CN1152934A - 微生物培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于各种细菌的分离与鉴定的方法和培养基，具体地讲，是根据其菌落形态学和颜色区分通常与尿路感染有关的微生物。

Description

微生物培养基
本发明涉及用于快速筛选临床培养物来检测某些最普通致病菌的培养基。这些培养基上所观察到的反应，对于快速及成本等效地推测诊断各种细菌感染十分有用。虽然预料其有许多其它应用，但这些培养基对试验尿样特别有利。
传染性疾病的诊断，传统上一直依赖微生物培养法鉴定出致病生物体，再决定采用适当的抗微生物治疗。尽管在分子和免疫学诊断领域有最新进展，但该方法仍沿用至今。快速和自动化法的开发有利于提高微生物分检效率的同时，传统定量培养法对于尿道感染及其它感染的最后诊断仍至关重要(Baron & Finegtold，诊断微生物学(Diagnostic Microbiology)，第八版，C.V.Mosfy，[1990]，第253页)。
适当采样及送达之后，实验室技术人员必需决定，大量培养基中哪一种最适用于培养手中之物。重要的是考虑样品类型(例如尿、血、痰等等)，以及取样位置与疾病或感染共生的最为常见分离的生物体。而得出最后诊断所需时间和成本也必需考虑。
就样品类型而言，要考虑必定分化出致病菌的有关正常菌丛。这对于一般含有一种特征背景菌丛的粪便、直肠、阴道、颊部及其它样品来说是特别现实的。尿，当从肾脏分泌出时是正常无菌液体，但会受到来自尿道、排尿口和皮层的菌丛污染，实际上当排出时，尿绝不会是无菌的。首先排出的10ml尿中，由于尿道中细菌随之排出，而含有多达每毫升104个生物体。这必定从感染生物体中分化出正常菌丛污染物。
像大多数身体部位一样，正常的尿道对表征正常菌丛起辅助作用。对女性来说，包含正常菌丛的生物体随其年龄和健康状况而异。初经前期妇女，66％的生物体是需氧棒状杆菌型、乳杆菌，和凝固酶阴性葡萄球菌。链球菌通常也存在。生育期妇女，则乳杆菌是最为常见的分离菌(Clarridge等人“尿道感染的实验室诊断(Laboratory Diagnosis of Urinary Tract Infections)”Cumitech 2A，第1页，美国微生物学会(American Society for Microbiology)，1987)。而绝经期妇女，其厌氧菌数明显增加，特别是黑色素拟杆菌(Clarridge等人，第1页)。其它生物体，例如类菌质体，和低密度肠格兰氏阴性杆菌也在健康妇女的尿道中发现(Carridge等人)。
对于男性，则很少有固有菌丛从尿中分离出。而凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌(即链球菌D族)、棒状杆菌和类菌质体可以从健康男性的尿道和尿中分离出(Clarridge等人，前述文献)。表1列出了与人类尿道共存的共栖菌丛(即正常菌丛)。
表1与尿道共存的共栖菌丛*
    栖于尿道的菌丛
    凝固酶阴性葡萄球菌绿色和非溶血性链球菌乳杆菌棒状杆菌SP(类白喉菌)奈瑟菌属(非致病种)短暂格兰式阴性需氧菌(包括肠杆菌)厌氧球菌丙酸杆菌SP厌氧格兰氏阴性球菌和杆菌共栖分枝杆菌SP共栖类菌质体SP偶然的酵母菌
*Koneman等人，诊断微生物学彩图集和教程(Color Atlas and Textbookof Diagnostic Microbiology)，第4版，(79页)(J.B.Lippincott Co.，1992)；Baron& Finegold.诊断微生物学第8版，253-262页(C.V.Mosby.1990)；和Power&McCuen，BBL产品和实验室程序手册(Manual of BBLProducts andLaboratory Procedures)，第6版48-49页(Becton Dickinson MicrobiologySystems，1988).
因为有正常菌丛共生，并希望鉴定致病生物体，所以目前已研究出污染程度达到最低的尿样收集法，包括截留清洁的中间尿流、小心插入导管、耻骨弓上抽吸、膀胱冲洗、和膀胱镜检查等。在患者不可能或不愿提供截流清洁样品时耻骨弓上抽吸是选用之法(比如婴儿)。
尿道感染(UTIs)是人类最为普遍的感染。据估计，所有20％的妇女患过至少一次UTT，并且发病率随年龄而升高(Baron & Finegold，诊断微生物学第8版254页(C.V. Mosfy，1990))。因为尿道感染的发病率仅次于上呼吸道感染，所以UTI诊断在最频繁的临床研究之列。而实际上，对细菌尿的检测要求远远超过了对呼吸致病菌的检测(pezzle“尿道感染检测的快速方法(Detecteon of Urinary Tract Infections by Rapid Method)”Clin.Microbiol.Rev.1：268(1988))。这总的代表了实验室的主要花费。
患UTIs的危险对留置导管的病人明显增加，以致于预料他们极有可能最后至少发展成患上一种UTI。随着医院里和病房中长期留置尿道管的患者人数不断增加，这种感染代表众多病人群体。即使短期插管也相当危险，因为有20％的机会短期插管的住院病人也会发展成UTI(Baron和Finegold前述文献)。事实上，由疾病控制中心(CDC)领导作出的国家医院感染研究(NNIS)报告有5％-6％的住院病人罹患医院感染病。据估计由此会增加病人住院天数3.2天左右，并直接多花大概$1800(1986年数字)。该数字还未考虑进医生收费，生产损失，以及引起死亡的损失等(至少1％住院感染病人死于其医院感染的直接后果，并对感染患者增加了2-3％的死亡率)。
大部分UTI由患者的大便等物污染尿道所致。因此，存在于病人胃肠道的肠杆菌科及其它生物体是大多数UTI的发病因素，其中大肠杆菌(E，coli)引起的感染最多。胃肠道是UTI的常用贮主这一结论，由观察到E.coli血清型在UTS中的分布，与其在感染患者的肠中的相对富含紧密相关这一现象而得到支持(C.M Kunin尿道感染的检测、预防和处置(Detection，Preventionand Management of Urinary Tract Infections)，Lea & Fefiger[1979]92页)。特别重要的是某些E.coli菌株与溶血性尿毒综合症之类的严重疾病有关(y.Yee等人，“溶血性尿毒症与产生维罗毒素的E.coli 0157：H7感染有关的新证据”感染疾病杂志(J.Infect.Dis.)，154：522-534[1986])，这显示E.coli菌株在严重衰竭UTI中的重要性。
除了E.coli之外，肠杆菌科的其它菌株也与UTI有关。例如变形杆菌常从男孩的UTI中分离出(Kumin等人，pp.47和92)。肺炎杆菌是另一种尿道感染的重要有机体，因为据报道，它是从UTI中分离出的第二最普遍致病菌(S.Falkow和Mekalanos，“肠内杆菌和弧菌”561-587页，在B.D.Davis等人(eds.)，微生物学第4版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia 1990)。实际上，80-95％的所有在普通医院收取的分离物中的肠杆菌是E.coli肺炎杆菌、或奇异变形杆菌(J.J.Farmer等人，“从临床样品中分离出的肠杆菌新品种和生物族的生化鉴定”临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol)，21；46-76[1985])。不容置疑，若给出大量样品，那么这些分离菌主要的部分来自UTI。肠内菌的其它种属也常常从UTI中分离出，包括沙门菌及志贺菌等特别要提及的致病菌。
周围环境随处可见的一种生物体、即绿脓假单孢菌，几乎可以感染任何组织和身体部位，包括尿道的创伤处。由绿脓假单孢菌引起的UTI在老年人中更为普遍(W.K.Joklik等人，津泽微生物学(Zinsser Microbiology)，Appleton-Century-Crofts，Norwalk，CT.1984，636页)。该生物体由于将病人置于疾患或免疫破坏的条件下而被认为是特别伤身的。
除了Gram氏阴性菌外，各种Gram氏阳性菌也普遍与UTI有关。粪肠球菌原是包括在链球菌属中的Gram氏阳性球菌。像E.coli一样(肠杆菌的最多种属)E.faecalis也是人类正常胃肠菌丛之一员，也可在正常阴道菌丛中发现。虽然E.faecalis与各种其它疾病有关，但UTI是该生物引起的最为常见的疾患(R.C.Moellering“肠球菌：一种多方面致病菌”3-6页，Gram氏阳性菌感染挑战：全球展望Healthmark[1988])。有关E. faecalis病的治疗考虑是非常重要的，因为该生物体对大量抗微生物剂均有抗性。例如E.faecalis对许多能杀死其它细菌的抗微生物剂均有耐药性。此种高度抗微生物抗性，显示出有必要将该来自UTI的生物鉴定出来。
一种重要的Gram氏阳性生物体，腐生植物葡萄球菌，是最近鉴定出的引起UTI的微生物(R.H.Latham等人，“由腐生植物葡萄球菌引起的青年成年妇女尿道感染”美国医药杂志(J.Amer.Med.)ASSOC.，250：3063-3066[1983]；和G.Wallmark等人，“腐生植物葡萄球菌：门诊女性病人尿道感染的常见病因”感染疾病杂志，138：791-797[1979])。该生物体与UTI相联系之前，一般认为从尿道中分离出来时，凝固酶阴性葡萄球菌是非致病的(例如见B.Hovelius和Mardh，“作为尿道感染普遍病因的腐殖植物葡萄球菌”感染疾病回顾(Rev.Infect，Dis)，6：328-337，1984)。因腐殖植物葡萄球菌是年青女性尿道感染最普遍相关的生物体之一，因而该生物体的重要性已被认识到。要紧的是，不仅这些生物体与UTI相关，它们也与肾盂肾炎和脓毒症之类的严重感染有关(W.Lee等人，“腐殖植物葡萄球菌引起的肾盂肾炎”感染疾病杂志，155：1079-1080[1987])。不像E.coli和其它肠内生物体一样，腐殖植物葡萄球菌的贮主还有待测定。
上面讨论的生物体最为普遍的关系到上行感染(A.J.Schaeffer，“膀胱炎和肾盂肾炎”418-435页，Youmans等人(eds)，感染疾病的生物学和医学基础(Biologic and Clinical Basis of Infectious Disease)，W.B.Saunders[1985])。然而该生物体可以通过从胃肠道直接延伸或通过血原性扩散而进入尿道。UTI也可以由与身体其它部位广泛感染相关的菌血症继发感染而引起(Schaeffer，421-423页)。由金色葡萄球菌、念珠菌SP和分枝杆菌SP之类的生物体溶血性扩散入肾脏更为普遍。因此，生物体可以通过各种手段接近尿道组织，包括外科手术和插管。
下面的表列出了与住院和群居获得性UTI有关的生物体。值得注意的是，这些生物体很大部分也栖于正常胃肠道和/或尿道和/或阴道。表3列出了从UTI中分离出的更为稀有的生物体。
表2与群居和住院情况下罹患UTI有关的常见生物体
    生物体           门诊           住院病人
  原发病例(％)   复发病例(％)    医疗病房(％)  加护单元(％)
    大肠杆菌     ≥90     69     42     24
    奇异变形菌     5     8     6     2
    克雷白氏肠     1     6     13     16
    杆菌sp.
    肠球菌sp.     1     3     15     23
    葡萄球菌sp.(凝固酶阴性)     1     3     7     5
    P.绿色菌     0     ＜1     6     17
  粘质沙雷氏菌     0     0     1     3
 所有其它生物体     2     11     10     10
*见Clarridge等人的论文(第1页提到)，P.2
表3尿路感染相关的不常见和无用的试剂*
         分枝杆菌sp.钩端螺旋体sp.流感嗜血杆菌G.vaginalis不动杆菌sp.产碱杆菌sp.假单胞菌sp.柠檬杆菌sp.淋病奈瑟氏球菌沙门氏菌sp.(包括伤寒沙门菌)志贺菌sp.β-溶血链球菌厌氧菌沙眼衣原体阴道密螺旋体S.haematobium疱疹病毒
*Koneman等；Baron和Finegold；以及Power和McCuen。
尽管可从尿路感染(UTI′s)中分离出很多生物，但如果分离的生物体是表2中所列的种类，情况会好一些，它突出了鉴定较少数量与UTI′s有关的生物体的重要性。
另一个问题涉及从尿路分离的培养物的种类。在普通人群中，与UTI′s相。关的最常见的是纯培养物。而在住院患者中常观察到混合培养物。这种混合感染会给治疗带来麻烦，因为治疗方案必须针对所有相关的生物体。被Oregna等人所引用的最近研究(上述)强调了混合培养物的频率，其中DeMontcles和Carret发现25％来自住院患者的尿培养物是混合的(De Montclos和Carret)，“细胞细菌学的尿的优化检测(Optimisation de l′examencytobacteriolique urinaire)”，生物光谱(Spectra Biologie)，92：49(1992))。重要的是，混合感染还会给诊断带来麻烦，因为某些生物会掩盖其它生物种类的存在。
由于UTI′s的普遍性，这种感染的诊断方法为普通的实验室方法。业已研究出分离、鉴定和/或检测与UTI′s相关的最常见的微生物的各种方法。这些方法主要有两类：(1)培养法，它利用传统的微生物培养技术分离微生物，然后根据其特有的生化特征、以及某些种类的血清学特征，鉴定这些微生物；(2)非培养法，它利用各种酶及其它系统来检测感染的存在。I.诊断尿路感染的培养法
目前，细菌性UTI′s的诊断通常是通过微生物培养和鉴定取自感染患者尿样里所存在微生物的方法而实现的。不过，多数送到临床化验室的样品呈阴性，或者细菌菌落数低于临床上认为是明显感染的水平(见Koneman等，256～257)。
一直以来，尿样里的微生物数量被认为是区分受污染样品和真正的UTI′s的重要因素。因此，通常要对样品中的微生物进行定量分析。
定量分析可以通过倾注平皿培养法来实现，该方法包括将样品稀释液同一定体积的熔融琼脂混合，将混合物倾注到陪替氏培养皿中，让琼脂固化，培养约24小时，计数培养皿里的菌落数，然后计算原始样品中的微生物数(Power和McCuen，pp48-49；以及Clarridge等，p.6)。尽管倾注平皿培养法能较可靠的测出样品中的微生物数，但实施该方法所必须的时间和操作使得其不能实际应用于临床试验(Clarridge等，P.6)。
更为常用的方法是划线平板法，在该方法中，设计了一种校准接种环，用于取出一定体积的(0.01或0.001ml)尿样，将接种环浸入尿样中并把接种环上的接种物划在琼脂板上(见E.J.Baron和S.M.Finegold，诊断微生物学，C.V.Mosby，St.Louis，1990，253-262页)。在培养18～24小时以后测定菌落数目，以便估计出患者尿样里的微生物数。
最常用的标准是，大于10,000CFU(菌落形成单位)/ml的计数表示有UTI。不过，“阳性”样品里的病原体和污染微生物的密度可能低于100CFU/ml。因此，一些专业人员鉴定所有数量在于100CFU/ml的细菌种类，正常的皮肤或生殖菌群除外(Baron和FineSeld，258页)。大于1000的数量对男性来说是明显感染的(Clarridge等，P.7)。
如果一个样品中含有一或两个以显著量生长的菌株，通常要对这些菌株进行鉴定并测定这样菌株的抗微生物敏感性特征(Baron和Finegold，P.260)。不管其菌落数多少，金黄色葡萄球菌(S.aureus)的纯培养物都被视为明显感染(Baron和Finegold，260页)。一般，要把分离出的醇母菌鉴定至属和/或种的级别，并报告给医生(Baron和Finegold，260页)。下表给出了与所涉及样品体积中与是否感染相关的数量。
表4
根据三个样品试验体积的菌落计数诊断尿路感染
    样品量(尿)     细菌数(CFU)
    感染     可能感染     未感染
    每1ml     100,000     1,000     100
    每10μl     1,000     10     1
    每1μl     100     1     -
培养诊断UTI′s的关键考虑因素是培养基的选择。为了让最大数量的菌种能够生长，培养定量方法必须在非选择性、非抑制性培养基(例如5％羊血琼脂，脑心浸出琼脂等)。无论其用途是非选择性的、选择性的或鉴别性的，大多数培养基是以这样的方式设计的：在接种样品之后，根据微生物和培养基的类型，将培养基在35～37℃培养18～24小时或更长时间。为了优化生长以便有助于鉴别诊断的特征，某些微生物要求不同的培养温度和/或时间。尽管有相关微生物的生长特性，主治医师还是希望尽可能快地鉴定。因此，能够快速生长并对病原微生物进行初步假设性诊断的原代分离培养基是十分理想的。这对于必须即时治疗的情况来说尤为重要。II.UTI诊断的非培养法
由于传统培养方法须费时并要用手工操作，以及大量的“阴性”样品的存在，生产商和研究人员一直热衷于开发快速尿筛选方法。这种筛选方法的目的是：1)及时向医师提供准确信息，以便用于对患者的迅速治疗；和2)迅速消除阴性样品，让微生物学家把更多的时间用在阳性样品上，以提高资金的利用率和工作效率。
在文献中公开的快迅方法包括显微镜检查法(例如革兰氏和吖啶黄染色)、酶促分析法(例如过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、硝酸还原酶和白细胞酯酶)、各种内毒素分析法、过滤法(如比色法)、生物发光测定法和自动化方法(生长的测光检测)。正如Pezzol所总结的(Pezzlo，“尿道感染检测的快速方法”，临床微生物学杂志(Clin.Microbiol.Rev.)，1：268，(1988))，已对这些方法作出了充分的评价。当一种培养方法以≥105CFU/ml作为参考时最为可行。然而，当这些方法采用较低的菌落数时就不那么可行了(Pezzol，P.271)。该方法的一个突出缺陷是它仅能提供对患者细菌尿的半定量测定；它不能够指示所有存在微生物的属或种。这是很重要的，因为医师需要了解病原微生物，以便为患者提供最佳的抗菌治疗。
从以上说明中可以清楚地看到，尽管已有许多检测系统，但都各自具有妨碍其用于某些场合的特点。这些检测方法大多要求昂贵的试剂、技术时间和实验室设备。现在需要一种省钱、至少与传统定量培养法一样灵敏、专一的方法。该方法应当快速可靠，并能够在尽可能短的时间内起码为主治医师提供初步诊断。
本发明公开了细菌生物的试验培养基以及用于细菌生长、分离和初步鉴定的方法。本发明设计了一些化合物和制剂以及特别适用于检测并初步鉴定与尿路感染(UTI′s)最相关微生物的方法。
在一种实施方案中，本发明提供了一种用于被怀疑含有细菌的测试样品中检查细菌存在的方法，包括以下步骤：a)用试样接种试验培养基，其中该培养基包括：i)在与β-葡糖醛酸酶反应时能产生第一种颜色的葡糖醛酸酶显色底物；ii)在与芳基硫酸酯酶反应时能产生第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物，其中第一和第二种颜色可用肉眼区分；以及iii)营养基质；b)培养上述试验培养基，以产生微生物的菌落，并出现一种或一种以上所述第一和第二种颜色；以及c)检测该培养基中i)具有第一种颜色的菌落的存在，ii)具有第二颜色菌落的存在；以及iii)无第一或第二种颜色菌落的存在。本发明并不想限定颜色的具体种类。
还设想本发明的方法还包括上述试验培养基上的菌落数的计数步骤。
在一个优选实施方案中，该方法的试验培养基还包括至少一种不透明化合物。最好这种不透明化合物能使试验培养基变成白色。在一种实施方案中，这种不透明化合物为蛋白质类物质。在一个特别有用的实施方案中，该蛋白类化合物为乳类制剂。然而在另一个实施方案中，上述不透明化合物为非蛋白类物质。在一个实施方案中，这种非蛋白不透明化合物可选自硅酸盐、氧化物和碳酸盐。本发明不想限定不透明的化合物的类型。
在一个实施方案中，该方法的试验培养基还包括至少一种胺。设想所述胺选自谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪胺并可成功地使用。还设想可用以选自章鱼胺、多巴胺和去甲肾上腺素的一种胺。
在一个最佳实施方案中，该方法还包括分析菌落里的细菌在有至少一种选自锰离子、铁离子和铜离子的配位化合物的条件下氧化至少一种芳香胺的能力的步骤。在一个实施方案中，所述芳香胺选自色氨酸和酪胺。
在另一个优选实施方案中，该方法还包括分析菌落周围的试验培养基中是否存在绿脓素的步骤。在一个最佳实施方案中，测定是否存在绿脓素的试验包括以下步骤：i)将酸涂在菌落周围的试验培养基上；和ii)观察试验培养基中颜色变化的发生。在该试验中特别推荐使用氢氯酸。已证实2N的HCl溶液特别适用于该实施方案。
在一个优选实施方案中，该方法还包括一个步骤是检验所述细菌水解尿素的能力。在另一个优选实施方案中，该方案还包括检验细菌还原亚碲酸盐的能力。
本发明的另一个实施方案包括一种用于被怀疑带菌的试样中检测细菌存在的方法，它包括以下步骤：a)接种试验培养基，包括i)至少一种在与一种酶反应时能产生有色菌落的显色底物；ii)至少一种蛋白类不透明化合物；以及iii)营养基质；b)培养该试验培养基以产生微生物的有色菌落；以及c)检查该试验培养基中i)是否有有色菌落；ii)是否有无色菌落；以及iii)菌落周围是否有透明的边缘。
在一实施方案中，蛋白类不透明化合物是乳类制剂。特别推荐把脱脂乳或还原脂乳用作蛋白类不透明化合物。还希望可以对这种蛋白类不透明化合物进行辐射灭菌。
在该方法的一种实施方案中，底物是芳基硫酸酯酶显色底物。在另一个实施方案中，底物是β-葡糖醛酸酶显色底物。在又一个实施方案中，底物包括一种芳基硫酸酯酶显色底物和一种β-葡糖苷酸酶显色底物。
本发明的另一个实施方案中包括一种用于被怀疑带菌的试验中检测细菌存在的方法，它包括以下步骤：a)用试样接种固体试验培养基，其中试验培养基包括：i)在与β-葡糖苷酸酶反应时能产生第一种颜色的β-葡糖苷酸酶显色底物；ii)在与芳基硫酸酯酶反应时能产生第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物；iii)蛋白类不透明试剂；和iv)至少一种在与至少一种细菌酶反应时能产生第三种颜色的化合物，其中可用肉眼区分上述第一、第二和第三种颜色；b)培养该试验培养基以形成微生物的菌落，产生上述第一、第二和第三种颜色中的一种或一种以上颜色；c)检查该试验培养基中i)具有第一种颜色的菌落的存在；ii)具有第二种颜色的菌落的存在；iii)具有第三种色颜菌落的存在；iv)没有第一、第二或第三种颜色的菌落的存在；和v)检查该试验培养基中菌落周围透明边缘的存在。
在一种实施方案中，所述细菌酶是选自下列一组酶中的一种：色氨酸氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶和酪胺氧化酶。在一个最佳实施方案中，该培养基还包括至少一种选自锰、铜和铁离子的配位化合物。估计这些细菌酶和配位化合物能够成功地以一种或一种以上酶与一种或一种以上配位化合物的任意组合形式使用。
在一个实施方案中，该方法还包括检验细菌水解尿素的能力的步骤。设想这一检验细菌水解尿素的能力的过程包括以下步骤：i)将细菌放入含有尿素和pH指示剂的溶液中；和ii)检查产生的颜色。在一个最佳实施方案中，该溶液中尿素的浓度约为5％，pH指示剂的浓度约为0.05％，溶液的pH被调至4～7。估计多种pH指示剂均可采用。在一个实施方案中，pH指示剂可选自m-甲酚紫、酚红、百里酚兰、溴百里酚兰、溴甲酚紫、二甲苯酚兰和甲酚红。本发明并不局限于上述的尿素酶试验机理。本发明也不局限于一种具体的pH指示剂或颜色。
在另个优选实施方案中，该方法还包括的一个步骤是检验细菌还原亚碲酸盐的能力。在一个最佳实施方案中，检验细菌还原亚碲酸盐的能力的过程包括以下步骤：i)将亚碲酸盐溶液滴在被怀疑是类肠球菌(Enterococcusfaecalis)的菌落上；ii)培养该细菌；和iii)检查黑色的产生。在一个实施方案中，亚碲酸盐溶液含有约1％的亚碲酸钾。本发明并不局限于亚碲酸盐试验的机理。本发明也不局限于具体的含亚碲酸的盐或在试验时所产生的一种具体颜色。例如，采用各种浓度的亚碲酸盐溶液估计都可产生一种灰色。
在该方法的一种优选实施方案中，生长在试验培养基上的大肠杆菌(Escherichia coli)菌落用眼看上去呈红色，在该菌落周围的培养基中有透明的晕圈。预计生长在本发明培养基上的肺炎杆菌(Klebsiella Pneumoniae)肉眼看上去呈靛蓝色并为粘液样，在菌落周围的培养基中有透明的晕圈。
预计生长在本发明培养基上的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)肉眼看上去呈棕色，并有棕色色素从菌落扩散至培养基中。预计生长在本发明培养基上的奇异变形菌肉眼看上去呈橙色，有弥散的边缘并有橙色色素从菌落扩散到培养基中。预计生长在本发明培养基上的奥克西托克雷伯杆菌(klebsiella oxytoca)肉眼看上去呈黄色，有黄色色素从菌落扩散至培养基中而且在菌落周围的培养基中有透明的晕圈。预计生长在本发明培养基上的铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)肉眼看上去呈绿色，有绿色色素从菌落中向外扩散而且在菌落周围的培养基中有透明的晕圈。
