CN1143913A - 移植骨的制备 - Google Patents

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Abstract

一种移植骨的制备方法，所述的骨含有其本身包含可除去材料的内部基质，所述的方法包括使所述的骨与低于环境压力的大气接触的步骤。此外，所述的方法还包括一个附加步骤，其中在所述的骨与所述的大气接触期间，将所述的骨与脱污染剂或洗涤剂保持接触。一种处理骨内基质用方法，所述的骨内基质含有预定量可除去材料，而且所述基质还含有预定量的能使所述的可除去材料基本上固定的脂类，所述的方法包括使所述的基质与低于环境压力的大气接触足够长的一段时间的步骤，使所述的脂类含量有效地减少到其所述的预定量之下。

Description

移植骨的制备
本申请是流水号07/815394美国专利申请(申请日：1991年12月31日)的部分继续申请，其说明书、权利要求书和附图作为参照全部并入本文。
                        发明领域
本发明涉及移植骨的处理方法。具体讲本发明涉及脱污染骨的供给，其移植显著减小移植受体暴露于污染病源体或免疫原性的材料之中的危险。
已报导的进展
移植用人骨的采购和处理是一项复杂的工作，它需要一系列环节的共同努力，即需要供骨人家庭、医院工作人员、地方采购单位、血样处理实验室、骨处理实验室、接受移植的病人和移植小组的共同努力。
一个主要问题是减少潜在危害性疾病传染给移植组织受体的危险。事实上，提供移植安全性骨组织是一项十分特殊的任务，因为产生免疫的材料以及微生物和病毒可以在骨样品的内部基质的深处发现。
就此而言，可以在加工实验室分析出血样中的各种已知感染剂，例如包括：
        人体免疫缺陷病毒(HIV--1)
        人体免疫缺陷病毒(HIV--2)
        人体T细胞亲淋巴病毒(HTLV--1)
        乙型肝炎
        丙型肝炎
        巨细胞病毒(CMV)
        梅毒螺旋体(梅毒)。
有关使用污染骨进行移植导致严重临床后果的情况，例如可以参见Kakaiya等人在《输液》31(3)，1277-1284页(1991)上登载的论文“组织移植传播的感染”，Shutkin在《骨和关节外科杂志》16-A(1)，160-162页(1954)上发表的论文“案例报导，使用冷藏骨--库存骨的同源血清肝炎”。经由骨和骨髓传播人体免疫缺陷病毒(HIV)也做了报导。参见载于Novbid.Mortal.Weekly Rep.，37，597--599，1988上的“HIV的骨移植传播病历报导和公共卫生建议”；Furlini等人在Eur.J.Clin.Microbio1.Infect.Dis.，7(5)，554-655，1988上发表的论文“受感染骨髓移植后对人体免疫缺陷病毒的抗体反应”。使用新鲜骨以及冷藏骨和冷冻干燥骨培养了HIV。参见Buck等人在Clin.Ortho.，251，249-253，1990上发表的论文“使用骨培养的人体免疫缺陷病毒，与移植的关联”。此外，保护骨处理实验室工作人员也很重要，因为极有可能传播HIV和乙型肝炎。
就骨加工方法学上的设计来说，另一个极重要的问题是避免和减小接受移植的病人对残留在移植骨中供体的大分子物质(例如胶原，以及主要组织相容性复合体的细胞表面抗原或其他糖蛋白)的免疫应答(其中包括移植排斥)。例如，参见Friedlander和Horowitz在Orthopedics，15(10)，1171-1175(1992)上，以及Mankin等人在同一杂志1147-1154页上发表的文章。
因此，目前十分需要一种骨加工方法，该方法能减少使用、制备和采购移植骨时产生受体免疫应答或传播疾病的危险。在这方面，另一个重要的问题是应当知道即使采用已有技术中采用的供体骨的筛选方法，也不可能检测到具体供体的近期感染，所以说应当强调改进骨清洗和脱污染处理方法的重要性，以便预防潜在或者未检测到的感染剂的感染。
骨处理过程通常采用供体筛选与抗生处理结合，该方法可以减少(但不能限制到可接受的水平)已知病毒沾染和各种细菌的传染，例如参见Scarborough，N.L.Orthopedics，15(10)，1161-1167(1992)和Malinin，T.I.，在《骨接肢和骨替换》(Habal和Reddi编，W.B.Saunders Company，Philadelphia，PA，1992)一书第19章206-225页上发表的文章“骨同种移植物的获得和保藏”。正如前面提到的那样，现在可以使用的方法对于属于人体或医院环境中普通菌丛的病毒、选择细菌和真菌没有预防保护作用。对于这些病原体筛选试验的灵敏度和特效性虽然高，但是筛选试验并不是非常安全的，例如低的抗体水平(如近期感染或免疫缺陷)或者技术人员的失误都可以造成错误的阴性结论。不仅如此，筛选试验只可以用于鉴定已知的感染剂。此外，上面提到的目前采用的那些惯常使用的抗生抗菌混合剂，不容易杀死各种类型的细菌。例如，通常使用的多粘菌素/杆菌肽溶液(50000单位杆菌肽/500000单位多粘菌素B)不能使变形菌(Proteus)株失活。而且传统的抗菌混合剂对于病毒或真菌没有显著的效果。
