CN1159450C

CN1159450C - 低氧亲和力的突变型血红蛋白

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Publication number: CN1159450C
Application number: CNB961935456A
Authority: CN
Inventors: ��ǳ�; 何潜; 金炫元; 申同健
Original assignee: Carnegie Mellon University
Current assignee: Carnegie Mellon University
Priority date: 1995-05-01
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2016-04-30
Also published as: CN1183120A; JPH11506314A; EP0826064A1; AU5720596A; JP3170289B2; WO1996034974A1; EP0826064B1; ATE283288T1; DE69633918D1; EP0826064A4; US5843888A

Abstract

本发明提供了一种非天然存在的突变型血红蛋白(α96Val→Trp)，该血红蛋白的氧亲和力比天然血红蛋白低，但在氧结合中的协同性较高。突变型血红蛋白宜利用重组DNA技术获取。这样的突变型血红蛋白可以用作代血制品的组分。

Description

低氧亲和力的突变型血红蛋白

申明

本发明是在政府的部分支持下进行的，资助编号为HL-24525。政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明主要涉及新的突变型血红蛋白，具体涉及重组突变型血红蛋白“rHb(α96Val→Trp)”，它的氧亲和力低，但在氧结合中的协同性高。本发明还涉及利用重组DNA技术制备可替代血红细胞的突变型血红蛋白。

发明背景

HIV和肝炎之类感染源在人血制品的血红细胞中的传播，加上由于缺少合适的供血者而造成的血源缺乏，这些使得人们对开发红细胞代用品，尤其是人血红蛋白(“Hb”)及其衍生物产生了极大兴趣。血红蛋白是携氧血液成份，位于红细胞内在血流中循环。

人正常成人血红蛋白(“Hb A”)是一种四聚体蛋白质，包含两条各含141个氨基酸残基的α链和两条各含146个氨基酸残基的β链，还带有被称为血红素的辅基。红细胞帮助维持血红蛋白处于还原性功能形式。血红素亚铁离子很容易被氧化，但可以被红细胞内的两种系统之一还原，即细胞色素b5和谷胱甘肽还原系统。

对于使用血红蛋白的无细胞溶液作为潜在的携氧红细胞替代品早已有研究。参见，Mulder，A.G.等，实验医学杂志(J.Cell Comp.Physilo)5：383(1934)，本文引用其内容作为参考。使用纯化自红细胞的非修饰的无细胞人血红蛋白除污染和前文所述的来源限制之外还受到许多限制，即辅因子2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的丧失使得氧亲和力上升，和Hb四聚体分解为由肾排除的αβ二聚体，这会导致慢性肾损伤。参见，Bunn，H.F.等，(J.Exp.Med.)129：909(1969)，本文引用其内容作为参考。

血红蛋白由于其对2，3-DPG(一种别构调节剂)的依赖性，可以改变其氧亲和力，从而提高体内的氧运送效率。2，3-DPG以一定的浓度存在于红细胞中，该浓度促进血红蛋白将氧释放给组织。没有2，3-DPG时，血红蛋白与氧的结合更紧密，不易释放与之结合的氧。这样，需要给因血浆中缺乏2，3-DPG而不能有效地进行氧传送的病人输入天然的人正常成人血红蛋白(“Hb A”)。

已经在以下系统中表达了人球蛋白和血红蛋白：转基因鼠，参见Chada，K.等，自然(Nature)(London)314：377(1985)和Townes，T.M.等， (EMBO. J.)4：1715(1985)，本文引用其内容作为参考；Swanson，M.E.等，在生物/技术 (Bio/Technology)10：557(1992)中所述的转基因猪，本文引用其内容作为参考；Groebe，D.R.等在蛋白质的表达与纯化(Protein Expression and Purification)中报道的昆虫细胞培养物，本文引用其内容作为参考；Wagenbach，M.等在生物/技术 (Bio/Technology)9：57(1991)中，和DeLiano，J.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)90：918(1993)中所述的酵母菌，本文引用其内容作为参考；和Hoffman，S.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：8521(1990)中所述，Hernan，R.A.等在生物化学(Biochemistry)31：8619(1992)中所述，和Shen，T.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：8108(1993)中所述的大肠杆菌(“E.coli”)，本文引用其内容作为参考。在许多方面，大肠杆菌系统是用于此目的的最佳选择，因为它表达效率最高，而且容易进行定点诱变。

Nagai，K.等在自然(Nature)309：810(1984)和 (Methods Enzymol)153：416(1987)中创建并描述了第一个表达作为融合蛋白的人α-或β-球蛋白的大肠杆菌系统，本文引用其内容作为参考，但是，对该系统产物的后处理过程十分繁琐而且得率很低。所以，该表达系统并不理想，尤其是在为了进行生物化学、生物物理学和生物学研究而需要大量重组血红蛋白(“r Hb A”)时。

Hoffman，S.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：8521(1990)中报道了一种共表达系统，在该系统中，合成的人α-和β-球蛋白基因被组织在单顺反子内，并且等量表达。表达的α-和β-球蛋白都在大肠杆菌中与内源血红素正确组装成四聚体的Hb分子。Hernan，R.A.等，在生物化学 (Biochemistry)31：8619(1992)中报道了非融合单一β-球蛋白在大肠杆菌中的表达。虽然这两个非融合系统在许多方面效果良好，但在α-和β-球蛋白的氨基(N)端都保留了额外的甲硫氨酸残基。

如Bunn，H.F.等编辑的血红蛋白：分子、遗传及临床方面(Hemoglobin： Molecular，Genetic and Clinical Aspects)(W.B.Saunders，Co.，Philadelphia，PA)pp.37-60(1986)(本文引用其内容作为参考)所述，Hb A天然氨基末端的缬氨酸残基被认为在调节氧亲和力，波尔效应(Bohr effect)和与别构剂和阴离子之间的相互作用方面起着重要作用。如在此引用参考的Kavanaugh，J.S.等在生物化学 (Biochemistry)31：8640(1992)中所述，额外的甲硫氨酸能够改变Hb分子N末端的构象。所以，Hb的氧合特性取决于N末端残基的完整性，所以必须从表达的Hb的α-和β-球蛋白的N末端去除额外的甲硫氨酸残基，才能使大肠杆菌系统有效地被用于生产需要的非修饰和突变型Hb。

甲硫氨酸氨肽酶(“Met-AP”或“MAP”)被发现负责在大肠杆菌、沙门氏菌、芽胞杆菌和酵母菌中去除新生肽链N末端的甲硫氨酸残基，而且已经纯化和鉴定了来自多种生物体的Met-AP。参见，Ben-Bassat，A等，细菌学杂志(J. Bacteriol)169：751(1987)和美国专利4,865,974、4,870,017和5,013,662，本文引用其内容作为参考。这些酶对某肽或蛋白质的N末端甲硫氨酸具有独有的特异性，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的Met-AP据报道能够去除许多表达的外源蛋白质的N末端甲硫氨酸。Ben-Bassat，A等，细菌学杂志(J.Bacteriol)169：751(1987)。

利用希尔系数(Hill coeffient)(“n”)衡量的协同氧合作用是其别构特性的较适宜的量度。参见Dickerson，R.E.等，血红蛋白：结构、功能、进化和病原学 (Hemoglobin：Structure，Function，Evolution，and Pathology)(Benjamin CummingsPublishing Co.，Menlo Park，CA)(1983)，本文引用其内容作为参考。Hb A在一般实验条件下与O₂结合的n_max约为3。在α₁β₂(或α₂β₁)亚基界面有氨基酸取代的人正常Hb通常表现出比Hb A高的氧亲和力和比其低的氧结合协同性。参见，Dicherson，R.E.等，同上(1983)；Bunn，H.F.等生物化学杂志(J.Biol. Chem.)249：7402(1974)；和Perutz，M.F.等，蛋白质中协同性和别构调节的机理 (Mechanisms of Cooperativity and Allosteric Regulation in Proteins)CambridgeUniversity Press(1990)。所以，α₁β₂亚基界面被认为对Hb的功能来说是十分重要的。例如，在β99Asp处发生氨基酸取代的人突变Hb具有大大低于Hb A的协同性和提高的氧亲和力。这类突变型血红蛋白的实例有HbKempsey(β99Asp→Asn)(Reed，C.S.等，血液(Blood)31：623(1968))；HbYakima(β99Asp→His)(Jones，R.T.等，临床研究杂志(J.Clin. Invest.)46：1840(1967))；和Hb Radcliff(β99Asp→Ala)(Weatherall，D.J.等，英国血液学杂志(British J.Haematol.)35：177(1977))，本文引用其内容作为参考。在此引用参考的Fermi，G.等在分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)175：159(1984)中，已经进行了对脱氧Hb A(不带氧分子的Hb A)的X射线晶体学研究，该研究显示β99Asp同时与α₁β₂亚基界面的α42Tyr和α97Asn以氢键连接。这表明，β99Asp的实质性作用是通过形成亚基间的氢键来维持脱氧Hb分子的稳定性。

最近，已经构建了两种涉及α42Tyr突变的重组Hb(“r Hb”)，两种突变在形成的突变体中导致了非常不同的特性。r Hb(α42Tyr→His)(Ishimori，K.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)246：14624(1989)和Imai，K.等，分子生物学杂志(J.Mol. Biol.)21 8：769(1 991)，本文引用其内容作为参考)表现出一定的氧结合协同性(pH＝6.8时，n＝2)和中等的氧亲和力。r Hb(α42Tyr→Phe)((Ishimori，K.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)246：14624(1989)和Imai，K.等，分子生物学杂志(J.Mol. Biol.)218：769(1991)，本文引用其内容作为参考)几乎完全没有氧结合协同性(n＝1.2)，而且具有很高的氧亲和力。两种突变体之间的特性差异被认为是因为在r Hb(α42Tyr→His)的脱氧态中，在α42His和β99Asp之间存在微弱的氢键，而在脱氧r Hb(42Tyr→Phe)中则没有。已知，不论在β99Asp或α42Tyr发生氨基酸取代而丧失亚基间氢键的异常Hb都同时丧失其功能特性，所以，这些氢键被认为对于Hb分子的结构和功能是十分重要的。

