CN1171742A - ε-氨基的选择性酰化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质的酰化。更具体地讲,本发明涉及在游离α-氨基的存在下,一步法选择性地酰化胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素原的游离ε-氨基。
Description
本发明涉及蛋白质的酰化。更具体地讲,本发明涉及在游离α-氨基的存在下,选择性酰化胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物的ε-氨基的一步法。
氨基的酰化是蛋白质的化学修饰中最常用的方法之一。酰化的通用方法记载于酶学方法,25:494-499(1972),该方法包括使用活性酯、酰卤或酸酐。使用活性酯、特别是N-羟基琥珀酰亚胺的脂肪酸酯,是用脂肪酸酰化游离氨基酸的一个特别有效的方法。Lapidot等,类脂研究杂志(J.of Lipid Res.)8:142-145(1967)。Lapidot等记载了N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备及其在制备N-月桂酰-甘氨酸、N-月桂酰-L-丝氨酸、和N-月桂酰-L-谷氨酸中的用途。
对于选择性酰化胰岛素氨基的早期研究记载于生物化学杂志,121:737-745(1971)(Lindsay等)。Lindsay等记载了胰岛素和乙酸N-琥珀酰亚胺基酯在低的试剂浓度及近中性的pH值下生产两个单取代的产物PheR1-乙酰基-胰岛素和GlyA1-乙酰基胰岛素的反应活性。在pH8.5,PheB1-乙酰基-胰岛素的产量下降并且还有LysB29-乙酰基-胰岛素产生。因此,Lindsay等得出结论,在pH6.9,反应活性的顺序为甘氨酸(A1)≈苯丙氨酸(B1)》赖氨酸(B29),而在pH8.5,甘氨酸(A1)>苯丙氨酸≈赖氨酸(B29)。文献出处同上。
Lindsay等在美国专利3869437中公开了用含有最多七个碳原子的酰基酰化B1氨基酸以及用含有最多四个碳原子的酰基选择性地保护A1和/或B29氨基。其中记载了N-羟基琥珀酰亚胺酯是特别有利的酰化剂。为了得到最高产率的B1氨基酰化的胰岛素,酰化剂的比例应相对较低(一至两摩尔当量以下的酰化剂)。另外,在pH等于7或接近大约7时可以得到单取代B1产物的最高产率。在pH8.5至9.0,所需的B1-酰化的严物的产率大大降低而有利于在位置A1和B29发生进一步的取代。
在美国专利3868356(D.G.Smyth)和美国专利3868357(Smyth等)中公开了N-酰化、O-取代的胰岛素衍生物,其中,A1、B1或B29氨基酸的氨基中至少有一个被转变成了保护的氨基。酰化反应用过量相对较少的酰化剂(例如每个氨基2至3摩尔酰化剂)在中性或弱碱性pH(例如7-8)下进行。该反应在A1和B1-氨基上发生反应,以非常高的产率生成二取代的衍生物。在过量酰化剂(例如最多10摩尔)的存在下,反应进一步在B29氨基上进行,生成三取代的衍生物。
为了选择性地酰化胰岛素,Muranishi和Kiso在日本专利申请1-254699中公开了一种制备脂肪酸胰岛素衍生物的五步合成法。第一步,制备活性脂肪酸酯;第二步,将胰岛素的氨基用对甲氧基苯甲酰氧基碳酰叠氮化物(pMZ)保护;第三步,将胰岛素-pMZ与脂肪酸酯反应;第四步,将酰化的胰岛素脱保护;第五步,将酰化的胰岛素分离纯化。很明显,选择性地酰化一个氨基基团只能通过用pMZ保护基团保护其它氨基来实现。使用这种方法,Muranishi和Kiso制备了如下化合物:LysB29-棕榈酰胰岛素(ε-氨基被酰化)、PheB1-棕榈酰胰岛素(B链上的N-末端α-氨基被酰化)和PheB1、LysB29-二棕榈酰胰岛素(ε-氨基和N-末端α-氨基均被酰化)。
类似的,Hashimoto等在药物研究6:171-176(1989)中描述了一种制备N-棕榈酰胰岛素的四步合成法。该合成法包括用pMZ对N-末端A1-甘氨酸和B29-赖氨酸的ε-氨基进行保护和脱保护。在文献所述的条件下制备了两种主要的酰化产物,B1棕榈酰胰岛素和B1、B29-二棕榈酰胰岛素。
因此,在本发明之前,胰岛素B29-Nε-氨基的选择性酰化是通过α-氨基保护并随后脱保护来进行的。
本发明提供一种选择性酰化胰岛素原、胰岛素和胰岛素类似物的ε-氨基一步合成法。非常令人惊奇的是,本发明可以在一步中高产率选择性地酰化ε-氨基。因此,本发明无需对胰岛素的其它氨基进行保护和脱保护。本发明提供制备ε-氨基酰化的胰岛素衍生物的更有效且更廉价的方法。
本发明提供一种用脂肪酸选择性地酰化含有游离的ε-氨基和游离的α-氨基的胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物的方法,所述方法包括将ε-氨基与可溶性的活性脂肪酸酯在碱性条件下,在极性溶剂中反应。
本文使用的所有氨基酸缩写均为美国专利与商标局所公认的缩写,参见37C.F.R.§1.822(B)(2)。
如上所述,本发明提供一种高度选择性地酰化胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物的一步酰化法。本发明确定了在ε-氨基和α-氨基中优先酰化ε-氨基的条件。通常,单酰化α-氨基的产率不到5%。
本文使用的术语“胰岛素”指人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。胰岛素含有三种游离的氨基:B1-苯丙氨酸、A1-甘氨酸、和B29-赖氨酸。位于A1和B1的游离氨基是α-氨基。位于B29的游离氨基是ε-氨基。
本文使用的术语“胰岛素原”是指如下结构式的适当交联的蛋白质:
B-C-A其中:
A是胰岛素的A链或其官能化衍生物;
B是胰岛素的B链或其带有ε氨基的官能化衍生物;并且
C是胰岛素原的连接肽。优选的胰岛素原为人胰岛素的A链、人胰岛素的B链,并且C是天然的连接肽。当胰岛素原是天然的序列时,胰岛素原含有三种游离的氨基:B1-苯丙氨酸(α-氨基)、C64-赖氨酸(ε-氨基)和B29-赖氨酸(ε-氨基)。
本文中使用的术语“胰岛素类似物”指如下结构式的适当交联的蛋白质:
A-B其中:
A是胰岛素A链的官能衍生物;并且
B是带有ε-氨基的胰岛素B链的官能衍生物。
优选的胰岛素类似物包括如下胰岛素,其中:
位置B28的氨基酸残基是Asp、Lys、Leu、Val或Ala;
位置B29的氨基酸残基是Lys和Pro;
位置B10的氨基酸残基是His或Asp;
位置B1的氨基酸残基是Phe、Asp,或单独缺失或与位置B2的残基同时缺失;
位置B30的氨基酸残基是Thr、Ala、或缺失;并且
位置B9的氨基酸残基是Ser或Asp;条件是位置B28和B29之一是Lys。