此外，对于使用脱污染剂穿透骨基质和使之脱污染来说，也有一些明显的限制。参见Friedlaender等人编著的《有关骨和软骨的同种移植生物学，保藏和临床应用》(Little，Brown and Company，Boston MA，1983)一书第22章第233-238页上由Prolo和Oklund发表的文章“骨的化学药品灭菌”。骨基质包含可以除去的物质，例如髓、细胞和脂类，它们阻止脱污染剂深入到如上面提到的感染剂或免疫原性的大分子可能存在的骨基质之处。
1964年公开的第964545号英国专利说明书中，介绍了从骨基质中提取可除去材料时遇到的一些困难，但是却没有解决。
该545号说明书描述了使用脂肪溶剂(例如，氯仿/甲醇混合物)清洗骨的操作方法。所涉及的主要时间期间，与优选的骨保藏方法(例如用于使适当尺寸的供骨段与接受移植的组织快速匹配的方法)不一致。据说，这种方法的另一个固有缺点是，它似乎限制在必须按某种特定的顺序完成的一系列特殊步骤上。假如不这样，据说产生免疫作用的供骨蛋白就会由于脂肪溶剂引起它的原位变性而残留于所述的的骨中。
实施本发明可克服与提供适于移植用脱污染骨有关的上述困难和其他困难。
                            发明概述
本发明发现，控制骨内基质经受清洗和/或脱污染时的大气压，能够特别有效地提供适于移植用骨。鉴于此，提供了一种移植骨的制备方法，所述的骨含有本身包含可除去材料的内部基质，所述的方法包括使所述的骨与低于环境压力的大气接触的步骤。在优选的方案中，所述的方法还包括使所述的骨或其所述的基质与含有脱污染剂或洗涤剂的溶液接触的附加步骤。
可以用本发明方法生产的脱污染骨处置的代表性临床适用征，是膝和髋外科以及股骨头、近胫骨和远股骨的移植。
本发明实践确定，骨基质中的脂类显著干扰其清洗和脱污染。因此，本发明的一个重要方面在于提供一种处理含有预定量可除去材料的骨内基质的方法，所述的基质还含有预定量的能使可除去材料基本上固定的脂类，所述的方法包括使所述的基质与低于环境压力的大气接触足够长的一段时间的步骤，使所述的脂肪含量低于其所述的预定数量。
另一方面，本发明提供一种处理含有内部基质的骨的方法，所述的基质本身含有预定量的与所述的骨具有显著亲合力的可除去材料，所述的方法包括使所述的基质与低于环境压力的大气接触的步骤，然后在与之接触时使所述的大气维持足够长的一段时间，以便使所述数量的可除去材料减少到其所述的预定值之下。
此外，本发明提供一种骨处理方法，其中在骨与低于环境压力的大气接触之前、期间或之后使之处于提高的温度之下。
本发明的这些和其他方面、以及特点和优点，将在紧随其后的发明的详细说明部分加以介绍。
附图简述
附图1是股骨示意图，其中示出便于接近骨中可除去材料的钻孔位置。
附图2是股骨头示意图，其中示出便于接近骨中可除去材料的钻孔位置。
附图3是股骨头示意图，其中示出便于接近骨中可除去材料的钻孔位置。
附图4是右股骨示意图，其中示出便于接近骨中可除去材料的钻孔位置。
附图5是显示按本发明方法生产的改进骨的照片。
发明详述
本发明提供一种简单、安全和有效的处理骨并使之适于移植用的方法，其中包括：
a)使所述的骨与能够使细菌、真菌、病毒和寄生虫有效失活的综合脱污染剂接触；
b)清洗所述的骨；和
c)通过使之与能够使细菌、真菌、病毒和寄生虫有效失活的综合脱污染剂接触，使所述被清洁的骨最终脱污染。
本发明还提供一种能够在上述方法(b)中使用的骨的清洁方法，该方法包括在提高的温度下和高压洗涤条件下使所述的骨与洗涤剂接触。
本说明书中的术语“骨”，采用其最一般的含义，它包括各种类型的人或动物骨组织，包括带有韧带和腱之类连接组织的全骨、骨片和骨段，以及研磨的骨制剂和研磨脱矿化的骨制剂。
通过使所述的骨与能使细菌、真菌、病毒和寄生虫有效失活的综合脱污染剂接触，完成初始或基本的脱污染。
接触时间应当长到足以使感染剂有效的失活。最好使所述的骨浸泡在综合脱污染溶液中至少2分钟或更长时间，优选10分钟或更长时间，最优选至少1小时或更多小时。在此基本脱污染浸泡过程中，可以从溶液中取出所述的骨以便除去肉眼可以看到的外部组织和脂肪，然后再将骨置于该溶液中进一步浸泡。
该综合脱污染剂应能有效地使细菌、真菌、病毒和寄生虫失活。优选的脱污染剂是碘的有机络合物(碘附)。适用的碘附包括聚乙烯吡咯烷酮碘(PVP-I或povidone iodine)，它是Purdue-Frederick，ISP(以前是GAF)和BASF出品的市售制剂。本发明方法中可以使用的PVP-I制剂包括分子量低于20000的那些，例如，BASF的PVP-I17/12。已经确定，优选的PVP-I制剂是分子量低于100000的那些，尤其是中位分子量约35000或者k值约26-32的那些，例如BASF的PVP-I碘附30/06。
