CN1184961C - 上皮生长因子受体拮抗体剂的制药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明用一种上皮生长因子受体(EGF-R)拮抗剂来抑制肺内的过量粘液分泌。所述的EGF-R拮抗剂可以是能结合并阻断EGF受体的有机小分子、抗体或抗体组分。该EGF-R拮抗剂适合通过足量注射来抑制肺气道内杯状细胞的形成。这抑制导致气道内粘液产生的杯状细胞的脱粒。本发明还提供筛选能抑制杯状细胞增殖的候选药剂的试验。

Description

上皮生长因子受体拮抗剂的制药用途
                             发明领域
本发明主要涉及肺病治疗领域。更具体地说，本发明是关于用EGF-R拮抗剂抑制肺和气道内粘液的过量分泌。此外，本发明还涉及开发或评价能够抑制肺内粘液过量分泌的候选药剂的方法。
                             发明背景
在呼吸系统的气道内，粘膜纤毛系统是将吸入的颗粒或感染因子驱除出肺内气道的第一防御机制。而且，气道液内的物质具有限制颗粒毒性和灭活感染因子的作用。咳嗽的物理机制具有将粘液驱除出气道通路的作用(参见，例如，“呼吸病治疗基础”(″Foundation of Respiratory Care″)Pierson和Kacmarek编辑(1992)Churchill Livingstone Inc.New York，New York；“内用药的Harrison原则”(″Harrison′s Principles of Internal Medicine″)，Fauci等编辑(1997)第14版，McGraw Hill，New York，New York)。
粘膜纤毛系统包括纤毛上皮细胞，上皮杯状细胞和粘膜下腺内的浆液细胞和粘液细胞。纤毛周围是一水性层(纤毛周液)，由氯通过上皮的主动运输和水通过上皮的被动运输而分泌到气道腔内。纤毛与浮在该水性层上的粘液接触，并通过一种单向推进运动使粘液向声门移动(参见Pierson和Kacmarek，同上和Fauci等，同上)。粘液由上皮杯状细胞和粘膜下腺细胞产生，并在脱粒后分泌入气道腔。
虽然，一般说来，粘液帮助清除吸入的颗粒或感染因子，但气道内粘液的过量分泌会造成渐进性气道阻塞。咳嗽无法清除外周气道内的分泌物。而且，内含大量杯状细胞的小气道因为其小，特别容易被粘液堵塞。气道分泌过量影响着许多人：它可见于于多种肺病中，例如慢性支气管炎、急性哮喘、囊性纤维变性和支气管扩张。
粘液分泌过量是慢性阻塞性肺病(COPD)患者的主要症状，并形成特定的病情(即，慢性咳嗽和多痰)。仅这一种情况就影响着1400万美国人，并可能造成渐进性失能和死亡。据估计，至少4％美国人患有哮喘，并每年造成至少2000人死亡(Pierson和Kacmarek，同上)。急性哮喘发作时，支气管壁肿胀，粘液量增多，支气管平滑肌收缩，造成气道狭窄。急性哮喘过量分泌的结果之一是过量粘液堵塞，这可能是致病和致死的主要原因。
分泌过量还与囊性纤维化有关，囊性纤维化是全球最常见的致死性遗传病之一。囊性纤维化是一种常染色体隐性病，使气道粘膜细胞变得对细胞膜氯离子通道的环化AMP依赖性蛋白激酶的活化作用无应答(参见Pierson和Kacmarek，同上和Fauci等，同上)。接着发生的电解质失衡降低气道粘液的水化水平，使得囊性纤维化患者肺内的粘液非常粘稠。过量分泌阻塞了囊性纤维化患者的空气通路，进而损害肺功能。
其他与分泌过量相关的疾病包括慢性阻塞性肺病(COPD)。在COPD发病中，氧化剂压力起着重要作用。吸烟产生氧自由基，与该病的发生密切相关。在COPD的炎症部位常会看到嗜中性粒细胞，而令人感兴趣的是，已知氧自由基是嗜中性粒细胞在活化过程中释放的。
为了帮助各种肺病患者通气，常需要机械地插入导管。导管通过咽喉导入，插在气管内。为了防止气管内插管周围漏气，可使围绕着下气管中导管周围的气球膨胀，这可能擦伤上皮并造成杯状细胞变形。上皮损伤引起修复过程，这可能造成粘液的大量分泌。这种长期的气管插管可能因为过量分泌而对患者造成损害。
过量分泌性肺病患者的肺内有大量的粘液，这阻碍了粘液的清除。细菌(例如肺炎球菌)等病原因子常会在粘液内聚集，造成肺的反复感染。
治疗气道分泌过量患者的经典方法包括抗生素治疗，支气管扩张药(例如甲基黄嘌呤(Methylxanthines)，具有强β2肾上腺刺激性的拟交感神经药物，副交感神经阻滞药物)，使用全身性或吸入性皮质类固醇，主要用于哮喘，通过口服化痰剂(例如愈创甘油醚)使粘液液化，和吸服“溶粘液”剂气溶胶(例如水、高渗性盐溶液)(参见，Harrison′s，同上)。囊性纤维化的一种较新的治疗方法是给予定向于多DNA粘液或痰液的DNAase(Shak等(1990)，美国科学院院报87：9188-9192；Hubbard，R.C.等(1991)，新英格兰医学杂志326：812)。此外，还运用胸部理疗，包括叩击、震动和导液引流，促进粘稠粘液的清除。严重肺损伤患者的最终选择可能是肺移植。所以，需要有一种针对粘膜分泌的更有效或可供选择的治疗方法。具体地说，需要一种能够减少气道内粘液分泌的特异性方法。
相关文献
用EGF抑制剂阻断癌细胞的生长，Levitski(1994)，欧洲生物化学杂志226(1)：1-13；Powis(1994)，药物治疗62：57-95；Kondapaka和Reddy(1996)，分子细胞内分泌117：53-58。
发明概述
气道内粘液分泌过量是许多不同肺病中的一种不良症状。这种分泌是杯状细胞脱粒引起的，刺激上皮生长因子受体(EGF-R)会促进杯状细胞的增殖。本发明通过给予治疗有效量的EGF拮抗剂(以激酶抑制剂为佳)来治疗肺分泌过量。所述拮抗剂可以是结合EGF或其受体的小分子、抗体或抗体组分。另一方面，本发明提供筛选抑制粘液过量分泌的候选药物的体外和体内方法。
本发明的主要目的是提供治疗包括肺内粘液分泌过量的疾病的方法。
本发明的目的还包括提供用于治疗造成粘液分泌过量的疾病的制剂。
本发明的目的还包括提供筛选抑制粘液过量分泌的候选药剂的体外方法，该方法的步骤包括：(i)让杯状细胞增殖的体外模型与EGF或其功能相当者接触；(ii)接着，让该体外模型与候选药剂接触；(iii)评价杯状细胞的增殖；如果杯状细胞增殖被移植，表明该候选药剂具有治疗潜力。
本发明的目的还包括提供筛选抑制粘液过量分泌的候选药剂的体内方法，该方法的步骤包括：(i)通过引入EGF-R和肿瘤坏死因子α建立分泌过多性肺病的动物模型；(ii)用EGF-R的配体，例如转化生长因子α(TGF-α)或EGF刺激导入的EGF-R，产生产粘液的杯状细胞；(iii)用候选药剂治疗；(iv)评价杯状细胞的增殖或粘液分泌；杯状细胞增殖被抑制或粘液分泌被抑制表明该候选药剂具有治疗潜力。
本发明的目的还在于提供筛选抑制粘液过量分泌的EGF-R拮抗剂的体外和体内方法。
本发明的优点在于提供了一种防止肺气道内粘液过量形成的手段。
本发明的特征之一是，可用不同类型的拮抗剂来阻断EGF和/或TFG-α的作用和它们与EGF-R的相互作用。
本发明内容之一是EGF拮抗剂制剂，用于减少哺乳动物，最好是人患者气道内粘液的分泌。
本发明的目的还包括肺内递送EGF拮抗剂的方法，用于减少哺乳动物，最好是人患者气道内粘液的分泌。
本发明的目的还包括提供治疗以气道内粘液分泌过量为症状之一的多种肺病的方法。这些疾病包括但不限于：慢性支气管炎、急性哮喘、囊性纤维化、慢性阻塞性肺病、变应性刺激或机械擦伤等上皮损伤引起的过量分泌，和鼻内过量分泌。
本领域技术人员在读了以下有关本发明治疗方法、体外和体内试验方法的详细描述后，可对本发明的以上及其他目的、优点和特征有清楚的理解。
                             附图简述
图1A是NCl-H292和A431细胞内EGF-R的Western印迹。图1B是用抗EGF-R抗体对NCl-H292细胞进行的免疫细胞化学分析。图1C是NCl-H292细胞内EGF-R的Northern分析。
图2：NCl-H292细胞的Alcain蓝/PAS染色，用于鉴定粘液素糖蛋白。
图3：NCl-H292细胞内MUC5基因表达的Northern分析。
图4A和4B：无病原体大鼠内用抗EGF-R抗体进行的EGF-R免疫组织化学分析。图4A：TNFα-处理的大鼠。图4B：卵蛋白致敏的大鼠。
图5显示EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522)对杯状细胞产生的作用(表示为被Alcain蓝/PAS染色阳性细胞占据的气道上皮染色区％)。
                             本发明的详细描述
本发明通过给予治疗有效量EGF拮抗剂(以激酶抑制剂为佳)提供了治疗气道粘液分泌过量的组合物和方法。所述拮抗剂可以是结合EGF或其受体的小分子、抗体或抗体组分。在气道粘液分泌过量性疾病中，例如慢性支气管炎、支气管扩张、囊性纤维化、极性哮喘、COPD等中，气道内粘液素合成增加，出现粘液分泌过量。分泌的粘液造成气道阻塞，可能在这些疾病中导致死亡。
气道损伤和炎症的几种原因会诱导气道上皮细胞内上皮生长因子受体的表达。EGF-R诱导后受到的配体依赖性和非配体依赖性机制激发，同时在基因表达水平和蛋白质水平引起粘液素的产生。已证明，EGF-R酪氨酸激酶的选择性抑制剂能够阻断这种粘液素基因和蛋白质的表达。
本发明认为，但非限定，杯状细胞产生的演进顺序可能以EGF-R的表达为基础。TNFα刺激诱导非粒化分泌细胞的强EGF-R染色；这些细胞随后被EGF-R配体激活，引起细胞质内粘液性糖复合物的渐进性染色，这些细胞先变成“前杯状细胞”，接着变成杯状细胞。这提示，EGF-R活化促进选择性的细胞分化而不是增殖。杯状细胞显然来自表达EGF-R的非粒化分泌细胞，并受EGF-R配体的刺激而产生粘液素。
除受细胞因子激发之外，EGF-R还受其他信号介质的激发。例如，长期吸烟与外周气道内的渐进性病变包括杯状细胞化生相关。已知，促炎细胞因子活化的嗜中性粒细胞和吸烟会通过EGF-R的肺配体依赖性活化作用而引起人支气管上皮细胞内粘液素的合成，这说明，嗜中性粒细胞的汇集和香烟的烟作为上皮细胞分化的调节者，异常诱导了气道内的产粘液素细胞。IL-8、N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸、TNFα、香烟的烟或H2O2等多种刺激因素活化的嗜中性粒细胞可上调上皮细胞内粘液素的表达，粘液素的合成则受EGF-R抑制剂的抑制。嗜中性粒细胞还能够产生EGF-R配体、EGF和TGFα。此外，上皮细胞是EGF-R配体的来源。
对气道上皮的机械损伤也会导致过量分泌，并造成粘液堵塞。EGF-R酪氨酸激酶抑制剂能够防止气管插管后的粘液分泌过量。
上皮损伤在患者中很常见，即使是在轻度哮喘患者中，这种损伤与临床症状的恶化越来越相关。变应性反应造成的上皮损伤诱导EGF-R活化，继而引起异常的杯状细胞产生。EGF-R与上皮损伤相关，例如哮喘、修复术和愈创中发生的“气道重塑”。哮喘中的机械性上皮破坏和上皮损伤可能包含类似的EGF-R联级反应，引起上皮分泌细胞的异常生长。
分泌过量还是鼻炎的一个重要表征。当鼻杯状细胞因杯状细胞的嗜中性粒细胞依赖性脱粒作用而受到“攻击”时，EGF-R和粘液素的表达被强烈上调。这些活动与杯状细胞的重新粒化相关。发炎时，例如嗜中性粒细胞浸润等刺激引起杯状细胞脱粒和粘液素分泌，EGF-R的上调和活化重新补充了气道上皮的粘液素。
在描述本发明治疗方法和制剂之前，首先要明白，本发明并不局限于所述的特定方法和制剂，因为这些显然可能改变。还需要明白的是，本文中的术语只是为了描述特定的实施例，而不是进行限定，因为，本发明的范围仅由权利要求书来限定。
若非另作说明，本文中的科技术语与本发明所属领域内一般技术人员的常规理解相同。虽然任何与本文所述相似或相当的方法和材料都可用来实施或试验本发明，但以下所述的是优选的方法和材料。文中提到的出版物在此用于公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
在此引用这些出版物只是因为它们公开在本发明申请日之前。本文没有承认本发明不能因为发明在先而先于这些出版物。而且，本文提供的出版日可能与实际有差别，有待分别证实。
                             定义
“上皮生长因子”或“EGF”指，对上皮细胞具有促有丝分裂生物活性的蛋白质或其部分(例如，Cohen(1986)生物学报道6(12)：1017；Aaronson，S.A.，“生长因子和癌症”，科学(1991)254：1146-1153)。例子是人上皮生长因子，例如Urdea等所述，(1983)美国科学院院报80：7461-7465。
对本发明目的而言特别有意义的是EGF对杯状细胞的促有丝分裂活性。本发明还希望包括这样的蛋白质或其部分，它们就EGF引发的生物应答而言是EGF的功能等价物。
“上皮生长因子受体”或“EGF-R”指，能够结合EGF蛋白或其部分的蛋白质或其部分。例子是人上皮生长因子受体(参见，Ullrich等(1984)自然309：418-425；Genbank登录号NM-005228)。较好的是，EGF配体的结合激活EGF-R(例如，引起胞内有丝分裂信号的活化，EGF-R的自身磷酸化)。本领域技术人员知道，除EGF之外的其他配体也可能结合EGF-R并激活EGF-R。这些配体的例子包括但不限于：TGF-α，β动物纤维素，双调蛋白，肝素结合性EGF(HB-EGF)和神经调节蛋白(又称hergulin)(Strawn和Shawver(1998)药物研究实验与观点7(4)553-573，和“蛋白质激酶机理手册：蛋白质酪氨酸激酶”(1995)Hardie等编辑，Academic Press，NY，NY)。
“EGF-R拮抗剂”指，任何能够直接或间接抑制EGF-R的作用，尤其是EGF-R对杯状细胞增殖或杯状细胞过量分泌粘液的作用的物质。EGF-R可通过配体依赖性和非配体依赖性机制活化，分别引起自身磷酸化或转磷酸化。EGF-R拮抗剂可抑制这两种机制或其中之一。例如，TNF-α与EGF-R结合引起配体依赖性的磷酸化，这可被结合EGF-R的抗体所阻断，从而阻止EGF与能够活化EGF受体的配体相互作用。此类抗体的例子参见Goldstein等(1995)临床癌症研究1：1311-1318；Lorimer等(1985)临床癌症研究1：859-864；Schmidt和Wels(1996)英国癌症研究杂志74：853-862。小分子酪氨酸激酶抑制剂也能够作为EGF-R拮抗剂。
或者，已知，例如氧自由基之类的化合物会刺激EGF-R的转磷酸化，引起该受体的非配体依赖性活化。通过转磷酸化活化EGF-R的其他方法包括紫外线和渗透压压力，以内皮素-1、溶血磷脂酸和凝血酶刺激与G蛋白偶联的受体、m1蝇覃碱乙酰胆碱受体和人生长因子。这种非配体依赖性机制的拮抗剂包括抗氧化剂，例如超氧化物歧化酶，DMSO，DMTU，抗坏血酸等。
EGF-R拮抗剂可以是结合EGF产生或EGF-R产生的激发因子的抗体，从而抑制EGF引起的杯状细胞增殖(即，使EGF-R磷酸化的磷酸化级联反应抑制剂)。例如，Arteaga等所述(1995)的TGFα-假单孢菌外毒素40融合蛋白，癌症研究54：4703-4709。