用本领域技术人员公知的标准生化术语来表示,优选的胰岛素类似物为:Lys B28ProB29-人胰岛素(B28是Lys;B29是Pro);AspB28-人胰岛素(B28是Asp);AspB1-人胰岛素、ArgB31,B32-人胰岛素、AspB10-人胰岛素、ArgA0-人胰岛素、AspB1、GluB13-人胰岛素、AlaB26-人胰岛素、脱(B30)-人胰岛素和GlyA21-人胰岛素。
术语“酰化”指引入一个或多个与蛋白质的游离氨基共价结合的酰基。
术语“选择性酰化”指在ε-氨基和α-氨基中优先酰化ε-氨基。通常,选择性酰化产生单酰化ε-氨基的产物与单酰化α-氨基的产物的量的比例大于大约5。优选该比例大于大约10,并最优选大于大约50。
术语“脂肪酸”指饱和或不饱和的C6-C21脂肪酸。术语“活性脂肪酸酯”指用常规技术活化了的脂肪酸,所述常规技术记载于酶学方法,25,494-499(1972)和类脂研究杂志,8:142-145(1967)(Lapidot等)。优选饱和的脂肪酸,包括肉豆寇酸(C14)十五烷酸(C15)、棕榈酸(C16)、十七烷酸(C17)和硬脂酸(C18)。最优选的脂肪酸是棕榈酸。活性脂肪酸酯包括如下试剂的衍生物,例如羟基苯并三唑(hydroxybenzotriazide)(HOBT)、N-羟基琥珀酰亚胺及其衍生物。优选的活性酯是棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯。
术语“可溶的”指在酰化胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素原的液相中含有足够量的酯。优选对于每摩尔胰岛素在液相中含有大约1至4摩尔当量的活性酯。
在此使用的术语“碱性条件”指反应液的碱性。反应必须在所有的游离氨基均基本去质子化的条件下进行。在含水溶剂或半水性溶剂混合物中,碱性条件指反应在pH大于9.0的条件下进行。在非水性的有机溶剂中,反应在有碱存在的条件下进行,该碱的碱性相当于在水中大于或等于10.75的pKa值。
术语“交联”指在半胱氨酸残基之间形成二硫键。适当交联的胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物含有三个二硫桥。第一个二硫桥是在A链的位置6和位置11的半胱氨酸残基之间形成。第二个二硫桥连接A链的位置7的半胱氨酸残基和B链的位置7的半胱氨酸。第三个二硫桥连接A链的位置20的半胱氨酸和B链的位置19的半胱氨酸。
在本发明之前,本领域技术人员是通过使用保护基以多步合成法选择性地酰化ε-氨基。Muranshi和Kiso在日本专利申请1-254699中公开了一种制备酰化的胰岛素衍生物的五步合成法。类似的,Hashimoto等在药物研究,6:171-176(1989)中描述了一种制备N-棕榈酰胰岛素的四步合成法。为了选择性地酰化胰岛素,两篇文献均描述了pMZ保护基的使用。
本发明以高产率的一步合成法生成Nε-酰化胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物。该反应可以在不使用氨基保护基的条件下制备Nε-酰化的蛋白质。通过将活性脂肪酸酯与蛋白质的ε-氨基在碱性条件下的极性溶剂中反应进行酰化。在弱碱性条件下,所有的游离氨基均未去质子化,从而导致N-末端氨基大部分被酰化。在含水溶剂或半水溶剂混合物中,碱性条件指反应在pH大于9.0的条件下进行。由于在pH大于12.0的条件下会引起蛋白质的降解,所以反应混合物的pH优选为pH9.5至11.5,并最优选10.5。混合的有机和含水溶剂中反应混合物的pH测量值为混合前水相的pH。
表1的数据表明反应液的碱性对反应选择性的影响。表1中的数据通过用两摩尔当量的棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯在50%的CH3CN/水中酰化人胰岛素得到。
表1:pH对胰岛素酰化的影响
反应产物 | 产物的相对量pH8.2 pH9.5 pH10.2 | ||
人胰岛素 | 85.2% | 12.5% | 1.6% |
单酰化的A1和B1 | 8.1% | 0.3% | 0.4% |
单酰化的B29 | 5.2% | 70.2% | 79.6% |
二酰化的 | 0.7% | 16.7% | 17.7% |
单酰化的B29与单酰化的A1和B1的比例 | 0.64 | 234 | 199 |
表1证实ε-氨基的酰化依赖于反应液的碱性。在大于9.0的pH下,反应选择性地酰化B29-赖氨酸的ε-氨基。
在非水溶剂中,反应在有碱存在的条件下进行,该碱的碱性相当于在水中大于或等于10.75的pKa值,以便将ε-氨基充分去质子化。即,该碱的碱性必须至少与三乙胺同样强。优选的碱是四甲基胍(TMG)、二异丙基乙基胺、或四丁基氢氧化铵。
对极性溶剂的选择主要取决于胰岛素原、胰岛素、或胰岛素类似物以及脂肪酸酯的溶解度。最重要的是,该溶剂可以完全是有机溶剂。通常可接受的有机溶剂包括DMSO、DMF等。也可以使用含水溶剂以及含水溶剂和有机溶剂的混合物。对极性溶剂的选择仅受反应物溶解度的限制。优选的溶剂和溶剂系统是DMSO;DMF;乙腈和水;丙酮和水;乙醇和水;异丙醇和水;异丙醇、乙醇和水;和乙醇、丙醇和水。优选的溶剂是乙腈和水;并最优选50%的乙腈。本领域技术人员可以理解,其它的极性溶剂也可以使用
对反应物的比例没有严格的限制。一般地,优选活性脂肪酸酯为摩尔过量。反应优选用1至4摩尔当量、最优选1至2摩尔当量的酯来进行。然而,本领域技术人员可以理解,在非常高的活性酯浓度下,将产生相当量的二或三酰化的产物。
对反应的温度没有严格的限制。反应在0至40摄氏度之间进行并通常在15分钟到24小时内完成。
酰化后,终止反应,将产物通过常规方法如反相或疏水色谱进行纯化。然后通过常规方法如冷冻干燥或结晶得到产品。
胰岛素原、胰岛素和胰岛素类似物可以通过各种已知的肽合成方法中的任何方法进行制备,所述方法包括经典(溶液)方法、固相法、半合成法、以及最近出现的重组DNA法。例如,Chance等在美国专利申请号07/388201和EPO公开号383472;Brange等在EPO 214826;以及Belagaje等在美国专利5304473中公开了各种胰岛素原和胰岛素类似物的制备,在此将这些文献引入本文作为参考。本发明的胰岛素类似物的A和B链还可以通过类胰岛素原的前体分子用重组DNA技术制备。参见Frank等,肽:合成-结构-功能,(Proc.Seventh Am.Pept.Symp.),D.Rich和E.Gross编(1981),在此将其引入本文作为参考。
提供以下实施例仅仅是为了进一步说明本发明。本发明的范围不仅限于如下实施例的内容。
实施例1用棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯在DMSO中酰化胰岛素