在此引用参考的Shaanan，B.等在分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)171：31(1983)中报道，含氧形式的Hb A在α₁β₂亚基界面的α94Asp和β102Asn之间有特征性氢键。在α94Asp发生氨基酸取代的人Hb，如Hb Titusville(α94Asp→Asn)(Schneider，R.G.等， (Biochim.Biohpys.Acta.)400：365(1975)，本文引用其内容作为参考)，或在β102Asn发生氨基酸取代的人Hb，如Hb Kansas(β102Asn→Thr)(Bonaventura，J.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)243：980(1968)，本文引用其内容作为参考)，以及其它的，都表现出很低的氧亲和力。但是，这些直接打断含氧形式Hb内α94Aps和β102Asn间氢键的Hb突变体其氧结合协同性都显著降低，而且很容易在连接态时分解为二聚体。

也有不涉及α94Aps或β102Asn的低氧亲和力人突变型Hb。例如HbPresbyterian(β108Asn Lys)(Moo-Penn，W.F.等， (FEBS Lett.)92：53(1978)和O’Donnell，J.K.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：27692(1994)；Hb Yoshizuka(β108Asn→Asp)(O’Donnell，J.K.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：27692(1994)；和重组Hb Mequon(β41Phe→Tyr)(Baudin，V.等， (Biochim.Biohpys. Acta.)1159：223(1992)，本文引用以上内容作为参考)，都表现出比Hb A低的氧亲和力，但是他们都表现出不同的利用希尔系数衡量的协同性，n在1.8至2.9之间不等。

已经使用了分子动力学(“MD”)模拟来计算天然蛋白和突变型蛋白之间的自由能差异。参见Dang，L.X等，美国化学协会杂志(J.Am.Chem. Soc.)111：8505(1989)和Gao，J.等，科学(Science)244：1069(1989)，本文引用其内容作为参考。Gao，J.等在科学(Science)244：1069(1989)报道，Hb Radcliff(β99Asp→Ala)的MD模拟显示出热动力学测量值与计算值之间的高度一致性。Kim，H.W.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91：11547(1994)中报道，MD模拟已被用于成功地设计异常Hb中的补偿性氨基酸取代，该取代可以恢复其别构特性，本文引用其内容作为参考。

在此引用参考的Shen，T.J.等在美国化学协会杂志(J.Am.Chem. Soc.)90：8108(1993)中描述了一种大肠杆菌表达质粒(pHE2)，在该质粒中合成的α-和β-球蛋白基因与大肠杆菌的甲硫氨酸氨肽酶基因在各自的tac启动子调控下共表达。用该质粒转化的大肠杆菌细胞表达r Hb A，共表达的MAP有效地切除了这种r Hb A N末端的甲硫氨酸。由此生产的没有N末端甲硫氨酸的重组Hb A在许多结构和功能特性上与天然Hb A一致。

但是，仍然需要一种可以被用作以血红蛋白为基础的代血制品或治疗剂的突变型血红蛋白。人们尤其感兴趣的是这样的突变型血红蛋白，即具有低氧亲和力，高氧结合协同性，而且不会在连接态时表现出异常的亚基分解。还需要用重组方法得到的这种血红蛋白，以及能够以高得率产生特别用于代血制品的这种突变型血红蛋白的有效的表达系统。

发明综述

所以，本发明的主要目的是提供一种低氧亲和力的突变型血红蛋白。

本发明的目的之二是提供一种低氧亲和力的非天然突变型血红蛋白。

本发明目的之三是提供一种人工生成的，最好是以重组方法产生的低氧亲和力突变型血红蛋白，同时具有正确的血红素构象。

本发明的目的之四是提供氧亲和力低但在氧结合中协同性高的突变型血红蛋白。

本发明目的之五是提供在无细胞环境中具有与红细胞中的人正常成人血红蛋白相似的氧结合特性的突变型血红蛋白。

本发明目的之六是提供用于产生这类突变型血红蛋白的表达系统。

本发明的另一目的是提供人造血红蛋白用作以血红蛋白为基础的代血制品或治疗剂。

本发明的目的还在于提供本发明非天然存在的突变型人血红蛋白作为制备用在代血中用于手术，创伤治疗和输血的药物的用途。

本发明的目的还在于提供一种产生人造血红蛋白的方法，它包括：

将重组DNA表达质粒引入除红细胞之外的合适的宿主细胞中，培养转化后的细胞，所述重组DNA表达质粒包含在各自tac启动子调控下的、串联的可表达的人α-和β-球蛋白基因和大肠杆菌的Met-AP基因，其中所述的α-球蛋白基因包含一个突变，该突变使得表达出的蛋白质中α链上96位的缬氨酸残基被色氨酸残基取代，所述序列分别表达所述的人α-和β-球蛋白基因以及Met-AP基因，并且结合血红素以形成本发明的突变血红蛋白；

表达所述的DNA，产生所述的人造血红蛋白；

回收和纯化所述的血红蛋白。

本发明的目的还在于提供一种无毒的药物组合物，它包含在药学上认可的载体内的非天然突变型血红蛋白，该突变型血红蛋白，其α链上96位的缬氨酸残基被色氨酸残基取代。

通过后文实施例可以达到本发明的上述及其它目的。

本发明内容之一描述了一种非天然的突变型血红蛋白，其中α链中96位的缬氨酸残基被色氨酸残基取代。

本发明内容之二，利用重组方法产生了具有比正常的人成人血红蛋白低的氧亲和力，但具有高氧结合协同性的血红蛋白。

本发明内容之三描述了一种非天然的低氧亲和力突变型血红蛋白，它在别构剂2，3-DPG存在下，具有与人正常成人血红蛋白相当的氧结合特性。

在较好的实施方式中，突变型血红蛋白中α链96位的缬氨酸残基被色氨酸残基取代。

通过以下说明和权利要求，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。

附图说明

图1，用pHE202(“pHE202/JM109”)质粒转化大肠杆菌JM1 09细胞，超声波粉碎后获得的r Hb(α96Val→Trp)，图1是该r Hb从Mono S柱上洗脱的色谱洗脱图形，图形显示峰a、b₁和b₂。洗脱液在546nm处检测。

图2A-2D是来自质粒pHE202的峰a(图2A)、峰b₁(图2B)和峰b₂(图2C)的rHb(α96Val→Trp)，以及作为参照的Hb A(图2D)的电喷雾质谱法。

图3A和3B是显示在29℃，在pH7的0.1M磷酸盐缓冲水溶液中，CO形式的4％来自pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)和4％Hb A的环流位移质子共振的¹H-NMR谱。图3A显示经Mono S柱纯化的纯洗脱液(a、b₁、b₂)的CO形式。图3B显示从CO形式回复到Fe⁺³态的来自峰a，b₁，b₂的纯r Hb(α96Val→Trp)。

图4A和4B显示在29℃(两图)和36℃(仅图4B)，在pH7的0.1M磷酸盐缓冲水溶液中，脱氧形式的4％来自pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)和4％Hb A的¹H-NMR共振。图4A显示的是邻近的组氨酸的超精-位移的N_δH可交换质子共振；图4B显示的是超精位移和可交换共振。“脱氧-r Hb”在图4B中表示脱氧rHb(α96Val→Trp)。

图5A-5D的¹H-NMR质谱显示的是在10、21、29和36℃，在10mM肌醇六磷酸(“IHP”)存在下，在pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液中，温度对4％来自pHE202/JM109的峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的300-MHz质子共振的影响。图5A和图5B分别是4％峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的可交换质子共振。图5C和5D分别是4％峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的环-流位移共振。

图6A-6D的¹H-NMR质谱显示的是在10、15、21和29℃，在无肌醇六磷酸(“IHP”)的pH7.0水中，温度对4％来自pHE202/JM109的峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的300-MHz质子共振的影响。图6A和图6B分别是4％峰a的rHbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的可交换质子共振。图6C和6D分别是4％峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的环-流位移共振。

图7A和图7B显示50％饱和时用氧分压表示的氧亲和力(P₅₀)(mmHg)，该图被绘制成pH的函数，使用的是Hb A或pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)在0.1M磷酸钠缓冲液中形成的0.1mM溶液，缓冲液pH范围为6.3-8.9，温度为29℃。图7A显示的是Hb A(○)和来自Mono S柱的r Hb(α96Val→Trp)纯洗脱液(峰a(■)、峰b₁(△)，和峰b₂(+))；图7B显示的是从CO形式转换到Fe⁺³态，再回复到CO形式的Hb A(○)和来自Mono S柱的r Hb(α96Val→Trp)纯洗脱液(峰a(■)、峰b₁(△)，和峰b₂(+))。

图8A和图8B显示希尔系数(n_max)作为pH的函数，其中的氧解离数据是利用0.1mM的Hb A或pHE202/JM109产生的r Hb(α96Val→Trp)的0.1M磷酸钠缓冲液溶液在6.5-8.4pH范围及29℃时获得的。图8A显示的是Hb A(○)和Mono S柱纯化的洗脱液(峰a(■)，峰b₁(△)，和峰b₂(+))；图8B显示的是从CO形式转换到Fe⁺³态，再回复到CO形式的Hb A(○)和来自Mono S柱的r Hb(α96Val→Trp)纯洗脱液(峰a(■)、峰b₁(△)，和峰b₂(+))。

图9显示用0.1mMHb的0.1M磷酸钠缓冲液溶液在pH7.4和29℃获得的氧解离曲线，Hb分别是Mono S纯化的pHE202/JM109的洗脱峰a的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A，分别与有别构剂：2mM的2，3-DPG和2mM的IHP存在下的Mono S纯化的r Hb(α96Val→Trp)比较。

图10A和10B分别显示氧亲和力(P₅₀)的温度依赖性和希尔系数，是使用Hb A或pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)在pH7.4的0.1M磷酸钠缓冲液溶液中形成的0.1mM溶液在16、20、25、29和37℃获得的。使用的Hb是：Hb A(○)，r Hb(α96Val→Trp)(△)，2mM IHP存在下的r Hb(α96Val→Trp)(+)；和2mM IHP存在下的Hb A(□)。

图11A和11B显示的是可交换质子共振(图11A)和环-流位移质子共振(图11B)，分别是4％来自pHE202/JM109的峰b₂的r HbCO(α96Val→Trp)，4％来自pHE202/JM109的峰2的r HbCO(α96Val→Trp)和Hb A，都是CO形式，配制在0.1M的pH7.0磷酸盐缓冲水溶液中，在29℃时。两种r Hb(α96Val→Trp)样品都在进行NMR测量前接受了氧化-还原处理。