在一优选实施例中，EGF-R拮抗剂是EGF-R酪氨酸激酶活性的抑制剂，特别是相比其他酪氨酸激酶对EGF-R具有选择性作用的小分子抑制剂—优选能阻断哺乳动物最好是天然人EGF受体，分子量低于1kD的小分子。
EGF和EGF-R的抑制剂包括但不限于：酪氨酸激酶抑制剂，例如PD153035、4-(3-氯苯氨基)喹唑啉或CP-358,774等喹唑啉，吡啶嘧啶，嘧啶嘧啶，CGP59326、CGP60261和CGP62706等吡咯嘧啶和吡唑嘧啶(Shawn和Shawver，同上)，4-(苯基氨基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶(Traxler等(1996)医学化学杂志39；2285-2292)，姜黄色素(二阿魏酰基甲烷)(Laxmin arayana等(1995)，致癌原16：1741-1745)，4，5-二(4-氟苯氨基)邻苯二甲酰亚胺(Buchdunger等(1995)临床癌症研究1：813-821；Dinney等(1997)临床癌症研究3：161-168)；含硝基噻吩基团的酪氨酸磷酸化抑制剂(Brunton等(1996)抗癌药物设计11：265-295)；蛋白质激酶抑制剂ZD-1839(AstraZeneca)；CP-358774(Pfizer，inc)；PD-0183805(Warner-Lambert)；或国际专利申请WO99/09016(American Cyanamid)，WO98/43960(American Cyanamid)，WO97/38983(Warener Labert)，WO99/06378(WarenerLabert)，WO99/06396(Warener Labert)，WO96/30347(Pfizer，Inc.)，WO96/33978(Zeneca)，WO96/33977(Zeneca)和WO96/33980(Zeneca)所述；或，反义分子。
“抑制”指，降低、中和、减弱或阻止杯状细胞增殖、杯状细胞脱粒或杯状细胞过量分泌粘液。
“处理”、“治疗”等在此指，获得所需药理学和/或生理学效果的方法。所述的效果可能是预防性的，即完全或部分预防疾病或其症状，和/或是治疗性的，即部分或完全治愈疾病和/或其引起的不良后果。此处的“治疗”包括对哺乳动物特别是人的各种疾病的治疗手段，包括：
(a)预防个体发生疾病或症状，该个体具有发生疾病或症状的倾向但尚未被诊断为已发生；
(b)抑制疾病或症状，即，阻止其发展；或
(c)缓解疾病或症状，即，引起疾病或症状的消退。
本发明旨在治疗肺病或气道疾病患者，特别是治疗粘液分泌过量的患者，即，预防、抑制或缓解粘液分泌过量。就症状治疗而言，本发明旨在减少气道内的粘液和痰液，抑制病原微生物引起的感染，缓解咳嗽，和防止气道阻塞造成的缺氧。
更具体地说，“治疗”指，对涉及粘液分泌过量的肺病患者产生治疗学上可测知的有益效果。
再进一步具体地说，“治疗”指，用EGF和/或EGF-R拮抗剂类化合物预防、缓解和/或抑制粘液的过量分泌，所述拮抗剂选自抗体、蛋白质酪氨酸激酶抑制剂和反义分子等。或者，治疗可包括通过阻止气道内EGF-R的表达实现对疾病进程的早期阻断。例如，可用阻断TNFα与其受体结合的物质防止EGF-R的上调。
治疗包括用药剂防止或抑制粘液分泌过量引起和/或与之相关的病原因子感染。
“抗体”指，能够与抗原结合的免疫球蛋白。本发明的抗体包括能与感兴趣的抗原或抗原性片段结合的抗体片段，例如F(ab′)2，Fab′，Fab。较好的是，所述抗体与抗原的结合抑制EGF或EGF-R的活性。
本发明的“人源化抗体”指，CDR来自非人源而Ig分子或其片段的其余部分都来自人抗体的全抗体分子，即包括两条完整轻链和两条完整重链的抗体，和只含有F(ab′)2，Fab′，Fab和Fv等抗体片段的抗体，它适合由编码人抗体的核酸序列产生。
本发明的“人抗体”和“人源化抗体”指，抗体分子各部分都来自编码人抗体的核酸序列的抗体。这样的人抗体最适合用于给人患者的抗体治疗，因为这样的抗体引起的免疫反应极小或根本没有。
本发明的“嵌合抗体”指，以上就“人源化抗体”所述的抗体和抗体片段。“嵌合抗体”包括人源化抗体。嵌合抗体重链或轻链氨基酸序列的至少一部分来自第一哺乳动物，重链或轻链氨基酸序列的另一部分来自不同的第二哺乳动物。较好的是，可变区来自非人哺乳动物，而恒定区则来自人。特别的是，嵌合抗体适合由这样两段核苷酸序列产生：一段来自非人哺乳动物，编码抗体的可变区，另一段来自人，编码抗体的恒定区。
“特异性结合”指，抗体与特定多肽的高活性和/或高亲和性。抗体与特定多肽上其表位的结合强于该抗体与任意其他表位，特别是存在于与特定感兴趣多肽处于同一样品内的相关分子内的表位的结合。特异性结合感兴趣多肽的抗体也许能够与其他多肽发生弱但仍可测知的结合，例如，结合水平为与感兴趣多肽结合的10％或更低。如此弱的结合或背景结合，很容易与抗体与感兴趣的化合物或多肽的特异结合区分开来，例如使用合适的对照。
“可测性标记的抗体”，“可测性标记的抗EGF”或“可测性标记的抗EGF片段”指，连接有可测标记的抗体(或保留了结合特异性的抗体片段)。可测标记一般通过化学偶联来连接，但是，当标记是多肽时，还可以用基因工程技术进行连接。产生可测标记的蛋白质的方法是本领域所熟知的。可测标记可选自许多本领域已知的此类标记，但通常是放射性同位素、荧光团、酶(例如辣根过氧化物酶)或其他分子或化合物，它们能够发出可测信号(例如放射性、荧光、颜色)或在与该标记的底物接触后发出可测信号。各种可测标记/底物对(例如辣根过氧化物酶/二氨基联苯胺，生物素/链霉亲和素，荧光素酶/荧光素)，标记抗体的方法，和使用标记后抗体检测抗原的方法，都是本领域所熟知的(例如，参见Harlow和Lane编辑的(抗体：试验室手册(1988)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring HarborNY)。
治疗方法
本发明提供通过给予治疗量EGF-R拮抗剂治疗肺分泌过量的方法。本发明所述的方法可治疗各种以粘液分泌过量或粘液病理性累积为特征的疾病，尤其是肺病。可用本发明方法治疗的肺分泌过量疾病例如但不限于：慢性阻塞性肺病，如慢性支气管炎；炎症，如哮喘；支气管扩张；肺纤维化；COPD；鼻分泌过量性疾病，如鼻过敏；以及其他分泌过量性疾病。可能还包括诸如囊性纤维化，Kartagener综合征，α-1抗胰蛋白酶缺陷，家族性非囊性纤维化呼吸道粘液浓稠等遗传病。
优选的是直接针对EGF或EGF-R的拮抗剂。然而，本领域熟练技术人员可看出，此种抑制可以针对引起EGF-R促进杯状细胞增殖这一生物级联反应中的各种因子或细胞，例如TGF-α拮抗剂。在理论所述之外，在炎性应答中，当肥大细胞或嗜中性粒细胞等细胞释放出TNF-α时级联启动，TNF-α然后促进EGF-R的表达。EGF-R被例如其配体EGF激活，继而触发杯状细胞增殖。因此，参与该级联反应的各种细胞或因子，例如参与TNF-α路径的那些，都可作为拮抗剂活性的目标。
治疗方法中给予的EGF-R拮抗剂可以是任意形式的。作为例子，EGF-R拮抗剂可以是小分子(即，反义寡核苷酸，酪氨酸激酶抑制剂等)，结合TGF-α或EGF-R的抗体或其部分。
小分子EGF-R拮抗剂
作用且选择性作用于EGF受体的酪氨酸激酶抑制剂在本领域是已知的，可以用在本发明方法中。前文已就此进行了例举，其中包括BIBX1522(BoehringerIngelheim，Inc.，Ingelheim，Germany)；CGP59326B(Novartis Corporation，Basel，Switzerland)；4-氨基喹唑啉EGF-R抑制剂(参见美国专利5760041)，取代的苯乙烯化合物，可以是萘，1，2-二氢化茚或苯并噁嗪；包括腈或单腈化合物(参见美国专利5217999)；美国专利5773476中的抑制剂；马铃薯羧肽酶抑制剂(PCl)，这是一种39个氨基酸的蛋白酶抑制剂，内含3个二硫桥(Blanco-Aparicio等(1998)生物化学杂志273(20)：12370-12377)；铃蟾肽拮抗剂RC-3095(Szepeshazi等(1997)，美国科学院院报94：10913-10918)等。其他酪氨酸激酶抑制剂还包括：喹唑啉，如PD153050，4-(3-氯苯氨基)喹唑啉或CP358,774，吡啶嘧啶，嘧啶嘧啶，吡咯嘧啶，如CGP59326，CGP60261和CGP62706，以及吡唑嘧啶(Shawn和Shawver，同上)，4-(苯基氨基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶(Traxler等(1996)，医学化学杂志39：2285-2292，姜黄素(Korutal等(1994)，生物化学生物物理学学报1224：597-600)；(Laxim arayana(1995)，致癌原16：1741-1745)；等。
优选的是EGF受体选择性(即，EGF-R比具有酪氨酸激酶活性的其他细胞表面受体受到更大程度的抑制)的酪氨酸激酶抑制剂。配制方法和药物递送方式可增强选择性，例如，将抑制剂优先递送到发炎的气道，等等。
全身性给药的一般剂量是每次0.1μg-100mg/kg体重。熟练技术人员很容易看出，剂量水平可根据具体化合物的功能、症状严重程度和患者对副作用的敏感性进行改变。有些特定化合物的效果要强于其他化合物。本领域熟练技术人员可通过多种方法方便地确定某给定化合物的优选剂量。优选的方法是用，例如，本文所述的体外或体内试验来测定给定化合物的生理学效力。
抗体EGF-R拮抗剂
特别有意义的是抗体EGF-R拮抗剂(例如，Viloria等，美国病理学杂志151：1523)。获得EGF或EGF-R的抗体是通过用EGF或EGF-R或其部分免疫异种的有免疫能力的哺乳动物，包括鼠科、啮齿类、兔、羊、猪、牛等。较好的是用人EGF或EGF-R或其部分作为免疫原。特定宿主的选择主要考虑方便性。按照常规技术进行免疫，免疫原可以通过皮下、肌内、腹膜内、血管内等方式给宿主动物注射。免疫原的使用一般为隔日腹膜内注射约1.0-10mg/kg EGF或EGF-R。注射可用或不用佐剂进行，例如完全或不完全Freund′s佐剂，specol，明矾等。完成免疫程序后，可按照常规方法收集抗血清，从而得到EGF或EGF-R特异性的多克隆抗血清。
通过免疫动物制备单克隆或多克隆抗体，以单克隆抗体为佳。在完成免疫程序后，可用常规方法才血清中收获多克隆抗血清。要生产单克隆抗体，需从合适的淋巴组织，例如脾、引流淋巴结等收获淋巴细胞，将其与合适的融合伴融合，后者通常是髓细胞系，于是产生分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤。用常规方法筛选具有感兴趣的抗原特异性的杂交瘤克隆。
特别感兴趣的是能结合EGF-R或EGF-R从而抑制EGF或EGF-R结合的抗体，最好是单克隆抗体，例如，特异性结合EGF-R的胞外域从而阻止EGF结合的抗体。这样的抗体可用前文所述的常规方法来制备，或者购买。可作为EGF拮抗剂的抗体例如但不限于：中和性抗EGF-R单克隆抗体C225(Kawamoto等(1983)，美国科学院院报80：1337-1341；Petit等(1997)，病理学杂志151：1523-153，ImClone Systerm NewYork，NY)生产和抗EGF-R单克隆抗体EMD55900(又称Mab 425)(Merck，Darmstadt，Germany)。
产生的所述抗体的形式可以是单链而不是通常的多聚体结构。有关单链抗体可参见Jost等(1994)，生物化学杂志，269：26267-73，等。将编码重链和轻链可变区的DNA序列与编码至少4个小中性氨基酸(包括甘氨酸和/或丝氨酸)的间隔序列连接。该融合体所编码的蛋白质允许组装成一个功能性可变区，它保留原抗体的特异性和亲和性。
将抗体人源化的方法在本领域是已知的。所述人源化抗体可以由具有人免疫球蛋白恒定区基因的转基因动物产生(参见，例如，国际专利申请WO90/10077和90/04036)。或者，可用重组DNA技术以人的相应序列取代CH1，CH2，CH3，铰链区和/或框架残基，从而通过基因工程获得感兴趣的抗体(参见WO92/02190)。
用Ig的cDNA构建嵌合免疫球蛋白基因在本领域也是已知的(Liu等，(1987)，P.N.A.S.，84：3439和(1987)，免疫学杂志139：3521)。从杂交瘤或其他产抗体细胞中分离mRNA用于产生cDNA。感兴趣的cDNA可用特异性引物通过聚合酶链反应来扩增(美国专利4,683,195和4,683,202)。或者，可建立一文库，然后筛选并分离感兴趣的序列。然后，将编码抗体可变区的DNA序列与人恒定区序列融合。有关人恒定区的基因序列可参见Kabat等(1991)“具有免疫学意义的蛋白质的序列”，N.I.H.，出版号：91-3242。很容易从已知克隆获得人C区基因。然后，用常规方法表达嵌合人源化抗体。
可通过例如蛋白酶或化学剪切等方法剪切完整的抗体蛋白，制备诸如Fv，F(ab′)2和Fab等抗体片段。或者，可设计一段截短的基因。例如一段编码F(ab′)2片段的嵌合基因，它包括编码H链CH1结构域和铰链区的DNA序列，随后是可产生截短分子的翻译终止密码子。
粘液分泌过量患者在开始时可每日两次吸入约20-400mg/kg体重的EGF-R拮抗剂。
反义分子EGF-R拮抗剂
在另一实施例中，所述治疗药剂是对编码EGF或EGF-R的人序列具有特异性的反义分子。所给的治疗药剂可以是反义寡核苷酸，具有不同于天然核酸的化学修饰的部分合成寡核苷酸，或表达RNA之类反义分子的核酸结构物。所述反义序列与目标EGF或EGF-R的mRNA互补，抑制目标基因产物的表达(参见，例如，Nyce等(1997)自然385：720)。反义分子通过激活RNA酶H或立体阻碍，减少可被翻译的mRNA量，由此抑制基因的表达。可以给予一种或组合的反义分子，所述组合可包含同一目标基因的多个不同序列，或与几个不同基因互补的序列。
优选的目标基因是EGF-R或EGF。此基因序列可向公开的数据库获取(人上皮生长因子：Genbank登录号K01166；人上皮生长因子受体前体的mRNA：Genbank登录号：X00588)。通常，反义序列来自与宿主动物相同的物种。
反义分子可通过将合适的载体导入靶细胞，并在其中表达载体内完整的目标基因或其部分来产生。转录的起始将是定向的，从而产生反义RNA分子。该反义RNA与内源性有义mRNA杂交，从而阻断靶基因的表达。可以采用天然转录起始区或异源性转录起始区。可通过体外重组，或染色体序列同源组合来引入启动子。许多在肌肉细胞内具有活性的强启动子在本领域是已知的，包括β肌动蛋白启动子，SV40早期和晚期启动子，人巨细胞病毒启动子，逆病毒LTR等。
转录载体一般含有方便的限制位点，它们靠近启动子序列，可供插入核酸序列。可制备转录盒，它含有转录起始区，靶基因或其片段，和转录终止区。可将转录盒引入各种载体，例如质粒，慢性病毒之类的逆病毒，腺病毒等，所述载体能在细胞内临时或稳定存在至少一天，通常以至少几天为佳。
