CN1161465C - 用于将选择的物质转运到细胞中的嵌合蛋白 - Google Patents

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Abstract

可用于将存在于诸如血液、淋巴液的胞外液中的选择物质转运到细胞里的嵌合蛋白；用所述嵌合蛋白定量分析选择的物质；编码所述嵌合蛋白的DNA；含有编码所述嵌合蛋白的DNA的质粒；被修饰成含有编码所述嵌合蛋白的DNA的哺乳动物细胞，该细胞表达并选择性地分泌所述嵌合蛋白；生产所述嵌合蛋白的方法；分离所述嵌合蛋白的方法；用所述嵌合蛋白分析选择的物质的方法；通过给药所述嵌合蛋白降低所选择物质的胞外水平的方法，该嵌合蛋白能将所选择的物质转运至细胞中。

Description

用于将选择的物质转运到 细胞中的嵌合蛋白
本申请是美国专利申请序列号08/470,058的继续，所述申请的申请日为1995年6月6日，题为“用于将选择的物质转运到细胞中的嵌合蛋白”，发明人为Michael W.Heartlein，Jeffrey F.，Lemontt和Michael F.Concino，该申请所披露的全部内容收入本文作为参考资料。
跨越细胞膜的分子转运是在细胞水平和整个生物体水平调节体内稳态的生理机制的一个重要部分。直接或间接用于组成细胞成份的分子通常是通过特异细胞表面受体的作用由胞外液转运到细胞中，所述受体结与所选择的物质结合并介导其吸收到特定类型的细胞中。很多影响细胞活性的激素、酶、和药物也是由特异细胞表面受体转运到细胞中的。另外，由体内产生(即：通过正常或缺陷型代谢途径产生)或通过内吞或暴露而摄入的毒性分子能被某些细胞摄取，并汇集或代谢。从生理上讲，从诸如血液或淋巴液的胞外液中清除内源产生的物质和外源物质通常是有益的。然而，在许多场合，若清除受到妨碍，或以比需要的程度低的程度进行，就会发病。一个例子是LDL胆固醇-一种天然物质，如果其含量异常高就必需以受控制的速度清除，从而避免其所带来的副作用。人类的高胆固醇血症，是一种以总血清胆固醇含量升高为特征的疾病。它通常是由于低密度脂蛋白(LDL)胆固醇过量或高密度脂蛋白(HDL)胆固醇缺乏所致，而且，通常会引起动脉粥样硬化和冠状动脉病。LDL可在血液中由肝脏所产生的载脂蛋白不断生成。为了保持其稳态水平，将LDL以与其生成速度相同的速度从血液中清除。如果LDL清除受到防碍，LDL的血液水平升高，其较大的危害是动脉粥样硬化。考虑到患者中有一半以上会死亡，在美国粥样动脉硬化是最主要的死亡原因。(Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，Ed.J.D.Wilson等，第12版，P995，McGraw-Hill，New York，1991)。
LDL颗粒携带大约60-70％的全血清胆固醇。LDL是大型球形颗粒，有一个由大约1500个胆固醇分子组成的油性核心，每个胆固醇分子通过酯键与一个长链脂肪酸连接。在所述核心外面有一层以下述方式排列的磷脂和未酯化的胆固醇分子：磷酯的亲水性头部在外侧，从而使得LDL可溶于血液或胞间液中。每一LDL颗粒含有一个载脂蛋白B-100(ApoB-100)分子-一种包埋于LDL亲水层中的大型蛋白分子。ApoB-100能由存在于细胞表面的LDL受体识别并结合。结合于LDL受体的LDL被带入细胞，在细胞中二者分离。LDL受体返回细胞表面，而LDL被送入溶酶体。在溶酶体中，LDL被加工，以释出未酯化的胆固醇。释出的胆固醇被掺入所有细胞的新合成的细胞膜中，并在特化细胞中被用于其它目的(例如，类固醇激素合成，胆汁酸生成)。
在很大程度上，血清LDL的稳态浓度是通过功能性肝LDL受体(LDLRs)的数量确定的，该受体在清除循环的LDL中起着关键作用(Brown，M.S.和Goldstein，J.L.，“科学”(Science)，232：34-47(1986))。患有家族性高胆固醇血症(FH)的个体在引起缺陷型LDLRs的突变方面是杂合的或纯合的，结果，这类个体具有过量的血清LDL。具有高血清LDL水平的其他个体可能带有渗漏性或以前未鉴定的LDLR突变，或者由于大量摄入食物脂肪而产生过多的LDL。FH和非-FH患者具有高的患心血管病的危险，能够从基于增进LDL代谢的治疗中获益，LDL代谢的增进是细胞吸收增加的结果。
因此，有必要研究增进细胞对选择的物质的吸收的方法。如上所述，所述物质可以用于分解代谢，或用于影响胞内过程，因此被视为调节剂。因此，通过将能够改变特殊的胞内过程的新的调节剂导入受体细胞，可以改变细胞活性。例如，通过将合适的调节剂导入细胞，可以改变细胞的蛋白磷酸化方式、特异细胞基因的表达、及细胞生长特性。所述调节剂可以是具有酶促活性的蛋白或是与特异细胞目标结合的蛋白，所述目标可以是核酸、蛋白、糖类，脂类或糖脂。
细胞表面受体提供了一种将选择的物质导入细胞的途径。该受体的天然配体可以是嵌合蛋白的一部分，其中，配体结构域功能性地连接于蛋白的某一结构域上，后者能在细胞内产生想要的作用，并可进行体内治疗。或者，所述蛋白结构域结合于待从胞外液中清除选择的物质上，用于分解代谢或其它代谢加工。
本发明涉及一种嵌合蛋白，包括一个功能域和一个载体域，其中：
所述功能域包含选自下列的第一受体的配体结合域：低密度脂蛋白受体(LDLR)，乙酰化低密度脂蛋白受体，肿瘤坏死因子α受体，转化生长因子β受体，细胞因子受体，免疫球蛋白Fc受体，激素受体，葡萄糖受体，糖脂受体和糖胺聚糖受体；并且
所述载体域包括与除第一受体之外的哺乳动物细胞表面受体结合的氨基酸序列，其中(a)所述氨基酸序列来自除所述第一受体以外的蛋白，且(b)所述哺乳动物细胞表面受体选自低密度脂蛋白受体(LDLR)，运铁蛋白受体，脱唾液酸糖蛋白受体，腺病毒受体，逆转录病毒受体，CD4，脂蛋白(a)受体，LDLR样蛋白受体(LRP)，乙酰化LDL受体，甘露糖受体和甘露糖-6-磷酸酯受体。
在一个实施方案中，所述功能域包括与LDL胆固醇结合的哺乳动物低密度脂蛋白受体的配体结合域，并且所述载体域包括与除LDL胆固醇受体之外的哺乳动物细胞表面受体结合的氨基酸序列。优选其中的哺乳动物细胞表面受体是人运铁蛋白受体并且所述载体域包含运铁蛋白序列或其一部分。
本发明还涉及一种DNA，其编码本发明的上述嵌合蛋白。
本发明还涉及一种遗传修饰的哺乳动物细胞，其表达本发明的DNA。在一个实施方案中，所述细胞选自人成纤维细胞，人角质形成细胞；人上皮细胞，人卵巢细胞，人肉皮细胞，人胶质细胞，人神经细胞，血液的组成部分，人肌细胞，人肝细胞和这些人细胞类型的前体。在另一实施方案中，所述细胞为无限增殖化细胞。优选所述细胞为原代细胞或继代细胞。
本发明还涉及一种将低密度脂蛋白转运到人细胞中的方法，包括将低密度脂蛋白与本发明的嵌合蛋白、以及一种人类细胞混合，所述混合在以下条件中进行，所述条件适于低密度脂蛋白结合该嵌合蛋白的功能域，也适于该嵌合蛋白的载体域结合人类细胞表面的受体，导致该嵌合蛋白与低密度脂蛋白形成复合体，并通过胞吞作用将该复合体转运到所述细胞中。在一个具体实施方案中，所述人细胞表面受体选自人运铁蛋白受体，人血清白蛋白受体，人脱唾液酸糖蛋白受体，人腺病毒受体，人逆转录病毒受体，人CD4，人脂蛋白(a)受体，人免疫球蛋白Fc受体，人甲胎蛋白受体，人LDLR样蛋白(LRP)受体，人乙酰化LDL受体，人甘露糖受体和人甘露糖-6-磷酸酯受体。在另一实施方案中，所述载体域包括与人细胞表面运铁蛋白受体结合的人运铁蛋白的氨基酸序列。
本发明还涉及本发明的嵌合蛋白在制备用于降低个体的血流中低密度脂蛋白含量的药物组合物的用途，其中，该个体的血流中的低密度脂蛋白结合所述嵌合蛋白的功能域，而该嵌合蛋白的载体域结合该人细胞表面受体，以便将结合有低密度脂蛋白的嵌合蛋白转运到具有人细胞表面受体的细胞中，从而降低个体的血流中低密度脂蛋白的含量。
本发明还涉及一种药物组合物，其含有本发明的嵌合蛋白。
本发明还涉及一种药物组合物，其含有本发明的遗传修饰的细胞。
本发明还涉及一种用于将选定的物质引入哺乳动物细胞的本发明的嵌合蛋白。
本发明还涉及一种用于将选定的物质引入人细胞的本发明的嵌合蛋白。
本发明涉及用于将存在于诸如血液或淋巴液的胞外液中的选择的物质转运到细胞里的嵌合蛋白；利用嵌合蛋白对所述选择性物质进行定量分析，编码嵌合蛋白的DNA；含有编码所述嵌合蛋白的DNA的质粒；被修饰成含有编码所述嵌合蛋白的DNA的哺乳动物细胞，该细胞能表达并选择性地分泌所述嵌合蛋白；产生所述嵌合蛋白的方法；分离所述嵌合蛋白的方法；用所述嵌合蛋白分析所选择的物质的方法；以及通过给药所述嵌合蛋白降低所选择物质的胞外水平的方法，所述蛋白可将选择的物质转运到细胞中。本发明还涉及一种基因疗法，其中，将表达并分泌嵌合蛋白的哺乳动物细胞植入个体内，该嵌合蛋白在个体内表达、分泌并结合所选择的物质。所得到的选择的物质-嵌合蛋白复合体被摄入体细胞，结果使所选择物质的胞外水平降低。
所述选择的物质可以是正常存在的(内源产生的)血液组分，如养分、代谢物、天然存在的激素或脂蛋白，或外源组份，如病原体、毒素、环境污染物或药物或药剂。在每种情况下，所选择的物质都是由嵌合蛋白从诸如血液或淋巴液的胞外液中除去的，所述嵌合蛋白可选择性地结合所选择的物质，并结合存在于一种或几种类型的体细胞，特别是人类体细胞上的细胞表面受体。所得到的嵌合蛋白-选择的物质复合体结合于细胞表面受体上，并被转运到细胞里，它们在细胞中汇集或被代谢，使所选择物质的胞外水平降低。
本发明的嵌合蛋白致少包括2部分：一个功能域和一个载体域。功能域包括一个能结合待转运到细胞里的选择的物质的氨基酸(多肽)序列，或含有能以特有方式影响靶细胞的序列。载体域包括一个能结合存在于一种或几种类型体细胞上的细胞表面受体的氨基酸(多肽)序列。作为功能域的氨基酸序列可以是所选择物质的配体结合域；作为载体域的氨基酸序列可结合于细胞表面受体，因此是一种细胞表面受体配体。功能域和载体域均可进行翻译后修饰，例如，通过在某些位点的糖基化进行修饰。在所选择的物质是血液、淋巴液或胞外液的正常组分时，结合该选择物质的配体结合域是正常结合选择的物质的氨基酸序列(即，结合选择的人体内物质)、具有改变了的结合特性的所述序列的修饰形式、或是不常存在于人体内的氨基酸序列，该序列通过合成或遗传工程方法产生，并结合于选择的物质。例如，所述功能和/或载体域可以自组合肽文库或噬菌体展示文库。所述功能和/或载体域还可以包括免疫球蛋白或单链抗体的抗源结合域，其中，所述免疫球蛋白或单链抗体的抗源结合域能识别需要的选择物质或细胞表面受体。当所选择的物质是一种外源组分时，结合该选择物质的氨基酸序列选自能结合所述外源组分的天然配体结合域，或被设计成能结合外源组分的氨基酸序列。结合细胞表面受体的氨基酸序列通常结合细胞表面受体，而不是所选择的物质通常结合的受体。因此，该方法导致选择的物质由一种途径进入细胞，不同于正常情况下生物体内所发生的情形。
所述嵌合蛋白的结构域可以各种构型交联，只要所得到的嵌合蛋白能够结合所选择的物质和细胞表面受体。通常，所述两种结构域是由重组DNA分子中的单一读框编码，而且，两个结构域是由一个肽键连接。两个结构域之间可以由同样是由所述开放读框编码的一个或几个氨基酸公开。或者，两个结构域是由不同的DNA分子表达，并在体外或体内由非共价键(如疏水或离子相互作用)或共价(如二硫化物)键连接。
一旦所选择的物质结合于嵌合蛋白的配体结合域上，所得到的复合体就被称为选择物质-嵌合蛋白复合体。存在于选择物质-嵌合蛋白复合体上的细胞表面受体配体结合在其细胞表面受体上，并将该复合体转运到细胞里(例如，通过胞吞作用)，由此降低选择物质的循环水平。
在一种实施方案中，本发明涉及可用于将LDL转运到细胞中的嵌合蛋白；含有嵌合蛋白的药用组合物；用所述嵌合蛋白分析LDL；编码所述嵌合蛋白的DNA；含有编码该嵌合蛋白的DNA的质粒；被修饰成含有编码所述嵌合蛋白的DNA的哺乳动物细胞，该细胞表达并选择性地分泌所述蛋白(遗传修饰细胞)；产生嵌合蛋白的方法；分离嵌合蛋白的方法；用嵌合蛋白分析LDL的方法和通过给药一种能将LDL转运到细胞里的嵌合蛋白降低LDL胆固醇(LDL)的胞外水平的方法。
在降低胞外LDL水平的一种实施方案中，给需要降低其血清胆固醇水平的人类患者给药一种结合LDL和一种除LDL受体(LDLR)之外的细胞表面受体的嵌合蛋白。在降低胞外LDL水平的另一种实施方案中，将被修饰成含有编码嵌合蛋白的DNA的细胞植入个体。在所述个体内，所述遗传修饰的细胞表达并分泌所述嵌合蛋白，后者结合血液中的LDL，并形成LDL-嵌合蛋白复合体，该复合体被转运到非遗传修饰细胞中，从而降低血清LDL胆固醇水平。
可用于LDL转运和分析样品中LDL的本发明嵌合蛋白至少包括两部分：一个功能域，它包括LDLR的配合结合域的氨基酸序列；一个载体域，它包括能结合一种或几种类型体细胞，特别是人类体细胞上的LDLR以外的一种细胞表面受体的氨基酸序列。在可用于增进LDL吸收到细胞里的嵌合蛋白的一种实施方案中，将含有LDLR的配体结合域(即LDL结合域)的一种氨基末端序列结合于含有一个细胞表面受体配体的C-末端序列上。LDL结合域的羧基末端结合于细胞表面受体配体结合域的氨基末端。
在所述嵌合蛋白的一种实施方案中，所述两个部分是人LDLR的配体结合域和人运铁蛋白；所述LDLR的LDL结合域连接在成熟的人运铁多肽的氨基末端。该嵌合蛋白能结合LDL和运铁蛋白受体。该嵌合蛋白一旦结合在诸如肝细胞的细胞表面的运铁蛋白受体上，所述嵌合蛋白和结合在该嵌合蛋白LDLR部分上的LDL通过由运铁蛋白受体介导的胞吞作用而被胞吞掉，结果使LDL进入所述细胞并使胞外LDL浓度降低。所述运铁蛋白受体存在于多种类型的哺乳动物细胞上，因此，所述嵌合蛋白可促进多种哺乳动物细胞对LDL的吸收。
在第二种实施方案中，所述嵌合蛋白包括一个功能域，该功能域是LDLR的配体结合域，还包括一个载体域，该载体域是一种能结合除运铁蛋白受体之外的细胞表面受体的氨基酸序列，所述细胞表面受体如血清白蛋白受体、脱唾液酸蛋白受体、腺病毒受体、逆转录病毒受体、CD4、脂蛋白(a)、免疫球蛋白Fc受体、甲胎蛋白受体、类LDLR蛋白(LRP)受体、乙酰化LDL受体、甘露糖受体或甘露糖-6-磷酸酯受体。一般，可以使用能结合任何受体的氨基酸序列，所述受体能结合并内化结合的配体。上述嵌合蛋白结合LDL和一种细胞表面受体，并可用于促进多种细胞对LDL的吸收。所述嵌合蛋白一旦结合在受体上，嵌合蛋白-LDL复合体就被胞吞，结果使LDL进入细胞，而胞外LDL浓度降低。
本发明的嵌合蛋白是由含有编码所述嵌合蛋白DNA的合适的哺乳动物细胞生产的。本发明的修饰哺乳动物细胞(即被修饰成含有编码本发明嵌合蛋白的哺乳动物细胞)包括由含有编码所述嵌合蛋白的DNA或RNA的质粒、核酸片段、或包括病毒载体在内的其它载体稳定地或非稳定地转染或感染的哺乳动物细胞，或是由含有编码所述嵌合蛋白的DNA或RNA(例如，质粒、核酸片段、或包含DNA或RNA的其它载体)的修饰的哺乳动物祖细胞衍生(直接或间接地)而来。