另外，预计生长在本发明培养基上的金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)肉眼看上去也呈黄色，在菌落周围的培养基中有透明的晕圈。预计生长在本发明培养基上的粪肠球菌肉眼看上去很小并呈白色，在菌落周围的培养基中有透明的晕圈。
在另一个实施方案中，一种用于鉴定菌落的培养基包括：i)蛋白类不透明化合物；ii)一种或一种以上显色底物；和iii)营养基质。在一个实施方案中，营养基质包括一种或一种以上选自下面包括的化合物：大豆胨、肉膏、硫酸镁和硫酸钠。预计可成功地用作营养基质其它化合物包括，但不局限于诸如牛肉膏和氯化物之类的化合物。在一个最佳实施方案中，所述蛋白类化合物为乳制品。预计很多种乳类化合物都可以成功地用于本发明的培养基，包括，但不限于脱脂或还原脂乳和酪蛋白。
培养基的一个实施方案包括一种或一种以上选自芳基硫酸酯酶底物、葡糖苷酸酶底物、色氨酸氧化酶底物和酪胺氧化酶底物的显色底物。
本发明的另一种实施方案包括一种用于鉴定菌落的培养基，其用量足于供菌落生长和分化：i)至少一种葡糖苷酸酶显色底物，ii)至少一种芳基硫酸酯酶显色底物和iii)至少一种能使试验培养基变成白色的不透明化合物。在一个最佳实施方案中，不透明化合物是非蛋白类物质。预计多种非蛋白类化合物都可成功地用于本发明的培养基中，包括(但不局限于)诸如硅酸盐(例如高岭土和焙烧硅藻土)、碳酸盐(如碳酸钙)和氧化物(如氧化钛)。不过，预计多种蛋白类不透明化合物也可以成功地使用，包括(但不局限于)多种乳制品，如酪蛋白和脱脂或还原脂乳。
而且，预计在培养基的一种实施方案中，所述显色底物选自芳基硫酸酯酶显色底物、葡糖醛酸酶显色底物、色氨酸氧化酶显色底物和酪胺氧化酶显色底物。预计这些底物能以任何组合形式成功地使用。例如，芳基硫酸酯酶底物既可以与葡糖醛酸酶组合，又可与色氨酸或酪胺氧化酶底物组合；葡糖醛酸酶底物可以与色氨酸或酪胺底物组合使用；色氨酸底物可以与酪胺底物组合使用。除了两种底物组合使用以外，预计还可将三种或三种以上的底物组合使用。在一个最佳实施方案中，培养基还包括至少一种选自锰、铜和铁的配位化合物。
本发明的另一个实施方案包括一种用于鉴定菌落的培养基，它含有足以让菌落生长和分化的用量：i)至少一种含酪蛋的化合物；ii)一种葡糖苷酸显色底物；iii)一种芳基硫酸酯酶显色底物，iv)选自锰、铜和铁的至少一种配位化合物；和v)一种胶凝剂。
在一个优选实施方案中，葡糖苷酸酶底物选自6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸和5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸。在另一个实施方案中，芳基硫酸酯酶底物是吲哚基-3-硫酸酯。预计本发明的培养基还包括至少一种选自谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪胺、章鱼胺、多巴胺和去甲肾上腺素的胺，它们可被成功地使用。
本发明一部分是基于这样的发现：在琼脂培养基中观察到，各种微生物都可以根据分化生化反应分化。本发明的多用途试验培养基可以用来对尿样和其它样品进行初步和快速的微生物筛选，无须接种多用途琼脂培养基，从而节省时间和资金。本发明的培养基仅需接种一处培养皿即可初步鉴定最常见的病原体。这与现有的方法不同，现有方法要求接种几种常用于尿样分析和各种微生物选择分离的培养基(例如，参见Baron和Finegold，83)，如血琼脂(例如，含有5％羊血的胰酪蛋白分解产物大豆琼脂)、哥伦比亚粘菌素一萘啶酮酸琼脂(CNA)、苯乙醇琼脂(PEA)、曙红亚甲蓝琼脂(EMB)、MacConkey和/或胱氨酸-乳糖-电解质缺乏(CLED)琼脂。这些非选择性、选择性和/或分化培养基使某些微生物可以生长，但各自都有明显的缺陷。
非选择性原生生长培养基，如血琼脂可以生长大多数尿路病原体。然而，在这种培养基上病原体和非病原体不能明显区分。另外，如果存在变形杆菌(Proteus)，它会很快充满整个琼脂表面，使得不可能挑取分离的菌落。此外，重要的斑点试验，如尿素酶斑点试验不能直接在取自此类和很多其它类培养基的细胞上进行。
选择和分化培养基(例如MacConkey和EMB[曙红亚甲蓝])通常只具有一种重要特征，如乳糖发酵。尽管他们可以让很少几种病原体生长并分化，其它病原体却会被抑制。因此，多种病原体和正常菌群通常不能在这种培养基上生长。很明显，可将其用于定量方法的普通用途，用来区分污染的样品和真正的UTI′s样品。就很多UTI′s的严重性而言，这是一个重要条件。
另外，这种培养基通常会干扰微生物生化分化中的其它重要反应和证实其身份。例如，尽管MacConkey琼脂可以目测观察乳糖发酵，但它会妨碍吲哚斑点试验，这种试验是区分很多微生物的重要试验，特别是大肠杆菌(E.coli)。另外，由于它含有抑制革兰氏阳性微生物的化合物(如胆汁盐和结晶紫)，这种微生物在这类培养基上生长很差或根本不能生长。因此，MacConkey和EMB不大适合于通常与UTI′s相关的很多微生物的初步分离和初步鉴定。
同样地，CLED也有明显的缺陷。因为这种培养基中含有对pH敏感的染料，这种染料会随着pH的升高和降低而逐渐改变颜色，在该培养基上不同的菌着色不像在MacCenkey(含有沉淀成分)上那么明显，而且当菌落过于密集时颜色还可能模糊。在培养过夜后，菌落的生长不如在其它培养基上快，但如果将培养基培养24小时以上，培养皿上的乳糖酵素会使整个培养皿变成粉红色，掩盖非酵素的存在。另外，葡萄球菌和肠球菌看上去很相似，而且，由于该培养基中缺少电解质，志贺菌属会受到抑制。
而且，本发明是为了克服用于细菌鉴定的多用途试验培养基的某些问题和局限而设计的。例如，Fluorocnlt ECD培养基(E.Merck AG，Darmstadt，德国)是利用甲基伞形基葡糖苷酸(MUG)(一种用于β-葡糖苷酸酶的能发出荧光的底物)的几种新培养基的典型代表。这种培养基与吲哚斑点试验结合可以相当清楚的初步鉴定大肠杆菌(E.Coli)(Heizmann等，“用荧光琼脂培养基和阳性吲哚反应快速鉴定Esoherichia Coli菌(Rapid Identification of EsoherichiaColi by flurocult media and Positive indole reaction)”，临床微生物学杂志，26；2682-2684(1988))。
一种更新的改进的含MUG的培养基最近被用于UTI′s，已经由Orenga等公开(“尿道Tra-Ct感染：先进的CPS ID，一种为Escherichia Coli，变形杆菌和肠球菌的计数和鉴定的新型即用培养基(Urinary Tra-Ct Infections：Improved CPS ID，aNew Ready-to-Use Medium for Enumeration andldentification of Escherichia coli，Proteeae and Enterococcus)”，微生物学中的快速方法和自动化(Rapid Method & Automation in Microbiology)，伦敦，1993年9月)。“CPS ID”是一种由bioMerieux公司(la Balme-Les-Grottes，法国)以四种用于鉴定大肠杆菌、变形杆菌科(Proteeae)和肠球菌种(Enterococcussp)的代谢试验为基础而开发的一种荧光琼脂培养基。大肠杆菌的鉴定是基于β-葡糖苷酸酶的活性和吲哚的有效性。变形杆菌科的鉴定是基于色氨酸脱氨酶的活性和吲哚试验。肠球菌种的鉴定是基于葡糖苷酶的活性。
尽管这种含有MUG的培养基可以提供初步诊断，但它们还有一些明显的缺陷。混合在琼脂中用于大肠杆菌鉴定的能发出荧光的4-甲基伞形基-β-D-葡糖醛酸必须在紫外光线下进行观察，而它在被β-葡糖苷酸酶水解后变模糊。因此，难于将这种培养基用于鉴定混合培养基中所存在的大肠杆菌。在CPS ID培养基中，色氨酸脱氨酶试验不是混在琼脂培养基中进行，而是以斑点试验的方式针对被怀疑的菌落进行。这相当不方便，而且增加了无法识别变形菌属(Proteus)菌落的可能性。此外，用于CPS ID培养基中以便识别肠球菌属细菌的β-葡糖苷酸酶显色试验对该属并不是十分专一，因为很多属(包括大多数肠细菌菌种)都是β-葡糖苷酶阳性的。CPS ID培养基也不能鉴别其它重要的尿路病原体，如肺炎杆菌和铜绿假单孢菌。
这种培养基的另一种更新的改进型被称为“Chromogenic CPS ID”或“CPS2”，它使用了一种用于β-葡糖苷酸酶检测的显色底物。由于这种培养基也是基于与“CPS ID”一样的四种代谢试验，因此它也具有与其前身一样的局限(Orenga等，Supra；Orenga等，“尿道Tra-Ct感染：先进的CPSID，一种为Escherichia Coli，变形杆菌和肠球菌的计数和鉴定的新型即用培养基”，摘要，14/2页，107页，关于微生物学和免疫学的快速方法和自动化第七届国际大会的摘要(Abstract of the Seventh International Congress onRapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology)，伦敦(1993年9月12-15日)；以及Freydiere和Glille，“技术信息(ANew CPS Medium forRapid Identification and Enumeration of Bacteria in Urine Sample)”，摘要14/5页，107页，关于微生物学和免疫学的快速方法和自动化第七届国际大会的摘要，伦敦(1993年9月12～15日))。
业已将盛有几种部分有用的培养基的陪替氏培养皿用于克服单一培养基的缺点。Remel公司(Lenexa，KS)生产了两种用于初步鉴定尿路病原体的产品。两种产品用了四种不同的培养基，这四种培养基被预先注入分成四个部分的培养皿(或四分体；这种培养皿常被称作“四分培养皿”)。正如在“技术信息(Technical Information)”(Remel，Inc.，Lenexa，KS，(1989))中所述，在“Uropath II Quad”培养皿中的第一部分盛有用于区分克雷伯氏菌属-肠细菌-沙雷氏菌属微生物的胆汁七叶苷琼脂。第二部分盛有可用于快速鉴定S.marcescens和区分沙雷氏菌属和肠杆菌属和克雷伯氏菌属的含有二苯胺蓝的DNAse Test Agar。第三部分盛有用于区分变形杆菌科(基于由变形杆菌属、Providencia和Morganella验证的苯丙氨酸脱氨反应)的苯内氨酸和用于在大肠杆菌鉴定中检测吲哚产生的胰胨。第四部分盛有被用作某些属发酵的碳源的核糖醇。
重要的是“Uropath II Quad”培养皿必须接种纯培养物。因此，这种培养基不适用于尿样的初步分离。这要求首先接种并在初级分离培养基上培养18～24小时。然后将分离的菌落挑取到“Uropath II Quad”培养皿上，并在该培养基上培养18～24小时，因此，即使是对肠杆菌科的细菌作出初步鉴定也至少需要2天时间。另外，Uropath II里的培养基既不适用于绿胺假单孢菌又不适用于革兰氏阳性细菌。
在“技术信息”(Remel，Inc.，Lenexa，KS，(1989))中公开的第二种类似产品是“Urinary Quad”，在“Urinary Quad”培养皿的第一部分中盛有葡萄糖琼脂，它用于获得样品中微生物的总数。过氧化氢酶试验可以在生长中在所述第一部分进行。第二部分盛有Simmen′s柠檬酸盐琼脂，用于基于柠檬酸盐的利用区分肠杆菌菌科和假单孢菌。第三部分盛有Levine′sEMB琼脂，它被用于基于乳糖发酵区别肠杆菌科。第四部分盛有尿素琼脂和明胶。尿素琼脂根据尿素酶活性区分肠杆菌。之所以含有明胶是为了进行明胶液化试验，以便鉴别假单孢杆菌。
尽管希望把“Urinary Quad”皿用作像“Uropath II Quad”皿一样的初级分离培养基，但它们具有明显缺陷。首先，除了葡萄糖琼脂之外，培养皿里的其它培养基仅是用于鉴别革兰氏阴性杆菌的。在第二至四部分中的琼脂对于革兰氏阳性微生物，如金色葡萄球菌(S.aureus)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)和肠球菌的鉴定毫无用处。可以对生长在葡萄糖琼脂上的细菌进行过氧化氢酶试验，它会提供革兰氏阳性微生物存在的线索，特别是在四分体其它几个部分很少或不生长时，不过，这仅能提供有限的信息，还需要其它试验来鉴定这些微生物。另外，如果是一种革兰氏阴性与革兰氏阳性微生物的混合培养物，革兰氏阳性菌很可能会被忽视。
四分培养皿的其它缺陷在于它比较昂贵，而且接种也更困难和麻烦，仅有有限的用于分布接种物的空间。另外，技术人员必须在每个培养皿上进行四次划线操作。除四分培养皿之外，其它结构的培养皿也可以商品化提供，如有三个部分的三分培养皿和有二个部分的二分培养皿。所有此类培养皿的标准尺寸为100×15mm(例如，见Fisher科学目录，1993/94，634-636页)。每一部分的可用表面积与分成的部分数成反比例。因此，尽管这种培养皿所需的操作比四分培养皿少，包括较少的培养基，但限制了培养皿的效用。
如上所述，与常用培养基相关的问题，突出了对更合适培养基的需求。例如，理想的培养基应能支持革兰氏阳性以及革兰氏阴性微生物的快速生长，能够检测其它主要种类的微生物。另外，这种培养基应当能够区分与UTI′s相关的所有最常见的微生物，无须在分隔的培养皿中补充其它培养基。在本发明中所公开的培养基能实现这些目的。
本发明提供的培养基配方，可用于与UTI′s相关的所有最常见的细菌种类的鉴别分析。这些相同的微生物也是在败血病和菌血中出现的主要病原体中的种类。
该培养基被设计成能充分利用这些重要菌种内发生的或由于代谢而发生的独特生化反应。当生长在本发明的优选培养基中时，大肠杆菌菌落大且为红色，在菌落周围有暗淡的透明晕圈。肺炎杆菌菌落大而且呈粘液状，为蓝/黑或蓝/灰色，在菌落周围有暗淡的透明晕圈。奥克西托克雷伯杆菌(K.oxytoca)菌落大，能产生嫩黄色素，使菌落和其周围的培养基着色，在菌落周围通常还有暗淡的透明晕圈。奇异变形菌菌落大，轻微扩散，并把其周围的培养基染成橙色。铜绿假单孢菌菌落大，由于它所产生的脓青素色素而被染成甸子绿至黄绿色，而且由于在周围的培养基中发生的蛋白水解作用而导致菌落周围有透明的晕圈。猪霍乱沙门氏菌菌落大且呈棕色，有棕色色素扩散到培养基中，但没有透明晕圈。粪肠球菌长成嫩白色小菌落，它能在菌落下面沉淀酪蛋白并能水解菌落周围的酪蛋白。金黄色葡萄球菌菌落为中等大小，并呈金黄色，也有蛋白水解的透明晕圈。
该培养基还考虑到了人尿(通常从中分离上述细菌的生物液体)的生化特性。例如，在经过短短3小时的培养之后即可观察到的大肠杆菌菌落的红色是由于存在β-葡糖苷酸酶。这是与人体生理学相关的，因为人体肝脏具有能把葡糖醛酸结合到芳族化合物上的酶，使其变成水溶性并容易由肾脏分泌到尿液里。大部分大肠杆菌都具有特有的β-葡糖苷酸酶，这种酶能除去上述共轭物上的葡糖醛酸，以便把它作为碳源加以利用，因而使得微生物能在尿路中生长。这种微生物还可以利用这种酶来降低尿中潜在有毒的葡糖苷酸结合的芳族化合物。
乳糖发酵也用于协助鉴别大肠杆菌，因为乳糖阳性菌株会由于β-半乳糖苷酶的作用(与和乳糖分解代谢有关的其它酶一起)而在菌落周围表现出部分透明或晕圈。这种透明不是由于蛋白水解作用，而可能是由于作为培养基组分的脱脂乳中乳糖的发酵所产生的有机酸对酪蛋白的溶解作用而造成的。通过把一滴或两滴2NHCl滴在菌落周围的透明部分可以证实这种溶解作用。上述透明部分在遇酸后由于酪蛋白的再沉淀会变混浊。如果把酸加在确实对酪蛋白发生蛋白水解作用的微生物周围的透明部分，与溶解酪蛋白的情况相反，这一部分仍保持透明。
可以基于在这些微生物周围缺乏透明部分而区分大肠杆菌和看上去相似的菌落，如较少分离到的葡糖苷酸酶阳性沙门氏菌属和志贺菌属亚种(shigella ssp)，以及沙雷氏菌属的红色色素菌株，这可能是由于在这些微生物周围没有透明区，因为它们缺乏β-半乳糖苷酶。另外吲哚斑点试验也很容易进行，该试验可以进一步证实大肠杆菌菌落(吲哚阳性)。大肠杆菌是报道过的β-葡糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶和吲哚均为阳性的仅有的菌种。
肺炎杆菌的鉴定也与正常的人体代谢相关，因为人体肝脏也有能把硫酸酯结合到不需要的芳族化合物上的酶。肺炎杆菌特有一种芳基硫酸酯酶，它能除去上述共轭物上的硫酸酯，以便把它作为硫源加以利用。与大肠杆菌相似，这种微生物也能用这种酶来降低尿中潜在有毒的硫酸酯结合的芳族化合物的浓度。因此，肺炎杆菌也有在尿路中定居所需的生化能力。在本发明的培养基上，乳糖发酵的(即乳糖阳性)肺炎杆菌菌株也具有与大肠杆菌相似的部分透明的晕圈。
借助于可利用本发明的培养基的生长而进行的吲哚和尿素酶斑点试验可以区分肺炎球菌和看上去相似的芳基硫酸酯酶阳性菌种，如克雷伯氏菌属和肠杆菌属亚种(例如，植物克雷伯氏菌(K.Planticola)、产气肠杆菌和Egergoviae；Yamada等，“肠细菌科细菌芳(香)基硫酸酯酶的比较免疫学研究：受硫化合物和酪胺调节的潜在芳(香)基硫酸酯酶的出现(Comparativeimmunological studies on arylsulfatase in bacteria of the familyEnterobacteriaceae：Occurrence of Latent arylsulfatase Pretein regulated bysulfur compounds and tyramine)”，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，l33：536～541[1978])。肺炎杆菌分离物通常为吲哚阴性和尿素酶弱阳性。
其它的克雷伯氏菌种，奥克西托克雷伯氏菌也能在本发明的培养基上产生特有的颜色。这种微生物为芳基硫酸酯酶阴性。但在过夜培养时会产生大的嫩黄色菌落。尽管其它细菌(例如Pantoeae sp)可以在本发明的培养基上长成大的黄色菌落，但没有其它微生物能产生由该细胞分泌的特有扩散性色素。另外，可进行吲哚和尿素酶斑点试验来证实奥克西托克雷伯氏菌的鉴定，该菌的菌落在吲哚试验中通常为阳性，而在尿素酶试验中为弱阳性。
奇异变形菌的鉴定是基于色氨酸氧化酶(也被称为色氨酸脱氨酶，可能是与苯丙氨酸脱氨酶一样的酶)活性。由变形杆菌科(Proteeae)的大部分成员所产生的这种酶能催化色氨酸脱氨变成吲哚丙酮酸。这种脱氨酶活性可直接在本发明的培养基中检测到，因为吲哚化合物与锰或铜的配位作用会产生橙色菌落。在经过短短4小时的培养之后即可观察到这种橙色，因此可以较迅速地初步鉴定奇异变形菌。
奇异变形菌在本发明的培养基上形成很小的菌落，这是优于其它常用培养基的一个突出优点。然而，在奇异变形菌的菌落上仍然可以看到锯齿形的扩散边缘，这是有助于识别这种微生物的一个显著特征。与大肠杆菌和克雷伯氏菌一样，尿素酶和吲哚斑点试验反应也可用来进一步验证菌落的身份，当然，尿素酶试验与从尿中分离的细菌的关系是很明显的，奇异变形菌在吲哚试验中呈阴性，而在尿素酶试验中呈强阳性。
猪霍乱沙门氏菌的鉴定是基于酪胺被酪胺氧化酶氧化生成羟基苯乙醛，当培养基配方中有锰或铜时，这种菌落就能产生棕色色素。猪霍乱沙门氏菌菌落为棕色，具有有限的边缘。这一点明显不同于变形杆菌属的菌落，变形杆菌属菌落为橙色，并有扩散的不均匀的边缘。
根据在氧化酶斑点试验中观察到的反应可很容易地确定猪霍乱沙门氏菌与看上去相似的酪胺氧化酶阳性菌落，如类产碱假单孢菌(P.pseudoalcaligenes)的区别。猪霍乱沙门氏菌为氧化酶阴性，而类产碱假单孢菌为氧化酶阳性。
铜绿假单孢菌的鉴定是基于脓青素，一种由大多数铜绿假单孢菌菌株所产生的甸子绿色可溶性色素。铜绿假单孢菌还具有很强的蛋白水解活性，它使该菌落下面琼脂中的酪蛋白变得透明，并在该菌落周围形成透明的晕圈。尽管其他人已研究了用乳品培养基来检测铜绿假单胞菌(例如参见Brown和Foster，“一种检测铜绿假单胞菌的简单乳品培养基(A simple diagnostic milkmedium for Pseudomonas aeruginosa)”，临床病理学杂志(J.Clin.Pathol.)，23：172-177[1970])，但本发明的培养基能使颜色的产生和水解反应的发生大大加快。Brown和Foster提到(174页)“乳琼脂的一个优点是48小时充分显色和水解”，实际上，他们得出的结果是在37℃下培养24小时，接着在20℃再培养24小时，才产生最好的颜色。最后在他们使用的培养基上还加了25％营养肉汤，培养24小时之后才能看到显色作用。这与本发明的方法和培养基完全不同，本发明只在一个培养温度下仅短短7小时内就很快产生颜色和酪蛋白的水解。此外，为进一步确认铜绿假单胞菌的身份，这些菌落的颜色是在滴入一或二滴2NHCl后几秒钟内就从绿变为粉红。还可用氧化酶斑点试验来证实该微生物不是肠杆菌科中的成员。
粪肠球菌与革兰氏阴性微生物的区别是它在本发明培养基上的菌落是亮白色的很小如针尖般一样。这种微生物由于琼脂中酪蛋白的水解，在其菌落周围也产生晕圈。此外，在菌落生长多的区域，乳糖在该培养基上发酵产生的酸使该乳酪蛋白沉淀而产生一种雾状的浑浊现象。
为证实粪肠球菌的存在，可把一、二滴1％的亚碲酸钾分配在这些菌落上。凡是能还原亚碲酸盐的菌落，一小时之内会变成黑色。粪肠球菌只是能还原亚碲酸盐的肠杆菌属中的一个成员(R.R.Facklam和J.A.Washington，III.“莲球菌和相关触酶阴性革兰氏阳性球菌(Streptococcus and related catalase-negative gram-positive cocci)，”A.Balows等人(eds.)，临床微生物学手册(Manual of Clinical Microbiology)，美国微生物学会，PP.238-257[1991])。在微生物学实验室中用的另外的“PYR”试验(吡咯烷酮基芳基酰胺酶)也能在这些菌落上进行。该试验有助于鉴别肠球菌与链球菌。肠球菌为阳性，而除酿脓链球菌(S.pyogenes)之外的所有链球菌均为阴性(Facklam和Washington，252页)。
与类肠球菌不同，金黄色葡萄球菌在这种培养基上形成中等大小的不透明金黄色菌落。与上述很多微生物一样，金黄色葡萄球菌通常是蛋白水解性的，能在琼脂上形成透明的晕圈。为了证实被怀疑的金黄色葡萄球菌的存在，可以进行凝固酶试验。预计用于试验凝固酶活性的任何方法都可以与本发明的培养基结合起来使用，包括载片和试管凝固酶试验。通常金黄色葡萄球菌为阳性，而大部分其它微生物为凝固酶阴性。
腐生葡萄球菌在这种培养基上能产生中等大小的不透明白色菌落，使其有别于粪肠球菌和金黄色葡萄球菌。这种微生物具有很强的蛋白水解活性，并能在其菌落周围的培养基中形成透明的晕圈。
表5
重要微生物在本发明培养基上的菌落特征
    生物体                菌     落
大肠杆菌(E.Coli) 大的红色菌落，周围有透明部分
肺炎杆菌(K.pneumoniae) 大的蓝灰色粘液状菌落，周围有透明部分
奥克西托克雷伯氏菌(K.oxytoca) 大的黄色菌落，有黄色色素从菌落中向外扩散，通常周围有透明部分
猪霍乱沙门氏菌(S.chaleraesuis) 大的棕色菌落，菌落周围的培养基为棕色，无透明部分
奇异变形菌(P.mirabilrs) 大的橙色、不均匀轻微扩散的菌落，菌落周围的培养基为橙色；无透明部分
铜绿假单孢菌(P.aeruginosa) 大的绿色菌落，菌落周围有透明部分，并有甸子绿或黄绿色素从菌落中向外扩散
粪肠球菌(E.faecalis) 小的白色菌落，有酪蛋白沉淀且菌落周围有透明部分
金黄色葡萄球菌(S.aureus) 中等黄色菌落，菌落周围通常有透明部分
腐生葡萄球菌(S.saprophyticus) 中等白色菌落，菌落周围有透明部分
将本发明多用途试验培养基的成分加以优化，以便能最简便地鉴别这些微生物。下面的表格总结了最常从UTI′s分离到的微生物生长在本发明培养基的优选方案中时的菌落特征。
如上表所示，当生长在本发明的培养基上时，与尿路感染和其它感染最相关的微生物可根据其菌落特征方便地加以区分。下表总结了菌落特征以及辅助斑点试验，这种试验可用于在经过本发明的培养基上培养以后证实这些重要菌种的身份。在该表中，符号“Δ”用于表示对本发明培养基上的菌落或从培养基中挑取的菌落所做的斑点试验。因此，在该设计中包括了凝固酶试验。
其它微生物，包括肠杆菌科的其它成员以及各种非葡萄糖发酵菌和革兰氏阳性菌也已在本发明的培养基上生长过。例如，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组strep)长成小的白色菌落，由于蛋白水解作用而具有透明的晕圈。尿气球菌(Aerococcus urinae)长成小的红色菌落(即β-葡糖苷酸酶阳性)，无透明部分。亚利桑那沙门氏菌(Salmonilla亚种3)能长成不透明的大的红色菌落(即β-葡糖苷酸酶阳性)。肾棒状杆菌(Corynebacterium renale)长成小的橙黄色菌落，由于蛋白水解作用而具有弱的透明部分。重要的是，该总结的结果表明，所述其它菌种不会产生与表6中菌种十分相似的显色反应，因此不会将其混淆。
尽管如此，本发明的培养基还可以用于除上表中所列微生物之外的其它微生物的生长和初步鉴定，对此也在上面做了明确的设计和解释。
表6
菌落形态学和斑点试验反应
    试验 Pos.Rxn  E.c.  P.m.  K.p.  K.o.  S.c.  P.a.  E.f.  S.s.  S.a.