或者，在一优选实施例中，所述反义分子是一段合成寡核苷酸。反义寡核苷酸一般含约7-500，通常约12-50，更多的是20-35个核苷酸，其长度取决于抑制效率、特异性、有无交叉反应性等。已发现，长7-8碱基的短寡核苷酸可作为基因表达的强选择性抑制剂(参见，Wagner等(1996)，自然生物技术14：840-844)。
选择与反义序列互补的内源mRNA有义链中的特异区。已证明，mRNA的5′区特别容易被反义抑制。然而，最近证明，mRNA的二级结构可能对各位点是否易受抑制很重要。可用经验方法选择寡核苷酸的特定序列，即，在体外或动物模型中分析数段候选序列对靶基因表达的抑制。也可使用多段序列的组合，即，选择mRNA序列上数个区域供反义链互补。
可用本领域已知的方法化学合成反义寡核苷酸(参见，Wagner等(1993)同上，和Milligan等，同上)。优选的是天然磷酸二酯结构经化学修饰得到的寡核苷酸，这可提高其胞内稳定性和结合亲和力。文献中已记载了许多这类修饰方法，它们改变骨架、糖或杂环碱基的化学结构。
寡核苷酸可另外多含一个定向部分以增强细胞对该分子的摄入。该定向部分是一种特异性结合分子，例如识别肺上皮细胞，特别是含EGF-R的上皮细胞表面分子的抗体或其片段。
双特异性抗体、嵌合抗体和单链抗体在本领域是已知的。可用多种方法对适当制备的非人抗体进行人源化。可用多种常规方法将寡核苷酸与定向部分连接，例如，通过二硫键、酰氨键或硫醚键，这取决于寡核苷酸骨架的化学结构。较好的是，连键能在细胞内被剪切而释放出寡核苷酸。
可将寡核苷酸与胆固醇等疏水性残基偶联，以保护它们不受核酸酶剪切，并加强通过细胞膜的运输。或者，也可以与聚L-赖氨酸或其他聚胺偶联来加强向细胞的递送。还可以进行的一项修饰是增加一插入组分，例如吖啶，它能够插入到靶mRNA中，使所得的杂合体稳定化。可将反义寡核苷酸与能在细胞内降解反义链-mRNA复合物的酶一起转染细胞，例如RNA酶H。任何能够优先降解或封闭反义链-mRNA双体的蛋白质或酶菌可类似地使用。
除反义抑制剂之外，还可用催化性核酸化合物(例如核酶)、反义偶联物等，以抑制基因表达。可在体外合成核酶，然后给予患者，或者由一表达载体编码，并由其在靶细胞内表达(例如，参见国际专利申请WO9523225和Beigelman等(1995)，核酸研究23：4434-42)。具有催化活性的寡核苷酸的例子参见WO9506764。反义寡核苷酸与能够介导mRNA水解的金属复合物(例如三吡啶铜(II))的偶联物参见Bashkin等，(1995)Appl.Biochem.Biotechnol.54：43-56。
药物制剂
EGF-R拮抗剂可以溶液或其他任何药学合适形式给予，例如作为脂质体悬浮液给予。合适的抗体或其他形式抗-EGF可用给予此类物质的常规方法配制给予。经典剂型可参见Remington药物学，最新版，Mack Publishing Company，Easton，PA。给予途径的选择可根据所给化合物，受治患者和疾病的情况。当发生粘液分泌过量时，根据疾病的严重程度，一种化合物可通过不同的途径给予，例如紧急情况下可能需要静脉给予，急性但无生命危险的情况可口服治疗，慢性治疗则可通过喷雾给予。
就治疗鼻道和气道疾病而言，优选局部递送。与全身性吸收相比，通过吸入或吹入喷雾剂给予可提供更高的药物浓度。或者，EGF拮抗剂可通过注射，例如肌内、静脉、皮下或腹膜内注射给予，最好的是IV注射和局部注射。然而，也可采用其他给药方式，只要该方式能够令EGF-R拮抗剂进入全身循环，例如，可以栓剂、皮肤膏药或经鼻的形式给药的透粘膜或透皮制剂。任何合适的制剂，只要能将EGF-R拮抗剂运送入血液或局部传送到肺内，均可采用。
合适的注射制剂一般含有使用生理盐水、Hank溶液或其它缓冲液的水性溶液或悬浮液，其中可以含有稳定剂或其他微量组分。也可使用脂质体制剂或其他微乳液形式。还可以提供冻干形式的EGF-R拮抗剂，重溶后给药。透粘膜或透皮给药一般包括协助穿越粘膜或皮肤屏障的物质，例如胆盐，梭链孢酸及其类似物，各种除垢剂等。也可以口服，条件是，配制合适的肠溶包衣，使EGF-R拮抗剂不在消化道内失活。
制剂的性质在一定程度上取决于所选的EGF-R拮抗剂。按照本领域熟练技术人员已知的技术和原则来配制合适的制剂。特定药物组合物所含EGF-R拮抗剂的百分比也取决于制剂的性质：如果是抗体，EGF-R拮抗剂的百分比变化范围较宽，一般约为1-85wt％。
有许多本领域已知的传递方法可加强细胞对核酸的摄入。可用的传递系统包括Sendai病毒-脂质体传递系统(Rapaport和Shai(1994)生物化学杂志269：15124-15131)，阳离子脂质体，聚合物传递凝胶或基质，多孔性气泡导管(参见，Shi等(1994)，循环90：955-951；和Shi等(1994)，基因治疗1：408-414)，逆病毒表达载体，等等。
用于EGF-R拮抗剂，以脂质体作为传递运载体是一种人们感兴趣的方法。脂质体与靶部位的细胞融合，将其内容物传递到细胞内隙腔。用各种保持接触的方法(例如分离，结合剂等)保持脂质体与细胞接触足够的时间以利融合。可用介导膜融合的纯化蛋白或肽例如仙台病毒或流感病毒等来制备脂质体。脂类可以是已知能形成脂质体的脂类(包括阳离子脂类，例如磷脂酰胆碱)的任意有效组合。其他脂质一般是中性脂，例如胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。可用Kato等(1991)在生物化学杂志266：3361上所述的方法来制备脂质体。
在一优选实施例中，EGF-R拮抗剂被包在一无菌稳定化的脂质体“鞘”内，例如PEG化的(peglated)脂质体。当静脉注射这样的脂质体时，它们可长时间保留在循环中。毛细管后小静脉空隙结点在气道炎症期间开启，允许液体累积，并允许补体、激肽原等分子进入组织，启动炎症级联反应。这样的炎症使得脂质体及其内容物选择性地沉积在发炎组织内(Zhang等(1998)，药物学研究15：455-460)。
EGF-R拮抗剂可通过用于吸入途径的药物传递系统给予患者。可将化合物配制成适合吸入给药的形式。所述的药物传递系统适合将EGF-R拮抗剂局部给予支气管粘膜层的呼吸道治疗。本发明可采用靠压缩气体的压力将EGF-R拮抗剂从容器内推出的系统。为此可采用喷雾剂或气密包装。
“喷雾”在此取其常规含义，即非常细微的液体或固体颗粒在压力下由推进气体载送到治疗部位。当本发明采用喷雾治疗剂时，喷雾剂中的活性化合物可以溶解、悬浮或乳化在液体载体和推进剂的混合物中。本发明采用喷雾剂是为了通过呼吸道实施细微固体颗粒或液体雾形式的给药。可采用本领域已知的各种类型推进剂，例如但不限于烃或其他气体。如果是压缩喷雾剂，可通过定量递送数值来确定剂量单位。
本发明也可用喷雾器来实施，这是一种在气体内产生大小基本均一的极细液滴的装置。较好的是，将含EGF-R拮抗剂的液体分散成液滴。这些小液滴可由气流携带通过喷雾器的出口管。所成的雾将渗透到患者的呼吸道内。
可给予待治哺乳动物一种含EGF-R拮抗剂或其类似物的粉末组合物，其中含有或不含润滑剂、载体或推进剂。本发明的这一实施例可用给予吸入粉末药物组合物的常规装置来实施。例如，可将化合物与合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物按单位剂量装在(例如明胶)胶囊或弹头，或泡囊中，借助于吸入器，粉末可通过它们被给予。
可用组合疗法来治疗分泌过量性肺病。具体地说，可将EGF-R拮抗剂与缓解过量分泌的常规治疗(例如支气管扩张剂、皮质类固醇、化痰剂、溶粘液剂等)联用，以促进粘液的清除。
根据患者情况，本发明制剂的给予可能以注射(例如静脉注射)或吸入为佳。通常，肺内有大量粘液的患者在开始时不能进行吸入治疗。这是因为，患者的肺严重堵塞，以至于向肺内吸入喷雾制剂可能不十分有效。然而，在注射治疗之后，或为了长期维持，或在患者的肺并未严重阻塞的情况下，则可优选吸入法。优选吸入法是因为，可将较小的剂量局部递送给最需要治疗的特定细胞。通过给予较小剂量，可消除或显著减轻各种副作用。通过直接向最需要治疗的细胞递送，可更快的获得治疗效果。
本发明可采用数种不同类型的吸入方法。起码可将本发明的拮抗剂配制成三种不同类型的吸入制剂。第一种，可将本发明拮抗剂与低沸点推进剂配制在一起。这类制剂一般用常规的计量吸入器(MDI)给予。然而，可改进常规MDI以改善给药计量的重复性，例如按美国专利5,404,871和5,542,410所述，用测定患者吸气量和气流速度的技术。
或者，可将本发明的拮抗剂配制成水溶液或乙醇溶液，用常规喷雾器递送。然而，更好的是，可用美国专利5,497,763；5,544,646；5,718,222和5,660,166所述的装置和系统来喷雾给予此类溶液制剂。
最后，可将本发明的拮抗剂化合物配制成干燥的粉末制剂。这样的制剂可简单地通过先形成粉末喷雾，然后吸入该干燥制剂来给予。如此实施的技术可参见1998年7月7日的美国专利5,775,320和1998年4月21日的美国专利5,470,794。
需指出的是，以上引用的专利又引用了有关肺内药物递送的其他出版物，这些出版物也可作为特殊的方法、装置和制剂用于本发明拮抗剂的传递。而且，对以上各专利都进行了全面的参考，以说明递送本发明拮抗剂制剂的配制、装置、包装和方法。
筛选试验
候选药物
可用筛选试验来鉴定是EGF拮抗剂的生物活性候选药物。特别感兴趣的是筛选对人细胞毒性低的药物的筛选试验。为此可采用多种试验，包括标记的体外蛋白质-蛋白质结合试验，电泳迁移率变化试验，蛋白质结合的免疫试验等。还可用纯化的EGF或EGF-R蛋白来测定三维晶体结构，可利用该信息建立分子间相互作用、转运蛋白功能等的模型。
“药剂”在此指任何能够改变或抑制EGF或EGF-R生理功能的分子，例如蛋白质或药物。通常，将多份实验混合物平行地与浓度不同药剂进行试验，以获得对不同浓度的差异性反应。通常，以浓度之一作为阴性对照，即零浓度或检测水平以下的浓度。
候选药剂包括各类化合物，但一般是有机分子，较好的是分子量大于50Da小于2,500Da的小分子有机化合物。候选药剂具有与蛋白质发生结构相互作用所必需的官能团，特别是氢键，而且，一般具有一个氨基、羰基、羟基或羧基，最好至少两个化学官能团。候选药剂通常具有以一个或多个上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。候选药剂也可能是生物分子，包括肽、多糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶，它们的衍生物、结构类似物，以及上述的组合。
候选药剂具有多种来源，包括合成或天然化合物文库。例如，有多种方法可随机或定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。另外，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库已可获得，或可方便的建立。此外，通过常规化学、物理和生物学方法可方便地对天然或合成文库加以修饰，并用来建立组合文库。已知的药剂可能适合通过定向或随机化学修饰形成结构类似物，例如乙酰化、烷基化、酯化、酰胺化等。
如果筛选试验是结合试验，可将分子中的一种或多种与一标记连接，该标记可直接或间接提供一可测信号。各种标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、诸如磁性颗粒等。特异性结合分子包括生物素和链霉亲和素，地高辛和抗地高辛等分子对。就特异性结合成员而言，通常按已知方法用一种可供检测的分子标记互补成员之一。
筛选试验还可能包括许多其他试剂。这包括盐，诸如白蛋白等中性蛋白质，除垢剂等，它们被可选性地用来优化蛋白质-蛋白质结合和/或降低非特异性结合或背景相互作用。可使用能提高试验效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。组分混合物可按任意顺序加入，只要能够发生所需的结合。培养可在任意合适的温度进行，一般为4-40℃。选择可得到最高活性的培养时间，但也可优化培养时间以利于快速高效的筛选。通常，培养0.1-1小时就够了。
在本发明所述制剂中，可用生理学上认可的载体包含具有所需药理活性的化合物，给予患者以治疗分泌过量性疾病。根据导入的方式，可用前述多种方法配制所述化合物。制剂中治疗活性化合物的浓度可以是0.1-100wt％。
剂量方案
合适的剂量也根据许多因素而不同，这包括受治患者的情况，受治的过量分泌情况的具体特点及其严重程度，用作活性成分的EGF-R拮抗剂的特性，给药方式，制剂，以及医生的判断。例如，如果是以注射制剂的形式给予单纯的抗EGF或抗EGF-R之类抗体，单次剂量约20-40mg/kg。可能需要在几天内重复多次给药，或者进行连续的静脉输注。对于慢性情况，给药可根据需要进一步延长。
剂量方案的效果将通过评价患者肺功能的改善来确定。这一评价包括：痰的粘弹性测定，肺功能改善，包括强迫咳痰量和最大中段呼气流速的提高。以上治疗方案可与辅助治疗，例如抗生素、DNA酶I或其他目前治疗分泌过量性肺病的方法联合进行。如果在对患者的治疗中同时给予抗生素，可在治疗后增加对细菌的定量测定，根据细菌生长的减少，粘液或痰液粘稠度的下降和肺对粘液或痰液肺清除的增加来评价治疗方法的效果。
肺功能测试，以及肺分泌过量性疾病临床发展的诊断测试，都是本领域技术人员已知的。标准肺功能测试包括：气道阻力(AR)；强迫肺活量(FVC)；每秒的强迫呼气量(FEV(1))；强迫中段呼气流速；和峰值呼气流速(PEFR)。其他肺功能测试包括血气分析；药物反应；激发和运动测试；呼吸肌力量测定；光纤气道检查；等。研究粘液特性的一些基本方法包括用例如磁性微量流变计测定的流变性质，通过测定粘液滴与表面的接触角来测定的粘度，该粘度反映一粘性表面与一粘性系统之间的吸引力。可用常规技术和直接测定(即，原位粘液清除)来研究纤毛的粘液运输。透上皮能力差异是肺上皮离子运输系统活性的直接结果，可用合适的微电极来测定。可用定量形态学方法确定上皮细胞的表面情况。
接受治疗的患者可以是表现出所述症状的人或其他动物等灵长类。虽然本发明方法特别适合治疗人患者，但应该明白，本发明方法同样适合兽医学应用。
体外筛选试验
在本发明另一实施例中，用体外筛选试验来评价候选药剂抑制杯状细胞增殖的治疗潜力，即，药剂是否具有EGF-R拮抗剂活性。通常，此类试验包括以下步骤：(i)杯状细胞增殖体外模型与EGF或其功能等价物接触；(ii)该体外模型然后与候选药剂接触；(iii)评价杯状细胞的增殖，杯状细胞增殖的抑制说明该候选药剂具有治疗潜力。
该试验最好与两个对照一起进行，其中，第二组细胞不与任何化合物接触，第三组只与EGF而不与候选药剂接触。然后通过比较来确定EGF和候选药剂对细胞的作用程度。
任何杯状细胞增殖体外模型都可使用。例如，可如Guzman等(1995)217：412-419所述分离大鼠气管细胞并维持培养。简而言之，将大鼠气管细胞接种在盖有半透性膜的胶原蛋白凝胶上，开始时，在培养基中浸没培养，然后保持一气/液界面。体外细胞的例子包括原代人支气管细胞(可向Clonetics，San Diego获取)；NCl-H292细胞(ATCC CRL-1848)和A431细胞(ATCC CRL-1555)。
体外培养物与EGF和候选药剂接触。根据接受评价的终点和候选药剂的特性，候选药剂可在加入EGF之前、同时或之后与培养物接触。评价所培养细胞相对对照的杯状细胞增殖抑制。
