CN1203603A

CN1203603A - 由抗－Fc受体抗体组成的治疗化合物

Info

Publication number: CN1203603A
Application number: CN96196166A
Authority: CN
Inventors: Y·M·德奥; J·高尔斯丁; R·格拉兹尔诺; C·索马孙达拉姆
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1998-12-30
Also published as: IL122423A0; US6395272B1; WO1996040789A1; US6270765B1; IL122423A; KR19990022644A; AU6383596A; CN101092453A; CA2220461A1; US20020032312A1; CA2220461C; NZ312328A; US5837243A; EP0832135A1; KR100320631B1; JPH11501522A; US6410690B1; MX9709324A; JP3262124B2

Abstract

披露了对Fc受体(FcR)特异性的多特异性多价分子,以及该分子的治疗用途和生产方法。

Description

由抗-Fc受体抗体组成的治疗化合物

发明背景

免疫球蛋白(Igs)由两个重链和两个轻链组成，每条链都含有决定抗体和效应基因功能的NH₂-末端抗原结合可变区和COOH-末端恒定区。Ig重链的COOH-末端区形成Fc区段，并通过与被称作Fc受体(FcRs)的特异受体的相互作用参与激发细胞活性。所有Ig类型或同种型(如IgG(FcγR)、IgE(FcεR)、IgA(FcαR)、IgM(FcμR)和IgD(FcδR)的Fc受体均已得到鉴定。不同的同型抗体的不同生物学活性部分取决于其与不同的免疫(效应基因)细胞上表达的不同FcR的结合能力(Fridman，W.H.(1991年，9月)，The FASEB Journal Vol.5，2684-2690)。已制备出抗FcRs的鼠源抗体(例如，参见US 4,954,617)，题为“Monoclonal Antibodies To FcReceptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes，和国际专利申请公开号WO 91/05871，题为“Monoclonal AntibodySpecific for IgA Receptor)。

鼠源单克隆抗体可以用作人的治疗剂，并可以在生产中不受人体病原，如肝炎病毒或人体免疫缺损病毒的污染。不过，鼠源单克隆抗体在某些人体治疗上的应用会导致对“外源鼠蛋白的免疫反应的发生。这种反应被称为人抗小鼠抗体或HAMA反应(Schroff，R.等(1985)，Cancer Res.，45，879-885)，它是一种会在人体内导致血清病变的症状，并导致所述鼠源抗体从患者的循环系统中快速清除。业已证实，在人体中的免疫反应是同时针对鼠源免疫球蛋白的可变区和恒定区的。

可以用重组DNA技术改变抗体，例如，通过用一种免疫球蛋白区段取代另一种特定免疫球蛋白区段。Neuberger等(PCT/GB85/00392)披露了一种方法，其中，可将一种种属Ig分子的互补重链和轻链可变区与另一种属Ig分子的互补重链和轻链Ig恒定区结合。该方法可用于取代鼠源恒定区段结构域，以产生可用于人体治疗的“嵌合”抗体。一种用Neuberger等所披露的方法生产的嵌合抗体，具有用于有效刺激抗体介导的效应基因功能(如补体固定)的人Fc区段，但仍具有诱发人抗鼠(“外源”)可变区的免疫反应的能力。

Winter(英国专利申请号GB2188538A)披露了一种用于改变抗体的方法，是通过用另一种种属的互补决定区取代该互补决定区(CDRs)。可将该方法用于将来自鼠单克隆抗体的可变区域的具有理想结合特性(例如与人体病原结合)替换到人重链和轻链Ig可变区域中。然后可将上述改变了的Ig可变区与人Ig恒定区结合，以产生除取代的鼠CDRs外其组成全部来自人体的抗体。Winter所披露的“改型”或“人源化”抗体在人体中引起的免疫反应明显弱于嵌合抗体的，因为其鼠源成分明显较少。另外，改变了的抗体在循环系统中的半衰期接近天然人抗体的半衰期。不过，如Winter所述，仅仅用对诸如病毒或细菌蛋白之类的抗原具有特异性的另一种抗体的互补CDRs取代所述CDRs，并不总会产生具有所需结合能力的改变了的抗体。在实践中，抗体可变区构架中的某些氨基酸与组成CDRs的氨基酸残基相互作用，这样氨基酸置换到人Ig可变区中可能为恢复抗原结合力所需。

已制备出包括一个抗Fc受体部分和一个抗靶部分的双特异分子(如，异种抗体)并用于治疗，例如，用于治疗癌症(如乳腺癌或卵巢癌)或致病性感染(例如，HIV)(例如参见国际专利申请公开号WO 91/05871，题为“Bispecific Heteroantibodies With Dual EffectorFunctions”；和国际专利申请号WO 91/00360，题为“BispecificReagents for AIDS Therapy”)。另外，可以给患者施用能识别抗原和抗原呈递细胞的双特异分子，以刺激免疫反应(例如，参见国际专利WO 92/05793，题为“Targeted Immunostimulation With BispecificReagents”)。

发明概述

一方面，本发明的特征是多特异性的多价分子，其最少包括一个抗-Fc受体部分、一个抗靶部分并选择性地包括一个抗增强因子(抗-EF)部分。在优选实施方案中，所述抗Fc受体部分是一个抗体片段(例如，Fab或(Fab′)₂片段)，抗靶部分是一种配体或抗体片段，而抗-EF部分是一种抗参与细胞毒性活性的表面蛋白的抗体。在一特别优选的实施方案中，所述重组抗-FcR抗体、片段或配体是“人源化的”(例如，至少有一部分源于非人抗体(如鼠源抗体)的互补决定区(CDR)，其余部分源于人体)。

另一方面，本发明的特征是用于产生多特异性分子的方法。在一实施方案中，将两种特异性编码于同一种载体中，并在一种宿主细胞中表达和组装。在另一实施方案中，通过重组产生各种特异性，所得到的蛋白或肽通过重链C-末端铰链区的硫氢键相互缀合在一起。在一特别优选的实施方案中，在缀合之前对铰链区进行修饰，以使其仅含有一个硫氢残基。

可以对由此所产生的重组抗体和多特异分子进行加工，以提高其亲和性和特异性。另外，当给人体服用人源化抗体时，其致免疫性较差。通过阅读以下的详细说明和权利要求，可以更好地理解本发明的其它特征和优点。

图1是人源化FcγRI抗体H22的部分铰链区的核苷酸和氨基酸残基序列。将[A]改变，以产生截短的单硫氢形式[B]，然后再进一步改变，以加工出两个独特的克隆位点[C]。下面画线的核苷酸表示的以前的序列不同处。上面画线的核苷酸是所示限制位点的识别序列。

图2是重链-EGF融合表达结构pJG055的示意图。

图3是抗-Fc受体配体双特异分子产生的示意图。

图4是用于检验人源化Fcγ受体-表皮生长因子融合蛋白活性的流式细胞测量法的示意图。

图5是由平均荧光强度(MFI)绘成的关系图，表示各种浓度的表皮生长因子(EGF)融合蛋白(H22-EGF融合)和全人源化双特异性(BsAb)H447与EGF受体(EGFR)表达1483细胞的结合。

