CN1192688A - 联合疗法治疗hiv和其它病毒性感染 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了治疗或预防病毒性感染,特别是HIV感染的新的抗病毒的联合疗法。这种新的抗病毒疗法将DP-178或DP-107(病毒融合抑制剂)与至少一种其它的抗病毒治疗剂合并使用。本发明的联合疗法比单用一种药物效果好,在某些情况下可产生协同作用。DP-178或DP-107与另一种抗病毒剂联合使用是一种理想的疗法,它以全新的机理,既阻断了HIV的传播,又消除了治疗剂的毒性。
Description
1.本发明的范围
本发明为申请号为08/481957(申请日期为1995年6月7日)的部分连续申请。
本发明涉及使用新的联合疗法治疗病毒性感染,尤其是HIV感染的方法。所述新的联合疗法采用肽DP-178,DP-107或片断,类似物和/或其同系物,以及至少一种其它的治疗剂。
DP-178是一种相应HIV-1LAI横跨膜蛋白(TM)gP41的氨基酸638到673的肽。DP-178包括其部分,类似物,及DP-178的同系物,它们都表现出抗病毒活性。抗病毒活性包括(但不限于)抑制HIV向未感染的CD-4+细胞传播。而且,本发明还涉及使用DP-.178和DP-178片断和/或类似物或同系物作为逆转录病毒(特别是HIV)向未感染的人或非人细胞传播的抑制剂。本发明还涉及抗病毒肽DP-107,一种相应HIV-1LAI横跨膜蛋白(TM)gP41氨基酸558到595的肽,这些氨基酸存在于其它的包膜病毒中。更准确地说,本发明涉及DP-107,其片断和/或类似物或同系物与其它治疗剂合并使用以治疗病毒性感染,尤其是HIV感染的用途。而且,本发明还涉及包含DP-178或DP-107和至少一种其它治疗剂的新的药用组合物。
2.本发明的背景
2.1人免疫缺陷病毒
人免疫缺陷病毒(HIV)是一种致病性逆转录病毒和引起获得性免疫缺陷综合病(AIDS)和相关疾病的成因因子(Barre-Sinossi,F.etal.,1983,Science 220:868-870;Gallo,R.et al.,1984,Science 224:500-503)。至少有两种不同的HIV类型:HIV-1(Barre-Sinossi,F.et al.,1983,Science 220:868-870;Gallo,R.et al.,1984,Science 224:500-503)和HIV-2(Clavel,F.etal.,1986,Science 223:343-346;Guyader,M.et al.,1987,Nature 326:662-669)。而且,这些类型病毒中的每一型群体都存在着大量的遗传异质性。人CD-4+T-淋巴细胞感染一种HIV病毒时将导致该型细胞衰竭,并最终引起机遇性感染,神经系统功能紊乱,肿瘤形成,而过早死亡。
HIV属逆转录病毒的慢病毒科中的一员(Teich,N.et al.,1984;RNA Tumor Viruses,Weiss,R.et al.,eds.,CSH-Press,PP.949-956)。逆转录病毒为小包膜病毒,它含有一种二倍体的单股RNA基因组,通过病毒编码的逆转录酶(一种RNA诱导的DNA聚合酶)产生的一种DNA中间产物进行复制(Varmus,H.,1988,Science 240:1427-1439)。其它逆转录病毒包括:致瘤病毒如人T-细胞白血病病毒(HTLV-I,-II,-III),和猫白血病病毒。HIV病毒颗粒由病毒核心组成,而该核心又由称作P24和P18的蛋白质构成。病毒核心含有病毒RNA基因组和复制过程中所需的上述酶类。十四烷基葡萄糖胺聚糖组成的病毒外壳包绕着病毒核心,外面再包着一层由感染的宿主细胞膜衍化的脂膜外套。HIV包膜表面的糖蛋白经合成形成一种单-160KD的前体蛋白,在病毒繁殖期间,这种前体蛋白在一种细胞蛋白酶的作用下分裂成两种糖蛋白:gP41和GP120。gP41是一种透膜蛋白,而gP120为一种细胞外蛋白,它与gP41以非共价的形式(可能是三聚体或多聚体的方式)连在一起(Hammerwskjold,H.and Rekosh,D.,1989,Biochem.Biophys.Acta 989:269-280)。
HIV以CD-4+T淋巴细胞作为靶细胞是因为CD-4表面蛋白起着HIV-1病毒细胞受体的作用(Dalgleish,A.et al.,1984,Nature312:767-768,Maddon et al.,1986,Cell 47:333-348)。病毒进入细胞后则依赖gP120结合在细胞CD-4+受体分子上,同时gP41也固定在病毒膜上的包膜糖蛋白复合体上(McD-ougal,J.S.et al.,1986,Science231∶382-385;Maddon,P.J.et al.,1986,Cell 47∶333-348),这就解释了HIV对CD-4+细胞的亲和性。
2.2HIV的治疗
HIV感染是一种全球流行的传染病,HIV相关疾病提出了一个严重的世界性卫生问题。尽管作出了巨大的努力以成功地设计有效的治疗药物,但目前并不存在针对AIDS的有疗效的抗逆转录病毒药物。为试图开发此类药物,曾考虑过针对病毒生命周期的几个阶段进行治疗性干扰(Mitsuya,H.et al.,1991,FASEB J.5:2369-2381)。干扰可能抑制HIV对细胞膜的结合,也可能抑制HIV RNA基因组反转录到DNA中,或者抑制病毒从宿主细胞中排出以感染新的靶细胞。
为开发能够抑制病毒进入细胞(即HIV感染的最早阶段)的药物,曾做了一些尝试。在这方面,注意力主要集中在CD-4+,即针对HIV的细胞表面受体上。例如,重组体的可溶性CD-4已表明能在病毒颗粒遇到嵌入细胞膜的CD-4分子之前即与之结合,以阻断HIV的感染性(Smith,D.H.et al.,1987,Science 238∶1704-1707)。某些原始HIV-1株对重组体的CD-4的抑制作用很不敏感(Daar,E.etal.,1990,Ann.Int.Med.112∶247-253)。此外,重组体的可溶性CD-4的临床试验已得出无定论的结果(Schooley,R.et al.,1990,Ann,Int.Med.112:247-253;Kahn,J.O.et al.,1990,Ann.Int.Med.112∶254-261;Yarchoan,R.et al.,1989,Proc.Vth.Int.Conf.on AIDS,P564,MCP137)。
以病毒编码的逆转录酶的靶向的药物,包括2’,3’-双脱氧核苷类似物如AZT,ddI,ddC,及d4T,已经开发出来,并显示出抗HIV活性(Mitsuya,H.et al.,1991,Science 249∶1533-1544)。这些核苷类似物虽然有益,却是非治疗性的,这可能与抗药性HIV突变型迅速出现有关(Lander,B.et al.,1989,Science 243∶1731-1734)。此外,这些药物常常显示出毒副作用如骨髓抑制,呕吐及肝功能异常。
HIV病毒复制的后期,也可认为是开发抗HIV药物的可能目标,因为该期涉及到某些病毒蛋白至关重要的病毒特异性的二次加工。后期加工依赖于某种病毒蛋白酶的活性,而正在开发的药物也正是抑制这种酶(Erikson,J.,1990,Science 249∶527-533)。这些候选药物的临床结果尚有疑问。
注意力还放在开发疫苗来治疗HIV感染方面。HIV-1包膜蛋白(gP160,gP120,gP41)已认为是存在于AIDS患者中的抗-HIV抗体的主要抗原(Barin et al.,1985,Science 228∶1094-1096)。迄今为止,这些作为抗原的蛋白似乎是开发抗-HIV的最有前景的候选物。为此,一些团体已开始利用gP160,gP120,和/或gP41的不同部分作为宿主免疫系统的免疫原靶子。例如,请参考Ivanoff,L.et al.,U.S.Pat.No.5,141,867;Saith,G.et al.,WO 92/22,654;Schafferman,A.,WO 91/09,872;Formoso,C.et al.,WO 90/07,119。然而,涉及所述候选疫苗的临床结果仍遥遥无期。
最近,可诱导全身、免疫应答的双股RNAs已与抗病毒剂如干扰素,叠氮胸苷(AZT)和膦酰基甲酸盐一道联合用于治疗病毒性感染(参看Carter,W.,U.S.Patent No.4,950,652)。此外,嘧啶核苷类似物和尿苷磷酸化酶抑制剂的联合疗法已用于治疗HIV(参看Sommadossi,J.P.et al.,U.S.Patent No.5077280)。尽管上述特异性疗法已证明是有益的,但一般来说联合疗法具有相互拮抗作用的可能性,就像在体外试验中合并使用叠氮胸苷(AZT)和病毒唑所表现的那样(参看U.S.PatentNo.4950652)。而且,假如大多数抗-HIV治疗剂毒性高且疗效差,则联合疗法就存在着很大问题。因而需要一种高效无毒的联合疗法。
本发明根据病毒融合抑制剂(DP-178,DP-107等)与其它抗病毒剂的合并使用提出一种新的联合疗法。DP-178和DP-107均为新的治疗剂,它们能阻止病毒与细胞融合,因而非常有效地预防了病毒在细胞与细胞之间的传播。另外,体外研究和动物试验证实DP-178和DP-107无毒性作用。本发明提供了将上述肽类与另一种抗病毒剂或任何其它治疗剂合并使用的第一份报告。
3.本发明的概述
本发明涉及将有效剂量的DP-178,或它的一种药学上可接受的衍生物与至少一种其它的治疗剂合并使用以治疗或预防哺乳动物(包括人)病毒性感染,尤其是HIV感染的方法。
本发明还涉及将有效量的DP-107,或它的药学上可接受的衍生物与至少一种其它的治疗剂合并使用以治疗或预防哺乳动物(包括人)病毒性感染,尤其是HIV感染的方法。
更准确地说,本发明涉及将有效量的DP-107,DP-178,或它们的一种药学上可接受的衍生物与至少一种其它的抗病毒剂合并使用以治疗或预防哺乳动物(包括人)病毒性感染的方法。本发明包括活性剂(例如DP-107,DP-178或另一种抗病毒剂)的给药方法:同时给药,或按先后次序给药,包括周期性给药。周期疗法涉及在一段时间内给予第一种抗病毒化合物,接着在另一段时间内给予第二种抗病毒化合物,然后重复这种给药顺序(即周期),以降低此种疗法产生的耐药性。本发明涉及联合使用DP-107,DP-178或它们的一种药学上可接受的衍生物和至少一种其它的治疗剂,特别是至少一种其它的抗病毒剂,它们可产生协同作用,即比单独使用一种药物或一种疗法效果好。
本发明还涉及DP-178,DP-107或它们的一种药学上可接受的衍生物与至少一种其它抗病毒剂(和病毒融合抑制剂有不同的作用部位)的联合使用。建立在联合使用上的这些治疗剂可产生双重作用(不管是协同作用还是增效作用)基础上的这种组合提供了一种改进的治疗方法。
本发明也涉及把有效量的DP-107,DP-178或它们的一种药学上可接受的衍生物与至少一种其它的治疗剂,尤其是至少一种其它的抗病毒剂合并使用以治疗或预防哺乳动物(包括人)的HIV感染的方法。
本发明涉及的抗病毒剂的新的组合提供了一种治疗手段,它不仅可以减少药物达到抗病毒活性所需的有效剂量(从而降低了毒性),而且还可以通过多种机制攻击病毒,从而增强抗病毒的确切效果。同样,所述的新的抗病毒组合提供了一种防止病毒对单一疗法产生耐药性的方法,因而也为临床医生提供了一种更为有效的治疗。
本发明的另一方面包括治疗或预防病毒性感染,尤其是HIV感染的药用组合物和制剂,其中所述的组合物包括有效量的DP-178,DP-107,或它们的一种药学上可接受的衍生物,至少一种另加的治疗剂和一种药学上可接受的载体。
与DP-178,DP-107或它们的一种药学上可接受的衍生物联合使用的治疗剂涉及到各种各样的已知治疗方法。但最好是将DP-107或DP-178与另一种具有不同攻击模式的治疗剂合并使用。这些治疗剂包括(但不限于此):抗病毒剂,如细胞活素(Cytokines)如rIFNα,rIFNβ,rIFNγ;逆转录酶抑制剂,如AZT,3TC,ddI和其它的双脱氧核苷或双脱氧氟代核苷;病毒mRNA封端(capping)的抑制剂,如病毒唑;HIV蛋白酶抑制剂,如ABT-538和MK-639;两性霉素B,作为一种脂键结合分子而具有抗-HIV活性,及锥栗精胺(castanospermine),作为糖蛋白加工的抑制剂。
因此,本发明提供了一种改进的抗病毒治疗方法,用于治疗广谱病毒包括HIV的感染。
本发明也提供了旨在增加疗效的联合疗法,该疗法优于使用单一治疗剂的疗法。
此外,本发明提供了可以减轻DP-178和DP-107和/或由肽构成的治疗剂的毒性的联合疗法,从而提供了一种较高的治疗指数。
本发明提供了一种防止病毒对单一疗法产生耐药性的联合疗法。
3.1定义
本文使用的“病毒性感染”一词用于描述一种疾病状态,更确切地说,系指病毒侵入健康的细胞,利用细胞的生殖机制进行繁殖或复制,最后使细胞溶化并导致细胞死亡,病毒颗粒释放后,再通过新产生的子代病毒感染其它的细胞。某些病毒引起的潜伏感染也是病毒感染的一个可能结果。
本文使用的术语“治疗或预防病毒性感染”意指抑制特定病毒的复制,抑制病毒的传播,预防病毒在其宿主中自我安置,改善或减轻病毒感染引起的疾病症状。如果病毒负载减轻,死亡率和/或发病率降低,则可认为治疗是有效的。
本文使用的术语“协同作用”涉及一种联合疗法,它比单纯使用任何两种或多种单一的治疗剂所产生的加合作用更为有效。本文使用的协同效果涉及到使用较低用量(剂量)的单一疗法以治疗或预防病毒性感染的能力。所述的较低剂量导致较低的毒性,而不降低药效。此外,协同效果能增加疗效,即增强抗病毒活性。最后,协同能避免或减轻病毒对任何单一疗法产生的耐药性。DP-178或DP-107与另一种治疗剂之间的协同相互作用的测定是以本文5.5节描述的抗病毒测定法获得的结果为基础。这些测定方法的结果采用Chou和Talalay组合法(Chou and Talalay,1984,Adv,Enzyme Regul.22:27-55)和“微机剂量-效果分析”软件来分析(Chou and Chou,1987,Softwareand manual.P19-64.Elsevier Biosoft,Cambridge,UK)以求获得一种组合指数。组合指数值<1表示协同作用,值>1表示拮抗作用,值=1表示增效作用。
这些测定法的结果也可采用Fritchard和Shipman的方法(Fritchard and Shipman,1990,Antiviral Research 14∶181-206)来分析。这种计算机程序是通过对结果的三维图解分析来确定抗病毒剂之间的相互协同或拮抗作用的一种测定方法。
术语“药学上可接受的载体”涉及一种载体媒介,它不干扰活性成份的生物学活性效应,在化学上不活泼,且对给药病人无毒性作用。
本文使用的术语“药学上可接受的衍生物”系指下文5.1.2节中描述的与DP-178或DP-107肽相应的任何同系物,类似物,或片断,它显示出抗病毒活性,且对受试者相对无毒性。