  β-葡糖苷酸酶   红色   +   -   -   -   -   -   -   -   -
  β-半乳糖苷酶   透明   +   -   +   +   -   -   -   -   -
    吲哚Δ   蓝色   +   -   -   +   -   -   -   -   -
  色氨酸氧化酶   橙色   -   +   -   -   -   -   -   -   -
    尿素酶Δ   红色   -   +  +/-   +/-   -   -   -   -   -
  芳基硫酸酪酶   蓝/黑   -   -   +   -   -   -   -   -   -
  酪胺氧化酶   棕色   -   -   -   -   +   -   -   -   -
    脓青素   甸子蓝   -   -   -   -   -   +   -   -   -
  脓青素酸性反应Δ   粉红色   -   -   -   -   -   +   -   -   -
    氧化酶Δ   紫色   -   -   -   -   -   +   -   -   -
    蛋白水解   透明   -   -   -   -   -   +   +   +   +
    凝固酶Δ   凝固   -   -   -   -   -   -   -   -   +
    亚碲酸盐还原   黑色   -   -   -   -   -   -   +   -   -
    分泌色素   黄色   -   -   -   +   -   -   -   -   -
    细胞色素   黄色   -   -   -   -   -   -   -   -   +
上表中所用缩略语的含义如下：
Pos.Rxn＝阳性反应        S.c．＝猪霍乱沙门氏菌
E.c.＝大肠杆菌           P.a.＝铀绿假单孢菌
P.m.＝奇异变形菌         E.f.＝粪肠球菌
K.p.＝肺炎杆菌           S.s.＝腐生葡萄球菌
K.o.＝奥克西托克雷伯氏菌 S.a.＝金黄色葡萄球菌
+＝阳性试验结果          -＝阴性试验结果
预计，除上述斑点试验外，其它试验也可以用于本发明的培养基。例如，与许多其它类型的鉴别培养基不同，本发明培养基的一个主要优点是，重要的反应，如吲哚、尿素酶、过氧化氢酶和亚碲酸盐还原反应不受培养基的组分或由生长在该培养基上的培养物所产生的代谢终产物的干扰。
本发明设计了一种一般用于细菌鉴定的指示培养皿。其培养基和方法是特别针对与UTI′s相关的三种最重要的菌种而设计的。正如将要在下面的实验部分将要提到的，初步研究是为了开发一种固体板状培养基，这种培养基中含有用于鉴定与UTI′s相关的最常见微生物的三种生化反应所需的显色化合物。最初的目的是为了同时试验由三种重要细菌所产生的三种重要的酶：葡糖苷酸酶(用于鉴定大肠杆菌)、芳基硫酸酯酶(用于鉴定肺炎杆菌)和尿素酶(用于鉴定奇异变形菌)。
微生物学家和培养基研究者早就意识到，要把多种试验反应合并在一种培养基中进行是非常困难的。对于其中pH变化明显是由于它对其它反应的有害影响的培养基来说尤为如此。在完成本发明的过程中就遇到了这些困难，其间，试验了上千种试剂和试剂的组合。
包括培养基里的以pH为基础的尿素酶试验试剂，会影响其它酶系统的试验。例如，当培养基中含有用于大多数尿素酶试验的pH指示剂酚红时，尿素酶阳性微生物的存在会导致大部分培养基改变颜色，掩盖或改变可在本发明培养基上观察到的其它颜色变化。这种现象特别有关于易于蔓延的尿素酶阳性微生物，如奇异变形菌。据观察，奇异变形菌生长在配方中含有pH指示剂的培养基上，会改变整个培养基皿的颜色。相反在配方中含有乳糖的培养基上，能利用乳糖细菌，如大肠杆菌、肺炎杆菌和粪肠球菌的存在会降低pH并干扰尿素酶反应。
为了避免这些问题，并提供一种鉴别变形菌科的可靠试验，发明了一种色氨酸氧化酶并用它取代用于鉴定奇异变形菌的尿素酶试验。这种色氨酸氧化酶在很多方面都优于尿素酶试验。正如将要在下文中进一步讨论的，尿素酶试验并非专一的检测尿素水解，它确实能试验pH的升高。相反，色氨酸氧化酶试验更为专一，它试验能把色氨酸氧化成吲哚丙酮酸的酶的存在，而且不依赖于检测中pH的变化。
作为把尿素酶试验结合在琼脂培养基中的一种取代方式，作为整个发明的一部分还开发了一种验证尿素酶斑点试验，它可以与色氨酸氧化酶试验一起使用，它是一检验被怀疑为变形菌属菌落的优选方法。与其它很多培养基(如血琼脂)不同，本发明的培养基不干扰尿素酶斑点试验(即：导致假阳性反应)。
本发明是以综合的、多种变形的、逐步的形式完成的，以各种浓度对每一种培养基成分进行了试验并观察了各种微生物的反应。首先，对用于葡糖苷酸酶试验的Sal-glc和用于芳基硫酸酯酶试验的Ind-SO4进行了优化，以便使葡糖苷酸酶阳性菌落(如大肠杆菌)呈红色，而芳基硫酸酯酶菌落(如肺炎杆菌)呈靛蓝色。在优化上述酶底物的浓度的过程中还注意到，要很好地诱导芳基硫酸酯酶，含有酪胺是很重要的。
随后，对各种乳制品产生不透明的白色背景以利于检测的能力和红色和蓝色显色试验的敏感性进行了试验。另外，还意外地观察到铜绿假单孢菌菌落在这种培养基上能产生深绿色，因而能够据此检测和鉴别这种微生物。
另外，乳制品还为直接在接种过的培养皿上的生长物上进行的亚碲酸盐斑点试验提供了高对比的白色背景。这种试验在鉴定粪肠球菌方面十分有用。在该试验中，将一滴亚碲酸盐加在菌落上并观察反应。能够还原亚碲酸盐的菌落将会在大约1小时内变成黑色。
含有乳制品还为在本发明的培养基中进行的另两个重要而有用的试验提供了基础。首先，它提供了一种检验重要的酶β-半乳糖苷酶存在的非显色方式。由于利用了该乳制品里的乳糖，长出的大肠杆菌和肺炎杆菌菌落周围的培养基里有透明部分(即晕圈和区域)。对这些微生物来说，晕圈的出现是溶解的结果，而不是因为乳制品中酪蛋白的降解。通过以这种新的方式使用乳制品，可以同时试验β-半乳糖苷酶以及β-葡糖苷酸酶(对于大肠杆菌来说很重要)和芳基硫酸酯酶(对于肺炎炎杆菌很重要)。乳制品变得透明还具有优于某些β-半乳糖苷酶试验培养基，如含有Andrade′s指示剂的CLED的优点，在那些培养基上培养超过预定的时间后会导致掩盖乳糖发酵反应。而在本发明的培养基上，晕圈不会因培养时间的增加而受到不利影响。
其次，含有乳制品还为试验蛋白酶解提供了便利途径。蛋白酶解是很多重要病原体细菌如铜绿假单孢菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和腐生葡萄球菌的特有特征。与大肠杆菌和肺炎杆菌落解乳蛋白不同，这些微生物确实能通过蛋白酶解降解乳蛋白，从而形成永久性的蛋白酶解透明晕圈。与含有抑制化合物(如在MacConkey中含有结晶紫和胆汁)的其它常用于尿样品的培养基不同，重要的是革兰氏阳性细菌在本发明的培养基上长的很好。
接下来还观察到，培养基中含有色氨酸以诱导大肠杆菌色氨酸酶，有利于加强吲哚斑点试验。该试验可以在生长于本发明的培养基上的菌落上进行，或者将一小滴吲哚试剂直接加在试验菌落上或者取一小部分试验菌落放在用吲哚试剂浸泡或饱和的滤纸上。与很多常用显色培养基(如MacConkey)不同，吲哚试验反应不会受生长在本发明培养基上的微生物的抑制。
随后，对配方进行优化以阻止变形菌属细菌在该培养基上蔓延。如果在琼脂培养皿上有蔓延的微生物，就很难或不可能挑选单一菌落用于纯培养。本发明的培养基通过抑制蔓延现象使得技术人员可以成功地分离出纯培养物用于任何必须的进一步研究。通过抑制蔓延，本发明培养基还利于可能存在于被分析样品中的其它微生物。这是本发明培养基的一个重要特征，而很多常用的选择或非选择培养基不能适当抑制蔓延。
在一组使用各种盐的实验中，证实了硫酸盐能比氯酸盐更好地减少蔓延。在这些研究过程中还发现，含有锰可以抑制奇异变形菌蔓延。
在以后的实验中，在培养基中使用锰引出了几个十分重要的发现。首先观察到，在存在这种金属时猪霍乱沙门氏菌菌落为棕色。这种颜色的产生被证实是由于其氧化培养基里的酪胺使其生成羟基苯乙醛的能力以及随后这种醛类化合物被锰离子氧化或配合生成棕色色素。其次，还发现奇异变形菌菌落在这种培养基上为橙色，这是由于其具有把培养基里的色氨酸氧化成吲哚丙酮酸酯的能力，随后这种化合物与锰离子配合生成橙色色素。已证实含有诸如锰和铜之类的金属十分有利于催化这类显色反应。
随后试验了几种试剂提高铜绿假单孢菌产生脓青素的能力。首先，在用酪胺所做实验中，意外地发现酪胺能激发脓青素的合成。其次，也有报导说镁激发脓青素合成(例如，参见E.O.King等，“用于证明脓青素和荧光素的两个简单培养基(Two Simple Media for the Demonstration of Pyocyanin andFluorescein)”，实验室和临床医学杂志(J.Lab&Clin Med)，44：301-307，1954；和J.F.MacFaddin，医用菌的分离-培养-鉴定-保存的培养基(Media for Isolafion-Cultivation-Identification-Maintenance of MedicalBacteria)，Williams&Wilkins，[1985]，652-656页)。这一发现得到了证实，而且发现镁用于本发明的培养基中是有利的，没有任何有害作用。再者，在用铜绿假单孢菌所做实验中意外地发现，谷氨酸和谷氨酰胺能激发脓青素合成。上述化合物是与其它氨基酸一起进行实验的，而且证实它们是有益的并无有害作用。在该实验过程中，意外发现苯丙氨酸也是有益的且无有害作用。相反，其它几种氨基酸无助于提高脓青素的产量。不过，在后面的实验中发现谷氨酸和谷氨酰胺的存在能延长斑点吲哚试验的存放时间。
一旦将上述反应的特征搞清，就对各种营养胨和浸膏对显色反应的影响进行研究。根据使用各种类型胨和胨制剂所做多次试验确定，大豆胨的效果最好。然后进行了优化胨以便使斑点吲哚反应和葡萄球菌属菌种(Staphylococcus sp)生长最佳的研究。在这些实验中发现，脑心浸出液(BHI)和肉膏具有很好的效果。还发现金黄色葡萄球菌菌落呈一种特异的黄色，并能在这种培养基上蛋白酶解，而腐生葡萄球菌菌落呈白色并在这种培养基上蛋白酶解。上述发现十分突出，因为很多用于UTI′s的选择和鉴别的培养基，最著名的有EMB和McConkey抑制革兰氏阳性微生物，像葡萄球菌属(Staphylococcus)和肠球菌属(Enterococcus)。因此，本发明提供了一种能让革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物很好生长的鉴别培养基。由于UTI′s最常见的两种病原是大肠杆菌(革兰氏阴性)和腐生葡萄球菌(革兰氏阳性)，本发明培养基的优点是这两种微生物都能很好的生长并可以区分。
在针对在培养皿上可见的反应对培养基的组分进行优化之后，又对用于验证各种菌种身份的斑点试验进行了研究和优化。例如，对斑点吲哚、尿素酶和亚碲酸盐还原试验进行微调，以避免干扰该多试验系统，同时获得有力的、易于解释的反应。
重要的是，不仅本发明的培养基适用于预测性鉴定与UTI′s相关的最常见微生物，而且本发明的方法和培养基还可以与传统的UTI′s诊断结合应用。例如，与对某些微生物有选择性的培养基(例如MacConkey，它能让革兰氏阴性菌生长，但抑制革兰氏阳性菌)和分配到四分培养皿上的培养基不同，本发明的培养基可用于测定出自尿样的菌落。除了标准的划线培养法之外，本发明的培养基和方法可用于倾注培养法。因此，这种培养基是多用途的，并且解决了与用于微生物学分析的培养基相关的很多问题。定义
在本发明说明书和权利要求中出现的名词“试样”和“样品”取其最广泛的意义。一方面它包括一种样品和培养物，另一方面它包括生物和环境试样。上述名词包括从人体和其它动物获得的所有类型的试样，包括(但不限于)体液，如尿，血液、粪便、脑脊液(CSF)、精液和唾液，还有固体组织。上述名词还用于表示常被用于获取微生物培养样品的拭子和其它取样装置。
生物样品可以是动物(包括人)、流体或组织、食品和配料，如乳制品，蔬菜、肉和肉制品，以及废弃物。环境样品包括环境材料，如表面物质，像土壤、水和工业样品，还有取自食品和乳品加工装置、设备、仪器的样品，一次性和非一次性物品。上述样品并不是对可用于本发明的样品类型的限制。
无论是生物的还是环境的，被认为含有微生物的样品可以首先用富集方法处理以便产生微生物的“纯培养物”，也可以先不做这样的处理。就“富集方法”或“富集处理”而言，本发明是指(i)用于通过液体、固体、半固体或其它培养基和/或技术从其它微生物中分离一种想要的具体微生物的常规技术，和(ii)用于从其它微生物中分离一种具体微生物的新技术。本发明并不仅仅局限于一个富集步骤或富集方法类型。例如，在本发明范围之内，可在用常规富集方法对样品进行处理之后，对所得制剂作进一步提纯，以便形成想要菌种的一个菌株的纯的或基本上纯的培养物。然后可以用本发明的培养基和方法对这种纯培养物进行分析。
这里所用的“生物体”一词是指任何种类或类型的微生物，包括(但不限于)细菌、酵母和其它真菌，以及原生动物。
这里所用的“培养物”一词是指被认为含有一种或一种以上微生物的任何样品或试样。“纯培养物”是指其中的微生物仅为一个属和种的培养物。“混合培养物”是指含有一个以上属和/或种的微生物的培养物。
这里所用的“微生物培养基”和“培养基”以及“介质”是指用于微生物生长和繁殖的任何基质。“介质”可用于表示供微生物生长的固体板状培养基。在该定义下还包括半固体和液体微生物生长系统，包括那些合并的活宿主生物体，以及任何类型的培养基。
这里所用“胨”一词的普通含义是指用于描述蛋白水解(例如消化红肉、蔬菜材料或酪蛋白)之后所获水溶性产物的化学上不确定的术语。本发明打算用植物、乳(酪蛋白)、和/或肉胨。这些胨可以由酸或酶产生。蛋白水解可得到一种游离氨基酸和聚合氨基酸(即肽)的混合物，包括胨；在加热至100℃之后全部留在溶液中(J.F.MacFaddin，P.1)。对核酸部分、矿物质和维生素来说胨也很重要，他们提供生长的培养物。
这里所用的“琼脂”一词取其广泛的固有含义，是指从天然材料，如海藻中提取的各种等级的琼脂，还有合成的化合物。因此，该术语包括所有用于微生物培养基的胶凝化合物或制剂，如藻酸盐、明胶、gellans等，不管其来源如何。还要指出，本发明中所用的琼脂和其它胶凝剂还可以由商业渠道从供货公司，如Difco(例如Bacto-agar)、BBL、Oxoid、Marcor、或其它途径获得。
这里所用的“选择性培养基”一词是指能支持被研究的特定微生物生长但抑制其它微生物生长的培养基。这种抑制可能起因于培养基的组分，如有选择毒性的化合物，以及由利用培养基组分的微生物所产生的微生物代谢终产物。
这里所用的“鉴别培养基”一词是指能支持各种微生物生长，但又能够用肉眼区分不同的属或种的培养基。例如，在鉴别培养基中可含有碳水化合物和pH指示剂。如果一种微生物能够酵解上述碳水化合物并降低培养基的pH，将会发生颜色的变化，如果相反，一种微生物不能酵解上述碳水化合物，则pH就不会降低，而且颜色也不会改变。预计菌落特征也可鉴别。例如，一种微生物可能在该培养基上产生红色菌落，而其它菌种则会见到蓝色或无色菌落。某些培养基是选择生的或鉴别性的，某些培养基是选择性和鉴别性同时兼备。同时兼具选择和鉴别培养基特征的培养基的例子有曙红亚甲蓝(“EMB”)和MacConkey，它们都含有能抑制革兰氏阳性微生物生长，同时又允许大部分革兰氏阴性微生物生长的化合物，并由于利用了培养基的组分而产生有色菌落。
这里所用的“显色”化合物一词是指通过光吸收或发射特征对体系作检测的任何化合物。这一术语包括可用肉眼或光学器械检测到的任何可溶和不可溶的酶促裂解产物。“显色剂”的定义包括所有能产生一种可根据颜色变化检测到的终产物的酶促底物。它包括(但不局限于)任何颜色，像在传统的“颜色”含义里一样，如靛蓝、蓝、红、黄、橙、绿、棕等，还有荧光染色或荧光显色化合物，它能产生可用荧光检测到的颜色(例如，荧光素的嫩黄色、罗得明的红色等)。应当指出，其它指示剂像染料(例如pH)和发光化合物都包括在该定义的范围内。
这里所用的“配位化合物”一词是指与发生显色反应有关的化合物及元素和离子。这一术语包括(但不局限于)诸如锰、铜和铁之类的金属及其它元素。预计这些配位化合物可以与其它化合物配合。
这里所用的“氨基酸”一词是可以聚合成蛋白质的、含有羧基(COOH)和氨基(NH2)的任何亚单位。这一术语并不仅局限于天然存在的氨基酸。因此，合成的和改性的L型和D型氨基酸都包括在这一广泛的定义内。
这里所用的“氨基”一词是指化学基团(NH2)，在添加一个质子后它能形成-NH3 +。这里所用的“胺”一词是其普通的化学定义。具体地讲，这一术语是任何可以通过用其它基团(例如烃基)取代氨的一个或一个以上氢原子而产生的化合物。这一定义里包括伯胺、仲胺和叔胺，以及脂族胺、芳族胺和混合的脂族-芳该胺。这里所用的“芳族胺”一词是指包括一个芳香结构，如一个苯环的胺。
这里所用的“不透明的”一词是指能形成不透明的培养基的化合物和试剂。这一术语被用于表示能阻止光线从培养基中透射的制剂。这与能让光线透射的制剂(例如胰蛋白酶大豆琼脂、营养琼脂等)不同。预料各种能产生不透性的化合物均可用于本发明，特别是能形成浅色(如白色)培养基的化合物，包括(但不局限于)乳、高岭土、焙烧硅藻土和其它硅酸盐、碳酸钙和其它碳酸盐，以及钛白(例如二氧化钛)和其它氧化物。在某些实施方案中，含酪蛋白的物质被用作能产生不透性的化合物。因此，预计蛋白类和非蛋白类化合物均可用于本发明的培养基中。
这里所用的“蛋白类的”一词是指含有蛋白质的任何化合物，而“非蛋白类的”一词是指不含有蛋白质组分的任何化合物。
这里所用的“脱脂乳”一词是指脂肪含量降低了的乳品。这一术语包括可作为“低脂”或“无脂”产品通过商业途径获得的乳品。这一术语包括(但不局限于)牛乳。
这里所用的“乳制品”一词是指含有由乳衍生的物质的任何组合物。应当指出，这一定义包括乳品里的蛋白质和其它物质(如乳糖)。
这里所用的术语“透明部分”、“晕圈”和“透明的晕圈”是指生长在本发明培养基上的某些微生物的菌落周围的透明区域。这种透明可能是不透明化合物组分被利用或溶解所致。由于生长在该培养基上的微生物利用或溶解了这种成分，菌落周围的不透明的性质变得透明(即，透明或半透明)。生长在这种培养基上的某些微生物能产生非常明显的透明部分，容易看见，其它微生物产生较弱的部分，其中透明部分不那么清晰或明显。
这里所用的“蔓延”一词是指变形杆菌属在培养基上，特别是在半固体或固体板状琼脂上的生长。蔓延是一种与游动生物体，特别是奇异变形菌相关的现象。其中，一组微生物作为一个整体由菌落向外生长。通常，在固体培养基上的这种生长像一系列围绕圈落的同心圆环，其形状通常像一个靶子。尽管变形杆菌属常与蔓延生长相关，预计生长在本发明培养基上的其它微生物也会出现蔓延。预计这种微生物的蔓延也可以被本发明的培养基所抑制。
这里所用的“扩散”一词是指某些微生物的菌落形态学，这里，菌落的边缘不光滑或完整。而且，当用肉眼或通过解剖显微镜观察时，菌落边缘通常是不规则的。该词是取它的常用含义，像本领域技术人员在观察细菌菌落形态学时所使用的那样。例如，预计某些微生物，包括(但不局限于)奇异变形菌在本发明的培养基上会表现某种程度的扩散菌落形态学。
这里所用的“粘液样的”一词是指其些微生物所表现的菌落形态学，其中，菌落构成与粘液相似。与观察细菌菌落形态学领域技术人员所用所有其它术语一样，这个词也是取其一般含义。例如，预计某些微生物，包括(但不限于)肺炎杆菌在本领域培养基上会生成粘液样菌落。不过，预计生长在本发明培养基上的某些肺炎杆菌菌落将不是粘液样的。