本发明的说明

I.定义

在本文中，“Hb A”或“天然Hb A”指由人获取的人正常成人血红蛋白。“重组人正常成人血红蛋白”，“r Hb A”和“非修饰r Hb A”指如Shen，t.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：8108(1993)中所述，利用重组DNA技术产生的，结构和功能与天然Hb A基本相同的人正常成人血红蛋白。

“r Hb(α96Val→Trp)”指利用重组DNA技术产生的，位于α₁β₂(或α₂β₁)界面的α链上96位的缬氨酸残基被色氨酸取代的突变型人正常成人血红蛋白。这种血红蛋白显示低氧亲和力和高氧结合协同性，在连接态时不发生异常的亚基解离。

“脱氧”或“含氧”指Hb A和r Hb(α96Val→Trp)中的血红素-亚铁离子的氧合态。含氧血红蛋白“含氧Hb”或“HbO₂”具有与血红素基团结合的4个氧分子；脱氧血红蛋白(“脱氧Hb”)不含氧分子。在一般动脉血中，正常成人血红蛋白A(“Hb A”)是含氧态的(“含氧Hb A”)。在静脉血中，部分Hb A是脱氧形式的(“脱氧Hb A”)。

“一氧化碳-Hb”，“HbCO A”， r HbCO(α96Val→Trp)”和“CO形式”都指与一氧化碳分子而不是氧分子结合的血红蛋白。

“铁-血红蛋白”，“铁-Hb”，“铁形式”，“金属球蛋白”，“met-Hb”和“Fe⁺³态”都指各自的血红素-铁原子被氧化成铁态(Fe⁺³)的Hb A和r Hb(α96Val→Trp)。铁-Hb不结合氧。

“亚铁-血红蛋白”，“亚铁-Hb”，“Fe⁺²态”和“亚铁形式”都指各自的血红素-铁原子处于天然的还原态(Fe⁺²)。亚铁-Hb能够结合氧或一氧化碳。

“调控”指编码序列的基因从属于DNA分子调控区中的另一基因，具体地说是启动子，编码序列由此在该启动子的调控下被表达和调节。没有这样的调控，编码序列会在宿主体内表达过多或过少，或在不合适的时候表达。

“Met-氨肽酶”，“Met-AP”和“MAP”指甲硫氨酸氨肽酶，该酶特异性地从肽序列上切断氨基端(N末端)的甲硫氨酸残基。

“四级结构转换”指血红蛋白亚基界面的结构重排，例如在从脱氧形式转变到含氧形式α₁β₂的转换。

“氧亲和力”指氧与血红蛋白的结合强度。高氧亲和力指血红蛋白不易释放与之结合的氧分子。P₅₀是氧亲和力的一种量度。

“协同性”指血红蛋白S形的氧结合曲线，即，与四聚体血红蛋白一个亚基结合的第一个氧分子促进氧与其它未结合的亚基的结合。这宜用希尔系数(n_max)来衡量。Hb A的n_max＝3.0。

血红蛋白的R型或R样以及T型或T样结构指表现特征性四级结构标记，例如以距DSS10.7ppm的质子共振为R-结构标记，以距DSS14ppm的质子共振为T-结构标记。有些突变型和化学修饰过的Hb可能具有改变了三级结构的T-或R-四级结构标记。

II.方法与结果

本发明提供了一种非天然存在的低氧亲和力突变型人血红蛋白以及利用重组技术产生这种血红蛋白的方法。更具体地说，本发明的目的在于利用重组技术产生的突变型Hb A，本文中表示为r Hb(α96Val→Trp)，其中α₁β₂(或α₂β₁)亚基界面区域内α链上96位的缬氨酸残基被色氨酸残基取代。这种新的人造血红蛋白，即完全来自血液以外来源的血红蛋白表现出低氧亲和力，但氧结合的协同性很高。此外，它在连接态时不会发生异常的亚基解离。在无细胞环境中，本发明的r Hb(α96Val→Trp)具有与红细胞内的Hb A相似的氧结合特性。这种利用重组技术产生的低氧亲和力血红蛋白突变体其价值在于可作为以血红蛋白为基础的代血制品的成份。这种血红蛋白还可以用在对肿瘤、损伤的放射治疗和手术中的血液稀释。

本发明的范围还包括制备和使用具有其它适当突变的低氧亲和力血红蛋白。具体地说，本发明的方法可用于产生具有其它优良特性的突变型血红蛋白。据信，α₁β₂界面和血红蛋白中央凹槽内的其它突变可以产生其它有用的低氧亲和力突变体。后文描述了评价这种突变蛋白在代血制品中或治疗中适用性的方法。

后文详细说明的分子动力学模拟显示，本发明r Hb(α96Val→Trp)独特的氧结合特性可能是因为在脱氧r Hb(α96Val→Trp)的α₁β₂界面内存在一个α96Trp与β99Asp之间的额外氢键。

尽管在α₁β₂界面内小氨基酸残基缬氨酸被大的色氨酸残基所取代，后文将证明，这种人造血红蛋白的血红素袋结构周围的三级结构以及α₁β₂亚基界面的四级结构与人正常成人血红蛋白非常相似。血红蛋白分子的三级结构指的是在直链序列中相距很远的氨基酸残基之间的立体关系，这种关系使每条链自体折叠，而四级结构指的是亚基链之间如何相互作用。

如后文所述，本发明的人造血红蛋白具有这样的特性，即该血红蛋白含氧(R-)型四级结构的连接形式，例如一氧化碳形式可以被转化成脱氧(T-)型四级结构，而无需加入肌醇六磷酸之类的别构剂来改变其连接状态。这种转化还可以通过在没有肌醇六磷酸存在下降低温度来进行。所以，本发明的重组血红蛋白可以用于获取对α₁β₂界面内亚基间作用的性质和血红蛋白别构机制分子基础的新认识。

显而易见的是，本发明的方法还可以用于产生其它具有不同特性的突变型人造血红蛋白，和具有补偿天然产生的突变体的血红蛋白。后文中的参考实施例说明了用于获取r Hb(α96Val→Trp)的较好的材料和方法。虽然本发明的rHb(α96Val→Trp)宜利用重组技术产生，但是可以理解的是也可以使用非重组方法。

实施例

A.质粒pHE202

表达质粒pHE202的构建

根据本发明，已经构建了两种表达r Hb(α96Val→Trp)的质粒，质粒pHE202和质粒pHE702。首先，质粒pHE202的构建方法和结果如下文所述。

将含有合成的人α-和β-球蛋白基因的表达质粒pHE2作为起始质粒。ShenT.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：8108(1993)中已就质粒pHE2的构建和性质作了全面的描述，本文引用其内容作为参考。在质粒pHE2的构建中，合成的人α-和β-球蛋白基因来自质粒pDLIII-13e(Somatogen，Inc.，Boulder CO，的产品，Hoffman，S.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)87：8521(1993)中作了全面描述，本文引用其内容作为参考)。大肠杆菌Met-AP基因的编码序列来自质粒pSYC1174(大肠杆菌MM294中的pSYC1174是CetusCorp.，Emeryville，CA的产品)，该菌株同时保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为ATCC53245，而且已经公开。同时参见美国专利4,865,974，4,870,017和5,013,662。质粒pHE2在各自的tac启动子调控下共表达合成的人α-和β-球蛋白基因和大肠杆菌Met-AP基因。

然后如后文所述，进行定点诱变，用色氨酸残基取代α链上96位的缬氨酸残基。利用本领域的常规方法将合成的人α-和β-球蛋白基因(来自质粒pDLIII-13e)插入噬菌粒pTZ18U(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中。利用标准DNA合成技术在DNA合成仪，University of Pittsburgh上合成序列为5’-TTTGAAGTT CCATGGATCAAC-3’的合成寡核苷酸(用下划线表示突变的密码子)，将它用作引入α96Val→Trp突变的引物。寡核苷酸合成技术是众所周知的，本发明并不限于任何特定的技术。如Kunkel，T.M.等在美国科学院院报(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)82：488(1985)和Shen，T.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)90：8108(1993)中所述进行定点诱变，本文引用其内容作为参考。然后用突变基因取代质粒pHE2中的人正常α-球蛋白基因形成质粒pHE202。宿主细胞大肠杆菌JM109中的质粒pHE202，标识为pHE202/JM109，于1995年4月26日保藏在Rockville，MD的美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC69792。

细胞的生长

利用本领域常规方法将质粒pHE202转化到大肠杆菌JM109细胞(Promega，Madison，WI)内。细胞在20升的Microferm MF20型发酵罐(New BrunswickScientific，Edison，NJ)中，于TB培养基中生长，培养基中含有1.2％细菌培养用胰蛋白胨，2.4％细菌培养用酵母提取物，0.4％甘油，17mM KH₂PO₄，72mMK₂HPO₄和100μg青霉素(Sigma，St.Louis，MO)，温度为30℃，直至细胞密度达到1-2×10⁹细胞/ml。

加入0.2mM的异丙基β-硫代吡喃半乳糖苷诱导r Hb(α96Val→Trp)的表达。然后在培养物中补充氯高铁血红素(20mg/l)(Sigma，St.Louis，MO)和葡萄糖(10mg/l)，至少再继续生长4小时。然后离心收获细胞，在需要进一步纯化前按每份100g在-80℃冷冻保存。

虽然优选大肠杆菌细胞来表达和产生本发明的重组突变型血红蛋白，但是本发明并不局限于大肠杆菌细胞。其它合适的表达系统，例如酵母细胞、昆虫细胞和猪及牛之类的转基因动物也可以较好地被用于表达突变型血红蛋白。质粒pHE202已被优化用于大肠杆菌细胞，但是后文所述的质粒pHE702是由人基因构建的，所以利用质粒pHE702中包含的人基因可使用其它合适的表达系统。

重组Hb的分离和纯化

基本上如Shen，T.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：8108(1993)中所述，略作修改，纯化由用质粒pHE202转化的细胞获得的r Hb(α96Val→Trp)。