使用的碘附溶液也可以通过使具有所需分子量的络合剂(PVP-I的情况下是聚乙烯吡咯烷酮)溶液以及足以提供所需有效碘浓度数量的分子碘共同混合的方法制备。例如，具有大约1％(重量)有效碘浓度的碘附，可以用下法获得：将90克PVP溶解于水中，搅拌下加入10克碘，最后加入足量水使总容积达到1升。为了获得具有所需有效碘浓度的PVP-I溶液，可以使用PVP/碘的其他比值。使用的有效碘浓度为碘重量占溶液重量0.03-1％，优选0.1-0.5％。
已经发现能使广谱感染剂(其中包括细菌、真菌、寄生虫和病毒)失活的其他脱污染剂，是过氧化氢、乙醇、臭氧、环氧乙烷、辐照及其联合使用，以及使用PVP-I。
综合脱污染剂溶液，应当具有能使细菌、真菌、寄生虫和病毒有效失活的浓度。作为基本脱污染溶液的碘附浓度，优选处于0.5-10％(重量)，最优选1-5％(重量)范围内，其中的有效碘浓度为0.05-1％(重量)，优选0.1-0.5％(重量)。PVP-I浓度，以PVP-I的重量计，优选处于0.5-10％，最优选1-5％，按重量计，其中有效碘浓度为0.05-1％，优选0.1-0.5％。
所述的基本脱污染溶液，可以包括一种洗涤剂，其浓度按占溶液重量计，优选为0.1-5％，更优选1-3％，最优选0.1-1％。阴离子、阳离子、两性离子和非离子型洗涤剂是适用的。优选的洗涤剂是非离子型洗涤剂，例如聚乙氧基亚乙基醚类(例如联合碳化物公司，Rhom & Haas出售的注册商标为Triton的商品)或者聚氧亚乙基脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如由ICI和Sigma公司出售的Tween系列产品)。最优选辛基苯氧聚乙氧基乙醇(Rhom & Haas的Triton X-100)；聚氧亚乙基脱水山梨糖醇中最优选聚氧亚乙基(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween-80)。基本脱污染处理最好进行如下：将所述的骨在0.1-5％PVP-I和1％(重量)TritonX-100溶液中浸泡至少2分钟或更长时间，优选10分钟或更长时间，更优选至少1或数小时。
最近确定，最优选的基本脱污染操作包括将所述的骨在不含洗涤剂的1％至约5％PVP-I溶液中浸泡至少大约1-2小时。由于不同PVP-I浓度下溶液中游离碘与络合碘之比不同，所以经确定这一步最好改变为首先将骨浸泡在5％PVP-I溶液中大约0.5-1.5小时，然后清骨，进而在1％PVP-I中浸泡大约0.5-1.5小时。
如上述实施方案1所述，本发明的基本脱污染步骤比已有技术中的抗菌混合剂更有效。PVP-I是优选的脱污染剂，因为它作用迅速，使广谱感染剂(病毒、细菌、真菌和寄生虫)失活而且对人体组织的毒性很低。据发现，PVP-I能够使HIV失活。所述的基本脱污染步骤不仅由于显著降低骨感染的危险而能保护骨的接受者，而且也能保护实验室工作人员。此外，所述的基本脱污染溶液，无论是含PVP-I的还是含有PVP-I和洗涤剂的，由于都能够使软组织、脂类和血液产品开始疏松和软化，所以能够提供易于清洗的骨。
基本脱污染之后的清洗操作，可以采用传统的方法进行，但是优选通过使骨能与易于除去脂肪、骨髓和其他碎片的洗涤剂接触来实现。所述的洗涤剂能裂解细胞(如血细胞)，溶解脂肪并且使蛋白质(其中包括骨髓)溶解化。所述的清洗操作包括搅拌和/或采用提高的温度。剧烈的搅拌是最优选的，而且可以用环形振荡器进行。这样洗涤能产出骨髓、细胞、脂肪和碎片数量都可以忽略的骨，因此对于移植受体来说，由于可以容纳感染剂的细胞和/或可以招致免疫应答的生物大分子被除去而提高了安全性。
适用、优选和最优选的洗涤剂与上面针对基本脱污染步骤所述的相同。按重量计，推荐的洗涤剂浓度约为0.1-5％，更优选1-3％，最优选0.1-1％。虽然可以向含有洗涤剂的溶液中加入浓度为0.1-10％的碘附，但是据测定优选将其省略。
最好在提高的温度和高压洗涤条件之下使用洗涤剂溶液洗涤所述的骨。高压洗涤条件为清洗液进入骨内基质提供足够的动力。这种高压洗涤条件包括，例如剧烈的搅动(如使用环形漆罐振荡器)，或高压灌洗作用(例如使用高压或高速液体射流)。适用的漆罐振荡器包括由Red Devil制造的那些，优选0-5400-OM型(615转/分，0.25马力)。液体射流的压力优选100-3000，最优选500-1500磅/平方英寸。最优选的液体射流是无菌并且包括去污剂。如果在20-80℃温度下，优选在37-80℃提高的温度下，最优选在大约50-65℃温度下，则清洗被显著加速且更为充分。高压洗涤能有效地使骨髓疏松并且能逐渐除去处于多孔骨髓中的碎片。经过此高压洗涤操作之后得到的骨，比标准方法处理过的骨清洁和白得多(参见图5)。
为了促进清洗，可以更换溶液，例如洗涤期间可以将骨转移到新鲜溶液之中。所述的溶液优选至少更换两次。清洗之后，通过反复用无菌水洗涤的方法可以将洗涤剂最终除去。为了除去洗涤剂也可以使用乙醇之类生理上可以接受的醇类。如果使用乙醇，则必须使用无菌水漂洗将其除去。