图6是在有和没有结合EGFR的鼠抗体M425的条件下，各种浓度的EGF融合蛋白或BsAb H447与A431细胞结合的关系图。

图7是各种浓度的EGF融合蛋白、BsAb H447或H425抗体与A431细胞结合而产生的抗体依赖型细胞毒性(ADCC)的关系图。

图8是在单独有培养基、含有25％人血清(HS)的培养基或含有Fcγ受体抗体m22的fab片段的培养基存在条件下，因EGF融合蛋白、BsAb H447或H425抗体的结合而产生的ADCC方框图。

图9是在有各种量EGF、H22-EGF、H22的Fab片段(H22Fab)或H425的F(ab′)₂片段(H425 F(ab′)₂)的条件下培养的活A431细胞数的示意图。

图10是H22 Fd-HRG融合蛋白的氨基酸序列。

图11是表示特异PC-3或SKBr-3肿瘤细胞杀灭百分比的直方图，所述细胞的致死是因为用由干扰素-γ处理的单核细胞，和来自表达H22-heregulin融合蛋白的骨髓瘤细胞的上清液1∶3或1∶30稀释液一起培养这些细胞所致。

图12是表示在有单核细胞和有各种浓度的H22-蛉蟾肽融合蛋白的条件下，PC-3肿瘤细胞溶胞百分比示意图。

图13是用于检验通过O-PDM或DTNB法产生的BsAb 447活性的流式细胞测量法的示意图。

图14是表示各种浓度O-PDM和DTNB衍生的BsAb 447与EGFR的MFI和FcγRI表达A431细胞的关系图。

图15是因源于BsAb 447的的O-PDM和DTNB与A431细胞结合，而产生的抗体依赖型细胞毒性的关系图。

图16是说明三特异性抗体的构建流程图。

图17表示一种二价双特异抗体转化成三价双特异抗体。对二价双特异缀合物进行还原，并与O-PDM处理过的520C9 Fab′混合，结果形成TsAb。

图18表示对HER2/neu(A部)和EGFR(B部)进行的双功能荧光激活细胞分选测定。

图19是各种浓度抗体BsAb或TsAb与靶细胞结合的关系图。随着Ab结合加强平均荧光强度(MFI)增强。可以看出，TsAb能以剂量依赖形式同时结合SDBr-3细胞上的HER2/neu和可溶性FcγRI。

图20表示TsAb以剂量依赖形式同时结合A431细胞上的EGFR和可溶性FcγRI。该测试与图19所用方法相似。

图21表明TsAb、M22×H425×520C9和BsAb、M22×520C9能够诱导SKBR-3细胞的ADCC，但BsAb、M22×H425不能。将各种浓度的抗体与SKBR-3细胞和预先激活的PMNs一起培养。

图22表明TsAb、M22×H425×520C9和BsAb、M22×H425能够诱导A431细胞的ADCC，但BsAb、M22×520C9不能。该测定以类似于图21的测定方式进行。

图23是全血调制测定的流程图(图A)及该测定的结果(B部)。此种三价抗体可迅速调制来自单核细胞表面的FcγRI。

图24的A部表示编码野生型(TT830)和突变型(TT833)破伤风毒素肽的寡核苷酸的氨基酸序列。B部是H22 Fd-TT融合蛋白示意图。

图25的A部、B部和C部表示MD×H210、Fab22-TT830和H22-TT833S分别与FcγRI阳性U937细胞结合的流式细胞测定分析结果。虚线表示负对照，实线表示用融合蛋白染色，点划线表示由鼠mAb22F(ab′)₂封闭的融合蛋白结合。

图26表示各种量的融合蛋白MD×H210、FAb22-TT830、和Fab22-TT833S与FcγRI阳性U937细胞培养所产生的平均荧光强度的示意图。

图27表示与照射过的单核细胞和各种浓度的TT830、Fab22-TT830、TT、或TT947一起培养的T细胞增殖示意图，表明融合蛋白Fab22-TT830加强的Th表位呈递比TT830高大约1000倍。

图28表示与1000nM的TT830或10nM FAb22-TT830和单核细胞一起培养的、和在加入所述T细胞和抗原之前用饱和量的mAb22F(ab′)2预培养或未预培养过的T细胞增殖情况直方图。

图29表示在没有(对照)或有IgG的条件下，与单核细胞和5nMFab22-TT830或1000nM TT830一起培养的T细胞的增殖情况直方图。

图30的A部B部表示与单核细胞和各种浓度的TT830或Fab22-TT830一起培养2天的T细胞的上清液中，IFN-γ的浓度(A部)和IL-4的浓度(B部)。

图31表示与单核细胞和各种浓度TT833S、Fab22-TT833S或TT830一起培养的T细胞增殖的示意图。

图32表示与TT830和单核细胞一起培养2天、与各种浓度的TT833S预培养过夜的T细胞增殖的示意图。

图33表示与TT830和单核细胞一起培养2天、用各种浓度的TT833S或FAb22-TT833S预培养过夜的T细胞增殖抑制百分比的示意图。

图34表示与单核细胞一起培养2天的T细胞的增殖，在加入T细胞之前先将单核细胞与TT830一起培养4小时(预脉冲)，然后再与10μM TT833S或0.1μM Fab22-TT833S(追加)一起培养过夜。

图35表示与单核细胞和TT830、FAb22-TT830、TT833S、和Fab22-TT833S一起培养的T细胞上清液中干扰素-γ(IFN-γ)和IL-4的直方图。

图36是只用培养基中的单核细胞刺激、与TT833S或与Fab22-TT833S一起刺激一天，然后用单核细胞和各种浓度的TT830再刺激2天的T细胞增殖的示意图，表明TT833S和Fab22-TT833S不会引起T细胞无反应性。

图37表示编码具有一种对FcγRI(H22)的结合特异性和一种对癌胚抗原(CEA)的结合特异性的单链双特异分子的两个表达构件(构件321和323)，和编码一种具有对FcγRI结合特异性的单链抗体的表达构件。其编码区受控于CMV启动子(CMVPr)。除了来自抗体的重链的可变区(VH)和氢链的可变区(VL)之外，由上述构件编码的蛋白融合于来自c-myc·(c-myc)的肽上和六组胺肽(H-6)上。

图38表示通过双特异ELISA测定的，由表达构件321(321-A5和321-B4)和323(323-B2和323-C4)编码的单链双特异性分子H22-抗-CEA与由构件225(225-C2)编码的单链H22抗体的结合水平的直方图。

图39是单链人源化抗FcγRI抗体的核酸序列和由所述核酸编码的氨基酸序列。

图40是具有对FcγRI结合特异性和对CEA结合特异性的单链双特异性分子的核酸序列和由该核酸编码的氨基酸序列。

发明详述

多特异分子

本发明涉及重组多特异分子。多特异分子可包括由抗-Fc受体部分和抗靶部分组成的双特异分子，其中，至少上述部分之一是用重组DNA技术构建的。多特异分子还可包括由一个以上抗Fc受体部分或抗靶部分组成的分子；由至少一个抗Fc受体、一个抗靶部分和能识别另一分子的另一部分或几部分组成的分子，其中，至少所述部分之一是用重组DNA技术构建的。