将生物合成的人胰岛素(BHI)结晶(71.9mg)溶于6.58mLDMSO。将溶液在室温下搅拌至晶体全部溶解(肉眼观察)。将20mg活性酯固体加入2mL DMSO中并剧烈搅拌至所有的活性酯颗粒全部溶解(肉眼观察),制得活性酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)的溶液。此时,将1,1,3,3-四甲基胍(26.8μl)加入5mL BHI溶液中,随后加入DMSO(94.4mL)和预先制备的活性酯溶液(400μl)。反应在室温下(20至25℃)进行大约60分钟。15分钟后取样,用1N乙酸稀释20倍并用HPLC进行分析。用终止样品中的B29-Nε-棕榈酰人胰岛素的量除以最初的BHI的量,计算出反应产率为67.1%。
实施例2用棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯在乙腈和水中酰化胰岛素
将生物合成的人胰岛素(BHI)结晶(199.5g)溶于20L 50mM pH2.5的硼酸溶液。用10%的HCl将溶液的pH调至2.5,并将溶液搅拌至晶体全部溶解(肉眼观察)。对起始原料取样,在276nm测得吸收值为10.55。将24g活性酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)固体加入到2.4L预先加热至约50℃的乙腈中并剧烈搅拌至所有的活性酯颗粒全部溶解(肉眼观察),制得所述活性酯的溶液。此时,加入10%NaOH将BHI溶液的pH调至约10.22。向调节了pH的BHI溶液中加入乙腈(18L)。反应在室温下(20至25℃)进行110分钟,然后加水(123L)终止反应,用10%的HCl和10%NaOH将得到的稀释液的pH调至2.01。用终止反应液中的B29-Nε-棕榈酰人胰岛素的量除以最初的BHI的量,计算出反应产率为73%。
实施例3用棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯在乙腈和水中酰化LysB28ProB29-人胰岛素
将LysB28ProB29-人胰岛素结晶(2.22g)溶于100mL pH2.5的50mM硼酸溶液。用10%HCl将溶液的pH调至2.5,并将溶液搅拌至晶体全部溶解(肉眼观察)。将270mg活性酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)固体加入到27mL预先加热至约50℃的乙腈中,剧烈搅拌至所有的活性酯颗粒全部溶解(肉眼观察),制得所述活性酯的溶液。加入10%NaOH将溶液的pH调至约10.22,并将该溶液在4℃下搅拌15分钟。向调节了pH的溶液中加入乙腈(73mL),随后加入预先制备的活性酯溶液。反应在4℃下进行85分钟,然后加入1N乙酸(600mL)终止反应,得到的pH为2.85。用终止反应液中的B29-Nε-棕榈酰LysB28 ProB29-人胰岛素的量除以最初的LysB28ProB29-人胰岛素的量,计算出反应产率为72.5%。
实施例4用棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯在乙腈和水中酰化BHI
将生物合成的人胰岛素(BHI)结晶(3g)溶于300mL pH2.5的50mM硼酸溶液。按照需要将溶液的pH用10%的HCl调至2.5并将溶液搅拌至晶体全部溶解(肉眼观察)。将400mg活性酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)固体加入到40mL乙腈中并剧烈搅拌,制得所述活性酯的溶液。此时,加入10%NaOH将BHI结晶的溶液的pH调至大约10.2。然后向BHI溶液中加入乙腈(240mL),随后加入预先制备的活性酯溶液。反应在室温下(20至25℃)进行约90分钟,然后加水(1800mL)终止反应并用10% HCl将得到的稀释液的pH调至约2.5。用反应液中的B29-Nε-棕榈酰人胰岛素的量除以最初的BHI的量,计算出反应产率为75.7%。
实施例5用棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯在乙腈和水中酰化胰岛素原
将人胰岛素原(HPI)水溶液(28.2mg/mL)用50mM的硼酸稀释至终体积为100mL,浓度为16.2mg/mL HPI。迅速搅拌下将150mg棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯溶于15mL乙腈(ACN),制得活性酯的溶液,然后用10%NaOH将HPI溶液的pH调至10.2,随后加入88mL ACN。加入12mL活性酯溶液(比HPI过量2倍摩尔量)引发反应。最终的反应体积为200mL,浓度为8mg HPI/mL 50%ACN水溶液。将反应在室温(20至25℃)下进行约60分钟,然后加入相同体积(200mL)的pH10.0的50mM甘氨酸终止反应。
对于ε-氨基酰化产物和α-氨基酰化产物的确切比例未进行计算,对于任何给定的时间点,色谱中所有ε-氨基酰化产物的总和相当于总面积的87-90%,而所有相关物质(可能包括任何α-氨基酰化的产物)的总和相当于总面积的不到7%。
实施例6用己酰N-羟基琥珀酰亚胺酯酰化ArgB31,ArgB32人胰岛素
将ArgB31,ArgB32人胰岛素(1.3mg)溶于200μL pH10.4的200mM(3-〔环己氨基〕-1-丙磺酸)缓冲液中。将己酰N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.3μ摩尔)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF),然后在搅拌下加入上述溶液中。将反应混合物在室温(20至25℃)下搅拌约四小时,然后用0.1N的HCl将pH调至大约2.5终止反应。在HPLC分析前将混合物通过0.45微米的滤纸以滤除凝胶状颗粒。在C4反相分析HPLC柱上将标题产物与起始原料分离。用终止反应液中B29-Nε-己酰-ArgB31,ArgB32-人胰岛素的量除以最初的ArgB31,ArgB32-人胰岛素的量,计算出反应产率为69.4%。
实施例7用棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯在DMSO中酰化LeuB26人胰岛素