将冷冻保存的细胞加入裂解缓冲液(40mM Tris-碱/1mM苄醚(Sigma)，3ml/g细胞)中搅拌至充分悬浮。将(Sigma)(1mg/g细胞)溶解在10ml 40mM的Tris-HCl，pH8.0的溶菌酶加入细胞悬浮液，在4℃静置约45分钟(溶液变得非常粘稠)。加入MgCl₂和MnCl₂至最终浓度分别为10mM和1mM。加入约3-5μg/ml的DNAse(ICN Biochemical，Inc.，Costa Meas，CA)，搅拌30-60分钟，或直至粘度降低。然后，裂解液在Branson 450超声处理仪(Branson，Danbury，CT)中，在冰浴中，在65-75W，进行3个3分钟循环的超声处理，在循环之间进行停顿以保证裂解液处于低温。然后，裂解液在Sorvall GSA转子中(E.I.duPont，Wilmington，DE)在14,000rpm，在4℃离心45分钟。然后用CO饱和上清液，并在4℃静置3至4天。用1M的Tris-碱将上清液的pH调节至8.0，缓慢加入10％的聚乙烯亚胺(Sigma)(vol/vol)，直至最终浓度0.5％，以便沉淀出核酸。在CO气氛下搅拌沉淀15分钟，然后如上所述在14,000rpm离心。用1M的Tris-碱将上清液的pH调节至8.3，将其通过Millipore Minitan丙烯酸超滤系统(Millipore Corp.，Bedford，MA)至体积约为150ml。对20mM pH8.3的Tris-HCl/0.1mM三亚乙基四胺(TETA)(后文称为“Q2缓冲液”)通宵透析浓缩液。通常通过添加20mM Tris-碱/0.1mM TETA来调节pH和电导率，使之与Q2缓冲液的一样。

在利用Pharmacia快速蛋白质液相色谱(“FPLC”)系统(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，IN)的最后纯化过程中使用了两根色谱柱。使用的第一根色谱柱是用于结合Hb的Q-琼脂糖高流速柱(Pharmacia阴离子交换柱)(5cm×28cm)。上样后，用Q2缓冲液(20mM Tris-HCl/0.1mM TETA，pH8.3)洗脱，并在260nm处检查，直至将污染核酸洗脱。然后用pH7.2的20mM Tris-HCl洗脱Hb部分。用pH6.8的10mM磷酸盐/0.1mM乙二胺四乙酸(“EDTA”)(缓冲液A)浓缩洗脱液。上样的第二根色谱柱是Mono S柱(Pharmacia阳离子交换柱，HR6/10)。用10mMpH6.8的磷酸钠/0.1mM乙二胺四乙酸(“EDTA”)至20mM pH8.3的磷酸钠/0.1mM EDTA的梯度在Mono S柱上纯化平衡后的样品。在546nm对洗脱部分进行检查。

如图1所示，r Hb(α96Val→Trp)被洗脱在两个主峰中，一个对称峰(a峰)和随后的两个重叠峰(b₁峰和b₂峰)。如前文所述获得的这些洗脱峰在后文中称为“a峰”、“b₁峰”和“b₂峰”，如图1所示。利用Antomini，E.等在血红蛋白和肌球蛋白与其配体的反应(Hemoglobin and Myoglobin in Their Reaction with Ligands)(North Holland，Amsterdam)p.19(1971)中所述的公开的消光系数来测定，本文引用其内容作为参考。

Hb的形式

Hb(即Hb A和r Hb(α96Val→Trp))的CO形式是通过将CO气流通过烧瓶内的HbO₂或脱氧Hb溶液来制备的。该过程在通风橱中进行。脱氧Hb通常是如Lindstrom，T.R.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)69：1701(1972)中所述，在4℃，于旋转蒸发器中在氮气氛下将HbCO或HbO₂转变成脱氧形式来制备的。氧-Hb是使脱氧-Hb接触空气或O₂。

蛋白质测序

如Hewick，R.M.等在生物化学杂志(J.Biol.Chem.)256：7990(1981)中所述，进行自动化的Edman降解循环，使用配备了在线苯基硫代乙内酰脲-氨基酸分析仪(120A型)的Applied Biosystem气/液相测序仪(470/900A型)进行自动Edman降解循环，本文引用其内容作为参考。

质谱分析

接受质谱分析的Hb样品对蒸馏水充分透析，然后冷冻干燥。在临分析前将样品在水中溶解成125pmol Hb/μl H₂O(7.8mg/ml)的最终浓度。然后将这些溶液分成等份后分别稀释至10pmol/μl 50：50的水/含0.2％甲酸的乙腈。将各份(10μl)最终溶液以5μl/min的速度引入电喷雾离子源。

电喷雾测定在VG Quattro-BQ(Fisons Instruments，VG Biotech，Altrincham，U.K.)上进行，这是一种质量范围在4000单电荷离子的三重四极装置。进行m/z980至1400的扫描，每次扫描10秒钟。将20次扫描得到的数据相加得出最终质谱。质量刻度的标定使用Hb A α链(Mr＝15，126.4)的多重带电离子峰作为外部参照。通过氨基酸测序计算得到的正常α链和β链的分子量分别为15，126.4和15，967.2。这些值是以以下元素原子量为基础的：C＝12.011；H＝1.00794；N＝14.00674；O＝15.9994；和S＝32.066，根据原子量和同位素丰度委员会(Commision on Atomic Weight and Isotopic Abundances)在 (Pure Appl. Chem.)63：975(1991)中的报道，本文引用其内容作为参考。图2A至2D显示得出的质谱。

血红素铁原子氧化态的转变

为了将Hb，在本例中是Hb A和r Hb(α96Val→Trp)的CO形式氧化成Fe⁺³态，测定pH6.5的0.1M磷酸盐缓冲液中的Hb溶液的浓度。在溶液中加入3摩尔过量K₃Fe(CN)₆(Fisher Scientific)或其它合适的氧化剂，并在室温下搅拌1小时。在此期间，Hb溶液由红色变成棕色。使生成的氧化型Hb(Fe⁺³)通过SephadexG-25(中等)凝胶柱，用0.1M pH6.5的磷酸盐缓冲液去除过量的K₃Fe(CN)₆，留下的Hb(Fe⁺³)在室温下静置过夜。

然后，如下还原氧化型Hb(Fe⁺³)，首先在试管中制备pH约7.0的0.1M磷酸盐缓冲液，并通过在缓冲液中吹氮气去除溶解氧来使缓冲液脱氧。在另一试管中，称取足量的连二亚硫酸钠(Fluka Chemie，Switzerland)制备0.1M的连二亚硫酸盐溶液。然后用氮气吹洗去试管中的氧。然后将脱氧的磷酸盐缓冲液在无氧条件下转移到脱氧连二亚硫酸盐中形成0.1M的最终浓度。使CO气流吹过氧化型Hb的表层(不产生气泡)。将脱氧连二亚硫酸盐缓冲液加入氧化型Hb溶液，直至颜色重新恢复到亮红色。此时，可检查光谱来确认所有的Hb(Fe⁺³)都被还原成了Hb(Fe⁺²)。用还原Hb所用的相同的通过CO气的缓冲液平衡Sephadex G-25凝胶柱。然后用相同的通过CO气的缓冲液使还原型Hb溶液通过Sephadex G-25凝胶柱。然后最好用前述FPLC Mono S色谱柱纯化由此得到的氧化/还原型Hb。然后如前文所述将得到的氧化型、还原型、Mono S纯化的r Hb(α96Val→Trp)或Hb A转变成一氧化碳或含氧形式。

可以使用其它合适的氧化剂来将亚铁-血红蛋白(Fe⁺²)氧化成铁-Hb(Fe⁺³)，例如氰铁酸盐、铜、过氧化氢、羟基胺、亚硝酸盐、肼、硫醇、芳基胺，或化学电势(“Em”)在0.14伏以上的其它化合物。其它可用于将铁-Hb(Fe⁺³)还原成亚铁-血红蛋白(Fe⁺²)的合适的还原剂是：(i)用于非酶还原反应的-连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽，和维生素C(在亚甲基蓝存在下)；(ii)用于酶还原反应的-细胞色素b₅还原酶，NADPH-黄素还原酶，以及Em在0.14伏以下的其它化合物。参见Bunn，H.F.等，血红蛋白：分子、异常及临床方面的内容(Hemoglobin：Molecular，Genetic and Clinical Aspects)(W.P.Saunders，Inc.，Philadephia，PA)pp.634-662(1986)，本文引用其内容作为参考。

NMR测定

¹H-NMR光谱学已被证明是研究Hb A结构特征的极好的工具，例如包括血红素袋结构在内的三级结构以及即亚基界面的四级结构。参见Ho，C.，蛋白质化学进展(Adv.Protein.Chem.)43：153(1992)，本文引用其内容作为参考。已知，血红蛋白的环-流位移¹H共振对CO形式的r Hb A的血红素取向和环境敏感(Ho，C.，蛋白质化学进展(Adv.Protein.Chem.)43：153(1992)和Shen，T.J.等，美国科学院院报 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：8108(1993)，本文引用其内容作为参考)。

在300MHz和10℃至36℃用Bruker AM-300分光计进行¹H-NMR光谱测定。将全部Hb样品加在pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液(100％H₂O水溶液)中。Hb的浓度范围约为4％。如Plateau，P.等在美化化学杂志(J.Am.Chem. Soc.)104：7310(1982)中所述，利用“跳-返”脉冲顺序抑制水信号，本文引用其内容作为参考。用5-mm多核探针(Bruker)的质子去偶线圈，用9.7微秒的90°脉冲，8kHz的光谱宽度(脱氧Hb的是16kHz)，8000数据点，获得特定的一氧化碳-Hb(“HbCO”)和脱氧-Hb样品的¹H-NMR光谱。通常，将256或1024次扫描进行平均以提高信号-干扰比。利用水信号，质子的化学位移直接以2，2-二甲基-2-硅杂戊烷-5磺酸钠(DSS)的甲基质子共振为参照，在29℃，信号出现在离作为内标的DSS 4.76ppm低磁场处。图3至6和图11展示了得到的¹H-NMR光谱。

Hb A样品的氧结合

在16℃-37℃，在pH6.0-8.3的0.1M磷酸钠缓冲液中，利用Hemox-Analyzer(TCS Medical Products，Huntington Valley，PA)测定氧解离曲线。加入Hayashi，A等在 (Biochim.Biophys.Acta)310：309(1973))(本文引用其内容作为参考)中所述的高铁血红蛋白还原酶系统30～60μl以防形式高铁-Hb。根据各条曲线测定50％氧合的作用分压(P₅₀)和希尔系数(n_max)。这些结果显示于图7-10。