在本发明产生嵌合蛋白的方法的一种实施方案中，所用的哺乳动物细胞是一种细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其含有并表达编码所述嵌合蛋白的DNA。所述嵌合蛋白能被选择性地分泌到培养转染的CHO细胞系的培养基中。在本发明生产嵌合蛋白方法的第二种实施方案中，所述修饰的哺乳动物宿主细胞是原代或继代细胞，如原代或继代人成纤维细胞，该细胞被编码所述嵌合蛋白的DNA转染或感染过。所述修饰细胞(例如，转染或感染过的原代或继代人成纤维细胞)能表达所编码的嵌合蛋白，并将该蛋白选择性地分泌到培养基中。另外，可将所述转染或感染过的原代或继代细胞植入诸如人的个体内，所述嵌合蛋白在该个体内分泌，用于治疗目的。
通过培养修饰细胞所产生的嵌合蛋白可以用任何合适的方法从细胞裂解物或培养基中分离。本文所披露的上述方法之一是基于亲和层析，其中，所述嵌合蛋白的分离是这样进行的：首先将该嵌合蛋白结合于一种抗体柱上，该抗体柱是用一种用来抗所述细胞表面受体配体的抗体制备的；洗脱；然后将其结合于带有选择的物质的柱上，所述嵌合蛋白的配体结合域结合在所述选择的物质上。例如，可以按以下方法分离结合LDL和用于运铁蛋白的细胞表面受体的嵌合蛋白；首先通过结合于一种抗运铁蛋白抗体柱上进行分离，然后结合于和一种抗LDL抗体柱结合的LDL上。所述分离方法的结果是获得了纯化的完整嵌合蛋白。或者，在所述第一个分离步骤中将所述嵌合蛋白结合于一种带有选择的物质的柱上，所述嵌合蛋白的配体结合域结合在所述选择的物质上，而在第二个分离步骤中结合于带有一种用于抗所述细胞表面受体配体的抗体的柱上。如本文所述，已纯化了包括源于LDLR和运铁蛋白的结构域的嵌合蛋白。
本发明的嵌合蛋白可用于将选择的物质-LDL转运到诸如肝细胞的细胞里，从而降低LDL的胞外水平。这种作用可在临床或治疗上加以应用，如用于控制或降低在诸如高胆固醇血症个体的人体内的血清LDL水平。在本发明方法的一种实施方案中，通过使用所述嵌合蛋白将LDL转运到细胞中，将表达所述嵌合蛋白的细胞植入需要降低其血清LDL水平的个体体内。在该个体体内，植入的细胞产生所述嵌合蛋白，该嵌合蛋白进入间隙液中。所述嵌合蛋白能由间隙液进入淋巴液，并最终进入血液，在血液中它与LDL结合，导致嵌合蛋白-LDL复合体的形成。该复合体被(例如，经血流)送至具有运铁蛋白受体的细胞(例如，肝细胞)，并由于运铁蛋白结构域-运铁蛋白受体间相互作用而结合在该细胞上。该嵌合蛋白-LDL复合体通过由运铁蛋白受体介导的胞吞途径而被吸收，该途径通常起着内化运铁蛋白的作用。在该方法的另一种实施方案中，给需要增加转运到细胞中的LDL的个体(尤其是人)给药纯化或部分纯化的嵌合蛋白。
所述嵌合蛋白具有多种其它临床或治疗用途，例如，用于降低内源产生的正常或非正常代谢物或养分(如乙酰化低密度脂蛋白、载脂蛋白E4、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β、细胞因子、免疫球蛋白、激素、葡萄糖、胆汁盐、糖脂[如Gaucher病患者所积累的葡糖脑苷脂或Fabry患者体内所积累的神经酰胺三己糖苷脂]、或糖胺聚糖[如Hunter、Hurler或Sly综合症患者体内所积累的糖胺聚糖])或外源物质(例如，病原体、环境污染物或醇)的正常或异常循环水平。
本发明的嵌合蛋白还可用于分析，特别是定量分析结合着配体结合域的选择的物质。例如，可将其用于测定血液中LDL、免疫球蛋白、生长激素和载脂蛋白E的水平的分析中。例如，可将所述嵌合蛋白用作诸如酶联测定的已知方法的一种成分，用于测定选择的物质。
图1是经正常的LDL受体介导的途径(LDLR途径)和运铁蛋白受体介导的途径(TFR途径)吸收LDL的示意图。
图2是LDLR/TF表达质粒pEFBOS/LDLrTFl.S.的示意图。该质粒的特异区段由指示的影或线表示。通过用大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶的Klenow片段处理补平Xba I-消化的pEF-BOS的末端，并与其EcoNI位点同样为平端的含有所述融合基因的EcoRI-SmaI片段连接而消除的限制酶切位点标在括号中。
图3A-3E是pEFBOS/LDLrTF 1.S中嵌合cDNA的核苷酸序列(序列1)和相应的氨基酸序列(序列2)，其中的起始蛋氨酸表示该融合蛋白的第一个氨基酸；...表示终止密码子；下面划线的密码子表示所述嵌合蛋白的人类运铁蛋白部分；而下面未划线的密码子表示所述嵌合蛋白的LDLR部分；核苷酸1-13：5′非编码LDLR序列；核苷酸3236-3428：3′非编码运铁蛋白序列。
图4是LDLR/TF表达质粒pEFBOS-LDLR/TF-710的示意图，其中，该质粒的特异区段由指示的影或线表示。
图5A-5F是pEFBOS-LDLR/TF1-710上嵌合cDNA的核苷酸序列(序列3)和相应的氨基酸序列(序列4)，其中的起始蛋氨酸表示所述融合蛋白的第一个氨基酸；...表示终止密码子；下面划线的密码子表示该嵌合蛋白的人类运铁蛋白部分；下面未划线的密码子表示该嵌合蛋白的LDLR部分；出示核苷酸1-13：5′非编码LDLR序列和核苷酸4244-4603：3′非编码运铁蛋白序列。
图6表示对在不同免疫亲和(IA)纯化阶段由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的LDLR/TF嵌合蛋白形式进行非还原SDS-PAGE和Western印迹分析的分析结果。
图7表示在所示LDL浓度下人类LDL与LDLR/TF嵌合蛋白的特异结合的曲线图。
图8表示结合于LDL的嵌合蛋白的微孔板结合分析的结果的曲线图。
图9表示LDLR/TF嵌合蛋白的Western印迹分析的结果。
本发明举例说明了用于将选择的物质导入细胞中以进行活体内治疗的方法。另外，本发明披露了用基因疗法产生治疗蛋白的用途，该蛋白被用于将选择的物质转运到细胞里。
正如本文所述，申请人已研究出一种用于将选择的物质吸收到细胞里的新方法，该方法利用一种嵌合蛋白并通过一种正常情况下不能将所选择的物质吸收到细胞中的机制而实现。所述嵌合蛋白能结合选择的物质，还能结合存在于体细胞，特别是人类体细胞上的细胞表面受体。嵌合蛋白与选择物质的结合会形成一种嵌合蛋白-选择的物质复合体，该复合体由细胞表面受体结合并被转运到具有所述受体的细胞中。所选择的物质可以是诸如血液或淋巴的胞外液的天然(内源产生的)组分，或诸如药物或毒素的外源组分。本发明的嵌合蛋白被自身输送到或被给药到个体体内，或通过基因疗法提供给个体，在该方法中，将表达并分泌所述嵌合蛋白的细胞导入需要产生并分泌该嵌合蛋白的个体体内。所述嵌合蛋白选择性地结合个体的胞外液(如血液、淋巴液)中的选择的物质，从而形成选择物质-嵌合蛋白复合体。该复合体上的配体结合域结合于个体的体细胞上的细胞表面受体。该复合体被转运到其所结合的细胞中，并因此降低所选择物质的胞外水平。
用于降低血清LDL水平的嵌合蛋白
在一种实施方案中，申请人提出了一种用于吸收正常情况下不能被人体吸收的人LDL、防止缺陷型LDLR生成或补充已知在有家族性高胆固醇血症的个体会发生的降低的LDLR含量、以及增加或提高细胞(具有正常数目的功能性LDLRs的细胞和具有异常数目的LDLRs的细胞)吸收LDL的能力的新方法。该新方法能促进LDL向具有异常数目功能性LDLRs和正常数目功能性LDLRs的肝细胞中的转运。申请人已证实，存在于人类细胞表膜上的一种受体可被用作将LDL转运到诸如肝细胞的细胞里的工具。可将诸如运铁蛋白受体、血清白蛋白受体、脱唾液酸糖蛋白受体、腺病毒受体、逆转录病毒受体、CD4、脂蛋白(a)受体、免疫球蛋白Fc受体、甲胎蛋白受体、类LDLR蛋白(LRD)受体、乙酰化LDL受体、甘露糖受体或甘露糖-6-磷酸酯受体之类的细胞表面受体用作将LDL转运到细胞中的工具。上述受体分别存在于多种不同类型的细胞上，因此，可将LDL转运到多种类型的细胞中。
申请人已生产出可用于将LDL转运到细胞中的嵌合蛋白。本发明的主题是这种嵌合蛋白，以及编码该嵌合蛋白的核酸序列；含有编码所述嵌合蛋白的DNA(或RNA)的哺乳动物宿主细胞，所述蛋白能在该细胞中表达；生产所述嵌合蛋白的方法；分离所述嵌合蛋白的方法；将所述嵌合蛋白用于定量分析LDL的方法；以及降低胞外LDL水平的方法，包括降低个体体内的血清LDL水平的治疗方法。在该治疗方法中，向个体提供一种能结合LDL和除人LDLR之外的一种人细胞表面受体的嵌合蛋白，通过给药所述嵌合蛋白本身或通过给药(如植入)表达并分泌所述嵌合蛋白的细胞而向个体提供所述嵌合蛋白。在任何情况下，所述嵌合蛋白都是结合LDL和人细胞表面受体，而且，所形成的复合体被转运到其所结合的细胞中，降低LDL的胞外水平。
在一种实施方案中，所述嵌合蛋白包括一个第一结构域，该结构域是LDLR的配体结合域，还包括一个第二结构域，该结构域是运铁蛋白(TF)。人运铁蛋白受体对其配体有极高的亲和性；其平衡解离常数(Kd)为2-7nM(Trowbridge，I.S。等，“生化药理学”(Biochem.Pharmacol.)，33：925-993(1984))。即使在运铁蛋白的浓度远低于全血蛋白浓度时运铁蛋白也可与其受体结合。类似地，LDL对其配体的亲合力很高[对肝受体的Kd＝7.2nM(Krampler F.等，“临床研究杂志”(J.Clin.Invest.)，80：401-408(1987))，对成纤维细胞受体的Kd＝2.8nM(Innerarity，T.L.等，“酶学方法”(Meth.Enzymol.)，129：542-565(1986)]。因此，该实施方案的嵌合蛋白对于两种成分(人LDL和人运铁蛋白受体)有很高的亲和力，为了通过由运铁蛋白受体介导的胞吞作用将LDL转运到细胞里，必须将以上两种成分结合在一起。图1中示LDLR-运铁蛋白(LDLR/TF)嵌合蛋白是如何通过运铁蛋白受体促进LDL吸收的示意图。经任何途径吸收的LDL均被代谢释放出胆固醇和游离氨基酸。在LDLR途径中，在释放出LDL之后LDLR又返回到细胞表面。在TFR途径中，LDL被释出，而TFR和LDLR/TF嵌合蛋白则返回到细胞表面。
整个人运铁蛋白可以存在于所述嵌合蛋白中；或者仅有结合铁和存在于人体细胞上的人运铁蛋白受体所需的部分人运铁蛋白包括在所述嵌合蛋白中。在中性pH下，每一TFR结合两个二铁(即铁饱和的)TF分子。其结合位点位于每一TF的N-末端结构域。单铁TF不易结合TFR，而脱辅基TF(apoTF，即无结合铁的TF)不能结合TFR。相反，在溶酶体的酸性环境中，当铁被释出时ApoTF仍然结合于TFR，以便使受体和apoTF返回到细胞表面。在本文中，所用的“人运铁蛋白”一词是指整个人运铁蛋白分子或与铁和人体细胞表膜上的运铁蛋白受体结合所需的该蛋白的部分区段。
在一种实施方案中，人LDL受体的配体结合域结合于成熟TF分子的N-末端。所述配体结合域可以包括存在于天然受体蛋白中的其它LDL受体区域。
嵌合蛋白的产生
本发明的嵌合蛋白，如用于将LDL转运到细胞里的嵌合蛋白可以用表达编码整个嵌合蛋白的单一核酸的宿主细胞生产，或用有一个以上核酸序列的宿主细胞生产，其中每个序列编码该嵌合蛋白的一个结构域，并选择性地编码用来连接这些结构域一个或几个氨基酸。还可用化学合成法生产所述嵌合蛋白。
A.宿主细胞
用于生产嵌合蛋白的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫、非哺乳类脊椎动物或哺乳动物细胞；哺乳动物细胞包括，但不限于仓鼠、猴、黑猩猩、狗、猫、牛、猪、小鼠、大鼠、兔、绵羊和人体细胞。所述宿主细胞可以是无限增殖化细胞(细胞系)或非无限增殖化(原代或继代)细胞，而且可以是多种类型细胞中的任一种，例如(但不限于此)，成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞(如乳腺上皮细胞、肠上皮细胞)、卵巢细胞(如中国仓鼠卵巢或CHO细胞)、内皮细胞、胶质细胞、神经细胞、血液组成部分(如淋巴细胞、骨髓细胞)、肌细胞、肝细胞及所述类型体细胞的前体。
含有并表达编码所述嵌合蛋白的DNA或RNA的细胞在本文中被称为遗传修饰细胞。含有并表达所述嵌合蛋白的DNA或RNA的哺乳动物细胞在本文中被称为遗传修饰的哺乳动物细胞。是通过已知转染方法将所述DNA或RNA导入细胞里的，例如电穿孔法、显微注射法、微粒轰击法、磷酸钙沉淀法、改进的磷酸钙沉淀法、阳离子型脂类处理法、光穿孔法、融合法、受体介导的转移、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物沉淀法。另外，可以通过用病毒载体感染将DNA或RNA导入细胞。生产表达编码嵌合蛋白的DNA或RNA的细胞(包括哺乳动物细胞)的方法披露于下列待批美国专利申请中：U.S.S.N.08/334,797，题为“用于基因治疗的体内蛋白生产和输送系统”，发明人为Richard F.Selden，Douglas A.Treco.和Michael W.Heartlein(申请日：1994年11月4日)；U.S.S.N.08/334,455，题为“用于基因治疗的红细胞生成素或胰岛素生成素的体内生产和输送”，发明人为Richard F Seldon，Douglas A.Treco和Michael W.Heartlein(申请日：1994年11月4日)和U.S.S.N.08/231,439，题为“DNA向原代或继代细胞的定向导入及其在基因治疗上的应用”，发明人为Douglas A.Treco，Michael W.Heartlein和Richard F Seldon(申请日：1994年，4月20日)。上述申请中每一份所披露的内容均被特意收作本文的参考。
B.核酸结构
用于表达所述嵌合蛋白的核酸结构可以是在转染的哺乳动物细胞中染色体外(附加)表达的核酸，或是通过同源重组随机地或在预先选择的靶位点整合到受体细胞的基因组上的核酸。除了嵌合蛋白编码序列之外，染色体外表达的核酸结构还包括足于在细胞中表达所述蛋白的序列，以及选择性地用于所述结构复制的序列。该结构通常包括一个启动子、嵌合蛋白编码DNA和一个聚腺苷酸化位点。编码所述嵌合蛋白的DNA以一种方式在所述结构中的定位使其表达是在所述启动子的控制之下。该结构可选择性地包括其它部分，如下列部分的一种或几种：剪接位点、增强子序列、受合适的启动子控制的选择标记基因、和受合适启动子控制的可扩增的标记基因。
在上述DNA结构整合到细胞基因组中的实施方案中，仅需要包括编码所述嵌合蛋白的核酸序列。它还可选择性地包括启动子和增强子序列、聚腺苷酸化位点、剪接位点、编码一种或多种选择标记的核酸序列、编码一种可扩增的标记的核酸序列和/或与受体细胞的基因组DNA同源的DNA，以便将所述DNA定向整合到该基因组的选择位点上(导向DNA或DNA序列)。
C.细胞培养方法
含有所述嵌合蛋白编码DNA或RNA的哺乳动物细胞的培养是在适于该细胞生长及所述DNA或RNA表达的条件下进行。可以用已知方法和本文所披露的方法鉴定表达所述嵌合蛋白的细胞，可以用已知方法和本文所披露的方法分离并纯化所述嵌合蛋白，进行或不进行嵌合蛋白生产的扩增。例如，可以通过筛选表现出显示存在编码所述嵌合蛋白的DNA或RNA的表型的遗传修饰的哺乳动物细胞进行鉴定，如PCR筛选、通过Southern印迹分析筛选、或筛选所述嵌合蛋白的表达。具有整合的嵌合蛋白编码DNA的细胞的选择可以这样进行：使所述DNA结构中包括一个选择标记，并培养含有选择标记基因的转染或感染过的细胞，培养是在仅适于能表达所述选择标记基因的细胞存活的条件下进行的。所导入的DNA结构的进一步扩增可以通过在适于扩增的条件下培养遗传修饰的哺乳动物细胞而实现(例如，在存在一定浓度的某种药物的条件下培养含有一种可扩增标记基因的遗传修饰的哺乳动物细胞，在该浓度下只有含有多拷贝可扩增标记基因的细胞才能存活)。