将LeuB26人胰岛素(1.0mg)溶于1mL含有95%二甲基亚砜(DMSO)和5%三乙胺(TEA)的混合物中。将棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯(0.7微摩尔)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF),然后在搅拌下加入上述溶液中。将反应混合物在室温下(20至25℃)搅拌约90分钟,然后用0.1N的HCl将样品稀释至0.2mg/ml以终止反应。在HPLC分析前将混合物用0.45微米的滤纸过滤,以滤除凝胶状颗粒。在C4反相分析HPLC柱上将标题产物与起始原料分离。用终止反应液中Nε-棕榈酰-LeuB26-人胰岛素的量除以最初的LeuB26人胰岛素的量,计算出反应产率为36.4%。
实施例8用棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯在二甲基亚砜(DMSO)中酰化人胰岛素
将生物合成人胰岛素结晶(1g,0.17mmol)在室温下完全溶于20mLDMSO制得胰岛素溶液。同时,将棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯(0.0817g,0.23mmol)在50℃下溶于3mLDMSO,制得活性酯的溶液。剧烈搅拌下,向胰岛素溶液中首先加入1,1,3,3 -四甲基胍(0.432mL,3.4mmol),然后加入全部的活性酯溶液。30分钟后,用120mL预先冷却至0℃的0.05M HCl终止反应。混合物的pH约为1.8。用反相HPLC分析终止混合物,结果表明B29-Nε-棕榈酰胰岛素占洗脱蛋白总量的72.2%,并占全部单酰化胰岛素的95%。
将全部反应混合物上到Vydac C4制备反相柱(5×25cm)(预先用含有0.1%三氟乙酸、20%乙腈水溶液的溶剂混合物平衡)上。上样后,将柱子首先用500ml同样的溶剂冲洗,然后以4mL/分钟的流速用由0.1%三氟乙酸、乙腈和水组成的溶剂系统展开,其中乙腈的浓度在9升内从20%增加至80%。B29-Nε-棕榈酰胰岛素在含有约53%乙腈的溶剂系统时洗脱。冷冻干燥除去溶剂后得到414mg(0.0684mmol)Nε-棕榈酰胰岛素,以起始原料计,产率为40.2%。
实施例9用1-辛酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯酰化LysB28 ProB29人胰岛素
将LysB28,ProB29人胰岛素(KPB)结晶(2.0g)溶于200mL pH2.5的50mM硼酸溶液缓冲液中。用10%HCl将溶液的pH调至2.5,然后将溶液搅拌至晶体全部溶解(肉眼观察)。将175mg活性酯(1-辛酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)固体加入25.62mL乙腈中并剧烈搅拌至活性酯颗粒全部溶解(肉眼观察),制得活性酯溶液。加入10%NaOH将KPB溶液的pH调至约10.4,然后将溶液在室温下搅拌约5分钟。向调节了pH的KPB溶液中加入乙腈(176mL),随后加入预先制备的活性酯溶液。反应在室温下进行90分钟,然后加入5.5mL 10%HCl(2.75%v/v)和三倍体积的冷水终止反应,得到的最终pH为2.70。用终止反应液中LysB29(C8)KPB的量除以最初的BHI的量,计算出反应产率为75.5%。将溶液分成两个800ml的等份并通过疏水色谱(SP20SS)进行纯化。柱色谱后进行超滤和冷干。
表2中的数据证实了胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素原的选择性酰化。实验用N-羟基琥珀酰亚胺的脂肪酸酯在室温下进行。在下表中,TMG和TEA分别代表四甲基胍和三乙胺。ND表示没有数据。
Claims (11)
1.用脂肪酸选择性地酰化带有游离ε-氨基和游离α-氨基的胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物的方法,包括将ε-氨基与可溶性的活性脂肪酸酯于碱性条件下在极性溶剂中反应。
2.权利要求2的方法,其中的蛋白质是人胰岛素、胰岛素类似物、或LysB28ProB29-人胰岛素。
3.权利要求1的方法,其中的活性脂肪酸酯是C6至C18脂肪酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯。
4.权利要求1的方法,其中的活性脂肪酸是C14至C18脂肪酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯。
5.权利要求1至4中任一权项的方法,其中的活性脂肪酸是棕榈酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯。
6.用脂肪酸选择性地酰化带有游离ε-氨基和游离α-氨基的胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物的方法,包括将ε-氨基与可溶性的活性脂肪酸酯在半水性溶剂中,在pH为大约9.0至12.0的条件下反应。
7.权利要求6的方法,其中的蛋白质是人胰岛素、胰岛素类似物、或LysB28ProB29-人胰岛素。
8.权利要求7的方法,其中的pH为大约9.5至大约10.5。
9.权利要求8的方法,其中的半水性溶剂是乙腈和水。
10.权利要求9的方法,其中的溶剂是50%的乙腈。
11.权利要求10的方法,其中的脂肪酸酯是棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯、辛酸N-琥珀酰亚胺基酯、或肉豆蔻酸N-琥珀酰亚胺基酯。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104558097A (zh) * | 2014-05-20 | 2015-04-29 | 广东东阳光药业有限公司 | 肽的酰化方法 |
CN105111305A (zh) * | 2015-10-10 | 2015-12-02 | 山东阿华生物药业有限公司 | 酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
CN105440125A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-03-30 | 山东阿华生物药业有限公司 | 地特胰岛素或其类似物的制备方法 |
CN107602437A (zh) * | 2017-08-09 | 2018-01-19 | 上海昂德生物科技有限公司 | 活化酯的制备方法 |
Families Citing this family (68)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9316895D0 (en) | 1993-08-13 | 1993-09-29 | Guy S And St Thomas Hospitals | Hepatoselective insulin analogues |