许多分子或生物活性标志可用来评价杯状细胞增殖。可用的此类标志例如但不限于：杯状细胞的特征性基因表达或蛋白质表达。某些粘液素基因，例如MUC5B(Desseyn等(1997)，生物化学杂志272：3168-3178)在气道内表达，基因产物大量存在于粘液中。粘液素基因的表达提供了一个测定粘液产生的合适标志。
可用常规技术来评价粘液素基因的表达，例如用：Northern印迹分析，聚合酶链反应(PCR)，检查粘液素基因启动子，或原位分析。或者，可用常规技术来评价粘液素蛋白，例如用可测的标记抗体进行Western印迹分析，ELISA，免疫化学分析等。还可用形态学指标来测定培养物中有无杯状细胞：例如用Alcian蓝/PAS染色法进行粘液素染色(Lou等(1998)，美国呼吸病治疗医学杂志157：1927-1934)。可用ELISA试验检测粘液素的抗体。EGF-R受到例如EGF、TGF-α等配体的激活，诱导特定EGF受体激酶的磷酸化，于是产生杯状细胞，因此，可测定EGF-R磷酸化来反映杯状细胞的诱导(Donato等(1984)，生物化学杂志264：20474-20481)。
与杯状细胞增殖相关的分子或生物化学标记的减少表明该拮抗剂具有治疗潜力。
活体方法
本发明的另一实施例中，用活体动物模型来评价候选药剂抑制杯状细胞增殖的治疗潜力。通常，该试验包括以下步骤：(i)通过诱导EGF-R表达，建立分泌过量性肺病的动物模型；(ii)刺激诱导所得EGF-R以产生产粘液素的杯状细胞；(iii)用候选药剂治疗；和(iv)评价杯状细胞的增殖或粘液的分泌，杯状细胞增殖抑制或粘液分泌抑制表明该候选药剂具有治疗潜力。
任何分泌过量性肺病的活体模型都可使用。例如，可如Temann等(1997)在美国呼吸细胞生物学杂志16：417-478中所述，或如本发明实施例所述使用的小鼠哮喘模型。或者，可如Takeyama等(1998)在美国生理学杂志中所述，采用大鼠模型。其他可用的动物模型例如但不下于豚鼠(组成型表达杯状细胞的一个物种)和家兔。
可用与体外模型所用相同的分子和生物化学标记来评价动物模型的肺组织或气管组织。杯状细胞增殖减少，表明该EGF-R拮抗剂具有治疗潜力。
以下实施例是为了向本领域熟练技术人员充分揭示如何实施和应用本发明，既不是限定本发明的范围，也不表明本发明的发明人只进行了以下实验。虽然已尽可能确保数据(例如，量、温度等)的准确性，但实验误差和方差是不可避免的。若非另作说明，份都是重量份，分子量都是平均分子量，温度都是摄氏度，压力都等于或接近大气压。
                           实施例
                            实施例1
                EGF系统调节气道内粘液素的产生
分泌过量性气道疾病中都会发生杯状细胞化生，但因为不清楚潜在的机制，尚没有有效的治疗方法。在健康的气道内，杯状细胞极少，但在分泌过量性气道疾病中则发生杯状细胞化生。对人支气管细胞系(NCl-H292)进行了研究。这些细胞组成型地表达EGF-R；EGF-R基因的表达可受肿瘤坏死因子TNFα的进一步刺激。EGF-R配体增加粘液素的合成，与TNFα的共培养会增强这一效果。
无病原大鼠的气道上皮细胞表达极少的EGF-R蛋白，但气管内灌注TNFα(200ng)诱导了基细胞、前杯状细胞和杯状细胞内的EGF-R，但不诱导纤毛细胞的；TNFα、EGF或TGFα单独不诱导杯状细胞的产生。然而，先灌注TNFα，然后灌注EGF-R配体则引起杯状细胞和前杯状细胞的增多，和明显的Alcian蓝/PAS阳性染色增多(反映粘液性糖复合物)和粘液素MUC5基因表达。在致敏大鼠中，卵清蛋白引起气道上皮内杯状细胞的产生和EGF-R的表达。在NCl-H292细胞中，在先用TNFα后用EGF-R配体刺激的大鼠中，在大鼠哮喘模型中，用EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522)的预处理阻止气道内杯状细胞的产生。以上发现显示了EGF-R级联反应抑制剂在分泌过量性气道疾病中的作用。
方法
体外研究
细胞培养。将人肺粘膜表皮样肿瘤细胞系，NCl-H292细胞培养在RPMl1640培养基中，其中含有10％胎牛血清，青霉素(100U/ml)，链霉素(100μg/ml)，在一水夹套培养箱内于37。℃，5％CO2中培养。长到铺满时，将细胞与EGF(重组人EGF，25ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)，TGFα(重组人TGFα，25ng/ml，Genzyme)，TNFα(重组人TNFα，20ng/ml，Genzyme)，EGF(25ng/ml)加TNFα(20ng/ml)或TGFα(25ng/ml)加TNFα(20ng/ml)共培养12小时，24小时或48小时。在用EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522(10μg/ml，由Boehringer Inglheim Inc.Ingelheim，Germany提供)的抑制研究中，在加入生长因子前，细胞先用BIBX1522预处理30分钟。培养后，将生长于一个T-75培养瓶内的细胞用来抽提总RNA或蛋白质，用生长于8-室玻片上的细胞进行Alcian蓝/PAS染色以显示粘液素。
Western印迹。裂解生长于T-75培养瓶内的细胞，用含1％Triton X，1％dioxycolate钠和PMSF(10mg/ml)的PBS洗脱细胞。用BCA蛋白质试验试剂(Pierce，Rockford，IL)估算蛋白质总量。细胞裂解液与Tricine样品缓冲液和2％βME在95℃煮沸。通过8％丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离蛋白质。所得凝胶在转移缓冲液：25mMTris-HCl，192mM甘氨酸，20％(体积/体积)甲醇，pH8.3中平衡。然后，蛋白质电泳转移到硝酸纤维素膜上。该膜然后在5％的脱脂牛奶PBS溶液中培养，其中含0.05％Tween20。然后，该膜与小鼠抗EGF-R单克隆抗体(1∶100)4℃共培养过夜。根据亲和素-生物素-碱性磷酸酶复合物法标准程序显示结合的抗体(ABC试剂盒，Vector Laboratories)。将A431细胞的裂解物(20)作为EGF-R的阳性对照。
NCl-H292细胞内EGF-R的免疫细胞化学定位。培养在8-室玻板上的细胞用4％多聚甲醛固定1小时。为了染色EGF-R，用含0.05％Tween20，2％正常山羊血清和2mM左旋咪唑作为抗体的稀释剂。各切片与抗EGF-R的小鼠单克隆抗体(1∶250)4℃共培养过夜，然后用PBS洗涤3次，洗去过量的第一抗体。细胞然后与1∶200稀释的生物素化的马抗小鼠免疫球蛋白(Vector Laboratories，Burlingame，CA)室温培养1小时。根据亲和素-生物素-碱性磷酸酶复合物法标准程序显示结合的抗体(ABC试剂盒，Vector Laboratories)。
探针。用线性化的pTRI-EGF-R-人探针模板(Ambion，Austin，TX)测定EGF-R mRNA的表达。该探针含有一段360bp的人EGF-R基因cDNA片段，它跨越外显子12到14。用人MUC5AC探针测定MUC5基因的表达，该探针含有一段298bp的人MUC5AC基因的cDNA片段(由Dr.Carol Basbaum提供)。
Northern印迹。用Tri-试剂(Molecular Research Ctr.Cicinnati，OH)抽提各种情况下培养于T-75组织培养瓶中的NCl-H292细胞的总RNA。总RNA(10μg)在1％琼脂糖/甲醛凝胶上电泳，然后通过毛细管点样转移到一张尼龙膜上(Amersham，ArlingtonHeights，IL)。用随机引发DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)以32P标记探针。42℃预杂交印迹4小时，然后42℃与32P标记特异性cDNA探针杂交16小时。杂交溶液含250mM Tris-HCl(pH7.5)，5％SDS，1％BSA，1％聚乙烯吡咯烷酮，1％Ficoll和0.5％焦磷酸钠。杂交后，膜用含0.1％SDS的2×SSC室温进行2次30分钟的洗涤，然后在50℃用含0.1％SDS的2×SSC进行2次30分钟的洗涤，用含0.1％SDS的0.1×SSC清洗。用膜曝光X光胶片。
活体研究
实验动物方案得到旧金山加利福尼亚大学动物研究委员会的批准。特定的体重230-250g的无病原雄性F344Fisher大鼠维持在空调(21℃)房间内，并给予标准实验室食物，自由饮水。
健康大鼠。用美索比妥钠(Brevital钠，50mg/kg)麻醉大鼠，让它们自然呼吸。为了测定TNFα是否上调气道内的EGF-R，气管内灌注TNFα(200ng，100μl)，24小时后将动物杀死。为了测定EGF或TGFα是否诱导气道上皮内的杯状细胞，气管内单独灌注EGF(600ng，100μl)或TGFα(合成大鼠TGFα，250ng，100μl，Sigma，St.Louis，Ml)，或在24小时前先灌注TNFα(200ng，100μl)，48小时后将动物杀死。各项研究中，以气管内灌注无菌PBS(100μl)作为对照。为了证实粘液素产生是通过EGF-R活化发生的，我们测定了EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522(剂量根据用该抑制剂阻止癌生长的研究来估计)的作用。大鼠先用BIBX1522(3，10或30mg/kg，i.p.)预处理，1小时前和24小时后灌注TGFα。TGFα灌注48小时后取出气管和肺进行检查。
致敏大鼠
致敏。在第0和第10天给大鼠腹膜注射卵清蛋白(10mg，V级，Sigma，St.Louis，MO)与100mg氢氧化铝复合物的0.5ml无菌盐水溶液致敏，休息10天。第20天，将卵清蛋白直接传递到气管内；给动物气管内灌注3次(第20，22和24天)100μl0.1％卵清蛋白盐水溶液进行攻击。将未受攻击的大鼠(第20天)和第三次攻击后48小时(第26天)的大鼠杀死。这一过程诱导杯状细胞化生。为了阻断杯状细胞的化生，致敏大鼠用EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522预处理。在卵清蛋白攻击的日子(第20，22和24天)，在攻击前1小时以BIBX1522(10mg/kg)预处理致敏大鼠，然后，还将BIBX1522(10-5M，100μl)与卵清蛋白一起气管内灌注。而且，还每隔24小时i.p.注射一次BIBX1522，直到大鼠被杀死的前一天。在第三次攻击后48小时将动物杀死，取出气管。
组织的制备。在麻醉期间的预选时刻，用多聚甲醛在DEPC处理的PBS中所成的1％溶液以120mmHg的压力进行全身循环灌注。然后取出气管，在4％多聚甲醛中放置24小时。固定后，将气管和肺泡包埋在JB-4加单体溶液A中供细胞分析，或包埋在O.C.T化合物(Sakura Finetek，USA Inc.，Torrance，CA)中供免疫组织化学分析和原位杂交。切取包埋组织的横截面切片(4mm厚)，放在玻片上。
细胞分析。我们用油浸物镜(放大1000倍)计点基底层2mm的上皮细胞细胞核，得出上皮细胞总数。跟踪基底层的数字化图象的轮廓线，以测定所分析各上皮区下基底层的线性长度。灌注刺激剂后形成“发育期”杯状细胞。这些细胞中有Alcian蓝/PAS阳性染色颗粒，但较小，细胞质内颗粒较少。我们称这些“发育期”杯状细胞为“前杯状细胞”，即成为成熟杯状细胞前的阶段。杯状细胞的形状为下部柱状上的高立方杯形，大量Alcian蓝/PAS阳性染色颗粒充满了细胞核与气道腔表面之间细胞质的大部分。前杯状细胞定义为：粘液染色面积较小(小于基底膜至腔表面高度的1/3)，或具有稀疏的Alcian蓝/PAS轻度染色小颗粒的细胞。纤毛细胞的识别特征是其有纤毛边缘，轻度染色的细胞质和圆形大细胞核。非粒化分泌细胞呈柱状，从气道腔延伸至基底层。细胞质被染成浅粉红色，可在其中看到少许微小的PAS阳性Alcian蓝阴性的颗粒。基细胞是扁平的小细胞，具有大细胞核，就在基底层之上，但不到达气道腔。
杯状细胞产生的定量测定。用已知(Weber等(1984)，科学，224：294-297)的半自动造影系统测定粘膜表面上皮上被Alcian蓝/PAS着色的粘液物质的体积密度，从而测定杯状细胞的产生。我们测定了Alcian蓝/PAS阳性染色面积和总上皮细胞面积，所给数据为Alcian蓝/PAS阳性染色总面积的百分比。以上分析用公开的结构域NIH造影程序(由U.S.National Institute of Health开发，可在网上以匿名FTP从zippy.nimh.gov获取，或向National Technical Information Service，Springfield，VA，部号PB95-500195GEl)获取软盘。
大鼠上皮内EGF-R的免疫组织化学定位。在大鼠气管冷冻切片中，用EGF-R的抗体(Calbiochem，San Diego，CA)进行免疫组织化学染色，以确定EGF-R的位置。灌注1％的多聚甲醛PBS溶液后，将组织在4％多聚甲醛PBS溶液中浸1小时，然后转移到防冻的30％蔗糖中过夜。将气管埋入O.C.T.化合物(Sakura Finetek USA，Inc.，Torrance，CA)中冷冻。切取冷冻切片(5μm)放在玻片(Superfrost Plus，Fisher scientificPittsburgh，PA)上。免疫染色的进行与体外研究的相似。
探针的制备。大鼠MUC5基因的cDNA是由Carol Basbaum博士提供的。将320bp的大鼠MUC5基因cDNA片段亚克隆到转录载体pBluescript-SK(-)(Statagene，La Jolla，CA)的Xba/HindlII位置。为了制备用于原位杂交的RNA探针，将含有大鼠MUC5基因cDNA的该重组质粒线性化，用T7或T3聚合酶体外转录分别得到反义或有义探针。用于原位杂交的探针是在[35S]UTP存在下产生的。转录后，用DNA酶消化cDNA模板，用Sephadex G-25 Quick SpinTM柱(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)纯化放射性RNA，用乙醇/乙酸铵溶液沉淀。用前，RNA探针以70％乙醇洗涤并以10mMDTT稀释。
原位杂交。切取冷冻切片(5μm)，放在带正电的玻片上(Superfrost Plus，FisherScientific，Pittsburgh，PA)。用相邻切片与有义和反义探针杂交。用相隔切片进行Alcian蓝/PAS染色。再次用4％多聚甲醛固定样本，在0.5×SSC中复水，然后在三乙醇胺中以乙酸酐乙酰化。用2500-3000cpm/μl有义或反义探针，在50％去离子甲酰胺，0.3M NaCl，20mM Tris，5mM EDTA，1×Denhardt′s溶液，20mM二硫苏糖醇，10％硫酸葡聚糖，0.5mg/ml酵母tRNA和0.5mg/ml超声波处理的鲑鱼精子DNA中，55℃杂交过夜。杂交后处理包括室温下以2×SSC、1mM EDTA，10mM β-巯基乙醇洗涤2次，与RNA酶溶液(20mg/ml)室温共培养30分钟，然后用0.1×SSC、1mM EDTA，10mM β-巯基乙醇55℃洗涤2小时，再以0.5×SSC室温洗涤。将样本脱水，空气干燥，覆盖以Kodak NBT核径迹乳液(Eastman Kodak，Rochester，NY)进行放射自显影。4℃曝光7-21天后，将玻片显影，固定，并用苏木精反染色(21)。