术语“治疗剂”系指能有助于治疗病毒性感染或由此而引起的疾病的任何分子,化合物或药物,尤指抗病毒剂。
本文涉及的肽定义为由肽键共价结合的两个或多个氨基酸组成的有机化合物。肽也可指构成氨基酸的数量,即二肽含有两个氨基酸残基,三肽含有三个,等等。含10个或10个以下氨基酸的肽可称为寡肽,而10个以上氨基酸残基组成的肽称为多肽。
本文定义的肽序列用代表氨基酸残基一个字母符号来表示如下:
A(丙氨酸)
R(精氨酸)
N(天门冬酰胺)
D(天门冬氨酸)
C(半胱氨酸)
Q(谷氨酰胺)
E(谷氨酸)
G(甘氨酸)
H(组氨酸)
I(异亮氨酸)
L(亮氨酸)
K(赖氨酸)
M(蛋氨酸)
F(苯丙氨酸)
P(脯氨酸)
S(丝氨酸)
T(苏氨酸)
W(色氨酸)
Y(酪氨酸)
V(缬氨酸)
4.图的概述
图1:由HIVLAI衍生的DP-178氨基酸序列(SEQ ID:1);由HIV-1SF2(DP-185;SEQ ID: 3),HIV-1RF(SEQ ID:4),和HIV-1MN(SEQ ID:5)衍生的DP-178同系物;由两株原型HIV-2株,即HIV-2rod(SEQ ID:6)和HIV-2NIHZ(SEQ ID:7)的氨基酸序列衍生的DP-178同系物;对照肽:DP-180(SEQID:2),一种与DP-178氨基酸残基以杂混次序结合的肽;与DP-178无关的DP-118(SEQ ID:10),它能抑制HIV-1细胞游离病毒的感染;与DP-178无关的DP-125(SEQ ID:8),曾表明可抑制HIV-1细胞游离病毒的感染(Wild et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10,537-10,541);与DP-178无关的DP-116(SEQ ID:9)经细胞游离病毒感染测定后表明不能抑制HIV-1感染(Wild,et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:10,537-10,541)。所有的图均采用上述单字母氨基酸码。
图2:合成肽抑制HIV-1细胞-游离病毒感染。IC50系指与未经治疗的对照比较,肽抑制来自感染细胞的RT繁殖达50%时的浓度。对照:用和处理过的培养物相同浓度的病毒感染未处理的细胞培养物后产生的RT的浓度。
图3:合成肽DP-178(SEQ ID:1)抑制HIV-1和HIV-2细胞-游离病毒感染。IC50与未经处理的对照比较,抑制RT繁殖达50%所需的肽浓度。对照:用和处理过的培养物同样浓度的病毒感染未处理细胞培养物后产生的RT的浓度。
图4:DP-178(SEQ ID:1)和DP-116(SEQ ID:9)对CEM细胞的细胞毒性研究。表明了细胞繁殖数据。
图5A-C:DP-178-衍生的肽的抗病毒数据。本文列出的肽是由环绕HIV-1BRU株DP-178区(如gP41氨基酸残基615-717)的周边区域衍生出来的。在这种情况下,肽在该区域含有DP178点突变,突变的氨基酸残基用阴暗背景表示。当出现此种情况,即受试肽有一个氨基和/或羧基端基加入或除去时(此类肽上发现的标准氨基-和乙酰基-阻断基则除外),此类变型会标明。
图5A:测试肽名右边紧挨着的一栏标明了测试肽的大小,并指出该肽是否由一个氨基酸肽“移行”(walk)过所述的DP178区衍生而来。右边再过去一栏标明了测试肽是否会有点突变,而该栏右边一栏标明DP178衍化的氨基酸序列是否加入或去除某些氨基酸残基。
图5B:测试肽名右边紧挨着的一栏标明该肽是否为DP178的片断,右边过去一栏指明该肽是否含有点突变,再往右一栏标明该肽是否含有从DP178序列本身加入或去除去的某些氨基酸。
图5C:测试肽名右边一栏标明该肽是否含有点突变。而它右边一栏则标明DP178序列本身是否加入或除去氨基酸残基。
图6:DP107和DP107gP41区截断肽的抗病毒数据。如图5C定义的IC50,采用纯化的肽已获得IC50的值,而标有星号(*)者除外,因为在这种情况下,IC50是由原肽制剂获得的。
图7:猴免疫缺陷病毒(SIV)TM(融合)蛋白DP178-类区的抗病毒数据。“NT”表示未测试。
5.本发明的详细描述
本发明涉及哺乳动物(包括人)HIV感染的治疗方法,该方法包括给予有效量的DP-107,DP-178或它们的一种药学上可接受的衍生物和至少一种有效量的其它治疗剂。最好这种治疗剂是另外一种抗病毒剂。
本方法提供了一种治疗病毒性感染,尤其是HIV感染的改良方法。必须特别指出的是,本发明提供了一种治疗HIV感染的协同组合,它包括有效量的DP-178,DP-107或它们的药学上可接受的衍生物和至少一种可用于治疗病毒性疾病的抗病毒化合物。DP-178,DP-107或一种药学上可接受的衍生物最好与逆转录病毒抑制剂,病毒蛋白酶抑制剂,细胞活素或细胞活素抑制剂,或病毒融合抑制剂联合使用。一名患者接受了本发明的联合疗法,对其足量给药以抑制病毒活性,抑制病毒表达,或抑制病毒传播。
本发明的方法包括联合疗法,即DP-178,DP107和至少一种其它的治疗剂或者同时使用(如作为一种混合物,或分开但同时使用);或者按先后次序(包括周期疗法)使用。周期疗法涉及在一段时间内给予第一种抗病毒化合物,随后在另一段时间内给予第二种抗病毒化合物并重复这种给药次序(即周期),以减轻对所述疗法之一产生的耐药性。本发明还涉及周期疗法,该疗法包括给予本发明的第一种肽后,再给予另一种抗病毒剂,然后给予本发明的又一种肽等等,即将所述的两种病毒融合抑制剂DP-107和DP-178或其衍生物与其它抗病毒剂联合使用。本发明还包括所述肽的联合使用,如DP-107和DP-107的联合使用。
给予DP-178,DP-107或一种药学上可接受的衍生物和一种或多种治疗剂的“联合疗法”既包括两种治疗剂可作为一种治疗混合物一起使用,也包括两种治疗剂可分开给予但同时使用,如经过不同的静脉途径进入同一个体。“联合疗法”还包括分开给药,即先给一种药物,再给第二种药物。
本申请人的新疗法涉及将抑制病毒融合和病毒在细胞与细胞之间的传播的肽与另一种治疗剂联合使用。不受理论的限制,本发明部分是建立在这种信念上,即相信HIV从感染的第一天起,就一天24小时不停地复制。因此,在病毒感染的不同阶段采用抗病毒剂治疗是有益的。
本文公开的联合疗法首次提出了把作用于病毒感染初期阶段的病毒融合抑制剂与具有不同作用目标的抗病毒剂结合使用。
DP-178和DP-107作用的部位在病毒表面,它防止来自感染宿主细胞的游离病毒和细胞与细胞之间的病毒传播。因此,不受理论的限制,申请人相信DP-178或DP-107与一种或多种具有不同作用靶向或不同作用机理的药物联合使用可提供相加作用或协同作用。本发明的联合疗法具有药物用量较小,较低毒性的浓度的特点。联合疗法不仅可减少药物达到抗病毒活性所需的有效剂量,从而降低了它的毒性,而且还由于通过多种机制攻击病毒而提高了绝对的抗病毒效果。最后,本发明的联合疗法也提供了一种防止或减轻产生病毒耐药性机会的手段。
与DP-178和/或DP-107联合使用的优选的治疗剂包括(但不限于此)五种不同的攻击病毒的模式:抑制逆转录酶,抑制病毒mRNA封端,抑制HIV蛋白酶,抑制蛋白糖基化,及抑制病毒融合。采用这些攻击模式的药物包括(但不限于此):抗病毒剂:如细胞活素,比如rIFNo,rIFNβ,rIFNγ;逆转录酶抑制剂:如AZT,3TC,D4T,ddI,及双脱氧氟代核苷;病毒mRNA封端抑制剂:如病毒唑;HIV蛋白酶抑制剂:如ABT-538和MK-639;两性霉素B,作为一种脂结合分子而具有抗HIV活性;及锥栗精胺,作为一种糖蛋白加工的抑制剂。
5.1.用DP-178或DP-107治疗HIV
5.1.1.DP-178和DP-107肽
DP-178或DP-107为通过抑制病毒融合而表现出强有力的抗病毒活性的肽。这些肽包括DP-178(一种gP41衍化的36氨基酸肽)DP-178的片断和/或类似物,及与DP-178类似的肽。此外,这些肽还包括可表现出抗病毒活性且与DP-107(一种38氨基酸肽)类似的肽,这些肽与HIV-1LAI横跨膜gP41蛋白的残基558-595一致,并存在于其它包膜病毒蛋白中。本发明的肽用作非人和人逆转录病毒,特别是HIV传播的抑制剂,其细节在本文和美国专利中均有描述(美国专利连续申请号,08/073028,申请日期为1993年6月7日;美国专利连续申请号08/264531,申请日为1994年6月23日;美国专利连续申请号08/255208,申请日为1994年6月7日;美国专利连续申请号08/360107,申请日为1994年12月20日;美国专利连续申请号08/374666,申请日为1995年1月27日;美国专利连续申请号08/470896,申请日为1995年6月6日;及美国专利连续申请号08/485264,申请日为1995年6月7日)在此,作为一个整体结合在本发明中作为参考。
尽管不受任何药效理论的限制,然而,提出了下列模式用以解释DP-178的有效力的抗-HIV活性。在病毒蛋白中,gP41,DP-178与位于gP41外区C-端的公认的α-螺旋区一致,且似乎和gP41上的远侧部位有关,它的相互作用的结构受亮氨酸链状切口(motif)(一种盘管状螺旋结构)的影响,一般称作DP-107。这两区的联系反映了分子键或“分子扣环”直接参与了融合过程。亮氨酸链状切口可能参与了膜的融合,而C-端α-螺旋的切口作为一种分子安全装置在病毒导致的膜融合过程中调节亮氨酸链的可利用性。
合成的如DP-107和DP-178这样的肽将成为HIV感染和融合的强有力的抑制剂,这很可能与它们能和病毒的gP41形成复合物并干扰它的融合过程有关;例如在病毒蛋白由天然结构向融合状态的结构转换过程中,所述的DP-107和DP-178肽可到达它们各自在病毒的gP41上的结合部位,并发挥一种破坏作用。
与gP41外区(含DP-107和DP-178区)一致的截断的重组gP41蛋白(gP41的融合肽,横跨膜区和细胞质区除外)不能抑制HIV-1导致的融合。然而,当将单个突变体导入,以破坏DP-107区的盘管螺旋状结构—一种引起DP-107肽生物学活性全部丧失的突变-无活性的重组蛋白则转换成有活性的HIV-1诱发融合的抑制剂。这种转换是由有效力的DP-178区从亮氨酸链区(即DP-107区)的分子扣环上脱出而引起的。
本发明的DP-178肽与来自HIV-1LAI株的横跨膜蛋白gP41的氨基酸残基638-673一致,且有36个氨基酸序列(从氨基端到羧基端读出如下):
NH2-YTSLIHSLIEESQNQQFKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID:1)
DP-178在本申请人的共同未决的美国专利申请(连续申请号为08/470896,申请日为1995年6月6日;申请号:08/374666,申请日:1995年1月27日;申请号:08/264531,申请日:1994年6月23日;申请号:08/255208,申请日:1994年6月7日)中已有描述,在此结合到本发明中作为参考。
除了全长DP-178(SEQ ID:1)36链节,本发明所述的肽可包括显示抗病毒活性的DP-178肽(SEQ ID:1)的截断部分。这种截断的DP-178(SEQ ID:1)肽可包括含3-36个氨基酸残基的肽(即肽的大小范围在三肽至36链节多肽之间),而且还包括(但不限于此)下文表I和表II列出的那些肽。这些表中的肽序列按从氨基端(左边)到羧基端(右边)排列。“X”代表一个氨基(-NH2),而“Z”代表一个羧基(-COOH)。另外,如同下面表述的那样,“X”和/或“Z”可代表一个疏水基团,一个乙酰基,一个FMOC基团,一个酰氨基,或一个共价键连结的大分子。
DP-107为一种38个氨基酸,与HIV-1LAI横跨膜(TM)gP41蛋白的残基558-595一致,能表现出有效力的抗病毒活性。DP-107为一种HIV-1-衍化的抗病毒肽,在其它非-HIV-1包膜病毒中也有发现。DP-107在本申请人共同未决的美国专利申请(连续申请号:08/470896,申请日:1995年6月6日;申请号:08/374656,申请日:1995年1月27日;申请号:08/2645 31,申请日:1994年6月23日;申请号:08/255208,申请日:1994年6月7日)中已有较全面的描述,在此结合到本发明中作为参考。
DP-107或DP-178截断物的缺失部分也在本发明的范围内。这些缺失部分由从DP107或像DP107的肽序列去除一个或多个氨基酸组成,而生成的肽序列长度的下限为4-6个氨基酸。这些缺失物可能涉及肽序列的一个单一的相邻部分或多个独立的部分。一个或多个这样的缺失物可被导入DP107或DP107的截断物中,只要这些缺失物产生的肽仍可为本文描述的107X178X4,ALLOMTI5或PLZIP搜索切口所识别,或者要么表现出抗融合或抗病毒活性,要么表现出调整涉及盘管螺旋状肽结构的细胞内过程的能力。
DP107和DP107截断物在本申请人的共同未决的美国专利申请(连续申请号为08/374666,申请日为1995年1月27日)中已有较全面的描述。在此结合到本发明中作为参考。
表I
DP-178(SEQ ID:1)羧基截断物X-YTS-ZX-YTSL-ZX-YTSLI-ZX-YTSLIH-ZX-YTSLIHS-ZX-YTSLIHSL-ZX-YTSLIHSLI-ZX-YTSLIHSLIE-ZX-YTSLIHSLIEE-ZX-YTSLIHSLIEES-ZX-YTSLIHSLIEESQ-ZX-YTSLIHSLIEESQN-ZX-YTSLIHSLIEESQNQ-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQ-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQE-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEK-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKN-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNE-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
使用单字母氨基酸代码。
附:
“ X”可代表一个氨基,一个疏水基团,包括(但不限于此)苄氧羰基,丹酰,或T-丁氧羰基,一个乙酰基,一个9-芴基甲氧羰基(FMOC),一个大分子载体基包括(但不限于)脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二醇,或碳水化物。
“Z”可代表一个羧基;一个氨基;一个T-丁氧羰基;一个大分子载体基包括(但不限于)脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二醇,或碳水化物。
表II
DP-178(SEQ ID:1)氨基截断物
X-NWF-Z
X-WNWF-Z
X-LWNWF-Z
X-SLWNWF-Z