如果要清洗的骨段带有连接组织，则在清洗操作中应当使用塑料包裹物或者无菌罩布之类无菌覆盖物覆盖所述的连接组织(如腱、韧带和半月板等)，以免与洗涤剂接触。
可以使所述的骨暴露于本身也具有杀菌作用的过氧化氢环境中进一步将其净化和脱污染。用洗涤剂洗涤之后，将所述的骨移入0.5-10％(优选3％)的过氧化氢溶液中一段时间，以足以使之进一步变白和除去痕量脂肪。可以采用搅动操作。熟化时间以5-120分钟为宜，优选5-60分钟，最优选15-30分钟。经此处理之后，用无菌水彻底清洗，除去残留的过氧化氢。
清洗后包装之前，对骨作最终脱污染处理。进行此最终脱污染处理的方法是，使所述的骨与综合脱污染剂接触至少2分钟或更长时间，优选至少10分钟或更长时间，最优选30-60分钟或更长时间。最优选的综合脱污染剂是1％(W/V)的聚乙烯吡咯烷酮碘。
存在软骨或者连接组织时，所述的脱污染和清洗溶液最好含有氯化钠(另一种生理上可接受的盐)，其存在量应当能阻止PVP-I在软骨或者连接组织中富集。优选使用0.01-0.75M，最优选使用0.15MNaCl。
最终脱污染处理使用的综合脱污染剂，可以利用无菌水洗涤的方法从骨中除去，或者以一薄层的形式使之残留在骨上，以便防止骨被污染剂进一步污染。这样涂敷的骨可以冷冻干燥。
最好在骨上形成PVP-I涂层。附着在骨上的PVP-I溶液使骨呈金黄的琥珀色，此色可以作为骨经过处理的一个标志。必要时，这种琥珀色骨可以直接冷冻干燥、包装和储存在室温下，优选储存在棕色瓶中。虽然组织冷冻干燥的方法是本领域中已知的，但是已发现适于冷冻干燥骨的方法是冷冻干燥大约10-168小时，优选大约20-28小时。在经过冷冻干燥骨上存在的残余PVP-I，直到洗涤除去之前或者移植后被体液除去之前均能提供保护作用。同样，所述的骨也可以用其他适用的综合脱污染剂、PVP-I或其混合物涂敷。
残留的综合脱污染剂也可以利用无菌水洗涤的方法除去，或者利用化学反应使之失活。因而可以恢复骨的原始米黄色。碘附可以在所需的浸泡时间经过之后，通过向浸泡溶液中加入抗坏血酸钠盐或硫代硫酸钠之类还原剂，利用化学方法使之失活。所述的还原剂应当具有足够的摩尔浓度和量以使残留的分子碘失活。例如，50-100微升1M的抗坏血酸钠溶液应当足以使10毫升1％PVP-I失活。这种处理使溶液从暗棕色变回到清亮的颜色，并且使骨变回到其天然颜色。
经过该最后的脱污染步骤之后，为了保存可以将骨冷冻干燥、低温储藏或鲜骨冷冻。
本领域普通技术人员应当知道，经过本文所述方式处理的骨适用于需要使用骨的所有医疗用途，例如骨移植、髋外科和膝外科。
                        本发明详述
导论
目前，人们认识到需要一种能够提供某种移植用骨的技术，这种技术可以有效地减少与现在移植操作有关的感染和免疫原性产生的严重风险。遗憾的是，由于骨结构中存在有某种物质(内部基质)，据认为所述的物质能够基本上阻止有效量用于清洗和脱污染的物质进入骨中，所以据证明移植用骨的制备是一个很困难的问题。
骨是一种特定形式的连接组织，其硬度源于软有机组织中矿物质的沉积。本领域知道，凡是提到骨内基质时是指在骨中发现的材料，不论是(致密的)皮质性物质，还是(海绵状)(小梁)网状骨质物质，据发现它们都被用来组织形成其中的结构，其中包括例如骨液、血管外液和血管内液、钙化的骨基质、骨髓(其中包括红骨髓和脂肪骨髓)及其细胞、成骨细胞、细胞外和细胞内的脂类以及红细胞。本领域知道，这些材料(除了通常钙化的骨基质之外)都是可以除去的物质，也就是说，最好在其清洗和/或脱污染时从骨中将它们除去，虽然人们也知道这种物质与骨之间具有亲合力，通常具有显著的亲合力，并且在骨中占有一定的空间。就本发明而言，据说基质中的可除去材料与骨样之间具有显著的亲合力，当骨在水基清洗液或脱污染液中与之接触时，如果在大约家庭水龙头的水压和室温下以从水源中流出的水流形式供给所述的溶液大约1-5分钟，则不能洗出大部分所述的材料。
正如本发明的基本实施方案所述明的那样，上面提到的内部基质材料显著干扰骨的清洗和脱污染操作。广义的讲，本发明所述实施方案的提出基于这样一个重要发现，即从计划移植用骨中除去(无论是直接还是间接除去)这种基质材料通过将骨样置于使它与低于环境压力的大气接触的环境中而得到极大地促进。按照本发明，所述的环境压力是指大约1.0大气压的气体压力。
本发明发现，在所述的基质中发现的脂类，无论是细胞外的还是细胞内的脂类，都往往使基质的可除去成分(例如，骨髓、细胞、抗原大分子、或者源于其中的碎片，以及脂类本身)基本上固定，从而阻止或限制这些成分被清洗和脱污染处理(如本文中所述的实施方案中记载的那些处理方法)除去。姑且不论理论，据认为由于骨内存在骨髓充填细胞和脂类疏水屏障，所以使清洗和脱污染水溶液不能有效地穿透骨内基质。
