CN1151760A - 血清对氧磷酶 - Google Patents

Abstract

本发明披露了人血清对氧磷酶和编码此血清对氧磷酶的DNA(RNA)。还提供了通过重组技术生产此多肽的步骤。此多肽的用途包括用作有机磷中毒的解毒剂和防止神经元细胞死亡。本发明还披露了鉴定编码本发明的多肽的核酸序列中的突变和检测本发明的多肽水平改变的诊断分析方法。

Description

血清对氧磷酶

本发明涉及新鉴定的多核苷酸，由此多核苷酸编码的多肽，此多核苷酸和多肽的应用，以及此多核苷酸和多肽的生产。更具体地说，本发明的多肽为血清对氧磷酶。本发明还涉及此多肽活性的抑制。

对硫磷(二乙基-对-硝基苯基硫代磷酸)和chlorpyrifos(O，O-二乙基-O-3，5，6-三氯-2-吡醇(pyridinol))是普遍使用的有机磷杀虫剂，每年都有大量农业工人和其它工人因此而中毒(Hayes，W.J.，Pesticides Studied in Man，Wilkins and Wilkins，Baltimore，pp.284-435(1982))。两种化合物在体内激活形成相应的胆碱酯酶的毒性氧磷抑制剂。这导致神经元细胞死亡和相关的神经紊乱。两种氧磷被血清酶对氧磷酶/芳基酯酶水解，如果不是全部，那就是绝大多数的酶位于高密度脂蛋白(HDL)颗粒中(Mackness，M.I.，et al.，Biochem.Pharmacol.，32：2291-2296(1983))。

在人类中，这种酶显示依赖底物的活性多态性(Mallinckrodt，M.G.and Diepgen，T.L，Toxicol.Environ.Chem.，18：79-196(1988))。人血清对氧磷酶/芳基酯酶催化有机磷化合物，芳香羧酸酯和氨基甲酸酯的水解。似乎存在两个等位基因，一个等位基因产物以高的转换数水解对氧磷，另外一个以低的转换数水解对氧磷。其他底物诸如苯乙酸酯，β和萘乙酸酯(Gan，K.N.，et al.，Drug Metab.Dispos.，19：100-106(1991))和chlorpyrifos氧磷(Furlong，C.E.，et al.，Anal.Biochem.，180：242-247(1989))被两个等位基因产物以相同的或相近的速率水解。此酶还水解神经毒剂soman和沙林(Gan，K.N.，et al.，Drug Metab.Dispos.，19：100-106(1991))。对有神经毒性的有机磷化合物的水解是对氧磷酶的一个有益的偶然的活性。

根据本发明的一个方面，提供了一个新的成熟多肽，和其有生物学活性并有益于诊断或治疗的片段，类似物和衍生物。本发明的多肽是人源性的。

根据本发明的另一个方面，提供了编码本发明多肽的分离的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因组DNA，及其类似物和有生物学活性的有益于诊断或治疗的片段。

根据本发明的另一个方面，提供了通过重组技术生产此多肽的方法，包括在促进所说蛋白质表达和所说蛋白的回收的条件下培养含有编码本发明多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。

根据本发明的另一个方面，提供了此多肽或编码此多肽的多核苷酸用作药物的方法，例如，作为有机磷中毒的解毒剂(杀虫剂中毒)和防止神经元细胞死亡。

根据本发明的另一个方面，提供了一个抗此多肽的抗体。

根据本发明的另一个方面，提供了核酸探针，包括与本发明的核酸序列特异性杂交的足够长的核酸分子。

根据本发明的另一个方面，提供了检测与编码本发明的多肽的核酸序列中突变有关的疾病或疾病易感性的诊断分析方法。

根据本发明的另一个方面，提供了利用此多肽或编码此多肽的多核苷酸进行体外目的的科学研究的方法，例如，DNA的合成和DNA载体的构建。

从本文的讲授中，本领域熟练技术人员应该明白本发明的这些和其它一些方面。

下列附图意在描述本发明实施方案的说明，并非是对由权利要求书所限定的本发明的范围的限制。

图1显示推断的成熟血清对氧磷酶多肽的cDNA序列和推测的氨基酸序列。氨基酸用标准的单字母缩写表示。

根据本发明的一个方面，提供了编码具有图1所示的推测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的成熟多肽或由1994年5月12日保藏的ATCC保藏号为75773的克隆的cDNA编码的成熟多肽的分离的核酸(多核苷酸)。

本发明的多核苷酸是从人扁桃体cDNA文库中发现的，结构上与人血清对氧磷酶/芳基酯酶家族有关。它含有一个编码约356个氨基酸残基的蛋白质的开放阅读框架。此蛋白质与oryctolagus cuniculus的血清对氧磷酶的同源性最高，在一个249个氨基酸片段中67％相同，83％相似。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与图1所示的编码序列(SEQ ID NO：1)相同，或与保藏克隆的编码序列相同，或者也可以是不同的编码序列，该编码序列由于遗传密码的丰余性或简并性，与图1的DNA(SEQ ID NO：1)或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。

编码图1的成熟多肽(SEQ ID NO：2)或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括：成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和另外的编码序列如前导序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)和非编码序列如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即仅包括多肽编码序列的多核苷酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)的多肽或编码由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸的变异体可以是天然发生的该多核苷酸的等位基因变异体，或是该多核苷酸的非天然发生的变异体。

因此，本发明包括编码图1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，所述变异体编码图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体、置换变异体和增加或插入变异体。

如上所述，多核苷酸可以具有为图1所示的编码序列(SEQ ID NO：1)的天然发生的等位基因变异体的编码序列，或保藏克隆的编码序列的天然发生变异体的编码序列。如本领域所公知的，等位基因变异体是多核苷酸的另一种形式，其可以置换、缺失或增加一个或多个核苷酸，但基本上不改变编码多肽的功能。