X-ASLWNWF-Z
X-WASLWNWF-Z
X-KWASLWNWF-Z
X-DKWASLWNWF-Z
X-LDKWASLWNWF-Z
X-ELDKWASLWNWF-Z
X-LELDKWASLWNWF-Z
X-LLELDKWASLWNWF-Z
X-ELLELDKWASLWNWF-Z
X-QELLELDKWASLWNWF-Z
X-EQELLELDKWASLWNWF-Z
X-NEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-KNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-EKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-QQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-NQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-EESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-IEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-LIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-SLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-IHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
使用单字母氨基酸代码。
附:
“X”可代表一个氨基;一个疏水基团,包括(但不限于)苄氧羰基,丹酰,或T-丁氧羰基;一个乙酰基;一个9-芴基甲氧羰基;一个大分子载体基包括(但不限于)脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二醇,或碳水化物。
“Z”可代表一个羧基;一个氨基团;一个T-丁氧羰基;一个大分子载体基包括(但不限于脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二-醇,或碳水化物。
5.1.2 DP-178和DP-107类似物和同系物
本发明的抗病毒肽也包括DP-178类似物和/或DP-178截断部分,它们包括(但不限于)含有DP-178(SEQ ID:1)序列,或DP-178截断的序列,含有一个或多个氨基酸取代物,插入物和/或缺失物的肽。下文将叙述的DP-178同系物的类似物也包括在本发明的范围内。本发明的DP-178类似物显示出抗病毒活性,而且还具有另外的优点,例如像增加生物利用率,和/或稳定性,或降低宿主的免疫识别。
HIV-1和HIV-2包膜蛋白结构不同,但在HIV-1和HIV-2的DP-178对应区内存在着一种明显的氨基酸保护作用。氨基酸保护具有周期性特点,提示有一些结构和/或功能的保护。因此,有一类氨基酸取代物可能包括那些氨基酸的改变,推测那些改变可稳定本发明的DP-178肽的结构。
氨基酸取代物具有保护或非保护性质。保护性的氨基酸取代物由具有类似电荷、大小,和/或疏水特性的氨基酸去取代DP-178(SEQID:1)肽序列的一个或多个氨基酸所组成,例如,像从谷氨酸(E)到天门冬氨酸(D)的氨基酸取代。当只制得保护性取代物时,生成的肽在功能上与DP-178(SEQ ID:1)或由DP-178衍生的DP-178肽等价。非保护性取代物由具有不同电荷,大小,和/或疏水特点的氨基酸取代DP-178(SEQ ID:1)肽序列的一个或多个氨基酸所组成,例如,像从谷氨酸(E)到缬氨酸(V)的取代。
氨基酸插入物可由单个氨基酸残基或范围为2-15个氨基酸长度的残基段组成。一个或多个插入物可以被导入DP-178(SEQID:1),DP-178片断,类似物和/或DP-178同系物中。
DP-178(SEQ ID:1),DP-178片断,类似物,和/或DP-178同系物的缺失物也包含在本发明范围内。这类缺失物由从DP-178或DP-178类肽序列中除去1个或多个氨基酸所组成,而生成的肽序列长度的下限为4-6个氨基酸。这类缺失物可能涉及所述的肽序列的单个相邻部分或多个独立的部分。
本发明的肽还进一步包括DP+178(SEQ ID:1)的同系物和/或表现出抗病毒活性的DP-178的截断物。这类DP-178同系物为肽类,其氨基酸序列由其它病毒(即非HIV-1LAI)肽区的氨基酸序列构成,且与衍化出DP-178(SEQ ID:1)的gP41肽区一致。这些病毒可以包括(但不限于)其它的HIV-1株和HIV-2株。由其它HIV-1(即非HIV-1LAI)株的对应的gP41肽区衍化的DP-178同系物可包括如下肽序列:NH2-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(DP-185;SEQID:3);NH2-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-COOH(SEQ ID:4);NH2-YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID:5)。SEQ ID:3(DP-185),SEQ ID:4,及SEQ ID:5分别由HIV-1SF2,HIV-1RF,及HIV-1MN株衍化而来。下划线的氨基酸残基指与所述的DP-178(SEQ ID:1)肽对应位置的残基不同的那些残基。所述DP-178的一个同系物—DP-185(SEQ ID:3)在下文第6节提到的工作实例中将有描述,并证实DP-185(SEQ ID:3)能表现出抗病毒活性。本发明的DP-178同系物也包括截断物,氨基酸取代物,插入物,和/或缺失物,如同上文描述的那样。
此外,如图1所示,HIV-1和HIV-2株与DP-178系列对应的区之间存在着明显的相似性。由所述的HIV-2NIHZ株衍化的一种DP-178同系物具有36个氨基酸组成的序列(从氨基端到羧基端读出)如下:NH2-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-COOH(SEQ ID:7)
表III和表IV列出了HIV-2NHZ DP-178同系物的一些可能的截断物,它们由3-36个氨基酸残基的肽组成(即肽的大小范围从一个三肽至36链节的多肽)。这些表中列出了从氨基端(左边)到羧基端(右边)的肽序列。“X”可代表一个氨基(-NH2),“Z”代表一个羧基(-COOH)。如下文所述,“X”和/或“Z”可替换着代表一个疏水基团,一个乙酰基,一个FMOC基,一个氨基,或一个共价结合的大分子。
表III
HIV-2NHZ DP-178同系物羧基截断物X-LEA-ZX-LEAN-ZX-LEANI-ZX-LEANIS-ZX-LEANISQ-ZX-LEANISQS-ZX-LEANISQSL-ZX-LEANISQSLE-ZX-LEANISQSLEQ-ZX-LEANISQSLEQA-ZX-LEANISQSLEQAQ-ZX-LEANISQSLEQAQI-ZX-LEANISQSLEQAQIQ-ZX-LEANISQSLEQAQIQQ-ZX-LEANISQSLEQAQIQQE-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEK-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKN-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNM-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMY-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYE-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYEL-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQ-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQK-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLN-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSW-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWD-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDV-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFT-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTN-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNW-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
采用单字母氨基酸代码。
此外,
“X”可代表一个氨基,一个疏水基团,包括(但不限于)苄氧羰基,丹酰,或T-丁氧羰基;一个乙酰基;一个9-芴基甲氧羰基(FMOC);一个大分子载体基包括(但不限于)脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二醇,或碳水化物。
“Z”可代表一个羧基,一个氨基;一个T-丁氧羰基;一个大分子载体基包括(但不限于)脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二醇,或碳水化物。
表IV
HIV-2NHZ DP-178同系物氨基截断物
X-NWL-Z
X-TNWL-Z
X-FINWL-Z
X-VFTNWL-Z
X-DVFTNWL-Z
X-WDVFTNWL-Z
X-SWDVFTNWL-Z
X-NSWDVFTNWL-Z
X-LNSWDVFTNWL-Z
X-KLNSWDVFTNWL-Z
X-QKLNSWDVFTNWL-Z
X-LQKLNSWDVFTNWL-Z
X-ELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-YELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-MYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-NMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-KNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-EKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-IQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-AQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-EQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-LEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-SLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-SQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-ISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-NISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-ANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-EANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKINSWDVFTNWL-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
采用单字母氨基酸代码。
此外,
“ X”可代表一个氨基,一个疏水基团,包括(但不限于)苄氧羰基,丹酰,或T-丁氧羰基;一个乙酰基;一个9-芴基甲氧羰基(FMOC);一个大分子载体基包括(但不限于)脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二醇,或碳水化物。
“Z”可代表一个羧基;一个氨基;一个T-丁氧羰基;一个大分子载体基包括(但不限于)脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二醇,或碳水化物。
5.1.3.DP-178和DP-107的制备
本发明的肽可用该领域熟知的技术合成或制备。如参看(reighton,1983,蛋白质:结构和分子原理,W.H.Freeman and Co.,NY,在此结合到本发明中作为参考。例如,短肽能在一种固体载体上或在溶液中合成。较长的肽能用重组DNA技术制得。编码本发明的肽的核苷系列可用该领域内普通技术人员熟知的技术合成和/或克隆,及表达。如参看Sambrook等人:分子克隆,A Laboratory Manual Vols.1-3,ColdSpring Harbor Press,NY.(1989)。
本发明的肽可以以一个或者多个联接肽的氨基酸残基的键为非肽键替换合成。这些替换的非肽键可利用为该领域技术人员所公知的反应形成,且可以包括(但不限于)亚氨基,酯,酰肼,氨基脲,及偶氮键等。在本发明的另一实施例中,含以上描述的序列的肽可利用存在于其氨基和/或羧基端的其它化学基团来合成,这样可增加这些肽的稳定性,生物利用率,和/或抑制活性等。例如,疏水基团像苄氧羰基,丹酰,或T-丁氧羰基可以加到肽的氨基端上。同样地,一个乙酰基或9-芴基甲氧羰基也可被置于肽的氨基端上。(参看上文表I至表IV的“X”)另外,所述疏水基团。t-丁氧羰基,或一个氨基也可加到肽的羧基端。(参看文表I至表IV中的“Z”)。而且,本发明的肽也可通过改变它们的空间构型而合成。例如,可使用肽的一个或多个氨基酸残基的D-异构体,而非通常的L-异构体。而且还进一步,本发明的肽的至少一个氨基酸残基可用一个公知的非自然存在的氨基酸残基取代。这些改变有助于增加本发明所述肽的稳定性,生物利用率和/或抑制活性。