这种作用是十分显著的，因为大家知道，例如脂肪细胞是骨基质的重要成分，而黄色的骨髓几乎完全由脂肪细胞所组成；例如参见Tanaka，Y和Goodman，V.R.，的《人血细胞的电子显微镜学》，第7章，380页，(Harper and Row，New York，NY，1972)。本发明的优选实施方案涉及其中含有预定量可除去材料的骨内基质的处理，所述的基质还含有预定量基本上使所述的可除去材料固定化的脂类，所述的方法包括使所述的基质与低于环境压力的大气接触足够长的一段时间的步骤，使所述的脂类含量降低到其预定值之下。
据说，一定量脂类能使骨基质中可除去材料基本上固定化，此时如果在大约家庭水龙头的水压和室温下以从水源中流出的水流形式使骨样与水基清洗液或脱污染液接触大约1-5分钟，所述的溶液不能洗出所述的材料。
就本发明而言，所述的“脂类”包括本领域能够理解的全部物质，例如其中有甘油三酯、游离脂肪酸、胆固醇及其酯类，以及卵磷脂和神经鞘髓磷脂之类的“极性”脂肪。
移植骨的制备
适于移植的骨用以下方法制备，该方法包括使骨与低于环境压力的大气接触的步骤，以及至少包括在所述的接触之前或之后使所述的骨与含有洗涤剂或脱污染剂的溶液接触的另一个步骤。至少一个这样的另一个步骤优选在与低压大气接触之后完成，以便利于通过除去脂类而形成的通向基质的通道孔打开。本发明的母实施方案(parent embodiment)规定了许多附加的清洗或脱污染步骤，其中包括在提高的温度下进行的步骤，这些步骤可以按一定顺序组合成具体的清洗或脱污染方法。如前所述，优选的脱污染剂包括乙醇、过氧化氢、洗必泰、次氯酸盐和碘附，例如PVP-I(尤其是分子量低于大约100000的)。就本文而言，提高的温度是指大约37℃或更高的温度，优选大约37-80℃，而且最优选大约50-65℃，然而最佳温度可以根据具体样品确定。按照本发明的母实施方案和所述的实施方案，也可以在低于37℃温度之下完成清洗和脱污染步骤。所述实施方案的优选的和具有代表性的实施例，列于下面的实施例6-9之中。
本发明实践中使用的术语“骨”，使用其最广的含义，其中包括各种人和动物的骨组织，例如全骨、骨片、带有韧带和腱之类连接组织的骨段，所述的样品能够在病人体内恢复天然骨的整体性，而且在移植部位具有支撑重量，这种骨片的一维尺寸通常至少为大约10毫米或更长。适用于本发明中的那些骨样包括可以由Cryolife Orthopaedics，Inc.(Marietta，GA)提供的(一般以商标VIP出售的，用病毒失活法制备的)下列产品：网状骨质段、网状骨质块、全髁骨、皮质带和撑条、双皮质层cloward定位销、双皮质层碎片定位销、髂骨三皮层碎片定位销、髌骨三皮层碎片定位销、外股骨、股骨头、全腓骨、肱骨头、全髂骨、髂骨板、半下颌骨、全骨盆、中肋骨、回旋套和全尺骨。本文的骨定义中，不包括研磨骨制剂、研磨脱矿化的骨制剂和骨碎片，被排除的这些类物质都具有下列共同的特征：(1)它们都不具有支撑重量的骨结构，因为在治疗时它们都不能支撑病人体中例如小于大约5毫米厚度的胫骨或股骨的皮质层骨；以及(2)由于研磨骨样或骨碎片具有很高的表面/容积比，所以其脂类基本上都不能介入其中可除去材料的固定化过程。
虽然本发明实践中采用低于环境压力的大气压力，但是通常发现(参见下面的实施例6-10)：为了获得有益效果一般需要大约0.7大气压或更低的压力，最优选的压力通常是大约0.3-0.1大气压。据发现，具有可以测量网状骨组织的大尺寸骨片(例如股骨头、外股骨和内胫骨)，最好在大约0.2-0.13大气压下处理。特定骨片需要使用的最佳大气压力，可以根据具体用途来确定，而且取决于在一或多个低大气压接触步骤之前进行的其他清洗或脱污染步骤之组合及特定顺序。使骨与低于环境压力的大气进行接触的最佳温度，一般约为20-60℃。而使压力保持在环境压力之下的最佳时间，一般来说同样处于30-60分钟范围内，但是对于每个用途来说，可以采用监测血和脂提取进程的方法确定(参见实施例10)。一般而言，使用低于环境压力之气体压力少于2分钟时无效，而超过5小时也不会产生进一步效果。
然而，对于实施本发明，就适于本发明使用的最佳低大气压条件来说，已经确定：使用过低的压力一般来说也是无效的。采用过低的压力会产生类似于冷冻干燥设备中看到的那种冻结效果，即骨中的可除去材料最初迅速离开所述的骨，但是在此之后由于包括脂类在内的所述的材料原位冻结而不能进一步得到清洗或脱污染。引起这种无清洗作用的精确低压力范围是许多参数(其中包括脂类、血液和骨髓的冻结温度以及骨表面积)的函数，而0.001大气压是一种不可接受压力的典型代表。对于骨样品和设备的各种具体组合，可以测定不可接受的低压的范围。
也已经发现，低于1.0大气压的大气与骨样内部基质的直接或间接接触过程，由于在骨样上钻有一或数个足够深度的孔而得以加速(例如，参见下面的实施例7-10以及下图1-4)。就本发明来说，下列各项可以作为实施时的指南：
(1)可能的情况下，一或数个孔应当钻在本领域知道的那种支撑重量最小的骨样区域之内，例如，参见显示股骨的图1-4。