US6869930B1 (en) | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
US5951974A (en) * | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
US6251856B1 (en) | 1995-03-17 | 2001-06-26 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
US5631347A (en) * | 1995-06-07 | 1997-05-20 | Eli Lilly And Company | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein |
US6451970B1 (en) * | 1996-02-21 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Peptide derivatives |
DE69731105T2 (de) * | 1996-07-11 | 2005-11-17 | Novo Nordisk A/S | Verfahren zur selektiven acetylierung |
US5905140A (en) * | 1996-07-11 | 1999-05-18 | Novo Nordisk A/S, Novo Alle | Selective acylation method |
US6444641B1 (en) | 1997-10-24 | 2002-09-03 | Eli Lilly Company | Fatty acid-acylated insulin analogs |
AU1111799A (en) * | 1997-10-24 | 1999-05-17 | Eli Lilly And Company | Fatty acid-acylated insulin analogs |
US5985263A (en) * | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
US5981709A (en) * | 1997-12-19 | 1999-11-09 | Enzon, Inc. | α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same |
US6451974B1 (en) | 1999-03-17 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Method of acylating peptides and novel acylating agents |
AU4904800A (en) * | 1999-05-27 | 2000-12-18 | Robert Z-T. Luo | Identification of compounds for modulating dimeric receptors |
US7169889B1 (en) * | 1999-06-19 | 2007-01-30 | Biocon Limited | Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin |
WO2001085256A2 (en) * | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Novo Nordisk A/S | Critical illness neuropathy |
US7316999B2 (en) | 2000-06-02 | 2008-01-08 | Novo Nordisk A/S | Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives |
EP1346726A4 (en) * | 2000-12-25 | 2004-09-15 | Shiseido Co Ltd | FRAGRANCE COMPOSITION STIMULATING THE SYMPATHETIC SYSTEM |
US7060675B2 (en) | 2001-02-15 | 2006-06-13 | Nobex Corporation | Methods of treating diabetes mellitus |
US7713932B2 (en) | 2001-06-04 | 2010-05-11 | Biocon Limited | Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof |
US6835802B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-28 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties |
US6713452B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-03-30 | Nobex Corporation | Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6828305B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6828297B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6858580B2 (en) * | 2001-06-04 | 2005-02-22 | Nobex Corporation | Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US20030082671A1 (en) | 2001-07-24 | 2003-05-01 | Thomas Hoeg-Jensen | Method for making acylated polypeptides |
JP4386722B2 (ja) * | 2001-07-24 | 2009-12-16 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | アシル化されたポリペプチドの製造方法 |
EP1421102A2 (en) * | 2001-07-24 | 2004-05-26 | Novo Nordisk A/S | Method for making acylated polypeptides |