此外,上文描述的任何肽可以有一个共价地连接在它们的氨基和/或羧基端上的非肽大分子载体基。例如,这些大分子载体基可包括脂质-脂肪酸轭合物,聚乙二醇,或碳水化物。DP-178和DP-107的截断物,类似物和同系物在本申请人的共同未决的申请中已有全面描述(申请号:08/073028,申请日:1993年6月7日;申请号:08/264531,申请日:1994年6月23日;申请号:08/255208,申请日:1994年6月7日;和申请号:08/360107,申请日:1994年12月20日),在此结合在本发明中作为参考。
5.1.4.本发明肽的治疗用途
本发明所述的DP-178(SEQ ID:1)肽,及DP-178片断,类似物,和同系物表现出有效力的抗病毒活性。本发明的DP-107类和DP-178类的肽优选表现出抗病毒活性。因此,所述的肽可以用作人和非人病毒和逆转录病毒,特别是HIV对未感染细胞传播的抑制剂。
用本发明的肽可抑制人逆转录病毒的传播,这些逆转录病毒包括(但不限于)HIV-1和HIV-2的所有病毒株以及人T-淋巴细胞病毒(HTLV-I和II)。本发明的肽可抑制非人逆转录病毒的传播,这些非人逆转录病毒包括(但不限于)牛造白细胞组织增生病毒,猫肉瘤和白血病病毒,猴免疫缺陷症、肉瘤和白血病病毒及羊进行性肺炎病毒。
本发明的肽可抑制非逆转录病毒的传播,这些非逆转录病毒包括(但不限于)人呼吸道合胞病毒,犬瘟热病毒,新城病病毒,人副流感病毒,及流感病毒。
本发明还进一步包括在联合疗法中使用所述的肽治疗上述的逆转录病毒和非逆转录病毒。
5.2用在DP-178或DP-107的联合
使用中的抗病毒剂
根据本发明所述,DP-178或DP-107(一种病毒融合抑制剂)可与其它治疗剂联合使用以增强其可达到的抗病毒效果。优选将DP-178或DP-107与其它抗病毒剂结合使用。这类可与DP-178或DP-107一起使用的其它抗病毒剂包括(但不限于):作用于与病毒复制有关的不同靶分子的药物,如逆转录酶抑制剂,病毒蛋白酶抑制剂,糖基化抑制剂;作用于与病毒传播有关的不同靶分子的抗病毒剂;作用于同一分子的不同位点的抗病毒剂;以及预防或降低病毒耐药性发生的抗病毒剂。本领域的技术人员将了解能表现上述活性模式的各种抗病毒治疗剂。
所述的DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物也可以与逆转录病毒抑制剂如核苷衍生物联合使用。核苷衍生物为嘌呤和嘧啶核苷的改良型,它们为RNA和DNA的构成阻断剂。正在研究中的许多核苷衍生物作为潜在的抗-HIV治疗剂可在整个基因组转录之前即提前终止病毒DNA复制。这些衍生物缺乏能结合到后成的核苷上的3’取代基,从而造成链的终止。核苷衍生物如3’叠氮基-3’-胸苷(AZT)和双脱氧肌苷(ddI)在体外和体内均用作HIV-1复制的抑制剂。核苷类似物是目前唯一批准的治疗HIV感染和AIDS的药物(Fischl et al,1987 N.Engl.J.Med.317,185-191;Mitsuya and Broder,1987,Nature,325,773-778)。这类化合物通过抑制逆转录酶引起cDNA合成的阻断而发生作用(Mitsuya and Broder,1987);这些抑制剂在HIV-1的感染周期的初期起作用并抑制其被结合进T-细胞基因组。然而,叠氮胸苷治疗导致耐药HIV株的产生(Larder 1989,1991,Ibid.)并使长期治疗的AIDS病人出现毒性作用(Fischl et al.1987,N.Engl.J.Med.317:185-191;Creagh-Kirk,et al.,1988,J.A,M.A.260:3045-3048)。
而且,所述的DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物可与核苷衍生物联合使用,这些核苷衍生物包括(但不限于)2’,3’-二脱氧腺苷(ddA);2’,3’-二脱氧鸟苷(ddG);2’,3’-二脱氧肌苷(ddI);2’,3’-二脱氧胞苷(ddC);2’,3’-二脱氧胸苷(ddT);2’,3’-二脱氧-二脱氧胸苷(d4T)和3’-叠氮基-2’,3’-二脱氧胞苷(AZT)。另外也可选择使用卤代核苷衍生物,优选2’,3’-二脱氧-2’-氟代核苷类包括(但不限于):2’,3’-二脱氧-2’-氟代腺苷;2’,3’-二脱氧-2’-氟代肌苷;2’,3’-二脱氧-2’-氟代胸苷;2’,3’-二脱氧-2’-氟代胞苷;和2’,3’-二脱氧-2’,3’-二脱氢-2’-氟代核苷类包括(但不限于):2’,3’-二脱氧-2’,3’-脱氢-2’-氟代胸苷(Fd4T)。优选本发明的2’,3’-二脱氧-2’-氟代核苷类为氟键在β构型上的核苷类,包括(但不限于):2’,3’-二脱氧-2’-β-氟代腺苷(F-ddA),2’,3’-二脱氧-2’-β-氟代肌苷(F-ddI),及2’,3’-二脱氧-2’-β-氟代胞苷(F-ddC)。这类组合允许使用较低剂量的核苷衍生物,因而降低了其毒性,且不失去因使用抗病毒肽产生的抗病毒活性。此外,该组合降低或避免了病毒耐药性。
本发明范围内的抗病毒肽和核苷衍生物的优选的组合包括有效量的DP-107,DP-178或其药学上可接受的衍生物和有效量的AZT,用以治疗HIV感染;也包括有效量的DP-107,DP-178或药学上可接受的衍生物和有效量的ddI。
根据本发明所述,DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物也可与尿苷磷酸化酶抑制剂联合使用,这类抑制剂包括(但不限于)无环尿苷化合物,包括苄基无环尿苷(BAU);苄氧基苄基无环尿苷(BBAU);氨甲基苄基无环尿苷(AMBAU);氨甲基苄氧基苄基无环尿苷(AMB-BAU);羟甲基苄基无环尿苷(HMBAU);及羟甲基苄氧基苄基无环尿苷(HMBBAU)。
根据本发明所述,DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物也能和细胞活素或细胞活素抑制剂联合使用,包括(但不限于):rIFNα,rIFNβ,rIFNγ,TNFα抑制剂,及MNX-160。人r干扰素-αA(>108 IU/mg)和r干扰素γ(1.4×108 IU/mg)可从HoffmanLaRoche处获得。人rIFNβ Ser 17(1.0×108 IU/mg)可从TritonBiosciences处获得。参考标准物可从以下单位获得:世界卫生组织(人IFNα WHO标准B,69,19和人IFNβ,WHO号:G-023-902-527)或国家过敏性和感染性疾病研究所(人r-干扰素,国家卫生所号:G-023-901-530)。
根据本发明所述,DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物可与病毒蛋白酶抑制剂包括(但不限于)Mk-639(Merck),Invirase(Saquinavir,Roche),ABT-538(Abbott,CAS Reg.No.155213-67-5),AG1343,VX0478(Burroughs Wellcome/Glaxo,CAS Reg.No.16184-49-9),DMP450,SC-52151(Telinavir)联合使用。一般认为蛋白酶抑制剂主要是在病毒装配期间或之后(即病毒芽生)起作用,以抑制病毒体发育到成熟的感染状态。例如,ABT-538在体外已显示出有效力的抗病毒活性,在体内显示出满意的药代动力学和安全性特征(Ho,et al.,1995,Nature 373:123-126)。对AIDS患者给ABT-538可引起血浆HIV-1水平呈指数下降和CD4淋巴细胞计数大大升高。病毒血症(plasma viraemia)随着ABT-538的治疗呈指数下降反映了游离病毒体的清除和因药物基本上阻断感染的新范围而引起的HIV-1感染细胞的丧失。ABT-538治疗减轻了病毒介导的CD4淋巴细胞的破坏。当把这种治疗与抑制HIV感染早期阶段和病毒融合的DP-178和/或DP-107联合使用时将可能产生协同作用并取得显著的临床效果。
DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物也能与干扰5’-mRNA过程的抗HIV药物如病毒唑(病毒唑(Virazole)来自ViratelInc)联合使用。虽然病毒唑的作用机理尚不清楚,但据认为该药在mRNA封端结构的形成上与鸟嘌呤竞争和/或干扰这些分子的功能性甲基化作用。这些病毒虽可逃脱DP-178和/或DP-107对病毒融合的抑制作用,但却被病毒唑阻断,因而显示出DP-178和/或DP-107和病毒唑抗HIV机制的协同作用。
此外,DP-178,DP-107或其药学上可接受的衍生物可与治疗剂如两性霉素B(Fungizone,由Gibro获得)联合使用,它为一种多烯microlide抗真菌抗生素,它与甾醇相互作用并与其发生不可逆性结合。两性霉素B代表独特的一类治疗剂,它能与多种脂包膜病毒,包括HIV发生抑制作用。尽管两性霉素在体内显示出严重毒性,但这种药物的甲酯形式却表现出抗HIV活性和在体外的低细胞毒性。因此,两性霉素B或它的甲酯可与DP-178,DP-107或其药学上可接受的衍生物联合使用。这种联合疗法允许临床医师使用一种较低(即较少毒性剂量的两性霉素B或它的甲酯,而不考虑其抗病毒活性的丧失,因为它是和抗病毒肽DP-178或DP-107联合使用的。
根据本发明所述,DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物也可与糖蛋白加工的抑制剂如锥栗精胺(Boehringer Mannheim)联合使用。锥栗精胺为一种抑制糖蛋白加工的植物生物碱,而显示出抗-HIV作用,因为HIV含有两个大的糖基化蛋白gP120和gP41。蛋白糖基化在gP120与CD4的相互作用上起重要作用。在锥粟精胺存在下合成的子代病毒体感染的条件下,其HIV的感染性减弱。因此DP-178,DP-107或其药学上可接受的衍生物与锥粟精胺联合使用可产生协同作用以抑制病毒的侵入,因而减弱感染。
治疗HIV的方法中,优选的组合疗法包括:使用有效量的DP-107,DP-178或其药学上可接受的衍生物和有效量的ddI;使用一种有效量的DP-107,DP-178或其药学上可接受的衍生物和有效量的3TC;以及使用有效量的DP-107,DP-178或其药学上可接受的衍生物和有效量的病毒唑。
治疗HIV的方法中,更优选的联合疗法包括使用有效量的DP-107,DP-178或其药学上可接受的衍生物和有效量的β-干扰素。
用于治疗HIV的方法中,另外的一种联合疗法包括使用有效量的DP-107,DP-178或其药学上可接受的衍生物和一种有效量的蛋白酶抑制剂。
为了评价DP-178,DP-107或其药学上可接受的衍生物与上文描述的抗病毒治疗剂联合使用的潜在的治疗效果,可用这一领域内周知的方法对这些组合疗法进行测试。例如,一种DP-178和AZT联合使用抑制HIV细胞毒性,合胞体形成,逆转录酶活性,或病毒RNA或蛋白生成的能力可在体外测试,如实施例6所述。
5.2.1抑制HIV的联合疗法的治疗用途
如上文描述的改进的或协同的DP-178或DP-107联合治疗可根据本发明在体内使用,以防止合胞体的形成和HIV病毒体的产生,从而抑制受试患者体内HIV的发展。本发明的联合疗法对缓解或治疗与HIV-感染的免疫抑制病人相关的疾病也是有用的。例如,抗病毒肽DP-178,DP-107或其药学上可接受的衍生物与抗真菌剂,抗病毒剂可合并用于抑制HBV,EBV,CMV,及其它的机遇性感染(包括TB)。
本发明的抗病毒肽DP-178,DP-107或其药学上可接受的衍生物最好用于抑制HIV感染。联合疗法的有效剂量可如下文所述在适宜的药物载体中进行配制并按任何适宜的途径给药,包括(但不限于):注射(如静脉注射、腹膜注射、肌肉注射、皮下注射等);上皮或粘膜内吸收(如口腔粘膜,直肠和阴道上皮,鼻咽部粘膜,肠道粘膜等);口服,透皮或任何其它的药学领域可使用的途径。
5.3.药物制剂,剂量和给药形式
5.3.1药用组合物
本发明用于治疗或预防人病毒性感染的药用组合物含有作为活性剂的DP-178,DP-107或其药学上可接受的衍生物和至少一种其它的治疗剂如另一种抗病毒剂。本发明的药用组合物提供了可产生加合和/或协同效果的联合疗法。
优选所述药用组合物含有DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物,还含有至少一种其它的抗病毒剂如逆转录酶抑制剂,蛋白酶抑制剂,mRNA加工的抑制剂,蛋白糖基化作用的抑制剂和病毒融合的抑制剂。这类治疗剂包括(但不限于)核苷类似物或链终止剂(如二脱氧核苷)。
在本发明范围内的可与DP-178或DP-107或其药学上可接受的衍生物联合使用的其它适宜的治疗剂包括(但不限于)2-脱氧-D-葡萄糖(2-dGlc)、脱氧野尻霉素,无环鸟苷,病毒唑(virazole)利福平(rifadin),金刚烷胺、rifabutine,更昔洛韦(ganciclover)、(DHPG)、氟化碘化阿糖胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、碘苷、三氟胸腺嘧啶核苷、阿糖腺苷(ara-A)、ara-AMP、溴乙烯基去氧尿苷、溴乙烯阿糖尿嘧啶(BV-aral),由Bristol-Meyers Squibb生产(1-β-D-阿糖呋喃糖苷-E-5-[2-溴乙烯基〕尿嘧啶)),金刚乙胺,苯己庚二酮、二芳基脒,(s)-(对硝基苄基)-6-硫代肌苷和膦酰基甲酸盐。
本发明所包括的新的药用组合物包括(但不限于)DP-178,DP-107或一种药学上可接受的衍生物和利福平(rifadin);DP-178或DP-107和AZT;DP-178或DP-107和ddI;DP-178或DP-107和ddC;DP-178或DP-107和金刚烷胺;DP-178或DP-107和无环鸟苷;DP-178或DP-107和Z-脱氧-D-葡萄糖;DP-178或DP-107和脱氧野尻霉素;DP-178或DP-107和α-干扰素及DP-178或DP-107和更昔洛韦。本发明包括含有DP-178或DP-107,或一种药学上可接受的衍生物,和随意选择一种以上的其它治疗性化合物的药用组合物。
本发明的肽也可用本领域技术人员熟知的技术给药。这些药物最好系统配制及给药。配制和给药方法的技术在“Remington’sPharmaceutical Science”一书中可以发现(18版,1990,Mack PublishingCo.,Easton,PA)。适宜的途径可包括口腔,直肠,透膜,或肠道给药;胃肠外给药,包括粘膜内,皮下,髓内注射,以及鞘内,直接心室内,静脉内,腹膜内,鼻内,或眼内注射,仅仅列举这些。最好的给药方式为静脉。为适于注射,本发明的药物可以配成水溶液,最好为生理相容的缓冲液,如Hanks’溶液,Ringer’s溶液,或生理盐水缓冲液。对于透膜给药,制剂中应使用适于穿透屏障的渗透剂。这些渗透剂是该领域内普遍知道的。