(2)根据骨样的种类选择所述的孔深度，孔深优选5-100毫米，对于人骨样(其中包括人股骨，参见实施例7-10)来说，孔深优选10-30毫米左右。虽然孔的数目、尺寸、深度和位置是由实践者加以确定的，但是所述的孔的直径优选0.5-3毫米左右。
下列的实施例用于详细说明和更具体描述本发明的母实施方案和本实施方案。
实施例1
步骤1：初步脱污染
人骨经采集和培养后发现被各种细菌和真菌污染，所述的污染菌包括：
            葡萄球菌(阴性凝结酶)
            肠球菌
            白色念珠菌
            无硝不动杆菌
            肺炎克雷伯氏杆菌。
将髂骨浸泡在5％PVP-I(聚乙烯基吡咯烷酮-碘，GAF出售的C15络合物)溶液中。除去外部的粗组织和脂肪，再将骨置于5％PVP-I中，总浸泡时间为1小时，然后检验骨(五个平行样)中残余的污染物。下表示出本方法与在生理盐水(阳性对照)中和杆菌肽/多粘菌素混合剂中培养的对照情况。
     溶液            微生物总数/骨
     预处理          8700
     后处理
     生理盐水                11000
     抗菌素混合剂            4300
     5％PVP-I               330
上述结果说明，在减少感染微生物数目方面，5％PVP-I优于所述的抗菌素处理。
步骤2：清洗
37℃将所述的骨移入一个内含1％(容积)辛基苯氧聚乙氧基乙醇(商标名为：Triton X-100)的带螺旋盖的罐中，然后在漆罐振荡器(由RedDevil公司制造的0-5400-OM型)上剧烈振荡10分钟。将骨转移至1％Triton X-100温热清洗液中后，处理过夜(37-42℃下大约15-18小时)并且剧烈振荡10分钟。将骨移入1％Triton X-100新鲜溶液中后再次剧烈振荡10分钟。残余的骨髓使用无菌水灌洗除去。
接着，将骨置于3％过氧化氢溶液中振荡10分钟，然后熟化总时间达60分钟。
经过清洗的骨使用无菌水灌洗和反复漂洗，彻底洗涤到无洗涤剂泡沫时为止。
步骤3：最终脱污染
将经过清洗的骨在室温下置于1％PVP-I中，剧烈振荡10分钟，并且处理总时间达30分钟，然后从溶液中将其取出。
步骤4：储存
必要时，可以使PVP-I留在骨上干燥，使骨呈现出丰富的金黄色并防止感染剂的进一步污染。然后可以使经过如此涂布的骨冷冻干燥。同样，必要时，也可以通过使PVP在骨上干燥的方法用PVP涂敷所述的骨。
实施例2
步骤1：初步脱污染
由地方采购单位收集整个人膝骨，包装后放在湿冰上运输到骨处理实验室中。
在实验室中，将膝骨置于1-5％PVP-I，0.15M氯化钠溶液中10-60分钟。
步骤2：组织的制备和清洗
除去带有连接骨块的下列膝组织：
           --髌骨腱
           --后十字形韧带
           --前十字形韧带
           --半月板。
修剪所述的骨片，除去过多的组织和脂肪。将韧带或腱包裹在无菌包裹物(例如塑料包装或无菌罩布)中，同时使用1％的温(40-65℃)TritonX-100溶液灌洗，然后使用无菌水或生理盐水彻底漂洗，用这样方法清洗所述的骨段。
步骤3：最终灭菌
将所述的组织置于1％PVP-I，0.15M氯化钠溶液中，室温下缓缓振荡一小时，然后使用无菌水或生理盐水彻底漂洗。每片骨在低温下保藏、包装并且储存于液氮之中，
实施例2(补充)
据测定，有关实施例2步骤2中使用的Triton X-100而言，其优选浓度为0.1％。
实施例3
步骤1：初步脱污染
人骨diaphysial经地方采购部门收集和包装后，用湿冰冷却下运输至骨加工处理实验室。
在该实验室将骨放入5％PVP-I，1％Triton X-100之中10-60分钟。
步骤2：组织制备和清洗
骨经清除处理除去过量组织和脂肪，然后将其置于5％PVP-I，1％Triton X-100之中。接着利用在温的(40-65℃)1％ Triton X-100之中灌洗和熟化，随后使用无菌水漂洗，将骨进一步洗净。
在骨磨中将骨研磨成骨片，经无菌水漂洗之后冷冻干燥。接着，在Tekmar骨磨中将所述的骨片研磨成更细的骨粉。
步骤3：脱矿化
所述的骨粉用0.6N的冷盐酸脱去矿物质，然后用无菌水漂洗。
步骤4：最终灭菌
经脱矿化处理的骨粉置于1％PVP-I中一小时，然后用无菌水充分漂洗。骨粉移至小瓶中冷冻干燥并包装之后保存在室温下。
实施例4
使用PVP-I灭活进行最终灭菌
骨经按类似实施例1的处理之后，置于20毫升1％PVP-I中熟化一小时。熟化后加入0.132毫升0.91抗坏血酸钠。此溶液几乎立即变成清澈的，10分钟之后所述的骨颜色变成其天然的灰白色。
实施例5
本例比较了使用标准方法得到的结果和使用高压/提高的温度洗涤剂清洗法得到的结果。清洗后，为了更好的展示清洗程度将所述的股骨头劈开。
图5右方所示的股骨头，在60℃下1％(体积)Tween-80之中熟化2天，定期使用漆罐振荡器(由Red Devil公司制造的0-5400-OM型)搅动10分钟。所述的股骨头然后使用温水灌洗，接着在3％过氧化氢中熟化20分钟，以后再次使用温水灌洗除去过氧化氢。