统计学。所有数据都表示为平均值±SEM。用单向方差分析确定各组之间差异的统计学显著性。当方差分析显示统计学显著性时，用Scheffe′s检验对多重比较进行校正。零假设的几率低于0.05，则认为有统计学显著差异。
结果
TNFα在NCl-H292细胞内刺激EGF-R的产生。首先，我们测定NCl-H292细胞是否组成型地表达EGF-R。对免疫印迹的Western分析证明在NCl-H292细胞的铺满培养物内存在着EGF-R蛋白(图1A，图右)。在细胞长到铺满后进行测定。裂解物在8％丙烯酰胺凝胶上电泳，用抗EGF-R抗体印染。图右记录了标志蛋白的分子量。EGF-R的阳性对照是来自A431的蛋白(图1A，图左)，该细胞组成型地表达EGF-R(Weber等，同上)。用抗EGF-R抗体进行的免疫细胞化学分析显示染色阳性，最引人注意的是分裂细胞内的染色阳性(图1B，在NCl-H292细胞培养物内用抗EGF-R抗体进行的免疫细胞化学分析)。长到铺满时，可看到阳性染色，分裂细胞内的染色最深(右侧箭头所示)。没有第一抗体，则没有染色(图左)。Northern印迹显示，TNFα(20ng/ml)上调EGF-R基因的表达，这一作用开始于第12小时，在第24小时增强(图1C，NCl-H292细胞内EGF-R的Northern分析)。该分析是在与TNFα(20ng/ml)培养12或24小时后，从铺满培养物中抽提的总RNA上进行的。RNA在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳，然后转移到尼龙膜上，与32P-标记的EGF-R cDNA探针杂交。杂交后，洗膜，并自显影。
EGF-R配体在NCl-H292细胞内刺激粘液性糖复合物的表达和MUC5基因的表达。EGF-R在NCl-H292细胞内组成型地表达，所以，我们评价EGF-R配体(EGF，TGFα)诱导产生粘液性糖复合物的能力(图2，Alcian蓝/PAS染色NCl-H292细胞以鉴定粘液素糖复合物)。上排＝不含抑制剂的细胞培养；下排＝EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522(10μg/ml)存在下的细胞培养。当细胞单独培养时(对照)，可看到部分PAS阳性染色(箭头，上排)；仅与TNFα共培养不影响染色；与EGF(25ng/ml)或TGFα(25ng/ml)共培养，PAS阳性染色增加(箭头)；与TNFα和TGFα共培养，阳性染色显著增加(箭头，上排)。
对照细胞部分被染色；仅与TNFα共培养不影响染色；与EGF(25ng/ml)或TGFα(25ng/ml)共培养，PAS阳性染色增加(箭头)；与TNFα和TGFα共培养，染色明显多于任一配体单独所得。EGF-R配体在NCl-H292细胞内诱导粘液性糖复合物。
为了测定MUC5基因的表达而进行Northern印迹(图3)。抽提细胞的总RNA(10μg)，在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳，然后转移到尼龙膜上，与32P-标记的MUC5cDNA探针杂交。杂交后，洗膜，并自显影。培养物是与单独培养基(C)，EGF或TGFα(25ng/ml)，TNFα(20ng/ml)，或TNFα加EGF或TGFα之一，共培养12小时(上排)或24小时(下排)而获得的，以研究它们对MUC5基因表达的作用。还获得了先与EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522，10μg/ml；下排)预培养，接着与TNFα加EGF或TGFα共培养的培养物；该抑制剂阻止MUC5基因的表达。
在对照状态下，NCl-H292细胞表现出一定程度的表达(图3，下排，左侧)：当细胞与EGF或TGFα共培养时，MUC5基因的表达在第12小时几乎看不出，但在第24小时却很明显。TNFα单独并不影响MUC5基因的表达，但将TNFα加入与EGF-R配体共培养的细胞时，MUC5基因的表达显著增加，高于EGF-R配体单独所引起的表达水平(图3)。
EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522)在NCl-H292细胞内阻止粘液性糖复合物的表达和MUC5基因的表达。EGF-R受体的活化诱导MUC5基因表达，为了验证这一假设，将NC1-H292细胞与EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522(10μg/ml)预培养，在对照状态下，PAS-染色受到抑制，与EGF-R配体共培养曾出现的染色增加受到显著抑制(图2，下排)。在Northern分析中，曾因与TNFα加EGF或加TGFα共培养而显著增加的MUC5基因表达因与BIBX1522的预培养而被完全抑制(图3，下排)。以上结果表明了NCl-H292细胞内粘液素基因诱导和粘液性糖复合物诱导时的EGF-R活化。
TNFα在大鼠内刺激EGF-R的产生。用无病原大鼠(组成型上皮杯状细胞极少)进行研究，从TNFα的作用开始。在对照状态下，气管上皮极少EGF-R-阳性细胞(图4A，左图)。然而，向气管内灌注TNFα(200ng)，在气管上皮的各类型细胞内诱导产生了EGF-R蛋白(图4，右图)。杯状细胞(G)，前杯状细胞(P-G)，非粒化分泌细胞(S)和基细胞(Ba)内出现EGF-R-阳性染色，但纤毛细胞内则没有。因此，TNFα诱导EGF-R蛋白产生。
EGF-R配体在大鼠内粘液性糖复合物产生和MUC5基因表达中的作用。在对照状态下，气管上皮中杯状细胞和前杯状细胞极少。向气管内灌注单独的EGF-R配体，EGF(600ng；未显示)或TGFα(250ng；表1)对上皮产生粘液性糖复合物的产生没有作用。然而，先给予TNFα(200ng)，24小时后再给予EGF或TGFα(表1)，48小时后将动物杀死，此时，Alcian蓝/PSA染色显著增加，杯状细胞和前杯状细胞的数量也显著增加，但细胞总数和纤毛细胞数量不变(表1)。原位杂交显示MUC5基因在对照动物内没有表达。先向气管内灌注TNFα，接着灌注EGF或TGFα，可在上皮内观察到MUC5的表达。因此，EGF-R单独诱导或EGF-R配体单独刺激不足以诱导杯状细胞的化生或粘液性糖复合物的产生。然而，在以TNFα诱导EGF-R后，EGF-R配体灌注显著刺激杯状细胞的化生。
              表1气管上皮内的细胞分析
卵清蛋白致敏
细胞类型 对照 TGFα TNFα/TGFα 只i.p. i.p.+i.t.
杯状细胞 2.8±0.7 5.8±1.2 28.8±3.4* 5.4±1.5 38.2±6.3*
前杯状细胞 7.8±1.3 12.8±1.6 44.8±3.6* 13.8±1.4 36.0±6.3*
分泌细胞 82.0±2.0 72.2±4.0 40.8±2.4 67.6±7.0 49.8±4.2
纤毛细胞 49.6±2.0 54.6±2.3 53.2±1.8 56.4±3.8 52.4±7.1
基细胞 57.8±2.6 56.8±2.3 43.0±3.5 60.2±3.4 59.8±2.9
不确定 1.4±0.5 2.0±0.4 0.8±0.4 1.4±0.2 2.6±0.5
总数 201.4±2.2 204.2±3.3 211.4±4.8 204.8±6.6 238.8±4.4*
AB/PAS染色面积％ 2.4±0.8 6.8±1.9 35.8±4.2* 7.8±2.9 38.7±6.2*
表1：介质和卵清蛋白致敏对大鼠气管上皮细胞的作用。按照“方法”部分所述分析细胞；5个大鼠一组。借助Alcianl蓝(AB)/PAS染色(染色粘液性糖复合物)进行特征鉴定。在计数细胞之外，还计算被AB/PAS染色占据的上皮总面积百分比。对照气道和仅以TGFα(250)刺激的气道中杯状细胞和前杯状细胞极少；AB/PAS染色极少。先灌注TNFα(200ng)，而后灌注TGFα，使得杯状细胞和前杯状细胞数量增加，AB/PAS染色细胞占据的面积增加。腹膜内注射(ip)卵清蛋白(OVA)致敏对细胞分布或AB/PAS染色没有影响，但先ip给予卵清蛋白而后气管内灌注(it)OVA时，杯状细胞和前杯状细胞数量显著增加，AB/PAS染色细胞占据的面积也显著增加。
卵清蛋白致敏在大鼠内诱导EGF-R和杯状细胞的产生。因为，据报道，急性哮喘造成死亡是因为粘液阻塞了气道，在无病原大鼠内建立一哮喘模型。在第0和10天注射卵清蛋白(10mg，ip)不刺激杯状细胞化生(表1)。然而，此后在第20、22和24天气管内三次灌注卵清蛋白(0.1％溶液100μl)，并在第26天将动物杀死，此时，杯状细胞和前杯状细胞的数量显著增加；纤毛细胞和基细胞的数量不变(表1，右侧)。用抗EGF-R抗体进行的免疫组织化学分析显示，对照气管内没有染色。既接收i.p.致敏又接收i.t.致敏的动物显示AB/PAS染色阳性细胞(图4B，右图)内选择性地EGF-R染色(图4B，左图)。3次气管灌注卵清蛋白(0.1％，100ml)后，杯状细胞和前杯状细胞内强烈表现EGF-R免疫活性(下排，左)，这些同样的细胞呈AB/PAS染色阳性(下排，右)。因此，哮喘卵清蛋白模型显示，产生EGF-R的细胞内，杯状细胞增殖。
EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522)在大鼠内阻止TNFα加EGF-R配体灌注和卵清蛋白致敏所诱导的杯状细胞产生。因为BIBX1522在培养的细胞内阻止粘液素产生，所以在无病原大鼠内测定该抑制剂的作用。BIBX1522以剂量依赖性方式抑制气管内灌注TNFα后灌注EGF-R配体TGFα所引起的AB/PAS染色增加(图5A，3-30mg/kg)。气管内灌注TNFα(诱导EGF-R)后灌注EGF-R配体TGFα引起显著的杯状细胞化生。
在卵清蛋白致敏的大鼠内，BIBX1522(10mg/kg，ip)预处理完全抑制杯状细胞的产生(根据AB/PAS染色评价，图5B)。i.p.给予OVA的动物在支气管上皮内只显示级少的AB/PAS阳性染色。先以OVA i.p.致敏，而后3次气管内(i.t.)灌注OVA的大鼠，其AB/PAS阳性染色显著增加。
以上研究显示，在体外和体内，EGF-R在受到EGF-R配体刺激时，诱导杯状细胞的产生，这样的效果是因为EGF-R的活化，并受EGF-R酪氨酸激酶抑制剂的阻断。在哮喘卵清蛋白模型中，该抑制剂还能阻止杯状细胞的产生。
在描述杯状细胞诱导机制之外，以上结果还根据EGF-R表达提出了杯状细胞产生演进顺序：TNFα刺激诱导非粒化分泌细胞的强染色；它们接着被EGF-R配体活化，这引起细胞质内的渐进性粘液性糖复合物染色，并且，细胞变成“前杯状细胞”，然后变成“杯状细胞”。灌注TNFα后灌注EGF-R配体诱导杯状细胞的产生，但不改变上皮细胞总数，这提示，EGF-R活化促进选择性细胞分化(而不是增殖)。以上发现提示，杯状细胞来自表达EGF-R的非粒化分泌细胞，而且受EGF-R配体激活而产生粘液素。
在因急性哮喘死亡的患者中，杯状细胞化生和粘液堵塞是重要发现。在哮喘鼠模型中，在反复灌注卵清蛋白后发生气道致敏，引起显著的气道杯状细胞化生。我们证明，在对照气道上皮内不表达的EGF-R在致敏动物中表达。被染色的是前杯状细胞和杯状细胞，这提示，EGF-R参与杯状细胞的产生。在实验性哮喘中，EGF-R受体酪氨酸激酶抑制剂(BlBX1522)预处理阻止气道杯状细胞的产生，证实了EGF-R活化在杯状细胞产生中的作用。
以上结果表明了杯状细胞化生中的EGF-R途径。先前的研究已经证明，各种刺激，诸如臭氧、二氧化硫、病毒、脂多糖、血小板活化因子和白介素-4，上调粘液素的表达和分泌。本发明提供了评价这些致炎刺激与EGF-R系统之间关联的机制。
哮喘被作为本发明治疗方法的一个例子：正常人气道上皮内纤毛细胞与杯状细胞之比为3-10∶1。在哮喘中，杯状细胞的数量可能等于或超过纤毛细胞；在因哮喘死亡的患者中，与非哮喘呼吸疾病死亡的患者相比，杯状细胞所占面积的百分比增加了30倍。抑制杯状细胞的产生应该能消除这一过量分泌来源。因为不知道杯状细胞的生命周期，所以无法准确预言治疗消除杯状细胞化生的时间过程。如果不再接触致敏原，在先前已致敏的小鼠中，杯状细胞化生随其他变应性炎症表征一起，可在50天内消退。抑制EGF-R活化可能更快地抑制杯状细胞化生，这取决于杯状细胞的寿命。最近，已报道了高选择性ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂。正在对EGF-R酪氨酸激酶抑制剂治疗与EGF-R表达相关的恶性肿瘤进行评价。
过量分泌是许多气道慢性炎性疾病的主要症状。目前，还没有有效的疗法来缓解这些症状，和阻止这些疾病的发展。本发明的发现提供了一种治疗的机制和方法：通过抑制EGF-R活化来阻止杯状细胞的产生。本发明提议用EGF-R活化抑制剂治疗过量分泌性气道疾病。
                            实施例2
                   氧化应力在杯状细胞产生中的作用
已经提出，长期吸烟与外周气道内的渐进性病变(包括杯状细胞化生)相关。同样，动物吸烟实验模型也显示引起气道内的杯状细胞化生。然而，还不知道吸烟诱导粘液素形成的机制。以下信息显示，被促炎细胞因子活化的嗜中性粒细胞和香烟的烟在人支气管上皮细胞内通过EGF-R的非配体依赖性活化引起粘液素MUC5AC的合成。以上结果说明嗜中性粒细胞聚集和香烟的烟是上皮细胞分化的调节者，上皮细胞分化则引起气道内对产粘液素细胞的不正常诱导。
方法
嗜中性粒细胞的分离。获取健康供血者的外周血，从中纯化人嗜中性粒细胞。用标准方法分离嗜中性粒细胞，即，Ficloo-Hypaque梯度分离，右旋糖苷沉降和低渗裂解红血球。按常规台盼蓝排除法沉淀，细胞活力大于95％。为了避免内毒素污染，将所有溶液通过0.1μm的滤膜。