本发明还包括这样的多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在同一读框中与有助于从宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列融合，例如前导序列，其功能是作为分泌序列控制多肽从细胞中的转运。具有前导序列的多肽是一种前蛋白，宿主细胞可裂解前导序列以形成多肽的成熟形式。所述的多核苷酸还可编码一种蛋白原，其是成熟蛋白加上附加的5’氨基酸残基。具有序列原的成熟蛋白是一种蛋白原及该蛋白的非活性形式。一旦序列原被切下，则保留一有活性的成熟蛋白。

因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白，或编码具有序列原的蛋白，或编码具有序列原或前序列(前导序列)的蛋白。

本发明的多核苷酸还可以具有在读框内与标记序列融合的编码序列，其可用于纯化本发明的多肽。标记序列可以是，例如，由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物用于在细菌宿主中纯化与该标记物融合的成熟多肽，或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素标记物(HA)。HA标记物相应于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37：767(1984))。

术语“基因”意思是产生多肽链的DNA片段；它包括编码区之前和之后的区域(前导序列和尾部序列)和各个编码片段(外显子)之间的中断序列(内含子)。

本发明的全长基因片段可以用作cDNA文库的杂交探针以分离全长的cDNA和分离与本发明基因的序列高度相似或有相似生物学活性的其它cDNA。这种类型的探针优选有至少30个碱基和可以含有，例如，50或更多个碱基。此探针还可以用于鉴定与全长转录文库和基因组文库相对应的cDNA克隆，或含有包括调和启动子区，外显子和内含子的完整基因的克隆。筛选的一个例子包括用已知DNA序列合成一个寡核苷酸探针以分离基因的编码区。具有与本发明的基因互补的序列的标记寡核苷酸被用来筛选人cDNA，基因组DNA或mRNA文库以确定探针可以杂交到哪个文库。

本发明还涉及可与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间具有至少70％、优选至少90％、更优选至少95％的同一性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用的，术语“严格条件”是指杂交仅发生在序列间具有至少95％、优选97％同一性的情况下。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保持了由图1的cDNA(SEQ ID NO：1)或保藏的cDNA编码的成熟多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。

作为选择，此多核苷酸可以有至少20个、优选至少30个、更优选至少50个可与本发明的多核苷酸杂交并与本发明的多核苷酸相同的碱基，如本文所描述的，这些碱基可能也可能不保留活性。例如，这种多核苷酸可以用作SEQ ID NO：1的多肽的探针以用于，例如，回收此多核苷酸或作为诊断探针或作为PCR引物。

因此，本发明涉及与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸有至少70％同一性，更好至少90％同一性和最好至少95％同一性的多核苷酸及其片段，其中的片段有至少30个碱基和有最好至少50个碱基，本发明还涉及由此种多核苷酸编码的多肽。

本文所指的保藏物将根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定期限保藏。这些保藏仅为本领域技术人员提供方便，而不是对根据35 U.S.C112索取保藏物的许可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及该序列编码的多肽的氨基酸序列引入本文作参考，并且在与本文的序列描述有抵触时，其是参照。制造、使用或销售保藏物需经许可，而本文不授予这种许可。

本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的血清对氧磷酶多肽，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。

当指图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持这些多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括蛋白原，其可通过裂解蛋白原部分而激活以生产有活性的成熟多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。

图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中的一或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基取代(优选由保守的氨基酸残基取代)，并且这种取代的氨基酸残基可以由遗传密码编码，也可不是由遗传密码编码，或者(ii)其中的一或多个氨基酸残基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物例如为增加多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iV)其中有附加的氨基酸与成熟多肽融合，例如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。这种片段、衍生物和类似物被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。

本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并优选纯化至均一性。

术语“分离的”是指从其原始环境(例如，若其是天然存在的则是天然环境)中脱离的物质。例如，存在于活体动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从一些或所有共存物质中分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是某种组合物的一部分，并且如果这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其还是分离的。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽(尤其是成熟多肽)及与SEQ ID NO：2的多肽有至少70％相似性(最好至少70％相同)的多肽和与SEQ ID NO：2的多肽有最好至少90％相似性(最好至少90％相同)的多肽和与SEQ ID NO：2的多肽有最好至少95％相似性(最好至少95％相同)的多肽，还包括通常含有至少30个氨基酸和最好至少50个氨基酸的此多肽的一部分。

如本领域所公知的，两个多肽之间的“相似性”是通过比较一个多肽与另一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸残基来确定的。

本发明多肽的片段或部分可以通过肽合成用于生产相应的全长多肽；因此，此片段可以用作生产此全长多肽的中间物。本发明的多肽的片段或部分可以用于合成本发明的全长多肽。

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞，以及用重组技术生产本发明的多肽。

宿主细胞用本发明的载体遗传工程化(转导或转化或转染)，所述的载体可以是克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。遗传工程化的宿主细胞可以在改良的传统营养培养基中培养，改良培养基是为了激活启动子，选择转化子或扩增血清对氧磷酶基因。培养条件如温度、pH等是先前用于选择用来表达的宿主细胞的条件，其对本领域普通技术人员是显而易见的。

本发明的多核苷酸可通过重组技术用于生产多肽，因此，例如，该多核苷酸可以包括在任一种表达载体中特别是载体或质粒中以表达多肽。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生于质粒和噬菌体DNA的结合体的载体；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和拟狂犬病毒。然而，也可使用任何其它载体，只要其在宿主中可复制和生存。

可通过多种程序将合适的DNA序列插入载体，通常，通过本领域公知的程序将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这些和其它程序属于本领域熟练技术人员的范畴。

表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA合成，作为这些启动子的代表性例子，可提及的有：LTR或SV40启动子，E.colilac或trp启动子，λ噬菌体P_L启动子和其它公知用于控制基因在原核细胞或真核细胞或者病毒中表达的启动子。表达载体还含有核糖体结合位点用于翻译起始和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的合适的序列。

另外，表达载体优选含有一个用于为选择转化的宿主细胞提供表型标记的基因，如对于真核细胞培养为二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如为四环素或氨苄青霉素抗性。