图5左方所示的股骨头是使用标准方法清洗的；即用60℃水灌洗15分钟，在3％过氧化氢中熟化15-20分钟，以后再次使用60℃温水灌洗除去过氧化氢，在70％乙醇中熟化1小时，再次使用60℃温水灌洗除去乙醇。图5是经过这样清洗得到的骨的照片。
实施例6
采用低于环境压力的大气处理的人股骨
由供骨者取下的股骨经过清创后，从远端切下大约15厘米。将此远端段竖直地置于真空保干器中，使此股骨头处于最上端而且其骨干处于最下端。使用市售真空泵(Gast出品，DOA-P104-AA型)抽真空一小时(导致真空室压力达0.15大气压时，大约相当25英寸汞柱)。在此操作期间，骨的温度维持在20-25℃下。收集了大约37毫升脂类。
然后清洗该骨，将其置于60℃下0.1％Triton X-100水溶液中，接着在振荡器(市售的漆料振荡器，Red Devil 5400-CM型)上剧烈振荡10分钟。60℃下继续熟化大约3小时。然后，使用无菌水漂洗所述的骨。
实施例7
使用低于环境压力的大气加速多种骨样内基质中可除去材料的置换
人骨经过清创后切成包括内股骨、内胫骨、网状骨质定位销和髂骨楔在内的形状。然后将这些骨样在5％碘附(PVP-I，如前面提到的，BASF产品30/06)中熟化50分钟，然后转移到1％的上述碘附中熟化30-60分钟。在股骨和胫骨片(定位销除外)上钻一些1毫米×10毫米的圆柱形孔，如图1-4所示。然后，把全部骨样置于真空保干器中，使骨样在其中处于一个脂类接受容器之上。使用Gast DOA-P104-AA型泵抽真空1小时，使腔室压力达到25英寸汞柱(0.16大气压)，骨在其中保持在大约23℃。收集到了大约37毫升脂类和7.5毫升血。
实施例8
使用低于环境压力的大气加速髂骨楔中可除去材料的置换
使用置于60℃水中的0.1％Triton X-100溶液将按照实施例7制备的髂骨楔(长度约1.5英寸，宽度约0.75英寸)预热一小时，偶尔作缓缓振荡，然后移入50毫升收集管中。抽真空(620mm Hg)80分钟，使腔室压力达到0.15大气压(骨样温度保持在23℃)。在30分钟期间内收集到大约0.8毫升脂类。
实施例9
人股骨样品的处理
对于本操作来说，从供骨者的两股骨外端切下各大约5.5英寸的左右外股骨样品。右侧股骨样品按照本领域公知的上述方法，使用多粘菌素/杆菌肽溶液处理，而左股骨样品按照仅随其下所述的病毒失活法(也参见实施例1)处理。
因此，将骨的左侧样品浸泡在5％碘附溶液(5％PVP-I，BASF产品，30/60)中大约一小时，然后移入1/2升容积的新鲜碘附溶液(1％PVP-I，BASF产品，30/60)中大约一小时，此后进行清创。然后穿过皮质层和网状骨质层区在骨上大约钻五个孔(直径1-2毫米，深度20毫米)，如图4所示。
经过温水漂洗和干燥之后，将骨样放入真空保干器中，使用GastDAA-V175-E8型真空泵中使用26mmHg真空度抽真空30分钟，使所述的骨处于0.132大气压压力下。骨的温度大约为23-35℃或者稍高。经此真空处理，除去大约30毫升脂类。
使用温水灌洗5分钟之后，将骨样放在0.1％表面活性剂溶液中，并且按实施例8的方式搅动10分钟。然后加入新鲜的表面活性剂溶液，并且重复此方法直到溶液完全清澈为止。接着，在60℃下使用另一份表面活性剂溶液处理3小时。用水漂洗之后，将骨移入3％过氧化氢水溶液中浸泡5-15分钟，然后用水漂洗。随后，将洗净的骨移入1％碘附溶液(PVP-I)中浸泡1小时，用水漂洗，之后用水将容器充满。加入还原剂硫代硫酸钠，使残留的碘转化成碘离子，所述的骨使用水充分漂洗之后储存。
为了比较本发明的移植骨和使用传统方法得到的骨，如上述提到的那样，按照本领域公知的多粘菌素/杆菌肽法处理右侧股骨样品。因此，对右侧股骨样品进行清创后，置于盛有温水的容器之中，用手振荡所述的容器，倾出含有脂类的水，然后加入新鲜热水。此过程重复到水中的脂类含量极少时(大约0.5小时)为止。使用传统方法得到的骨依然保留其不适于临床使用的特点，例如由于残留的血而呈红棕色，而且由于残留的脂类而具有油状残渣。
实施例10
在大气压(低于环境压力的)作用下从股骨中流出血和脂类的证据
对于单个骨样(如图4所示的带有数个1-2mm钻孔的人外股骨样品)测定了有效的大气压力。使用手动真空泵降低空气压力，每次降低2.5英寸Hg(大约0.08大气压)的压力。使骨样在设定的每个压力下保持5分钟，并且测量每个时间间隔内产生的血液和/或脂肪的滴数。试验结果示于下表1之中。
                         表1
 真空度    大气压％       容积(滴数/5分钟)     液滴的特性
(英寸汞柱)
   0           1.0               3                只含血
   2.5         0.92              2                只含血