“抗Fc受体部分”是指一种抗体、一种功能性抗体片段(例如，Fab片段)或识别并结合一种效应细胞上的Fc受体的配体。用于本发明的优选抗体能在一个未被内源免疫球蛋白结合的位点上结合效应细胞上的Fc受体。最理想的是，抗Fc受体部分结合一种人FcγR(即，FcγRI、FcγRII或FcγRIII)。优选的人源化抗-FcγR单克隆抗体披露于PCT申请WO 94/10332和US 4,954,617中(上述专利所披露的全部内容被收作本文参考)。

本文所述“效应细胞”是指免疫细胞。特定的效应细胞表达特定的Fc受体并执行特定的免疫功能。例如，表达FcγRI的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞和树状细胞，参与供靶细胞特异性致死和将抗原呈递至免疫系统的另一部分。效应基因细胞上特定FcR的表达可以由细胞因子之类的体液因子调节。例如，业已发现FcγRI的表达可由干扰素γ(IFN-γ)上调。这种强化了的表达可加强FcγRI细胞对靶的胞毒活性。

特异结合于Fc受体的重组抗体或抗体片段优选为“人源化的”，即源于人抗体，但至少有一部分源于非人抗体的互补决定区(CDR)。对上述部分进行选择，以形成所述人源化抗体对人Fc受体的特异性。所述人源化抗体具有源于非人抗体的CDRs，而该抗体的其余部分则是人的。

所述抗体可以是完整的，即具有重链和轻链，或也可以是其任何片段，例如Fab或(Fab′)₂片段。所述抗体还可以是一种轻链或重链二聚体，或其任何小型片段，如Ladner等(US 4,946,778，授权日1990年8月7日)披露的Fv或单链构件，所述专利的内容特意被收作本文参考。

人源化抗体或其片段可以是任何能够保留非人CDRs的人抗体。优选的人抗体源于已知的蛋白，以NEWM和KOL作为重链可变区(VHs)，以REI作为IgK链可变区(VKs)。

插入人抗体的非人CDR部分的选择要使所述人源化抗体能充分结合Fc受体。可通过将一部分CDR插入人抗体，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检验所产生的人源化抗体的结合能力来选择一个足够的部分。

可以用至少一部分非人CDR置换特定人抗体的所用CDRs，或用非人CDRs仅置换某些CDRs。只需要置换能使人源化抗体与Fc受体结合所需数目的CDRs即可。WO 94/10332中披露了一种源于鼠单克隆抗体(mab)，即mab22的非人CDR，该申请的全部内容被收作本文参考。该mab22抗体对Fc受体有特异性，并进一步披露于1988年9月4日授权的US 4,954,617中，该专利的内容也被特意收作本文的参考。已于1992年11月4日将人源化mab22抗体生产细胞系以HA022CLI为名称保存于美国模式培养物保藏中心，入藏号：CRL11177。

可以用任何方法将一种抗体人源化，该方法可以用源于非人抗体的CDR置换人抗体的至少一部分CDR。Winter披露了一种可用于制备本发明人源化抗体的方法(英国专利申请GB 2188638A，申请日1987年3月26日)，该申请的内容被特意收作本文参考。可以通过寡核苷酸定量诱变，用非人CDRs置换人CDRs，该方法披露于WO 94/10332中，题为“Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin Gon Human Mononuclear Phagocytes”。

要求保护的多特异分子除含抗Fc受体部分之外，还可以包括“抗靶部分”，即一种抗体、一种功能性抗体片段或一种识别并结合病原体(例如，病毒、细菌、真菌)、病原体感染的细胞、癌或肿瘤细胞(例如，乳腺、卵巢、前列腺等)或患者(例如，人或动物)体内的其它不希望的细胞或一种抗体或其修饰形式的配体。另外，所述靶部分可以包括或针对一种抗原。一优选实施方案含有一种可用于刺激免疫系统的抗原，例如，在慢性感染的场合，耗尽循环系统中的抗原，并治疗肿瘤。特别优选的实施方案有一种结合于含有抗FcR抗体的多价分子的抗原。

本发明特定实施方案中，多特异分子含有一个配体。该配体可以是任何能与一种分子相互作用的配体。优选实施方案中，所述配体结合一种蛋白，例如癌细胞之类的靶细胞上的表面蛋白。优选配体包括对生长或分化因子之类的受体的配体。例如，一种多价分子可以包括表皮生长因子，或可以与表皮生长因子受体之类的受体相互作用的至少一部分或修饰形式。在本发明的另一优选实施方案中，所述配体是一种小型肽，如铃蟾肽、胃泌素释放肽(GRP)、雨滨蛙肽、神经介肽B或神经介肽C。所述肽的序列记载于US 5,217,955中，该专利的内容被收作本文参考。所述配体也可以是上述肽中任一种的修饰形式。所述修饰可以加强与所述受体的结合、减弱结合或不影响与受体的结合。配体的修饰还可将一种兴奋剂转化成拮抗物，以使该配体抑制而不是刺激细胞增殖。所述配体的修饰可以是至少一个氨基酸的增加、缺失、取代或修饰。

在本发明的具体实施方案中，一种多价或双特异分子包括一种抗原。在本文中，“抗原”一词是指任何天然的或合成的致免疫性物质，致免疫性物质的片段或部分，一种肽表位或半抗原。

本发明的一个实施方案中，用一种双-或多特异分子将一种抗原导向所述细胞，以加强其内化过程并由该细胞呈递，并最终刺激其中的免疫反应。在一具体实施方案中，双特异结合试剂与抗原特异性结合(直接结合该抗原的一个表位或间接结合于与该抗原连接的一个表位)，同时，结合一种抗原呈递细胞的表面受体，该细胞可以内化抗原，以便进行加工和呈递。在另一实施方案中，所述抗原连接于多-或双特异分子，同时结合一种抗原呈递细胞的表面受体。该双-或多特异分子的受体结合部分(以及该双-或多特异分子本身)结合抗原呈递细胞的受体。在某些场合，所述分子的结合基本上不受所述受体的天然配体的抑制。结果，所述抗原针对所述受体不会在所述配体的生理水平上受到抑制，所述靶受体仍然能结合所述配体并起作用。