MD模拟

用Brooks，C.L.等在分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)208：159(1989)中所述，使用CHAMM22(Brooks，C.L.等， (J.Comp.Chem.)4：187(1983)，本文引用其内容作为参考)的随机边界法，利用极性氢蛋白模型(param19)的标准参数进行MD模拟。

为了比较不同血红蛋白构象的稳定性，分子被分配在半径分别为10埃和15埃的MD区和郎之万(Langevin)区，两区被定中心在脱氧Hb A晶体结构参照坐标系上，Fermi，G.等在分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)175：159(1984)中对后者进行了说明，本文引用其内容作为参考。这些坐标系大致位于两α96Val侧链的C_β中间。为了计算模拟自由能，将分子分配在半径分别为10埃和15埃的MD区和郎之万区，两区定中心在Hb A的脱氧和含氧晶体结构中β99Asp侧链C_β的质心坐标系上(Fermi，G.等分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)171：31(1983)，Shannan，B.分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)173：31(1983)，本文引用其内容作为参考)。如Jorgensen，W.L.等在化学物理杂志(J.Chem.Phys.)79：926(1983)中所述，内球区被粲数拟合(charmm-adapted)的预平衡TIP3P水分子充满，本文引用其内容作为参考。脱氧模拟包括103个水分子，含氧模拟包括83个水分子。

因为不知道r Hb(α96Val→Trp)晶体结构，α96Trp的几种不同的局部构象被考虑作为起始构象。旋转异构体文库(Ponder，J.W.等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)193：775(1987)，本文引用其内容作为参考)中机率大于10％的四种可能的侧链角度(χ₁＝-70.4，χ₂＝-100.5(37.9％)；χ₁＝64.8，χ₂＝-88.9(20.7％)；χ₁＝-177.3，χ₂＝-95.1(13.8％)；χ₁＝-179.5，χ₂＝87.5(10.3％))被作为进行MD模拟的最初取向。每种构象使用相同数量的蛋白质原子和水分子。

野生型蛋白质和突变蛋白质之间的转化可以利用杂合势能函数V_λ＝(1-λ)V_A+λV_B(Gao，J.等，科学(Science)244：1069(1989)和Tidor，B.等，生物化学 (Biochemistry)30：3217(1991)，本文引用其内容作为参考)获得，其中λ是0和1之间的偶联因子。V_A和V_B分别是Hb A和突变型Hb的势能函数。进行9种λ_i值(λ＝0.1、0.2、…0.9)的模拟，每次使用5-ps平衡后5-ps生成的动态，但是在λ＝0.1和λ＝0.9时使用10-ps平衡。将非键合相互作用在8.5埃缩短为0，并使用介电常数(ε＝1)。所有涉及氢原子的键都用SHAKEJ计算法约束(Ryckaert，J.R.等， (J. Comput.Phys.)23：327(1977)，本文引用其内容作为参考)。一次10ps的模拟在SunSparc工作站10上约需2小时，积分时间为1fs。

利用Kirkwood，J.G.，化学物理学杂志(J.Chem.Phys.)3：300(1935)所述的热动力学积分法，即以下积分方程，由Hb脱氧形式和含氧形式的MD模拟轨迹文件获得模拟的自由能：

ΔG＝G_B-G_A，

ΔG = G_{B} - G_{A}

= {&Integral;}_{0}^{1} {(ΔV)}_{λ} dλ = \underset{I}{Σ} {(ΔV)}_{λ} Δλ

其中ΔV＝V_B-V_A，热动力平均值(△V)_λ表示杂合系统V_λ的平均值。热动力方程的线性形式表明总的模拟自由能可以分解为单独的加合分量。由Gao，J.等，科学 (Science)244：1069(1989)所述的热动力循环可以间接得出突变引起的协同性自由能改变。

为了结构分析的目的，利用Brooks，C.L.等在物理学化学进展(P.Phys. Chem.)90：6680(1986)中所述的势能公式，由最接近的模拟状态(λ＝0.1和λ＝0.9)计算野生型系统(λ＝0)和突变型系统(λ＝1)的一般结构，本文引用其内容作为参考：

X₀＝(Xe^+0.18ΔV)_λ＝0.1/(e^+0.18ΔV)_λ＝0.1和X₁＝(Xe^+0.18ΔV)_λ＝0.9/(e^+0.18ΔV)_λ＝0.9

其中的X代表系统的Cartesian坐标，X₀和X₁模拟平均野生型和突变型坐标，β＝1/K_BT，()_λ是势能V_λ下的总平均数。

B.结果

r Hb(α96Val→Trp)的生物化学特性

如前文所述，如图1所示，由包含质粒pHE202的大肠杆菌JM109经超声处理后获得的表达的r Hb(α96Val→Trp)经Mono S色谱得到两个主峰(a峰和b峰)。首先是对称峰(a峰)然后是两个交叠峰(b₁和b₂)。这些由Mono S色谱得到的峰在后文中称为“a峰”“峰b₁”和“峰b₂”。所有这些CO形式的峰都显示与Hb A一致的可见光谱范围，即350-700nm(没有显示结果)。

如图2所示，如前文所述进行的电喷雾质谱法显示，三个峰的氨基末端甲硫氨酸都被共表达的Met-AP有效切除。对于a峰，至少98％α链的质量为15，213，这是缬氨酸被色氨酸取代后的计算值，多至90％β链的质量为15,867，这是Hb A的β链的计算质量。有一小部分组分(＜10％)其质量(15,998)对应于正常β链加甲硫氨酸残基。但是，对于峰b₁和峰b₂，α链和β链都具有正确的质量，具有非可测(＜2％)的N末端甲硫氨酸。

r Hb(α96Val→Trp)的¹H-NMR研究

i.Hb由CO形式转化到高铁形式，再回复到CO形式

图3展示了经Mono S纯化、来自pHE202/JM1 09的r Hb(α96Val→Trp)CO形式的三个峰与HbCOA的环-流位移¹H共振比较。光谱是利用转化成各自CO形式的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A在pH7.0的0.1M磷酸盐水溶液中的4％溶液在29℃获得的。为了获得图3B的光谱，所有的血红蛋白都被从CO形式转化成Fe⁺³形式，再回复到CO形式。距DSS 0至～0.2ppm处的¹H共振来自Hb分子血红素袋结构附近的氨基酸残基的质子和卟啉的质子(Ho，C.，蛋白质化学进展(Advanc. Protein Chem.)43：153(1992)，本文引用其内容作为参考)。由图3A可见，来自a峰、b₁峰和b₂峰的r HbCO(α96Val→Trp)其环-流位移¹H共振与HbCO A的都有某些不同。而且，在距DSS 0至～1.1ppm范围内还有HbCO A中没有的其它共振和强度变化。但是，a峰在～1.7至～1.8ppm处的共振与Hb A的基本相同，而峰b₁和峰b₂的要宽的多，该处的共振被认为是HbCO A的α和β链上E1 1Val的γ₂-甲基(Lindstrom，T.R.等，生物化学(Biochemistry)11：1677(1972)和Dalvit，C等，生物化学(Biochemistry)24：3398(1985)，本文引用其内容作为参考)。Shen，T.J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：8108(1993)中论述了在大肠杆菌中利用Hb表达质粒pHE2使得血红素正确插入表达的球蛋白中的现象。他们描述了r Hb A一种纯化成份的血红素袋结构通过氧化和还原处理向天然Hb A的血红素结构的转变。同样，本发明也研究了将r Hb(α96Val→Trp)的异常¹H共振转变成血红蛋白天然形式共振的可能性。如前所述，来自三个峰的rHb(α96Val→Trp)首先被氧化成各自的高铁状态，然后还原成各自的CO或含氧形式。如图3B所示，氧化和还原处理后，三个峰的“转变后的Hb”都显示一致的NMR光谱(远端缬氨酸的环境都相同)，这与转变前的a峰r Hb(α96Val→Trp)的(图3A)相似。这表明a峰的r Hb(α96Val→Trp)具有正确的血红素构象和亚基界面。所以，将a峰的r Hb(α96Val→Trp)用于后文中作以研究，除非另作说明。

ii.血红素环境和亚基界面

图4A和图4B的¹H-NMR光谱是a峰的、即来自pHE202/JM109并经Mono S纯化的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A如前所述其脱氧形式在pH7.0的0.1M磷酸盐水溶液中形成的4％溶液的光谱。图4A的光谱是在29℃获得的；图4B的光谱是如图中所示在29℃和36℃获得的。图4A显示邻近的组氨酸残基的超精位移NδH可交换质子共振。在图4A中，～63ppm处的共振是脱氧Hb A的β链上邻近的组氨酸残基(α87His)的超精位移N_δH可交换质子，～77ppm处的共振是脱氧Hb A的β链上对应残基(β92His)(Takahashi，S.等，生物化学(Biochemistry)19：5196(1980)和La Mar，G.N.等，生物化学生理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res. Commun.)96：1172(1980)，本文引用其内容作为参考)。如图4A所示，a峰rHb(α96Val→Trp)的这两个邻近组氨酰基共振的化学位移与Hb A的相同。这表明在r Hb(α96Val→Trp)邻近的组氨酸周围没有微扰。

图4B显示的是a峰r Hb(α96Val→Trp)和Hb A脱氧形式的亚铁超精位移和可交换质子共振。超精位移共振来自血红素基团和邻近氨基酸残基上的质子，是因为质子与血红素铁原子Fe(II)的非配对电子之间的超精相互作用。在29℃，与Hb A的相比，a峰r Hb(α96Val→Trp)在距DSS～22.5和～18.7ppm(与脱氧Hb A的β链缔合的质子)(Takahashi等，1980)周围和距DSS～17ppm周围(与脱氧Hb A的α链缔合的质子)(Takahashi等，1980)的超精位移共振显示某些化学位移的改变。距DSS 11至14ppm范围内的可交换¹H共振被认为是Hb A脱氧四级结构的极好的标志(Ho，C. 蛋白质化学进展(Advanc.Protein Chem.)43：153(1992)，本文引用其内容作为参考)。～14ppm的共振已被认为是α42Tyr和β99Asp之间的亚基间氢键，这是脱氧四级结构(T)的特征性特性(Fung，L.W.M.等，生物化学 (Biochemistry)14：2526(1975)，本文引用其内容作为参考)。如图4B所示，脱氧形式的Hb A和a峰r Hb(α96Val→Trp)在距DSS～14ppm的共振没有明显差异，这表明突变没有干扰脱氧形式的α₁β₂亚基间氢键。