此外,所述的肽也可用于先前未曾感染而急性暴露于一种HIV病毒的个体作为一种预防性措施。所述肽的这种预防性使用的实例包括(但不限于)病毒母婴传播的预防和其它一些存在HIV传播可能性的固定场所,如卫生保健部门的事故;像卫生工作者暴露于HIV污染的血制品下。在这样的情况下,本发明的肽可以起到预防性疫苗的作用,其中宿主将产生针对本发明的肽的抗体,通过如抑制HIV的进一步感染以中和HIV病毒。因此,本发明的肽用作预防性疫苗的实施方案包括给予宿主一定浓度的有效肽以产生足够中和HIV的免疫应答,如抑制HIV感染细胞的能力。精确的浓度取决于所给予的特异性肽,但也可使用这一领域内普通技术人员熟知的标准技术来测定免疫应答的产生。用作疫苗的肽通常肌注给药。
所述的肽可和适宜的添加剂配在一起以增强免疫学应答。这类添加剂包括(但不限于)矿物质凝胶如氢氧化铝;表面活性物质如溶血卵磷脂,普卢龙尼克(pluronic)多元醇,聚阴离子;其它肽类;油乳剂;以及其它潜在的人用添加剂如卡介苗(BCG)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。许多方法可用来引入本文描述的疫苗制剂中。这些方法包括(但不限于)口服,皮内,肌内,腹膜内,静脉,皮下和鼻内途径。
本发明给予肽的有效剂量可用该领域内技术人员所周知的方法,如设置一些参数像生物半衰期,生物利用率,及毒性来确定。下文第6节给出了一些数据,如已证实DP-178在体内达到有效剂量所需的循环血液水平为10ng/ml的肽。
5.3.2剂量
在治疗患有病毒感染的哺乳动物(包括人)时,必须给予病人有效治疗量的DP-178,DP-107或一种药学上可接受的衍生物,即给予足以抑制病毒复制的量。例如,将DP-178或DP-107按大约每天0.1-1.0mg/kg的剂量输注,持续12周。优选的剂量为20-35mg;根据体表面积得出的DP-178或DP-107或其一种药学上可接受的衍生物的等效日剂量约为7-70mg。最优选的剂量大约为20mg-35mg,大约持续12周。DP-178,DP-107或一种药学上可接受的衍生物给药剂量的间隔约为每天一次到四次,最好是每两天一次到每天一次。给药的最佳剂量是使DP-178,DP107或其一种药学上可接受的衍生物的血浆峰浓度达到1mg/ml-10mg/ml。这点可通过将缓冲盐水中成分配制成2.0%的无菌注射液(为化学领域内技术人员熟知的任何适宜的盐溶液均可使用)而做到。通过连续输注通过HPLC测定血浓度确定量的DP-178或DP-107,可以维持所需的血浓度。
与DP-178,DP-107或其一种药学上可接受的衍生物联合使用的治疗剂如抗病毒剂的有效剂量是以该领域技术人员熟知的各种抗病毒剂的推荐剂量为基础的。例如,叠氮胸苷(AZT),2’,3’-二脱氧肌苷(ddI)和β干扰素的剂量可在标准临床医师参考书中找到。此外,其它治疗剂包括抗病毒剂的剂量在文献中已有报道,例如,ABT-538为口服给药,第一天为600-1200mg/天,以后每天一次(Ho,etal.,1995,Nature 373:123-126)。在测试了这些剂量与DP-178,DP-107或一种药学上可接受的衍生物联合使用的有效性后,这些推荐的或公知的剂量优选比使用下面第5.4节描述测定方法,检验组合物形成的DP-178,DP-107或药学上可接受的衍生物的剂量的有效性,所确定的剂量低10%-50%。必须注意到,当出现毒性反应,骨髓,肝或肾功能不全或严重的药物与药物间的相互作用时,临床医生应知道如何和何时终止,中断或调整药物至较低剂量。相反,如果临床反应不够充分(出现毒性除外),临床医生也应知道如何调整治疗至较高的水平。
一个有效的治疗剂量是指该经合物的足以引起病人症状改善或存活期延长的用量。这类化合物的毒性和治疗效果可按标准药学程序经细胞培养或实验动物来确定,如确定半数致死量LD50(实验群体中有50%致死的剂量)和半数有效量ED50(实验群体中50%达到治疗有效果的剂量)。毒性和治疗有效果的剂量比率叫做治疗指数,它可用比率LD50/ED50表示。治疗指数大的化合物最好。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用来确定人的剂量使用范围。这类化合物的剂量最好位于这样一个循环血液的浓度范围内,即包括ED50且无毒性或毒性很低。根据使用的剂型和采用的给药途径,剂量可在此范围内变化。对于本发明方法使用的任何化合物而言,其治疗有效果剂量可从细胞培养测定中初步推出。剂量可从动物模型达到包含IC50(即与细胞培养确定的未治疗对照者比较,受试化合物达到感染细胞RT繁殖最大抑制量一半时的浓度)在内的循环血浆浓度范围推出。这些资料可用于较精确地确定人的使用剂量。例如,血浆中的浓度可用高效液相色谱(HPLC)测定。
5.4药物制剂和给药途径
含有DP-178,DP-107或一种药学上可接受的衍生物的药用组合物可直接给予病人,或在药用组合物中与适宜的载体或赋形剂混合使达到治疗病毒感染,特别是HIV感染的剂量。本申请的化合物制剂和给药技术可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(MackPublishing Co.,Easton,PA)的最新版本上发现。
如下文第6节举出的实例所示,本发明的肽的抗病毒活性可表现出一种显性(Pronounced type)和亚性(subtype)特异性,即特异的肽仅对抑制特异性的病毒活性有效。本发明的这种特征有许多优点。例如,有一个优点体现在诊断试剂领域,其中一项是可利用本发明的肽的抗病毒特异性来鉴别某一病毒分离株的类型。至于对HIV而言,一个优点就是可以很容易确定一个病毒分离株是否含有HIV-1或HIV-2株。例如,未感染的CD-4+细胞可以被一株鉴定为含HIV DP-178(SEQ ID:1)肽的分离株同时感染,此后可用上文5.2节中描述的技术对细胞上清液的逆转录病毒活性进行测定。那些逆转录病毒活性完全或几乎完全受到抑制的病毒分离株含HIV-1。而那些病毒活性未被改变或仅有少量减轻的病毒分离株可认为不含HIV-1。这类病毒分离株则可用本发明的一种或多种其它的DP-178肽进行处理,然后再测定其病毒活性,以鉴定该病毒分离株的类型。
使用药学上可接受的载体按本发明的方法将本文公开的混合物配制成适宜的剂型,以用于全身给药将包括在本发明范围内。正确选用载体和适当的生产工艺,可使本发明的组合物,特别是配成溶液的组合物,能通过胃肠外途径给药,如静脉注射。所述的化合物可采用该领域熟知的并且药学上可接受的载体配成适宜于口服给药的剂型。这类载体能使本发明的化合物配制成片剂,丸剂,胶囊,液体剂,凝胶,糖浆,淤浆剂和混悬剂等等,以方便接受治疗的病人口服摄入。
给药的适当途径可包括口腔,直肠,透膜,或肠道给药;胃肠外给药包括肌内,皮下,髓内注射,以及鞘内,直接心室内,静脉内,腹膜内,鼻内或眼内注射;透皮,局部用药,阴道等等。剂型包括(但不限于)片剂,锭剂;散剂,悬浮剂,栓剂,溶液,胶囊,霜剂,贴剂,微泵剂等等。
为方便起见,本发明使用的药用组合物可使用一种或多种含赋形剂和辅助剂(便利加工活性化合物)的生理学可接受的载体以常规方式配制成药学上可使用的制剂。合适的制剂取决于所选的给药途径。
为方便注射,本发明的治疗剂可配成水溶液,最好是生理上相容的缓冲液如Hanks’s溶液,Ringer’s溶液,或生理盐水缓冲液。对于透膜给药,制剂中应使用适于透过屏障的渗透剂,这些渗透剂是该领域内普遍熟知的。
口服给药的化合物可通过将活性化合物与该领域熟知的药学上可接受的载体结合而较方便地配制成。这类载体能将本发明的化合物配制成片剂,丸剂,糖衣丸,胶囊,液体剂,凝胶,糖浆,淤浆剂,悬浮剂等等。以方便接受治疗的病人口服摄入。药物的口服制剂可用固体赋形剂磨碎成均匀的混合物,再加工成颗粒,必要时加入适宜的辅助剂,制成片剂或糖衣片的片芯。适宜的赋形剂主要是填料如糖,包括乳糖,蔗糖,甘露醇,或山梨糖醇;纤维素制品剂如玉米淀粉,小麦淀粉,米淀粉,马铃薯淀粉,明胶,西黄蓍胶,甲基纤维素,羟丙基甲基纤维素,羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果必要,可以加入崩解剂,如交联聚乙烯吡咯烷酮,琼脂,或藻酸或其盐类如藻酸钠。
糖衣片芯应提供适当的包衣。为此目的,可采用浓缩糖溶液,溶液中可任意含有阿拉伯树胶,滑石,聚乙烯吡咯烷酮,carbopol凝胶,聚乙二醇和/或二氧化钛,硝基纤维素溶液,以及适当的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可加入到片剂或糖衣片的包衣中用以区别或标示活性化合物各剂量的不同的组合。
用于口服的药用组合物包括由明胶制成的装填式胶囊,以及由明胶和一种增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。装填式胶囊含有与填充剂如乳糖,粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸盐和可选稳定剂混合形式的活性成分。在软胶囊中,活性化合物可溶解或悬浮于适当的液体中,如脂肪油,液体石蜡,或液状聚乙二醇。此外,还可加入稳定剂。口服的所有制剂都应是方便这种给药的合适的剂型。
对于口腔给药而言,所述组合物可采用片剂或锭剂等方便的形式配制。
对于吸入给药,本发明使用的化合物可用气雾剂喷射的形式很方便地释放出来,这可通过高压包或喷雾器,或者使用某种合适的抛射剂如二氯二氟甲烷,三氯氟代甲烷,二氯四氟乙烷,二氧化碳或其它适合的气体来实现。在高压气雾剂的情况下,剂量单位可通过一个阀的计量释放来确定。用作吸入器或吹气器的明胶的胶囊和药筒的可制成含有所述化合物和一种适宜的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
所述化合物可配制成便于胃肠外给药如注射,包括集合药团注射或连续静脉滴注。便于注射的制剂可表现为单位剂量形式,如安瓿或多剂量的制剂可表现为单位剂量形式,如安瓿或多剂量容器并加入保存剂。所述组合物也可采用混悬液,溶液或以油或水为介质的乳剂形式,且可含有配方剂如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给药的药用组合物包括活性物质的水溶液,即水溶形式。此外,活性物质的悬浮液可制成适宜的油状注射悬浮液。适合的亲油溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油,或合成的脂肪酸酯,如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质,如羧甲基纤维素钠,山梨醇,或葡聚糖。所述悬浮液也可有选择地包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的物质,以制备高浓度的溶液。
粉针剂的活性成分可与合适的媒体,如无菌去热源注射水配合,然后使用。
所述的化合物也可配制成直肠组合物如栓剂或滞留灌肠剂,如含常规栓制基质如可可脂或其它的甘油酯。
除了已描述过的制剂外,所述的化合物还可配制成一种长效(depot)制剂。这种长效制剂可采用植入法(如皮下或肌肉)或肌注给药。因此,所述的化合物可用合适的聚合物或疏水物质来配制(如一种可接受的油乳剂)或离子交换树脂,或微溶的衍生物如一种微溶的盐来配制。
本发明的疏水化合物的一种药物载体为含苄醇,一种非极性表面活性剂,一种与水混溶性有机聚合物和水相的一种共溶体系。该共溶体系可为VPD共溶体系。VPD是一种由3%重量/容量(W/V)苄醇溶液,8%W/V的非极性表面活性剂多乙氧基醚,及65%W/V的聚乙二醇300在无水乙醇中组成的溶液。而VPD共溶体系(VPD:5W)由1∶1稀释的VPD与5%的葡萄糖在水溶液中配成。这种共溶体系能较好地溶解疏水性化合物,而本身对全身给药产生的毒性很低。自然,一种共溶体系在不破坏其溶解度和毒性特点的情况下,其比例可有较大的变化。而且,共溶成份的同一性可以变化:如其它的低毒性的非极性表面活性剂可用来取代多乙氧基醚;聚乙二醇的所占分数值可以改变;其它生物相容的聚合物可取代聚乙二醇,如聚乙烯吡咯烷酮;以及其它的糖或多糖可代替葡萄糖。
所述药用组合物也可包括合适的固相或凝胶相载体式赋形剂。这类载体或赋形剂的例子包括(但不限于)碳酸钙,磷酸钙,各种糖,淀粉,纤维素衍生物,明胶,及聚合物如聚乙二醇。适于本发明使用的药用组合物也包括其中包含以达到其预定目的有效量的活性成分的组合物。所述的有效量的确定方法完全在本领域技术人员的能力范围内,特别是根据本文已详尽公布的那些内容。
5.5抗病毒活性的测定
本发明的联合疗法显示的抗病毒活性可以用体外测定法较容易地测出,如下文描述的那样,可以测定所述肽的抑制合胞体形成的能力,或者其抑制无细胞病毒感染的能力。采用这些测定法,一些参数如肽对某一病毒株表现的相对抗病毒活性和/或肽对特定毒株的特异性抑制活性可以测出。细胞融合测定法可以用来测定肽在体外抑制HIV-诱导的合胞体形成的能力。这样一种测定法可包括在HIV慢性感染的细胞和一种待测定治疗剂存在的情况下,培养未感染的CD-4+细胞(如Molt或CEM细胞)。对于每种联合疗法而言,都可测出一种浓度范围。该范围应包括不加肽的对照培养物。采用该领域内普通技术人员公知的标准条件下培养。经过一个适宜的培养期后(如37℃下培养24小时),可在显微镜下检查培养物是否存在多核巨细胞,它是细胞融合和合胞体形成的指征。
逆转录酶(RT)测定法可以用来检测所述的肽在与另一种抗病毒剂联合使用时,对无细胞HIV感染CD-4+细胞的抑制能力,这种测定法包括在所述的肽和抗病毒剂联合使用时对病毒和CD-4+细胞的适宜培养浓度(即TCID50)进行测定。采用该领域内技术人员熟知的培养条件。除了不加肽的对照培养之外,如上所述,还可使用一定范围内浓度的肽。将培养物温育一定时期(如7天)后,采用标准程序制备一种无细胞上清液,再检测作为成功感染的一个指标的RT活性。RT活性可用Goff等(Goff.s.el al.,1981,J.Virol.38:239-248)和/或Willey等(Willey,R.et al.,1988,J.Virol.62:139-147)描写的标准技术进行检测。这些参考文献结合在本发明中作为参考。
本领域内技术人员熟知的标准方法可用来测定非逆转录病毒活性。例如,请参见Pringle等关于呼吸道合胞病毒和副流感病毒活性测定技术的探讨(Pringle,C.R.el al.,1985,J.Medical Virology 17:377-386)。不可参见“Zinsser Microbiology”一书(1988,Joklik,W.K.et al.,eds.,Appleton&Lange,Norwalk,CT,19 th ed.),作为对该技术的综述。在此结合到本发明中作为参考。
5.5.1抗病毒化合物对不同阶段HIV感染
的活性测定