可采用含有如上所述合适DNA序列以及合适启动子或调控序列的载体转化合适的宿主以使宿主表达蛋白质。

作为合适的宿主的例子，可以提及的有：细菌细胞，如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇和粘虫Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。选择合适的宿主细胞被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。

更具体地，本发明还包括重组构建体，所述构建体包含一或多种上述序列。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，在该载体中以正向或反向插入本发明的序列。在这一实施方案的一个优选方面，该构建体还包括调节序列，包括例如，与所述序列连接的启动子。本领域熟练技术人员已知大量的合适的载体和启动子，它们是可商购的。以下举出载体的例子，细菌的载体：pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pbs，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体：pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它质粒或载体，只要其可在宿主中复制和生存即可。

启动子区可以选自使用CAT(氯霉素转移酶)的载体或其它带有选择性标记的载体的任何所需基因，两个合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI，1acZ，T3，T7，gpt，lambda P_I，P_L和trp；真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体和启动子属于本领域普通技术人员的水平范畴。

在另一实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞，所述的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))将构建体导入宿主细胞。

可以用传统的方式使用宿主细胞中的构建体以生产由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。

在合适的启动子的控制下，可以在哺乳细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白质，也可采用无细胞翻译系统使用由本发明的DNA构建体衍生的RNA生产这种蛋白质。原核和真核宿主使用的合适的克隆和表达载体见Sambrook，et al，Molecular Clonning：ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，该书引入本文作参考。

高等真核生物对编码本发明的多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一增强子序列而得以增加，增强子是约10-300bp的顺式作用的DNA因子，其作用于启动子以增加其转录。其例子包括位于复制起点晚期侧(100-270bp处)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。

通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞的转化的选择标记，如E.coli的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。这种启动子可以衍生于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白的操纵子。在合适的阶段，杂合结构序列装配上翻译起始和终止序列，以及优选地，装配一能指导翻译的蛋白质进入周质空间或胞外培养基的前导序列。任选地，杂合序列可以编码一包括N-末端鉴别肽的融合蛋白质，以赋予所需的特征，如表达的重组产物的稳定性和纯化简便性。

用于细菌的表达载体的构建是通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入带有功能启动子的可操纵阅读相而完成。载体包括一或多种表型选择标记及一个复制起点以确证载体保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中扩增。合适的用于转化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各菌种，当然，也可采用其它菌。

作为代表性而非限制性的例子，有用的细菌表达载体可以包括衍生于包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的选择标记和细菌复制起点，这些商购质粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子及待表达的结构序列结合。

转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至合适的细胞密度后，用合适的方法(如温度改变或化学诱导)诱导选定的启动子，并继续培养细胞一段时间。

典型地，细胞由离心收集，用物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以进一步纯化。

用于表达蛋白质的微生物细胞可用任何常规方法破碎，如冻-融循环、超声处理、机械破碎，或使用细胞裂解试剂，这些方法是本领域技术人员公知的。

也可使用各种哺乳细胞培养系统表达重组蛋白，哺乳细胞表达系统包括由Gluzman，Cell，23：175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及其它能表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’旁侧非转录序列。可使用源自SV40剪接体的DNA序列和多腺苷酸化位点以提供所需的非转录遗传因子。

血清对氧磷酶多肽可以通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水互作层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析的方法从重组细胞培养物中回收并纯化。如果需要，可以使用蛋白质再折叠步骤以完成成熟蛋白的构象。最后，可以用高压液相色谱(HPLC)作为最后的纯化步骤。

本发明的多肽可以是一个天然纯化的产物，或是化学合成方案的产物，或是通过重组技术从原核或真核宿主产生(例如，通过培养的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)。根据重组生产步骤中所用的宿主的不同，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽还包括一个起始的甲硫氨酸氨基酸残基。

本发明的血清对氧磷酶多肽可以用作有机磷中毒的解毒剂，因为胆碱酯酶的毒性氧磷抑制剂可以被血清对氧磷酶水解。

血清对氧磷酶多肽可以用于阻止因这类中毒引起的神经元细胞死亡。如果不治疗有机磷中毒，将导致神经元细胞死亡。

本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。血清对氧磷酶基因的位置靠近染色体7上的囊性纤维化基因。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。

本发明的多肽可以与合适的药物载体结合应用，这种组合物包括治疗有效量的多肽以及药物学可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水、缓冲的盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其结合物。配制品应适合给药方式。

本发明还提供了一种药物包装盒或试剂盒，其包括一或多个填充有一或多种本发明的药物组合物成分的容器。与这种容器在一起的还有由控制药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构出具的通知，该通知反应了该机构许可其为人体用而生产、使用或销售。另外，本发明的多肽可以与其它治疗化合物结合应用。

所述的药物组合物可以以传统的方式给药，如口服、局部、静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、鼻内或皮内给药。血清对氧磷酶的给药量应足以有效治疗和/或预防具体的症状。通常血清对氧磷酶是以至少约10μg/kg体重而给予，在大多数情况下，给药量不超过约8mg/kg体重/天，考虑到给药途径、症状等，剂量是约每天为10μg/kg体重-1mg/kg体重。

根据本发明，这些多肽还可以用于体内表达，即通常所指的“基因治疗”。

因此，例如，患者的细胞可以用编码某多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在体外进行工程化，然后用工程化的细胞提供给需要此多肽治疗的患者。这些方法是本领域所熟知的。例如，细胞可以通过本领域所熟知的方法使用含编码本发明多肽的RNA的逆病毒颗粒进行工程化。

类似地，例如也可通过本领域公知的程序在体内对细胞进行工程化以在体内表达多肽。如本领域所公知的，可将生产含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产者细胞给予患者以在体内进行细胞的工程化并在体内表达多肽。通过这种方法给予本发明的多肽的这些和其它方法对于本领域熟练技术人员根据本发明的教导是显而易见的。例如，用于工程化细胞的表达载体可以不是反转录病毒，而是例如腺病毒，其在与合适的输送载体结合后可用于在体内工程化细胞。