有一种类型的抗原可以是变应原。“变应原”是指能在易感患者体内诱发变态反应或哮喘反应的物质。变应原的种类繁多，它可以包括花粉、昆虫毒液、动物毛发皮屑、真菌孢子和药物(例如青霉素)。天然的、动物的和植物的变应原的例子包括以下属所特有的蛋白：犬属(家犬)；表皮螨属(如美洲家刺皮螨)；猫属(家猫)；豚草属(豚草)；毒麦属(例如，Lolium perenne或多花黑麦草)；柳杉属(日本柳杉)；链格孢属(互生链格孢菌)；桤木；赤杨属(欧洲樟木)；桦木属(疣其桦木)；栎属(白栎)；樨榄属(欧橄榄)；蒿属(艾蒿)；车前草属(例如，长叶车前)；墙草属(例如，Parietariaofficinalis或Parietaeria judaicia)；小蠊属(例如，德国小蠊)；蜜蜂属(例如，多花蜜蜂)；柏木属(例如，地中海柏木、绿干柏和大果柏木)；桧属(例如，新疆圆柏，铅笔柏，欧洲刺柏和Junsperus ashei)；金钟柏(例如，Thuya orientalis)；扁柏属(例如，日本扁柏)；大蠊属(例如，美洲蠊)；冰草(例如，Agropyron repens)；黑麦属(黑麦)；小麦属(例如，小麦)；鸭茅属(例如，鸭茅)；羊茅属(例如，Festuca elatior)；早熟禾属(如草地早熟禾或Poa compressa)；燕麦属(燕麦)；绒毛草属(例如，绒毛草)；黄花茅属(例如，Anthoxanthum odoratum)；燕麦草属(例如，燕麦草)；翦股颖属(例如，小糠草)；梯牧草属(例如，梯牧草)；虉属(例如，五色草)；雀稗属(例如，paspalum notatum)；高梁属(例如，Sorghumhalepensis)和雀麦属(例如，无芒雀麦)。

很多变应原存在于豚草、禾本科植物或树木的花粉中，或存在于真菌、动物、屋内灰尘或食物中。作为一类，它们相对地抗蛋白裂解消化。优选的变应原是结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE，因此，引起I型过敏性超敏反应。当所述多价剂的至少一种特异性是针对IgG配体结合区以外的高亲和性Fc受体表位时，这种双特异结合剂可降低患者体内的超敏性。在变应原结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的IgE之前，通过双特异结合剂竞争IgE结合变应原可以实现上述目的，由此降低I型超敏反应的可能性。另外，作为将变应原导向FcγRI的结果，可能诱发T细胞对变应原的耐受状态，这种状态会干扰IgE-介导的I型反应。用显著低于目前采用剂量的变应原，诱导与IgE竞争结合变应原的IgG可以获得耐受性。

在某些场合，可能希望将本身为弱抗原性或非抗原性物质(如半抗原)结合于大的致免疫性蛋白(例如细菌毒素)之类的载体分子上，以便于给药。在这种情况下，可使所述双特异结合剂结合于与所述物质结合的载体的一个表位上，而不是结合于所述物质本身的一个表位上。

可直接或间接连接于本发明的多-或双特异分子的抗原可以是可溶性的或颗粒状；它可以带有B细胞表位、T细胞表位或同时带有二者。所述抗原可来源于细菌、病毒或寄生物。通常，所述抗原包括一种致病性生物的表面结构部分。例如，所述抗原包括一种病毒表面结构，如人免疫缺损病毒(HIV)的外被糖蛋白或肝炎病毒的表面抗原。另外，所述抗原可能与一种病变细胞相关，如肿瘤细胞，为治疗所述疾病可产生针对该抗原的免疫反应。所述抗原可以包括一种肿瘤特异性或肿瘤相关抗原，如表达于人乳腺和卵巢癌细胞的Her2/新原癌基因产物(Slamon等(1989)Science 244：707)。

可用本发明的多价分子在体外或体内处理患者的细胞。所述多价分子可被用于在培养中将抗原引导致抗原呈递细胞。从患者血液中分离并纯化免疫活性细胞。然后用包括所述抗原的多价分子处理所述细胞，或用所述抗原和具有对该抗原的结合特异性的多价分子处理所述细胞。由靶抗原呈递细胞对所述抗原进行加工，并将片段呈递到其表面。经过刺激之后，可将该细胞送回患者体内。

可将本发明方法用于提高或加强对抗原的免疫反应。例如，本发明方法可用于治疗慢性感染，如肝炎和AIDS，而未受该辅助的免疫系统不能克服所述感染。当需要加强针对入侵生物的免疫反应时，可将该方法用于治疗感染的急性期。

该方法可用于降低为获得保护或治疗免疫反应所需的抗原剂量，或用于宿主对所述抗原无反应或反应很弱的场合。尽管降低抗原剂有效剂量普遍所希望的，但当抗原对宿主是有毒性的情况下(如变态反应)，则降低剂量特别有利。用包括一种抗原，或包括一种与抗原相互作用的抗体之类的配体的双-或多特异分子之方法和用途，进一步披露于公开的PCT申请PCT/US91/07283中。

本发明的另一实施方案中，一种多特异分子包括一个经过修饰的抗原，以便当抗原呈递细胞将修饰的抗原呈递给T细胞时，其对T细胞活性的影响得到改变。Allan等已证实，置换能刺激T细胞，例如刺激T细胞增殖的肽中一个或几个氨基酸，可得到一种不能刺激该T细胞或诱导该T细胞无反应的抗原。这种修饰肽被称作改性肽配体(APL)。因此，所述APLs可连接于具有至少一种对FcγRI的结合特异性的双特异或多特异分子。当所述分子被抗原呈递细胞吞噬并呈递给T细胞时，该T细胞的增殖可能被抑制或使其无反应。因此，给患者施用一种包括下述物质的多价分子：(a)抗原的至少一种改性肽，该抗原正常情况下能刺激T细胞，但经过修饰以后诱导该T细胞无反应，和(b)至少一种抗FcγRI抗体，该抗体可以诱发该患者对所述抗原的耐受性。因此，可将所述多-或双特异分子用于使患者对各种抗原，如自身抗原产生耐受性。因此，根据所用的抗原，本发明方法可提供加强免疫反应的方法，即通过使用能刺激T细胞的抗原，本发明还提供了通过抑制T细胞刺激或诱导T细胞无反应，来减弱免疫反应的方法。

本发明的多特异、多价分子还可包括一个“抗增强因子(抗-EF)部分”。“抗增强因子部分”可以是一种抗体、功能性抗体片段或与抗原结合的配体，由此加强抗Fc受体部分或抗靶部分的作用。所述“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶。包括结合于靶细胞抗原的抗靶部分，和结合于不同靶抗原的抗增强因子部分的多价分子，特别适用于所述靶细胞进行抗原调制或抗原性变化(例如，已公开的对某些寄生虫(如锥虫)而言)。或者，所述抗增强因子部分可以结合于不同于与抗靶或抗Fc受体部分结合的实体的一种实体。例如，抗增强因子部分可以结合一种细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或能加强对所述靶的免疫反应的其它免疫细胞)。

制备多特异分子的方法

可以用多种方法制备上述多特异分子。例如，两种特异性可编码于同一个载体中，并在同一个宿主细胞中进行表达和组装。当多特异分子是下面例2所述的配体X fab融合蛋白时，该方法特别适用。本发明的双特异分子也可以是一种单链双特异分子，如单链双特异抗体，包括一个单链抗体和配体的单链双特异分子，或包括两个配体的单链双特异分子。多价分子还可以是单链分子或可以包括至少两个单链分子。用于制备双-或多价抗体的方法例如披露于下列美国专利中：US 5,260,203；US 5,455,030；US 4,881,175；US 5,132,405；US5,091,513；US 5,476,786；US 5,013,653；US 5,258,498；和US5,482,858。