研究抗病毒化合物对不同阶段HIV感染(急性、细胞混合培养、慢性)的活性的三种不同的体外测定方法已为本领域技术人员所熟知(Lambert et al.,1993,Antiviral Res.21:327-342)。这些方法可用来评价DP-178,DP-107或一种药学上可接受的衍生物与一种已描述过的抗病毒剂联合使用的效果。全部测定均在24穴板(Nnnc)上进行,每样三份,5倍连续稀释的抑制剂在100%二甲基亚砜(DMSO)中制得,以达到200×最终浓度。将1/200体积的稀释液加到培养穴中,以产生最终浓度为0.5%DMSO和所需浓度的抑制剂。试验或者按两种抑制剂的固定比(即,1∶10或1∶40,AZT:DP-178)的稀释液,或者按变化的浓度进行。
首先,急性感染测定法以体内CD-4+细胞丧失引起的快速复制和细胞病变效应为模式。测定对急性感染的Molt4细胞的治疗可表明抗病毒化合物在抑制HIV-1感染在T细胞中的传播是有效的。对于这些测定法而言,每穴3×104的未感染的Molt4细胞被感染了50TCIDS的HIV-1(LA1株)。抑制剂的备料在100%DMSO中制备,在0天(当天)即病毒吸收期1.5小时后立即加入。在第1天和第4天将含有同样浓度的抑制剂的培养基加到培养物中。第7天收获样品。
第二,含有已整合的原病毒并表现出中到低水平连续的病毒表达的慢性感染细胞很可能代表了体内感染了病毒体的贮主,它最终导致疾病恶化。在生长培养基中的慢性感染细胞经三次冲洗后被转移到每穴密度为6×104细胞的板上。抑制剂在0天加入。在第1天和第3天将含同样浓度抑制剂的生长培养基加入到培养物中。第5天收获后测定。
第三,这些研究中使用的细胞混合培养测试是体内感染的恰当的模型,因为它涉及到培养物中细胞与细胞的融合和传播以及HIV-1的细胞外传播。对于这种测定而言,将3×104未感染的Molt4细胞与每穴3×103H9/LA1或CEM/LA1慢性感染的细胞在24穴板上混合培养。在0天加入抑制剂,在第1天和第3天将含抑制剂的生长培养基加到测定板上。第5天收获后测定。抗病毒活性用几个参数测量:经处理培养丸状细胞的Westum斑点分析,RT水平及上清液中P24抗原水平。
联合用药效果可用Chou和Talalay的多元药物分析法(Chou andTalalay,1984,Adv.Enzyme Regul.22:27-55)和“微机量效分析法”软件(Chou and Chou,1987,Software and manual.P19-64.Elsevier Biosoft,Cambridge,UK)的方程进行计算:
其中,CI是联合治疗指数,(DX)1是药物1单独使用达到X%效果所需的剂量,(D)1是与(D)2联合治疗时产生相同X%效果所需药物1的剂量。类似地,(DX)2和(D)2的值是由药物2推导出来的。α值可采用平均效果方程:fa/fu=(D/Dm)m由量效曲线的位置来确定。其中,fa是受剂量D影响的分数,fu是未感染的分数,Dm是达到50%效果所需的剂量,而m是量效曲线的斜率。对于互相排斥的药物(即作用模式类似),两种药物在平均效果图上呈单独直线及互相平行的直线。相互不排斥的药物(即各自不独立的作用模式)在平均效果图上将给出平行的直线,但其混合物则给出一条拱形上行的曲线。如果药物相互排斥,α则为零;如果它们相互不排斥,α则为1。假定相互不排斥药物获得的值总是稍大于相互排斥的药物。CI值小于1表示协同作用,其值大于1表示拮抗作用,其值等于1表示加合作用。
联合用药效果也用MacSynergy计算机程序(Pritchard andShipman,1990,Antiviral Research 14:181-206)计算。这种计算机程序也接受药物与药物相互作用的三维图像分析。抗病毒化合物联合使用所观察到的协同作用的量可用MacSynergy程序计算和用三维条线图上药物相互作用的百分数和药物浓度对应作图来表示。协同作用的量在图上用条线的高度表示,而拮抗作用则作为负值标在图上底线的下面。
6.实例:DP-178(SEQ ID:1)是一种
有效力的HIV-1感染抑制剂
在本例中,DP-178(SEQ ID:1)已表明为一种有效力的HIV-1调解的CD-4+细胞-细胞融合和无细胞病毒感染的抑制剂。在融合测定中,这种肽在浓度为1-10ng/ml时可完全阻断病毒诱导的合胞体形成。在感染性测定中,阻断感染的抑制浓度稍高些,为90ng/ml。已进一步表明,DP-178(SEQ ID:1)对HIV-1的抗病毒活性有高度的特异性。此外,一种合成的肽DP-185(SEQ ID:3)作为HIV-1衍生的一种DP-178同系物也发现能阻断HIV-1调解的合胞体形成。
6.1材料和方法
6.1.1肽的合成
Fast Moc化学公司的应用生物系统模型341A肽合成剂可用来合成肽。采用Rink树脂(Advanced Chemtech)可制备酰胺化的肽,而含游离羧基端基的肽可在Wang(对-烷氧基-苄基-醇)树脂(Bachen)上合成。首先残基将双偶联到适合的树脂上,接着使残基单偶联。偶联的每一步都跟随着乙酐封端过程。用三氟乙酸(TFA)(10ml),水(0.5ml),茴香硫醚(0.5ml),乙二硫醇(0.25ml)和结晶苯酚(0.75g)处理以使肽从树脂上解离出来。提纯用反相高压液相色谱法进行。约50mg粗肽样品在Waters Delta Pak C18柱(19mm×30cm,15μ球形填料)上用线性梯度洗脱;水/乙腈0.1%TFA。将冻干的肽贮存干燥并制备肽的水溶液(约1mg/ml)。电子喷射质谱产生下列结果:DP-178(SEQID:1):44491.87(计算值为4491.94);DP-180(SEQ ID:2):4491.45(计算值为4491.94);DP-185(SEQ ID:3):未做(计算值为4546.97)。
6.1.2病毒
HIV-1LAI病毒从R.Gallo(Popovic,M.et al.,1984,Science224∶497-508)处获得并在含10%胎牛血清的RPMI1640中培养的CEM细胞上繁殖。使感染的CEM细胞的上清液通过一个0.2μm的滤器,采用AAS细胞系以支持病毒复制,感染效价用微量感染性测定进行估算。为此目的,将25μl的连续稀释病毒液加入到一块96穴的微量滴定板中的浓度为2×105/ml的75μl AA5细胞上。待测的每份病毒稀释液准备3份。细胞培养8天,每隔一天加入新鲜的培养基。感染后第8天,对上清液样品检测病毒复制,作为逆转录酶活性释放到上清液中的证据。根据Reed和Muench公式计算TCID50(Reed,L.J.et al.,1938,Am.J.Hyg,27:493-497)。用于这类研究的HIV-1LAI和HIV-1MN种系的效价在AA5细胞系中测定,它们的效价大约分别为1.4×106和3.8×104TCID50/ml。
6.1.3细胞融合测定
如以前所述,约7×104Molt细胞与慢性感染HIV-1ALI病毒的1×104CEM细胞在96穴板(one-half area cluster plates;Costar,Cambridge,MA),最终体积为100μl的培养基上培养(Mattews,T.J.etal.,1987,Proc.Natl.Acad,Sci.USA 84:5424-5428)。加入1体积10μl的肽抑制剂,将该细胞混合物在37℃下培养24小时。然后,用放大40倍的显徽镜(单视野镜下可观察到整个穴的情况)对多核巨细胞进行计数检查。
6.1.4无细胞病毒感染测定
将合成肽或者与247TCID50(图2描述了该实验)或者与62TCID50(图3描述了该实验)单位的HIV-1LAI病毒或25TCID50单位的HIV-2NIHZ和CEM CD4+细胞在肽浓度为0,0.04,0.4,4.0和40μg/ml时于37℃培养7天。每分钟对产生的逆转录酶(RT)活性计数用下文6.1.5节描述的测定法确定(参看Reed,L.J.et al.,1938,Am.J.Hyg.27:493-497,关于TCID50计算的说明)。
6.1.5逆转录酶测定
微量逆转录酶(RT)测定为Goff等(Goff.s.el al.,1981,J.V:rol.38:239-248)和Willey等(Willey,R.et al.,1988,J.Virol.62:139-147)采用。将取自病毒/细胞培养的上清液调整到1%三硝基甲苯-X100。将10μl的上清液样品加入到96穴U形底微量滴定板中的50μl的RT混合物中,使样品在37℃培养90分钟。RT混合物含有75mM KCl,2mM二硫苏糖醇,5mM MgCl2,5μg/ml Poly A(Pharmacia,cat.No.27-4110-01),(0.25单位/ml Oligo dT(Pharmacia,cat.No.27-7858-01),0.05%NP40,50mM Tris-HCl,pH7.8,0.5μM非放射活性脱氧胸苷三磷酸(dTTP),及10μCi/ml 32P-dTTP(Amersham,Cat.No.PB.10167)。
培养一个时期后,将40μl反应混合物涂到一种Schleicher和Schuell(S+S)NA 45膜上(或DE81纸上),该膜浸透了2×SSC缓冲液(0.3MNaCl和0.003M柠檬酸钠),并铺在S+SMinifold上,上面加一张GB003(S+S)滤纸,采用部分真空过滤。在完全真空的条件下,用200μl 2×SSC将minifold的每一穴冲洗4遍。从minifold上取下膜在盛有过量2×SSC的Pyrex盘中至少洗2次。最后,用吸湿纸把膜上的水份吸干,放在Whatman3号纸上,用偏氯纶包装纸覆盖,置于薄膜上于-70℃过夜。
6.2结果
6.2.1肽对感染细胞诱导的合胞体
形成的抑制作用
抗病毒活性的初步筛选就是测定肽阻断合胞体形成的能力,这种合胞体形成是由未感染Molt4细胞与HIV-1慢性感染的CEM细胞混合培养过夜诱发的。在此给出几个这类实验的结果。在第一种实验中,系列DP-178(SEQ ID:1)肽浓度(在10μg/ml和12.5ng/ml之间)可用来测定其对细胞融合过程的阻断的影响。对于这些实验而言,将用HIV-1LAl、HIV-1MN、HIV-1RF,或HIV-1SF2病毒慢性感染了的CEM细胞和未感染的Molt4细胞一起混合培养过夜。图4的结果表明DP-178(SEQ ID:1)对HIV-1的每个毒株提供全面保护作用直到DP-178(SEQ ID:1)的最低浓度。抑制HIV-1LAI的最低浓度为12.5ng/ml;而对所有其它的HIV-1病毒来说,本研究所用DP-178(SEQ ID:1)的最低浓度为100 ng/ml。第二种肽DP-180(SEQ ID:2)含有和DP-178(SEQ ID:1)相同的氨基酸残基,但按随机次序排列,结果即使在40μg/ml的高浓度下(图4)也未显示出抗融合活性。这些观察表明DP-178(SEQ ID:1)的抑制效果是基本序列特异性,且与非特异性肽/蛋白的相互作用无关。DP-178抑制作用的实际终点(即最低有效抑制浓度)是在1-10ng/ml范围内。
此外的一系列实验涉及到一种DP-178(SEQID:1)同系物的制备和它抑制HIV-1诱导的合胞体形成的能力的测定。如图1所示,DP-185(SEQ ID:3)的序列和DP-178(SEQ ID:1)稍有不同,在于它的基本序列取自HIV-1sF2株,且含有一些与DP-178(SEQ ID:1)接近N端有关的氨基酸差异。如图4所示,DP-185(SEQ ID:3)即使在312.5ng/ml(已测量的最低浓度)时,亦表现了抑制活性。
此外的一系列实验涉及到DP-178(SEQ ID:1)HIV-1和HIV-2抑制活性的比较。如图5所示,DP-178(SEQ ID:1)在肽浓度低于1ng/ml时亦可阻断HIV-1调解的合胞体形成。然而DP-178(SEQ ID:1)即使在高达10μg/ml的浓度下也不能阻断HIV-2调解的合胞体形成。DP-178(SEQ ID:1)作为HIV-1调解的细胞融合抑制剂的这种惊人的4log选择性证实了在DP-178(SEQ ID:1)作用中的意外HIV-1的特异性。DP-178(SEQ ID:1)可抑制HIV-1调解的细胞融合,但在同样的细胞型和实验浓度下,这种肽却不能抑制HIV-2调解的细胞融合这一事实进一步证实DP-178(SEQ ID:1)的抗病毒作用的高度选择性。
6.2.2肽对无细胞病毒感染的抑制作用
接着是测定DP-178(SEQ ID:1)阻断无细胞HIV-1病毒感染CD-4+CEM细胞的能力。如图2结果所示,该实验测定了DP-178(SEQID:1)阻断HIV-lLAI分离株感染CEM细胞的能力。本实验包括三个对照肽:DP-116(SEQ ID:9),DP-125(SEQ ID:8),及DP-118(SEQID:10)。DP-116(SEQ ID:9)代表一种用这种测定法曾证实无活性的肽,而DP-125(SEQ ID:8);Wild,C.et al.,1992,Proc.Natl.Acad,Sci.USA 89:10,537)和DP-118(SEQ ID:10)则是用此种方法测定证实有活性的肽。每个浓度(0,0.04,0.4,4,和40μg/ml)的肽与247 TCID50单位的HIV-1LAI病毒和CEM细胞共同培养。培养7天后,测定无细胞的上清液中是否存在作为成功感染标记的RT活性。图2所示结果证实DP-178(SEQ ID:1)在浓度低至90ng/ml(IC50=90ng/ml)时可抑制HIV-1病毒分离株调解的重新感染过程。作为对比,两种阳性对照肽:DP-125(SEQ ID:8)和DP-118(SEQ ID:10)却有高达60倍的IC50浓度(约为5μg/ml)。
在另一试验中,采用CEM细胞和HIV-lLAl或HIV-2NTHZ测定DP-178(SEQ ID:1)对HIV-1和HIV-2的抑制作用。这些实验使用了62TCID50 HIV-1LAI或25 TCID50 HIV-2NTHZ共培养7天。如图3所示,DP-178(SEQ ID:1)抑制HIV-1感染的IC50约为31ng/ml。作为对比,DP-178(SEQ ID:1)对HIV-2NTHZ表现出高得多的IC50,因此使DP-178(SEQ ID:1)作为HIV-1的抑制剂要比作为HIV-2的抑制剂多两个Logs。该发现与上文(6.2.1节)描述的融合抑制试验的结果一致,并进一步证实了高度的选择性水平(即对HIV-1的作用超过HIV-2)。
7.实例:HIV-1抑制剂IDP-178(SEQ ID:1)
是无细胞毒性的
本实例表明,36个氨基酸合成肽抑制剂DP-178(SEQ ID:1)对培养中的细胞即使在所试的最高肽浓度下(40μg/ml)仍无细胞毒性。
7.1材料和方法
细胞繁殖和毒性测定:将每种肽浓度下的约3.8×105CEM细胞于T25烧瓶中,37℃时,培养3天。如图1所示,测试的肽为DP-178(SEQ ID:1)和DP-116(SEQ ID:9)。每种肽使用的浓度为0,2.5,10,和40μg/ml。细胞计数在培养时间为0,24,48和72小时时进行。
7.2结果