可以用本文所披露的方法通过检测表达产物鉴定表达所述嵌合蛋白的遗传修饰的哺乳动物细胞。例如，可以通过夹心酶免疫测定鉴定表达其第二个结构域是运铁蛋白的嵌合蛋白的哺乳动物细胞，其中，所述嵌合蛋白通过与对LDL结合域有专一性的单克隆抗体结合而捕获在微量滴定板上，并通过与对人TF结构域有专一性的抗人TF单克隆抗体的结合检测结合的嵌合蛋白。由于所表达的每种嵌合蛋白均含有一个可测定的TF结构域，可以通过检测人TF的酶联免疫吸附测定(ELISA)(实施例6)对大多数不能合成人TF的遗传修饰的哺乳动物细胞类型的嵌合蛋白水平进行常规分析。另外，可以通过LDL结合试验鉴定表达所述嵌合蛋白的哺乳动物细胞(实施例9)。另外，可以用本领域普通技术人员所熟知的其它方法鉴定上述细胞(Sambrook，J.等，“分子克隆，实验指南”(Molecular Cloning；a Laboratory Manual)第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989；Ausubel，F.A.等著，“现代分子生物学方案”(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley,New York，1994)。
D.嵌合蛋白的纯化
由遗传修饰的哺乳动物细胞产生的嵌合蛋白可以用本领域技术人员熟知的方法及本文所披露的方法从所述细胞中分离，并进行纯化或部分纯化。如在实施例7中所述，已通过一种基于直接与所述嵌合蛋白的两个结构域结合的方法从表达该蛋白的细胞中获得了所述嵌合蛋白。该方法包括两个步骤：一个步骤涉及与参与运铁蛋白受体结合的运铁蛋白表位的免疫亲和结合，另一个步骤涉及与LDLR结构域的配体(LDL)亲和结合。为了纯化LDLR-结合域运铁蛋白嵌合蛋白，以如下方式实施所述方法：将培养表达所述嵌合蛋白的细胞的培养基与该细胞分离，而且，一般通过切向流超滤进行浓缩。将所得到的富集或浓缩了所述嵌合蛋白的培养基与结合于一种柱基质上的抗人运铁蛋白单克隆抗体(抗-TF MAb)接触，从而使得培养基中含有运铁蛋白表位的所有蛋白被结合上去。将结合的蛋白从免疫亲和柱上洗脱，随后对所得到的免疫亲和纯化的嵌合蛋白进行一个配体亲和纯化步骤，在该步骤中，在适于LDL-LDLR结合的条件下使其与通过固定于柱基质上的抗LDL抗体直接结合在所述柱基质上的LDL接触。结果，含有运铁蛋白和完整的LDLR配体结合域的嵌合蛋白被结合在LDL上；该嵌合蛋白被从所述柱上洗脱，得到该嵌合蛋白的高度纯化的制备物。在例7中证实，该方法可以分离出含有运铁蛋白并能结合LDL的完整的嵌合蛋白。可对上述方法加以改进，以纯化这样的嵌合蛋白：其中，第一结构域是一种LDLR配体结合域之外的配体结合域，而第二结合域是一种运铁蛋白以外的细胞表面受体配体。
在本发明的纯化含有完整LDLR结合域和运铁蛋白的嵌合蛋白的方法的一种实施方案中，纯化过程是这样进行的：将培养表达所述嵌合蛋白的宿主细胞的培养基与该宿主细胞分离，并通过切向流超滤进行浓缩，浓缩时使用截断分子量为100,000Da的滤膜。在一个实验中，所述培养基被浓缩了大约32倍。
一种抗-TF MAb(例如，HTF-14，Biodesign，Kennebunk，ME，如实施例7所述，自腹液中分离)被结合于一种诸如聚苯乙烯珠(例如，溴化氰[CNBr]-活化的琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B))的固相支持物上，以形成一种免疫亲和柱。通过将浓缩的培养基上HTF-14免疫亲和柱而使该培养基与固相支持物结合的抗TF MAb接触，并在合适条件下使其与抗TF MAb的接触保持足够长的时间，以使培养基中的嵌合蛋白上的运铁蛋白结构域与抗TFMAb结合(即：通过与嵌合蛋白的运铁蛋白结构域的相互作用而使该嵌合蛋白结合于MTF-14上)。结果，含运铁蛋白的嵌合蛋白被非共价地结合到固相支持物上(如，结合到HTF-14结合的珠上)。将固相支持物结合的嵌合蛋白置于适当条件下(例如，用0.1M甘氨酸，pH2.3洗涤)，以洗脱所述嵌合蛋白，并收集洗脱的嵌合蛋白。
在实施例7所述的实施方案中，用0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl，pH7.4[Tris缓冲盐溶液(TBS)]洗涤含有结合的嵌合蛋白的HTF-14免疫亲和柱，然后用0.1M甘氨酸，pH2.3洗脱。将2ml的级分收集到合适pH的缓冲液中，以中和洗脱缓冲液，并合并某些级分。分析显示，这一步骤可从所述浓缩培养基中获得纯化大约8,000倍的嵌合蛋白。如在实施例7中所述，所得到的免疫亲和纯化的嵌合蛋白是一种混合物，其含有包括运铁蛋白和完整LDLR结合域的嵌合蛋白和被丝氨酸蛋白酶降解过的、因而不包括完整的LDLR结合域的嵌合蛋白。上述纯化方法的第二步是一个基于配体亲和性(LDL-亲和性)的步骤，这一步骤可以分离包括运铁蛋白和完整LDLR结合域的嵌合蛋白和不包括完整LDLR结合域的嵌合蛋白。在这一步中，将免疫亲和纯化的嵌合蛋白混合物上到一种配体亲和柱上，该柱含有CNBr活化的琼脂糖凝胶珠，在该珠上结合有人LDL(hLDL)(例如，通过固定在所述珠粒上的多克隆兔抗人LDL抗体)。将免疫亲和纯化的嵌合蛋白加注到抗-LDL(LDL)配体亲和柱上，在合适条件下保持足够的时间，使所述珠上的LDL与嵌合蛋白里的LDLR结合，生成与该柱非共价地结合的嵌合蛋白。用TBS洗涤该柱，并用由TBS配制的20mM EDTA，pH7.4洗脱。收集洗脱级分并进行分析，证实级分2和3含有峰值浓度的所述蛋白。
E.嵌合蛋白的体外鉴定
对按本文所述方法生产的嵌合蛋白进行的分析(见实施例10)表明，该蛋白以依赖于二价阳离子的方式结合LDL，这是LDL-LDLR结合相互作用的非常确实的特征。进一步分析显示，在酸性缓冲条件下所述嵌合蛋白不能与LDL进行结合，EDTA和酸性缓冲液均能有效解离结合于LDL上的嵌合蛋白(实施例10)。LDL-LDLR结合相互作用的另一个非常确实的特征是，在体内的酸性内体区室中LDL被释出。这表明所述嵌合蛋白能在细胞内的以相似的方式起作用，会导致在细胞中嵌合蛋白能释出LDL。综合以上发现可以看出，所述嵌合蛋白具有结合血清LDL，并将其吸收到细胞中以进行进一步的代谢的功能。
进一步的分析(实施例9)证实，最大半数结合出现在当LDL的浓度约为3nM之时，这相当于在固相结合试验中纯化的LDLR浓度(Innerarity，T.L.等，“酶学方法”(Meth.Enzymol.)，129：542-565(1986))以及公开的在人体成纤维细胞中LDL从LDLR解离的Kd值。上述结果支持了这样的看法：所述嵌合蛋白对LDL的结合亲合力相当于完整长度的、质膜结合的LDLR对LDL的结合力。
按实施例11、13和14所述方法测定嵌合蛋白的功能活性，其中，该蛋白的第一结构域是LDLR的配体结合域，第二结合域是运铁蛋白。为了测定嵌合蛋白是否能导致细胞经运铁蛋白受体吸收LDL，采用诸如HepG2的肝细胞系。如实施例13所述，在体外将肝细胞暴露给嵌合蛋白和LDL处理。为了测定嵌合蛋白是否能在培养基中结合人LDL，并介导经运铁蛋白受体将LDL吸收到肝细胞中，按实施例13所述方法在有嵌合蛋白的条件下测定未标记的LDL或未标记的运铁蛋白抑制细胞吸收标记的LDL(例如，125I-LDL)的能力。可以用实施例13所述方法分析由运铁蛋白吸收的LDL是否被代谢成胆固醇库。例如，通过测定一种酶，如3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG CoA还原酶)的产生可以测定LDL吸收对胆固醇生物合成的抑制作用，细胞中过多的胆固醇可下调(抑制)所述酶的产生。另外，对一种酶，如乙酰辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的含量或活性的测定，可用于证实LDL是否已被运铁蛋白受体吸收并被代谢成胆固醇，所述酶的含量随细胞中胆固醇的增加而增加。提高的ACAT活性是细胞中胆固醇含量增加的标志。
F.嵌合蛋白的体内鉴定
可以用实施例14所述方法测定所述嵌合蛋白的抗高胆固醇血症的效果。简言之，将嵌合蛋白给药于人类家族性高胆固醇血症的动物模拟系统，如LDLR剔除小鼠或Watanabe兔，并测定其对血清胆固醇含量的影响。给LDLR剔除小鼠或Watanabe兔给药适量的嵌合蛋白后血清胆固醇含量降低这一事实，证明了所述嵌合蛋白将胆固醇转运到细胞中的能力。
G.嵌合蛋白的治疗用途
可将本发明的嵌合蛋白用于促进LDL向诸如肝细胞的细胞中的转运。可以给需要促进其LDL代谢的个体给药嵌合蛋白，如其LDLR-配体结合域与运铁蛋白结构域融合的嵌合蛋白。以含于合适载体中的形式给药嵌合蛋白，该载体可以是生理盐水或水或与稳定剂或赋形剂(如白蛋白或低分子量糖类)混合。用公知技术通过多种途径给药所述嵌合蛋白，如通过肌内、静脉内、腹膜内注射。或者，将表达嵌合蛋白的遗传修饰的哺乳动物细胞植入个体内。可转染非无限增殖化细胞(原代或继代细胞)和/或无限增殖化细胞。所述细胞包括，但不限于成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞(例如，乳腺上皮细胞、肠上皮细胞)、卵巢细胞(例如，中国仓鼠卵巢或CHO细胞)、内皮细胞、胶质细胞、神经细胞、血液组成部分(例如，淋巴细胞、骨髓细胞)、肌细胞、肝细胞及所述类型体细胞的前体。还可以用本发明方法转染无限增殖化细胞，并用于蛋白生产或基因治疗。可用于通过本发明方法进行蛋白生产或基因治疗的无限增值化人体细胞系的例子包括，但不限于HT 1080、Hela、MCF-7乳腺癌细胞、K-562白血病细胞、KB癌细胞、2780AD卵巢癌细胞、Raji(ATCC CCL 86)细胞、Jurkat(ATCC TIB 152)细胞、Namalwa(ATCC CRL 1432)细胞、HL-60(ATCC CCL 240)细胞、Daudi(ATCC CCL 213)细胞、RPMI 8226(ATCC CCL 155)细胞和MOLT-4(ATCC CRL 1582)细胞。当把遗传修饰的无限增殖化细胞用于基因治疗时，可将细胞包在一种半透隔离装置中，该装置允许所述嵌合蛋白扩散到外面。
在本发明的基因治疗方法中所用的细胞(例如，成纤维细胞)优选获自待治疗的个体。通过导入本发明的DNA结构修饰所述细胞，如编码这样一种嵌合蛋白的DNA结构：其中，结构域1是人LDLR的配体结合域，而结构域2是由源于运铁蛋白的氨基酸序列组成。在培养基中对所得到的遗传修饰的细胞进行扩增，并将其导入个体体内。可以用待批美国专利申请07/787,840所披露的方法生产表达编码所述嵌合蛋白的DNA结构的细胞，该申请题为“用于基因治疗的体内蛋白生产及输送系统”，发明人为Richard F Selden，Douglas A.Treco和Michael W.Heartlein(申请日：1991年11月5日)，该申请所披露的内容被收作本文参考。所述细胞表达并分泌所述嵌合蛋白，该蛋白结合LDL并将其转运到在表面带有运铁蛋白受体的细胞中。由运铁蛋白受体介导的嵌合蛋白-LDL复合体的胞吞作用能把LDL导入细胞，并降低胞外LDL含量。可将编码一种嵌合蛋白的DNA导入哺乳动物细胞，所述嵌合蛋白可以如上文所述，其第二结构域是一种除运铁蛋白以外的细胞表面受体配体。可将表达并分泌所述嵌合蛋白的遗传修饰的哺乳动物宿主细胞植入个体体内，在个体体内，所述嵌合蛋白结合LDL。所得到的嵌合蛋白-LDL复合体结合于具有所述受体的细胞上(对于该受体来说，第二结构域的氨基酸序列是一种配体)，并通过受体介导的胞吞作用进入所述细胞。因此，可降低循环的LDL含量。
植入个体体内的遗传修饰的哺乳动物宿主细胞的数目取决于需要输送的嵌合蛋白的量和该细胞表达这种蛋白的水平。个体对所述蛋白的需要量取决于诸如年龄、体型、性别、血清LDL含量和该嵌合蛋白的血清半衰期之类的因素。所需剂量可以凭经验确定或根据所确定的该嵌合蛋白的药物动力学特征计算。
可以把其它相关的嵌合蛋白用于清除血液中的氧化LDL，这种LDL从临床角度看是全LDL的一个重要部分。据认为，当大量循环LDL与血管中的内皮细胞相互作用时，粥样硬化斑形成的早期阶段就会发生，此时，由于自由基的作用，发生apoB-100上的胺基(例如，赖氨酸和精氨酸残基)氧化。已知LDL颗粒中apo B-100的氧化(包括乙酰化)会导致对LDL受体亲和力的丧失。氧化LDL不能由肝脏清除，却积累在循环系统中，直到与清除受体(AcLDLR；以前被称为酰基LDL受体)相互作用，该受体主要存在于巨噬细胞上。吸收大量氧化LDL的巨噬细胞变得充满脂泡，并被称为“泡沫细胞”。据认为具有用于与内皮细胞粘合的细胞表面决定簇的泡沫细胞在粥样硬化斑形成初期起着一定作用，并且，确实出现在各种时期的斑中。
含有与人运铁蛋白融合的清除受体配体结合域的嵌合蛋白(AcLDLR/TF)，因为能通过与肝脏中运铁蛋白受体结合并清除氧化LDL而具有治疗用途。另外，由于所述嵌合蛋白可以高浓度使用，它可以作为巨噬细胞AcLDLR的竞争剂，以使大部分氧化LDL结合于AcLDLR/TF上，而不是结合于巨噬细胞上的AcLDLR上。这样一来，可以减少积累在巨噬细胞中的氧化LDL，因而还可减少存在于心血管内皮中的泡沫细胞，从而干扰早期粥样硬化斑的形成。
更常见的是，可将其它嵌合蛋白用于治疗目的，以降低与某些疾病有关的其它生化物质的含量。嵌合蛋白的高亲和力配体结合域不一定局限于那些已知的受体分子(例如，LDLR或AcLDLR)，还可以包括其对蛋白配体或小分子有高结合力的其它类型的蛋白。可将具有抗体(例如，单链抗体)的抗原结合特性的分子或具有可逆的结合活性的其它蛋白和人运铁蛋白或具有结合于其它细胞受体配体用于构建嵌合蛋白编码序列。
在一种实施方案中，所述嵌合蛋白具有对载脂蛋白E4(apoE4)的高亲和力结合特异性，但对apoE3或apoE2没有。约有半数的早老性痴呆症的情况与apoE的特殊等位形式有关，并发现apoE的E4等位形式累积在脑的淀粉样原纤维中，并且是该病的一个危险因素。apoE2和apoE3等位基因与危险的增加无关，而且可能在抗病方面起着某种作用。可将能降低apoE4含量的嵌合蛋白用于治疗目的，以延缓老年性痴呆症的发生。通过本文所述方法可将含有一个apoE4结合域的嵌合蛋白与运铁蛋白融合，以产生这样一种分子：它可以从循环系统中清除apoE4，并最终逆转发生于外周组织中的累积作用。
嵌合蛋白的诊断用途