所述单链分子与其特异靶的结合可以用本文实施例中所披露的双特异ELISA试验加以证实。

另外，多特异分子的每一种特异性可以分别产生，而将所得到的蛋白或肽彼此缀合在一起。例如，两个人源化抗体可以通过两个重链的C-末端铰链区的硫氢基结合而缀合在一起。在一最佳实施方案中，对所述铰链区进行修饰，以使其在缀合之前包括奇数个(优选1个)硫氢基残基。

可以用下面实施例所披露的方法或本领域众所周知的方法，通过缀合抗FcR和抗靶部分制备本发明的双特异分子。例如，可将各种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的例子包括蛋白A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(例如，参见Karpousky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)、Brennan等(Science(1985)229：81-83)和Glennie等(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)所披露的方法。优选的缀合剂为SATA和磺基-SMCC，二者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)购买。

多特异分子的治疗用途

根据具体的多特异分子结合带有FcR的免疫细胞和特异靶细胞的能力，可将其施用于患者，以治疗或预防多种疾病或症状，包括：癌症(例如，乳腺癌、卵巢癌、肺部小细胞癌)、病原体感染(如HIV等病毒)、病原虫(如鼠弓形体)、真菌(如念珠菌)；自身免疫性(如免疫性血小板减少性紫癜和系统性狼疮)。还可将所述多特异、多价分子用于预防接种，使患者能抗靶细胞的感染。

为了用于治疗，可以用任何方式给患者施用有效量的合适的多价分子，只要该分子发挥预期的治疗作用。优选的施用方法包括口服和经皮(例如，经膜片)施用。其它施用方式的例子包括注射(皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内注射等)。注射也可以分批或连续输液形式进行。

多特异分子可同一种可以药用的载体一起施用。在本文中，“可以药用的载体”意欲包括能和一种多特异分子同时施用，并使该分子能发挥其预期作用的物质。所述载体的例子包括溶液、溶剂、分散介质、缓释剂和乳剂等。将所述介质用于可以药用的活性物质为本领域所熟知。任何适宜于所述分子的其它常见载体均落入本发明范围之内。

多特异分子的“有效量”这一表达方式，是指实现预期的生物学效果所必需的量，或足够实现所述效果的量。例如，一种有效量的多特异分子(其中，抗靶部分能识别致病性细胞)可能是消除肿瘤、癌症或细菌、病毒或真菌感染所需的量。用于任何特定目的的有效量均可根据以下因素而变化，如被治疗的疾病或症状、所服用的具体多特异分子、患者的体重、或疾病或症状的严重度。本领域普通技术人员可凭经验确定一种特定多特异分子的有效量，无需做过多实验。

以下的实施例将对本发明做进一步说明，这些实施例并不构成对本发明的进一步限定。在本文中所引用的所有文献、待批专利申请和公开的专利的内容特别收作本文的参考资料。

实施例例1：生产包括对Fc受体特异性的鼠源或人源化抗体和抗-her2 neu

抗体的双特异抗体

单克隆抗体

通过离子交换层析从杂交瘤上清液中纯化抗FcγRI单克隆抗体(mAbs)、M22、M32.2和197，通过蛋白A亲和层析(Pharmacia，Piscataway，NJ)和凝胶过滤从杂交瘤上清液中纯化DZ33，即人抗-HIV-1IgGl mAb。已于1987年7月1日将M32.2交由美国模式培养物保藏所(12301Parklawn Drive，Rockville，MD20852)保藏，确定的ATCC入藏号为HB9469。

细胞系

鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)是一种非Ig合成细胞系，将其用于表达重组mAbs。在补充了10％的胎牛血清(FBS，Gibco，Paisley，U.K.)的DMEM中培养NSO细胞。SKBR-3是人乳腺癌细胞系，它能过度表达HER2/neu原癌基因(ATCC，Rockville，MD)，在Iscove氏改进的Dulbecco氏培养基(IMDM，Gibco，Grand Island，NY)中培养所述细胞。U937是获自ATCC的单核细胞系，它能表达FcγRI，在补充了10％FBS(Gibco，Grand Island，NY)的RPM-1640中生长该细胞系。

克隆鼠免疫球蛋白V区基因

用Favaloro等所述方法从鼠杂交瘤22中制备细胞质RNA(Favaloro，J.R.Treisman和R.Kamen(1982)Transcription maps ofpolyoma-specific RNA：analysis by two-dimensional S1 gelmapping。Meth.Enzymol.65：718)。通过由引物CG1 FOR和CK2FOR启动的逆转录从RNA制备IgV区cDNAs，该方法披露于国际专利申请WO94/10332中，题为“Humanized Antibodies to FcReceptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes”。所述cDNA合成是在标准条件下用100U MMLV逆转录酶(LifeTechnologies Paisley，UK)完成的。通过PCR扩增V_H和VkcDNAs(Orlandi，R.，D.H.Güssow，P.T.Jones和G.Winter(1989)(Cloningimmunoglobulin variable domains for expression by the polymerase Chainreaction)，Proc，Natl，Acad.Sci.USA 86：3833)，该扩增采用与披露于WO94/10332中的SH2BACK和VK7BACK相关的cDNA引物。纯化扩增的V_H和Vk DNA，克隆到M13中，并用T7 DNA聚合酶(Pharmacia，Piscataway，NJ)通过双脱氧法测序。

构建嵌合抗体基因

为了便于将鼠V区DNA克隆到表达载体中，在紧靠两个M22 V区基因的末端处设置限制位点。就V_H而言，用VH1BACK和VH1FOR(Id.)通过PCR将一个5′PstI位点和一个3′BstE II位点引入克隆的V_H基因。就Vk而言，用引物VK1BACK和VK1FOR(Id.)通过PCR将一个5′PvuII位点和一个3′BglII位点引入克隆的鼠Vk基因。在某些场合，所述引物相对某天然序列改变了一个或几个氨基酸。用合适的限制酶切下所述V区基因(ChVH和ChVK)，并克隆到含有Ig启动子、信号序列和剪接位点的M13VHPCR1和M13VKPCR1(Id.)上。将所述DNA以HindIII-BamHI片段的形式从M13上切下，并克隆到含有人IgG1(Takahashi，N.等，(1982)，Structure of humanimmunoglobulin gamma genes：implications for evolution of a genefamily，Cell，29：671)、和人κ恒定区(Hieter，R.A.等，(1980)Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J regiongenes conserve homology in functional segments，Cell 22；197)、区域基因组DNA的表达载体pSVgpt和pSVhyg上。