这里所用的“可扩散的色素”一词是指由细菌细胞和菌落产生并释放的着色的(即有色的)物质。当生长在微生物培养基上时常可以见到可扩散的色素，因为它能使培养基着色。例如，脓青素是由大多数铜绿假单孢菌菌株所产生的一种可扩散的色素，它能把这种微生物菌落周围的培养基染成绿色。这种绿色根据菌株和培养基成分不同在嫩绿至深绿或甸子绿之间变化。有多种由各种微生物产生的可扩散色素。本发明并不局限于脓青素或任何其它具体的可扩散色素。
这里所用的“初步分离”一词是指直接由样品培养微生物的过程。因此，初步分离包括诸如由培养拭子、尿样等接种琼脂培养皿的过程。初步分离也可以在液体或半固体培养基中进行。
这里所用的“预测性诊断”一词是指能给主治医师提供某些指导的初步诊断，如初步诊断与患者疾病相关的病原微生物。预测性诊断通常是基于“预测性鉴定”，这里所用的“预测性鉴定”一词是指基于对菌落特征、在初步分离培养基上的生长、革兰氏染色结果等的观察而对微生物做出的初步鉴定。
这里所用的“确诊”一词是指最终诊断，其中，患者疾病的病原已被查清。实验
下面所列举的实例是为了证实和进一步解释本发明的某些优选实施方案和方面，不应视为对本发明范围的限制。
在下面的实验说明中，使用了以下缩略语：eq(等同物)；M(克分子)；μM(微克分子)；N(当量)；mol(摩尔)；mmol(毫摩乐)μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；1或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；MRAD(北拉德)；℃(摄氏度)；CFU(菌落形成单位)；ELISA(酶联免疫吸附测定)；TSA(胰蛋白酶大豆琼脂)；EMB(曙红亚甲蓝培养基)；MacConkey(MacConkey培养基)；CLED(胱氨酸乳糖电解质缺乏琼脂)；Salmon-glc，或Sal-glc(Salmon-β-D-glcA；6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸，单环己基胺盐，Biosynth)；Magenta-glc或Mag-glc(Magenta-β-D-glcA；5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸环己基胺盐，Biosynth)；Ind-glc(吲哚基葡糖苷酸，Biosynth)；Ind-SO4(3-羟基吲哚硫酸，Sigma)；Mag-SO4(品红硫酸酯；5-溴-6-氯-3-吲哚基硫酸酯；Biosyth)；X-SO4(5-溴-4-氯-3-吲哚基硫酸酯；Biosynth)；YEP(酵母强化胨；Deltown)；尪胨#3(ProteosePeptone#3，Difco laboratories)；PP(尪胨，Marcor)；UHT(超高温巴氏灭菌；用于商品化制备的乳品，如由加拿大Visalia的Reel-Fresh发售的UHT奶)；脱脂奶粉(Oxoid奶粉，Oxoid)；Redigel(RCR Scientific，Goshen，IN)；Oxoid(Oxoid，Basingstoke，英格兰)；BBL(Becton Dickinson MicrobiologySystems，Cockeysville，MD)；DIFCO(Difco  Laboratories，Detroit，MI)；Marcor(Marcor Development，Hackensack，NJ)；Sheffield(Sheffield Products，Norwich，NY)；Champlain(Champlain Industries，Clifton，N.J.)；Intergen(Intergen，Inc.，Purchase，NY)；U.S.Biochemical(美国生化公司，Clevelond，OH)；Scientific Products(McGraw Park，IL)；Sigma(Sigma化学公司，St.Louis，MO)；Biosynth(Biosynth AG，SKokie，IL)；和Deltown(DeltownChemurgic，Greenwich，CT)。
在下面的实验部分，除非另有说明所用的所有氨基酸均为L-型。一般，各种培养基都是对不含其余成分的8％脱脂奶粉溶液通过高压灭菌而制备的。在121℃温度下高压灭菌5分钟以后，将脱脂乳溶液加入其它成分中，并将该琼脂培养基注入培养皿。划线接种琼脂板，并在环境气压下在30～35℃培养过夜。下表列举了用于下列实施例的主要菌株。还试验了在该表中没有列举的肠杆菌科的其它种和株，各种革兰氏阳性和多种其它微生物。
表7
试验的主要菌株
    微生物     来源和编号   是否典型菌株？
    大肠杆菌     ATCC 11775     Yes
    粪肠球菌     ATCC 19433     Yes
    肺炎杆菌     ATCC 13883     Yes
  奥克西托克雷伯氏菌     BIOLOG 1046     No
    奇异变形菌     ATCC 7002     No
    铜绿假单胞菌     ATCC 10145     Yes
    金黄色葡萄球菌     ATCC 12600     Yes
    猪霍乱沙门氏菌     ATCC 13312     Yes
    无乳链球菌     ATCC 13813     Yes
    腐生葡萄球菌     ATCC 15305     Yes
表8
实施例
    组     目的     实施例号
    I     葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶试验反应     1-5
    II     乳品制剂和透明反应     6-7
    III     色氨酸对吲哚斑点试验的影响     8
    IV 锰离子对变形杆菌属蔓延的抑制及其它优点     9-12
    V     所加氨基酸和镁离子的作用     13-16
    VI     各种盐的比较     17-18
    VII     胨对显色反应和微生物生长的影响     19-22
    VIII 用于葡萄球菌属生长的胨、浸膏和氨基酸的优化，以及吲哚斑点试验的稳定化     23-28
    IX     各种斑点试验的研究     29
下面的实施例按上表所示顺序进行分组
第一组
葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶试验反应
在这一组实验中，试验了用于葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶显色反应的各种底物。
例1
显色底物最低满意浓度的确定
大多数显色底物都非常昂贵，而且使用足于使菌落具有适当显色的浓度也很重要。在该实验中，确定了葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶的显色底物最低满意浓度。
1.Ind-SO4和Sal-Glc
首先筛选一种含有少量盐的基本培养基，以减少变形杆菌属的蔓延。这种基本培养基含有琼脂(15g/l)，YEP(4g/l)，KH2PO4(0.1g/l)，K2HPO4(0.1g/l)和MgSO4(0.1g/l)。该基本培养基被用于确定Ind-SO4和Sal-glc的最低满意浓度。对Ind-SO4和Sal-glc的25mg/l、50mg/l、75mg/l和100mg/l浓度进行了试验，并对50mg/l X-SO4和50mg/l X-glc进行了试验。将各种添加剂加入上述基本培养基制备该培养基，用芳基硫酸酯酶阳性菌株(肺炎杆菌)和葡糖苷酸酶阳性菌株(大肠杆菌)接种并观察。
肺炎杆菌被用于试验芳基硫酸酯酶化学。据观察，即使采用最高浓度的芳基硫酸酯酶显色底物(100mg/l)也不起作用(即：菌落呈白色而不是蓝灰色)。不过，酪胺和其它胺可起到芳基硫酸酯酶诱导物的作用(T.Harada和Y.Murooka，“细菌芳基硫酸酯  合成的多重调控中酪胺氧化酶的参与(Participation of tyramine oxidase in multiple control of bacterial arylsulfatasesynthesis)”，(Mem.Inst Sci.Ind，Res.)，Osaka大学37：45-58[1980])。因此，酪胺结晶被加到培养皿表面，大约1小时之内肺炎杆菌菌落变成深蓝灰色。
大肠杆菌被用于试验葡糖苷酸酶化学。发现当Sal-glc的浓度为25mg/l时菌落为白色、50mg/l时为粉红色、75mg/l和100mg/l时为红色，而X-glc浓度为50mg/l时菌落为白色。
基于上述结果，确定Sal-glc的最佳浓度为75mg/l而Ind-SO4的最佳浓度为100mg/l，只要含有适量的酪胺即可。
2.芳基硫酸酯酶和葡糖苷酸酶诱导物的作用
在这一组实验中，试验了其它变化形式。这里，基本培养基由琼脂(15g/l)、YEP(4g/l)、Na2HPO4(3.5g/l)、KH2PO4(1.5g/l)和MgSO4(0.1g/l)组成。将上面制备的基本培养基等分成“A”组和“B”组，它含有各种附加化合物。
A组分成两批，各含有Sal-glc(50mg/l)。第一批不含其它添加剂，第二批含有β-甲基葡糖醛酸(100mg/l)，它是大肠杆菌葡糖醛酸酶的一种诱导物。在两批培养基上大肠杆菌菌落都是粉红色，所以较便宜的β-甲基葡糖醛酸不会增强菌落着色。
B组分成3批，各自由基本培养基和100mg/l Ind-SO4组成。第一批不含其它添加剂。其余两批含有芳基硫酸酯酶的潜在诱导物，具体为500mg/l酪胺HCl和500mg/l硫酸软骨素(Sigma)。在所有三种配方的培养基上在35℃培养过夜后，肺炎杆菌菌落均为白色。在酪胺培养皿上，在室温下再经过几天培养，肺炎杆菌和猪霍乱沙门氏菌变为蓝黑色。由该实验可以看出，当培养转入室温进行时芳基硫酸酯酶的活性较强。另外，还惊奇地发现在含有酪胺的培养皿上铜绿假单孢菌菌落为绿色。
例2
酪胺满意浓度的确定
如上例所述，酪胺对芳基硫酸酯酶反应有明显的有益影响。因此，设计下面的实施例是为了确定能产生最强的芳基硫酸酯酶反应的满意的酪胺浓度。
在该实施例中，基本培养基由琼脂(15g/l)、YEP(2g/l)、Ind-SO4(100g/l)、MgC12(0.1g/l)和FeC12(0.1g/l)组成。将该基本培养基分成10批。第一批无添加剂，作对照。第二批含50mg/l酪胺HCl；第三批含100mg/l；第4批含200mg/l；第5批含500mg/l；；第6批含1000mg/ml；第7批含2000mg/ml。第8、9和10批也含有2000mg/l酪胺，但在第8批中另加Ind-SO4(100mg/l)，在第9批中另加硫酸软骨素(100mg/ml)，而在第10批中另加牛磺酸(100mg/l)。在将上述培养基混配好并高压灭菌之后，加注到培养皿中并接种微生物。下列诸表给出了四种微生物在每一批培养基上在不同温度下培养不同时间以后的结果。
表9
在35℃培养24小时后的结果
  批号   肺浆杆菌 铜绿假单胞菌 奇异变形菌 猪霍乱沙门氏菌
    1     白     白     白     白
    2     浅灰     白     白     白
    3     浅灰     白     白     白
    4     浅灰     白     白     白
    5     深灰     浅绿     白     白
    6     中灰     绿     白     白
    7     浅灰     绿     白     浅蓝
    8     浅灰     绿     白     浅蓝
    9     中灰     绿     白     白
    10     浅灰     绿     白     白
表10
在室温下再培养2天后的结果
  批号   肺浆杆菌 铜绿假单胞菌 奇异变形菌 猪霍乱沙门氏菌
    1     白     白     白     白
    2     浅灰     白     白     白
    3     浅灰     白     白     白
    4     浅灰     白     白     浅灰
    5     暗     白     白     浅灰
    6     暗     绿     白     浅灰
    7     中灰     绿     白     浅灰
    8     深灰     绿     白     深蓝
    9     中灰     绿     白     浅灰
    10     暗     绿     白     浅灰
取得了几个惊人发现，首先，证实200mg/l的Ind-SO4能比100mg/l的浓度产生明显较暗的芳基硫酸酯酶反应。其次，发现500mg/l浓度的酪胺可激发绿色脓青素的合成。再者，发现肺炎杆菌的芳基硫酸酯酶比猪霍乱沙门氏菌的芳基硫酸酯酶更易受到更强的诱导，而且，将酪胺含量保持在较低水平可以区分这些菌种。
例3
对Ind-SO4和X-SO4的评价
该实验是接着前两个实施例设计的，在该实施例中对各种浓度的Ind-SO4和X-SO4的效果进行了评价。基本培养基由琼脂(15g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、尪胨#3(3g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、NaCl(5g/l)和酪胺HCl(500mg/l)。制备该基本培养基并将其分成两批。灭菌之后对培养基进行分装、接种各种微生物、在30℃培养并观察。下表给出了添加到每一批里去的化合物，以及关于观察到的微生物的菌落特征的有关资料。
上述结果表明，第4、5、9、11和12批能产生最暗的反应色。Ind-SO4和X-SO4看上去大致相同，将其合并也不会更好。基于上述结果，证实好的最低浓度约为200mg/l。
表11
    批号     所加化合物     观察结果
    1     70mg/l Ind-SO4 肺炎杆菌为蓝黑色
    2     100mg/l Ind-SO4 肺炎杆菌为比第一批暗的蓝黑色
    3     150mg/l Ind-SO4 肺炎杆菌为比第二批暗的蓝黑色
    4     200mg/l Ind-SO4 肺炎杆菌为比第三批暗的蓝黑色
    5     250mg/l Ind-SO4 肺炎杆菌大致与第四批相同
    6     70mg/l X-SO4 肺炎杆菌为普鲁士兰
    7     100mg/l X-SO4 肺炎杆菌为比第六批暗的普鲁士蓝
    8     150mg/l X-SO4 肺炎杆菌为比第七批暗的普鲁士蓝
    9     200mg/l X-SO4 肺炎杆菌为比第八批暗的普鲁士蓝
    10     35mg/l Ind-SO4+35mg/l X-SO4 肺炎杆菌为蓝黑(类似Ind-SO4)
    11     75mg/l Ind-SO4+75mg/l X-SO4 肺炎杆菌蓝黑色(类似类似Ind-SO4)比第十批暗
    12   100mg/l Ind-SO4+100mg/l X-SO4 肺炎杆菌蓝黑(类似类似Ind-SO4)大致与第十一批相同
例4
对Ind-SO4和Mag-SO4的评价
在该实验中对各种浓度Magenta-SO4(“Mag-SO4”)和Ind-SO4的效果进行了比较。对除胨之外的几种化合物进行了试验，以便产生较暗的芳基硫酸酯酶反应。在该实验中，基本培养基是由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、大豆胨(6g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、谷氨酰胺(1g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪胺(250mg/l)、红色-glc(70mg/l)、MnCl2(50mg/l)和CuSO4(50mg/l)组成。
制备7批基本培养基，并加入下表所列的试剂。在接种和培养之后观察芳基硫酸酯酶反应。
表12
    批号     试剂
    1     100mg/l抗坏血酸和100mg/l Mag-SO4
    2     100mg/l Mag-SO4
    3     200mg/l Mag-SO4
    4     100mg/l Mag-SO4和100mg/l Ind-SO4
    5     200mg/l Mag-SO4和200mg/lInd-SO4
    6     250mg/l Ind-SO4
    7     250mg/l Ind-SO4和1g/l MgCl2
第5批能让肺炎杆菌产生最暗的总体反应，但加入200mg/l的Mag-SO4会使沙汴门菌属菌落呈粉红色(即：一种弱阳性反应)。在第3批上观察到类似问题。因此，这样的组合被证明不理想。
第6批效果很好(含有250mg/l Ind-SO4)，但第7批(另有1g/l MgC12)从总体上看能产生最佳的效果。由于这一批中含有MgC12，激发了铜绿假单孢杆菌产生绿色脓青素，提高该培养基的鉴别能力。
例5
Sal-Glc浓度
在该例试验了Sal-glc的各种浓度。基本配方由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、Marcor大豆胨(6g/l)、无水Na2SO4(2.5g/l)、无水MgSO4(0.6g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、谷氨酰胺(1g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪胺游离碱(200mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)和MnSO4(50mg/l)。将该培养基分成5批，在添加和不添加其它化合物的条件下试验Sal-glc的各种浓度。
下表列出了每一批的组分和在用各种微生物接种并培养培养基之后观察到的反应。在这些制剂中，第5批能以最少量的Sal-glc产生最佳的效果。尽管Sal-glc的浓度愈高，产生的颜色愈强，但这种化合物的费用使得较高的浓度在多数情况下不合算。
表13
    批号     Sal-Glc     观察结果
    1     30mg/l     大肠杆菌为白/粉红色
    2     40mg/l     大肠杆菌为粉红色
    3     50mg/l     大肠杆菌为暗粉红色
    4     60mg/l     大肠杆菌为浅红色
    5     70mg/l     大肠杆菌为红色
第II组
乳品制剂和透明反应
在以下实验中，试验了不同乳品制剂产生不透明的白色背景的能力，这种能力有利于检测和显色试验的灵敏度。乳制品的加入还提供了检验蛋白酶解和乳糖利用的简便方法。因此，也要对这些反应进行观察。
例6
利用脱脂乳检验乳糖利用和/或蛋白酶解
在该实验中，以胨、浸膏和乳糖的各种不同组合制备脱脂乳培养皿，并试验乳糖利用反应。采用了一种简单的基本培养基，它由琼脂(15g/l)、NaCl(5g/l)和Oxoid脱脂乳(16g/l)组成。接种以后将培养皿在30℃培养大约24小时。
下表中列出了加入每一批试验培养基中的成分，以及观察到的大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、肺炎杆菌和铜绿假单孢菌的反应。由于大肠杆菌和肺炎杆菌都是乳糖发酵微生物，预计它们会因为酪蛋白溶解而产生透明部分。
对铜绿假单孢菌而言，这种透明部分是因蛋白酶解所致。
表14
批号     成分     Ecoli S.choler. K.Pneumo.   P.aerug.