嵌合蛋白还是生化分析中的有用的诊断剂。例如，可将嵌合蛋白用于测定生物样品(例如，细胞裂解液、血液、淋巴液、尿液、水或乳)中选择的物质，如LDL的量。如果必要，可对待分析的生物样品加以处理，以使所选择的物质可用于结合一种合适嵌合蛋白的第一结构域(例如，对于LDL而言，嵌合蛋白中的第一结构域是人LDLR的配体结合域)，并在适于所述第一结构域与所选择的物质结合的条件下与所述嵌合蛋白结合。通常，所述嵌合蛋白可以以某种方式结合于一种固体表面，如微量滴定板、聚合物珠或其它表面，以使在用于结合选择的物质与所述嵌合蛋白的第一结构域的条件下该蛋白仍结合于所述表面上。如果所选择的物质存在于生物样品中，该物质与所述嵌合蛋白结合，并用已知方法检测所产生的选择物质-嵌合蛋白复合体(例如，采用一种抗体，该抗体结合于选择的物质并共价连接(缀合)于一种活性酶或放射性核素。监测所述酶的活性，例如，通过测定生色或生荧光底物的裂解进行上述监测)。嵌合蛋白可以方便形式，如以微量滴定板形式，以高度特异性在直接分析中检测物质。在本文所提供的一个实施例中，通过与结合于微量滴定板的LDLR/TF嵌合蛋白结合而对LDL进行定量。通过与抗LDL抗体反应测定所得到的结合LDL。
在其它实施方案中，嵌合蛋白可以取代ELISA测定中的抗体。例如，直接或间接结合于平板上的LDL能够捕获具有LDLR配体结合域的嵌合蛋白。然后通过与HRP-缀合的抗所述嵌合蛋白的第二结构域的抗体反应检测被捕获的嵌合蛋白，例如，当采用LDLR/TF嵌合蛋白时，抗-TF抗体可以与TF结构域反应。作为另一个例子，可将与人免疫缺损病毒(HIV)的组分结合的嵌合蛋白用于检测在诸如血液或组织样品的复杂的生物样品中所述病毒的存在。
将通过以下实施例说明本发明，这些实施例没有任何限定的用意。实施例1构建编码一种LDLR/TF嵌合蛋白的质粒，该蛋白具有与人运铁
蛋白的氨基酸20-698融合的人LDLR的氨基酸1-374
该实施例中披露了编码一种LDLR/TF嵌合蛋白的基因的装配，该嵌合蛋白具有与人运铁蛋白的氨基酸20-698融合的成熟的人LDLR的氨基酸1-374，并披露了LDLR/TF表达质粒的构建。
寡核苷酸1
5′GCTGTGGCCA CCTGTCGCCC TGAC(序列5)
寡核苷酸2
5′TGCACACCAT CTCACAGTTT TATCAGGGAC CACAGCCTTG CAGGCCTTCG
TGTGGGGGTC(序列6)
寡核苷酸3
5′GCCTCGAAGC TGGTTCATCT G(序列7)
寡核苷酸4
5′GACCCCCACA CGAAGGCCTG CAAGGCTGTG GTCCTGATA AAACTGTGAG
ATGGTGTGCA(序列8)
将寡核苷酸1-4用于聚合酶链式反应，以产生一种融合片段，其中，相当于人LDL受体外显子1-8的一个cDNA序列与编码人运铁蛋白的cDNA序列融合。首先，将寡核苷酸1和2用于扩增源于pLDLR2(ATCC#39966)的LDL受体cDNA的522bp部分。接着，将寡核苷酸3和4用于扩增由运铁蛋白序列组成的372bp的片段，以质粒TfR 27A(ATCC#53106)为模板。最后，混合以上两种扩增片段，并用寡核苷酸2和3进行进一步扩增，以产生最终的834bp融合片段。上述PCR融合将LDL受体序列的Val 374(相对于成熟LDLR蛋白序列编号)与运铁蛋白的Val 20结合在一起。用BamHI部分消化该融合片段，并用EcoRI彻底消化。分析公开的LDLRcDNA(Genbank入藏号K 02573)的DNA序列和TF cDNA(Genbank入藏号M12530)的DNA序列预测有1个由消化所述PCR-产生的融合片段得到的734bp的片段。对该734bp的片段进行凝胶纯化，以便用于克隆。
为了构建人LDL受体的前374个氨基酸与编码人运铁蛋白的氨基酸20-698的DNA序列的完整融合体，构建了两个中间质粒。首先，通过用PstI部分消化将完整的运铁蛋白cDNA从TfR27A上切除。将含有TF cDNA的2.3kb的片段连接在PstI消化的pBSIISK+(Stratagene，La Jolla，CA)上。将连接混合物转化到大肠杆菌中，分离含有单一的2.3kb运铁蛋白cDNA插入片段的克隆，命名为pBSIITF。接着，用EcoRI和SacI消化pBSIITF，以产生相当于运铁蛋白cDNA序列的1.4kb片段。对该片段进行凝胶纯化，并连接于EcoRI和SacI消化的pLDLR2上。将连接混合物转化到大肠杆菌中，并分离含有在EcoRI位点与LDL受体序列接合的1.4kb运铁蛋白cDNA的单克隆，命名为pLT 1.5。然后，对源自由EcoRI和BamHI消化的TfR27A的574bp的运铁蛋白cDNA片段进行凝胶纯化。将该片段和734bp LDL受体/运铁蛋白融合片段(由EcoRI和部分BamHI消化上述PCR产物而产生)连接于EcoRI消化的pLT1.5.上。将连接混合物转化到大肠杆菌中，并分离含有编码与整个成熟运铁蛋白编码序列(氨基酸20-698)融合的人LDL受体的前395个氨基酸(成熟蛋白的374个氨基酸及21个氨基酸信号肽)的序列的单克隆。该质粒被命名为pLDLrTF1。
为了构建可用于在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白的质粒，在用SmaI和EcoNI消化后质粒pLDLrTF1后，从中分离该嵌合蛋白的编码序列。用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段将因EcoNI消化所产生的粘端补平。消化的DNA在1％低熔点琼脂糖凝胶上电泳，并提取相当于嵌合cDNA的3.4kbDNA片段。将该片段连接于在用XbaI消化和Klenow处理后又经凝胶纯化的质粒pEF-BOS(MizuShima，S.和Nagata，S.，“核酸研究”(Nucleic AcidsRes.)18：5322(1990))。质粒pEF-BOS采用源于延伸因子-1α(EF-1α)基因的启动子序列。然后用该连接混合物转化感受态大肠杆菌。通过限制酶分析筛选转化体，分离得到一个在质粒pEF-BOS中具有所需取向的LDLR/TF融合基因(该编码序列的取向由EF-1α启动子的3′延伸)的克隆，并命名为pEFBOS/LDLrTF I.S(图2)。质粒pEFBOS/LDLrTFI.S中LDLR/TF融合基因的全核苷酸序列如图3所示。
实施例2 构建编码一种LDLR/TF嵌合蛋白的质粒，该嵌合蛋白具有与人运
        铁蛋白的氨基酸20-698融合的人LDL的氨基酸1-710
该实施例披露了编码一种LDLR/TF嵌合蛋白的基因的组建，该嵌合蛋白具有与人运铁蛋白的氨基酸20-698融合的人LDLR的氨基酸1-710，并披露了LDLR/TF表达质粒的构建。在该LDL受体-运铁蛋白(LDLR/TF)嵌合蛋白的实施例中，融合点位于成熟LDLR多肽的位置731上的Val密码子之后。获自ATCC的质粒pLDLR2(ATCC#39966)含有编码人LDL受体(LDLR)的cDNA序列。通过以下步骤将该cDNA序列插入质粒pBS(Stratagene，La Jolla，CA)，以便于构建一种嵌合基因。用EcoNI消化pLDLR2，并通过用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理将其末端补平。然后用BgIII消化处理过的DNA。分离含有LDLR cDNA的5′1，721bp的LDLR cDNA及5′非翻译侧翼序列的1.735bp EONI-BglII片段。用BglII和NaeI消化pLDLR2，然后分离一个含有剩余的925bp cDNA和3′非翻译侧翼序列的976bp的DNA片段。通过用EcoRV消化将质粒pBS线性化，并通过用T4 DNA连接酶将分离的1,735bp 5′LDLR和976bp 3′LDLR片段连接于EcoRV消化的pBS上重组LDLR cDNA序列。将连接混合物转化到大感受态肠杆菌细胞中，然后通过限制酶分析分析单细菌克隆。将一个具有正确组装的LDLRcDNA的克隆命名为pBSL-1。
人运铁蛋白cDNA序列获自ATCC保藏物#53106，克隆TfR7A。通过用PstI消化从TfR27A上切除2.3kb运铁蛋白cDNA序列，并将其插入克隆质粒pBSIISK+(Stratagene)的Pst I位点，得到质粒pBSIITF。
为了制备含有融合点在LDLR的氨基酸731(相对于成熟蛋白氨基酸序列编号)与TF的氨基酸20之间的DNA片段，在聚合酶链式反应中采用寡核苷酸LDLRTF 710-1，-2，-3，和-4。
LDLRTF710-1：
5′TGCACACCAT CTCACAGTTT TATCAGGGAC GACCTTTAGC CTGACGGT
(序列9)
LDLRTF710-2：
5′TCAGTGGCCC AATGGCATC
(序列10)
LDLRTF710-3：
5′CAGGAGACAT CCACCGTCAG GCTAAAGGTC GTCCCTGATA AAACTGTGAG A
(序列11)
LDLRTF710-4：
5′CTTCCCATGA GGAGAGCT
(序列12)
在预备PCR反应时，用SalI消化pBSIITF和用NotI消化pBSL1使所述质粒模板线性化。分两步产生含有融合编码序列的片段。第一步是在一种反应混合物中进行，该混合物含有10μl Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)、线性化pBSIITF和pBSL1 DNA各lng、12μl 2.5mM dNTP′s，0.3μl寡核苷酸LDLRTF 710-2和-4、1μl寡核苷酸LDLRTF 710-1和-3，并加水至终体积100μl。用寡核苷酸LDLRTF710-2和-4对上述PCR扩增所得到的1.4kb融合片段进行进一步扩增。对扩增的1.4kb片段进行凝胶纯化，并用EcoNI和EcoRJ消化，然后连接于含有源于pBSL1的LDLR序列的2.18kb SalI-EcoNI片段、源于pBSIITF的1.55kb EcoRI-XbaI片段(含有TF cDNA序列)和SalI-XbaI消化的pBSIISK(Stratagenc，La Jolla，CA)上。将连接混合物用于转化感受态大肠杆菌细胞。通过4重连接得到的具有正确组装的片段的克隆被命名为pLDLRTF-710。
为了在哺乳动物细胞中表达嵌合cDNA，将pLDLRTF1-710的嵌合cDNA亚克隆到表达质粒pEF-BOS(Mizushima，S和Nagata，S.，“核酸研究”(Nucleic Acids Res.)18：5322(1990))上，该质粒利用源自延伸因子-1α(EF-1α)基因的启动子序列。
用XbaI消化pEF-BOS，以除去450bp的填充片段。通过增加一个XbaI接头对位于pBSIISK+和pLDLRTF-710的LDLR结合点的SalI位点进行修饰。用XbaI消化该修饰片段，得到一个含有LDLR/TF融合基因的4.4kbXbaI片段。纯化4.4kbXbaI片段，并连接于XbaI消化的pEF-BOS上。将连接混合物用于转化感受态E.coli细胞。在质粒pEF-BOS中有正确取向的LDLR/TF融合基因XbaI片段(该取向为编码序列由EF-1α启动子的3′延伸)的一个克隆被命名为pEFBOS-LDLR/TF-710(图4)。质粒pEFBOS-LDLR/TF-710中LDLR/TF融合基因的完整核苷酸序列如图5所示。
实施例3用编码LDLR/TF嵌合蛋白的质粒转染哺乳动物细胞并鉴定表达 LDLR/TF嵌合蛋白的克隆
A.转染原代人皮肤成纤维细胞
在该实施例中，在一种培养基中培养获自新生人包皮的正常皮肤成纤维细胞，所述培养基由DMEM(Cellgro 50-013)、15％小牛血清(Hyclone)、均为25单位/ml的青霉素和链霉素(Gibco 15070-014)和2.25％Hepes缓冲液(Gibco 15630-015)组成。在电穿孔缓冲液(137mM NaCl、6mM葡萄糖、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、1mg/ml乙酰化BSA[Sigma B-2518]、20mMHepes缓冲液，pH7.3)中洗涤生长细胞，并以每毫升6百万个细胞的浓度重悬于电穿孔缓冲液中。将体积不足50μl的质粒DNA(共100μg)加至电穿孔仪的样品池(BIO-RAD 165-2085)中，随后加入0.5ml的细胞悬浮液(共3百万个细胞)。
质粒DNA由等摩尔的编码所述嵌合蛋白的质粒(在该例中为61.2μgpEFBOS/LDLrTFl.S(8.66kb)见实施例1)和带有显性选择药物抗性标记的质粒(在该实施例中为38.8μg质粒pSV2neo(5.50kb；ATCC # 37149)组成。基于对药物G418的抗性将质粒pSV2neo用于有效选择稳定转染的细胞。
对所述样品池施以电脉冲(250V，电容设定为960微法拉)，使DNA充分进入细胞。释释细胞，并铺板于组织培养皿中，培养皿里盛有添加了0.4mg/mlG418(GENETICIN，Gibco 860-1811)的同一种生长培养基。只有稳定地转染了pSV2neo或同时转染于pSV2neo和pEFBOS/LDLrTFI1.S的细胞可在该培养基中形成集落。在其基因组上未能整合pSV2neo的细胞被所述药物杀死，且不形成集落。还可以采用能赋予显性选择药物抗性的其它共转染质粒。
在培养2-3周后，肉眼鉴定G418-抗性细胞克隆，并转移到多孔平板上，在含有所述药物的培养基中进一步生长。然后对分离到的抗药性转染体克隆进行源于嵌合蛋白编码质粒(在该例中为pEFBOS/LDLrTF1.S.)的嵌合蛋白的共表达和分泌的筛选。
为了鉴定嵌合蛋白表达克隆，在一种分析中检验各克隆的条件培养基，看其中是否存在有所述嵌合蛋白，在该实施例中，以上分析是基于对细胞受体配体结构域(本例中为人运铁蛋白)的检测。将用于人运铁蛋白的夹心酶免疫测定(TF ELISA；见实施例6)用于检测所述条件培养基中的嵌合蛋白。隔离培养表达LDLR/TF的阳性克隆，并对嵌合蛋白的表达水平进行定量分析。
在一个实验中，用克隆环从生长于含有0.4mg/ml G418的培养基中分离206个转染的克隆，并转移到96孔培养皿中。生长一个时期之后，通过TFELISA检验条件培养基中TF抗原的存在，发现其中22个为阳性。负对照培养物(生长于无G418条件下的未转染细胞的克隆或用pSV2neo转染后分离得到的G418-抗性克隆)不表达可检测到的人TF抗原。扩增22个阳性克隆中的16个，以便作进一步分析。将培养物在T-25瓶中生长至接近铺满，并加入新的培养基。24小时后分离该培养基，通过TF ELISA对嵌合蛋白的含量进行定量。对所述细胞进行胰蛋白酶消化，并用Coulter计数器测定细胞数。计算获自各瓶的条件培养基中总嵌合蛋白量(以纳克(ng)运铁蛋白当量[TFeq]计)，并除以各瓶的总细胞数，得到表达率的定量结果，以每日每106细胞所产生的TFeq ng数表示。在15个表达克隆中测得的嵌合蛋白表达水平为：2、7、11、21、49、52、90、93、99、131、175、193、200、206和231ng TFeq/106细胞/日。
B.转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞
用磷酸钙沉淀法(Graham，F.L，和Vander Eb，A.J.，“病毒学”(Virology)，52：456(1973)；Chu和Sharp，“基因”(Gene)，13：197(1981)用嵌合蛋白表达质粒(该实施例中为pEFBOS/LDLrTF1.S)转染CHO细胞。一种共转染显性选择标记质粒pSV2dhfr也被用于稳定转染细胞的克隆选择，该方法是根据宿主CHO细胞系DUKX-B11中非功能性二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的互补作用(Chasin，L.和Urlaub，G.，“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，77：4216(1980))。在以下实验中，使用质粒pSV2dhfr的dhfr基因(S.Subramani等，“分子细胞生物学”(Mol.Cell.Biol)，2：854-864(1981)，其中dhfr是SV40启动子表达。
在完全培养基中培养源于DUKX-B11的细胞，该培养基含有aMEM(无核糖核苷和脱氧核糖核苷，Sigma M-4526)、10％胎牛血清(Hyclone A-1111)、4mM L-谷氨酰胺(Gibco 25030-016)、分别为50单位/ml的青霉素和链霉素(Gibco 15070-014)、15μg/ml L-脯氨酸(Sigma P-4655)、10μg/ml腺苷(Sigma A-4036)、10μg/ml胸苷(Sigma T-1895)和10μg/ml脱氧腺苷(Sigma D-8668)。
向生长于T75瓶中20ml完全培养基里的铺满度达约60-70％的细胞中加入10ml新的完全培养基，并在37℃下培养4小时。在结束为期4小时培养之前30分钟时，用以下方法制备细磷酸钙沉淀和质粒DNA的悬浮液：
将质粒pEFBOS/LDLrTF1.S(50μg)和pSV2dhfr(1μg)混合于总体积为0.5ml的含有0.25M CaCl2的TE缓冲液(1mM Tris-HCl，0.1m MEDTA，pH7.9)中。将该溶液滴加到含有280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4、50mM Hepes，pH7.1的另一种溶液中。在室温下将1ml混合物静置30分钟，以形成磷酸钙沉淀。将1ml悬浮液加至预先温育细胞4小时的10ml培养基中。搅拌该培养基，以分散所述颗粒，并在37℃下将所述细胞再培养4小时。通过抽吸除去培养基，并在室温下让所述细胞与5ml含有20％甘油的完全培养基接触1分钟。随后加入15ml完全培养基以除去甘油，接着再分别用20ml完全培养基洗涤两次。然后向细胞中加20ml完全培养基，并在37℃下培养24小时，使所述转染质粒DNA整合到染色体上并表达。24小时后，对所述细胞进行胰蛋白酶消化，并在DHFR选择培养基中分成7份等体积的培养物(即A-G收集物)。
DHFR选择培养基仅能正选择获得并表达质粒pSV2dhfr的细胞(有或没有pEFBOS/LDLrTF1.S)。不能表达DHFR的细胞不能生长于该选择培养基中。DHFR选择培养基含有aMEM(见上文)，10％透析过的胎牛血清、4mML-谷氨酰胺，分别为50单位/ml的青霉素和链霉素，以及15μg/ml L-脯氨酸。该培养基含有0.1％葡萄糖和0.22％碳酸氢钠。
让收集物A-G在DHFR选择培养基中生长17天，长至接近铺满，在此期间每3或4天用新的选择培养基进行补充。然后向各收集物的细胞补充20ml新的选择培养基，培养24小时，回收条件培养基并通过TF ELISA测其嵌合蛋白含量。
该选择培养基中所含的牛运铁蛋白抗原不会与TF ELISA中所用的抗人运铁蛋白的抗体发生交叉反应。而且，在该测验中，未转染的宿主CHO细胞系、DUKX-B11不能合成在测试中可检测到的可分泌运铁蛋白抗原。因此，在转染细胞群条件培养基中测得的高于该测验背景水平(1ng/ml)的任何浓度的运铁蛋白抗原均可作为该转染群体表达并分泌LDLR/TF嵌合蛋白的证据。
在DHFR选择培养基中生长17天以后，经收集物A-G的细胞条件作用24小时的培养基中含有可检测水平的嵌合蛋白。在该实施例中，在为期1天的条件作用期结束时，收集物A-G分别产生53、52、52、79、74、75和33ng TFeq/ml。因此，起初所有组的细胞能产生含量相当但含量不相同的嵌合蛋白。因此，pSV2dhfr-编码DHFR酶表达的选择会导致源于pEFBOS/LDLrTF 1.S的嵌合蛋白的共表达，因为相当比例的细胞在可表达形式中同时整合了两种质粒。
然后用很多已完善的DHFR基因扩增方法(Kaufnan，R.J.和Sharp，P.A.，“分子生物学杂志”(J.Mol.Biol)，159：601(1982))中的任一种处理细胞群A-G，以选择能表达较高含量DHFR酶的亚群，这种特性又与对毒性抗叶酸药物氨甲蝶呤(MTX)相关。在该实施例中，先选择抗20nM MTX的收集物，再选择抗50nM MTX(Sigma M-8407)的收集物。在每一步，通过TF ELISA监测各相关亚群中分泌性嵌合蛋白的共表达水平。表现出嵌合蛋白产量提高的亚群，可能含有某些高表达力细胞，该细胞可通过细胞克隆从所述亚群中分离。
在该实施例中，收集物E和收集物F亚群在20nM MTX和50nM MTX下的嵌合蛋白表达比其它收集物提高的幅度大。然后通过有限稀释法克隆在50nM MTX下选择的收集物E和收集物F的细胞；在大量克隆中，鉴定出收集物E的9个、收集物F的14个细胞克隆为最佳生产克隆，分离这些细胞克隆，并在多孔培养板上通过TFELISA测定嵌合蛋白产量。对以上23个克隆(包括收集物E的两个最高产者(E77和E117)，和收集物F的两个最高产者(F3和F57))作进一步测定，分析在经过更多轮DHFR基因扩增之后其提高产量的能力(实施例4)。
实施例4鉴定生产细胞系并评价嵌合蛋白生产的潜在调节物
A.生产细胞系的鉴定
在含有100nM MTX(Sigma M-8407)的DHFR选择培养基(实施例3)中生长源于dhfr-缺陷型CHO系DUKX-B11的氨甲蝶呤(MTX)-抗性CHO细胞系。该培养基含有0.1％葡萄糖。某些培养基还含有2mM丁酸钠(Fluka19364)或丝氨酸蛋白抑制剂抑蛋白酶肽(Boehringer Mannheim 981-532)或Refablock SC(Boehringer Mannheim 1429-876)。
分别培养收集物E的两个最高表达克隆(E77，它在6-孔平板上在为期4天的培养中能产生大约1.5μg TF eq/ml，和E117，它在6-孔平板上在为期4天的培养中能产生1.1μg TF eq/ml)，并通过选择对100nM MTX的抗性进行扩增，以确定嵌合蛋白的产量是否会增加。收集物E的所有9个克隆合并成一个新的收集物，称作收集物H，然后通过选择对100nM MTX的抗性进行扩增。类似地，通过选择对100nM MTX的抗性分别扩增收集物F的两个最高表达克隆(F3和F57)，并将收集物F的全部14个克隆合并成一个新的收集物，称作收集物J，并以类似方法扩增。
以提高的DHFR扩增的函数形式评价以上4个克隆(E77、E117、F3和F57)、收集物H和收集物J在T75培养瓶中的提高的生产力(ng TF eq/106细胞/日)。通过TF ELISA测嵌合蛋白产量。还可以在随后的继代培养期间在相同MTX抗性水平下测其产量而监测所述生产力的稳定性。
结果(见表1)表明，克隆E77是最高的稳定生产克隆。随后扩增至200nM和500nM MTX不会导致嵌合蛋白生产力的提高。同样，选择收集物H和收集物J对MTX抗性的提高不会因此选择出更高产的亚群。
克隆E77看来似乎在100nM MTX中的生长较好，因此被选作滚瓶的生产细胞系。
表1作为MTX浓度和继代培养次数函数的CHO转染子库和克隆的嵌合蛋白生产力(ng TFeq/106细胞/日)
[MTX](nM) 继代培养     E77     E117     F3     F57 收集物H 收集物J
    50     1     1577     479     616     830     404     328
    50     2     1168     ND     552     608     ND     ND
    100     1     3554     800     620     1031     505     224
    100     2     1842     1532     347     604     381     187
    100     3     2011     729     641     1135     252     121
    100     4     1462     593     ND     ND     ND     ND
    200     1     1791     779     699     1045     404     90
    200     2     2000     728     855     948     327     97
    200     3     1598     928     975     546     510     100
    500     1     1577     957     855     ND     319     50
    500     2      ND     954     ND     ND     322     52
ND：未测定
B.评价嵌合蛋白产量的潜在调节物
研究在T瓶和滚瓶中生产细胞系E77产生的嵌合蛋白的数量和品质。
早先的免疫沉淀实验已证实，来自用质粒pEFBOS/LDLrTF1.S转染的人成纤维细胞的培养物上清液的一少部分免疫沉淀蛋白保留了TF结构域，但缺少完整的LDLR结构域。还发现由CHO细胞系E77(以及CHO转染子的其它克隆或库)分泌的嵌合蛋白也是如此。推断这种较小的产物可能是因为一种特异性内肽酶作用于LDLR结构域内的一个位点而产生的假说，可以通过测定该产物的累积量是否会受到特殊蛋白酶抑制剂或加热失活的血清的抑制而得到证实。浓度为0.002％的丝氨酸蛋白酶抑制剂抑蛋白酶肽在降低该较小产物方面的作用较小。因此，试验了较高浓度(0.5％)的抑蛋白酶肽。
在T75瓶中用3种不同的培养基将细胞生长至铺满，所有培养基均含有DMEM和100nM MTX。培养基A含10％透析过的FBS(胎牛血清)，无添加剂，培养基B含10％加热失活的透析FBS，而培养基C与培养基A相同，不同的是添加0.5％抑蛋白酶肽。分别向培养物中加入培养基A、B或C，并培养。在加培养基1和2天后并在37℃下培养7天后从条件培养基中取小样，培养之后，在非还原SDS/聚丙烯酰胺凝胶上对各样品进行电泳，转移到硝酸纤维素上，并通过结合于和绵羊抗人TF缀合的辣根过氧化物酶(HRP)进行检测。
结果表明，所述较小的产物于2天后累积在培养基A中，并于1天后以低丰度出现在所有3种条件下。添加培养基B(加热灭活血清)不能阻止这种体外蛋白酶解，与蛋白酶解剂不是所述血清的可加热灭活的成分的看法一致。不过，加入0.5％抑蛋白酶肽(培养基C)能明显降低蛋白酶解程度。这支持了以下观点：在通过铺满培养物条件作用培养基期间，完整长度嵌合蛋白的降解，是由具有特异内肽酶活性的分泌性丝氨酸蛋白酶所致。
用其它抑制剂也可抑制丝氨酸蛋白酶活性(Pefablock SC；PB)。对3天条件作用的培养基进行Western印迹分析发现，提高培养基中PB的浓度会使100kd降解产物的相对丰度降低。使用0.6mM PB看来似乎有强的抑制作用，尽管0.3-0.5mM PB也能明显降低降解作用。
实施例5 LDLR/TF嵌合蛋白的滚瓶生产
最初的按比例放大嵌合蛋白产量的试验涉及采用表面增大20倍(1450cm2)的滚瓶(Falcon 3069)，每瓶装有250ml培养基，均以0.3转/分钟的速度转动。让E77细胞长至铺满，并每周补饲并收获(实施例4)。将20个滚瓶分为3个处理组。滚瓶RB8-RB12添加100nM MTX培养基。RB3-RB7添加无MTX的培养基。RB13-RB22添加100nM MTX培养基，但接种E77的亚克隆-SC7。
共得到48.5升培养液，其含有96mg TFeq或149mg嵌合蛋白，平均每升产生3.1mg嵌合蛋白。RB13-RB22的平均嵌合蛋白浓度最低，为2.2mg/1，而RB3-RB7组和RB8-12组的产量分别为3.3mg/l和3.8mg/l。以上结果表明，除去MTX选择剂不会提高产量。合并RB3-RB22的48.5升条件培养基，并浓缩以便作进一步纯化。
实施例6 TF ELISA
在测定嵌合蛋白中所含人TF抗原的夹心酶免疫测定(TF ELISA)中，用以1∶1000的比例稀释于1×PBS(Gibco 310-4200AJ)的MAb HTF-14(Biodesign H 61016M)涂敷平板。用溶于ELISA封闭缓冲液(PBS，2％BSA、0.05％Tween-20)中的人脱辅基-TF(SigmaT-1147)作为标准。人全-TF(铁饱和的)表现出有与脱辅基-TF(无铁)相同的标准曲线。检测用的酶缀合物是以1∶5000的比例用于ELISA封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗人TF(Biodesign K 90070P)。HRP底物为OPD(Dako S-2000)，将8mg OPD溶于12ml含有0.0125％H2O2的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.0而制成。
基于与人脱辅基-TF标准的比较，TF ELISA能有效检测嵌合蛋白的摩尔浓度。所述嵌合蛋白的蛋白组分的分子量(116.3Kd)比人TF的分子量(75.1Kd)大55％。假设所述嵌合蛋白对MAb HTF-14和HRP-羊抗人TF的亲和力与人TF标准对它们的亲和力相同，则嵌合蛋白的浓度可以以与每ml TF纳克当量相当的值表示(即：ng TFeq/ml)。因此，在这种情况下以ng/ml计的嵌合蛋白的实际浓度约高出55％。
实施例7 LDLR/TF嵌合蛋白的纯化
本实施例中采用以下材料和方法。为了从MAb HTF-14腹水中纯化IgG，使用山羊抗小鼠IgG琼脂糖珠(Hyclone EK-4081)。用HRP-缀合的绵羊抗小鼠IgG(Cappel 55565)检测小鼠IgG。让HTF-14 IgG与溴化氰激活的琼脂糖反应，将所述抗体共价连接于琼脂糖珠上，以便用于含TF表位的嵌合蛋白的免疫亲合(IA)纯化。对于基于LDL结合的IA层析来说，首先让亲合纯化的免抗人LDL(Biomedical Technologies BT-905)与溴化氰激活的琼脂糖共价反应，然后再将其用于共价固定纯化的人LDL(BiochemicalTechnologies TB-903)。用HRP-缀合的山羊抗兔IgG(Cappel 55689)检测兔IgG。
A.通过抗-TF免疫亲和层析进行纯化
1.从MAb HTF-14腹水中分离IgG
用一个单克隆抗体亲和分离系统(Hyclone，EK-4081)从腹水中(Biodesign，H61016M，IgGl亚类)分离抗运铁蛋白单克隆抗体HTF-14。该系统采用抗体抗小鼠IgG包衣的琼脂糖珠，以便结合并从腹水中分离所述单克隆抗体。用含85％NaCl的50ml 30mM乙酸由一个步骤洗脱所述抗体，并滴注到固体硼酸钠中，使终浓度为0.1M硼酸钠、30mM乙酸、85％NaCl。收集液被立即放入12-14Kd截断分子量的透析管中，并在4℃下透析过夜，然后于-20℃冷冻。将收集液解冻，合并，并用Amicon Centriprep浓缩至50-12.5ml，浓度为4.36mg蛋白/ml。从112ml腹水中纯化得到54mg抗运铁蛋白单克隆抗体。有效抗体在这一纯化步骤的产率为99％。