细胞培养。NCl-H292细胞是一种人肺粘膜上皮样肿瘤细胞系，将其培养在RPMl1640培养基中，其中含有10％胎牛血清，青霉素(100U/ml)，链霉素(100μg/ml)和Hepes(25mM)，在水夹套培养箱内37℃、5％CO2培养。用6-孔培养板或8室玻片培养细胞。长到铺满后，细胞与单独的嗜中性粒细胞(106细胞/ml)，单独的TNFα(重组人TNFα，20ng/ml，Genzyme，Cambridge，MA)单独IL-8(重组人IL-8，10-8M，Genzyme)，单独的fMLP(10-8M，Sigma，St.Louis，MO)，TNFα加嗜中性粒细胞，IL-8加嗜中性粒细胞，fMLP加嗜中性粒细胞，过氧化氢(H2O2，200μM)，，香烟烟的溶液或TGFα(重组人TGFα，0.1-25ng/ml，Calbiochem，San Diego，CA)共培养1小时。然后，洗涤细胞，只用新鲜培养基培养。在预先选定的时间停止实验(mRNA：6小时和12小时；蛋白质：24小时)。作为对照，仅用培养基培养细胞相同时间。在其他嗜中性粒细胞研究中，选用TNFα作为刺激剂，因为它对MUC5AC合成的作用最强。嗜中性粒细胞先用TNFα(20ng/ml)培养1小时，然后用无菌PBS洗涤以避免上清液污染(例如，嗜中性粒细胞释放的分子)，NCl-H292细胞与这样的嗜中性粒细胞共培养，或者仅与上清液共培养。在用EGF-R酪氨酸激酶抑制剂进行的抑制研究中，NCl-H292细胞先用BIBX1522(10μg/ml，Boehringer Ingelheim Inc.，Ingelheim，Germany)或酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478(10μM，Calbiochem)预处理30分钟，然后加入刺激剂。还检测了一种血小板衍生的生长因子受体酪氨酸激酶的选择性抑制剂(酪氨酸磷酸化抑制剂AG1295，Calbiochem)和一种酪氨酸磷酸化抑制剂的阴性对照(酪氨酸磷酸化抑制剂A1，100μM)的作用。在用EGF-R配体的阻断性抗体进行的抑制研究中，上清液先用抗TGFα抗体(Calbiochem)或抗EGF抗体预处理30分钟，然后将其加入NCl-H292细胞中。用氧自由基清除剂DMSO(1％，Sigma)，1，3-二甲基-2-硫脲(DMTU，50mM，Sigma)或超氧化物歧化酶(SOD，300U/ml，Sigma)检测氧自由基的作用。
香烟烟溶液的制备。用试验香烟(编号2R1，University of Kentucky Tobacco andHealth Research Foudation)进行研究。如现有文献所述制备香烟烟的溶液(Dusser等，1989，临床研究杂志84：900-906)。简而言之，以1口烟/分钟的速度将香烟的烟抽入一支聚丙烯针筒(35ml)中，抽10次，然后缓慢通入20ml RPMl1640，其中含有50mM Hepes缓冲液。然后将香烟溶液调节至pH7.4，并在制备后立即使用。
显示NCl-H292细胞内的粘液性糖复合物和MUC5AC蛋白质。在实验最后，培养在8-室玻板上的细胞用4％多聚甲醛固定1小时，然后用Alcian蓝/高碘酸-希夫(PAS)染色显示粘液性糖复合物，或用于MUC5AC的免疫细胞化学分析。在MUC5AC免疫细胞化学分析中，用含0.05％Tween，2％正常山羊血清和左旋咪唑(2mM)的PBS作为抗体的稀释剂。细胞与抗MUC5AC的小鼠mAb(克隆45M1，1∶200，NeoMarkers，Fremont，CA)室温培养1小时，然后用PBS洗涤3次，洗去过量的第一抗体。细胞然后与生物素化的马抗小鼠IgG(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)的1∶200稀释液室温培养1小时。按照标准的亲和素-生物素-碱性磷酸酶复合物方法显示被结合的抗体。
人MUC5AC基因的原位杂交。将一段298bp的人MUC5AC的cDNA片段插入TA克隆载体(Invitrogen，San Diego，CA)。如前文所述制备RNA探针和进行原位杂交。
MUC5AC蛋白的免疫试验。如前所述测定MUC5AC蛋白。简而言之，用PBS制备不同稀释度的细胞裂解物，每份50μl的样品与碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(50μl)在96格培养板(Maxisorp Nunc，Fisher Scientific，Santa Clara，CA)中40℃共培养，直到干燥。培养板用PBS洗涤3次，用2％BSA(V组分，Sigma)室温封闭1小时。再次用PBS洗培养板3次，然后与50μl 1∶100稀释(用含0.05％Tween20的PBS稀释)的小鼠单克隆MUC5AC抗体共培养。1小时后，培养孔用PBS洗涤3次，每孔内加入100μl辣根过氧化物酶-山羊抗小鼠IgG偶联物(1∶10,000，Sigma)。1小时后，培养板用PBS洗涤3次。与TMB过氧化物酶溶液(Kirkegaard&Laboratories，Gaithersburg，MD)进行颜色反应，用2N H2SO4终止反应。在450nm读取吸光度。
TGFα蛋白的定量分析。用市售的ELISA试剂盒(Sigma)，按照生产商的说明，测定TGFα蛋白。嗜中性粒细胞与TNFα(20ng/ml)培养1小时后取上清液与含1％TritonX-100、1％脱氧胆酸钠和多种蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液PBS(Complete Mini，Boehringer Mannheim，Germany)混合，然后用来测定TGFα。
EGF-R蛋白的免疫沉淀和酪氨酸磷酸化的免疫印迹。细胞无血清培养24小时，然后用TGFα，H2O2或活化的嗜中性粒细胞上清液刺激15分钟。刺激后，裂解细胞，在凹式振荡器内4℃培养30分钟。在4℃ 14,000rpm离心5分钟去除不溶性物质。将上清液分成含等量蛋白质的等份，各自用抗EGF受体的抗体(多克隆，Ab4，Calbiochem)和20μl蛋白A-琼脂糖(Santa Cruz)4℃免疫沉淀2小时。沉淀用0.5ml裂解缓冲液洗涤3次，悬浮在SDS样品缓冲液中，煮沸5分钟。在8.0％丙烯酰胺凝胶上SDS-PAGE分离蛋白质。所得凝胶在转移缓冲液(25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，20％(体积/体积)甲醇，pH8.3)中平衡。然后将蛋白质电泳转移到硝酸纤维素膜(0.22μm)上，用5％脱脂乳的PBS(含0.05％Tween20)封闭过夜，然后与单克隆抗磷酸酪氨酸抗体(1∶100，Santa Cruz)共培养1小时。用标准的亲和素-生物素-碱性磷酸酶复合物法(ABC试剂盒，Vector Laboratoraies)显示结合的抗体。
统计学。所有数据都表示为平均值±SEM。用方差的单向分析测定组间差异的统计学显著性。当方差分析显示统计学显著性时，用Scheffe′s检验对多重比较进行校正。零假设的几率低于0.05被认为显示具有统计学上显著的差异。
结果
活化嗜中性粒细胞引起粘液素MUC5AC的合成。当嗜中性粒细胞和活化嗜中性粒细胞的刺激剂(IL-8，fMLP，TNFα)与NCl-H292细胞共培养1小时，在24小时内，MUC5AC蛋白合成显著增加，但没有刺激过的嗜中性粒细胞(106/ml)，单独的IL-8或fMLP对MUC5AC的合成没有影响，与单独的TNFα共培养只引起MUC5AC合成小而不明显的增加。当嗜中性粒细胞先与TNFα预培养1小时，然后将它们与上清液分开，上清液与NCl-H292细胞共培养1小时，在12小时内上调MUC5AC基因的表达，并在24小时刺激用Alcian蓝/PAS和MUC5AC蛋白的抗体进行的染色；其余的NCl-H292细胞只表现极少的MUC5AC基因表达，小而班驳的Alcian蓝/PAS染色和MUC5AC蛋白染色。与对照相比，上清液引起的MUC5AC蛋白合成显著增加。培养后与上清液分开的嗜中性粒细胞没有作用。所以，被活化的嗜中性粒细胞迅速分泌一种能引起MUC5AC合成的活性产物。
EGF-R酪氨酸激酶抑制剂阻止活化嗜中性粒细胞上清液诱导的MUC5AC合成。已知，EGF-R配体通过活化EGF-R酪氨酸激酶，在NCl-H292细胞内引起MUC5AC的合成，所以，对EGF-R活化在活化嗜中性粒细胞上清液诱导的MUC5AC合成中的作用进行了研究。用选择性EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BlBX1522，AG1478)预处理NCl-H292细胞，阻止了通常由活化嗜中性粒细胞上清液诱导的MUC5AC蛋白合成。一种选择性血小板衍生的生长因子受体激酶抑制剂(AG1295)和酪氨酸磷酸化抑制剂(A1)的阴性对照没有作用。以上结果表明，在活化嗜中性粒细胞上清液诱导的MUC5AC合成中，EGF-R酪氨酸激酶被活化。
活化嗜中性粒细胞上清液中分泌的EGF-R配体在MUC5AC合成中的作用。为了确定EGF-R酪氨酸激酶的活化是否依赖EGF-R配体(EGF或TGFα)，我们将活化嗜中性粒细胞的上清液与抗EGF-R配体的中和抗体预培养。用抗TGFα抗体或抗EGF抗体预处理上清液不抑制活化嗜中性粒细胞上清液所诱导的MUC5AC合成。而且，上清液中不含TGFα。因此，活化嗜中性粒细胞上清液引起的EGF-R酪氨酸磷酸化是受一种非EGF-R配体(EGF或TGFα)依赖性机制诱导的。
香烟烟和氧自由基引起MUC5AC合成。与TGFα一样，香烟烟和氧自由基，H2O2，在12小时内，上调MUC5AC基因的表达。同样，所有刺激剂都在24小时内以剂量依赖性方式增加MUC5AC蛋白的合成和粘液性糖复合物的产生。在H2O2应答中的最大MUC5AC合成明显比TGFα应答中的少。AG1478预处理阻止所有刺激剂引起的MUC5AC蛋白合成的增加，这说明，刺激剂通过活化EGF-R酪氨酸激酶引起粘液的合成。自由基清除剂(DMSO和DMTU)和SOD预处理显著抑制活化嗜中性粒细胞上清液、烟草烟和H2O2引起的MUC5AC合成，但DMSO或SOD对TGFα引起的MUC5AC蛋白合成没有作用。
H2O2和活化嗜中性粒细胞上清液引起的EGF-R酪氨酸磷酸化。EGF-R蛋白的分布在无血清对照和所有受刺激(活化嗜中性粒细胞上清液，烟草烟，H2O2或TGFα)情况中相似。加入活化嗜中性粒细胞上清液、烟草烟、H2O2或TGFα后15分钟内，全部蛋白质发生酪氨酸磷酸化；无血清对照则没有作用。TGFα诱导的蛋白质全面酪氨酸磷酸化大于活化嗜中性粒细胞上清液、烟草烟或H2O2的作用。为了确定EGF-R是否被磷酸化，用抗EGF-R抗体进行免疫沉淀：活化嗜中性粒细胞上清液、烟草烟的可溶产物和H2O2都在15分钟内诱导了EGF-R特异性酪氨酸磷酸化，其作用与TGFα相似。用AG1478预处理NCl-H292细胞抑制所有刺激剂诱导EGF-R酪氨酸磷酸化。DMSO抑制上清液、烟草烟和H2O2诱导的EGF-R酪氨酸磷酸化，但DMSO对TGFα诱导的EGF-R酪氨酸磷酸化没有作用。
以上结果显示，当嗜中性粒细胞被IL-8、fMLP或TNFα活化时，引起NCl-H292细胞内的粘液素MUC5AC的合成。而且，嗜中性粒细胞与TNFα共培养1小时后收集的上清液引起MUC5AC的合成，该作用受选择性EGF-R酪氨酸激酶抑制剂的抑制。EGF-R酪氨酸激酶被抑制完全阻断活化嗜中性粒细胞上清液引起的MUC5AC合成；非EGF-R酪氨酸激酶抑制剂，选择性血小板衍生的生长因子受体激酶抑制剂(AG1295)和酪氨酸磷酸化抑制剂(A1)阴性对照则没有作用，这说明，EGF-R酪氨酸磷酸化是活化嗜中性粒细胞上清液诱导的MUC5AC合成的信号传递路径。
为了进一步分析活化嗜中性粒细胞上清液诱导EGF-R酪氨酸磷酸化的机制，对配体依赖性和非配体依赖性EGF-R路径都进行了研究。首先，我们测定了活化嗜中性粒细胞上清液中的TGFα，发现上清液中没有可测量的TGFα。先前的报道显示，嗜中性粒细胞只含有低水平(2.5pg/106细胞)的TGFα。活化嗜中性粒细胞上清液对MUC5AC合成的作用与1ng TGFα一样强，这一TGFα量是嗜中性粒细胞中含量的400倍。接着，我们用EGF-R配体的中和抗体进行封闭研究：用EGF-R和TGFα的中和抗体预处理不能抑制活化嗜中性粒细胞上清液引起的MUC5AC合成。以上结果提示，嗜中性粒细胞上清液引起的MUC5AC合成不是嗜中性粒细胞分泌EGF-R配体(TGFα和EGF)引起的。接着，我们检测了非配体依赖性路径：因为已知嗜中性粒细胞在活化过程中释放氧自由基引起各种细胞中EGF-R酪氨酸激酶的转活化，所以我们假设，在NCl-H292细胞中，活化嗜中性粒细胞释放氧自由基，引起EGF-R酪氨酸磷酸化，并引起MUC5AC的合成。自由基清除剂(DMSO和DMTU)和SOD抑制活化嗜中性粒细胞上清液引起的MUC5AC合成。据报道，TNFα在嗜中性粒细胞悬液中引起氧化爆，在1小时内达到最大应答；本发明的结果显示相似的时间过程。
在本发明研究中，异源性H2O2是嗜中性粒细胞在氧化爆中释放的主要产物，它在NCl-H292细胞中引起MUC5AC的合成。然而，MUC5AC合成对H2O2的最大应答只是对TGFα应答的一半。本发明研究的一项重要发现是，烟草烟单独引起MUC5AC的合成。这提示，烟草烟可以在体内通过直接刺激或通过嗜中性粒细胞聚集引起的间接刺激而引起MUC5AC的合成。烟草烟中引起MUC5AC合成的确切分子尚不清楚。已知烟草烟含有多种产物(例如，尼古丁，焦油、丙烯醛和氧化剂)。在我们的实验中，氧化剂应力可能是造成这一应答的机制。烟草烟诱导的MUC5AC合成被EGF-R酪氨酸激酶抑制剂完全抑制这一事实表明，EGF-R活化在烟草烟诱导的MUC5AC合成中起着主要作用。
在气道疾病中，嗜中性粒细胞气道炎症是一种常见特征，嗜中性粒细胞聚集并被细胞因子和烟草烟活化。本发明研究显示，聚集的嗜中性粒细胞和烟草烟还是在气道内诱导产生产粘液素细胞的上皮细胞分化的调节者。最重要的是，抑制EGF-R的活化可以作为治疗分泌过量性气道疾病的方法。
                            实施例3
                  气道上皮创伤引起杯状细胞化生
曾假设，灌注到气道内的琼脂糖塞会使支气管长期拥堵但不会将阻塞支气管，而滞留的琼脂糖塞会引起炎症，引起杯状细胞化生。现如Alcian蓝/PAS阳性染色和粘液素MUC5AC表达所显示的，琼脂糖塞诱导显著的局部杯状细胞产生，并与局部的炎细胞局部聚集相关。这样的结果显示，在琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生中发生了EGF-R活化。
方法
动物。实验动物方案得到了旧金山加利福尼亚大学动物研究委员会的批准。选用无病原雄性F344大鼠(体重230至250g；Simonsen Lab.，Gilroy，CA)。将大鼠笼养在无病原，并在周围配有受控层流通风罩的Bioclean笼子中；动物可自由地进食无菌食物和饮水。
药物。使用以下来源的药物：环磷酰胺(Sigma，St.Louis，MO)，美索比妥钠(Brevital，Jones medical Industries，Inc.，St.Louis，MO)，戊巴比妥钠(Nembutal，Abbott Lab.，North Chicago，IL)，BIBX1522，这是一种选择性EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(由BoehringerIngelheim，Inc.提供，Ingelheim，Germany)，将它溶解在以下溶液中：2ml聚乙二醇400(Sigma，St.Louis，MO)，1ml 0.1N的HCl和3ml 2％甘露醇的水溶液(pH7.0)。NPC15669(一种白细胞活动抑制剂)，由Scios Nova，Inc.，Mountain View，CA提供。