衍生上述反转录病毒质粒载体的反转录病毒可以包括，但不限于，莫洛尼氏鼠白血病毒，脾坏死病毒，反转录病毒诸如劳氏肉瘤病毒，哈维氏肉瘤病毒，禽类白血病病毒，长臂猿白血病病毒，人类免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增生肉瘤病毒，和乳腺肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体由莫洛尼氏鼠白血病毒衍生而来。

载体包括一个或多个启动子，可以使用的适当的启动子包括，但不限于，反转录病毒LTR，SV40启动子，和Miller，et al.，Biotechniques，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述的人细胞肥大病毒(CMV)启动子，或任何其它启动子(例如，诸如真核细胞启动子的细胞启动子包括，但不限于，组蛋白，pol III，和β-肌动蛋白启动子)。其它可以使用的病毒启动子包括，但不限于，腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子，和B19细小病毒启动子。根据本文的讲授，本领域熟练技术人员应该明白如何选择适当的启动子。

编码本发明多肽的核酸序列处于一个适当的启动子控制之下。可以使用的适当的启动子包括，但不限于，诸如腺病毒主晚期启动子的腺病毒启动子；诸如细胞肥大病毒(CMY)启动子的异源启动子；呼吸合胞体病毒(RSV)启动子；诸如MMT启动子的诱导性启动子；金属硫蛋白启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；诸如单疱疹胸苷激酶启动子的病毒胸苷激酶启动子；反转录病毒LTR(包括上面描述的修饰的反转录病毒LTR)；β-肌动蛋白启动子；人生长激素启动子。启动子还可以是控制编码本发明多肽的基因的天然启动子。

反转录病毒质粒载体用来转染包装细胞系以形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞系的例子包括，但不限于，如Miller，Human Gene Therapy，Vol.1，pgs.5-14(1990)(引入本文作为参考文献)描述的PE501，PA317，φ-2，φ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，φCRE，φCRIP，GP＋E－86，GP＋envAm12，和DAN细胞系。载体可以通过本领域所公知的任何方法转染包装细胞，这些方法包括，但不限于，电穿孔法，脂质体法和磷酸钙沉淀法。在一个选择中，反转录病毒质粒载体可以被装入脂质体内，或与脂质相伴随，然后转染宿主。

生产细胞系产生感染性反转录病毒颗粒，其中包括编码本发明多肽的核酸序列。然后这些反转录病毒载体颗粒可以用于体外或体内转染真核细胞，转染的真核细胞将表达编码本发明多肽的核酸序列。可以被转染的真核细胞包括，但不限于，胚干细胞，胚癌细胞，以及造血干细胞，肝细胞，成纤维细胞，成肌细胞，角质细胞，内皮细胞，和支气管上皮细胞。

本发明还涉及本发明的基因用作诊断的用途。此基因的突变体的检测将使某疾病的诊断或对因血清对氧磷酶低水平表达引起的疾病的易感性的诊断成为可能。

携带本发明基因的突变的个体可以通过各种各样的技术在DNA水平上进行检测。用于诊断的核酸可以从患者的细胞中获得，包括但不限于，血液，尿，唾液，组织活体解剖和尸检材料。基因组DNA可以直接用于检测，或在分析前用PCR方法扩增(Saiki et al.，Nature，324：163-166(1986))。RNA和cDNA也可以用于同样目的。作为一个例子，与编码血清对氧磷酶的核酸互补的PCR引物可以用于鉴定和分析突变。例如，缺失和插入可以通过与正常基因型的扩增产物相比片段长度大小的改变来检测。点突变可以通过将扩增DNA与放射性标记的RNA或放射性标记的反义DNA序列杂交来进行鉴定。可以通过核糖核酸酶A消化或熔点温度的改变将精确配对的序列从错误配对的双螺旋中区别出来。

参考基因和有突变的基因之间的序列差异可以通过直接的DNA测序方法来揭示。另外，克隆的DNA片段可以用作探针以检测特定DNA片段。当这种方法与PCR方法结合时其灵敏性大大加强。例如，某测序引物与双链PCR产物或通过修饰的PCR方法产生的单链模板分子共同使用。序列测定用传统的放射性标记的核苷酸方案或用荧光标记物的自动测序方案。

基于DNA序列差异的遗传学测试可以通过检测有或没有变性剂时DNA片段在凝胶内的泳动性的改变来完成，小的序列缺失和插入可以通过高分辨率凝胶电泳看到。不同序列的DNA片段可以在变性的甲酰胺梯度凝胶上分开，在这种凝胶中不同DNA片段的泳动性根据其特定的熔解或部分熔解温度被阻滞在凝胶的不同位置(参见，例如，Myers et al.，Science，230：1242(1985))。

在特定位点上的序列改变也可以用核酸酶(如核糖核酸酶)保护分析，和S1保护或化学断裂方法来揭示(例如，Cotton et al.，PNAS，USA，85：4397-4401(1985))。

因此，某特定DNA序列的检测可以用诸如杂交，核糖核酸酶保护，化学断裂，直接的DNA测序或使用限制酶(例如，限制性片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern杂交等方法来完成。

除了更传统的凝胶电泳和DNA测序方法外，突变还可以通过原位分析来鉴定。

本发明还涉及检测各种组织中本发明多肽的水平改变的诊断分析，因为与正常的对照组织样品相比此蛋白的过量表达可以检测血清对氧磷酶的存在。用于检测从宿主获得的样品中的本发明的多肽水平的分析方法是本领域熟练技术人员所公知的，包括放射免疫分析，竞争性结合分析，Western杂交分析和优选的ELISA分析(酶联免疫吸附分析)。ELISA分析包括制备血清对氧磷酶抗原特异性的抗体，优选是单克隆抗体。另外通过抗此单克隆抗体来制备报道抗体。报道抗体被结合上一种可检测到的试剂，如放射性，荧光或实施例中的辣根过氧化物酶。某样品从宿主中取出并在固体支持物，例如一个聚苯乙烯皿上温育，以使样品中的蛋白与之结合。然后通过与诸如牛血清白蛋白的非特异性蛋白温育封闭皿上的任何自由的蛋白结合位点。接下来，单克隆抗体在皿中温育，在这段时间内单克隆抗体结合到与聚苯乙烯皿结合的任何本发明的多肽。所有未结合的单克隆抗体用缓冲液洗掉。然后将偶联辣根过氧化物酶的报道抗体放入皿中，从而导致报道抗体与任何与本发明的多肽结合的单克隆抗体相结合，然后未结合的报道抗体被洗掉。随后将过氧化物酶底物加入皿中，与标准曲线相比，在指定的时间内产生的颜色的深浅是衡量患者样品的指定体积中本发明的多肽的数量的标尺。