    1 胰化蛋白胨(10g/l)和酵母提取物     +++    -   不生长     +++
    2 胰化蛋白胨(10g/l)，酵母提取物和乳糖     +++    -   ++/+++     +++
    3     胰化蛋白胨(10g/l)     +++    -     +     +++
    4 胰化蛋白胨(10g/l)和乳糖(2g/l)     +++    -     +     +++
    5     胰化蛋白胨(5g/l)     +++    -     ++     +++
    6 胰化蛋白胨(5g/l)和乳糖     +++    -   ++/+++     +++
    7     尪胨#3(3g/l)     +++    -     ++     +++
    8     尪胨#3(3g/l)和乳糖     +++    -     ++     +++
S.choler  ＝猪霍乱沙门氏菌
K.pneumo. ＝肺炎杆菌
P.aerug.  ＝铜绿假单胞菌
+++       ＝由于酪蛋白溶解或蛋白酶解而产生的很好的透明部分
++        ＝好的透明部分
+         ＝可观察到的透明部分
-         ＝无透明部分
基于上述结果，可以看出胨或补充0.2％的乳糖对酪蛋白溶解反应无大的影响。然而，发现酵母提取物能抑制铜绿假单孢菌产生脓青素。例如，在第1、2和4批培养基上铜绿假单孢菌菌落为浅绿色，在第3和6批上菌落为中绿色，而在第5、7和8批上菌落为深绿色。因此，总体上看第5、6、7和8批为各种成分的最佳组合。
在该实验以及其它类似实验中，惊奇地发现铜绿假单孢菌能产生深绿色菌落，在菌落周围有明显的蛋白酶解的透明部分。很容易区分因乳糖酵解所致的蛋白质溶解和真正的蛋白酶解，因而易于进行快速斑点试验。在该斑点试验中，将1滴或2滴2HCl加到透明部分并观察不透明性的产生。如果发生了真正的蛋白酶解，透明部分仍保持透明。如果因乳糖消耗而发生了溶解作用，透明部分就变得不透明。
例7
乳品配方
在该实例中，对不同的乳制品进行了试验，以确定可用于本发明培养基的最佳乳制品和乳品浓度。0.1％的甘油与一批脱脂奶粉一起进行试验。
基本培养基由琼脂(17g/l)、大豆胨(6g/l)和NaCl(5g/l)组成。将各种浓度的液体或粉状乳品加入该基本培养基中，并分装到培养皿里，接着接种和培养该培养皿上的微生物，观察反应。下表列出乳制品及其浓度，以及对生长在这些不同配方培养基上的微生物所产生的反应的观察结果。
表15
    批号     乳制品     透明反应
1 1.6％Oxoid脱脂奶粉 良
    2     2.0％Oxoid脱脂奶粉     比第1批好
    3 1.6％Oxoid脱脂奶粉和0.1％甘油 铜绿假单胞菌为黄色；观察到更多裂解
    4   3ml/20ml UHT奶(低脂)     不透明
    5   4ml/20ml UHT奶(低脂)     不透明
6 2ml/20ml凝乳 良
    7     2.5ml/20ml凝乳     比第6批好
    8     5.0ml/20ml凝乳     不如第6批好
奶粉培养皿的颜色为灰白色。比较而言，UHT奶培养皿稍白，而凝乳培养皿略微黄一些。根据培养的微生物所产生的反应，脱脂乳制品优于低脂UHT奶。同样，根据这些结果，估计脱脂奶的最佳浓度为1.6～2％(第1和2批)。每升基本培养基中含有100～125ml凝乳时也能产生良好效果(第6和7批)。
该例证实了把乳蛋白用作显色琼脂培养基的某些主要优点，包括加强色差(即：产生更明显的反应)，降低昂贵化学药品的浓度是必须的，以及可观察到的蛋白酶解和蛋白溶解反应。尽管在本发明中也考虑了诸如能产生不透明性的无机化合物，如高岭土，但这种代替的产生不透明性的化合物不能观察由酪蛋白溶解、降解和/或沉淀所致的某些重要表型反应。不过，本发明并不限制能够观察到这些表型反应的不透明化合物的使用。
第III组
色氨酸对吲哚斑点试验的影响
该吲哚斑点试验在证实大肠杆菌(吲哚阳性)和奇异变形菌(吲哚阴性)方面是十分重要和有用的试验。由于其它肠杆菌可能对葡糖苷酸酶和乳糖利用是阳性，因而可能与大肠杆菌混淆。因此，在该实验中试验验了添加的色氨酸对吲哚斑点试验的影响。如下文将要讲到的，取得了惊人的发现。还试验了培养温度及提高了CO2浓度的空气的影响。
例8
色氨酸、和温度及CO2培养条件的影响
在该实验中，基本培养基由琼脂(15g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、NaCl(10g/l)、胨#3(g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、酪氨HCl(500mg/l)和Ind-SO4(250mg/l)组成。下表给出了每一批的添加化合物和/或特殊培养条件以及所得结果。对这些培养基灭菌、分装、接种和培养按上述方法进行(除非另有说明，培养是在30℃和大气压力下进行)。
表16
  批号     添加的化合物     结果
    1     对照(30℃)     斑点吲哚阴性
    2  500mg/l L-色氨酸(30℃) 斑点吲哚阳性；铜绿假单胞杆菌稍浅
    3  2000mg/l L-色氨酸(30℃) 斑点吲哚阳性；铜绿假单胞菌更浅
    4     37℃ 肺炎杆菌稍浅但更粘；铜绿假单胞菌稍暗
    5     37℃+CO2 铜绿假单孢菌更浅；透明部分不太明显；肺炎杆菌较浅而且更粘
由上表可以看出，加入500mg/l色氨酸被证明有利于产生很强的阳性斑点吲哚试验反应。然而，如果色氨酸的浓度太高，它会对铜绿假单孢菌菌落的绿色造成不利影响。在37℃培养是有利的，但在高CO2浓度的条件下培养不利于肺炎杆菌和铜绿假单孢菌菌落着色，并会使在脱脂乳中的透明部分更不明显。
第IV组
锰离子对变形杆菌属蔓延的抑制和其它优点
在这一组实验中，研究了各种化合物抑制变形杆菌属蔓延的能力。这些化合物对其它生物体的影响也很有意义并且也作了记录。例如，特别有意义的是各种金属离子对铜绿假单孢菌产生的色素以及显色反应的冲击。
例9
锰、甲萘醌、铋、亚碲酸盐和混杂矿物质的作用
在该实验中，研究了锰、甲萘醌、铋、亚碲酸盐和混杂矿物质对该基本培养基反应的影响。特别是这些化合物/化合物的组合物抑制变形杆菌属菌落蔓延，同时支持其它希望的微生物良好生长的能力。
所述基本培养基由琼脂(15g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、NaCl(10g/l)、尪胨#3(3g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、NaCl(5g/l)、酪胺HCl(500mg/l)和Ind-SO4(250mg/l)。将该基本培养基分成20批，并添加下表中所列各种化合物。按上述方法将该培养基分装并接种。接种以后，把培养皿放在30℃培养并观察。
表17
批号 所加的化合物 观察结果
    1 无(对照)
    2 4g/l奶粉 废弃，中等泡沫
    3 4g/l酪蛋白酸钠 废弃，中等泡沫
    4 4g/l酪蛋白 或许对肺炎杆菌和粪肠球菌稍好
    5 10mg/l甲萘醌亚硫酸氢盐 无差别
    6 1mg/l甲萘醌亚硫酸氢盐 无差别
    7 200mg/l MnCl2 抑制奇异变形菌蔓延；沙门氏菌属橙/棕色；铜绿假单胞菌稍暗。
    8 200mg/l MnCl2+100mg/l尿素 抑制奇异变形菌蔓延；沙门氏菌属橙/棕色；铜绿假单胞菌稍暗。
    9 200mg/l MnCl2+200mg/l尿素 抑制奇异变形菌蔓延；沙门氏菌属橙/棕色；铜绿假单胞菌稍暗。
    10 200mg/l MnCl2+500mg/l尿素 抑制奇异变形菌蔓延；沙门氏菌属橙/棕色；铜绿假单胞菌稍暗；肺炎杆菌较暗带有橙色晕圈
    11 200mg/l MnCl2+1000mg/l尿素 抑制奇异变形菌蔓延；沙门氏菌属橙/棕色；铜绿假单胞菌稍暗；肺炎杆菌较暗带有橙色晕圈
    12 200mg/l MnCl2+200mg/l硫代硫酸钠 抑制大肠杆菌变透明
    13 200mg/l柠檬酸铋+200mg/l硫代硫酸钠 大肠杆菌、沙门氏杆菌属、肺炎杆菌、奇异变形菌均为灰黑色
    14 5mg/l亚碲酸钾 粪肠球菌黑色；铜绿假单胞菌绿色；肠球菌被抑制
    15 10mg/l亚碲酸钾 粪肠球菌黑色；铜绿假单胞菌绿色；肠球菌被抑制
    16 200mg/l CaCl2 无差别或稍差
    17 200mg/l MgCl2 无差别或稍差
    18  200mg/l MgSO4 无差别或稍差
    19  200mg/l Na4PPi 无差别或稍差
    20  200mg/l KH2PO4 无差别或稍差
该实验产生了几个非常惊人而且非常重要的结果。首先，发现加入锰非常有利于抑制变形杆菌属的蔓延，即使在有尿素时也是如此。另外，还发现在有锰时猪霍乱沙门氏菌产生棕色色素。后来发现这种色素是由于猪霍乱沙门氏菌使酪胺脱氨生成羟基苯乙醛的能力，该化合物随后又被锰氧化和/或配合以生成棕色色素。锰还能对铜绿假单孢菌产生绿色脓青素的作用有较小的激发作用。重要的是锰没有有害作用。
在该实验中，还发现在有亚碲酸盐时粪肠球菌菌落为暗黑色。也可将其用作本发明的一种快速、易行的诊断试验。然而，由于亚碲酸盐对很多细菌(包括大部分肠杆菌)有毒，不可能将其加入培养基中而又没有不利影响。因而发展了一种亚碲酸盐斑点试验作为其替代形式。在该试验中，可以将一、两滴亚碲酸钾直接加在被认为是粪肠球菌菌落的菌落上，对其进行试验。粪肠球菌菌落能还原亚碲酸盐，并且在温室下培养约1小时后变成黑色。
例10
锰浓度本身和与其它添加剂组合后的作用
在该实验中，试验了几种培养基，所有培养基均含有锰。基本培养基由琼脂(15g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、酪蛋白(4g/l)、尪胨#3(g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、NaCl(5g/l)、Ind-SO4(250g/l)、mag-glc(70mg/l)、酪胺HCl(300mg/l)和MnC12(50mg/l)组成。将该基本培养基分成8批，加入下表中所列出的各种化合物。接种以后，所有培养皿均放在30℃下培养，然后观察。
表18
    批号     所加的化合物     观察结果
    1     无(对照)
    2     酪胺200mg/l     同1
    3     MnCl2 150mg/l 同1；沙门氏菌属很轻的暗黄色
    4 酪胺(200mg/l)+MnCl2(150mg/l)     同1；沙门氏菌属稍暗
    5     色氨酸(100mg/l) 好的斑点吲哚；奇异变形菌略显橙色(少有蔓延)
    6     色氨酸(200mg/l) 差的斑点吲哚；奇异变形菌橙色(蔓延较多一些)
    7     色胺(100mg/l) 同1；肺炎杆菌稍暗；奇异变形菌、大肠杆菌被轻度抑制。
    8   硫酸软骨素(100mg/l) 同1；肺炎杆菌稍暗；奇异变形菌、大肠杆菌被轻度抑制。
该实验产生了几个十分惊人、十分重要的结果。首先，提高锰和/或酪胺浓度少有或没有有利效果。更重要的是，由第5和6批可以看出，添加少到100mg/l的色氨酸也获得了良好的斑点吲哚试验。更惊人、更重要的发现是，培养基中同时存在色氨酸和锰时，奇异变形菌菌落及其周围的培养基变成亮橙色。与100mg/l的用量相比，200mg/l的色氨酸的颜色明显较强。很怀疑这种橙色是由于在奇异变形菌的作用下色氨酸脱氨变成吲哚丙酮酸，随后吲哚丙酮酸与锰配位产生橙色色素
例11
用各种矿物试验对吲哚丙酮酸的氧化或配合作用
在前面的实例中发现，在存在色氨酸和锰时，奇异变形菌能产生很强的橙色。据推测，这是由于吲哚丙铜酸被锰氧化或配合。在该实验中，试验了各种矿物的能力，以便最大限度地增强吲哚丙酮酸的颜色生成作用。为了观察颜色生成的速度和程度，将1mg/ml吲哚丙酮酸溶于水中，并用NaOH中和其酸性。根据所取得的结果，总结出Mn、Cu、Fe或其中二者的组合可以从吲哚丙酮酸有效地产生有色化合物。下面列出了诸矿物及其产生的不同颜色。
表19
批号 矿物 矿物在水中的颜色 IPA和矿物的颜色 IPA、矿物和HCl的颜色
1 MnCl2 浅粉红/透明 黄橙 粉橙
2 CoCl2 蓝 蓝 黄色透明
3 CuSO4 蓝 荧光嫩绿 黄色透明
4 ZnSO4 透明 透明 透明
5 NiCl2 甸子蓝 甸子蓝 透明
6 MnCl2和CuSO4 -- 黄/黑/棕 粉橙
7 Fe2(SO4)3 浅黄 红 红
例12
锰和铜单独使用和组合使用的比较
在该实验中，试验了锰和铜在该培养基中的显色反应。基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、大豆胨(6g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、谷氨酰胺(1g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪氨HCl(250mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)和Sal-glc(70mg/l)。该培养基分成四批，按下表所示以各种浓度加入矿物质。接种培养基并在24小时时观察。
表20
批号     所加的化合物     奇异变形菌颜色
    1     对照     浅橙
    2     对照加50mg/l MnCl2     暗橙
    3     CuSO4(50mg/l)     红橙
    4     MnCl2(50mg/l)和CuSO4(50mg/l)     比第2批暗的橙色
锰和铜都能使奇异变形菌很好地着色而又没有明显不利影响。最后确定单独用锰，因为其所产生的橙色明显不同于大肠杆菌由Sal-glc产生的红色和猪霍乱沙门氏菌由酪胺产生的棕色。
第V组
添加氨基酸和锰离子的作用
在这一组实验中，试验了各种氨基酸增强铜绿假单孢菌产生脓青素以及其它显色反应的能力。另外，还研究了Mg++对脓青素产生的影响。
例13
谷氨酸、酵母提取物与培养温度和气压的作用
在本实验中，试验了谷氨酸、酵母提取物、以及培养温度和气压条件的作用。基本培养基由琼脂(15g/l)、Oxoid奶粉(16g/l)、酪胺HCl(500mg/l)和Ind-SO4(250mg/l)组成。将该基本培养基分成10批，每一批中添加下表中所示的化合物。在用大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎杆菌和铜绿假单孢菌接种以后，按下表规定分别将培养皿放在30℃、26℃或35℃温度下培养。
表21
  批号     所加化合物   培养温度
    1 尪胨#3(3g/l)，加谷氨酸一钠(2g/l)     30℃
    2 尪胨#3(3g/l)，加酵母提取物(1g/l)和谷氨酸一钠(2g/l)     30℃
    3 尪胨#3(10g/l)     30℃
    4 尪胨#3(10g/l)加酵母提取物(1g/l)     30℃
    5 胰化胨(10g/l)     30℃
    6 胰化胨(10g/l)，加酵母提取物(1g/l)     30℃
    7 胰化胨(10g/l)，加酵母提取物(1g/l)和谷氨酸一钠(2g/l)     30℃
    8 胰化胨(10g/l)，加酵母提取物(1g/l)和Sal-glc(80mg/l)     30℃
    9 胰化胨(10g/l)，加酵母提取物(1g/l)     26℃
    10 胰化胨(10g/l)，加酵母提取物(1g/l)  35℃加CO2
下表给出了四种微生物在每一批培养基上的结果。根据这些结果可以看出，在30℃和26℃温度下培养的结果相同，二者在变透明方面均好于在35℃提高CO2浓度的条件下培养。发现谷氨酸能增强铜绿假单孢菌和肺炎杆菌的颜色，而酵母提取物能损害这些微生物产物颜色。
表22
批号     大肠杆菌 猪霍乱沙门氏菌     肺炎杆菌 铜绿假单胞菌
    1     白；透明部分 很轻的黄色     中灰；透明     甸子蓝
    2     白；透明部分     白     浅灰；透明   黄甸子蓝
    3 白；较少透明部分     浅黄 很轻的灰色；透明     甸子蓝
    4 白；较少透明部分     白 很轻的灰色；透明   黄甸子蓝
    5 白；较少透明部分     白     浅灰；透明   浅甸子蓝
    6 白；较少透明部分     白   浅灰；不太透明 很浅的甸子蓝
    7 白；较少透明部分     白   中灰；不太透明   浅甸子蓝
    8   红/透明部分     白     浅灰；透明 很浅的甸子蓝
    9   白；透明部分     浅黄 很轻的灰；透明 很浅的甸子蓝
    10   白；透明部分     白 很轻的灰；不太透明 很浅的甸子蓝
例14
苯丙氨酸的作用
由于加入色氨酸十分有利，因此决定试验添加其它芳族氨基酸，苯丙氨酸。在该实验中，试验了苯丙氨酸在该培养基中的各种有益作用。基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、NaCl(15g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、酪胺HCl(250mg/l)、色氨酸(250mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Ind-glc(250mg/l)和MnCl2(50mg/l)。一批培养基由基本培养基和尪胨#3(3g/l)组成。另一批培养基由基本培养基、尪胨#3(3g/l)和苯丙氨酸(250mg/l)组成。在用大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、肺炎杆菌和铜绿假单孢菌接种每一批培养基后，将培养皿放在30℃下培养。
令人惊奇的是，加入苯丙氨酸有利于肺炎杆菌、铜绿假单孢菌和奇异变形菌着色。
例15
镁和各种氨基酸的作用
在本实验中，试验了镁和各种氨基酸增强肺炎杆菌的芳基硫酸酯酶反应和铜绿假单孢菌产生脓青素的能力。
基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、大豆胨(6g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、尿素(500mg/l)、色氨酸(250mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪胺HCl(250mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Sal-glc(70mg/l)和MnC12(50mg/l)。在对微生物进行接种和增培养之后，观察反应。下表列出了各种被试验的化合物。
表23
    批号     受试化合物
    1     对照
    2     MgCl2(500mg/l)
    3     谷氨酸一钠(1g/l)
    4     谷氨酸胺(1g/l)
    5     天冬氨酸一钠(1g/l)
    6     脯氨酸(1g/l)
    7     苷氨酰-谷氨酸(1g/l)
    8     乙酰胺
在这些添加剂中，MgCl2(第2批)和谷氨酰胺(第4批)能增强脓青素的产生，但MgCl2能轻度激发奇异变形菌蔓延。添加谷氨酸(第3批)没有什么作用。天冬氨酸盐、脯氨酸和乙酰胺(第5、6和8批)能轻度减少脓青素的生成。令人惊奇的是，甘氨酰谷氨酸(第7批)能溶解酪蛋白并使整个培养皿透明。
例16
其它氨基酸的作用
在本实验中，试验了各种其它氨基酸增强肺炎杆菌芳基硫酸酯酶的反应和铜绿假单孢菌产生脓青素的能力。基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、大豆胨(6g/l)、MgCl2(1g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、谷氨酰胺(1g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪氨HCl(250mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)和Sal-glc(70mg/l)。下表列出了被试验的化合物和在接种和培养后观察到的反应。
表24
批号     被试验的化合物     观察结果
    1     无     奇异变形菌为浅橙色
    2     L-丙氨酸     无影响
    3     L-组氨酸HCl   奇异变形菌为暗锈色，但有更多蔓延
    4     L-赖氨酸HCl     奇异变形菌有更多蔓延
    5     L-乌氨酸HCl     奇异变形菌有更多蔓延
    6     L-精氨酸HCl     奇异变形菌有更多蔓延
    7     L-精氨酸碱     奇异变形菌有更多蔓延
这些氨基酸中无一对肺炎杆菌或铜绿假单孢菌有益，而其中大多数会轻度增加奇异变形菌的蔓延。
第VI组
各种盐的比较
在下面的一系列实验中，测定了各种盐对奇异变形菌属蔓延的影响。
例17
NaCl和Na2SO4与其它可变因素的比较
在本实验中，试验了两种基本配方，比较了NaCl2和Na2SO4对显色反应和澄清反应的影响及其诱导奇异变形菌蔓延的能力。配方1被用于第1～10批，而配方2被用于第11～19批。配方1由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、Marcor大豆胨(6g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、色氨酸(250mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪氨HCl(250mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Sal-glc(70mg/l)，MnC12(50mg/l)和NaCl(5g/l)组成。
除了用Na2SO4(5g/l)取代NaCl外，配方2与配方1相同。将培养基分批，并按下表加入各种浓度的化合物。
表25
   1                 配方
   2        尿素(500mg/l)
   3        谷氨酸胺(1g/l)
   4        MgCl2(1g/l)
   5        CuSO4(50mg/l)
   6        色氨酸(250mg/l)
   7        葡糖醛酰胺(1g/l)
   8        乳糖(5g/l)
   9        色氨酸(250mg/l)，CuSO4(50mg/l)，谷氨酰胺(1g/l)，MgCl2(1g/l)
  10        色氨酸(250mg/l)，CuSO4(50mg/l)，谷氨酰胺(1g/l)，尿素(500mg/l)
  11        配方2
  12        尿素(500mg/l)
  13        谷氨酰胺(1g/l)
  14        MgCl2(1g/l)
  15        CuSO4(50mg/l)
  16        色氨酸(250mg/l)
  17        葡糖醛酰胺(1g/l)
  18        乳糖(5g/l)
  19        色氨酸(250mg/l)，CuSO4(50mg/l)，谷氨酰胺(1g/l)，MgCl2(1g/l)
  20        色氨酸(250mg/l)，CuSO4(50mg/l)，谷氨酰胺(1g/l)，MgCl2(1g/l)，尿素(500mg/l)
总体上看，含有Na2SO4的培养皿(第11-20批)比含有NaCl的培养皿(第1-10批)有较少的奇异变形菌蔓延，而大肠杆菌、肺炎杆菌和粪肠球菌周围有更清晰的透明部分。加有CuSO4的培养皿(第5和15批)能大大减少蔓延。由此可见，氯离子比硫离子更能激发蔓延。
例18
MgCl2和MgSO4与MnSO4和CuSO4的比较
在本实例中，比较了镁的氯酸盐和硫酸盐与各种浓度CuSO4和MnSO4添加在培养基里的适当性，及其减少奇异变形菌蔓延的能力。基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、Marcor大豆胨(6g/l)、Na2SO4·10H2O(5g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、谷氨酰胺(1g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪胺HCl(250mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)和Sal-glc(70mg/l)。将该培养基分成10批，并按下表所示加入各种浓度的矿物质。
表26
  批号   MgSO4浓度   MgCl2浓度   MnSO4浓度   CuSO4浓度
    1      --     1g/l     50mg/l     50mg/l
    2     1.25g/l     50mg/l     50mg/l
    3     1.25g/l     50mg/l     0mg/l
    4     1.25g/l     50mg/l     25mg/l
    5     1.25g/l     50mg/l     75mg/l
    6     1.25g/l     50mg/l     100mg/l
    7     1.25g/l     0mg/l     50mg/l
    8     1.25g/l     25mg/l     50mg/l
    9     1.25g/l     75mg/l     50mg/l
    10     1.25g/l     100mg/l     50mg/l