构建人源化抗体基因

根据人NEWM(Poljak，R.J.等，Amino acid sequence of the V_Hregion of a human mycloma immunoglobulin，(IgG New)，Biochemistry，16：3412)和KOL(Marquat，M.等，(1980)Crystallographicrefinement and atomic models of the intact immunoglobulin molecule Koland its antigen-binding fragment at 3.0A和1.9A resolution J.Mol.Biol，141：369)的V_HS构建两种人源化重链。人源化轻链源于人Bence-Jones蛋白REI(Epp，O.等(1974)Crystal and molecular structure ofa dimer composed of the vandible portion of the Bence-Jones ProteinREI，Eur J.Biochem.45：513)，其带有某种构架区(FR)变化。所进行的修饰使得Vk区更接近人的亚群I，并包括用Lys39、Val104、Glu105和Lys107置换Thr39、Leu104、Gln105和Thr107。另外，将Met4换成Leu4，以容纳一个Pvu II限制位点。

将含有NEWM V_H和REI VkFRs的DNA与无关的CDRs克隆到载体M13VHPCR1和M13VKPCR1(Favaloro等，同上)上。用编码KOLFR氨基酸和无关的CDRs的寡脱氧核苷酸，通过一系列的序贯PCRs构建编码KOL V_H的DNA。然后将该构件克隆到M13VHPCR1上。

合成编码mAB M22 CDRs的寡脱氧核苷酸，其侧翼为相当于人FRs的核苷酸。就基于NEWM的人源化V_H而言，其引物包括鼠FR氨基酸Phe 27，Ile28和Arg71，因为它有可能影响抗原结合(Chothia，C.和A.M.Lesk(1987)，Canonical structures for the hypervariabieregions of immunoglobulins，J.Mol.Biol.，196：901；Tramontano，A.等，(1990)，Framework residue 71 is a major determinant of theposition and conformation of the second hypervaniable region in V_Hdomains of immunoglobulins，J.Mol.Biol.215：175)。就人源化V_K而言，同样包含一个影响其亲合性的鼠源氨基酸Phe 71(Foote，J.和G.Winter，(1992)，Antibody framework residues affecting theconformation of the hypervariable loops，J.Mol.Biol.224：487)。在KOL V_H中不含鼠源FR残基。在含有M13 ssDNA模板的反应中，将5′-磷酸化的带有与人V区基因退火的M13通用正向引物的寡脱氧核苷酸克隆到M13上。将该DNA延长，并用2.5U T7 DNA聚合酶(UnitedStates Biochemicals，Cleveland，OH)和0.5U T4 DNA连接酶(GibcoBRL，Grand Island，NY)连接。用M13反向测序引物和1U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)从所述延长/连接混合物中优选扩增突变链，然后用M13正向和反向引物进行PCR扩增。用BamHI和HindIII切割DNA产物，克隆到M13上，并通过DNA测序鉴定三链CDR-接枝突变体。

对含有人源化V区的M13克隆的整个序列进行测序，以确保没有假突变。用HindIII和BambHI消化来自经证实的克隆的RF DNA，将其克隆到pSVgpt或pSVhyg上，并像构建嵌合抗体基因那样精确加入人IgG1或人κ恒定区。

重组mAbs的表达和纯化

用PvuI消化重(5μg)和轻(10μg)链表达载体，用乙醇沉淀，并溶于50μl水中。通过离心收获NSO细胞(1-2×10⁷)，再悬液于0.5ml DMEM中，并与所述DNA在0.4cm的电击小池中混合。5分钟之后，在冰上对所述细胞进行一次170V，960μF的脉冲(GenePulser，Bio-Rad，Melville，NY)，并在冰上再培养15分钟。让所述细胞在DMEM中恢复24-48小时。然后通过加入霉酚酸(0.8μg/ml)和黄嘌呤(250μg/ml)使该培养基具有选择性。将200μl的样品等分样加到96孔平板上。再经过10-12天之后，选择通过ELISA测定，抗体含量最高的孔中的细胞，并通过有限稀释进行克隆。

通过蛋白A亲和层析(Boehringer Mannheim，Lewes，U.K.)从过分生长的培养物中纯化抗体。通过测A_280nm确定其浓度，并通过ELISA和SDS-PAGE验证。

测定抗体结合的ELISA

用溶于50mM碳酸氢盐缓冲液，pH9.6中的山羊抗人IgM抗体(Sera-Lab，Crawley Down，U.K.)涂敷微量滴定板的孔。用1％BSA封闭该板，然后加入由人FcγRI的胞外区和获自瞬时转染的COS细胞(表达载体由马萨诸塞州、波士顿市、Massachusetts GeneralHospital的Brian Seed博士惠赠)的人IgM重链(sFcγRI-μ)组成的。可溶性融合蛋白。然后在有过量(2.2μg/孔)的含有λ轻链的人IgG1抗体(Sigma，St.Louis，MO)的条件下，加入重组体22或对照mAbs，以便通过其Fc部分阻止试验mAbs的非特异结合。用过氧化物酶标记的山羊抗人κ链抗体(Sera-Lab，Crawley Down，U.K.)和邻苯二胺检测结合的22mAbs。

抗体的荧光素标记

通过加入0.1M Na₂CO₃将mAb溶液的pH调至9.3。以2mg/ml的浓度，将异硫氰酸荧光素(FITC)(Sigma，St.louis，MO)溶于DMSO中。每毫克mAb中加入40μg FITC，并在室温下培养2小时。通过G-25层析从游离的FITC中分离荧光素化的mAb。

制备血细胞

从肝素化的静脉全血中制备血沉棕黄色层。以2.5∶1(v/v)的比例，用含有5％葡聚糖的RPMI稀释全血。在冰上让红细胞沉降45分钟，然后将上清液里的细胞转移至一支新试管，并通过离心沉淀。通过低渗溶胞除去残余的红细胞。将残余的淋巴细胞、单核细胞和嗜中性白细胞保持在冰上，直到用于结合试验。在某些实验中，通过Ficollhypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)梯度分离将嗜中性白细胞同单核细胞分离。为了上调FcγRI，用细胞因子处理嗜中性白细胞和单核细胞。在Teflon平皿中，以4×10⁶细胞/ml RPMI的浓度在37℃、5％CO₂条件下将单核细胞培养物培养48小时，所述RPMI中含有2.5％正常AB型人血清(Sigma，St.Louis，MO)和500 IRU/ml IFN-γ(R&D Systems，Minneapolis，MN)。在含有50ng/mlG-CSF(由德国Erlanger大学的R.Repp惠赠)和500 IRU/ml IFN-γ的AIMV培养基(Gibco，Grrand Island，NY)中将嗜中性白细胞培养，48小时(37℃，5％CO₂)。

流式细胞测定

如上所述，用96孔微量滴定板进行细胞结合测定(Guyre，P.M.等，Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on FcγR are ableto trigger receptor function.J.Immunol.，143：1650)。简言之，用含有2mg/ml BSA和0.05％NaN₃(PBA)的PBS，pH7.4洗涤细胞，并用PBA调至2.0×10⁷细胞/ml。在PBA中制备FITC-标记的和非缀合的抗体。将细胞(25μl)、抗体(25μl)和人血清(25μl)、或人IgG(10mg/ml，Sigma，St.louis，MO)(25μl)、或PBA(25μl)加入所述微量滴定板中，并在冰上放置45-60分钟。用PBA洗细胞3次，以除去孔中未结合的抗体。用1％的多聚甲醛固定细胞。在一台Becton Dickinson FACScan上分析带荧光的细胞。