竞争性分析是将本发明多肽的特异性抗体结合到固体支持物上，标记的血清对氧磷酶和宿主样品通过此固体支持物，结合到此固体支持物上标记的数量与样品中本发明的多肽的数量呈相关性。

本发明还提供了筛选药物的方法以鉴定那些增强(激动剂)血清对氧磷酶和其底物相互作用的药物，该方法包括，例如，用多种药物和对硫磷或chlorpyrifos接触包含编码血清对氧磷酶的DNA分子的哺乳动物细胞，检测那些增强毒性氧磷被血清对氧磷酶水解的药物，然后即可鉴定起特异性激动剂作用的药物。可以使用各种各样的检测方法，毒性氧磷可以用一种可检测的标记物质来“标记”(例如，放射性标记或非同位素标记，如生物素)以使其水解可以测量。用本领域所公知的放射性配基结合方法，通过选择与转染细胞内表达的血清对氧磷酶多肽高亲和性结合的化合物来鉴定药物候选者。

本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。

简而言之，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而将序列定位在染色体上。使用基因的3’非翻译区的计算机分析快速选择长度不超过基因组DNA的一个外显子并因而不会使扩增复杂化的引物，随后使用这些引物对含有个别的人染色体的体细胞杂合子进行PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合子能得到扩增产物。

体细胞杂合子的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的一个快速程序。采用本发明相同的寡核苷酸引物，可以类似的方式将来自特定染色体的一组片段或大基因组克隆的集合体进行亚定位。其它的可类似用于染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流选的染色体进行的预筛选，以及通过杂交预选以构建染色体-特异cDNA文库。

cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步法染色体定位。这一技术可使用短至50或60个碱基cDNA。此技术的综述见Verma et al.，HumanChromosomes：a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦某一序列已被精确定位于染色体某一位置，则可比较该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱资料的关系，这种资料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man中发现(可在线从Johns Hopkins University Welch Medical Library获得)。随后可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)鉴别基因与已定位于相同染色体区的疾病之间的关系。

接着，必须确定感染个体和未感染个体之间的cDNA或基因组序列的差异，如果在一些或所有感染个体中观察到某一突变而未在任何正常个体中观察到这种突变，则该突变可能是该疾病的致病原。

应用目前的物理作图和遗传作图技术的分辨率，一种精确定位于与疾病有关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在的致病基因中的一个(这假定作图分辨率为1兆碱基，并且每20kb为一个基因)。

多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达其的细胞可用作免疫原生产抗体，这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体，以及Fab片段，或者Fab表达文库的产物。可使用现有技术中公知的各种程序生产这些抗体和片段。

抗对应于本发明的序列的多肽的抗体可以通过将多肽直接注射给动物或将多肽给予动物、优选非人而获得，如此获得的抗体随后与多肽本身结合。以这种方式，仅编码多肽的一个片段的序列也可用于生产与完整天然多肽结合的抗体，这种抗体随后可用于从表达该多肽的组织中分离该多肽。

为制备单克隆抗体，可使用任何提供由连续细胞系培养物生产的抗体的技术，例如杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256：495-497)，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(kozbor et al.，1983，Immunology Today 4：72)，以及生产人单克隆多肽的EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)。

用于生产单链抗体的技术(USP4.946，778)可以用来生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。另外，转基因小鼠也可用于表达本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。

以下述实施例为参考将进一步描述本发明；但是众所周知，本发明不仅限于这些实施例。除非另有特别描述，所有的份和量都根据重量。

为促进对下述实施例的理解，以下将描述常用的方法和/或术语。

“质粒”的命名是将小写字母p置于前面和/或后跟大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者是商购得到的，或者是公众可以不受限制地得到的，或者可以根据公布的程序由可得到的质粒构建的。另外，与所述的这些等效的质粒是本领域公知的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。

DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的特定序列的限制性酶对DNA的催化裂解。本文所用的各种限制性酶是可商购的，其反应条件、辅因子和其它要求对于本领域普通技术人员是公知的。为分析目的，典型地，1μg质粒或DNA片段使用约2单位的酶，反应体积为20μl缓冲液；为分离DNA片段用于构建质粒的目的，典型地，在较大体积中用20-250单位酶消化5-50μgDNA。对特定限制性酶的合适的缓冲液和底物由厂商提供。通常使用37℃1小时的温育时间，但可根据供应商的指示而变化。消化后，将反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶上电泳以分离所需片段。

裂解片段的大小分离是根据Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行。

“寡核苷酸”是指可化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两个互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸则不能与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有经过脱磷酸化的片段连接。

“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有说明，连接可以采用公知的缓冲液，在每0.5μg约等摩尔的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)的条件下进行。

除非另有说明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52：456-457(1973)的方法进行转化。

