中，如果两个引物以合适于连接的交互位置与靶核酸退火，则DNA连接酶结合两个引物。
前两个扩增方法，PCR和LCR均涉及DNA区段的扩增并通常用于这种区段的检测和分析方法中。这些扩增通常用热循环仪进行，其产生变性-复性/反应温度的循环用于反应。SDA和NASBA可以用于扩增DNA区段，但SDA提供DNA产物而NASBA提供RNA扩增产物。典型地，这些扩增方法需要在加入引物时或之前至少一个起始高温保温以提供靶DNA的变性，随后在较低温度下进行恒温反应。例如，NASBA包括在75℃起始保温，随后在41℃保温，类似地，SDA包括在95℃的起始保温，随后在37℃的保温。
1.用于核酸扩增的固相支持体
本发明这一方面的固相支持体包括(1)沉积于其上的一或多种试剂，用于支持扩增反应(如酶、缓冲系统、盐、引物、稳定剂如蔗糖或其它糖、碳水化合物或其它惰性聚合物等)或(2)沉积和附着至少一种引物。本发明因此提供了一种制备方法以在发生扩增反应的位点沉积耗材。标准化的制备方法反过来又降低了由分布耗材至反应位点的不精确导致的扩增方法错误的可能性。
本发明的沉积方法使得能以非常小的体积沉积用于扩增的试剂。随着规模的降低，进行扩增的装置可以具有低的热阻抗，从而冷热循环的时间缩短。另外，如果使用例如1996年1月24日申请的美国申请60/010,513和1997年1月23日申请的美国申请08/786,956中描述的电热热泵，可以实现快速的上升和下降温度转换(这些专利申请引入本文作参考)。这种快速的温度转换降低了循环时间(例如每循环少于5分钟)并保证例如反应混合物仅最小程度地暴露于中间温度，能使酶DNA聚合酶是活性的但是可靠性降低。
通过将引物系统地施加于用于扩增反应的固相支持体上，每种引物的相对位置和性质得以明确，并在实验室人员操作时不易发生鉴定错误。
2.用至少一种附着探针进行扩增的方法
本发明还提供了进行核酸扩增反应的方法，其中至少一种探针附着于固相支持体上。对于需要两个引物的任何特定的扩增，优选地是一个探针附着于支持体，另一个在溶液相中。优选地，采用的检测方法是鉴别在扩增过程后附着于固相支持体上的信号(这种检测方法的例子见下述)。本发明使得多重扩增能用单一的试剂混合物进行，同时由于各个附着的引物的空间分离使得混合物的每种扩增均是可鉴别的。
在这种混合但空间分辨的扩增中，希望的是使扩增过程在这样的条件下进行，使得在扩增过程的链熔融步骤中，第二个链扩增产物(不通过附着的引物附着于固相支持体的产物)的扩散最低。这一扩散限制有助于保证第二条链在匹配的附着引物的位点可被利用，从而可以发生对数扩增。然而，应注意的是当接受算术扩增的情况下，不需要定位第二条链产物。第二条链产物的定位例如可通过保持相对较薄层的反应混合物液体(例如见1996年1月24日申请的美国申请60/010,513和1997年1月23日申请的美国申请08/786,956中描述的反应室)，向反应混合物中加入增加粘度的物质，并注意在温度循环步骤不搅拌反应混合物。
附着的引物例如可通过掺入放射性同位素或附着可检测的试剂如荧光分子而标记。如果用附着的可检测试剂标记，优选的是试剂的附着方式是能通过内切核酸酶的作用易于从固相支持体上除去。合适的化学方法见Holland等，美国科学院院刊88，7276-7280，1991。对于附着于附着于固相支持体的引物的标记，检测可涉及应用核酸酶，其消化除去不被与扩增的核酸的双链相互作用保护的标记。
或者，标记可掺入扩增中所用的第二个引物中，以这种方式，标记的引物与固相支持体的空间分辨的结合通过由扩增序列介导的杂交发生。
E.在固相支持体上进行的化学过程如核酸扩增所用的装置
本发明进一步提供了用于在固相支持体上进行化学过程(特别是核酸扩增)的装置，包括：
用于将至少两层材料支撑在一起的托架，所述的材料包括：
第一层一或多种用于支持化学过程的液体的可释放容器，该化学过程使用预计含有靶分子的样品，其能在化学过程中产生应答性结果；以及
第一种多孔材料的第二层，其上附着样品的分子，这些分子预计包括靶分子，
其中，容器中的液体可以从容器中释放以浸润第一种多孔材料。在特别优选的实施方案中，该装置包括：
用于将至少两层材料支撑在一起的托架，所述的材料包括：
第一层一或多种用于支持核酸扩增反应的液体的可释放容器，该核酸扩增反应使用预计含有靶核酸的样品，从靶核酸可以经扩增引物扩增出扩增子核酸；以及
第一种多孔材料的第二层，其上附着样品的核酸分子，这些核酸预计包括靶核酸，
其中，容器中的液体可以从容器中释放以浸润第一种多孔材料。