BsAb偶联方法

用Glennie等的方法(Glennie，M.J.等，(1987)，Preparationand performance of bispecific F(ab′gamma)²，antibody containingthioether-linked Fab′gamma fragments，J.Immunol.，139：2367)构建BsAb。通过体外培养相应的杂交瘤细胞生产mAbs22(鼠源和人源化的)和520C9(抗-HER2/neu)抗体。用胃蛋白酪分别消化所述抗体，以产生F(ab′)₂，然后加入10mM巯基乙醇胺(MEA)在30℃下作用30分钟将其还原成Fab′。将Fab′片段加注到在50mM乙酸钠、0.5mM EDTA，pH5.3(4℃)中平衡过的Sephadex G-25柱上。将溶于二甲基甲酰胺中的、并在甲醇/冰浴中冷却的邻苯二马来酰亚胺(O-PDM，12mM)加(一半体积)到M22×520C9情况下的鼠源22 Fab′中，和加至H22×520C9情况下的520C9 Fab′中，并在冰上培养30分钟。然后在用50mM乙酸钠，0.5mM EDTA，pH5.3(4℃)平衡过的Sephadex G-25上，从游离O-PDM中分离Fab′-马来酰亚胺。为了制备BsAbs，以1∶1的摩尔比将M22 Fab′-马来酰亚胺加入到520C9 Fab′或将520C9 Fab′-马来酰亚胺加入到H22Fab′。在Amicon室中用Diaflo膜在氮气下将反应物浓缩至起始体积(均在4℃下进行)。18小时以后，用1M Tris-HCl，pH8.0将其pH调至8.0。然后用10mM MEA还原该混合物(30分钟，30℃)，并用25mM碘乙酰胺烷基化。用在PBS中平衡过的Superdex 200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱将双特异F(ab′)₂与未反应的Fab′s和其它产物分离。

依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)

将HER2/neu过表达人乳腺癌细胞SKBR-3用作由细胞因子激活的嗜中性白细胞进行溶解的靶(参见血细胞制备一节)。在与嗜中性白细胞和抗体混合于U形底微量滴定板中之前，用100μCi⁵¹Cr标记靶1小时。在37℃下培养5小时后收集上清液，并分析其放射性。细胞毒性用以下公式计算：溶胞％＝(实验CPM-靶渗漏CPM/洗涤剂溶解CPM-靶渗漏CPM)×100％。比溶解度＝有抗体的溶解％-无抗体的溶解％。测定重复3次。

超氧化物诱导

将U937细胞用于测定H22经FcγRI诱发超氧化物突发产生的能力(Pfefferkorn，L.C.和G.R.Yeaman(1994)，Association of IgA-Fc receptors(Fc×R)With FcεRIγ2 Subunits in U937 Cells，J.Immunol.153：3228；Hallet，H.B.和A.K.Campbell(1983)。Twodistinct mechanisms for stimulating of oxygen-radical production inpolymorphonuclear leucocytes，Biochem J.216：459)。在有100U/mlIFN-γ(Genentech.S.San Francisco，CA)的条件下，在含有10％FBS(Hyclone，Logan，UT)的RPMI-1640(Gibco，Grand Island，NY)中将U937细胞培养5天，以诱导其分化并加强FcγRI表达。在实验当天，在37℃下于含有10％FBS的新鲜RPMI-1640中将上述分化细胞培养20分钟。然后将所述细胞沉淀，并再悬浮于补充了1mMCaCl₂、1mMMgCl₂、11mM葡萄糖和100μg/ml BSA(Sigma，St.Louis，MO)的PBS中，使其浓度为3×10⁶细胞/ml。为了诱发超氧化物释放，将100μl细胞加至100μl含有0.1mM鲁米诺(Sigma，St.Louis，MO)、0.5mM钒酸钠(Sigma，St.Louis，MO)、和mAbM22、H22或197的反应溶液中，并放入22℃的发光计中。在将所述细胞加入到发光计里反应溶液中之后，马上开始测定超氧化物的自发发生，每隔30-40秒测一次。为了同由M22、H22或197交联的FcγRI诱发的超氧化物比较，以10μg/ml的浓度使用每种mAb。监测以mV/秒为单位的超氧化物产生速度20分钟。以各种浓度加入MabM22、M32.2和197，以建立超氧化物产生的剂量关系。结果

鼠IgV区基因

用对鼠源重链和κ恒定区特异的引物，由M22杂交瘤RNA制备IgV区cDNAs，再采用一系列基于已知信号序列和/或成熟V区5′序列的引物进行PCR扩增。采用SH2BACK/CG1FOR和UK7BACK/CK2FOR引物组合获得预期大小的V_H和VκPCR产物。用合适的限制酶消化扩增的DNA，克隆到M13上，由至少24个独立的克隆测定沿两个方向的序列。推断氨基酸序列示于序列29和30中。Vκ的4N-末端残基由VKBACK引物编码。

M22 V_H和Vκ分别为鼠重链亚群IIID和κ亚群I的成员(Kabat，E.A.等，(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services)。除L97位的残基之外，M22 Vκ的氨基酸序列与鼠抗IgG mAb A17的氨基酸序列相同(Schlomchik，M.等，Variable region sequences of murine IgM anti-IgG monoclonal autoantibodies(类风湿因子)。II Comparison ofhybridonias derived bylipopolysaccharide stimulation and secondaryprotein immunization，J.Exp.Med.165：970)。

人源化mAbs及其结合的起始特征

M22 V_H FR与KOL(人亚群III)的同源性(79％)大于其与NEWM(人亚群II)的同源性(57％)。为了验证以上差别对结合的影响，根据包括鼠残基Phe27、Ile28和Arg71的NEWM V_H或根据无鼠FR氨基酸的KOL V_H构建重链。将两种人源化V_H与相同的REI-衍生的人源化轻链配合。

首先通过ELISA测定与FcγRI/IgM重链融合蛋白的结合评估人源化mAbs的亲合性。数据表明，KOL V_H/REI V_κmAb具有与嵌合的mAb相同的结合力，而NEWM V_H/REI Vκ mAb的亲合性大约低5倍。非特异人IgG1 mAb的低结合力表明，人源化mAbs的95％以上的结合力是由Fv部分产生，而不是由Fc区产生。

如果NEWM FR的附加变化预计能恢复其结合力，但这种变化可能产生新的表位，这种表位可以引起不希望的免疫反应。因此，选择被命名为H22和KOL V_H/REI mAb以进一步检测其结合特征。

mAb H22的功能特征

进行一系列的结合实验，以确定H22抗体的特异性和同种型。用和M22或H22缀合的荧光素染色的外周血白细胞，证实了与单核细胞的特异结合大约为每个细胞10⁴结合位点。相反，淋巴细胞或未刺激的嗜中性白细胞少有或没有特异结合(表1)：表1：H22与单核细胞的特异结合