         实施例1血清对氧磷酶的细菌表达和纯化

编码血清对氧磷酶的DNA序列，ATCC#75773，首先用对应于加工的血清对氧磷酶蛋白的5’基因序列(减去信号肽序列)和血清对氧磷酶基因3 ’端的载体序列的PCR寡核苷酸引物扩增。与血清对氧磷酶相对应的附加序列相应地加到5’和3’序列上。5’寡核苷酸引物的序列为5’-TCAGGATCCAGAAATCGACTTAAAGCCTCC-3’(SEQ IDNO：3)，其含有一个Bam HI限制酶位点，后跟从加工蛋白密码子的假定末端氨基酸起始的血清对氧磷酶密码序列的21个核苷酸。3’序列为5’-TCAAAGCTTTAGAGTTCACAATACAAGGC-3’(SEQ ID NO：4)，含有与Hind III限制酶位点的互补序列并后跟血清对氧磷酶的21个核苷酸。限制酶位点与细菌表达载体pQE-9上的限制酶位点相对应(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE-9编码抗生素抗性(Amp)，一个细菌复制起始点(ori)，一个IPTG-可调节启动子操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-His标记物和限制酶位点。然后pQE-9用Bam HI和Hind III消化。扩增的序列连入pQE-9并与编码组氨酸标记物和RBS的序列在一个读框中。然后连接混合物用于转化大肠杆菌SURE(可从Stratagene Cloning Systems，11099 NorthTorrey Pines Road，LA Jolla，CA 92037得到)，操作方法按Sambrook，J et al，.MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，1989进行。转化子按他们在LB平板上的生长能力来鉴定，选择对氨苄青霉素/卡那霉素有抗性的菌落。分离质粒DNA，进行限制分析鉴定。含所需构建体的克隆在补加Amp(100μg/m1)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。过夜培养物以1∶100到1∶250的比率进行扩大培养。细胞生长至光密度600(O.D.⁶⁰⁰)值在0.4到0.6之间，然后加入IPTG(“异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至终浓度为1mM。IPTG通过使lacI抑制子失活，清除P/O来诱导增强基因表达。细胞继续生长3到4个小时，然后离心回收细胞，细胞沉淀物溶于6摩尔盐酸胍中。清澈后，在允许含6-His标记物的蛋白紧密结合的情况下用镍螯合柱层析从此溶液中纯化溶解的血清对氧磷酶。Hochuli，E.et al.，J.Chromatography 411：177-184(1984)。用pH5.0的6摩尔盐酸胍从柱子中洗脱血清对氧磷酶，为了复性的需要，将洗脱液调整到含3摩尔盐酸胍，100mM磷酸钠，10毫摩尔还原型谷胱甘肽和2毫摩尔氧化型谷胱甘肽。在此溶液中温育12小时后，将蛋白对10毫摩尔磷酸钠进行透析。

                    实施例2重组的血清对氧磷酶在CHO细胞中的表达

表达质粒血清对氧磷酶HA是由载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)衍生而来的，此载体包含：1)SV40复制起始位点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起始位点，4)CMV启动子，紧接着多接头区，一个SV40内含子和多腺苷化位点。将编码整个血清对氧磷酶前体的DNA片段和融合到其框架3’端的HA标记物克隆到载体的多接头区，因此，重组蛋白的表达就直接在CMV启动子的指导下。HA标记物与来源于以前所描述的流感病毒血细胞凝集素蛋白的一个表位相对应(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A.Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA标记物与我们目标蛋白的融合可以让我们用识别HA表位的抗体轻而易举地鉴定重组蛋白。

质粒的构建策略描述如下：

编码血清对氧磷酶的DNA序列，ATCC#75716用PCR的方法构建，使用两个引物：5’引物序列为5’-CGCGGGATCCACCATGGGGGCGGCTGGTGGCTCT-3’(SEQ IDNO：5)，含有一个Bam HI限制酶位点，后接从起始密码子开始的血清对氧磷酶密码序列的21个核苷酸。3’序列为5’-CGCGTCTAGACGGTTAGAGTTCACAATACAAGGC-3’(SEQ ID NO：6)，包含互补于一个Xba I限制酶位点和翻译终止密码子的序列，和血清对氧磷酶密码序列的最后18个核苷酸(不包括终止密码子)。因此，PCR产物含有一个Bam HI位点，血清对氧磷酶的密码序列，一个翻译终止密码子，和一个Xba I位点。PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp用限制酶Bam HI和Xba I消化并连接。连接混合物用于转化大肠杆菌SURE(Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037有售)。转化培养物涂于含氨苄青霉素的培养基平板上，挑选抗性菌落。从转化子中分离质粒DNA，用限制分析检测正确片段的存在。为了重组血清对氧磷酶的表达，用DEAE-DEXTRAN方法使表达载体转染CHO细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。血清对氧磷酶HA蛋白的表达用放射标记和免疫沉淀的方法检测(E.Harlow，D.Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。转染后两天，蛋白用³⁵S-半胱氨酸标记8小时，然后收集培养基，用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5))裂解细胞。(Wilson，I.et al.，Id.37：767(1984))。细胞裂解物和培养基用一个HA特异性的单克隆抗体进行免疫沉淀。用15％的SDS-PAGE凝胶分析沉淀的蛋白。

               实施例3血清对氧磷酶在人组织中的表达模式

用Northern杂交分析检测血清对氧磷酶在人组织中的表达水平。细胞总RNA样品用RNAzol^TMB系统(Biotecx Laboratories，Inc.6023 South Loop East，Houston，TX 77033)分离。从每个特定的人组织中分离的约10μg总RNA在1％琼脂糖凝胶上分离并杂交到尼龙膜上。(Sambrook，Fritsch，and Maniatis，Molecular Cloning，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。标记反应用50ng DNA片段根据Strategene Prime-It kit进行，标记的DNA用Select-G-50柱纯化(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 80303)。然后尼龙膜用处于0.5M NaPO₄，pH 7.4和7％SDS中的1,000,000cpm/ml的放射性标记的全长血清对氧磷酶基因在65℃杂交过夜。用0.5×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，60℃洗涤两次后，将尼龙膜与一个增感胶片置于-70℃曝光过夜。