US7595172B2 (en) | 2001-07-24 | 2009-09-29 | Novo Nordisk A/S | Method for making acylated polypeptides |
PE20030536A1 (es) | 2001-09-07 | 2003-07-03 | Biocon Ltd | Metodos para sintetizar conjugados polipeptido de insulina-oligomero, y conjugados polipeptido de proinsulina-oligomero y metodos de sintetizar dichos conjugados |
US7312192B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US6913903B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-07-05 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US7166571B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-01-23 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US7030082B2 (en) * | 2001-09-07 | 2006-04-18 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith |
US6770625B2 (en) | 2001-09-07 | 2004-08-03 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US20030199445A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-10-23 | Knudsen Lotte Bjerre | Use of GLP-1 compound for treatment of critically ill patients |
US7273921B2 (en) | 2002-09-25 | 2007-09-25 | Novo Nordisk A/S | Method for producing acylated peptides |
DE60328112D1 (de) * | 2002-09-25 | 2009-08-06 | Novo Nordisk As | Verfahren zur herstellung acylierter peptide |
MXPA06001283A (es) * | 2003-08-05 | 2006-04-11 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina novedosos. |
EP1687428A1 (en) | 2003-11-14 | 2006-08-09 | Novo Nordisk A/S | Processes for making acylated insulin |
CA2910494C (en) | 2004-07-19 | 2018-10-23 | Biocon Limited | Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof |
US9056921B2 (en) | 2005-08-16 | 2015-06-16 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
DK1969004T3 (da) | 2005-12-28 | 2011-11-28 | Novo Nordisk As | Insulinsammensætninger og metode til at lave en sammensætning |
EP1991576B1 (en) * | 2006-02-27 | 2010-09-29 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
US8927015B2 (en) * | 2006-04-12 | 2015-01-06 | Emisphere Technologies, Inc. | Formulations for delivering insulin |
US20090306337A1 (en) | 2006-07-31 | 2009-12-10 | Novo Nordisk A/S | Pegylated, Extended Insulins |
KR101729986B1 (ko) | 2006-09-22 | 2017-04-25 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 프로테아제 내성 인슐린 유사체 |
EP2069502B1 (en) | 2006-09-27 | 2014-02-26 | Novo Nordisk A/S | Method for making maturated insulin polypeptides |
WO2008132224A2 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-06 | Novo Nordisk A/S | Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein |
ES2744384T3 (es) | 2007-06-13 | 2020-02-24 | Novo Nordisk As | Formulación farmacéutica que comprende un derivado de insulina |
ES2664822T3 (es) | 2007-10-16 | 2018-04-23 | Biocon Limited | Una composición farmacéutica sólida administrable por vía oral y un proceso de la misma |
ES2618073T3 (es) | 2008-03-14 | 2017-06-20 | Novo Nordisk A/S | Análogos de insulina estabilizados frente a proteasas |