2.将HTF-14固定在溴化氰活化的琼脂糖上
将纯化的单克隆抗人运铁蛋白抗体(HTF-14)共价结合于溴化氰激活的Sepharose 4B(CN-Br 4B)(Pharmacia)上。用0.01 NHCl将12g支持物膨胀至37ml。然后用10倍体积含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3(pH8.3)洗涤所述珠。加入含0.5M NaCl的由0.1M NaHCO3(pH8.3)配制的浓度为4.36mg/ml的抗体溶液，并在4℃下反应20小时，同时在机械转动的平台上轻轻摇动。通过加入30ml 1M乙醇胺(pH8.5)转动3小时封闭游离胺基。
3.结合并洗脱浓缩的条件培养基收集液中的嵌合蛋白
将支持物脱气，并倾入50ml的Pharmacia Econo柱中。该柱在TBS(pH7.4)中平衡。培养上清液事先已被浓缩32倍(从48.5升浓缩至1.5升)。对其再次进行分析，发现含有62.3mg运铁蛋白当量和1,044g总蛋白。以10,000rpm的速度离心培养物上清液，并经0.22μm的滤膜过滤。然后将其直接加注到HTF-14免疫亲和柱上，以100ml/小时的速度循环40小时。用10倍柱体积的TBS(pH7.4)洗柱。再用0.1M甘氨酸(pH2.3)洗脱该柱。将2ml的级分收集到盛有1ml 2MTris-HCl(pH8.5)的试管中，以中和洗脱缓冲液。收集级分7-30。经测定该收集液中含54mg总蛋白，其中有26.4mg嵌合蛋白(非降解和蛋白酶降解部分)，相当于纯度为49％，由培养基进行一步纯化的倍数为8193倍。
B.LDL配体亲和层析
1.将免抗人LDL固定在溴化氰活化的琼脂上
将5mg多克隆兔抗人LDL抗体(Biomedical Technologies，BT-905)结合于溴化氰激活的Sepharose 4B(CN-Br 4B)(Pharmacia)上。将兔抗hLDL透析到含有0.5MNaCl的0.1MNaHCO3(pH8.3)中。在0.01N HCl中膨胀350μg支持物。然后用含有0.5M NaCl的10倍体积的0.1M NaHCO3(pH8.3)洗涤上述支持物。加入抗体溶液并通过在4℃下轻轻混合24小时进行反应。然后通过加入2ml 1M乙醇胺(pH8.5)轻轻混合1小时封闭游离胺基。99％的有效抗体结合于所述柱上，形成共价结合有5mg抗h LDL的1ml抗hLDL柱。
2.结合LDL
获得由10mg LDL(Biomedical Technologies，BT-903)溶于50mM Tris、0.15M NaCl和0.3mM EDTA中制成的浓度为5mg/ml的溶液。将该溶液透析到含有2mM CaCl2的TBS中。将10mg LDL以2mg/ml的浓度在抗hLDL柱上循环10次。经测定，有3.2mg LDL留在流通液中，表示约有6.8mg hLDL结合在柱上。
3.结合并洗脱IA收集液中的嵌合蛋白
将1ml浓缩的免疫亲和纯化的嵌和蛋白(在抗TF IA柱上纯化)(含有138μg嵌和蛋白)在1ml的抗h LDL/LDL配体亲和柱上循环10次。假设非降解蛋白与蛋白酶解裂解蛋白之比为1∶1，说明有67μg完整蛋白。流通液中含有29μg或21％嵌合蛋白。用20倍体积的TBS(pH7.4)洗柱，然后用由TBS配制的20mM EDTA(pH7.4)洗脱。收集1ml级分。通过在280nm处的光吸收测知，级分2和3含有蛋白峰值。在Amicon Centriprep 100过滤装置中以1000rpm离心30分钟浓缩上述级分。测知有10.2μg加入的完整嵌合蛋白被洗脱到峰值级分中。
实施例8用蛋白酶抑制剂纯化LDLR/TF嵌合蛋白并解离结合牛LDL
前面的实施例披露了一种从CHO生产细胞系E77中分离非降解的LDLR/TF嵌合蛋白的纯化方法，该方法采用以下步骤：1)收集并浓缩条件培养基，2)免疫亲和层析(嵌合蛋白的人运铁蛋白结构域与固定的HTF-14单克隆抗体的特异结合)，和3)配体亲和层析(嵌合蛋白的人LDLR结构域与固定的人LDL的特异结合)。尽管前面的实施例中介绍了一种分离LDLR/TF嵌合蛋白的两步法，但LDL配体亲和层析步骤相对而言不够充分(即：只能回收加入的一部分蛋白)。这可能是由于这样的事实：免疫亲和纯化的嵌合蛋白含有结合的胆固醇，可能为源于在细胞培养中所用的透析的胎牛血清的牛LDL颗粒形式。因此，在一部分嵌合蛋白分子中，由于结合的源于血清的牛LDL-胆固醇而使人LDL结合可能受到抑制。本实施例所提供的方法涉及在结合于固定的人LDL上之前从嵌合蛋白上解离牛LDL。
嵌合蛋白聚集在含有丝氨酸蛋白酶抑制剂PefablockSC(以0.2mM的浓度加入新鲜培养基中)的培养基中。该抑制剂对于所产生的总嵌合蛋白量无明显影响，但其确实提高完整LDLR/TF的相对产量。浓缩条件培养基，并加注到HTF-14免疫亲和柱上。由于LDL结合至嵌合蛋白LDLR结构域上是二价阳离子依赖型的，而MAb HTF-14与嵌合蛋白的运铁蛋白结构域的结合是不依赖二价阳离子的，所以，用EDTA洗所述含有结合嵌合蛋白的柱，以便特异性地洗脱结合于嵌合蛋白上的牛LDL。在EDTA洗脱之后，用实施例7所述方法用0.1M甘氨酸(pH2.3)洗脱嵌合蛋白，结果是LDLR/TF产物含有较少的结合胆固醇。该材料可用于体外和体内实验，或用于治疗目的。还可选择性地通过LDL配体-亲和层析对其作进一步纯化，以除去已丧失LDLR结合域的降解产物。
为了阐明免疫亲合纯化的具有结合的牛LDL的嵌合蛋白(实施例7)与免疫亲和纯化的缺乏牛LDL的嵌合蛋白(本实施例)的差异，首先将用蛋白酶抑制剂产生的嵌合蛋白结合于HTF-14免疫亲和柱上，洗脱，并再次上HTF-14柱。在有0.2mM PefablockSC的条件下生产出总共43.51升条件培养基，其含有56.1mg嵌合蛋白，用一个装有截断分子量为100,000da的过滤盒(Millipore)的Pellicon切向流过滤系统将培养基浓缩主体积为1.17升，含50.8mg嵌合蛋白(回收率为91％)。浓缩液(50.8mg嵌合蛋白，90.7g总蛋白)上HTF-14柱(87％结合)，并按上述实施例方法用0.1M甘氨酸(pH2.3)洗脱)。几乎所有的洗脱嵌合蛋白均被释入头24个级分中。合并上述级分，其含有35.9mg嵌合蛋白和82.6mg总蛋白，相当于纯化了776倍，回收率为71％。发现该嵌合蛋白洗脱库(称IA1)中，每mg嵌合蛋白含2.9mg总胆固醇。
将IA1库的24.4mg嵌合蛋白再上HTF-14柱(99.9％结合)。用20mMEDTA洗脱不能释出大量嵌合蛋白(0.005％的总结合嵌合蛋白被释出)。随后用0.1M甘氨酸(pH2.3)洗脱嵌合蛋白，收集主洗脱峰级分，并用PBS透析收集液，得到含有19.13mg总嵌合蛋白(回收率78％)的收集液。发现该嵌合蛋白洗脱库(称作IA2)中每mg嵌合蛋白仅含有0.13mg总胆固醇。因此，在甘氨酸洗脱前，用20mM EDTA洗柱已除去95％以上结合于嵌合蛋白的胆固醇。
为了进一步纯化，在有二价阳离子的条件下将嵌合蛋白的IA2制剂上人LDL配体亲和柱，然后如实施例7所述方法用1摩尔过量的EDTA洗脱。缺乏牛LDL的上柱材料的结合和洗脱总回收率比实施例7中所述材料的大，由于结合至嵌合蛋白的牛LDL而使该柱的结合和回收受到抑制。
图6表示LDLR/TF嵌合蛋白形式，产生于CHO细胞，在免疫亲和纯化(IA)的各个时间并通过非还原SDS/PAGE和Western印迹进行分析。电吸印到硝酸纤维素上的蛋白结合于过氧化物酶缀合的抗人运铁蛋白抗体，随后对过氧化物酶进行化学发光检测。主带是LDLR/TF嵌合蛋白，而较小的次带表示已丧失LDLR结合域的产物。
泳道1表示源于表达LDLR/TF嵌合蛋白的CHO细胞的浓缩的条件培养基。泳道2表示通过实施例7的方法从CHO细胞上清液中纯化的LDLR/TF嵌合蛋白。加样材料为从IA(MAb HTF-14)柱上洗脱的蛋白级分库的一个等分试样。泳道3表示用TBS透析过的泳道2的LDLR/TF嵌合蛋白库。泳道4表示用实施例7所述方法从CHO细胞上清液中纯化的LDLR/TF嵌合蛋白。浓缩的条件培养基被结合于抗人运铁蛋白免疫亲和柱上，并从该柱上洗脱，然后结合于人LDL配体亲和柱上，并从该柱上洗脱。发现缺少免疫活性材料的较小的带。泳道5表示用实施例8所述方法从CHO细胞上清液中纯化的LDLR/TF嵌合蛋白，该方法包括解离结合的牛LDL的步骤。泳道3所示库的嵌合蛋白(IA1)再次结合于IA柱上，然后通过在含有20mM EDTA的TBS中洗柱除尽结合的牛LDL。此处所示嵌合蛋白(称作IA2)表示EDTA洗涤步骤后从IA柱上洗脱的蛋白级分库。泳道1，2，3和5中的材料是从在有丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefablock SC的条件下生长的CHO细胞中分离的。
实施例9通过体外结合试验测定结合于LDLR/TF上的LDL
为了研究LDL对LDLR/TF的结合亲和力，研究出了一种小平板结合试验。在该试验中，人LDL由结合于板上的嵌合蛋白捕获在该板上，嵌合蛋白通过用于涂孔的抗TF单克隆抗体结合于板上。然后通过与抗-LDL抗体反应检测人LDL。该试验取决于同时含有TF和LDLR结构域的嵌合蛋白。
在37℃下用Mab HTF-14(1∶500的比例溶于50mM Tris-HCl，2mMCaCl2，pH8.0中)涂96孔ELISA小平板45分钟，然后在溶液B(50mMTris-HCl，2mM CaCl2、pH8.0，0.5％BSA、0.05％Tween-20)中洗涤3次。在37℃下于封闭溶液(50mM Tris-HCl，2mM CaCl2，pH8.0，1％ BSA，0.05％ Tween-20)中将各孔培养45分钟。除去封闭溶液并代之以各种结合介质，在37℃下培养30分钟。结合介质含有以0.5μg/ml(0.97nM aooB-100)-50μg/ml(97nM apoB-100)的浓度溶于溶液B中的人LDL，此外，加入浓度为1.55μg/ml(13.3nM)的嵌合蛋白、浓度为1μg/ml(13.3nM)的人运铁蛋白，或什么也不加。用溶液B将板洗涤3次，然后在37℃下与对人LDL特异的绵羊多克隆Ab(IgG)(以1∶1000的比例溶于溶液B中；BiomedicalTechnologies，Inc.，BT-999)一起培养30分钟。用溶液B将所述平板洗涤3次，然后在37℃下与对绵羊IgG特异的过氧化物酶缀合的兔多克隆Ab(以1∶5000的比例溶于溶液B；Cappel，55814)一起培养20分钟。用溶液B将该板洗涤3次，然后在37℃下与过氧化物酶底物1，2-亚苯二胺(0.67mg/ml，溶于0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.0)一起培养5分钟。以0.8N的终浓度加入H2SO4终止反应，然后用小平板读数器在490nm处测光吸收。在各种LDL浓度下，从含有人运铁蛋白的结合介质中获得的信号与在无运铁蛋白或嵌合蛋白的条件下获得的信号相当，该信号被视为非特异结合的背景水平。从在有嵌合蛋白的条件下获得的信号中扣除在各种LDL浓度下非特异结合的平均吸收值，得到表示LDL与嵌合蛋白特异结合的吸收值。将该吸收值对LDL浓度作图，如图7所示。假设50μg/ml浓度下的信号表示最大结合，观察到的LDL的半数最大结合是在约1.6μg/ml(3.1nM)时。
实施例10 LDLR/TF嵌合蛋白的结合和解离特性
对LDL:LDLR相互作用已作详细说明，证明其需要Ca++或其它二价阳离子。另外，LDL配体与LDLR的结合取决于pH，因此在低pH下会发生解离(J.L Goldstein和M.S.Brown，“生物化学年评”(Ann.Rev.Bioche m.)，46：897(1977))。从生理上讲，后一特征是重要的，它使LDLR能将LDL释入酸性体内区域中，并再利用所述受体。因此，为研究LDL:LDLR相互作用而专门设计的体外试验被用于研究LDL与LDLR/TF嵌合蛋白结合和解离的pH和阳离子依赖性。
检测用实施例8方法生产并纯化的LDLR/TF嵌合蛋白的LDL结合特性。具体地讲，通过检测在有和没有EDTA的条件下的结合研究LDL与嵌合蛋白的LDLR结构域结合的阳离子依赖性。通过在有和没有EDTA的条件下进行的检测结合后洗涤步骤的的效果研究LDL与嵌合蛋白LDLR结构域结合的阳离子依赖性。类似地，通过检测在结合期间和结合后洗涤步骤中pH8.0与pH5.2条件下的效果分别研究LDL结合于嵌合蛋白的pH依赖性。在低pH值下降低的结合力表明，在内体的酸性环境下LDL可从LDLR/TF:TFR复合体中释出，以便再利用该复合体。为了检验以上结果研究出了一种小平板结合试验，结果如图8所示。
该小平板结合试验检测结合于固定在涂有抗LDL抗体的ELISA平板上的LDL上的嵌合蛋白量。用溶于50mM Tris-HCL，pH8.0，2mM CaCl2(溶液A)中的5μg/ml绵羊抗人LDL抗体涂96孔微量滴定板。用溶液A+0.5％BSA洗涤，然后在37℃下用溶液A+1％BSA封闭30分钟。作为负对照的样品孔不涂抗人LDL抗体(无Ab)。用溶液A+0.5％BSA洗涤除去非结合的LDL。由于预计LDL:LDL结合对二价阳离子浓度不敏感，而用溶液A+0.5％BSA和20mM EDTA(在EDTA中预洗)洗涤某些对照孔。接着，以1μg/ml的浓度将溶于溶液A+0.5％BSA(未处理)的嵌合蛋白加入所有孔中，并在37℃下培养30分钟。用溶于溶液A+0.5％BSA和20mM EDTA的嵌合蛋白处理某些孔(在EDTA中结合)，其它孔用pH5.2的含有25mM乙酸钠、150mM NaCl和2mM CaCl2的缓冲液中的嵌合蛋白处理(在pH5.2中结合)。然后用下列3种溶液之一洗涤样品：1)溶液A+0.5％BSA(未处理)，2)溶液A+0.5％BSA和20mM EDTA(在EDTA中洗涤)或3)25mM乙酸钠(pH5.2)，150mM NaCl、2mM CaCl2(在pH5.2下洗涤)。然后在37℃下用HRP-缀合的绵羊抗人运铁蛋白抗体(Biodesign K90070P，以1∶5000的比例稀释于溶液A+0.5％BSA中)培养孔30分钟，接着用溶液A+0.5％BSA进行充分洗涤(非处理)。某些孔用溶液A+0.5％BSA和20mMEDTA洗涤(在EDTA中的后HRP洗涤)，而其它孔在25mM乙酸钠(pH5.2)、150ml NaCl、2mM CaCl2中洗涤(在pH5.2下进行的后HRP洗涤)。最终的洗涤步骤之后在37℃下与邻苯二胺底物反应5分钟。加入2N H2SO4终止反应，然后在490nM处对所述板分析吸收。
如图8所示，嵌合蛋白与板(非处理的)的结合完全取决于板结合LDL的存在，因为包衣抗体(抗-LDL)的缺乏导致仅有背景含量的嵌合蛋白结合(无Ab)。而且，EDTA不能明显解离结合于包衣抗体的LDL，对最终嵌合蛋白结合信号(在EDTA中预洗)的较小影响证实了这一点。