                         实施例4通过基因治疗的表达

通过皮肤活体解剖从患者获得成纤维细胞，得到的组织置于组织培养基中并将其分割成小块。将小的组织块置于组织培养瓶的湿润表面上，每瓶约10块。将培养瓶倒转，封紧置室温过夜。在室温放置24小时后，将培养瓶翻转过来，组织块仍固定于培养瓶的底部，加入新鲜培养基(例如，含10％FBS，青霉素和链霉素的Ham’s F12培养基)，然后37℃培养约一个星期。此时，加入新鲜培养基，此后每隔几天换一次培养基。继续培养两星期后即出现单层成纤维细胞。将单层细胞用胰蛋白酶处理并转到更大的培养瓶中。

一侧含有莫洛尼氏鼠白血病病毒的长末端重复序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.et al.DNA，7：219-25(1988))用EcoRI和HindIII消化，然后用牛肠磷酸酶处理，在琼脂糖凝胶上分离线性载体并用玻璃珠纯化。

编码本发明多肽的cDNA用分别与5’和3’序列相对应的PCR引物扩增。5’引物含有一个EcoRI位点，3’引物包括一个HindIII位点。在T4 DNA连接酶存在的条件下，将等量的莫洛尼氏鼠白血病病毒的线性骨架和扩增的EcoRI和HindIII片段加到一起，混合物保持在适合两个片段连接的条件下。连接混合物用于转化细菌HB101，然后将细菌置于含卡那霉素的琼脂板上以确定载体含有适当插入的感兴趣的基因。

双向性的pA317或GP＋aml2包装细胞在补加10％小牛血清(CS)，青霉素和链霉素的Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)培养基中生长到铺平表面的密度。然后在培养基中加入含有本发明基因的MSV载体，这样包装细胞被此载体转染。现在包装细胞即可产生含本发明基因的有感染性的病毒颗粒(包装细胞此时为生产细胞)。

将新鲜的培养基加到转染的生产细胞中，然后从一个铺有生产细胞的10cm平板中收获培养基。含感染性病毒颗粒的培养基用一个微孔滤膜过滤以除去混在一起的生产细胞，然后此培养基用于感染成纤维细胞。从即将铺满的成纤维细胞平板上移去培养基，迅速用从生产细胞来的培养基代替。移去此培养基并用新鲜的培养基代替。如果病毒的滴度高，那么实际上所有的成纤维细胞都被感染，不需要进行选择。如果滴度很低，那么有必要用具有选择性标记，例如neo或his，的反转录病毒载体。

然后将工程化的成纤维细胞单独或在cytodex 3微载剂珠上生长到铺满后注射到宿主体内。现在成纤维细胞开始生产蛋白产物。

从上述的讲授中可知，本发明的各种修改和变化是可能的，因此，在所附的权利要求书的范围内，本发明可以不同于已描述的方式实施。

                           序列表(1)一般信息：

  (i)申请者：HUDSON，ET AL

  (ii)发明名称：血清对氧磷酶

  (iii)序列数：6

  (iv)联系地址：

     (A)收信人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，

                STEWART & OLSTEIN

     (B)街道：6 BECKER FARM ROAD

     (C)城市：ROSELAND

     (D)州：NEW JERSEY

     (E)国家：USA

     (F)邮政编码：07068

(v)计算机可读形式：

   (A)媒体类型：3.5英寸软盘

   (B)归档日期：IBMPS/2

   (C)操作系统：MS-DOS

   (D)软件：WORD PERFECT 5.1

(vi)本申请数据：

   (A)申请号：

   (B)申请日：同时

   (C)分类：

(vii)在先申请数据

   (A)申请号：08/270，583

   (B)申请日：1994年7月5日

(viii)律师/代理人信息：

   (A)姓名：FERRARO，GREGORY D.

   (B)登记号：36，134

   (C)案号/文档号：325800-

(ix)电讯信息：

   (A)电话：201-994-1700

   (B)电传：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：1079碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1CCCATGGGGC GGCTGGTGGC TGTGGGCTTG CTGGGGATCG CCCTGGCCCT CCTGGGCGAG         60AGGCTTCTGG CACTCAGAAA TCGACTTAAA GCCTCCAGAG AAGTAGAATC TGTAGACCTT        120CCACACTGCC ACCTGATTAA AGGAATTGAA GCTGGCTCTG AAGATATTGA CATACTTCCC        180AATGGTCTGG CTTTTTTAAG TGTGGGTCTA AAATTCCCAG GACTCCACAG CTTTGCACCA        240GATAAGCCTG GAGGTATACT AATGATGGTT CTAAAAGAAG CAAAACCAAG GGGACGGGAA        300TTAAGAATCA GTCGTGGGTT TGATTTGGCC TCATTCAATC CACATGGGAT CAGCACTTTC        360ATAGACAACG ATGACACAGT TTATCTCTTG GTTGTAAACC ACCCAGAATT CAAGAATACA        420GTGGAAATTT TTAATTTGGA AGAAGCAGAA AATTCTCTGT TGCATCTGAA AACAGTCAAA        480CATGAGCTTC TTCCAAGTGT GAATGACATC ACAGCTGTTG GACCGGCACA TTTCTATGCC        540ACAAATGACC ACTACTTCTC TGATCCTTTC TTAAAGTATT TAGAAACATA CTTGGAATTA        600CACTGGGCAA ATGTTGTTTA CTACAGGCCA AATGAAGTTA AAGGTGGTAG CAGGAAGGAT        660TTGGATTCAG CAAATGGGAT CAATATTTCA CCTGGATGGA TAAGTTTTTC TATGTTGGCT        720GACATATTGG CTCATGAAAT TCATGTTTGG GGAAAACACA CTAATATGAA TTTAACTCAG        780TTGAAGGTAC TTGAGCTGGA TACACTGGTG GATAATTTAT CTATTGATCC TTCCTCGGGG        840GACATCTGGG TAGGCTGTCA TCCTAATGGC CAGAAGCTCT TCGTGTATGA CCCGAACAAT        900CCTCCCTCGT CAGAGGTTCT CCGCATCCAG AACATTCTAT CTGAGAAGCC TACAGTGACT        960ACAGTTTATG CCAACAATGG GTCTGTTCTC CAAGGAAGTT CTGTAGGCTC AGTGTATGAT       1020GGGAAGCTGC TCATAGGCAC TTTATACCAC AGAGCCTTGT ATTGTGAACT CTAAATTGT        1079(2)SEQ ID NO：2信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：356个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：