琼脂糖塞。将II型琼脂糖培养基EEO(Sigma，St.Louis，MO)在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中所成的4％溶液制成琼脂糖塞(直径0.7-0.8mm)。为了在组织中显示琼脂糖塞，在50℃融化琼脂糖，然后加入Monastral蓝B(Sigma，St.Louis，MO)的3％悬浮液。
实验方案。我们采用无病原大鼠是因为它们的气道内一般只有极少的杯状细胞。用美索比妥钠麻醉动物(Brevital，25mg/kg，i.p.)。无菌条件下，采用颈中线切开术暴露出气管，将20号Angiocath(Becton Dikinson，Sandy，UT)与聚乙烯管(PE90，内径0.86mm，外径1.27mm，Clay Adams，Parsipany，NY)连接，通过它滴注琼脂糖塞，将聚乙烯管缝入切开的气管。将聚乙烯管弯成30度角，从而可选择性地灌注到右支气管内。灌注后，将切口缝合。
为了评价EGF-R对琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生的作用，在灌注琼脂糖塞之前1小时用BIBX1522(80mg/kg，i.p.)处理动物，然后每日重复(40mg/kg，i.p.，bid)。在灌注琼脂糖塞后24、48或72小时将动物杀死。
为了评价TNFα对琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生的作用，用TNFα的中和抗体(Genzyme，Boston，MA)处理动物。第一次处理(0.2ml盐水中含100μl，i.p.)是在琼脂糖塞灌注前1小时，然后每日一次i.p.注射。另外，用皮下植入的渗透压微型泵(Alzet 2ML1，AlzaCorp.，Palo Alto，CA)来输注TNFα的中和抗体。
为了研究嗜中性粒细胞对琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生的作用，用环磷酰胺(骨髓白细胞的抑制剂)或环磷酰胺加NPC15669联合预处理大鼠。在灌注琼脂糖塞前5天给予一次环磷酰胺(100mg/kg，i.p.)，第二次注射环磷酰胺(50mg/kg，i.p.)是在灌注前1小时。在用NPC15669的研究中，该药物在琼脂塞灌注前1小时注射给予，然后在灌注后的3天内每日注射一次。
所有药物(B1BX1522，TNFα中和抗体，环磷酰胺和NPC15669)都在灌注琼脂糖塞前1小时i.p.给予，然后在3天内每日重复一次。
组织的制备。在琼脂糖塞灌注后的不同时刻，用戊巴比妥钠(65mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，用多聚甲醛在焦碳酸二乙酯处理的PBS中所成的1％溶液以120mmHg的压力灌注系统循环。取出右肺，用右侧尾叶进行组织学研究。为制备冷冻切片，取出组织，在4％的多聚甲醛中浸1小时，然后在30％蔗糖中浸过夜以防冻。将组织包在O.C.T.化合物(Sakura Finetek，USA.Inc.，Torrance，CA)中。为制备甲基丙烯酸酯切片，将组织在4％多聚甲醛中浸24小时，然后用梯度浓度的乙醇脱水，并包在甲基丙烯酸酯JB-4(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)中。组织切片(4μm厚)用Alcian蓝/PAS染色，并用苏木精反染色。
支气管上皮的形态学分析。按照现有文献中的技术，用半自动造影分析系统测定上皮内的粘液性糖复合物Alcian蓝/PAS染色区域百分比。人工圈出上皮区域和上皮中Alcian蓝/PAS染色的粘液性糖复合物区域，用NIH图象程序(US National Institutes ofHealth开发，可以匿名FTP从网上获得，或向National Technical Information Service，Springfield，Virginia；部号：PB95-500195GEI)获取软盘。该数据表示为Alcian蓝/PAS染色面积占上皮总面积的百分比。为了对粘液分泌进行准定量分析，计算Alcian蓝/PAS阳性染色长度与总长之比，从而确定阳性染色占据上皮的百分比。计算脱落上皮长度与上皮总长度之比，从而确定脱落上皮的百分比。
甲基丙烯酸酯切片内细胞类型的鉴定和细胞分析。用油浸物镜(放大1000倍)计点基底层2mm的上皮细胞细胞核，由此测定上皮细胞总数。所分析各上皮区下基底层的线性长度通过跟踪基底层的数字化图象的轮廓线来测定。如前所述鉴定上皮细胞。简而言之，基细胞是小而扁平且具有大细胞核的细胞，就在基底层之上但不到气道腔。细胞质被染成深色，其中没有Alcian蓝/PAS阳性颗粒。纤毛细胞的识别特征是它们有前毛边缘，细胞质染色浅，具有大的圆形细胞核。非粒化分泌细胞呈柱形，从支气管腔延伸到基底层。向支气管内灌注琼脂糖塞后，“发育期”杯状细胞(前杯状细胞)形成。这些细胞呈Alcian蓝/PAS阳性染色，颗粒很小，细胞并不被颗粒所充满；它们有较小的粘液染色面积(小于上皮从基底膜到腔表面高度的1/3)，或有着分散的被Alcian蓝/PAS浅染色的小颗粒。没有足够的细胞质特征可供正确分类的细胞被认为是类型不确定的细胞。
EGF-R的免疫组织化学定位。用EGF-R的单克隆抗体(Calbiochem，San Diego，CA)通过免疫组织化学定位来测定EGF-R的存在。先前制备的4μm冷冻切片用4％多聚甲醛后固定，并用0.3％H2O2/甲醇处理。将组织与EGF-R抗体(1∶250稀释)共培养。先与生物素化的马抗小鼠IgG(1∶200；Vector Lab.，Burlingame，CA)反应，接着与链霉亲和素过氧化物酶复合物(ABC试剂盒，Vector Lab.，Burlingame，CA)反应，用四盐酸3，3′-二氨基联苯(Sigma，St.Louis，MO)染色显示抗原-抗体复合物。阴性对照玻片以PBS代替第一抗体或第二抗体共培养。
原位杂交。用Carol Basbaum博士提供的含320bp大鼠MUC5AC基因cDNA片段的质粒制成[35S]标记的核探针(riboprobe)。切片与[35S]标记的RNA探针杂交(2,500-3,000cpm/μl杂交缓冲液)，在严谨条件下洗涤，包括用RNA酶处理。自显影7-21天后，用照相乳剂显影，玻片用苏木精染色。
计点气道上皮内的嗜中性粒细胞。用四盐酸3，3′-二氨基联苯染色嗜中性粒细胞，评价进入支气管的嗜中性粒细胞，计点气道腔和上皮内的嗜中性粒细胞数；结果表示为每毫米(mm)基底层长度上的染色细胞数。
支气管肺泡灌洗(BAL)。为了评价各组动物内的分化细胞数，每次用3ml无菌PBS灌洗肺部5次，将洗液合并，测定体积。洗液以1000rpm离心10分钟，以收集BAL中的细胞。然后用血细胞计数仪计点10μl细胞悬液中的细胞数，如此测定BAL中的细胞数。在Diff-Quick(American Scientific Products，McGaw Park，IL)染色的细胞离心制备物上进行分化细胞计数。各细胞离心玻片上取样至少200个细胞获得分化细胞计数。
统计学分析。数据表示为平均值±SE。为了进行统计学分析，先进行方差的双向或单向分析(ANOVA)，然后按需要进行Student T检验。将几率低于0.05认为有统计学上显著的差异。
结果
气道上皮结构的作用：杯状细胞化生。为了确定琼脂糖塞是否影响气道上皮的结构，给5只无病原大鼠的右支气管灌注琼脂糖塞。在对照动物中，支气管上皮含极少的杯状细胞。然而，在局部灌注琼脂糖塞后，Alcian蓝/PAS染色显示杯状细胞面积随时间增加，这早在灌注后24小时就可测得，在灌注后72小时达到最大。在第24小时，琼脂糖塞明显增加前杯状细胞和杯状细胞的数量，在第48小时，可发现更多的成熟杯状细胞(表1)。在第72小时，琼脂糖塞增加了杯状细胞的数量(P＜0.01)；但基细胞和纤毛细胞的数量没有改变(P＞0.05)。在灌注后72小时，每毫米基底层上的上皮细胞总数略有增加，但不明显(P＞0.05，表1)；上皮高度(从基底膜到上皮气道腔)由对照气道的16.0±1.2μm增加到琼脂糖塞灌注后72小时的38.1±9.1μm(n＝5，P＜0.01)。
在对照动物的气道腔内，没有Alcian蓝/PAS染色。然而，气道腔内靠近琼脂糖塞处可观察到阳性染色，这说明有粘液性糖复合物分泌。在有琼脂糖塞的气道内，染色随时间增加。气道内靠近琼脂糖塞的被Alcian蓝/PAS阳性染色占据的上皮总长度百分比由对照动物的0.1±0.1％增加到第24、48和72小时的4.7±1.4％，13.3±0.7％和19.1±0.7％(n＝5)。而且，在第24、48和72小时，琼脂糖塞分别造成拥堵支气管上皮13.5±2.3％，6.9±2.4％和5.1±1.5％的剥落(n＝5)。
琼脂糖塞对粘液素基因表达的作用。在对照大鼠中，在支气管内，用MUC5AC基因的反义探针未测得信号(每组的n＝4)。在灌注了琼脂糖塞的支气管内，有MUC5AC的信号，并从第24小时至72小时随时间增强(n＝4)。MUC5AC基因被发现优先在Alcian蓝/PAS阳性染色的细胞内表达。其他类型细胞(例如平滑肌、结缔组织)内没有检测到信号。用MUC5AC有义探针检测的切片显示没有表达。
琼脂糖塞对气道上皮内EGF-R表达的作用。在对照动物中，用抗EGF-R的抗体进行的免疫染色显示上皮有稀疏的染色。然而，在灌注琼脂糖塞后，琼脂糖塞附近的上皮表现出细胞内被Alcian蓝/PAS染色的EGF-R阳性染色。EGF-R的染色格式与MUC5AC和AB/PAS染色的平行。前杯状细胞、杯状细胞和非粒化分泌细胞为EGF-R免疫阳性。纤毛细胞显示无免疫活性。在没有被琼脂糖塞阻塞的气道内，上皮显示极少的EGF-R染色，似乎与对照动物内的染色相同。
EGF-R酪氨酸激酶抑制剂对杯状细胞化生和对粘液素基因表达的作用。在本发明研究中，琼脂糖塞灌注在产粘液素细胞内引起了EGF-R的表达。EGF-R是酪氨酸激酶受体族中的一员。因此，当EGF-R配体(EGF或TGFα)与EGF-R结合时，特异性EGF-R酪氨酸激酶被活化。所以，为检验在琼脂糖塞灌注后是EGF-R活化诱导了MUC5AC基因和粘液性糖复合物的表达这一假设，给大鼠腹膜内注射EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BlBX1522)。BIBX1522在琼脂糖塞诱导后24、48和72小时显著抑制上皮内Alcian蓝/PAS染色面积。在琼脂糖塞灌注后72小时，MUC5AC基因的表达完全被抑制。
TNFα的中和抗体对杯状细胞化生和对EGF-R蛋白表达的作用。我们假设，在琼脂糖塞诱导的炎症期间有TNFα释放。所以，我们研究用TNFα的中和抗体预处理大鼠对琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生的作用：在用TNFα的中和抗体预处理的动物中(n＝5)，琼脂糖塞不再刺激EGF-R蛋白的表达和Alcian蓝/PAS染色阳性细胞的产生。
琼脂糖塞引起的炎细胞的聚集。需要提出的是，琼脂糖塞造成上皮损伤，并引起炎细胞浸润。许多炎细胞都既产生TNFα又产生EGF-R配体。EGF-R及其配体都参与引起杯状细胞化生的EGF-R级联反应。我们双向地研究了白细胞和巨噬细胞在琼脂糖塞诱导效应中的作用。首先，我们检测了支气管肺泡灌洗液中的细胞。在对照大鼠中，回收到的主要是巨噬细胞(n＝5；图4，对照)。在琼脂糖塞灌注后，巨噬细胞数量增加(P＜0.05)，洗液中出现大量嗜中性粒细胞(P＜0.01)。淋巴细胞的数量不变。
还在组织切片中检测了浸润细胞：没有琼脂糖塞的气道内只有极少的嗜中性粒细胞，但有琼脂糖塞的气道的上皮和气道腔内都有嗜中性粒细胞。在对照气道和琼脂糖塞灌注后24、48和72小时的气道腔内，嗜中性粒细胞的数量分别是0.2±0.2、42.4±7.1、40.7±7.7和20.1±7.2/mm基底层(P＜0.05；n＝5)。此外，在对照气道和琼脂糖塞灌注后24、48和72小时的气道上皮内，嗜中性粒细胞的数量分别是1.3±0.4、15.6±2.6、14.9±1.4和14.8±2.6/mm基底层(P＜0.01，n＝5)。
环磷酰胺对嗜中性粒细胞聚集、杯状细胞化生和EGF-R蛋白表达的作用。在环磷酰胺处理的大鼠中，血液嗜中性粒细胞减少(环磷酰胺处理后，静脉血中的嗜中性粒细胞为1.8±0.5％，n＝5)。BAL中琼脂糖塞诱导的嗜中性粒细胞聚集被抑制。在第24小时，气道腔(2.6±0.3mm)和上皮(0.8±0.2/mm)内的嗜中性粒细胞数量也显著减少。环磷酰胺还抑制琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生和EGF-R蛋白的表达。在环磷酰胺中添加leumedin、NPC15669时，抑制琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生的效果与单独环磷酰胺的相似。以上结果显示嗜中性粒细胞参与琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生。
讨论
在本发明的研究中，我们研究了灌注琼脂糖塞在无病原大鼠内对气道内杯状细胞化生的作用，在对照状态下，无病原大鼠的气道内只有极少的杯状细胞。对照动物支气管和没有琼脂糖塞的支气管(对照肺)内的上皮细胞都呈Alcian蓝/PAS染色阴性。琼脂糖塞灌注造成塞附近支气管上皮内杯状细胞面积深度的时间依赖性增加，这在灌注后24小时内就可测得，在72小时时最大。而且，拥堵气道附近的气道也呈Alcian蓝/PAS染色阳性。细胞总数，基细胞和纤毛细胞的数量都不变，但在灌注琼脂糖塞后，杯状细胞增多，非粒化分泌细胞随时间减少(表2)。以上结果提示，杯状细胞化生是非粒化分泌细胞转化为杯状细胞的结果。
                                 表2
            琼脂糖塞对无病原大鼠内气管上皮细胞分布的作用*
细胞类型 对照 24小时 48小时 72小时
杯状细胞 0.0±0.0 13.1±5.6 25.7±15.0 51.5±9.0
前杯状细胞 0.0±0.0 32.8±2.9 25.7±15.0 51.5±9.0
分泌细胞 43.5±3.0 24.4±3.3 18.4±3.7 8.9±2.3
纤毛细胞 98.5±4.0 83.8±7.9 81.6±5.0 84.0±3.9
基细胞 18.4±5.7 10.6±0.8 11.6±1.7 11.0±2.3
不确定+ 13.0±0.5 1.4±0.8 1.1±0.1 0.6±0.4
总数 161±7.2 166.1±6.1 175.5±6.2 180.9±7.5
用所述方法分析细胞，每组的n＝5。借助于Alcian蓝/PAS染色(使粘液性糖复合物着色)来确定细胞的特征。对照气道含极少的前杯状细胞和杯状细胞。在琼脂糖塞灌注后，与对照动物相比，前杯状细胞和杯状细胞的数量呈时间依赖性增加(第24，48和72小时)，非粒化分泌细胞则减少。
*数据表示为细胞数/mm基底层的平均值±SE。
+与对照相比的P＜0.05；
&与对照相比的P＜0.01；
|细胞没有足够明显的细胞质特征可供分类。