有效力的HIV-1抑制剂DP-178(SEQ ID:1)是否显示出任何细胞毒性,可通过测定该肽对培养细胞的繁殖和生存能力的影响给予评价。除了各种浓度的DP-178(SEQ ID:1)外,CEM细胞还在一种以前作为HIV抑制剂但表明无效的肽DP-116(SEQ ID:9)存在的情况下进行培养(Wild,C.et al.,1992,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 89:10537-10541)。此外,细胞还在无二者中任何一个肽的情况下进行培养。
细胞毒性研究的结果证实,DP-178(SEQ ID:1)对培养中的细胞不显示出细胞毒性作用。如下面表V所示,即使在DP-178(SEQ ID:1)最高测试浓度(40μg/ml)时培养3天,细胞的繁殖和生存能力特点都与DP-116(SEQ ID:9)或无肽对照组无明显不同。细胞繁殖数据也用图表形式表达在图6中。如上文第6节提供的实例证实,DP-178(SEQ ID:1)在肽浓度1-10ng/ml范围时,可完全抑制HIV-1调解的合胞体形成,而在浓度最少为90ng/ml时,可完全抑制无细胞病毒的感染。因此,本研究证实,即使肽浓度比HIV抑制剂量高3个log,DP-178(SEQID:1)也不表现出细胞毒性作用。
表V
%生存能力
肽 时间(小时)肽 浓度μg/ml 0 24 48 72DP178 40 98 97 95 97(SEQID:1)
10 98 97 98 98
2.5 98 93 96 96DP116 40 98 95 98 97(SEQID:9)
10 98 95 93 98
2.5 98 96 98 99无肽 0 98 97 99 988.实例:DP-107和DP-178肽截断物和突变物的抗病毒活性
本节提供的实例表示了DP-107和DP-178肽截断物和突变物的抗病毒活性的一项研究。它证实几种DP107和DP178的改性肽也显示出较大的抗病毒活性。
8.1材料和方法
抗-HIV测定:抗病毒测定的操作如上文6.1节所述。测定使用HIV-1/IIIb和/或HIV-2NIHZ分离株。除非图5A-C另有说明,否则使用纯化的肽。
肽:本研究提供的肽的特性是:
1)图5A-C表示含有DP178区的HIV-1BRU分离株及其周围区域衍生的肽。这一区域的跨距(spanned)特指从gP41氨基酸残基615到氨基酸残基717之间。列出的肽含有这一区域的截断物和/或突变物(它不同于DP178序列的氨基酸序列)。而且,如图所示,某些肽有氨基端和/或羧基端(加入或除去);图6表示代表DP107和/或环绕HIV-1BRU分离株的DP107氨基酸序列的gP41区的截断物。如图所示,某些肽未受到阻断和生物素羧基化(biotinylated)。
阻断的肽含有一个酰基N-端和一个氨基C-端。
8.2结果
图5A-C列出已经获得的第1组DP-178衍生的肽的抗-HIV资料。所示完整的、非突变DP178肽(在图5A-C中称为T20)的结果为对于4ng/ml而言。
在图5中,一些DP178截断物,如它们的低ID50值所表明的,显示出一种高水平的抗病毒活性。例如,这些截断物包括测试的肽T-50,T-624,T-636至T-641,T-645至T-650,T-652至T-654和T-656。T-50代表一种测试的肽,它含有一个点突变,如残基的阴影背景所示。HIV-1衍生的测试肽表现出一种不同的株特异性抗病毒活性,这些肽在对HIV-2 NIHZ分离株的试验中均未发现合适的抗-HIV-2抗病毒活性。
图5B列出的肽为测试肽,代表DP178的氨基端(T-4)或羧基端(T-3)的一半。氨基端肽无活性(IC50>400μg/ml),而羧基端肽表现出有效力的抗病毒活性(IC50=3μg/ml)。一些其它的测试肽也表现出高水平的抗病毒活性。这些肽包括如T-61/T-102,T-217至T-221,T-235,T-381,T-677,T-377,T-590,T-378,T-591,T-271至T-272,T-611,T-222至T-223和T-60/T-224。某些抗病毒肽含有点突变和/或氨基酸残基的增加物(它们不同于DP178氨基酸序列)。
图5C中,点突变和/或氨基端和/或羧基端改变已导入DP178本身的氨基酸序列中。如图所示,大多数列出的测试肽表现出有效力的抗病毒活性。
如图6所示,DP107肽(在图5中称为T21)也已产生并受到测试。图6也提供了有关阻断和未阻断的资料,它们含有来自gP41区的另外的氨基酸残基(DP107存在于gP41区中)。这些肽的绝大多数,如它们的低IC50值所表明的,显示出抗病毒活性。
因此,本节提出的结果证实,不仅全长DP-107和DP-178肽表现出有效力的抗病毒活性,而且这些肽的截断物也具有明显的抗病毒特性。
9.实例:潜在的SIV DP178/DP107
类似物:抗病毒特性
在该实例中,采用上文所述的计算机辅助搜索切口可以鉴定猴免疫缺陷病毒(SIV)DP178样肽,并测定其抗-SIV活性。已证实鉴定出来的几个肽表现出有效力的抗病毒能力。
9.1材料和方法
抗-SIV抗病毒测定:该测定Langolis等已有报道(Langolis,A.J.et al.,1991,AIDS Research and Human Retroviruses 7:713-720)。
肽:符合本研究特点的肽为T-391至T-400,如图7所示的那样。这些肽代表经STV TM蛋白的DP178类区的一种移行(walk)。
每种肽经2-倍连续稀释至100μg/ml到约100ng/ml的范围,然后进行测试。对每种测定,也使用一个不含肽的穴。
9.2结果
图7概括的数据代表了通过对SIV TM蛋白的DP178类区的“肽移行”获得的抗病毒资料。
如图7所示,肽T-391至T-400经测试后显示出和原肽同样的有效力的抗病毒活性。
因此,本文前述的计算机辅助搜索(如8节举出的例子)可成功地鉴别具有开发抗-SIV抗病毒化合物前景的病毒肽区。
本发明不限于已描述过的具体实施例这一范围(打算对本发明各个方面作专门的阐述),功能上等效的方法和成份均包括在本发明的范围内。确实,除了本文已表明的和已叙述的那些内容外,本发明的各种修改对该领域的技术熟练人员(已可从前面的叙述及附图了解到)来说是显而易见的。这类修改也在附加的权利要求书的范围内。
Claims (33)
1.一种治疗受试者HIV感染的方法,该方法包括给予有效量的DP-107或其一种药学上可接受的衍生物和有效量的至少一种治疗剂。
2.一种治疗受试者HIV感染的方法,该方法包括给予有效量的DP-178或其一种药学上可接受的衍生物和有效量的至少一种治疗剂。
3.权利要求1或权利要求2的方法,其中所述的治疗剂为一种抗病毒剂。
4.权利要求3的方法,其中所述抗HIV剂为逆转录酶抑制剂,病毒蛋白酶抑制剂,细胞活素(cytokine),细胞活素抑制剂,糖基化作用抑制剂或病毒mRNA加工抑制剂。
5.权利要求3的方法,其中所述抗病毒剂为核苷类似物。
6.权利要求5的方法,其中所述核苷类似物为AZT、ddI、ddC、ddA、d4T或3TC。
7.权利要求3的方法,其中所述抗病毒剂为α-干扰素,β-干扰素或γ-干扰素。
8.权利要求2的方法,其中所述DP-178衍生物为含有T-624,T-636至T-641,T-645至T-650,T-652至T-654,或T-656组的肽。
9.一种抑制HIV复制的方法,包括给予受治疗者有效量的DP-107或其一种药学上可接受的衍生物和有效量的至少一种治疗剂。
10.一种抑制HIV复制的方法,包括给予受治疗者有效量的DP-178或其一种药学上可接受的衍生物和有效量的至少一种治疗剂。
11.一种抑制HIV逆转录病毒向细胞传播的方法,包括使有效量的DP-107或其一种药学上可接受的衍生物和有效量的至少一种治疗剂接触所述细胞的方法。
12.一种抑制HIV逆转录病毒向细胞传播的方法,包括使有效量的DP-178或其一种药学上可接受的衍生物和有效量的至少一种治疗剂接触所述细胞的方法。
13.权利要求9,10,11或12的方法,其中所述治疗剂为抗病毒剂。
14.权利要求13的方法,其中所述抗病毒剂为逆转录酶抑制剂,病毒蛋白酶抑制剂,细胞活素,细胞活素抑制剂,糖基化作用抑制剂或病毒mRNA加工抑制剂。
15.权利要求13的方法,其中所述抗病毒剂为核苷类似物。
16.权利要求15的方法,其中所述核苷类似物为AZT、ddI、ddC、ddA、d4T或3TC。
17.权利要求13的方法,其中所述抗病毒剂为α-干扰素,β-干扰素或γ-干扰素。
18.权利要求1,2,9或10的方法,其中所述给药是有顺序的。
19.权利要求1,2,9或10的方法,其中所述给药是同时进行的。
20.权利要求1,2,9或10的方法,其中所述给药途径为口腔。
21.权利要求1,2,9或10的方法,其中所述给药途径为胃肠外。
22.权利要求21的方法,其中所述给药途径为静脉。
23.一种用于治疗HIV感染的药学上可接受的组合物,它包括有效量的DP-178或其一种药学上可接受的衍生物,一种有效量的其它治疗剂和一种药学上可接受的载体。
24.一种用于治疗HIV感染的药用组合物,它包括有效量的DP-107或一种药学上可接受的衍生物,有效量的另一种治疗剂和一种药学上可接受的载体。
25.权利要求23或24的药用组合物,其中所述治疗剂为抗病毒剂。
26.权利要求25的药用组合物,其中所述抗病毒剂为核苷类似物。
27.权利要求26的药用组合物,其中所述核苷类似物为AZT、ddI、ddC、ddA、或3TC。
28.一种治疗受试者HIV感染的方法,包括(a)给予有效量的DP-107,DP-178或其一种药学上可接受的衍生物;(b)给予有效量的另一种抗病毒剂;和(c)给予DP-107,DP-178或其一种药学上可接受的衍生物。
29.权利要求28的方法,其中所述DP-107或其一种药学上可接受的衍生物,有效量的另一种治疗剂和一种药学上可接受的载体按步骤(a)给药,DP-178或其一种药学可接受的衍生物按步骤(c)给药。
30.权利要求29的方法,其中重复(a)至(c)的步骤,直至疾病症状减轻。
31.一种治疗受试者HIV感染的方法,包括给予有效量的DP-178-类肽或其一种药学上可接受的衍生物和有效量的至少一种治疗剂。
32.权利要求31的方法,其中所述DP-178类肽是从猴免疫缺陷病毒衍化而来。
33.权利要求32的方法,其中所述DP-178类肽选自含T-391,T-392,T-393,T-394,T-395,T-394,T-395,T-396,T-397,T-398,T-399或T-400的组中。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013127300A1 (zh) * | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | 用于抑制hiv的多肽、其药物组合物及其用途 |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6479055B1 (en) * | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
US6271198B1 (en) | 1996-11-06 | 2001-08-07 | Genentech, Inc. | Constrained helical peptides and methods of making same |
US6841657B2 (en) | 1997-04-17 | 2005-01-11 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Inhibitors of HIV membrane fusion |
US6150088A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-21 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein |
US6818740B1 (en) | 1997-04-17 | 2004-11-16 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Inhibitors of HIV membrane fusion |
US7960504B2 (en) | 1998-07-30 | 2011-06-14 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Inhibitors of HIV membrane fusion |
US6747126B1 (en) | 1998-07-30 | 2004-06-08 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Peptide inhibitors of HIV entry |
AU4988900A (en) | 1999-05-05 | 2000-11-17 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | T20/dp178 and t21/dp107 are activators of human phagocyte formyl peptide receptors |
SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
CA2395291C (en) | 1999-12-16 | 2012-09-11 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Five-helix protein |
AU2001233340B2 (en) | 2000-02-10 | 2006-05-04 | Panacos Pharmaceuticals, Inc. | Assay for detection of viral fusion inhibitors |
CA2403718A1 (en) * | 2000-03-17 | 2001-09-27 | Panacos Pharmaceuticals, Inc. | A method for generating immunogens that elicit neutralizing antibodies against fusion-active regions of hiv envelope proteins |
US20050065319A1 (en) * | 2000-12-19 | 2005-03-24 | Baroudy Bahige M. | Combination method for treating viral infections |
CN1255548C (zh) | 2001-06-15 | 2006-05-10 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | gp41片段的乙酰化 |