如图4B所示，在29℃，在r Hb(α96Val→Trp)中出现了一个新的距DSS～12.6ppm的共振，这在脱氧Hb A中是没有的。但是，在较高温度(36℃)获取¹H-NMR光谱时，距DSS～12.6ppm的共振发生位移。对温度敏感的化学位移表明，这一新的共振很可能是超精位移共振而不是可交换共振(Jesson，J.P.，化学物理学杂志(J.Chem.Phys.)47：579)1967)；Kurland，R.J.等，核磁共振杂志(J.Megn. Reson.)2：286(1970)；Johnson，M.E.等，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)99：1245(1977)，本文引用其内容作为参考)。

以上结果表明MD模拟可以被成功用于由野生型(Hb A)向突变型Hb(α96Val→Trp)的转化。

iii.不改变连接状态的四级结构转换

r Hb(α96Val→Trp)的CO形式在10mM肌醇六磷酸(IHP)(Sigma)存在下的可交换质子共振与Hb A的相比表现出某些非常有趣而独特的性质。获得的是在300MHz，和10mM IHP存在下，来自pHE202/JM109 a峰的r HbCO(α96Val→Trp)和HbCO A在pH7.0的0.1M磷酸盐水溶液中形成的4％的¹H-NMR光谱。光谱是在10、21、29和36℃获得的。图5A和5B分别展示r HbCO(α96Val→Trp)和HbCO A的可交换质子共振。图5C和5D分别展示r HbCO(α96Val→Trp)和HbCOA的环-流位移共振。

在29℃和IHP存在下，在r HbCO(α96Val→Trp)的¹H-NMR光谱(图5A)中，含氧四级(R)结构特征性的距DSS～10.7ppm的共振(α94Asp和β102Asn之间的亚基间氢键)(Fung，L.W.-M.等，生物化学(Biochemistry)14：2526(1975)；Shaana，B.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)171：31(1983)，本文引用其内容作为参考)消失。取而代之的是，与HbCO A(图5B)相比，图5A显示有一个脱氧四级(T)结构特征性距DSS～14ppm的共振(α42Tyr和β99Asp之间的亚基间氢键)(Fung，.等， 1975；分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)175：159(1984)，本文引用其内容作为参考)。

如后文所述，根据图5，强效别构剂IHP的存在似乎能稳定r Hb(α96Val→Trp)的脱氧形式，由此能够使得平衡向脱氧形式移动。在IHP存在下，尤其在低温下，α₁β₂和α₂β₁亚基界面内新的氢键的存在能够增加额外的稳定性，使得四级结构更容易向脱氧四级结构转变。

图5A中，随着温度从29℃降至10℃，r Hb(α96Val→Trp)光谱中距DSS～14ppm共振的强度逐渐加强。在36℃，距DSS～14ppm的共振消失，而出现成为肩峰的含氧四级(R)结构的特征性距DSS～10.7ppm共振。10℃时～14ppm共振的相对强度与r Hb(α96Val→Trp)可交换共振的相近。这一距DSS～14ppm共振的化学位移不随温度而改变，这表明该共振的起源是可交换的而不是超精位移的。距DSS～14ppm共振的出现并不伴随从～11ppm至～24ppm超精位移共振的出现，这表明血红素铁离子仍然处于低旋、反磁状态(即配体结合形式)。脱氧(T-)和含氧(R-)四级结构特征性共振其强度随温度的改变是可逆的。

图5B显示与图5A中r HbCO(α96Val→Trp)的观察相反，在10mM IHP存在下，HbCO A的可交换质子共振随温度改变只有很小的变化。即使在10℃，HbCOA在～14ppm只有一个很弱的信号，与r HbCO(α96Val→Trp)的相比，在强度上大不相同。在中温区，例如21和29℃，在10mM IHP存在下，r HbCO(α96Val→Trp)的可交换质子共振显示含氧四级结构特征性的～10.7ppm共振基本消失，而脱氧四级结构特征性的～14ppm共振强度很弱。这些结果显示，可能存在一种中间四级结构，它失去一个α94Asp和β102Asn之间的氢键，这可以由～10.7ppm的共振证明，但尚未形成α42Asp和β99Asp之间的氢键，这可以由～14ppm的共振证明。添加强效别构剂，和/或降低温度，可以将本发明的r HbCO(α96Val→Trp)逐渐转变成脱氧样四级结构，但不改变其连接状态。

如图5C和5D所示，还在不同的温度比较了CO形式的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A在10mM IHP存在下的环-流位移质子共振。随着温度的改变，r Hb(α96Val→Trp)在距DSS 0至-1.1ppm共振的相对强度和化学位移发生很大改变，而Hb A的变化很小。在低温下，r Hb(α96Val→Trp)和Hb A两者CO形式的被认为是HbCO A的α和β链上E11Val(远端的缬氨酸)的γ₂-甲基的距DSS-1.7至-1.8ppm的共振(Lirdstrom，T.R.等，生物化学(Biochemistry)11：1677(1972)；Dalvit，C.等，生物化学(Biochemistry)24：3398(1985)，本文引用其内容作为参考)合并成一个峰。r Hb(α96Val→Trp)距DSS-11.7ppm至-1.8ppm的共振比Hb A的宽得多。据信，r Hb(α96Val→Trp)距DSS 0至-1.1ppm区域内共振相对强度和化学位移的变化和-11.7ppm至-1.8ppm共振的变宽可能反应了Hb A中没有的结构转变。

还获取了在300MHz和没有任何IHP存在下，a峰的r HbCO(α96Val→Trp)和HbCO A在pH7.0的1.0M磷酸盐水溶液中形成的4％溶液的¹H-NMR光谱。在图6A和6B中比较了在不同温度下、无IHP存在下获得的CO形式的rHb(α96Val→Trp)和Hb A的可交换质子共振光谱。随着温度的降低，没有IHP时，r Hb(α96Val→Trp)中出现距DSS～14ppm的共振，但是Hb A即使在10℃也没有距DSS～14ppm的共振。图6C和图6D显示无IHP存在下r Hb(α96Val→Trp)和HbCO A都有环-流位移共振。这些图同样显示出依赖于温度的光谱改变。

r HbCO(α96Val→Trp)在距DSS 0至-1.1ppm范围内共振的相对强度和化学位移被发现随温度变化很大，而HbCO A的只有很小的变化。r HbCO(α96Val→Trp)在低温下有脱氧四级结构特征性距DSS～14ppm可交换共振，以及在距DSS 0至-1.1ppm环-流位移区共振的相对强度和化学位移改变(图6C和6D)表明，即使没有IHP，也发生了脱氧四级结构转变。

r Hb(α96Val→Trp)的氧结合特性

将来自pHE202/JM109的三个r HbCO₂(α96Val→Trp)峰(a峰，峰b₁和b₂)的Hb在pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液中形成的0.1mM溶液上样在Sephadex-75色谱柱上。都在对应于HbO₂ A的位置洗出一对称峰，表明三种形式的含氧rHb(α96Val→Trp)在本实验条件下都是四聚体(没有显示结果)。

如前文所述，研究了作为pH函数的峰a、b₁和b₂的r Hb(α96Val→Trp)的氧结合特性。简而言之，在29℃，在pH6.3至8.9，获取各种Hb在0.1M磷酸钠缓冲液中形成的0.1mM溶液的氧解离数据。由各曲线确定50％饱和度时的氧分压(P₅₀)。图7A的数据来自pHE202/JM109产生的、经Mono S纯化的组分，pHE202/JM1 09产生的峰a、b₁和b₂和Hb A。图7B的数据来自如前所述由各自的CO形式转换成Fe⁺³形式再回复到CO形式的pHE202/JM109产生的、经MonoS纯化的组分，pHE202/JM109产生的峰a、b₁和b₂和Hb A。在两图中，Hb A是(○)；峰a的r Hb(α96Val→Trp)是(■)；峰b₁的r Hb(α96Val→Trp)是(△)，和峰b₂的r Hb(α96Val→Trp)是(+)。如图7A和7B所示，在氧化和还原处理前，峰b₁和b₂的r Hb(α96Val→Trp)显示与Hb A相近的P₅₀值(50％饱和度时的氧分压)，但是，峰a的r Hb(α96Val→Trp)和“转换过的”峰b₁和b₂的r Hb(α96Val→Trp)表现出低得多的氧亲和力。

测定pHE202/JM109产生的、Mono S纯化的峰a、b₁和b₂的rHb(α96Val→Trp)和Hb A各自非修饰形式和由各自的CO形式转换成Fe⁺³形式再回复到CO形式的希尔系数(n_maw)。如前所述获取氧解离数据。简而言之，在29℃，用Hb在pH6.5至8.4的0.1M磷酸钠液中形成的0.1mM溶液获取各Hb样品的数据。由各曲线确定希尔系数。图8A显示各种非修饰血红蛋白的数据；图8B显示由各自的CO形式转换成Fe⁺³形式再回复到CO形式的血红蛋白的数据。在两图中，Hb A是(○)；峰a的r Hb(α96Val→Trp)是(■)；峰b₁的r Hb(α96Val→Trp)是(△)，和峰b₂的r Hb(α96Val→Trp)是(+)。

图8A和图8B显示，峰a的r Hb(α96Val→Trp)和“转换过的”Hb表现出Hb A波尔效应(△logP₅₀/△pH)的约90％，而且，比之Hb A的约3，表现出pH依赖性n_max约2.2至2.6的协同性。

以下表1比较了pHE202/JM109产生的a峰的r Hb(α96Val→Trp)、r Hb A(根据Shen，T.-J.等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：81080(1993)所述在自己的实验室中制备的)，Hb A和有5mM 2，3-DPG存在下的Hb A的P₅₀和n_max。峰a的r Hb(α96Val→Trp))显示与有2，3-DPG存在时的Hb A相似的氧结合特性。所以，据信，由于r Hb(α96Val→Trp)独特的结构，即使在没有别构剂存在下，它仍然具有与有别构剂存在下的Hb A近似的特性。