第2批好于第1批，因为变形杆菌属在第1批上蔓延的更多一些。这一观察结果验证了在前面实施例中的发现，即氯化物比硫酸盐更能激发奇异变形菌的蔓延。与第1批相比，克雷伯氏菌属和假单孢菌属在第2批上的颜色更深一些。与第1批相比，大肠杆菌和粪肠球菌周围的透明部分更加清晰。CuSO4能抑制变形杆菌属蔓延并使其菌落颜色较深。不过CuSO4使克雷伯氏菌落较浅。在这些批次中，第2和3批具有最佳的总体效果。由这些结果可以确定，硫酸盐优于氯酸盐。Mn和Cu具有很宽的有效浓度范围。不过，Mn的着色效果稍好一些，而且50mg/l的浓度似乎是接近最佳值。
第VII组
胨对显色反应及微生物生长的作用
在这一组实验中，研究了各种胨和提取物对显色反应的作用。特殊生长物质的选择对于很多显色反应都有深刻影响。业已发现通过适当选择胨，所有培养基都可得以大大改善。
例19
各种胨的作用
在本实验中，研究了各种胨的作用。基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、NaCl(5g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Ind-glc(250mg/l)、酪胺HCl(250mg/l)、色氨酸(250mg/l)和MnCl2(50mg/l)组成。将基本培养基分成26批，并加入下表中所示的各种化合物。在本例中试验了两组胨#3，一组为“旧”，另一组为“新”。符号“CAA”用于表示可从Marcor购买的酪蛋白氨基酸；“CE90”表示可从Deltown购买的胰酶
消化物；而GPMix表示Biolog公司生产的专卖混合物。
  表27
    批号     所加的化合物
    1     3g/l  尪胨#3  (旧)
    2     6g/l  尪胨#3  (旧)
    3     3g/l  尪胨#3  (新)
    4     6g/l  尪胨#3  (新)
    5     3g/l  尪胨  (新)
    6     3g/l  尪胨  (新)加3g/l  尪胨#3  (旧)
    7     3g/l  尪胨(Marcor)
    8     3g/l  尪胨(Marcor)，加3g/l  尪胨(Marcor)#3(旧)
    9     3g/l  CAA(Marcor)
    10     3g/l  CAA(Marcor)，加3g/l  尪胨#3  (旧)
    11     3g/l  CAA-R  (Marcor)
    12     3g/l  CAA-R  (Marcor)。加3g/l  尪胨#3  (旧)
    13     3g/l酪蛋白胨(Marcor)
    14     3g/l酪蛋白胨(Marcor)，加3g/l  尪胨#3  (旧)
    15     3g/l  CE90MX
    16     3g/l  CE90MX，加3g/l  尪胨#3  (旧)
    17     3g/l  TSB
    18     3g/l  TSB加3g/l  尪胨#3  (旧)
    19     3g/l  Tryptose
    20     3g/l  Tryptose，加3g/l  尪胨#3  (旧)
    21     3g/l  胰化胨
    22     3g/l  胰化胨，加3g/l  尪胨#3  (旧)
    23     3g/l  大豆胨
    24     3g/l  大豆胨，加3g/l  尪胨#3  (旧)
    25     3g/l  明胶的胰酶消化物
    26     3g/l  明胶的胰酶消化物，加3g/l  尪胨#3  (旧)
  表28
批号   大肠杆菌 猪霍乱沙门氏菌   肺炎杆菌 铜绿假单胞菌   奇异变形菌   粪肠球菌
  7，8   灰色；透明     黄 浅灰；部分透明     甸子蓝 橙色；长得较差   白色；透明
  9，10   灰色；透明     黄 浅灰；部分透明     甸子蓝 橙色；长得较差   白色；透明
  13，14   灰色；透明   更黄；较差 不太灰；较差   较深；较好     较好   白色；透明
  17，18   灰色；透明   不太黄；较好   较深；更好   较浅；较差     较好   白色；透明
  19，20   灰色；透明   不太黄；较好   较深；更好   较浅；较差     较好   白色；透明
  23，24   稍深；长得更好   不太黄；较差   较深；更好   较浅；较差     较好   白色；透明
令人惊奇的是，所加具体胨的量和种类对于由细菌产生的反应有很大影响。在第1-8批中，对于大肠杆菌和铜绿假单孢菌来说第7和8批(Mar-cor PP)最佳，第1-4批次之，第5和6批又次之。由此可见，对于大肠杆菌和铜绿假单孢菌来说6g/l的胨比3g/l的胨效果好。
对大肠杆菌来说，第23批(大豆胨)最佳，第17(TSB)和7(Marcor PP)批次之。对肺炎杆菌来说，第17批(TSB)最佳，第23(大豆胨)和7(Marcor PP)批次之。对铜绿假单孢菌来说，第13批(Marcor酪蛋白胨)最佳，第9(CAA)、7(Marcor PP)和19(tryptose)批次之。在上述所有配方中，第25批(酪蛋白的胰酶消化物)能产生最蓝的菌落。其它批次产生的菌落为稍浅的甸子蓝和嫩绿。对猪霍乱沙门氏菌来说，第15(CE90MX)和25(明胶的胰酶消化物)批最佳。对奇异变形菌来说，在第13(酪蛋白胨)、17(TSB)和23(大豆胨)批上可观察到更好的生长。对于粪肠球菌来说，除了第13批(酪蛋白胨)产生较少的透明外，所有结果大致相同。
对于所有这些配方来说，大肠杆菌的吲哚斑点试验都呈阴性，尽管第17批(TSB)能产生非常弱的阳性结果。对于被试验的微生物来说最佳的培养皿和反应如上表所示。基于这些结果，具有最佳总体反应的培养皿是第17和18(TSB)、以及第23和24(大豆胨)批。
例20
确定成分的培养基和胨
在上例中发现，大豆胨，或许在与酪蛋白胨组合以后(如在TSB中)是有利的。在本例中，试验了大豆和酪蛋白胨的作用。还观察了这些胨对斑点吲哚试验的影响。
基本培养基是一种已知成分的组合物，它由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、NaCl(5g/l)、谷氨酸钠(2g/l)、尿素(500mg/l)、酪胺HCl(250mg/l)、色氨酸(250mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Mag-gle(70mg/l)和MnCl2(50mg/l)组成。
将各种浓度的大豆和酪蛋白胨以2∶1的比例或将大豆蛋白胨单独加入上述基本培养基中，以制成10批培养基。在第1～5批中，大豆和酪蛋白胨分别以6g/l、9g/l、12g/l、15g/l和18g/l的总浓度加入。第6～10批单加相同浓度的大豆胨。
将大肠杆菌、肺炎杆菌、铜绿假单孢菌、奇异变形菌和粪肠球菌接种到上述每一种配方上，并在30℃培养。然后对培养皿的菌落和形态学进行观察。还对大肠杆菌进行斑点吲哚试验。
在大豆/酪蛋白培养皿中，6g/l的浓度最佳。但在这种培养基上假单孢菌菌落的颜色太浅。大豆胨培养皿有较好结果，不过在较高浓度(15g/l和18g/l)时克雷伯氏菌属菌落的颜色太浅。在所有试验过的配方中，就菌落颜色、形态学和斑点吲哚试验结果而言，含6g/l大豆胨的效果最好。采用该配方，大肠杆菌菌落呈红色，而且斑点吲哚效果良好。肺炎杆菌菌落呈蓝/黑色，铜绿假单孢菌菌落呈甸子蓝，奇异变形菌为橙色，而粪肠球菌菌落为白色有透明晕圈。因此，由上述结果可知，浓度为6～9g/l的大豆胨对这种培养基来说是合适的。
例21
各种大豆胨
在本实验中，试验了各种品牌、批次大豆胨的可用性。基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、谷氨酰胺(1g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪氨(250mg/l)、Sal-glc(70mg/)、Ind-SO4(250mg/l)、MnCl2(50mg/l)和CuSO4(50mg/l)组成。将该混合物分成15批，并加入下表中所列的各种胨。符号“SE50M”和“SE50BT”表示不同等级的大豆胨，可从Marcor购买。HySoy是一种特级大豆胨，可从Sheffield Products(Norwich，NY)购买。除非另有说明，每种胨都是以6g/l的浓度试验。
表29
批号     胨及其它成分
    1  Marcor大豆胨MD-R6623
    2  Marcor大豆胨MD-R6623，加500mg/l Malt提取物
    3  Marcor大豆胨MD-R6623，分别加100mg/l丝氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、胸苷和次黄嚅呤
    4  Marcor大豆胨SE 50M 92-0934-02
    5  Marcor大豆胨SE 50M 92-0934-02，加500mg/l Malt提取物
    6  Marcor大豆胨SE 50M 91-0126-01
    7  Marcor大豆胨SE 50M C703 (1987)
    8  Marcor大豆胨SE 50BT B521
    9  Oxoid Soya Peptone
    10  DIFCO Soytone
    11  Sheffield HySoy
    12  Marcot尪胨
    13  Marcor酪蛋白胨4.5g/l加Marcor大豆胨SE 50M 92-0934-02  (1.5g/l)
    14  Oxoid TSA
    15  DIFCO TSA
在这些批次中，第1、2、7和11批最佳。Malt提取物(第2批)未产生任何明显不同的结果。尽管肺炎杆菌菌落看上去在第9和10批上很好，但由于这些会增强变形杆菌属的蔓延而使其没有多大用途。对于肺炎杆菌来说，第12批不好，而且变形杆菌属在该培养基上蔓延。尽管假单孢菌属菌落颜色稍浅，第11批还是很好。使用丝氨酸、蛋氨酸、胸苷和次黄嘌呤(第3批)所产生的结果稍差。TSA配方(第14和15批)和SE50BT(第8批)都不能产生好的结果。
对肺炎杆菌来说，最佳培养皿来自(按从最好至最差的顺序排列)第11、15、12、7和2批。对假单孢菌属来说，第13、12和8批的培养皿最佳。变形杆菌属的蔓延在第13、12、10和9批(按从最差到最好顺序排列)中特别差。
例22
不同大豆胨的使用
在本例中，试验了来自各个生产商的其它商品大豆胨。基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、Na2SO4(无水)(2.5g/l)、MgSO4(1.25g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、谷氨酰胺(1g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪胺HCl(250mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Sal-glc(70mg/l)和MnSO4(50mg/l)组成。将该混合物分成10批，试验下表中列出的各种大豆胨。除非另有说明，每种胨都是以6g/l的浓度试验。
表30
    批号     大豆胨
    1     Marcor MD-R6623
    2     Marcor HS MD-00583
    3     Marcor HS MD-06851
    4     Deltown L127
    5     Champlain CVP-LS
    6     Champlain Pansoy M
    7     Champlain Pansoy 61
    8     Sheffield HY-Soy
    9     Sheffield NZ-Soy
    10     Sheffield Ami-Soy
在试验过的各种大豆胨中，第2批(Marcor HS MD-00583)和第8批(Sheffield Hy-Soy)能产生最佳结果，而第1批也能产生很好的结果。第4批所产生的结果与第1批的结果相似，尽管假单孢菌属菌落颜色较浅而变形杆菌属在第4批上蔓延更重。在第3批上产生的肺炎杆菌菌落颜色太浅，而沙门氏菌属菌落的颜色太深。
第5和6批能产生非常有趣的结果。第5批培养基的颜色比其它批次的深。在这种培养基上，克雷伯氏菌属和假单孢菌属菌落颜色很深，而沙门氏菌属菌落比在其它培养基上颜色深。而且，奇异变形菌不会在这一批培养基上蔓延。然而，在大肠杆菌和粪肠球菌菌落周围没有透明部分，这在一定程度上限制了该配方的应用。
假单孢菌属菌落在第6批上非常黄。不过，奇异变形菌生长很差而且其菌落不着色。克雷伯氏菌菌落也近乎无色。此外，在大肠杆菌和粪肠球菌菌落周围没有透明部分。假单孢菌的颜色在这种琼脂上得到加强，但是黄色而非绿色。
第7批令人满意，尽管克雷伯氏菌菌落颜色浅而奇异变形菌蔓延的更严重。第9批产生的奇异变形菌和假单孢菌属菌落的颜色浅，但沙门氏菌属菌落颜色较深。不过，克雷伯氏菌属菌落不着色，而且在大肠杆菌和粪肠球菌菌落周围有很差的透明部分。与第5批相似，第10批是一种较深颜色的培养基，而且在这些培养基上的反应也相似。不过，克雷伯氏菌属菌落不着色。
由上述结果可以确定，用于第2和8批的大豆胨比较合适。
第VIII组
优化胨、提取物和氨基酸，以利于葡
萄球菌属的生长和吲哚斑点试验的稳定
就其与UTI′s的一般关系而言，设计一种能分离并鉴定葡萄球菌属菌种，特别是区别金黄色葡萄球菌和腐生葡萄球菌的培养基是很重要的。在该实验过程中，发现葡萄球菌在仅含大豆胨的培养基上生长的不好。因此，对其它胨、提取物和浸出物进行了试验和比较。
在这一组实验中，对基本营养进行了优化，以使葡萄球菌属长的最好，同时，被研究的大肠杆菌能产生很强的斑点吲哚试验。
例23
胨的配方和反应
在该实验中，试验了不同的胨、提取物和浸出物加入基本培养基里的影响，基本培养基包括琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、大豆胨(6g/l)、Na2SO4(无水，2.5g/l)、MgSO4(无水，0.6g/l)、谷氨酸一钠(2g/l)、谷氨酰胺(1g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪氨(200mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Sal-glc(70mg/l)和MnSO4(50mg/l)。将该培养基分成20批，并按下表所示进行添加。然后用大肠杆菌、肺炎杆菌、铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌和B组链球菌接种每一批培养基。培养之后与对照组比较相对生长量，并记录每一批的斑点吲哚试验结果。
表31
批号 所添加的化合物 吲哚反应 较好结果 较差结果
1 对照 很弱
2 大豆胨(3g/l) 强阳性 铜绿假单胞菌肺炎杆菌金黄色萄葡球菌
3  Oxoid酵母提取物(1g/l)，加牛心浸出液(1g/l) 阴性 肺炎杆菌B组链球菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌
4  Oxoid酵母提取物(1g/l) 很弱 肺炎杆菌腐生萄葡球菌
5  Oxoid酵母提取物(3g/l) 很弱 肺炎杆菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌 大肠杆菌
6 牛心浸出物(1g/l) 很弱 金黄色萄葡球菌
7 牛心浸出物(3g/l) 很弱 肺炎杆菌B组链球菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌
8 脑心浸出物(1g/l) 很弱 肺炎杆菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌
9 脑心浸出物(3g/l) 阳性 肺炎杆菌B组链球菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌
10 Marcor尪胨(1g/l) 很弱 肺炎杆菌B组链球菌
金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌
11 Marcor尪胨(3g/l) 很弱 肺炎杆菌B组链球菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌
1 2   Oxoid Lad Lemco(1g/l) 很弱 肺炎杆菌B组链球菌
1 3   Oxoid Lad Lemco(3g/l) 阴性 肺炎杆菌B组链球菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌
14 酪蛋白胨(1g/l)(Oxoid胨化乳) 很弱 腐生萄葡球菌
15 酪蛋白胨(3g/l)(Oxoid胨化乳) 很弱 金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌 铜绿假单胞菌粪肠球菌
16 鱼胨，低盐(1g/l)(U.S.Biochemical) 强阳性 肺炎杆菌B组链球菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌 铜绿假单胞菌
17 鱼胨，低盐(3g/l)(U.S.Biochemical) 强阳性 肺炎杆菌B组链球菌金黄色萄葡球菌腐生萄葡球菌 铜绿假单胞菌
18 甘露醇(1g/l) 弱 铜绿假单胞菌
19 甘露醇(3g/l) 阳性 铜绿假单胞菌(很差)
20 可溶性淀粉(1g/l) 很弱 腐生萄葡球菌 铜绿假单胞菌
由上述结果可以看出，培养基中含有胨能极大地影响吲哚反应，以及着色反应、与酪蛋白反应和这些微生物的生长。添加大豆胨、鱼胨和脑心浸出物能产生最佳结果(第2、9、16和17批)。
鱼胨的一个不利方面是，它会减少铜绿假单孢菌的绿色。总体上看，脑心浸出液最佳(第9批)，因为它能产生最强的着色、生长和酪蛋白反应，特别是对革兰氏阴性细菌。
例24
有和没有BHI的大豆胨，和葡萄球菌的生长
在该实验中，试验了各种大豆胨浓度和脑心浸出物(BHI)浓度对斑点吲哚试验，金黄色葡萄球菌和腐生葡萄球菌的生长和蛋白酶解，以及奇异变形菌的蔓延的影响进行了试验。基本培养基与上一实施例相同，添加了6g/l大豆胨。按下表所示加入添加成分。
表32
  批号   添加成分 重要观察结果
    1 对照(6g/l大豆胨)
    2 3g/l大豆胨
    3 6g/l大豆胨 肺炎杆菌较深；金黄色萄葡球菌和腐生萄葡球菌比在第1批(对照)上长的好
    4 9g/l大豆胨 同第3批
    5 1g/l大豆胨，加1g/l BHI
    6 2g/l大豆胨，加2g/l BHI
    7 3g/l大豆胨，加3g/l BHI 肺炎杆菌较深；金黄色萄葡球菌和腐生萄葡球菌比在第1批(对照)上长的好。
    8 4g/l大豆胨，加4g/l BHI 肺炎杆菌更深；金黄色萄葡球菌和腐生萄葡球菌比在第1批(对照)上长的更好，且透明部分也更好，铜绿假单胞菌较浅。
    9 3g/l大豆胨，加1g/l BHI
    10 4g/l大豆胨，加2g/l BHI
    11 3g/l BHI 肺炎杆菌浅
由上述结果可以看出，大豆胨的浓度可提高到至少12g/l。浓度为3g/l的BHI(第7和11批)使葡萄球菌生长的最好，而且似乎能够促进这些微生物的蛋白酶解透明作用。值得一提的是，发现变形杆菌属在第1或11批上不蔓延。随着大豆胨浓度升高，变形杆菌属的蔓延加强。所有批次都能对大肠杆菌产生强吲哚反应。
随着大豆胨含量增加，奇异变形菌的蔓延加强，但这种蔓延仍在合理范围内。在所有批号中3、4和8号良好，而7和11号最好。由此可见，BHI的适宜量约为3g/l；而大豆胨的适宜量约为6～9g/l。
例25
改变Sal-Glc与甲基-glc的浓度；牛肉粉
与BHI的浓度；以及高浓度的苯丙氨酸
在本实验中，对用各种化合物稳定斑点吲哚试验的问题进行了研究。基本培养基由琼脂(17g/l)、大豆胨(HySoy)(9g/l)、Na2SO4(无水，2.5g/l)、MgSO4(无水，0.6g/l)、色氨酸(500g/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、谷氨酰胺(1g/l)、酪胺(200mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、甲基-glc(70mg/l)，MnSO4(50mg/l)组成。下表列出了每一批的添加成分。
表33
    批号     添加成分
    1  Sal-glc(70mg/l)，加Intergen牛肉粉(3g/l)lot#12342
    2  Sal-glc(70mg/l)，加Intergen牛肉粉(3g/l)lot#LT63106
    3  Sal-glc(70mg/l)，加Intergen牛肉粉(5g/l)lot#LT63106
    4  Sal-glc(70mg/l)，加BHI(3g/l)，加250mg苯丙氨酸
    5  Sal-glc(70mg/l)，加BHI(3g/l)
    6  Sal-glc(30mg/l)，加BHI(3g/l)
    7  Sal-glc(40mg/l)，加BHI(3g/l)
    8  Sal-glc(50mg/l)，加BHI(3g/l)
    9  Sal-glc(60mg/l)，加BHI(3g/l)
    10  Sal-glc(140mg/l)，加BHI(3g/l)
在第1批中，金黄色葡萄球菌生长较弱。在第2批中，金黄色葡萄球菌颜色稍黄。第3批的结果大致与第2批相同。第4和5批相同，长出粉红色大肠杆菌。大肠杆菌在第6批上为白色，在7、8和9批上为浅粉色，在第10批上为深红色。因此，甲基-glc不会增强大肠杆菌着色。Sal-glc的浓度为70mg/l时能令人满意，但浓度为140mg/l时明显更好。
另外，将上面制备的第1～5批培养基的培养皿存放约1个月，然后用标准的大肠杆菌菌株(ATCC模式株，#11775)以及5个临床分离到的大肠杆菌菌株接种。培养之后，试验斑点吲哚反应并记录每一菌株。对第1、2、4和5批而言，所有5个菌株都产生很轻的吲哚反应。第3批对3个菌株产生强的反应；而对另三个菌株的反应较弱。还采用了一个TSA对照培养皿；所有6个菌株在该培养基上的反应都很强。
还观察到，在第1～5批中，红色葡糖苷酸酶逐渐减弱为粉红色。这些结果表明，当Intergen牛肉粉的浓度为5g/l时比浓度为3g/l时能更好地维持斑点吲哚试验。
例26
斑点吲哚试验中稳定性
在本实验中，研究了延长所制备的培养基的吲哚试验放置时间的方法。基本培养基由琼脂(17g/l)、HySoy大豆胨(9g/l)、BHI(3g/l)、Na2SO4(无水，2.5g/l)、MgSO4(无水，0.6g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、酪胺(200mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Sal-glc(70mg/l)，MnSO4(50mg/l)组成。下表列出了加入试验的10批培养基的每一批中的成分。该表中
还包括了在接种微生物并培养24小时之后所获得的珍贵观察结果。
表34
批号 所加的化合物     观察结果
    1 对照物(无谷氨酸，无谷氨酰胺)
    2 500mg/l色氨酸 铜绿假单胞菌稍深；金黄色萄葡球菌稍黄一点点
    3 1g/l谷氨酰胺 铜绿假单胞菌稍深；金黄色萄葡球菌稍黄且生长较好
    4 2g/l谷氨酸 铜绿假单胞菌更深；金黄色萄葡球菌不太黄
    5 100mg/l甲基葡糖苷酸 与对照物相同
    6 500mg/l甲基葡糖苷酸 与对照物相同，不过肺炎杆菌略深
    7 3g/l Primex鱼胨(08/200) 大肠杆菌和腐生萄葡球菌不太透明；金黄色萄葡球菌生长较好
    8 3g/l Primex鱼胨(08/300) 腐生萄葡球菌略显不太透明；金黄色萄葡球菌生长较好
    9 3g/l Intergen牛肉粉 腐生萄葡球菌略显不太透明；金黄色萄葡球菌生长较好；肺炎杆菌稍深
    10 3g/l Quest Prima tone牛肉膏 腐生萄葡球菌略显不太透明；金黄色萄葡球菌生长较好；肺炎杆菌稍深；铜绿假单胞菌较浅
在上述配方中，第3、6和9批最佳。首先用新制备的培养皿试验大肠杆菌的吲哚反应。第1、5、6和7批产生较弱的反应，而第2批产生较强的吲哚反应。第4批对铜绿假单孢菌和金黄色葡萄球菌的颜色有轻微损害。
然后在冷藏条件下保存培养皿，并于两周之后再试验。对模式株(ATCC#11775)和5个临床上分离的具有弱吲哚阳性特征的大肠杆菌菌株进行试验。下表给出了由这些培养皿获得的结果。还使用了TSA对照皿和血(第11批)。在下表中，“W”表示弱反应，“+”表示阳性试验结果；ND表示未进行试验。
表35
批号 葡糖苷酸酶试验     斑点吲哚试验
大肠杆菌，模式株 大肠杆菌，模式株 五种临床大肠杆菌分离物
    1     W 暗蓝色 暗蓝色
    2     W 暗蓝色 暗蓝色
    3     W 暗蓝色 3个暗蓝；1个中蓝；1个深蓝
    4     + 深蓝 3个浅至暗蓝色；2个中蓝
    5     + 暗蓝色 4个浅至暗蓝，1个中蓝
    6     + 暗蓝色 4个浅至暗蓝，  1个中蓝
    7     W 暗蓝色 4个浅至暗蓝，1个中蓝
    8     ND ND ND
    9     + 暗蓝色 4个浅至暗蓝，1个中蓝
    10     W 暗蓝色 4个浅至暗蓝，1个中蓝
    11     ND 深蓝 1个中蓝；4个深蓝
由上述结果可以看出，谷氨酸、甲基-glc和Intergen牛肉粉能阻止延时对葡糖苷酸酶试验的破坏作用。令人惊奇的是谷氨酸能在6个大肠杆菌菌株中的3个上阻止对吲哚反应的破坏，而谷氨酰胺能在6大肠杆菌菌株中的2个上阻止这种破坏。
例27
添加牛肉提取物和其它化合物以改善培养基的存放期