   5                             4                只含血
   7.5                           1             2份脂类＋3份血
   10          0.66              5                只含脂类
   12.5                          8                只含脂类
   15                            11               只含脂类
   17.5                          18               只含脂类
   20                                  28            只含脂类
   22.5                                38            只含脂类
   25             0.16                 82            只含脂类

Claims (27)

1.一种移植骨的制备方法，所述的骨含有其本身包含可除去材料的内部基质，所述的方法包括使所述的骨与低于环境压力的大气接触的步骤。
2.按照权利要求1所述的方法，其中在所述的大气与所述的骨接触期间，使所述的骨与脱污染剂或洗涤剂保持接触。
3.按照权利要求1所述的方法，其中包括使所述的骨或其所述的基质与含有洗涤剂或脱污染剂的溶液接触的附加步骤。
4.按照权利要求3所述的方法，其中包括在与所述的大气进行所述的接触之前，使所述的骨或其所述的基质与洗涤剂或者与脱污染剂接触的步骤，而且还包括在与所述的大气接触之后，使所述的骨或其所述的基质与洗涤剂或者与脱污染剂接触的步骤。
5.按照权利要求3所述的方法，其中所述的脱污染剂能够使一种或多种细菌、真菌、病毒、朊病毒或寄生虫失活。
6.按照权利要求1所述的方法，其中在与所述的大气接触之前或者之后，使所述的骨经历高压洗涤条件。
7.按照权利要求6所述的方法，其中所述的高压洗涤条件包括使用高速液流灌洗。
8.按照权利要求6所述的方法，其中所述的高压洗涤条件包括剧烈搅动。
9.按照权利要求1所述的方法，其中在与所述的大气接触之前、期间或者之后，使所述的骨经历提高温度处理。
10.按照权利要求9所述的方法，其中所述的提高温度处于约37℃至约80℃之间。
11.按照权利要求10所述的方法，其中所述的提高温度处于约50℃至约65℃之间。
12.按照权利要求3所述的方法，其中所述的脱污染剂选自乙醇、过氧化氢、洗必泰、次氯酸盐和碘附。
13.按照权利要求12所述的方法，其中所述的脱污染剂是碘附。
14.按照权利要求13所述的方法，其中所述的碘附是分子量低于100000的聚乙烯吡咯烷酮碘。
15.按照权利要求1所述的方法，其中所述的大气与所述的基质接触的过程因在所述的骨上钻有一或数个孔而得以加速。
16.按照权利要求15所述的方法，其中所述的一或数个孔钻在所述的骨承重最小的区域内。
17.按照权利要求16所述的方法，其中所述的孔直径大约为0.5-3mm。
18.按照权利要求17所述的方法，其中所述的孔深度大约为10-30mm。
19.按照权利要求1所述的方法，其中所述的大气压力约为0.7大气压或更低，而且与所述的骨接触大约2分钟-5小时。
20.按照权利要求19所述的方法，其中所述的大气压力约为0.3大气压或更低，而且与所述的骨接触大约30-60分钟。
21.按照权利要求19所述的方法，其中所述的大气压力约为0.2大气压或更低，而且与所述的骨样接触大约30-60分钟。
22.按照权利要求1所述的方法，所述的方法便于使病毒失活。
23.一种处理含有内部基质的骨的方法，所述的基质本身含有预定量的与所述的骨具有显著亲合力的可除去材料，所述的方法包括使所述的基质与低于环境压力的大气接触的步骤，然后在与之接触时使所述的大气维持足够长的一段时间，使所述数量的可除去材料减少到其所述的预定值之下。
24.一种处理含有预定量可除去材料的骨的内部基质的方法，所述的基质还含有预定量的基本上使所述的可除去材料固定化的脂类，所述的方法包括使所述的基质与低于环境压力的大气接触足够长的一段时间，使所述的脂类含量减少到其所述的预定值之下。
25.一种处理骨的方法，所述的骨含有一部分内部基质，于环境压力下和在其所限定的空间中，所述的基质含有预定量可除去材料，所述的方法包括使所述的基质外部空间和与基质接触的外部空间低于环境压力足够长的一段时间，使残留在所述限定空间内的可除去材料数量减少到其所述的预定量之下。
26.按照权利要求1的方法生产的、适于移植到病人体内的骨。
27.按照权利要求24的方法生产的、适于移植到病人体内的骨。
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