表1

a峰的r Hb(α96Val→Trp)	r Hb A	Hb A	Hb A+2，3-DPG
a峰的r Hb(α96Val→Trp)	r Hb A	Hb A	Hb A+2，3-DPG	pH P₅₀ n_max(mmHg)	P₅₀ n_max(mmHg)	P₅₀ n_max(mmHg)	P₅₀ n_max ^*(mmHg)
6.5 26.6 2.46.8 22.0 2.57.4 11.6 2.68.0 5.6 2.4	19.8 3.017.3 2.97.3 2.93.6 2.9	20.0 3.016.5 3.08.0 3.03.5 3.0	26.3 2.723.4 2.811.1 2.93.8 2.7	pH P₅₀ n_max(mmHg)	P₅₀ n_max(mmHg)	P₅₀ n_max(mmHg)	P₅₀ n_max ^*(mmHg)
6.5 26.6 2.46.8 22.0 2.57.4 11.6 2.68.0 5.6 2.4	19.8 3.017.3 2.97.3 2.93.6 2.9	20.0 3.016.5 3.08.0 3.03.5 3.0	26.3 2.723.4 2.811.1 2.93.8 2.7	^*实验误差：±10％

在29℃，还获取了以下血红蛋白样品在pH7.4，0.1M磷酸钠缓冲液中形成的0.1mM溶液的氧解离数据。测定了Hb A、r Hb(α96Val→Trp)(pHE202/JM109)、有2mM 2，3-DPG存在下的r Hb(α96Val→Trp)和有2mM IHP存在下的r Hb(α96Val→Trp)的曲线。实验结果如图9所示。除了低氧亲和力和高协同性，a峰的r Hb(α96Val→Trp)还显示出特有的氧结合特性。在很低的氧压力下，a峰的r Hb(α96Val→Trp)在别构剂例如2，3-DPG存在下的氧结合表现为双相曲线。

图10A和10B分别比较了温度对a峰的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A的氧亲和力(P₅₀)和希尔系数(n_max)的影响。

用各种Hb样品在pH7.4的0.1M磷酸钠缓冲液中形成的0.1mM溶液获取各自的氧解离数据。温度为16、20、25、29和37℃。由各曲线测定P₅₀和希尔系数(n_max)。获得的是以下样品的数据：Hb A(○)；a峰的r Hb(α96Val→Trp)(pHE202/JM109)(△)；2mM IHP存在下的r Hb(α96Val→Trp)(+)；2mM IHP(+)存在下的Hb A(□)。图10A显示的是氧亲和力(P₅₀)；图10B显示的是希尔系数(n_max)。

如图10A所示，不论有没有IHP存在，r Hb(α96Val→Trp)和Hb A的氧亲和力都随温度的降低而显著升高。但是，图10B显示r Hb(α96Val→Trp)和Hb A的希尔系数(n_max)并不随温度发生很大的改变。在15至37℃的温度范围内，rHb(α96Val→Trp)和Hb A都表现出约n_max2.0至2.9的协同性。

B.质粒pHE702

表达质粒pHE702的构建

按照已公开的方法(Kunkel，T.M.1985) 美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)82：488-492；Shen，T.-J.等，1993 美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)90：8108)用寡核苷酸 5’-AGCTTGAAGTT CCATGGGTCCACCC-3’(DNAInternational，Inc.，Lake Oswego，OR)在质粒pHE7中引入相似的α96Val→Trp突变，形成质粒pHE702。

质粒pH7是表达人α-和β-cDNA和大肠杆菌的Met-AP基因的质粒。与前文的pHE2一样，它包含两个以相同取向串联排列的表达盒：(i)tac启动子-大肠杆菌Met-AP编码序列-5ST1T2终止子和(ii)tac启动子-α-球蛋白cDNA编码序列-β-球蛋白cDNA编码序列-5ST1T2终止子。

用先前构建质粒pHE2的方法构建质粒pHE702，所不同的是：(1)用人α-球蛋白cDNA取代合成的人α-球蛋白基因；(2)用人β-球蛋白cDNA取代合成的人β-球蛋白基因；(3)直接从大肠杆菌基因组DNA获取大肠杆菌Met-AP编码序列，而不是从质粒pSYC1174获得。

以pKT218-αc(Yale University的B.G.Forget提供)为模板，使用两个合成引物5’-GAGAACCCCATATGGTGCTGTCTCCTGCC-3’和

5’-CCGAGGCACTAGTTTAACGGTATTTGGAGGTC-3’(都由DNAInternational，Inc.提供)通过PCR获取人α-球蛋白cDNA编码序列，两引物与人α-球蛋白cDNA的5’端和3’端互补并分别含有NdeI位点和SpeI位点。

以按照Groebe，等在蛋白质的表达和纯化(Protein Expression and Purification)3：134(1992)中所述方法构建的pβ为模板，使用两个合成引物

5’-CAAACAGACCATATGG TGCACCTGACTCCTGAGGAG-3’和

5’-AGCAAGAATGCATGCTTAGTGATACTTGTGGGCCAGG-3’(都由DNAInternational，Inc.提供)通过PCR获取人β-球蛋白cDNA编码序列，两引物与人β-球蛋白cDNA的5’端和3’端互补并分别含有NdeI位点和NsiI位点。

以大肠杆菌基因组DNA为模板，使用两个合成引物

5’-TGGACAGAATTCCATGGCATTCTCAATCA-3’和

5’-TGGCTTAAGCTTATTCGTCGTGCGAG-3’(都由 DNA SynthesizingFacility，University of Pittsburgh提供)通过PCR获取大肠杆菌Met-AP基因的编码序列，两引物与大肠杆菌Met-AP基因的5’端和3’端互补并分别含有EcoRI位点和HindIII位点。存在于宿主大肠杆菌JM109中的质粒pHE702，标识为pHE702/JM109，于1995年4月26日保藏在Rockville MD的美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC69793。

由质粒pHE202和pHE702产生的r Hb(α96Val→Trp)的比较含有pHE702的大肠杆菌JM109的生长条件与前述用于含有pHE202的相同。pHE702产生的r Hb(α96Val→Trp)的得率是用前述pHE202产生的rHb(α96Val→Trp)的50％。如前所述，pHE702是用人基因构建的，所以宜使用其它的表达系统。经Mono S色谱后，pHE702产生的r Hb(α96Val→Trp)洗脱图形出现两个峰，标记为峰1和峰2(未显示结果)。同样，以相同方式对pHE702产生的血红蛋白的进行了对pHE202产生的r Hb(α96Val→Trp)的全部分析。

对pHE202和pHE702这两种不同质粒产生的低氧亲和力r Hb(α96Val→Trp)的功能和结构特性进行了比较。前文已详细描述了pHE202产生的rHb(α96Val→Trp)。如前所述将pHE202和pHE702产生的r Hb(α96Val→Trp)氧化还原，然后在29℃在pH6.8和7.4的0.1M磷酸钠缓冲液中测定他们的P₅₀和n_max，并与Hb A的比较。以下表2概括了pH6.8和pH7.4时，Hb A、pHE202产生的r Hb(α96Val→Trp)和pHE702产生的r Hb(α96Val→Trp)的氧结合特性。显然，两种质粒产生的r Hb(α96Val→Trp)表现出基本相同的功能特性。

表2

P₅₀(mmHg)^* n_max ^*

pH pH

6.8 7.4 6.8 7.4

Hb/A 17.2 8.0 3.1 3.0

pHE202产生的 20.6 11.2 2.4 2.6

r Hb(α96Val→Trp)(峰b₂)

pHE702产生的 22.8 11.7 2.4 2.8

r Hb(α96Val→Trp)(峰b₂)

^*实验误差：±10％

图11显示如前所述，在29℃、pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液中进行的Hb A和pHE202以及pHE702产生的r Hb(α96Val→Trp)CO形式的的¹H-NMR光谱。图11A显示的是Hb A和pHE202以及pHE702产生的r Hb(α96Val→Trp)CO形式的可交换质子共振，图11B显示的是环-流位移质子共振。两组¹H-NMR结果都显示两种r Hb(α96Val→Trp)的¹H-NMR光谱没有可检知的差异。所以，可以推定，pHE202和pHE702产生的r Hb(α96Val→Trp)之间没有可检知的结构或功能差异。

C.MD模拟

脱氧Hb A晶体结构中两个α96Val残基的Cα之间的距离为10.3埃(Fermi，G.等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)175：159(1984)，本文引用其内容作为参考)。rHb(α96Val→Trp)α96位置上的色氨酸残基大小会使人预计r Hb(α96Val→Trp)的稳定性将高度依赖于色氨酸残基侧链的角取向。最初脱氧型的计算机模拟显示，在旋转异构体文库中机率大于10％的四种色氨酸侧链角中，只有侧链角χ₁＝64.8和χ₂＝-88.9(20.7％)的色氨酸具有稳定的构象。其它三种色氨酸构象都直接相互对正，具有不利的非结合相互作用。

对全部4种可能的色氨酸残基角度进行了Hb野生型和突变型之间的转变。以下表3概括了脱氧型显示平均模拟结构中两条α链上Nε₁Trp96残基之间的距离和每个α96Trp残基的侧链角。

表3

旋转异构体文库^* α₁96Trp α₂96Trp 距离

χ₁ χ₂ χ₁ χ₂ χ₁ χ₂ Nε₁(α₁)-

(度) (度) (度) (度) (度) (度) Nε₁(α₂)

(埃)

-70.4±7.0 100.5±18.2 -63.3 -176.3 -88.5 128.9 7.7

(37.9％)

64.8±13.0 -88.9±5.3 92.3 -71.0 96.2 -78.7 17.3

(20.7％)

-177.3±7.9 -95.1±7.6 -86.5 89.9 -174.2 -116.3 10.2

(13.8％)

-179.5±3.4 87.5±3.8 -118.0 89.5 -177.1 71.8 5.6

(10.3％)

^*Ponder，J.W.等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)193：775(1987)