如果该结合步骤是在EDTA的摩尔数超出Ca++10倍的条件下(在EDTA中结合)或在酸性条件下(在EDTA中结合)或在酸性条件下(在pH5.2下结合)进行，与平板固定的LDL结合的嵌合蛋白量急剧下降至背影或接近背景水平。这表明嵌合蛋白：LDL结合相互作用取决于非螯合二价阳离子的存在，并且对pH敏感，类似于在体外或体内观察到的LDL:LDLR结合作用。
嵌合蛋白在允许条件下结合以后，接着在EDTA(在EDTA中洗涤)或在酸性条件下(在pH5.2下洗涤)进行的洗涤步骤，能有效从LDL解离嵌合蛋白至背景或接近背景水平。上述结果表明，在酸性条件下嵌合蛋白能释放其结合的LDL，如对LDLR所作的体外和体内观察所证实的。
在嵌合蛋白结合、洗涤并结合于HRP-缀合的抗人运铁蛋白抗体上之后，随后在EDTA(在EDTA中的后HRP洗涤)中或在酸性条件下(在pH5.2下的后HRP洗涤)进行的洗涤步骤仅能部分实现从LDL上解离嵌合蛋白。因此，上述结果证实pH和EDTA的作用是由于LDL：嵌合蛋白复合体的解离，而不是由于抑制了HRP缀合的抗人运铁蛋白抗体与预先形成的LDL：嵌合蛋白复合体中TF结构域的结合。另外，上述结果表明，抗体与嵌合蛋白的TF结构域的结合对LDLR结构域有别构效应(导致LDL亲和性提高)，或者导致对解离剂的空间位阻作用(使LDL：嵌合蛋白复合体在解离条件下的稳定性增加)。
实施例11在哺乳动物细胞中表达的LDLR/TF嵌合蛋白含有完整LDLR和TF 结构域
该实施例描述的实验证实了单个LDLR/TF嵌合蛋白含有LDLR和TF结构域，其基于所用MAbs的已知特异性，表明该结构域保留了分别对LDL和TFR的功能性结合活性。
在转染的哺乳动物细胞中表达的LDLR/TF嵌合蛋白源于由5′人LDLRcDNA序列(374个氨基酸的配体结合域)从3′末端融入编码成熟人运铁蛋白的完整cDNA序列构成的融合基因。为了证实该嵌合蛋白保留了天然LDLR和TF蛋白的结构特征，作者在本文中证实，LDLR/TF嵌合蛋白可由两种不同的MAbs：HTF-14(抗人TF，Biodesign H61061 M)和C7(抗人LDLR，Amersham RPN 537)进行免疫沉淀。
已知MAb HTF-14可与人TF上的构象(和非还原)表位特异反应，其图谱位于或接近TFR结合位点。HTF-14与TF的结合能抑制TFR结合。MAb HTF-14与LDLR/TF嵌合蛋白的结合证实了该嵌合蛋白的TF结构域大部分是完整的，并暗示LDLR/TF中的这种构象也会具有TFR结合活性。
实施例12提供的数据表明，LDLR/TF嵌合蛋白实际上确实结合于人TFRS。
已知MAb C7能在LDL(配体)-结合位点或接近该位点处与人LDLR的配体结合域特异反应。C7与LDLR的结合能抑制LDL结合，相反，LDL与LDLR的结合能抑制C7结合。Mab C7与LDLR/TF嵌合蛋白的结合可作为该嵌合蛋白的LDLR结构域基本完整的证据，并暗示LDLR/TF中的该位点也具有LDL结合活性。其它实施例(实施例9)表明，LDLR/TF嵌合蛋白确实结合人LDL。
首先，在含有1％NP-40的TBS中用山羊抗小鼠IgG琼脂糖珠(HycloneEGK-1060)对1ml获自用pSV2neo(负对照)转染或用pEFBPS/LDLrTF1.S和pSV2neo共转染的正常人成纤维细胞克隆的条件培养基进行预清除，随后加入MAb HTF-14、MAb C7或一种无关的MAb(抗人因子IX，HematologicTechnologies，Inc.AHIX-5041)。在抗体结合之后，通过加入山羊抗小鼠IgG琼脂糖珠沉淀抗原-抗体复合体。洗涤琼脂糖珠，以除去非结合材料，并通过与含有SDS的SDS/PAGE样品缓冲液一起煮沸洗脱蛋白质。对洗脱液做SDS/PAGE(8％凝胶)电泳，电吸印到支持的硝酸纤维素滤膜(Schleicher和Schuell BA-S-85)上，并将滤膜放在含有0.05％Tween-20和5％(w/v)脱脂奶粉的TBS中干燥几小时。用HRP-缀合的绵羊抗人TF(BiodesignK90070P)处理封闭的滤膜，以检测带有各种人TF表位，包括由HTF-14识别的表位的蛋白。此处的抗体结合是在含有0.05％Tween-20的TBS中进行。在结合步骤之后，用含有0.05％Tween-20的TBS洗涤几次，接着用TBS洗2次。在检测HRP与化学发光剂(Amersham RPN2106)的缀合物后，对所述膜进行曝光、处理和扫描(图9)。泳道1含有由MAb HTF-14免疫沉淀的源于反对照人成纤维克隆(SV2neo-转染)的1ml条件培养基。不存在嵌合蛋白。当在结合介质中使用2％的脱脂奶粉时，观察不到在泳道1中观察到的材料，因此，可能与嵌合蛋白无关。泳道2含有1ml由MAbHTF-14免疫沉淀的源于用pEFBOS/LDLRrTF1.S和pSV2neo共转染的人成纤维细胞克隆的条件培养基。发现一种较大蛋白(约116kd)和一种较小蛋白(约100kd)。较小蛋白由较大蛋白通过在LDLR结构域中由一种特异丝氨酸蛋白酶进行的裂解而来。泳道3含有1ml源于与泳道2所用相同的人成纤维细胞的条件培养基，但它是由Mab C7免疫沉淀的。出现了较大蛋白(约为116kd)，其分子大小与由MAb HTF-14免疫沉淀的主要产物相同。这表明，一个LDLR/TF嵌合蛋白同时含有LDLR结构域(可用C7免疫沉淀)和TF结构域(在Western印迹分析中可由HTF-14检测)。MAb C7不能免疫沉淀泳道3中出现的较小产物，该产物保留了完整的TF结构域，但缺乏完整的LDLR结构域。泳道4含有1ml源于与泳道2和3所示相同的人成纤维细胞克隆的条件培养基，但能由对人因子IX专一的MAb免疫沉淀，尚不清楚其结合LDLR还是TF。正如所预计的，LDLR/TF嵌合蛋白不能由该抗体进行免疫沉淀。
实施例12在体外将LDLR/TF嵌合蛋白结合于人肝细胞上的运铁蛋白受体
通过其结合于人肝细胞表面的运铁蛋白受体(TFR)的能力测用实施例8所述方法纯化的LDLR/TF嵌合蛋白的官能度。如本实施例中所述，LDLR/TF嵌合蛋白阻断TF结合到细胞，表明其结合人肝细胞上的运铁蛋白受体。可将Hep G2细胞用于肝细胞的体外研究，因为它合成在正常人肝脏中通常由肝细胞合成的大部分蛋白，包括TFR。
将Hep G2细胞(ATCC号HB 8065)生长于由DMEM(Cellgro 50-013)、10％胎牛血清(Hyclone A-1111)、和均为50单位/ml的青霉素和链霉素(Gibco BRL 15070-014)组成的培养基中。放射性标记的运铁蛋白获自Amersham(IM 194)，其为(3-[125I]碘代酪氨酰)-运铁蛋白(人)，比活性为700-800 Ci/mmol。该125I-TF是铁饱和的(即：全TF)，并被溶于含有80％DMEM(Cellgro 50-013)、0.5％无蛋白酶牛白蛋白(Sigma A-3059)和20％磷酸盐缓冲溶液(PBS；GibcoBRL 1 4200-026)中。将放射性标记的TF结合的抑制剂稀释于PBS中，并通过取代PBS成分加入结合介质中。在本实施例中，对嵌合蛋白和未标记的全TF测试抑制活性。
将Hep G2细胞铺板于6孔组织培养板(直径35mm)的孔中，浓度为2×105细胞/孔，并生长3天。然后用DMEM洗条细胞1～2次，然后在37℃下用5ml DMEM培养30分钟。该洗涤和培养步骤有助于清除由胎牛血清导入的血清成分，包括运铁蛋白，否则，其会结合于TFR上，并影响结合试验。在经过30分钟培养以后，将平板置于冰上，通过抽吸除去培养基。每孔接受1ml用冰预冷的结合介质，并通过在4℃下摇或转2小时(在结合期间)缓慢振动所述平板。
在为期2小时的结合之后，将板置于冰上，并在随后的洗涤步骤中保持于冰上。为了从细胞上除去非结合标记，用含有0.5％BSA的PBS将各孔洗3遍，然后再用PBS洗3次。然后用1ml 1N NaOH对各孔里的细胞进行裂解，并将裂解液转移到12×75mm的聚苯乙烯管(Falcon 2052)中。另用1ml 1NNaOH洗涤所述孔，将洗液加入装有相应裂解液的管中。通过在γ计数器(Beckman)上定量γ发射测定所述裂解液中放射性TF的量。由于在结合期结束时将细胞放在冰上，阻止了细胞对标记TF的吸收，计数的γ发射反映了在结合阶段结束时细胞表面的标记TF。同样中和裂解液并以牛白蛋白作为标准通过BCA蛋白分析(Perce 23225G)测定总蛋白含量。总放射性(以每分钟的计数表示；cpm)与总蛋白含量(以mg计)之比可以用来很好的估计配体结合力。
TF结合于Hep G2细胞上的TFR的平衡解离常数为7nM(Trowbridge，I.S.等，“生物化学和药学”(Biochem.Pharmacol.)，33：925-993(1984))。如果作为125I-TF与TFR结合的竞争抑制剂的未标记的TF是以7nM的浓度存在，配体结合(以cpm/mg计)将会被抑制大约50％。另外，如果任何非标记配体(以约7nM的浓度存在)能以与TF(例如LDLR/TF)的亲和力相当的亲和力结合于TFR，将观察到50％的结合抑制。当非标记配体以高浓度存在时(例如，比Kd高50或100倍)，几乎所有的受体结合位点将被占据，结合至细胞的唯一配体应是结合在非特异位点上的(例如，除TFR之外的位点)那些配体。如果非标记的配体不结合于TFR，将不会出现结合抑制。因此，不与TFR直接作用的人LDL对于TFR与125I-TF的结合无抑制作用。
已用上述配体结合试验证实LD1R/TF嵌合蛋白对于TFR与Hep G2细胞上的125I-TF的结合有竞争抑制作用，因此能特异结合人TFR。
在一种实施方案中，将Hep G2细胞与非抑制剂或全TF或纯化的LDLR/TF嵌合蛋白[自表达LIDLR/TF嵌合蛋白的CHO细胞中纯化，其上的人LDLR的氨基酸1-395融合于人运铁蛋白的氨基酸20-698(见例3)]一起培养，以测定所述蛋白的抑制效果。为了进一步饱和TF或LDLR/TF嵌合蛋白的铁结合位点，在含10μM FeCl3的5nM、50nM或500nM的浓度下试验全TF和嵌合蛋白。结果如下面的表2所示：
表2 125I-全TFa与Hep G2细胞b的结合(裂解液中每mg总蛋白结合的CPM)
抑制剂  0nM  5nM 500nM  500nM/10μM FeCl3
无  62,856  - - -
全TF  -  33,602(53％) 1,026  (2％) 1,160  (2％)
LDLR/TF嵌合蛋白  -  73,982(117％) 3,363  (5％) 2,724  (4％)
括号中的数字表示相对于在无抑制剂的条件下结合(设为100％)的结合数的百分比。
a.0.32nM标记的TF
b.35mm孔，以2×105细胞的密度接种
以上结果表明，全TF和LDLR/TF嵌合蛋白是标记TF结合的有效抑制剂。因此，该配体结合试验证实LDLR/TF嵌合蛋白对TFR与Hep G2细胞上的125I-TF的结合有竞争抑制作用，因此可特异结合至人TFR。
可用类似试验证实嵌合蛋白也可结合于人成纤维细胞和其它类型细胞表面上的TFR。
实施例13在体外将LDL吸收到人肝细胞中
可以如下方式检验如在上述实施例中纯化的LDLR/TF嵌合蛋白结合于人LDL和人TFR的能力：检验其通过TFR-介导的途径促进细胞对LDL的吸收。而且，由嵌合蛋白所产生的额外的LDL吸收会因与TF的竞争而受到抑制。
为了定量Hep G2细胞系的LDL吸收，将该细胞置于结合介质中，洗涤、裂解并以与实施例12所述用于TFR结合的方法相同的方法测试放射性和总蛋白含量。不过，在该试验中，采用放射性标记的LDL，并通过在37℃下培养研究其结合后被细胞吸收的情况。在培养期间，标记的LDL结合于LDLR并经过正常LDLR途径进入细胞。另外，标记的LDL也可结合于嵌合蛋白上，LDLR/TF-LDL复合体在结合于TFR后进入细胞，并经TFR途径被吸收。因此，非标记的LDL能抑制标记LDL与LDLR和嵌合蛋白的结合，而人全TF仅能抑制LDLR/TF-LDL复合体与TFR的结合。
将比活性为大于每ng LDL蛋白200 cpm的放射性标记的(125I)人LDL(Biomedical Technologies，Inc.；BT-913R)稀释于含有80％DMEM、0.5％无蛋白酶牛白蛋白和20％PBS的培养基中。通过替代PBS成份将放射性标记的LDL结合和吸收的抑制剂稀释于PBS中。在该实施例中，在有或没有嵌合蛋白和有或没有非标记抑制剂全人TF(Sigma T-3400)或LDL(Biomedical Technologies，Inc.BT-903)的条件下测125I-LDL的吸收。
以每孔2×105细胞的密度将Hep G2细胞铺板于6孔组织培养板(直径35mm)的孔中，并在由DMEM(cellgro 50-013)、10％胎牛血清(Hyclone A-1111)和均为50单位/ml的青霉素和链霉素(Gibco BRL 15070-014)组成的培养基中生长3天。然后用DMEM洗涤细胞1-2次，并在37℃下与5mlDMEM一起培养30分钟。该洗涤和培养步骤有助于清除由胎牛血清导入的血清组分，包括运铁蛋白，否则，其会结合于TFR上，并干扰结合试验。在为期30分钟的培养之后，通过抽吸除去各孔中的培养基，并代之以1ml吸收介质。将平板放入37℃下标准组织培养箱中，使能吸收并聚积标记LDL。
在吸收期之后，将平板量于冰上，并在随后的洗涤步骤中保持于冰上。为了从细胞除去非结合标记，用含有0.5％BSA的PBS将各个孔洗3次，接着再用PBS洗3次。然后用1ml 1N NaOH裂解各孔里的细胞，并将裂解液转移到12×75mm的聚苯乙烯管(Falcon 2052)中。再用1ml 1N NaOH洗孔，并将洗液加入装有相应裂解液的孔中。通过在γ计数器(Beckman)中对γ发射进行定量来测定裂解液中放射标记的LDL量。由于所述细胞内化标记LDL，上述发射计数反映了细胞内标记LDL及其代谢物的量，以及在吸收阶段结束时细胞表面的完整的标记LDL的量。还要中和裂解液并通过BCA蛋白测定(Pierce 23225G)分析总蛋白含量。总放射性(cpm)与总蛋白含量(mg)之比可用于很好的估计LDLR吸收。该试验可用于证实LDLR/TF嵌合蛋白能促进HepG2细胞对放射标记LDL吸收的提高，而非标记TF或LDL相当于该增加吸收的竞争抑制剂。
细胞对LDL的吸收还可以用常规方法(Goldstein，J.Z，等，“酶学方法”(Meth.Enzymol.)，98：241-260(1983))通过测定内化LDL对胞内过程和基因表达的影响进行监测。从LDL上直接释出的或通过水解胆固醇酯释出的游离胆固醇形成一个胆固醇调节库，它不仅抑制编码3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的基因表达，而且能激活编码酰基辅酶A：胆固醇O-酰基转移酶(ACAT)的基因的表达。由于HMG-CoA还原酶催化胆固醇生物合成中的限速步骤，编码该酶的基因的下调能减少胆固醇的从头生物合成，因为胞内胆固醇含量的提高是由于LDLR/TF刺激的吸收增加所致。另外，ACAT-酯化过量的游离胆固醇的一种酶-表达的增加使其可以以胆固醇酯滴(主要为油酸胆固醇酯)形式贮存于细胞质中，使细胞贮存胆固醇的能力提高。最后，游离胆固醇调节库的增加可下调LDLRs的合成。因此，上述增加胞内胆固醇库对胆固醇代谢的3种次级作用，这3种作用构成了胆固醇体内平衡的机制，它可保护生物以防止过多的产生胆固醇。