CA2474056A1 (en) * | 2002-01-24 | 2003-07-31 | Sangstat Medical Corporation | Combination therapy for treatment of hiv infection |
EA007918B1 (ru) * | 2002-09-24 | 2007-02-27 | Франтиэ Биотекнолоджиз Ко., Лтд. | Пептидные производные-ингибиторы слияния при вич-инфекции |
US7556813B2 (en) * | 2002-09-27 | 2009-07-07 | Trimeris, Inc. | Antiviral peptide-polymer conjugate comprising a polymer covalently attached to two or more synthetic HIV gp41 HR1 and/or HR2 peptides |
CN101152574A (zh) * | 2002-09-27 | 2008-04-02 | 唐纳士公司 | 用于预防和治疗获得性免疫缺陷综合症的协同组合物 |
EP1583542B9 (en) | 2003-01-14 | 2008-10-22 | Gilead Sciences, Inc. | Compositions and methods for combination antiviral therapy |
US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
US20050281829A1 (en) * | 2003-05-06 | 2005-12-22 | Hehir Cristina A T | Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs |
US20050037947A1 (en) * | 2003-05-06 | 2005-02-17 | Bitonti Alan J. | Inhibition of drug binding to serum albumin |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
HUE026384T2 (en) * | 2003-05-06 | 2016-06-28 | Biogen Hemophilia Inc | VII coagulation factor-FC chimeric proteins for the treatment of hemostasis disorder |
US20080096809A1 (en) * | 2003-12-22 | 2008-04-24 | Yeda Research & Development Co. Ltd. | Diastereomeric Peptides Useful as Inhibitors of Membrane Protein Assembly |
EP1708734A4 (en) * | 2004-01-07 | 2009-06-17 | Trimeris Inc | PEPTIDES DERIVED FROM HIV GP41 HR2 AND THEIR USE IN THERAPY TO INHIBIT THE TRANSMISSION OF HUMAN IMMUNODICIENCY VIRUS |
CN1968710B (zh) | 2004-06-01 | 2013-12-25 | 默沙东公司 | HIV gp41融合中间体的稳定的肽模拟物 |
US20060154895A1 (en) * | 2004-12-09 | 2006-07-13 | Maxwell Gordon | Method of treating acquired immunedeficiency syndrome |
GB0501352D0 (en) * | 2005-01-21 | 2005-03-02 | Slingsby Jason H | Use of glycosylation modulators in combination with membrane fusion inhibitors for treatment of infections caused by viruses bearing glycosylated envelope |
EP1868652A2 (en) * | 2005-04-05 | 2007-12-26 | Istituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. | Method for shielding functional sites or epitopes on proteins |
US7456251B2 (en) | 2006-02-02 | 2008-11-25 | Trimeris, Inc. | HIV fusion inhibitor peptides with improved biological properties |
EP1886696A1 (en) * | 2006-08-03 | 2008-02-13 | Endotis Pharma | Conjugates of antithrombin binding oligosaccharide derivatives and therapeutic proteins |
EP2054086A1 (en) | 2006-08-17 | 2009-05-06 | F. Hoffmann-Roche AG | A conjugate of an antibody against ccr5 and an antifusogenic peptide |
TW200817438A (en) | 2006-08-17 | 2008-04-16 | Hoffmann La Roche | A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide |
EP2479189B1 (en) | 2006-12-12 | 2015-02-25 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Transferrin fusion protein libraries |
TW200902544A (en) * | 2007-03-13 | 2009-01-16 | Hoffmann La Roche | Peptide-complement conjugates |
KR20100016142A (ko) * | 2007-04-03 | 2010-02-12 | 트라이머리스, 인코퍼레이티드 | 항바이러스 펩티드 치료제 전달용 신규 제제 |
CL2008002092A1 (es) | 2007-07-20 | 2009-05-29 | Hoffmann La Roche | Conjugado que contiene dos o mas peptidos antifusogenicos y un anticuerpo anti-cd-4; metodo de produccion; composicion farmaceutica que lo comprende; polipeptidos antifusogenicos y uso del conjugado para tratar infecciones viricas. |
MX2010003179A (es) * | 2007-09-25 | 2010-04-30 | Trimeris Inc | Metodos de sintesis para peptidos anti-vih terapeuticos. |
WO2011133948A2 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Longevity Biotech, Inc. | Highly active polypeptides and methods of making and using the same |
KR20130045385A (ko) | 2010-09-14 | 2013-05-03 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 세르핀-핑거 융합 폴리펩티드 |
TWI577377B (zh) | 2010-09-16 | 2017-04-11 | Viiv醫療保健公司 | 醫藥組合物 |
US9789164B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-10-17 | Longevity Biotech, Inc. | Peptides comprising non-natural amino acids and methods of making and using the same |
SG10201913874TA (en) | 2013-03-15 | 2020-03-30 | Biogen Ma Inc | Factor ix polypeptide formulations |
EP3478324A1 (en) | 2016-07-01 | 2019-05-08 | GlaxoSmithKline Intellectual Property (No.2) Limited | Antibody-drug conjugates and therapeutic methods using the same |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5141867A (en) * | 1987-02-02 | 1992-08-25 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleotide sequence encoding a human immunodeficiency virus antigen |
US4950652A (en) | 1987-03-23 | 1990-08-21 | Hem Research, Inc. | dsRNAs for combination therapy in the treatment of viral diseases |
US5077280A (en) | 1988-04-12 | 1991-12-31 | Brown University Research Foundation | Treatment of viral infections |
GB8815241D0 (en) | 1988-06-27 | 1988-08-03 | Wellcome Found | Antiviral combinations & compounds therefor |
DE68925909T2 (de) | 1988-12-20 | 1996-11-14 | Clarity Technologies Inc | Synthetische hiv ähnliche peptide, deren zusammensetzungen und verwendungen |
US6248574B1 (en) | 1989-12-13 | 2001-06-19 | Avigdor Shaffermann | Polypeptides selectively reactive with antibodies against human immunodeficiency virus and vaccines comprising the polypeptides |
IL102092A (en) | 1991-06-11 | 1996-11-14 | Microgenesys Inc | Use of recombinant VIH protein wrapped in VIH abduction drug and a pharmaceutical preparation containing the accumulated protein |
ATE183515T1 (de) * | 1992-07-20 | 1999-09-15 | Univ Duke | Zusammensetzungen die die hiv replikation inhibieren |
US6017536A (en) * | 1993-06-07 | 2000-01-25 | Trimeris, Inc. | Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities |
US5464933A (en) * | 1993-06-07 | 1995-11-07 | Duke University | Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission |
US6479055B1 (en) * | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
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-
2002
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013127300A1 (zh) * | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | 用于抑制hiv的多肽、其药物组合物及其用途 |
CN103974971A (zh) * | 2012-02-28 | 2014-08-06 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | 用于抑制hiv的多肽、其药物组合物及其用途 |
CN103974971B (zh) * | 2012-02-28 | 2016-09-14 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | 用于抑制hiv的多肽、其药物组合物及其用途 |
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CA2224008A1 (en) | 1996-12-19 |
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