只有来自最初的色氨酸侧链角χ₁＝64.8和χ₂＝-88.9的模拟结构显示两个α96Trp具有相对对称的构象。在这种构象中，较好的保存了两个α96Trp的侧链角，两个α96Trp残基的Nε₁之间的距离表明两个α96Trp残基充分分开而不至于相互影响。这些结果表明色氨酸侧链角χ₁＝64.8和χ₂＝-88.9最接近于天然构象。

所以，为了简化模拟的自由能分析，计算协同性的自由能时，只用在定中心于r Hb脱氧和含氧形式晶体结构中β99Asp的Cβ的质心坐标的球区上χ₁＝64.8和χ₂＝-88.9的侧链角进行模拟。该球区只包括一个用于计算的α96Trp。

脱氧形式的Hb A和r Hb(α96Val→Trp)的一般模拟结构由分子图形程序，GRAPHX生成，该程序是Pittsburgh Supercomputing Certer，Pittsburgh，PA开发的。以上侧链角的一般模拟结构表明除了已有的β99Asp与α42Tyr之间和β99Asp与α97Asn之间的氢键之外，还有新的α96Trp和β99Asp之间的界面间氢键。脱氧形式的转化的突变型Hb(α96Val→Trp)的100-ps MD表明α₁β₂亚基界面内的这些氢键十分稳定，即β99Asp与α42Tyr之间的平均模拟距离约为2.25±0.19埃和2.32±0.22埃，β99Asp与α97Asn之间的约为2..22±0.34埃。

虽然没有有关r Hb(α96Val→Trp)协同性自由能的实验测得值，但是rHb(α96Val→Trp)的希尔系数相对较高(pH7.4时，n_max＝2.6)，这与Hb A的十分相近，这表明r Hb(α96Val→Trp)的协同性自由能与Hb A的相近。如以下表4所示，r Hb(α96Val→Trp)和Hb A之间协同性自由能差异的计算值是每个界面-1.5kcal/mol，大致符合对于协同性略低于Hb A的Hb的估计值(Turner，G.J.等，蛋白质(Protein)14：333(1992)，本文引用其内容作为参考)。

表4

有贡献成份 ΔG(脱氧) ΔG(含氧) ΔΔG

(kcal/摩尔)

溶剂 0.3 -5.0 -5.3

蛋白质

α94Asp -0.8 -1.3 -0.5

α97Asn -1.9 -0.7 1.2

β99Asp -12.2 2.6 14.8

β101Glu 0.1 -0.8 -0.9

β102Asn 0.5 -0.8 -1.3

自身(α96Val→Trp) -24.9 -32.0 -7.8

总值 -24.9 -39.1 -1.5

以上值都是一个α₁β₂界面的。只列出了贡献大于0.5kcal脱氧或含氧形式的残基。ΔG的正号表示使r Hb(α96Val→Trp)不如Hb A稳定。ΔΔG等于ΔG(含氧)-ΔG(脱氧)，即r Hb(α96Val→Trp)和Hb A之间的协同性自由能差异。

这样，MD模拟的结果被很好地用于获取有关对总的协同性自由能有贡献的特定相互作用的信息。表4还列出了每个氨基酸残基对总的协同性自由能的贡献。大多数氨基酸的贡献小于1.0kcal，这表明在α₁β₂界面引入色氨酸不会引起大的构象改变。对总的协同性自由能最大的贡献来自于与β99Asp的相互作用(14.8kcal)，这很可能是由于脱氧结构的稳定化作用(-12.2kcal)。以上结果表明，可能是新的α96Trp和β99Asp之间的氢键引起了r Hb脱氧结构的稳定化作用。

本发明的r Hb(α96Val→Trp)可以在用作代血制品或治疗剂之前进行交联，以防该分子解离成二聚体。虽然，实际上所有红细胞中的血红蛋白都是四聚体状态的，但是在例如代血制品中循环的无细胞血红蛋白会解离成二聚体，其程度可堵塞肾小球，以及输入的四聚体血红蛋白被连续排出循环。血红蛋白必须进行交联以防止这种解离清除作用。

血红蛋白可以在α链之间交联，例如利用二异氰硫基苯磺酸盐，在四聚体的内部交联，例如利用吡多醛及其衍生物和酰基的磷酸酯。参见Winslow，R.M.，等编辑，代血制品效用的生理学基础(Blood Substitutes Physiological Basis of Efficacy)(Birkhauser，Boston，MA)pp.82-84(1995)，本文引用其内容作为参考。同时参见，Winslow，R.M.，以血红蛋白为基础的红细胞取代物(Hemoglobin-Based Red Cell Substitutes)(Johns Hopkins University Press，Baltimore，MD)(1992)；Manning.L.R.等，生物化学(Biochemistry)27：6640(1988)；Benesch，R.E等，生物化学生理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)156：9(1988)；Bucci，E.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：6191(1989)；Chang，T.M.S等编辑，国际代血制品会议第二次会议(Proceeding II of International Symposium on Blood Substitutes)，(Biomater.Artif.Cells Artif.Organs)(1988)；Kluger，R.等，生物化学(Biochemistry)31：7551(1992)；和DeVenuto，F等， (Surg.Gynecol.Obster.)155：342(1982)，本文引用其内容作为参考。

纯化的，正确交联的r Hb(α96Val→Trp)然后可以被加入以血红蛋白为基础的代血制品中，根据本领域已知的方法，这种代血制品是在生理学上被认可的。参见，R.M.Winslow等编辑的代血制品效用的生理学基础(Blood Substitutes Physiological Basis ofEfficacy)(Birkhauser，Boston，MA)pp.82-84(1995)，本文引用其内容作为参考。

虽然为了说明已经对本发明进行了详细的描述，但是应该理解的是，所有的具体细节都是为了说明，本发明技术人员将可以在本发明的范围内进行某些改动，本发明的范围和精神仅受权利要求的限制。

序列表

(1)一般信息

(i)申请人：Ho，Chien

Kim，Hyun-Won

Shen，Tong-Jian

(ii)发明名称：低氧亲和力突变型血红蛋白

(iii)序列数目：8

(iv)通讯地址：

(A)收信人：Carnegie Mellon University

(B)街道：4400 Forbes大道

(C)城市：Pittsburgh

(D)州：PA

(E)国家：USA

(F)邮编：15213

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：5-1/4低密度盘

(B)计算机：IBM PC机或兼容机

(C)操作系统：MS-DOS

(E)软件：ASCII

(vi)本申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日期：30-04-96

(C)分类：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US08/432,071

(B)申请日期：01-05-95

(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：Mary-Elizabeth Buckles

(B)登记号：31，907

(C)参考/案卷号：95-243PCT

(ix)通讯信息：

(A)电话：202/414-9200

(B)传真：202/414-9299

(C)电传：64711

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成DNA

(x)公开信息：

(A)作者：Hyun-Won Kim

Tong-Jian Shen

Dazhen Philip Sun

Nancy T.Ho

Marcella Madrid

Chien Ho

(B)名称：新的低氧亲和力重组血红蛋白(α96Val→Trp)：转换四级结构不改变其连接状态

(C)刊物：分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)

(D)卷号：248

(E)期号：4

(F)页数：867-882

(G)日期：00-05-95

(K)SEQ ID NO：1中的有关残基：1至21

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

TTTGAAGTTC CATGGATCAA C 21

(3)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

AGCTTGAAGT TCCATGGGTC CACCC

25

(4)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：29核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GAGAACCCCA TATGGTGCTG TCTCCTGCC

29

(5)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：32核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

CCGAGGCACT AGTTTAACGG TATTTGGAGG TC 32

(6)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：36核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

CAAACAGACC ATATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGAG 36

(7)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：37核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

AGCAAGAATG CATGCTTAGT GATACTTGTG GGCCAGG

37

(8)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：29核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

TGGACAGAAT TCCATGGCTA TCTCAATCA

29

(9)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26核苷酸

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

TGGCTTAAGC TTATTCGTCG TGCAG 26

Claims

1.一种非天然存在的突变型人血红蛋白，其中α链96位上的缬氨酸残基被色氨酸残基取代。

2.根据权利要求1所述的血红蛋白，它具有比正常人成人血红蛋白低的氧亲和力。

3.根据权利要求2所述的血红蛋白，它具有高的氧结合协同性。

4.根据权利要求3所述的血红蛋白，它是利用重组技术产生的。

5.如权利要求1所述的血红蛋白，它是重组血红蛋白r Hb(α96Val→Trp)。

6.如权利要求1所述的血红蛋白，在别构剂2，3-DPG存在下，以表征氧亲合力的P₅₀和表征协同性的希尔系数n_max所反应的其氧结合特性与人正常成人血红蛋白具有如下相当性：pH6.5时的P₅₀为26.6，n_max为2.4；pH6.8时的P₅₀为22.0，n_max为2.5；pH7.4时的P₅₀为11.6，n_max为2.6；pH8.0时的P₅₀为5.6，n_max为2.4。

7.如权利要求5所述的血红蛋白，它是由用质粒pHE202转化的细胞产生的。

8.如权利要求5所述的血红蛋白，它是由用质粒pHE702转化的细胞产生的。

9.权利要求1所述非天然存在的突变型人血红蛋白作为制备用在代血中用于手术，创伤治疗和输血的药物的用途。

10.一种重组DNA表达质粒，它包含在各自tac启动子调控下的、串联的可表达的人α-和β-球蛋白基因和大肠杆菌的Met-AP基因，其中所述的α-球蛋白基因包含一个突变，该突变使得表达出的蛋白质中α链上96位的缬氨酸残基被色氨酸残基取代，所述序列分别表达所述的人α-和β-球蛋白基因以及Met-AP基因，并且结合血红素以形成权利要求1所述的血红蛋白。

11.一种产生人造血红蛋白的方法，它包括：

将权利要求10所述的表达质粒引入除红细胞之外的合适的宿主细胞中，培养转化后的细胞；

表达所述的DNA，产生所述的人造血红蛋白；

回收和纯化所述的血红蛋白。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的质粒是pHE202。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述的质粒是pHE702。

15.一种无毒的药物组合物，它包含在药学上认可的载体内的非天然突变型血红蛋白，该突变型血红蛋白，其α链上96位的缬氨酸残基被色氨酸残基取代。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述的无细胞环境中的血红蛋白具有比人正常成人血红蛋白低的氧亲和力。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中的血红蛋白是r Hb(α96Val→Trp)。

18.质粒pHE202。

19.质粒pHE702。