   (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Gly Arg Leu Val Ala Val Gly Leu Leu Gly Ile Ala Leu Ala

              5                  10                  15Leu Leu Gly Glu Arg Leu Leu Ala Leu Arg Asn Arg Leu Lys Ala

             20                  25                  30Ser Arg Glu Val Glu Ser Val Asp Leu Pro His Cys His Leu Ile

             35                  40                  45Lys Gly Ile Glu Ala Gly Ser Glu Asp Ile Asp Ile Leu Pro Asn

             50                  55                  60Gly Leu Ala Phe Leu Ser Val Gly Leu Lys Phe Pro Gly Leu His

             65                  70                  75Ser Phe Ala Pro Asp Lys Pro Gly Gly Ile Leu Met Met Val Leu

             80                  85                  90Lys Glu Ala Lys Pro Arg Gly Arg Glu Leu Arg Ile Ser Arg Gly

             95                 100                 105Phe Asp Leu Ala Ser Phe Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Ile

            110                 115                 120Asp Asn Asp Asp Thr Val Tyr Leu Leu Val Val Asn His Pro Glu

            125                 130                 135Phe Lys Asn Thr Val Glu Ile Phe Asn Leu Glu Glu Ala Glu Asn

            140                 145                 150Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Val Lys His Glu Leu Leu Pro Ser

            155                 160                 165Val Asn Asp Ile Thr Ala Val Gly Pro Ala His Phe Tyr Ala Thr

            170                 175                 180Asn Asp His Tyr Phe Ser Asp Pro Phe Leu Lys Tyr Leu Glu Thr

            185                 190                 195Tyr Leu Glu Leu His Trp Ala Asn Va1 Val Tyr Tyr Arg Pro Asn

            200                 205                 210Glu Val Lys Gly Gly Ser Arg Lys Asp Leu Asp Ser Ala Asn Gly

            215                 220                 225Ile Asn Ile Ser Pro Gly Trp Ile Ser Phe Ser Met Leu Ala Asp

            230                 235                 240Ile Leu Ala His Glu Ile His Val Trp Gly Lys His Thr Asn Met

            245                 250                 255Asn Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Glu Leu Asp Thr Leu Val Asp

            260                 265                 270Asn Leu Ser Ile Asp Pro Ser Ser Gly Asp Ile Trp Val Gly Cys

            275                 280                 285His Pro Asn Gly Gln Lys Leu Phe Val Tyr Asp Pro Asn Asn Pro

            290                 295                 300Pro Ser Ser Glu Val Leu Arg Ile Gln Asn Ile Leu Ser Glu Lys

            305                 310                 315Pro Thr Val Thr Thr Val Tyr Ala Asn Asn Gly Ser Val Leu Gln

            320                 325                 330Gly Ser Ser Val Gly Ser Val Tyr Asp Gly Lys Leu Leu Ile Gly

            335                 340                 345Thr Leu Tyr His Arg Ala Leu Tyr Cys Glu Leu

            350                 355(2)SEQ ID NO：3信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：30个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

TCAGGATCCA GAAATCGACT TAAAGCCTCC                 30(2)SEQ ID NO：4信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：30个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

TCAAAGCTTT TAGAGTTCAC AATACAAGGC                30(2)SEQ ID NO：5信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：34个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

CGCGGGATCC ACCATGGGGG CGGCTGGTGG CTCT           34(2)SEQ ID NO：6信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：34个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：寡核苷酸CGCGTCTAGA CGGTTAGAGT TCACAATACA AGGC               34

Claims (20)

1.一种分离的多核苷酸，包括：

(a)编码包括SEQ ID NO：2所示的1-356位氨基酸的多肽的多核苷酸；

(b)能与(a)的多核苷酸杂交并至少有70％同一性的多核苷酸；和

(c)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。

2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸为DNA。

3.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸为RNA。

4.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸为基因组DNA。

5.权利要求2的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO：2的1-356位氨基酸的多肽。

6.一种分离的多核苷酸，包括选自如下一组的成员：

(a)编码具有由ATCC保藏号75773所含的DNA表达的氨基酸序列的成熟多肽的多核苷酸；

(b)编码具有由ATCC保藏号75773所含的DNA表达的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(c)能与(a)和(b)的多核苷酸杂交并至少有70％同一性的多核苷酸；和

(d)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。

7.权利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1所示的1-1079位核苷酸的序列。

8.权利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO：1所示的4-1079位核苷酸的序列。

9.含有权利要求2的DNA的载体。

10.用权利要求9的载体转化或转染的宿主细胞。

11.生产多肽的方法，包括：从权利要求10的宿主细胞表达由所说DNA编码的多肽。

12.生产能够表达多肽的细胞的方法，包括由用权利要求9的载体遗传工程化细胞。

13.包括选自如下一组成员的多肽：(i)具有SEQ ID NO：2的推测的氨基酸序列的多肽和所说多肽的片段，类似物和衍生物；和(ii)由ATCC保藏号75773的cDNA编码的多肽和所说多肽的片段，类似物和衍生物。

14.权利要求13的多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO：2的1-356位氨基酸。

15.治疗需要血清对氧磷酶的患者的方法，包括：给患者以治疗有效剂量的权利要求13的多肽。

16.权利要求15的方法，其中所说的多肽的治疗有效剂量是以给患者提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说多肽的方式给药。

17.诊断与权利要求13的多肽的低水平表达相关的疾病或疾病易感性的方法，包括：

鉴定编码所说多肽的核酸序列中的突变。

18.一种诊断方法，包括：

分析来自宿主的样品中的权利要求13的多肽的存在。

19.鉴定作为权利要求13的多肽的激动剂的化合物的方法，包括：将多肽的底物与待筛选的化合物接触；和测定此化合物是否水解此底物。

20.抗权利要求13的多肽的抗体。

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