优选地，第一种多孔材料含有预计含有靶核酸的材料的施用图案。第一种多孔材料包括膜，其中膜或薄膜可以是任何已用于附着核酸的膜或薄膜如尼龙或硝酸纤维素。
在一优选的实施方案中，托架进一步在第一层和第二层之间支撑一第二种多孔材料的第三层。优选地，在第二种多孔材料之上或之中沉积有一或多种支持化学过程(如核酸扩增)的试剂，试剂优选地是干燥形式。在一个优选的实施方案中，试剂以匹配于预计的靶分子沉积图案的图案沉积。优选地，第二种多孔材料中嵌入非多孔区域以分离多孔区域，在其上任选地沉积有试剂。非多孔区域用于产生通道介导来自每个释放容器的液体通过第二种多孔材料至与释放容器并排的第一种多孔材料的区域。第二种多孔材料是能支持干燥形式的沉积试剂的材料，并可以是例如膜或薄膜或织造或非织造纤维网(如纤维素材料、玻璃纤维材料)、明胶、合成凝胶如丙烯酰胺凝胶、或更刚性的多孔材料(如烧结的玻璃、多孔聚合物材料如多孔聚碳酸酯)。
图6示出了本发明的三层的三明治结构，第一层501含有释放容器504，释放容器可以例如用塑料盖密封，在向层501顶部施加压力时塑料盖爆开。本发明还涉及均匀施加压力至层501顶部从而打开释放容器的装置。多孔第三层502接受来自释放容器的液体，如果第三层掺入用于化学过程干的试剂，来自释放容器的液体溶解试剂并将其印迹至多孔第一层503。
典型地，第一层503在其浸润于试剂和液体中后，从三明治装置中移出，并置于温度控制装置中。例如，在杂交反应中，浸润来自释放容器的液体的多孔第一层在升高的温度下保温。在扩增反应中，浸润来自释放容器的液体的多孔第一层通常进行温度循环反应。在抗体结合或其它结合分析中，可能不需升高的温度，并且在某些情况下通常采用降低的温度。
在一个优选的实施方案中，释放容器的液体由水、稳定剂如蔗糖、甘油或其它醇、稳定缓冲剂如磷酸盐、其它盐以及不需冷冻在水溶液中稳定的其它组分制备。第二种多孔材料优选地在其上沉积干燥形式更稳定的组分，如核苷酸(包括脱氧核苷酸)三磷酸和酶。引物通常在溶液中稳定，但是更优选以干燥形式存在，如沉积在第二种多孔材料上或第一种多孔材料上。释放容器的例子包括1997年1月23日申请的美国申请08/786,956中所述的Bursapak供应室，该申请引入本文作参考。
尽管本发明以优选的实施方案进行了描述，对于本领域普通技术人员显而易见的是在优选的装置和方法中可以有变化，并且本发明可以不同于本文所述的方式实施。因此，本发明包括在权利要求书所限定的本发明的实质和范围内的所有修饰。

Claims (6)

1、一种固相支持体，其具有一个表面，该表面上经静电沉积或受控场沉积而干式沉积了包括至少一种聚合物的组合物，其中所述的聚合物是核酸、肽、或者蛋白，并且该聚合物附着于该表面，其中的静电沉积包括在该表面上形成静电电荷以有效地将含有所述组合物的带电荷粒子吸引至该表面，而受控场沉积包括在该表面上形成电磁场以有效地将此类带电荷粒子导向该表面。
2、权利要求1的固相支持体，其中所述的固相支持体是柔性支持体。
3、制备权利要求1的固相支持体的方法，包括
产生一电磁力以将具有第一种电荷的粒子吸引至该固相支持体的表面，以及
将该表面与包括所述组合物的该带电荷粒子接触，从而用该组合物包被该表面。
4、权利要求3的方法，进一步包括
经下述一种或多种方法将物质附着于固相支持体：
(i)将包被的固相支持体储存一段足够的时间以增加固相支持体与沉积的化合物之间的结合强度；
(ii)在沉积的化合物或固相支持体中产生反应性基元以进行反应形成化合物与支持体之间的共价附着；
(iii)提供掺入到支持体中的反应性基元并将化合物与反应性基元反应以将化合物与表面进行共价结合；
(iv)保持吸引带电荷粒子至表面支持体的场足够的时间以增加固相支持体和化合物间的结合强度；
(v)用足以溶解部分沉积的化合物的液体湿润包被的表面，但优选不加入足以将沉积的化合物从固相支持体洗脱的液体；或者
(vi)加热包被的表面。
5、权利要求3的方法，包括
(1)在第一个过程中，通过将与第一种极性相反的第二种极性的离子导向表面以在表面产生第二种极性的电荷来产生电磁力；或者
(2)在第二个过程中，通过在固相支持体表面产生电场来产生电磁力。
6、一种聚合的核酸的矩阵，其包括经静电沉积或受控场沉积而沉积并附着在固相支持体的表面上的空间分辨的核酸探针，其中的静电沉积包括在该表面上形成静电电荷以有效地将含有所述聚合的核酸的带电荷粒子吸引至该表面，而受控场沉积包括在该表面上形成电磁场以有效地将此类带电荷粒子导向该表面。
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