当发生LDL吸收是由于嵌合蛋白对TFR-介导的胞吞途径起作用所致时，所释出的游离胆固醇不会像下调LDLRs合成那样下调TFRs的合成。该下调作用的结果将最终导致胞内胆固醇的减少(因为降低吸收是由于LDLRs量减少)，胞内胆固醇的减少会因为HMG-CoA还原酶的活性提高而接着会导致胆固醇生物合成的增加，而且由于降低了ACAT活性而使贮存胆固醇的能力降低。在有嵌合蛋白存在的条件下，可以进行通过TFR-介导的胞吞途径的LDL连续吸收，导致HMG-CoA还原酶的连续抑制和ACAT的连续活化。因此，绕过正常的LDL吸收途径，可在相当长的时间内分别维持胞内胆固醇生物合成和贮存的减少和增加，使总血清胆固醇维持降低的水平。
实施例14 LDLR/TF嵌合蛋白对小鼠体内胆固醇含量的影响
为了证实LDLR/TF嵌合蛋白在体内模型系统中是否具有抗高胆固醇血症的作用，实施静脉内注射纯化的嵌合蛋白，并在注射后一或多个时间间隔测定胆固醇含量。由于外源给药的诸如LDLR/TF的蛋白在动物体内具有有限的循环寿命，注射一次仅能起到暂时降低LDL胆固醇含量的作用，一旦所注射的蛋白被从循环系统中清除，胆固醇含量又恢复基本水平。不过，通过缓释装置或基因疗法(植入分泌嵌合蛋白的遗传工程细胞)连续输入嵌合蛋白对LDL胆固醇有长期或持久作用。
Ishibashi等(“临床研究杂志”(J.Clin.Invest.)92：883-893(1993))描述了一种LDLR-剔除小鼠，与大部分实验小鼠品系相比，该小鼠的总胆固醇和LDL胆固醇量均较高。该小鼠品系含有纯合的LDLR缺失基因，将其用于LDLR/TF对哺乳类的生物作用的体内研究。
在正常小鼠体内，大部分循环胆固醇由HDL携带，而在人体内，大部分胆固醇由LDL携带。不过，与人不同，小鼠的70％的LDL部分与apoB-48相关，载脂蛋白B的截短的变体缺乏LDLR的结合位点，而30％与含有LDLR结合区域的apoB-100相关。相反，98％的人LDL含有apoB-100。以重量百分比计，小鼠LDL含有9.5％未脂化的胆固醇，23.5％胆固醇酯，以及20.5％蛋白；人LDL含有9.2％未脂化的胆固醇，37％胆固醇酯，和22％蛋白(Chapman，M.，“酶学方法杂志”(J.Meth.Enzymol.)128：70-143(1986))。
纯合缺失LDLR基因的作用是破坏LDL(apoB-100)的清除，产生较高的稳态水平的LDL。纯合雌性LDLR-剔除小鼠的总胆固醇含量比正常纯合野生型对照的胆固醇含量高139mg/dl(Ishibashi等，“临床研究杂志”(J.Chin.Invest.)92：883-893(1993))。由于功能性LDLR与apoB-100LDL部分相互作用，但不与apoB-48LDL部分作用，而且假设多出的139mg/dl的总胆固醇仅含于ApoB-100LDL部分，各小鼠的大约1ml的血清在apoB-100LDL部分中至少含有1.39mg总胆固醇，其为LDLR/TF结合的靶分子。假设胆固醇含有重量百分比为33％的LDL，这一部分为20.5％的蛋白，而且apoB-100分子的分子量为514Kd，则1.39mg的总胆固醇相当于每只小鼠约1.68nmol apo B-100(每个LDL颗粒一个apo B-100分子)。为了与LDLR/TF进行单分子结合(其分子量为116.3Kd，不包括糖)，1.68nmolLDLR/TF相当于每只小鼠195μg LDLR/TF。为了以等于诸如10％在LDLR-剔除小鼠体内循环的LDL(apo B-100)颗粒数的量给药LDLR/TF(0.168nmol)，需要给每只小鼠注射19.5μg LDLR/TF融合蛋白。
为了确定总胆固醇、HDL胆固醇和LDL胆固醇的基本水平，在注射嵌合蛋白或负对照之前一定时间，对麻醉的小鼠施行逆向轨道放血。对于每只动物来说，从凝固血块中分离血清，并用比色终端(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)通过偶联酶促测定测总胆固醇和HDL胆固醇水平。通过用96孔微量滴定板进行手工操作，对总胆固醇浓度(mg/dl)进行定量。将血清和胆固醇标准稀释于普通盐溶液中，并将其各10μl加到96孔微量滴定板的两个或三个孔中。将200μl胆固醇制剂(Sigma 352-20)加入各孔中，并在37℃下将板培养10分钟，此后，在小平板计数器上在490nm下读光吸收。在该实验中，吸收值在0～200mg/dl范围内是线性的(用胆固醇标准绘制标准曲线；Sigma C-0534)而且可以稀释样品使其落入以上范围内。
在用HDL胆固醇制剂(Sigma 352-3)沉淀LDL和VLDL胆固醇部分之后，以总胆固醇形式定量(按上述方法进行)HDL胆固醇浓度(mg/dl)。将血清与1/10体积的HDL胆固醇制剂混合，并在室温下放置约5分钟。在小型离心机中高速离心2分钟，然后除去部分上清液，稀释于普通盐水中，并用以上方法测定总胆固醇。为了获得原始血清中的HDL胆固醇浓度，将测定的上清液中的总胆固醇浓度乘以1.1，以补偿因加入HDL胆固醇制剂而造成的体积增加10％。通过从在用HDL胆固醇制剂处理血清并除去LDL和VLDL部分之前获得的总胆固醇值中扣除HDL胆固醇值，计算出LDL胆固醇。
确定预注射基本量的血清后，将适量的LDLR/TF嵌合蛋白(在磷酸盐缓冲溶液PBS中)各50μl注射到麻醉的LDLR-剔除小鼠的尾脉内。为了测定麻醉和注射效果，将50μl PBS作为负对照注射到不同的LDLR剔除动物体内。为了测定TF受体与所给药的TF结构域的相互作用是否影响脂蛋白代谢，将含有与LDLR/TF相同摩尔浓度的人全运铁蛋白(全TF)的50μl PBS溶液作为额外的负对照注射到LDLR-剔除动物体内。人全TF含有与LDLR/TF嵌合蛋白所含相同的TF结构域，但缺乏LDLR结构域且不能结合LDL。这类负对照可用于评价可能因注射等量的人蛋白或人TF抗原而产生的任何效果。
在注射嵌合蛋白或负对照物质之后，以适于取样的给定体积和频率的时间间隔再次施行逆向轨道放血。分析注射后放血的血清中总胆固醇和HDL胆固醇浓度。LDL(即LDL+VLDL)胆固醇量以总胆固醇浓度和HDL胆固醇浓度之间的算术差来计算。这样，可以对LDLR/TF在降低特异血清胆固醇部分方面的作用进行定量。
也可以测定注射后放血的血清，以确定循环系统中保留的LDLR/TF嵌合蛋白浓度。由于该试验中所用抗体不会与小鼠运铁蛋白交叉反应，可以采用人TF ELISA(例6)。小鼠血清中嵌合蛋白消失速度的测定可用于估算嵌合蛋白的循环半衰期。
还可以研究特殊嵌合蛋白对脂蛋白清除速度的影响。Ishibashi等(“临床研究杂志”(J.Clin.Invest.)92：883-893(1993)已证实，小鼠体内LDLR的丧失可显著降低注射的放射标记LDL或VLDL的清除速度，但不会改变所注射的放射标记HDL的清除速度。可以研究给药嵌合蛋白(药丸或连续灌输)后清除速度，以便对因给药嵌合蛋白所致的脂蛋白清除速度的增加进行定量。
除了LDLR剔除小鼠之外，还可将Watanabe兔用于分析LDLR/TF嵌合蛋白对胆固醇含量的体内影响，该兔具有缺陷型LDL受体和因缺陷型LDL代谢所致的高胆固醇血症。
等同形式
本领域技术人员可以理解，或仅用常规实验即可确定本文所披露的本发明具体实施方案的很多等同形式。这些等同形式意欲包括在以下权利要求范围内。

Claims (47)

1.一种嵌合蛋白，包括一个功能域和一个载体域，其中：
所述功能域包含选自下列的第一受体的配体结合域：低密度脂蛋白受体，乙酰化低密度脂蛋白受体，肿瘤坏死因子α受体，转化生长因子β受体，细胞因子受体，免疫球蛋白Fc受体，激素受体，葡萄糖受体，糖脂受体和糖胺聚糖受体；并且
所述载体域包括与除第一受体之外的哺乳动物细胞表面受体结合的氨基酸序列，其中(a)所述氨基酸序列来自除所述第一受体以外的蛋白，且(b)所述哺乳动物细胞表面受体选自低密度脂蛋白受体，运铁蛋白受体，脱唾液酸糖蛋白受体，腺病毒受体，逆转录病毒受体，CD4，脂蛋白(a)受体，低密度脂蛋白受体样蛋白受体，乙酰化LDL受体，甘露糖受体和甘露糖-6-磷酸酯受体。
2.权利要求1的嵌合蛋白，其中所述功能域包括与LDL胆固醇结合的哺乳动物低密度脂蛋白受体的配体结合域，并且所述载体域包括与除LDL胆固醇受体之外的哺乳动物细胞表面受体结合的氨基酸序列。
3.权利要求2的嵌合蛋白，其中哺乳动物细胞表面受体是人运铁蛋白受体并且所述载体域包含运铁蛋白序列或其一部分。
4.一种DNA，其编码权利要求1的嵌合蛋白。
5.一种遗传修饰的哺乳动物细胞，其表达权利要求4的DNA。
6.权利要求5的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中所述细胞选自人成纤维细胞，人角质形成细胞；人上皮细胞，人卵巢细胞，人内皮细胞，人胶质细胞，人神经细胞，血液的组成部分，人肌细胞，人肝细胞和这些人细胞类型的前体。
7.权利要求5的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中该细胞为无限增殖化细胞。
8.权利要求6的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中该细胞为原代细胞或继代细胞。
9.一种DNA，其编码权利要求2的嵌合蛋白。
10.一种遗传修饰的哺乳动物细胞，其表达权利要求9的DNA。
11.权利要求10的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中所述细胞选自人成纤维细胞，人角质形成细胞；人上皮细胞，人卵巢细胞，人内皮细胞，人胶质细胞，人神经细胞，血液的组成部分，人肌细胞，人肝细胞和这些人细胞类型的前体。
12.权利要求10的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中该细胞为无限增殖化细胞。
13.权利要求11的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中该细胞为原代细胞或继代细胞。
14.一种DNA，其编码权利要求3的嵌合蛋白。
15.一种遗传修饰的哺乳动物细胞，其表达权利要求14的DNA。
16.权利要求15的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中所述细胞选自人成纤维细胞，人角质形成细胞；人上皮细胞，人卵巢细胞，人内皮细胞，人胶质细胞，人神经细胞，血液的组成部分，人肌细胞，人肝细胞和这些人细胞类型的前体。
17.权利要求15的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中该细胞为无限增殖化细胞。
18.权利要求16的遗传修饰的哺乳动物细胞，其中该细胞为原代细胞或继代细胞。
19.一种将低密度脂蛋白转运到人细胞中的方法，包括将低密度脂蛋白与下列物质混合：
a)权利要求2的嵌合蛋白；和
b)一种人类细胞，
所述混合在以下条件中进行，所述条件适于低密度脂蛋白结合该嵌合蛋白的功能域，也适于该嵌合蛋白的载体域结合人类细胞表面的受体，导致该嵌合蛋白与低密度脂蛋白形成复合体，并通过胞吞作用将该复合体转运到所述细胞中。
20.权利要求19的方法，其中该人细胞表面受体选自人运铁蛋白受体，人血清白蛋白受体，人脱唾液酸糖蛋白受体，人腺病毒受体，人逆转录病毒受体，人CD4，人脂蛋白(a)受体，人免疫球蛋白Fc受体，人甲胎蛋白受体，人低密度脂蛋白受体样蛋白受体，人乙酰化LDL受体，人甘露糖受体和人甘露糖-6-磷酸酯受体。
21.权利要求19的方法，其中该载体域包括与人细胞表面运铁蛋白受体结合的人运铁蛋白的氨基酸序列。
22.一种将低密度脂蛋白转运到人细胞中的方法，包括将低密度脂蛋白与下列物质混合：
a)权利要求3的嵌合蛋白；和
b)一种人类细胞，
所述混合在以下条件中进行，所述条件适于低密度脂蛋白结合该嵌合蛋白的功能域，也适于该嵌合蛋白的载体域结合人类细胞表面的受体，导致该嵌合蛋白与低密度脂蛋白形成复合体，并通过胞吞作用将该复合体转运到所述细胞中。
23.权利要求22的方法，其中该人细胞表面受体选自人运铁蛋白受体，人血清白蛋白受体，人脱唾液酸糖蛋白受体，人腺病毒受体，人逆转录病毒受体，人CD4，人脂蛋白(a)受体，人免疫球蛋白Fc受体，人甲胎蛋白受体，人低密度脂蛋白受体样蛋白受体，人乙酰化LDL受体，人甘露糖受体和人甘露糖-6-磷酸酯受体。
24.权利要求22的方法，其中该载体域包括与人细胞表面运铁蛋白受体结合的人运铁蛋白的氨基酸序列。
25.权利要求2的嵌合蛋白在制备用于降低个体的血流中低密度脂蛋白含量的药物组合物的用途，其中，该个体的血流中的低密度脂蛋白结合所述嵌合蛋白的功能域，而该嵌合蛋白的载体域结合该人细胞表面受体，以便将结合有低密度脂蛋白的嵌合蛋白转运到具有人细胞表面受体的细胞中，从而降低个体的血流中低密度脂蛋白的含量。
26.权利要求3的嵌合蛋白在制备用于降低个体的血流中低密度脂蛋白含量的药物组合物的用途，其中，该个体的血流中的低密度脂蛋白结合所述嵌合蛋白的功能域，而该嵌合蛋白的载体域结合该人细胞表面受体，以便将结合有低密度脂蛋白的嵌合蛋白转运到具有人细胞表面受体的细胞中，从而降低个体的血流中低密度脂蛋白的含量。
27.一种药物组合物，其含有权利要求1的嵌合蛋白。
28.一种药物组合物，其含有权利要求2的嵌合蛋白。
29.一种药物组合物，其含有权利要求3的嵌合蛋白。
30.一种药物组合物，其含有权利要求5的遗传修饰的哺乳动物细胞。
31.一种药物组合物，其含有权利要水6的遗传修饰的哺乳动物细胞。
32.一种药物组合物，其含有权利要求7的遗传修饰的哺乳动物细胞。
33.一种药物组合物，其含有权利要求8的遗传修饰的哺乳动物细胞。
34.一种药物组合物，其含有权利要求10的遗传修饰的哺乳动物细胞。
35.一种药物组合物，其含有权利要求11的遗传修饰的哺乳动物细胞。
36.一种药物组合物，其含有权利要求12的遗传修饰的哺乳动物细胞。
37.一种药物组合物，其含有权利要求13的遗传修饰的哺乳动物细胞。
38.一种药物组合物，其含有权利要求15的遗传修饰的哺乳动物细胞。
39.一种药物组合物，其含有权利要求16的遗传修饰的哺乳动物细胞。
40.一种药物组合物，其含有权利要求17的遗传修饰的哺乳动物细胞。
41.一种药物组合物，其含有权利要求18的遗传修饰的哺乳动物细胞。
42.权利要求1的嵌合蛋白用于将选定的物质引入哺乳动物细胞的用途。
43.权利要求2的嵌合蛋白用于将选定的物质引入哺乳动物细胞的用途。
44.权利要求3的嵌合蛋白用于将选定的物质引入哺乳动物细胞的用途。
45.权利要求1的嵌合蛋白用于将选定的物质引入人细胞的用途。
46.权利要求2的嵌合蛋白用于将选定的物质引入人细胞的用途。
47.权利要求3的嵌合蛋白用于将选定的物质引入人细胞的用途。
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