据报道，大鼠气道杯状细胞表达MUC5AC基因。在本发明研究中，对照支气管不表达MUC5AC基因，但被琼脂糖塞阻塞或琼脂糖塞附近的气道呈Alcian蓝/PAS染色阳性，表达MUC5AC基因，这提示，MUC5AC基因参与琼脂糖塞诱导的粘液产生。以上结果表明，琼脂糖塞在大鼠气道的选定细胞内诱导粘液素基因的表达和粘液性糖复合物的产生。
对琼脂糖诱导杯状细胞化生的机制进行了研究。无病原大鼠的气道上皮内一般不表达EGF-R，但可被TNFα诱导。当上皮内存在EGF-R时，灌注EGF-R配体(EGF或TGFα)使得粘液素基因和蛋白质表达增加。EGF-R酪氨酸激酶的一种选择性抑制剂(BIBX1522)将上述应答完全抑制，表明EGF-R在杯状细胞化生中具有信号传递作用。对BIBX1522对琼脂糖诱导的杯状细胞化生的作用进行了研究：BIBX1522抑制琼脂糖塞诱导的粘液性糖复合物产生和MUC5AC基因的表达。这些结果显示在琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生中存在着EGF-R级联反应。
对EGF-R级联反应诱导琼脂糖塞引起杯状细胞化生的机制进行了研究。首先，我们研究了EGF-R蛋白在支气管上皮内的表达。对照气道的EGF-R染色一致呈阴性，但含琼脂糖塞的气道则表现为选择性的时间依赖性的EGF-R染色阳性。染色阳性的细胞包括非粒化分泌细胞，前杯状细胞和杯状细胞。因此，琼脂糖塞诱导EGF-R蛋白的表达。先以TNFα的中和抗体预处理的大鼠不发生琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生，说明TNFα参与琼脂糖塞诱导的EGF-R表达。
环磷酰胺是一种选择性抑制白细胞产生的药物，避免琼脂糖塞灌注后嗜中性粒细胞进入气道灌洗液和气道上皮的聚集，并防止琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生。在引入琼脂糖塞后，巨噬细胞也增加，但环磷酰胺并不抑制巨噬细胞的聚集。以上结果说明，嗜中性粒细胞参与琼脂糖塞诱导的杯状细胞化生。环磷酰胺还减少琼脂糖塞灌注后的EGF-R蛋白表达，这一事实说明嗜中性粒细胞参与，至少部分参与炎症中的EGF-R表达。
嗜中性粒细胞还能产生EGF-R配体EGF-R和TGFα。此外，上皮细胞是EGF-R配体的来源，而且，在琼脂糖塞附近出现明显的上皮剥落。因此，上皮可能是TNFα和EGF-R配体重要的潜在来源。
可以假设，琼脂糖塞的有效刺激与琼脂糖塞在呼吸时的运动因而造成上皮细胞脱落有关。据报道，对气道上皮的机械损伤引起分泌过量。这些现有的研究支持这样的假设，即，对气道上皮的机械创伤会造成分泌过量。据报道，orotracheal插管造成马大量分泌粘液。给患者长期插管可能造成粘液分泌过量，可能引起粘液堵塞。EGF-R酪氨酸激酶抑制剂可在气管插管后防止粘液过量分泌。
在对患者(即使是轻度哮喘)的研究中常会发现上皮损伤，这样的损伤还会随临床症状的恶化越来越相关。变应性应答引起的上皮损伤会诱导EGF-R活化，EGF-R活化则引起异常的杯状细胞产生。以上信息说明，EGF-R活化参与一种不同的，具体说是与杯状细胞化生相关的应答。机械性上皮损伤和哮喘中的上皮损伤可能具有类似的EGF-R级联反应，造成异常的上皮分泌性细胞的增殖。以上，提供了急性哮喘死亡中发生的分泌过量的一种机制。
实施例4
EGF-受体引起的杯状细胞的重新粒化
鼻内吸入fMLP诱导大鼠鼻呼吸道上皮内杯状细胞脱粒。在鼻吸入fMLP(10-7M)后4小时，在鼻隔膜上皮内诱导显著的脱粒。杯状细胞吸入后48小时内重新粒化。在对照状态下，杯状细胞内表达MUC5AC蛋白，但不表达EGF-R蛋白。在对照上皮内，EGF-R和MUC5AC基因和蛋白质都没有，但在吸入后48小时，表达显著。用EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522预处理抑制fMLP诱导杯状细胞脱粒后的粘液素MUC5AC基因和蛋白质的表达。以上结果说明，EGF-R的表达和活化参与大鼠鼻上皮内杯状细胞的重新粒化。
方法
动物。实验动物方案得到了旧金山加利福尼亚大学动物研究委员会的批准。选用无病原雄性F344大鼠(体重230至250g；Simonsen Lab.，Gilroy，CA)。将大鼠笼养在无病原，并在周围配有受控层流通风罩的BioClean笼子中；动物可自由地进食无菌食物和饮水。
鼻组织的制备。在吸入fMLP后的不同时刻，用戊巴比妥钠麻醉动物(65mg/kg，i.p.)。露出动物的心脏，将一根钝头针从左心室尖插入升主动脉，用1％多聚甲醛灌注全身循环。切开右心房形成固定剂出口。取眼睛、下颌、皮肤和肌肉组织，将头部在大量的相同固定液中浸24小时。固定后，头部用Surgipath(脱钙剂Il，Surgical Medical Industries，Inc.，Richmond，IL)脱钙4-5天，用磷酸盐缓冲液清洗。在鼻颚尖突线将鼻腔横切开来。将前部组织块包在乙二醇甲基丙烯酸酯(JB 4 Plus，Polysciences，Inc.，Warrington，PA)，或包在OCT化合物(Sakura Finetek，USA.Inc.，Torrance，CA)中制成冷冻切片。从乙二醇甲基丙烯酸酯包块的前表面切下5μm厚的切片，用Alcian蓝(pH2.5)/高碘酸-希夫(AB/PAS)染色(显示酸性和中性糖复合物，用3，3′-二氨基联苯)(Sigma Chemical，St.Louis，MO)染色，以显示迁移到上皮内的白细胞。从冷冻块的前表面切下5μm厚的切片，用AB/PAS染色，或用于EGF-R和MUC5AC免疫染色。
计点鼻粘膜内的嗜中性粒细胞。放大400倍，在高压场中，计点3，3′-二氨基联苯染色上皮层中的嗜中性粒细胞。计点单位基底层长度上的细胞核数来确定鼻萼上皮内的嗜中性粒细胞数(从基底膜到细胞顶点)。
定量测定杯状细胞的脱粒和重新粒化。为了评价杯状细胞的脱粒和重新粒化，我们按照已知方法，用半自动造影系统测定粘膜表面上皮上被Alcian蓝/PAS染色的粘液物质的体密度。将Axioplan显微镜(Zeiss，Inc.)与摄象机控制单元(DXC7550MD；Sony Corp.of America，Park Ridge，NJ)连接，检测被染色的玻片。用IMAXX摄象系统(PDI，Redmond，WA)，用400倍的相差透镜在高压场中记录鼻上皮的图象。浅层上皮分泌细胞内的胞内粘液素呈大小不一的椭圆形紫色颗粒。我们测定了Alcian蓝/PAS染色面积和上皮总面积，表示为Alcian蓝/PAS面积占总面积的百分比。这一分析是在Macintosh9500/120计算机(Apple Computer，Inc.，Cupertino，CA)上，用公共域NIH图象程序进行的。
EGF-R和MUC5AC蛋白的免疫定位。用3％H2O2/甲醇处理多聚甲醛固定的鼻组织的冷冻切片以封闭内源性过氧化物，并将它们与1∶100倍稀释的抗EGF-R的小鼠单克隆抗体(Calbiochem，San Diego，CA)或MUC5AC(NeoMarkers Inc.，Fremont，CA)共培养1小时。以3，3′-二氨基联苯为色原，用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Lab.，Inc.，Burlingame，CA)显示免疫反应性EGF-R或MUC5AC。用PBS代替第一或第二抗体作为对照。
方法。我们用无病原的大鼠进行研究，它们的鼻萼上皮一般有许多杯状细胞。为了测定喷雾fMLP对杯状细胞脱粒和对嗜中性粒细胞迁移进入鼻粘膜上皮的作用，用戊巴比妥钠麻醉大鼠(65mg/kg，i.p.)，向鼻内喷雾N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸(fMLP；10-5M，Sigma，St.Louis，MO)的无热原盐水溶液5分钟。用超声波雾化器(PulmoSonic，DeVilbiss Co.，Somerset，PA)以0.3ml/min的速度产生喷雾，用它给动物通气，进行喷雾处理。以类似方式只给予对照动物鼻内盐水喷雾。
为了研究fMLP喷雾吸入后鼻杯状细胞的重新粒化，在鼻内给予fMLP后第48小时，将大鼠杀死。
为了评价EGF-R酪氨酸激酶活化对杯状细胞重新粒化的作用，吸入fMLP之前30分钟，用EGF-R酪氨酸激酶抑制剂(BIBX1522，15mg/kg，Boehringer Ingelheim Inc.，Ingelheim，Germany提供)腹膜内预处理动物，每日2次。
统计学。所有数据表示为平均值±SEM。对每一实验组进行单向ANOVA或StudentT检验。将几率低于0.05认为统计学显著的差异。
结果
fMLP引起的杯状细胞脱粒对鼻上皮结构的作用。在对照状态下，鼻萼上皮具有明显的被AB/PAS染色的杯状细胞区，但鼻腔表面没有被染色。对粘液素MUC5AC蛋白的免疫染色区与AB/PAS染色区相应，但原位杂交显示极少或没有MUC5AC基因表达。EGF-R蛋白的免疫组织化学染色呈阴性。以上结果显示，对照大鼠的鼻上皮含有含MUC5AC蛋白但不表达粘液素基因的完整杯状细胞。鼻腔没有被染色提示没有发生粘液素脱粒(分泌)。
假设，未受刺激的大鼠鼻上皮含有内含大量粘液素蛋白的“稳定”的非脱粒杯状细胞。已证明，嗜中性粒细胞化学吸引剂(例如fMLP)可使嗜中性粒细胞既入气道上皮，并在那里引起弹性酶依赖性的杯状细胞(GC)脱粒。为了确定GC脱粒的作用，鼻内喷雾5分钟给予嗜中性粒细胞化学吸引剂fMLP(10-7M)。给予fMLP后4小时杀死的大鼠中，AB/PAS染色面积和MUC5AC阳性免疫染色面积显著减小，并发生嗜中性粒细胞进入鼻上皮聚集。AB/PAS染色占据大部分的鼻气道表面，这证实发生了GC脱粒。然而，给予fMLP后4小时，MUC5AC基因的表达没有改变。
给予fMLP后48小时杀死的大鼠中，用EGF-R抗体进行的前杯状细胞和杯状细胞内EGF-R染色呈阳性，AB/PAS和MUC5AC免疫阳性染色区恢复到对照状态水平，说明发生了鼻GC的重新粒化。此时，嗜中性粒细胞聚集不再存在；GC所占据的区域内可看到MUC5AC基因表达，说明GC重新粒化与粘液素基因的表达相关。
EGF-R酪氨酸激酶磷酸化在杯状细胞重新粒化中的作用。过去对大鼠的研究报道，EGF-R的活化引起粘液素基因和蛋白质的表达。为了检验EGF-R活化在fMLP后的大鼠鼻GC重新粒化中起作用这一假设，用选择性EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522预处理大鼠(n＝5)，fMLP喷雾引起嗜中性粒细胞进入鼻上皮的聚集和GC脱粒，但在48小时后，AB/PAS染色区和MUC5AC免疫阳性染色区减小了。以上结果显示，EGF-R活化参与了fMLP引起的鼻GC粘液素合成。
在本发明的研究中，我们对大鼠鼻上皮内粘液素产生的调节进行了研究。对照上皮含有明显是杯状细胞，而且，这些细胞内含有MUC5AC蛋白。但是没有MUC5AC基因表达。据报道，其他气道上皮细胞内通过EGF-R的表达和活化而发生MUC5AC粘液素表达。在对照大鼠的鼻上皮细胞内，我们发现没有EGF-R基因或蛋白质表达。鼻腔内没有AB/PAS或MUC5AC蛋白染色，提示没有发生明显的杯状细胞脱粒(分泌)。在“稳定”杯状细胞内，EGF-R可能被下调，避免粘液素的进一步合成。所以，我们通过诱导杯状细胞脱落对鼻杯状细胞进行“攻击”，我们检测了此后气道上皮结构的变化。
嗜中性粒细胞化学吸引剂引起豚鼠和人的气道内由嗜中性粒细胞弹性蛋白酶介导的嗜中性粒细胞依赖性杯状细胞脱粒，与嗜中性粒细胞与杯状细胞间的紧密接触有关。为了诱导一般发生在鼻隔膜内杯状细胞的脱粒，鼻内吸入化学吸引剂fMLP。fMLP使嗜中性粒细胞进入鼻上皮聚集，然后发生杯状细胞脱粒，Alcian蓝/PAS染色面积显著减小。
接着，研究了fMLP诱导GC脱后鼻上皮细胞内的活动。在给予fMLP后4小时，当发生最大的鼻GC脱粒时，仍然没有EGF-R和MUC5AC表达。然而，给予fMLP后48小时，前杯状细胞和杯状细胞内强烈表达EGF-R。此时，MUC5AC基因在上皮细胞内强烈表达，这些活动与杯状细胞的重新粒化相关(AB/PAS和MUC5AC染色增加)。实际上，给予fMLP后48小时，重新粒化已经发生到了使得杯状细胞面积接近对照状态下的程度。以上发现提示，GC脱粒引起EGF-R的表达和活化，因此引起MUC5AC粘液素的表达。
为了研究EGF-R酪氨酸激酶活化在GC重新粒化中的作用，我们用选择性EGF-R酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522预处理动物。在用BIBX1522预处理的动物中，fMLP仍能引起GC脱粒。然而，BIBX1522预处理阻止GC重新粒化，并阻止它们表达MUC5AC蛋白。以上结果说明EGF-R活化参与GC脱粒后粘液素的重新产生。在无病原大鼠中，杯状细胞是“无活性的”(即，没有脱粒)，EGF-R被下调。当炎症(例如嗜中性粒细胞浸润刺激)引起GC脱粒和粘液素分泌时，EGF-R的上调和活化使得气道上皮重新被粘液素充满。以上发现提示，可能可用选择性EGF-R酪氨酸激酶抑制剂预防鼻病中的分泌过量。
虽然以上结合具体实施例对本发明进行了描述，但本领域熟练技术人员应该明白，在本发明的宗旨和范围内可进行多种改变和等价替换。此外，对于本发明的目的、宗旨和范围，可根据具体情况，对材料、组合物、过程、过程的步骤进行多种修改。后文的权利要求意在覆盖以上所有这些修改。

Claims (14)

1.上皮生长因子受体拮抗剂用于制造治疗肺内粘液过量分泌的药物的用途，所述拮抗剂是上皮生长因子受体选择性酪氨酸激酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中的拮抗剂是上皮生长因子受体选择性酪氨酸激酶抑制剂BIBX1522。
3.根据权利要求1所述的用途，其中的拮抗剂抑制上皮生长因子受体的转磷酸化。
4.根据权利要求3所述的用途，其中的拮抗剂是一种抗氧化剂。
5.根据权利要求1所述的用途，所述药物为注射剂型。
6.根据权利要求5所述的用途，所述药物是以普通盐水为运载体的静脉注射剂型。
7.根据权利要求1所述的用途，所述药物为吸入剂型。
8.根据权利要求1所述的用途，所述药物为脂质体剂型。
9.根据权利要求8所述的用途，所述药物为静脉给药的脂质体剂型。
10.一种用于治疗气道粘液过量分泌的药物制剂，它包含：
足以抑制气道粘液过量分泌的治疗有效量的上皮生长因子受体选择性酪氨酸激酶抑制剂；
用于吸入途径的药物传递系统。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，所述上皮生长因子受体选择性酪氨酸激酶抑制剂以水性或醇性溶液配制成制剂。
12.根据权利要求10所述的药物制剂，所述上皮生长因子受体选择性酪氨酸激酶抑制剂被配制成粉末型制剂。
13.根据权利要求10所述的药物制剂，所述适合吸入给药的制剂为喷雾剂。
14.根据权利要求10所述的药物制剂，其中还包含支气管扩张剂、皮质类固醇、化痰剂或溶粘液剂。
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