本实验是要证实一种通过添加更多牛肉提取物或其它化合物改善培养基的存放期的方法。基本培养基由琼脂(17g/l)、脱脂奶粉(16g/l)、HySoy大豆胨(9g/l)、Na2SO4(无水，2.5g/l)、MgSO4(无水，0.6g/l)、色氨酸(500mg/l)、苯丙氨酸(250mg/l)、谷氨酰胺(1g/l)、酪胺(200mg/l)、Ind-SO4(250mg/l)、Sal-glc(70mg/l)和MnSO4(50mg/l)组成。将该培养基分成12批，每一批含有下表中给出的成分。
表36
批号 所加化合物 观察结果
    1 0.5％Intergen牛肉粉和0.8％高岭土(取代脱脂乳) 除克雷氏菌属和革兰氏阳性外均良好
    2 0.3％BHI 良好
    3 0.5％BHI 肺炎杆菌和铜绿假单胞菌较深，变形杆菌属蔓延更多
    4 0.3％Marcor牛肉膏粉 良好
    5 0.5％Marcor牛肉膏粉 肺炎杆菌和铜绿假单胞菌较弱，变形杆菌属蔓延更多
    6 0.3％Intergen牛肉粉 铜绿假单胞菌较弱
    7 0.5％Intergen牛肉粉 铜绿假单胞菌好
    8 0.7％Intergen牛肉粉 铜绿假单胞菌好；肺炎杆菌有一点深
    9 0.9％Intergen牛肉粉 铜绿假单胞菌好；肺炎杆菌有一点深
    10 0.5％Intergen牛肉粉，加0.2％谷氨酸钠 铜绿假单胞菌有一点浅；肺炎杆菌有一点深
    11 0.5％Intergen牛肉粉，加0.4％谷氨酸钠 不如第10批好
    12 0.5％Intergen，加0.1％CVPLS(Champlain) 可能有利于肺炎杆菌和铜绿假单胞菌，但变形杆菌属蔓延更多
对大肠杆菌来说，所有批号都好，但Marcor牛肉膏有一点弱。对肺炎杆菌来说，最好的批号为2、8、9、10和12，次之的批号为2、3、7和9，对于这种微生物来说最差的批号为1。对奇异变形菌来说，最佳批号为1，因为在存在高岭土的情况下没有蔓延现象。在其它所有批号上都有中度蔓延。
对铜绿假单孢菌来说，第1批最好，因为高岭土使得其菌落非常蓝。第2和4批次之，第3、5和11批最差。
对金黄色葡萄球菌来说，第1批是最差的，因为高岭土抑制革兰氏阳性细菌的生长。第5、11和12批也差，产生白色菌落而不是黄色的。
基于以上观察结果0.3％的BHI浓度较好，它能使金黄色葡萄球菌产生很强的黄色。不过，Marcor牛肉膏粉能产生几乎与BHI相同的效果。在intergen牛肉粉上，铜绿假单孢菌为较弱绿色，但仍是绿色的。
另外，还根据在冷藏保存12天以后的吲哚反应，确定了上述诸配方的存放期。存放12天以后，用各种大肠杆菌菌株接种上述12批中每一批的琼脂培养皿，并观察吲哚试验反应。
发现含有高岭土的第1批上，所有大肠杆菌菌株均为深蓝色吲哚反应，而且该微生物长成红色菌落。对含有1.6％脱脂乳的批号(2、3、4、5和6)来说，所有大肠杆菌菌株的吲哚试验为浅蓝色，而其菌落为粉红色。
第7-9批的结果实际上与第2-6批的结果相同，只是5个大肠杆菌菌株中的2个为深蓝色吲哚反应。在所有批号中第10、11和12批最好，因为所有5个大肠杆菌菌株都产生蓝色吲哚反应。由上述结果可以看出，谷氨酸一钠能有效地延长吲哚斑点试验的寿命。CVPLS也有效，但它使铜绿假单孢菌的着色较浅。用高岭土取代脱脂乳也有效果。但高岭土抑制革兰氏阳性细菌。
例28
对培养基进行辐射灭菌以延长存放期
在本实验中，研究了对除琼脂之外的培养基成分进行辐射灭菌的可能性。这是基于商业应用的考虑，如果以预先灭菌的粉状形式提供给用户，培养基较容易制备。因为高压灭菌时奶粉含焦化并变黑，估计对奶粉进行辐射灭菌会好一些。还认为这样可以延长所制备的培养基的吲哚斑点试验的寿命。
1升培养基中所需的粉状成分的组成为Darigold无脂干奶粉(Darigold，NFDM，高温处理，Seattle，WA)(16g)、HySoy大豆胨(9g)、Intergenm Beefpowder(7g)、Na2SO4(无水，2.5g)、MgSO4(无水，0.6g)、谷氨酸一钠(2g)、谷氨酰胺(1g)、色氨酸(500mg)、苯丙氨酸(250mg)、酪胺自由基(200mg)、Ind-SO4(250mg)、Sal-glc(70mg/l)和MnSO4(50mg)。用电子束以2.5、3.0、3.5和4.0MRAD的剂量对每一等分的上述粉状物进行处理。为了制备该培养基，将琼脂(17g)加入1升的水中并在121℃高压灭菌15分钟。然后在无菌条件下把辐射过的粉状物加入灭过菌的琼脂中，混合好，并分装到无菌培养皿中。将倾注的琼脂培养皿在冷藏条件下保存，并以1周的间隔用各种细菌菌株进行试验。
总体上看，这种培养基和制备方法十分令人满意。如果对培养基成分作过多辐射，有轻微而又可以觉察到的损害。其表现为奇异变形菌和猪霍乱沙门氏菌的显色反应较轻；大肠杆菌、肺炎杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和腐生葡萄球菌对乳质的澄清作用较差。因此，理想的辐射剂量为2.5MRAD。在存放9周以上时间后试验该培养基，所有的显色反应和澄清反应，以及吲哚斑点试验仍令人满意。
尽管已证实该方案十分理想，但进行某些改变也被证明是有利的。例如，根据其来源和凝胶强度需要把琼脂的浓度降低至10～15g/l。Sal-glc的浓度可从70mg/l提高到120mg/l，这样可以更迅速的产生较深的红色。不过，Sal-glc是该培养基里最昂贵的成分，所以必须同等看待费用及颜色。另外，如果通过辐射对培养基灭菌，就不必添加谷氨酸一钠来保证吲哚斑点试验的稳定性。最后，必须对大豆胨和肉膏的来源和用量进行评价，并逐批加以调整。
第IX组
尿素酶和亚碲酸盐斑点试验的研究
在本实验中，讲述了用于在本发明的培养基上生长细菌和试验基在斑点尿素酶中反应的方法，以及亚碲酸盐还原试验。通常尿素酶试验是在一种不方便的“试管”中进行的，而亚碲酸盐还原试验是在一种特制的琼脂培养基上进行。不过，为了能够容易、方便的进行这些试验，研究了一种新的方法。此外，这种为了用于本发明的培养基而开发的独特试验也可用于取代传统试验。
如例9所述，将亚碲酸盐加入该培养基中的企图是不成功的。将尿素酶试验包括在该培养基中而不会影响其它重要试验(结果未示出)的企图同样也是不成功的，如在本发明的说明书中所述。因此，一个重要目标是确定本发明的培养基在这些试验反应中是否有问题，或者这种培养基是否好于常用的培养基。另外，研究了用于亚碲酸盐还原和尿素酶活性的简单易行的独特试验方法。
例29
斑点试验研究
在本实验中，研究了用于试验生长在本发明培养基上的细菌在斑点尿素酶和亚碲酸盐还原试验中的反应的快速方式。尿素酶
需要有一种迅速而又可靠的方法来证实变形杆菌科成员的身份，如用尿素酶斑点试验证实奇异变形菌。通常尿素酶试验培养基含有尿素、缓冲液和酚红(例如，Christensen′s尿素琼脂，Ewing′s尿素肉汤[尿素R肉汤]，和Stuart′s尿素肉汤；例如，参见MacFaddin，医用菌的分离-培养-鉴定-保存的培养基，825-827页)。其它商品化用具包括尿素浸渍过的试验条或棉拭(如Remel的产品)。在常规试验方案中，用微生物的重悬浮液接种培养基，并在35℃下培养。在培养15分钟、30分钟、60分钟和4小时后观察培养基。尿素酶阳性微生物会在培养基中产生亮粉色或红色，而尿素酶阴性微生物不会改变培养基的颜色。上述方法并不对尿素酶的存在专一，因为它们都依赖于对培养基中的碱度的证实。
目前所用培养基的缺点包括，在培养基中使用胨，这可能导致假阴性结果，由于蛋白质的水解和过量氨基酸残基的释放会提高pH。另外，Stuart′s尿素酶肉汤是高度缓冲的，并可能掩盖滞后的尿素酶阳性微生物的尿素酶活性。因此，这种培养基仅适用于变形杆菌科的强尿素酶阳性成员。而且，上述所有培养基都要求浓的接种物，以便获得没有以上局限的可靠结果。
因此，所需要的就是能提供快速、可靠结果的尿素试验方法和培养基。在经过一些实验之后，研制了一种很好的试剂。该试剂包括尿素、M-甲酚紫和溶于水中的二甲基谷氨酸。本发明设想这些成分在一定浓度范围内都能成功地应用。不过，在一个优选方案中，这些浓度为：尿素约5％、m-甲酚紫0.05％和溶于水中的二甲基谷氨酸0.05％。用这种橙色溶液去饱和滤纸盘。然后用一个钝端木质涂布棒挑取生长于该培养基上的细菌菌落，并以斑点形式转移到饱和过的滤纸上。对于诸如奇异变形菌之类的强尿素酶阳性细菌来说，上述斑点在几秒钟内变成亮紫色。而弱尿素酶阳性细菌(如肺炎杆菌)的斑点在10～30分钟内变紫，但尿素酶阴性细菌(如大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、铜绿假单孢菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌腐生葡萄球菌和无乳链球菌)的斑点仍为橙色。因此，对于强尿素酶阳性微生物来说试验结果几乎马上可以出来，而对于较弱的尿素酶生产菌来说在半小时内也可得到结果。
与用酚红作为pH指示剂的传统方法不同，本例中研制的方向是用m-甲酚紫作pH指示剂。酚红在pH约为7.4时从黄变成红，而m-甲酚紫在pH约为8.2时从黄变为紫。由于它需要更大的pH变化才能产生颜色变化，因此m-甲酚紫比酚红更不容易发生假阳性反应。这种特殊方法和试剂提供了一个检验由生长在本发明培养基上的微生物产生的尿素酶的快速途径。还设想这种试验方法和试剂可用于其它微生物培养基，包括那些会影响传统尿素酶试验方法的培养基。亚碲酸盐
还希望找到一种快速、可靠的方法，以便通过亚碲酸盐斑点试验证实粪肠球菌的身份。亚碲酸盐耐力通常是一种含有0.04％亚碲酸钾的琼脂培养基试验的(例如，参见R.R.Facklam和J.A.Washington.“链球菌和相关触酶阴性革兰氏阳性球菌”，临床微生物学手册，美国微生物学会，第5版[1991]p.252)。将被怀疑的肠球菌属菌种接种到该培养基上，在35℃下培养7天，观察黑色菌落的发育。该试验依赖于在存在亚碲酸盐时微生物的生长，亚碲酸盐是一种对大部分菌种有毒的化合物(即：在研究本发明的培养基时，即使以低浓度向培养基中添加亚碲酸盐，凭经验也会发现抑制生长)。因此，希望开发一种可在生长于本发明培养基上的菌落上进行的快速、易行的斑点试验方法。
经过一些实验之后，创出了一种易行的方法，其中制备一种亚碲酸盐水溶液，并将1或2滴该溶液加到被怀疑为粪肠球菌的菌落上。在室温下培养大约1小时后，粪肠球菌还原亚碲酸盐并变黑。尽管计划使用一定浓度范围的亚碲酸盐和盐(如钾、钠等)，但在优选方案中采用大约1％的亚碲酸钾溶液。
由以上实施例可清楚地看到，本发明提供了一种适用于初步鉴定与UTI′s相关的最常见微生物的培养基。除了用于加强铜绿假单孢菌产生脓青素的低铁浓度之外，本发明的培养基还含有用于激发铜绿假单孢菌的肺炎杆菌产生颜色的酪胺、谷氨酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸。培养基里的镁也能激发脓青素的产生。低氯化物浓度可减少变形杆菌属的蔓延。酪胺和锰的存在使猪霍乱沙门氏菌菌落和产生酪胺氧化酶的其它菌株呈棕色。酪胺还可用作芳基硫酸酯酶的诱导物。另外，酪胺激发脓青素产生，有利于铜绿假单孢菌的鉴别。
重要的是，除了可根据对菌落的观察进行初步鉴定之外，本发明的培养基还可利用分离的菌落进行斑点试验。与其它常用培养基不同，对这样的斑点试验反应没有抑制作用。例如，可以对分离的菌落进行斑点吲哚试验，以证实大肠杆菌和变形杆菌属的存在，并区分细菌的某些种。发现把氢氯酸(浓度以2N为佳)滴在被怀疑是铜绿假单孢菌的绿色菌落上能使菌落变成粉红色，它是由本发明而来的另一个试验。
预计用于鉴定和区分细菌菌种的其它方法也可以结合本发明的培养基一起使用。例如，用于鉴别细菌菌种的过氧化氢酶、氧化酶、PYR水解、七叶苷水解和其它试验均可采用。本发明并不局限于在上述实施例中公开的具体斑点试验或其它酶试验。
预计其它琼脂替代品，如在被授予Roth的美国专利US-4241186和4282317(这里收作参考)中披露的果胶基产品也可用于本发明。这种代用品可减少贵重化学品的使用，而且在需要时便于利用倾注培养法，而不是划线培养法。这种改进还有利于将这种培养基用于水和其它样品，特别是环境样品。
预计本发明的培养基能以各种形式使用。例如，设想该培养基能以现有的和革新的样形式使用，如以“Diaslide”形式使用(M.Rosenberg等，“一种新型尿培养装置的起始检测(lnitial testing of a novel urine culturedevice)”，临床微生物学杂志，30；2686(1992))。“Deaslide”是一种装置，在它的密封划槽的两侧盛有CLED和macConkey或EMB，用于来自尿样的细菌的生长和半量化分析。因此设想本发明的培养基可用于类似场合，还打算以其它形式使用本发明的培养基，包括肉汤和半固体制品。因此，本发明的培养基并不局限于分装到任何具体装置，如培养皿中的固体制剂。
还打算把其它能产生不透性的试剂用于本发明的培养基中，或者与乳品组合使用，或者作为乳品的代替物。预计，合成的或改进的类乳溶液或其它不透明的蛋白类溶液或悬浮液可以取代或被加入脱脂乳中。此外，尽管蛋白酶解和乳糖利用反应是看不见的，但不透明无机材料，包括(但不局限于)高岭土、其它硅酸盐、氧化钛和碳酸钙的使用，具有很多与奶相同的优点。
还设想把除了在上述实施例中披露的显色底物以外的其它底物也用于本发明中。例如，预计发荧光的底物或发光成分也可用于本发明。本发明并不限于特定的底物，不管是显色的、发荧光的、发光的，还是用于检测系统的其它类型物质。
预计菌落颜色会根据所用显色化合物而变化。很多色源现在已商品化，而将来无疑会有其它色源供应。因此，酶促底物和颜色的任何组合形式都可用于本发明的培养基。
预计本发明的培养基还可用于除在实施例中提及的微生物之外的微生物的生长和初步鉴定。例如，如上文所讨论过的，无乳链球菌(B组链球菌)长成小的白色菌落，由于蛋白酶解而有透明的晕圈。尿气球菌(Aerococcusurinae)长成小的红色菌落(即：葡萄苷酸酶阳性)，无透明部分。亚利桑那沙门氏菌(沙门氏菌属亚种3)长成大的红色菌落(即：葡糖苷酸酶阳性)，无透明部分。肾棒状杆菌(Corynbacterium renale)长成大的橙色菌落，因蛋白酶解而有弱的透明部分。因此，预料本发明的培养基和方法可用于与UTI′s相关的其它微生物，以及与UTI′s无关的微生物。
预料还可将其它酶试验系统与本发明的培养基结合使用。例如，预计可以添加β-半乳糖苷酶、β-木糖苷酶和C8-酯酶的底物，分别用于鉴定大肠杆菌、克雷伯氏菌属和肠杆菌属的种(例如，见J.L.Sepulveda，“用简单的酶解试验直接从血培养物中快速推测鉴定革兰氏阴性杆菌(RapidPresumative identification of gram-negative rods directly from blood culturesby simple enzymatic tests)”，临床微生物学杂志，28：177-181[1990])和沙门氏菌属的种(A-M Freydiere和Y.Gitte，“用Rambach琼脂和C8酯酶点试验法检测沙门氏菌(Detection of salmonellae by using Rambach agar and by aC8 esterase spot test)，”临床微生物学杂志，29：2357-2359[1991])。还可以使用其它有用显色底物，本发明的范围并不局限于以上所列举的。
预计本发明的培养基即可以是选择性的又可以是鉴别性的。这种培养基会抑制某些微生物的生长，但其它可生长的生重要菌种可以被区分。例如，为了使该培养基对革兰氏阴性细菌有选择性，可加入像脱氧胆酸、十二烷基硫酸钠和胆汁盐之类的化合物，以便抑制革兰氏阳性细菌的生长。或者，为了使该培养基对革兰氏阳性细菌有选择性，可加入诸如苯乙醇、粘菌素和萘啶酮酸之类的化合物，以便抑制革兰氏阴性细菌的生长。
预料还可通过大部分或全面取代来改进本发明的培养基，本发明优选实施方案中所含酪胺的其它芳基硫酸酯酶诱导物，包括诸如章鱼胺、多巴胺和去甲肾上腺素之类的化合物(见T.Harade和Y.Murooka，supra)。
预料还可通过改善养分和盐的配方来改变本发明的培养基。如在本说明书中所述，有很多令人满意的方案。例如，业已发现可用铜和铁盐来取代Mn盐或将其补充进去以便使色氨酸和酪胺氧化酶产生显色反应。氯酸盐可以取代硫酸盐(尽管变形杆菌属可更多蔓延)。胨和提取物的很多不同组合都令人满意，尽管优选的养分已被高度优化。
预料各种化合物都可用于斑点尿素酶试验和亚碲酸盐试验。例如，预计可将除m-甲酚紫之类的pH指示剂用于尿素酶斑点试验(例如，酚红、溴-甲酚紫、甲酚红、酚红、二甲苯酚蓝、百里酚蓝等)，同时采用缓冲液而不是二甲基谷氨酸。另外，还打算把其它亚碲酸盐用于亚碲酸盐试验。例如，既可采用亚碲酸钠又可采用亚碲酸钾，还可采用其它含亚碲酸盐的化合物。
最后，预料还可以通过省略一种或一种以上成分对本发明的培养基进行改进。这对于降低培养基成本重要的场合特别有用。例如，在某些应用场合可能不必区分所有上述细菌菌种，此时可以通过省去不必要的成分设计出简化的、较便宜的培养基。因此，在主要以“大肠菌类”细菌为目的的水培养中，可以通过省略或降低谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪胺、Ind-SO4、MnCl2、MgSO4和Na2SO4的浓度对该培养基进行简化。另外，可以用β-半乳糖苷酶显色底物取代β-葡糖苷酸酶底物或将其进行补充。
由以上所述可以清楚地看出，本发明提供了一种可用于各种革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌的快速而又可靠的分离与鉴别的很有用的培养基。还可以清楚地看出，本发明的方法提供了一种快速且可靠地鉴别各种细菌的易应用的方法。特别重要的是，本发明可用于最常见的UTI病原体，特别是大肠杆菌和奇异变形菌(革兰氏阴性)和粪肠球菌(革兰氏阳性)的生长和鉴别。本发明的培养基具有优于其它培养基的明显优点，因为所有微生物都能长的很好，并且可以相互区别，以及与其它细菌菌种区别。因此，本发明满足了对能够提供快速诊断结果的培养基的需求，并根据患者感染的病原体制定具体的治疗方案，而不是仅凭经验对患者进行处理，这样可能用到不合适的抗菌剂。
按PCT19条的修改
根据PCT第19条修改的说明
以下是国际局于1995年10月4日收到的根据PCT第19条修改的权利要求书。申请人对原权利要求书中的1、11、16-18、24、27-28、31-32、34-36以及38-41作了修改，其余的权利要求未变。另外，为使本申请与所准许的优先权申请的权利要求相一致，新增加权利要求57-108。这些增加的权利要求57-108并不超出原始提交的该国际申请所公开的范围，因为这些权利要求均能得到本说明书的支持。
权利要求书
按照条约第19条的修改
1、一种检测被怀疑带细菌生物体的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)用所述试样接种一种试验培养基，其中，所述培养基包括：i)一种能在与β-葡糖苷酸酶反应时生成第一种颜色的β-葡糖苷酸酶显色底物；ii)一种能在与芳基硫酸酯酶反应时生成第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物，所述第一和第二种颜色可用肉眼区分；和iii)营养基质；
b)培养所述试验培养基以产生所述细菌生物体的细菌菌落，该细菌菌落产生一种或一种以上的所述第一和第二种颜色；和
c)检查所述培养基中i)具有所述第一种颜色的细菌菌落的存在，ii)具有所述第二种颜色的细菌菌落的存在；iii)没有所述第一或第二种颜色的细菌菌落的存在。
2、如权利要求1的方法，它还包括计数存在于所述试验培养基上的细菌菌落数的步骤。
3、如权利要求1的方法，其特征在于所述试验培养基还包括至少一种不透明的化合物。
4、如权利要求3的方法，其特征在于所述不透明的化合物使所述培养基呈白色。
5、如权利要求3的方法，其特征在于所述不透明的化合物是蛋白类的。
6、如权利要求5的方法，其特征在于所述蛋白类化合物是乳制品。
7、如权利要求3的方法，其特征在于所述不透明的化合物是非蛋白类的。
8、如权利要求7的方法，其特征在于所述非蛋白类化合物选自硅酸盐、氧化物和碳酸盐。
9、如权利要求1的方法，其特征在于所述试验培养基还包括至少一种胺。
10、如权利要求9的方法，其特征在于所述胺选自谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪胺、章鱼胺、多巴胺和去甲肾上腺素。
11、如权利要求1的方法，还包括这样的步骤：检验细菌生物体在至少有一种选自锰、铁和铜离子的配位化合物的条件下氧化至少一种芳香胺的能力。
12、如权利要求11的方法，其特征在于所述芳香胺选自色氨酸和酪胺。
13、如权利要求1的方法，还包括检验在所述细菌菌落周围的试验培养基中存在脓青素的步骤。
14、如权利要求13的方法，其特征在于所述检验脓青素存在的过程包括以下步骤：i)将酸加在所述细菌菌落周围的培养基里；和ii)观察在所述培养基中颜色变化的产生。
15、如权利要求14的方法，其特征在于所述酸是约为2N的氢氯酸。
16、如权利要求1的方法，还包括检验细菌生物体具有水解尿素能力的步骤。
17、如权利要求1的方法，还包括检验细菌生物体具有还原亚碲酸盐能力的步骤。
18、一种检测被怀疑带细菌生物体的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)接种一种试验培养基，其中，所述试验培养基包括：i)至少一种能在与一种酶反应时生成有色细菌菌落的显色底物；ii)至少一种蛋白类不透明化合物；和iii)营养基质；
b)培养所述试验培养基，以产生所述生物体的有色细菌菌落；和
c)检查所述试验培养基中i)有色细菌菌落的存在；ii)没有颜色的细菌菌落的存在；和iii)所述细菌菌落周围透明部分的存在。
19、如权利要求18的方法，其特征在于所述蛋白类不透明的化合物是乳制品。
20、如权利要求19的方法，其特征在于所述蛋白类不透明的化合物是辐射灭菌的。
21、如权利要求18的方法，其特征在于所述底物是芳基硫酸酯酶显色底物。
22、如权利要求18的方法，其特征在于所述底物是β-葡糖苷酸酶显色底物。
23、如权利要求18的方法，其特征在于所述底物包括芳基硫酸酯酶显色底物、β-葡糖苷酸酶显色底物、和β-半乳糖苷酶显色底物。
24、一种检测被怀疑带细菌生物体的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)用所述试样接种一种固体试验培养基，其中，所述培养基包括：i)一种能在与β-葡糖苷酸酶反应时生成第一种颜色的β-葡糖苷酸酶显色底物；ii)一种能在与芳基硫酸酯酶反应时生成第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物；iii)一种蛋白类不透明的试剂；和iv)至少一种能在与至少一种细菌酶反应时生成第三种颜色的化合物，其中，第一、二和三种颜色可用肉眼区分；
b)培养所述试验培养基以产生所述细菌生物体的细菌菌落，从而产生一种或一种以上所述第一、二和三种颜色；
c)检查所述培养基中i)具有所述第一种颜色的细菌菌落的存在；ii)具有所述第二种颜色的细菌菌落的存在；iii)具有所述第三种颜色的细菌菌落的存在；iv)没有所述第一、二或三种颜色的细菌菌落的存在；和v)所述细菌菌落周围透明部分的存在。
25、如权利要求24的方法，其特征在于所述细菌酶选自色氨酸氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶和酪胺氧化酶。
26、如权利要求24的方法，其特征在于所述培养基还包括至少一种选自锰、铜和铁离子的配位化合物。
27、如权利要求24的方法，还包括检验具有水解尿素能力的细菌生物体的步骤。
28、如权利要求27的方法，其特征在于所述检验具有水解尿素能力的细菌生物体的过程包括以下步骤：i)放入一种含有尿素和一种pH指示剂的溶液里；和ii)检查颜色的产生。
29、如权利要求28的方法，其特征在于所述溶液中尿素的浓度约为5％，所述pH指示剂的浓度约为0.05％，该溶液的pH被调整至大约4～7。
30、如权利要求29的方法，其特征在于所述pH指示剂选自m-甲酚紫、酚红、百里酚蓝、溴百里酚蓝、溴甲酚紫、二甲苯酚蓝和甲酚红。
31、如权利要求24的方法，还包括检验具有还原亚碲酸盐能力的细菌生物体的步骤。
32、如权利要求31的方法，其特征在于所述检验具有还原亚碲酸盐能力的细菌生物体过程包括以下步骤：i)将亚碲酸盐溶液滴加在被怀疑是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的菌落上；ii)培养；和iii)检查黑色的产生。
33、如权利要求32的方法，其特征在于所述亚碲酸盐溶液包括大约1％的亚碲酸钾。
34、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是大肠杆菌(Escherichia coli)，肉眼看上去呈红色，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
35、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上所述细菌菌落是肺炎杆菌(Klebsiella Pneumoniae)，肉眼看上去呈靛蓝色并呈粘液样，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
36、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)，肉眼看上去呈棕色，有棕色色素从菌落扩散到培养基里。
37、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奇异变形菌(Proteus mirabilis)，肉眼看上去呈橙色，有不规则的扩散边缘并有橙色色素从菌落扩散到培养基里。
38、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奥克西托克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，肉眼看上去呈黄色，有黄色色素从菌落里扩散出来，并且在菌落周围的培养基里有透明的部分。