US8691759B2 (en) | 2008-03-18 | 2014-04-08 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
JP5591243B2 (ja) | 2008-09-12 | 2014-09-17 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | ペプチド又はタンパク質のアシル化の方法 |
EP2352513B1 (en) * | 2008-10-30 | 2016-09-14 | Novo Nordisk A/S | Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency |
UA102888C2 (ru) * | 2009-02-20 | 2013-08-27 | Іпсен Фарма С.А.С. | Аналоги нейропептида y с заменой на пролин в положении 34 |
CN102770152B (zh) | 2009-11-25 | 2016-07-06 | 阿瑞斯根股份有限公司 | 肽类的粘膜递送 |
DK2632478T3 (da) | 2010-10-27 | 2019-10-07 | Novo Nordisk As | Behandling af diabetes melitus under anvendelse af insulinindsprøjtninger indgivet med varierende indsprøjtningsintervaller |
CN104364260B (zh) | 2012-04-11 | 2017-02-22 | 诺和诺德股份有限公司 | 胰岛素制剂 |
US10137172B2 (en) | 2013-04-30 | 2018-11-27 | Novo Nordisk A/S | Administration regime |
AU2014333979B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-02-15 | Novo Nordisk A/S | Novel derivative of an insulin analogue |
FR3013049B1 (fr) | 2013-11-14 | 2015-11-13 | You-Ping Chan | Analogue de l'insuline glargine |
AR099569A1 (es) | 2014-02-28 | 2016-08-03 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina y los usos médicos de estos |
US10724025B2 (en) | 2016-05-05 | 2020-07-28 | Codexis, Inc. | Penicillin-G acylases |
MA46780A (fr) | 2016-11-07 | 2019-09-11 | Novo Nordisk As | Esters à dchbs actif de composés peg et leur utilisation |
ES2930149T3 (es) | 2016-12-16 | 2022-12-07 | Novo Nordisk As | Composiciones farmacéuticas que contienen insulina |
US10335464B1 (en) | 2018-06-26 | 2019-07-02 | Novo Nordisk A/S | Device for titrating basal insulin |
CN116874585B (zh) * | 2023-09-06 | 2023-12-15 | 杭州湃肽生化科技有限公司 | 一种地特胰岛素的合成方法 |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR1468831A (fr) * | 1965-10-05 | 1967-02-10 | Roussel Uclaf | Procédé de préparation de nouveaux composés polypeptidiques et produits en résultant |
DE1902865A1 (de) * | 1968-02-01 | 1969-09-11 | American Home Prod | Substituierte Insulin-Derivate,Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen |
US3591574A (en) * | 1968-05-29 | 1971-07-06 | American Home Prod | Tri-n-phenylglycyl derivatives of insulin |
US3528960A (en) * | 1968-10-07 | 1970-09-15 | Lilly Co Eli | N-carboxyaroyl insulins |
US3823125A (en) * | 1969-10-14 | 1974-07-09 | American Home Prod | N-aminoacyl-substituted insulins |
US3752798A (en) * | 1969-12-02 | 1973-08-14 | G Amird | Tris-na1,nb1,nepsilonb29 - (3-x-3-oxo - 1-y-prop-1-en-1-yl)(ndelta-(4-z-6-r-pyrimidin - 2 - yl) ornithine b22)-insulins and their preparation |
US3869437A (en) * | 1970-05-08 | 1975-03-04 | Nat Res Dev | Mono-, di, and N{HD A1{B , N{HU B1{B , N{HU B29{B -tri-acylated insulin |
US3950517A (en) * | 1970-05-08 | 1976-04-13 | National Research Development Corporation | Insulin derivatives |
GB1381273A (en) * | 1971-01-28 | 1975-01-22 | Nat Res Dev | Insulin derivatives |