39、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述菌菌落是铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)，肉眼看上去呈绿色，有绿色色素从菌落里扩散出来，并且在菌落周围的培养基里有透明的部分。
40、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肉眼看上去呈黄色，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
41、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，肉眼看上去小且呈白色，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
42、一种用于鉴定细菌菌落的培养基，包括i)至少一种蛋白类不透明的化合物；ii)一种或一种以上显色底物；和iii)营养基质。
43、如权利要求42的培养基，其特征在于所述营养基质包含一种或一种以上选自含大豆胨、肉膏、硫酸镁和硫酸钠这一组的化合物。
44、如权利要求42的培养基，其特征在于所述蛋白类化合物是乳制品。
45、如权利要求42的培养基，其特征在于所述一种或一种以上选自含芳基硫酸酯酶底物、葡糖苷酸酶底物、色氨酸氧化酶底物和酪胺氧化酶底物这一组显色底物。
46、一种用于鉴定细菌菌落的培养基，包括所述细菌菌落生长和分化用的足够量的：i)至少一种葡糖苷酸酶显色底物，ii)至少一种芳基硫酸酯酶显色底物；和iii)至少一种能使试验培养基呈白色的不透明的化合物。
47、如权利要求46的培养基，其特征在于所述不透明的化合物是非蛋白类的。
48、如权利要求47的培养基，其特征在于所述非蛋白类化合物选自硅酸盐、碳酸盐和氧化物。
49、如权利要求46的培养基，其特征在于所述不透明的化合物是蛋白类的。
50、如权利要求49的培养基，其特征在于所述不透明的化合物是乳制品。
51、如权利要求46的培养基，其特征在于所述显色底物选自芳基硫酸酯酶显色底物、β-葡糖苷酸酶显色底物、β-半乳糖苷酶显色底物、色氨酸氧化酶显色底物和酪胺氧化酶显色底物。
52、如权利要求46的培养基，还包括至少一种选自锰、铜和铁离子的配位化合物。
53、一种用于鉴定细菌菌落的培养基，包括足够所述细菌菌落生长和分化用的足够量的：i)至少一种含酪蛋白的化合物；ii)一种葡糖苷酸酶显色底物；iii)一种芳基硫酸酯酶显色底物；iv)至少一种选自锰、铜和铁的配位化合物；和v)一种胶凝剂。
54、如权利要求53的培养基，其特征在于所述显色底物选自6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸和5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸。
55、如权利要求53的培养基，其特征在于所述芳基硫酸酯酶显色底物是羟基吲哚-3-硫酸酯。
56、如权利要求53的培养基，还包括至少一种选自谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪胺、章鱼胺、多巴胺和去甲肾上腺素的胺。
57、一种检测被怀疑带菌的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)用所述试验样品接种一种固体试验培养基，其中，所述培养基包括：i)一种能在与β-葡糖苷酸酶反应时生成第一种颜色的β-葡糖苷酸酶显色底物；ii)一种能在与芳基硫酸酯酶反应时生成第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物；iii)一种乳类不透明的试剂；和iv)一种能在与至少一种细菌酶反应时生成第三种颜色的含色氨酸的化合物，其中，所述第一、二和三种颜色可用肉眼区分；
b)培养所述试验培养基以便产生所述细菌生物体的细菌菌落，该细菌菌落能产生一种或一种以上所述第一、二和三种颜色；和
c)检查所述试验培养基中i)具有所有第一种颜色的细菌菌落的存在；ii)具有所述第二种颜色的细菌菌落的存在；iii)具有所述第三种颜色的细菌菌落的存在；iv)没有所述第一、二或三种颜色的细菌菌落的存在；和v)所述细菌菌落周围透明部分的存在。
58、如权利要求57的方法，其特征在于所述培养基还包括至少一种选自锰、铜和铁离子的配位化合物。
59、如权利要求57的方法，还包括检验具有水解尿素的能力的细菌生物体的步骤。
60、如权利要求59的方法，其特征在于所述鉴定具有水解尿素能力的细菌生物体的过程包括以下步骤：i)放入一种含有尿素和一种pH指示剂的溶液中；和ii)检查颜色的产生。
61、如权利要求60的方法，其特征在于所述溶液中尿素的浓度约为5％，而所述pH指示剂的浓度约为0.05％，该溶液的pH被调整至4～7。
62、如权利要求61的方法，其特征在于所述pH指示剂选自m-甲酚紫、酚红、百里酚蓝、溴百里酚蓝、溴甲酚紫、二甲苯酚蓝和甲酚红。
63、如权利要求57的方法，还包括检验具有还原亚碲酸盐能力的细菌生物体的步骤。
64、如权利要求63的方法，其特征在于所述检验具有还原亚碲酸盐能力的细菌生物体的过程包括以下步骤：i)将亚碲酸盐溶液滴加在被怀疑是粪肠球菌的菌落上；ii)培养；和iii)检查黑色的产生。
65、如权利要求64的方法，其特征在于所述亚碲酸盐溶液含有大约1％的亚碲酸钾。
66、如权利要求57的方法，其特征在于生长所述试验培养基上的所述细菌菌落是大肠杆菌，肉眼看上去呈红色，在菌落周围的培养基里有透明部的。
67、如权利要求57的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上所述细菌菌落是肺炎杆菌，肉眼看上去呈靛蓝色并呈粘液样，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
68、如权利要求57的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是猪霍乱沙门氏菌，肉眼看上去呈棕色，有棕色色素从菌落扩散到培养基里。
69、如权利要求57的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奇异变形菌，肉眼看上去呈橙色，有不规则的扩散边缘；并有橙色色素从菌落扩散到培养基里。
70、如权利要求57的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奥克西托克雷伯氏菌，肉眼看上去呈黄色，有黄色色素从菌落扩散到培养基里，而且在菌落周围的培养基里有透明的部分。
71、如权利要求57的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是铜绿假单孢菌，肉眼看上去呈绿色，有绿色色素从菌落扩散到培养基里，并且在菌落周围的培养基里有透明的部分。
72、如权利要求57的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是金黄色葡萄球菌，肉眼看上去呈黄色，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
73、如权利要求57的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是粪肠球菌，肉眼看上去小且呈白色，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
74、如权利要求57的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是猪霍乱沙门氏菌，肉眼看上去呈棕色，有棕色色素从菌落扩散到培养基里。
75、一种检测被怀疑带菌的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)用所述试样接种一种固体试验培养基，其中，所述培养基包括：i)一种能在与β-葡糖苷酸酶反应时生成第一种颜色的β-葡糖苷酸酶显色底物；ii)一种能在与芳基硫酸酯酶反应时生成第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物；iii)能在与至少一种细菌酶反应时生成第三种颜色的色氨酸，其中，所述第一、二和三种颜色可以用肉眼区分。
b)培养所述试验培养基，以产生所述细菌生物体的细菌菌落，该菌落能产一种或一种以上所述第一、二和三种颜色。
c)检查所述试验培养基中具有所述第一、二或三种颜色的细菌菌落的存在。
76、如权利要求75的方法，其特征在于所述培养基还包括至少一种选自锰、铜和铁离子的配位化合物。
77、如权利要求75的方法，还包括检验具有水解尿素的能力的细菌生物体的步骤。
78、如权利要求75的方法，其特征在于所述检验具有水解尿素能力的细菌生物体的过程包括以下步骤：i)放入一种含有尿素和一种pH指示剂的溶液中；和ii)检查颜色的产生。
79、如权利要求78的方法，其特征在于所述溶液中尿素的浓度约为5％，所述pH指示剂的浓度约为0.05％，该溶液的pH约为4～7。
80、如权利要求79的方法，其特征在于所述pH指示剂选自m-甲酚紫、酚红、百里酚蓝、溴百里酚蓝、溴甲酚紫、二甲苯酚蓝和甲酚红。
81、如权利要求75的方法，还包括检验具有还原亚碲酸盐的能力的细菌生物体的步骤。
82、如权利要求81的方法，其特征在于所述检验具有还原亚碲酸盐的能力的细菌生物的过程包括以下步骤：i)将亚碲酸盐溶液滴加在被怀疑是粪肠球菌的菌落上；ii)培养；iii)检查黑色的产生。
83、如权利要求82的方法，其特征在于所述亚碲酸盐溶液含有大约1％的亚碲酸钾。
84、如权利要求75的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是大肠杆菌，肉眼看上去呈红色。
85、如权利要求75的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是肺炎杆菌，肉眼看上去呈靛蓝色，并呈粘液样。
86、如权利要求75的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是猪霍乱沙门氏菌，肉眼看上去呈棕色，有棕色色素从菌落扩散到培养基里。
87、如权利要求75的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奇异变形菌，肉眼看上去呈橙色，有不规则的扩散边缘，并有橙色色素从菌落扩散到培养基里。
88、如权利要求75的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奥克西托克雷伯氏菌，肉眼看上去呈黄色，有黄色色素从菌落里扩散出来。
89、如权利要求75的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述菌菌落是铜绿假单孢菌，肉眼看上去呈绿色，有绿色色素从菌落里扩散出来。
90、如权利要求75的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是金黄色葡萄球菌，肉眼看上去呈黄色。
91、如权利要求75的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是粪肠球菌，肉眼看上去小且为白色。
92、一种检测被怀疑带菌的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)用所述试样接种一种固体试验培养基，其中，所述培养基含有：i)一种能在与β-葡糖苷酸酶反应时生成第一种颜色的，选自6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸和5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸的β-葡糖苷酸酶显色底物；ii)一种能在与芳基硫酸酯酶反应时生成第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物，羟基吲哚-3-硫酸酯；iii)一种含有酪蛋白的不透明的试剂；iv)一种能在与至少一种细菌酶反应时生成第三种颜色的含色氨酸的化合物，其中，所述第一、二和三种颜色用肉眼可以区分；
b)培养所述试验培养基，以产生所述细菌生物体的细菌菌落，该菌落能产生一种或一种以上所述第一、二或三种颜色；和
c)检查所述试验培养基中i)具有所有第一种颜色的细菌菌落的存在；ii)具有所述第二种颜色的细菌菌落的存在；iii)具有所述第三种颜色的细菌菌落的存在；iv)没有所述第一、二或三种颜色的菌落的存在；和v)在所述细菌菌落周围的培养基里透明部分的存在。
93、如权利要求92的方法，其特征在于所述培养基还包括至少一种选自锰、铜和铁离子的配位化合物。
94、如权利要求92的方法，还包括检验具有水解尿素的能力的细菌生物体的步骤。
95、如权利要求94的方法，其特征在于所述检验具有水解尿素能力的细菌生物体的过程包括以下步骤：i)放入一种含有尿素和一种pH指示剂的溶液中；和ii)检查颜色的产生。
96、如权利要求95的方法，其特征在于所述溶液中尿素的浓度约为5％，而所述pH指示剂的浓度约为0.05％，该溶液的pH大约为4～7。
97、如权利要求96的方法，其特征在于所述pH指示剂选自甲酚紫、酚红、百里酚蓝、溴百里酚蓝、溴甲酚紫、二甲苯酚蓝和甲酚红。
98、如权利要求92的方法，还包括检验具有还原亚碲酸盐能力的细菌生物体的步骤。
99、如权利要求98的方法，其特征在于所述检验具有还原亚碲酸盐能力的细菌生物体的过程包括以下步骤：i)将亚碲酸盐溶液滴加在被怀疑是粪肠球菌的菌落上ii)培养；和iii)检查黑色的产生。
100、如权利要求99的方法，其特征在于所述亚碲酸盐含有大约1％的亚碲酸钾。
101、如权利要求92的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是大肠杆菌，肉眼看上去呈红色，在菌落周围有透明部分。
102、如权利要求92的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是肺炎杆菌，肉眼看上去呈靛蓝色并为粘液样，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
103、如权利要求92的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是猪霍乱沙门氏菌，肉眼看上去呈棕色，有棕色色素从菌落扩散到培养基里。
104、如权利要求92的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奇异变形菌，肉眼看上去呈橙色，有不规则的扩散边缘，并有橙色色素从菌落扩散到培养基里。
105、如权利要求92的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奥克西托克雷伯氏菌，肉眼看上去呈黄色，有黄色色素从菌落里扩散出来，并在菌落周围的培养基里有透明部分。
106、如权利要求92的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是铜绿假单孢菌，肉眼看上去呈绿色，有绿色色素从菌落里扩散出来，并在菌落周围的培养基里有透明的部分。
107、如权利要求92的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是金黄色葡萄球菌，肉眼看上去呈黄色，在菌落周围的培养基里有透明的部分。
108、如权利要求92的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是粪肠球菌，肉眼看上去小且为白色，在菌落周围的培养基里有透明的部分。

Claims (56)

1、一种检测被怀疑带菌的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)用所述试样接种一种试验培养基，其中，所述培养基包括：i)一种能在与β-葡糖苷酸酶反应时生成第一种颜色的β-葡糖苷酸酶显色底物；ii)一种能在与芳基硫酸酯酶反应时生成第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物，所述第一和第二种颜色可用肉眼区分；和iii)营养基质；
b)培养所述试验培养基以产生所述生物体的细菌菌落，从而产生一种或一种以上的所述第一和第二种颜色；和
c)检查所述培养基中i)具有所述第一种颜色的细菌菌落的存在，ii)具有所述第二种颜色的细菌菌落的存在；iii)没有所述第一或第二种颜色的细菌菌落的存在。
2、如权利要求1的方法，它还包括计数存在于所述试验培养基上的细菌菌落数的步骤。
3、如权利要求1的方法，其特征在于所述试验培养基还包括至少一种不透明的化合物。
4、如权利要求3的方法，其特征在于所述不透明的化合物使所述培养基呈白色。
5、如权利要求3的方法，其特征在于所述不透明的化合物是蛋白类的。
6、如权利要求5的方法，其特征在于所述蛋白类化合物是乳制品。
7、如权利要求3的方法，其特征在于所述不透明的化合物是非蛋白类的。
8、如权利要求7的方法，其特征在于所述非蛋白类化合物选自硅酸盐、氧化物和碳酸盐。
9、如权利要求1的方法，其特征在于所述试验培养基还包括至少一种胺。
10、如权利要求9的方法，其特征在于所述胺选自谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪胺、章鱼胺、多巴胺和去甲肾上腺素。
11、如权利要求1的方法，还包括这样的步骤：检验所述菌落中细菌生物体在至少有一种选自锰、铁和铜离子的配位化合物的条件下氧化至少一种芳香胺的能力。
12、如权利要求11的方法，其特征在于所述芳香胺选自色氨酸和酪胺。
13、如权利要求1的方法，还包括检验在所述细菌菌落周围的试验培养基中存在脓青素的步骤。
14、如权利要求13的方法，其特征在于所述检验脓青素存在的过程包括以下步骤：i)将酸加在所述细菌菌落周围的培养基里；和ii)观察在所述培养基中颜色变化的产生。
15、如权利要求14的方法，其特征在于所述酸是约为2N的氢氯酸。
16、如权利要求1的方法，还包括检验所述细菌生物体水解尿素的能力的步骤。
17、如权利要求1的方法，还包括检验所述细菌生物体还原亚碲酸盐的能力的步骤。
18、一种检测被怀疑带菌的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)接种一种试验培养基，其中，所述试验培养基包括：i)至少一种能在与一种酶反应时生成有色细菌菌落的显色底物；ii)至少一种蛋白类不透明化合物；和iii)营养基质；
b)培养所述试验培养基，以产生所述生物体的有色细菌菌落；和
c)检查所述试验培养基中i)有色细菌菌落的存在；ii)没有颜色的细菌菌落的存在；和iii)所述细菌菌落周围透明部分的存在。
19、如权利要求18的方法，其特征在于所述蛋白类不透明的化合物是乳制品。
20、如权利要求19的方法，其特征在于所述蛋白类不透明的化合物是辐射灭菌的。
21、如权利要求18的方法，其特征在于所述底物是芳基硫酸酯酶显色底物。
22、如权利要求18的方法，其特征在于所述底物是β-葡糖苷酸酶显色底物。
23、如权利要求18的方法，其特征在于所述底物包括芳基硫酸酯酶显色底物、β-葡糖苷酸酶显色底物、和β-半乳糖苷酶显色底物。
24、一种检测被怀疑带菌的试样中细菌生物体存在的方法，包括以下步骤：
a)用所述试样接种一种固体试验培养基，其中，所述培养基包括：i)一种能在与β-葡糖苷酸酶反应时生成第一种颜色的β-葡糖苷酸酶显色底物；ii)一种能在与芳基硫酸酯酶反应时生成第二种颜色的芳基硫酸酯酶显色底物；iii)一种蛋白类不透明的试剂；和iv)至少一种能在与至少一种细菌酶反应时生成第三种颜色的化合物，其中，第一、二和三种颜色可用肉眼区分；
b)培养所述试验培养基以产生所述生物体的细菌菌落，从而产生一种或一种以上所述第一、二和三种颜色；
c)检查所述培养基中i)具有所述第一种颜色的细菌菌落的存在；ii)具有所述第二种颜色的细菌菌落的存在；iii)具有所述第三种颜色的细菌菌落的存在；iv)没有所述第一、二或三种颜色的细菌菌落的存在；和v)检查所述培养基中所述细菌菌落周围透明部分的存在。
25、如权利要求24的方法，其特征在于所述细菌酶选自色氨酸氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶和酪胺氧化酶。
26、如权利要求24的方法，其特征在于所述培养基还包括至少一种选自锰、铜和铁离子的配位化合物。
27、如权利要求24的方法，还包括检验所述细菌生物体水解尿素的能力的步骤。
28、如权利要求27的方法，其特征在于所述检验所述细菌生物体水解尿素的能力的过程包括以下步骤：i)将所述细菌生物体放入一种含有尿素和一种pH指示剂的溶液里；和ii)检查颜色的产生。
29、如权利要求28的方法，其特征在于所述溶液中尿素的浓度约为5％，所述pH指示剂的浓度约为0.05％，该溶液的pH被调整至大约4～7。
30、如权利要求29的方法，其特征在于所述pH指示剂选自m-甲酚紫、酚红、百里酚蓝、溴百里酚蓝、溴甲酚紫、二甲苯酚蓝和甲酚红。
31、如权利要求24的方法，还包括检验所述细菌生物体还原亚碲酸盐能力的步骤。
32、如权利要求31的方法，其特征在于所述检验所述细菌生物体还原亚碲酸盐能力的过程包括以下步骤：i)将亚碲酸盐溶液滴加在被怀疑是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的菌落上；ii)培养所述细菌生物体；和iii)检查黑色的产生。
33、如权利要求32的方法，其特征在于所述亚碲酸盐溶液包括大约1％的亚碲酸钾。
34、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是大肠杆菌(Escherichia coli)，肉眼看上去呈红色，在菌落周围的培养基里有透明的晕圈。
35、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上所述细菌菌落是肺炎杆菌(Klebsiella Pneumoniae)，肉眼看上去呈靛蓝色并呈粘液样，在菌落周围的培养基里有透明的晕圈。
36、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)，肉眼看上去呈棕色，有棕色色素从菌落扩散到培养基里。
37、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奇异变形菌(Proteus mirabilis)，肉眼看上去呈橙色，有不规则的扩散边缘并有橙色色素从菌落扩散到培养基里。
38、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是奥克西托克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，肉眼看上去呈黄色，有黄色色素从菌落里扩散出来，并且在菌落周围的培养基里有透明的晕圈。
39、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述菌菌落是铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)，肉眼看上去呈绿色，有绿色色素从菌落里扩散出来，并且在菌落周围的培养基里有透明的晕圈。
40、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肉眼看上去呈黄色，在菌落周围的培养基里有透明的晕圈。
41、如权利要求24的方法，其特征在于生长在所述试验培养基上的所述细菌菌落是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，肉眼看上去小且呈白色，在菌落周围的培养基里有透明的晕圈。
42、一种用于鉴定细菌菌落的培养基，包括i)至少一种蛋白类不透明的化合物；ii)一种或一种以上显色底物；和iii)营养基质。
43、如权利要求42的培养基，其特征在于所述营养基质包含一种或一种以上选自含大豆胨、肉膏、硫酸镁和硫酸钠这一组的化合物。
44、如权利要求42的培养基，其特征在于所述蛋白类化合物是乳制品。
45、如权利要求42的培养基，其特征在于所述一种或一种以上选自含芳基硫酸酯酶底物、葡糖苷酸酶底物、色氨酸氧化酶底物和酪胺氧化酶底物这一组显色底物。
46、一种用于鉴定细菌菌落的培养基，包括所述细菌菌落生长和分化用的足够量的：i)至少一种葡糖苷酸酶显色底物，ii)至少一种芳基硫酸酯酶显色底物；和iii)至少一种能使试验培养基呈白色的不透明的化合物。
47、如权利要求46的培养基，其特征在于所述不透明的化合物是非蛋白类的。
48、如权利要求47的培养基，其特征在于所述非蛋白类化合物选自硅酸盐、碳酸盐和氧化物。
49、如权利要求46的培养基，其特征在于所述不透明的化合物是蛋白类的。
50、如权利要求49的培养基，其特征在于所述不透明的化合物是乳制品。
51、如权利要求46的培养基，其特征在于所述显色底物选自芳基硫酸酯酶显色底物、β-葡糖苷酸酶显色底物、β-半乳糖苷酶显色底物、色氨酸氧化酶显色底物和酪胺氧化酶显色底物。
52、如权利要求46的培养基，还包括至少一种选自锰、铜和铁离子的配位化合物。
53、一种用于鉴定细菌菌落的培养基，包括所述细菌菌落生长和分化用的足够量的：i)至少一种含酪蛋白的化合物；ii)一种葡糖苷酸酶显色底物；iii)一种芳基硫酸酯酶显色底物；iv)至少一种选自锰、铜和铁的配位化合物；和v)一种胶凝剂。
54、如权利要求53的培养基，其特征在于所述显色底物选自6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸和5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸。
55、如权利要求53的培养基，其特征在于所述芳基硫酸酯酶显色底物是羟基吲哚-3-硫酸酯。
56、如权利要求53的培养基，还包括至少一种选自谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪胺、章鱼胺、多巴胺和去甲肾上腺素的胺。
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