GB1381274A (en) * | 1971-01-28 | 1975-01-22 | Nat Res Dev | Insulin derivatives |
US3864325A (en) * | 1971-11-18 | 1975-02-04 | Nat Res Dev | (N{HU Al{b , N{HU Bl{b , N{HU B29{B , carbamoyl)-(O{HU A14{B , O{HU B16{B , O{HU B26{B aryl) insulin derivatives |
BE791949A (fr) * | 1971-11-27 | 1973-05-28 | Schering Ag | Derives d'insuline, leur preparation et leur utilisation |
US3755569A (en) * | 1972-07-25 | 1973-08-28 | American Home Prod | Acyl substituted insulins |
DE2252157C3 (de) * | 1972-10-25 | 1976-03-18 | Hoechst Ag | Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten |
DE2253327A1 (de) * | 1972-10-31 | 1974-05-09 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
NL7314766A (zh) * | 1972-10-31 | 1974-05-02 | ||
DE2428412A1 (de) * | 1974-06-12 | 1976-01-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
DE2439296A1 (de) * | 1974-08-16 | 1976-02-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten |
GB1492997A (en) * | 1976-07-21 | 1977-11-23 | Nat Res Dev | Insulin derivatives |
US4218539A (en) * | 1978-03-24 | 1980-08-19 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates and method of preparation and use |
PH25772A (en) * | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
JPH01254699A (ja) * | 1988-04-05 | 1989-10-11 | Kodama Kk | インスリン誘導体及びその用途 |
PT93057B (pt) * | 1989-02-09 | 1995-12-29 | Lilly Co Eli | Processo para a preparacao de analogos da insulina |
AU8091091A (en) * | 1990-07-26 | 1992-02-18 | University Of Iowa Research Foundation, The | Novel drug delivery systems for proteins and peptides using albumin as a carrier molecule |
US5304473A (en) * | 1991-06-11 | 1994-04-19 | Eli Lilly And Company | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production |
KR100310122B1 (ko) * | 1993-09-17 | 2002-04-24 | 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느 | 아실화된인슐린 |
DE4437604A1 (de) * | 1994-10-21 | 1996-04-25 | Basf Ag | Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung |
US5905140A (en) | 1996-07-11 | 1999-05-18 | Novo Nordisk A/S, Novo Alle | Selective acylation method |
-
1994
- 1994-11-17 US US08/341,231 patent/US5646242A/en not_active Ceased
-
1995
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1999
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104558097A (zh) * | 2014-05-20 | 2015-04-29 | 广东东阳光药业有限公司 | 肽的酰化方法 |
CN105111305A (zh) * | 2015-10-10 | 2015-12-02 | 山东阿华生物药业有限公司 | 酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
CN105111305B (zh) * | 2015-10-10 | 2018-12-14 | 山东阿华生物药业有限公司 | 酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
CN105440125A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-03-30 | 山东阿华生物药业有限公司 | 地特胰岛素或其类似物的制备方法 |
CN105440125B (zh) * | 2015-11-25 | 2019-09-24 | 华润昂德生物药业有限公司 | 地特胰岛素或其类似物的制备方法 |
CN107602437A (zh) * | 2017-08-09 | 2018-01-19 | 上海昂德生物科技有限公司 | 活化酯的制备方法 |
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