抗体	单核细胞	淋巴细胞	PMNs
抗体	单核细胞	淋巴细胞	PMNs	M22	10,000^a	＜1000	＜1000
H22	10,500	＜1000	＜1000	M22	10,000^a	＜1000	＜1000

^a每个细胞的抗体位点，重复试验的平均值

为了证实H22结合于FcγRI上处于于M22相同的位点，并且还作为一种配体结合于Fc结合区，用两种抗FcγRI鼠源mAb(M22和M32.2)和一种人IgG1 mAb进行竞争实验。在有饱和FcγRI上的Fc结合位点的过量人IgG存在的条件下，未缀合的H22和M22均等竞争结合荧光素化的M22或荧光素化的H22。正如所预料的，抗FcγRI抗体M32.2在FcγRI上的结合位点，不同于M22的结合位点(Guyre，P.M.等，J.Immunol.143：1650)，而且也不能与M22-FITC竞争。另外，H22-FITC受H22的抑制而不受不相关的人IgG1 mAb的抑制，证实了FcγRI结合的特异性是由H22的V区产生。

H22，而非M22，通过荧光素化人IgG1能够竞争由Fc介导的与FcγRI的结合。该实验证实，H22的Fc部分，而非M22结合于FcγRI的Fc结合区。这与人IgG抗体(而非鼠源IgG1)的Fc部分以高亲和力结合FcγRI的能力一致。

由于M22的人源化主要是为了提高其免疫治疗效果，H22与单核细胞和细胞因子激活的嗜中性白细胞的结合活性在有人血清的条件下测定。在有或没有人血清的条件下，H22-FITC以类似的亲和力结合于单核细胞上的FcγRI。相反，由Fc介导的不相关的人IgG-FITC的结合能完全被人血清抑制。类似情况是，在有和无人血清的条件下，H22-FITC以类似的亲合力结合于IFN-γ-处理的嗜中性白细胞上。综上所述，这些数据表明，H22既能通过其V区结合于一个不同于Fc结合区的位点，又能通过其Fc区结合于FcγRI的配体结合区。前者的结合活性能有效克服人IgG1的抗体封闭。

H22 BsAb的功能活性

抗FcγRI抗体用于免疫治疗的最初用途是BsAbs的开发，BsAbs能将带有FcγRI的效应细胞连接到肿瘤细胞、病毒或病毒感染的细胞上。这种BsAb以M22开发；因此，将M22抗肿瘤BsAb(520C9×M22)和相应的H22 BsAb(520C9×H22)介导细胞毒性的能力进行比较。所述BsAbs由与抗HER2/neu抗体(520C9)的Fab′化学缀合的H22或M22 Fab′组成，因此对效应细胞触发分子FcγRI和肿瘤抗原有特异性。

通过ADCC测定比较M22衍生的和H22衍生的BsAbs。M22-和H22衍生的BsAbs介导HER2/neu超量表达SKBR-3细胞的致死。鼠源和人源化BsAbs对带有抗原的靶细胞有类似的溶解水平。另外，在有人血清的条件下，两种BsAb保持其ADCC活性，而过量M22F(a，b′)₂则产生完全抑制致死作用。综合上述结果可知，由H22 BsAb引起的溶解是通过M22表位介导的，而ADCC是FcγRI特异性的。

最后，测定了H22和M22刺激单核细胞样细胞系U937产生超氧化物的能力。仅能通过其V区与FcγRI结合的M22，只能诱导产生很少量的氧，可能是因为它不能够有效地交联所述受体。不过，H22可以通过其Fc区作为配体借助结合作用而与FcγRI交联，还可以作为抗体通过其Fv与FcγRI交联，可诱导更大量的超氧化物释放。例2：功能性H22-表皮生长因子融合蛋白的产生材料和方法

表达载体和克隆

用于H22的重链和轻链的基因组克隆的表达载体(pSVgpt和pSVhygt)披露于WO 94/10332中，题为“Humanized Antibodies to FcReceptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes”。对于Fab-配体融合构件来说，不需改变其轻链。不过，对于重链来说，必需将CH2和CH3区除去并代之以配体的编码序列。所述重链载体带有2个BamHI位点，一个位于VH和CH1之间的内含子中，另一个位于CH3的下游。利用上述BamHI限制位点，用仅编码CH1和大部分铰链区的截短形式置换编码恒定区的DNA。为此，用聚合酶链式反应(PCR)产生重链片段的新的C-末端，其改变如图1所示。

图1[C]所示构件由位于克隆限制性位点XhoI和NotI下游和BamHI位点上游的翻译终止密码子组成，所述BamHI位点被用于克隆产生VH下游CHI片段的新的PCR，该构件用于产生融合蛋白构件。所述克隆位点位于大部分铰链区的下游，以保持Fd与配体结构区之间的柔性，该克隆位点被用于插入编码EGF或其它配体的DNA。另外，保留了已有构件中的单一Cys残基，以便缀合形成二聚体分子。

通过PCR扩增编码所述配体的DNA，以便在编码区的N-末端形成XhoI位点，在其C-末端形成NotI位点，然后将其以正确阅读框架插入上述新合成的H22重链截短的片段的同一位点。编码表皮生长因子(EGF)的cDNA获自ATCC(#59957)。仅克隆了编码大约1200个残基的前体中成熟EGF的53个氨基酸(从Asn971开始，到Arg1023结束)的DNA(Bell，G.I.，Fong，N.M.，Stempien，M.M.，Wormsted，MA.，Caput，D.，Ku.，L.，Urdea，M.S.，Rall，L.B.&Sanchez-Pescador，R.Human Epidermal Growth Factor Precurser：cDNASequence，Expression In Vitro and Gene organization.Nucl.Acids Res.14：8427-8446，1986)。

表达

鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)是一种非-Ig合成系，将其用于表达所述融合蛋白。最终的表达载体为一种带有融入EGF框中的编码H22Fd的DNA的pSVgpt构件(如图2所示)，用一台BioRad GenePulser通过电击将其转录到NSO中，NSO预先已用含有编码H22轻链的DNA的pSVhyg构件转染过。上述多肽是由所述载体上的Ig启动子和Ig增强子表达，并由位于该构件N-末端的mAb22重链信号肽分泌。转染后1或2天，将霉酚酸和黄嘌呤加入培养基中，以选择摄入了所述DNA的细胞。在通过ELISA证实其结合活性之后，分离单个的生长菌落，并亚克隆。

纯化

对表达H22-EGF融合蛋白的细胞进行亚克隆和扩增。在离心培养物中扩增和生长所述融合蛋白表达克隆，并对上清液进行澄清和浓缩。在抗人κ链亲合柱(Sterogene.Carlsbad，CA)上进行亲和层析，实施小规模纯化。通过在非还原条件下，在5-15％丙烯酰胺梯度凝胶上进行SDS-PAGE，分析纯化的蛋白。图3是表示抗Fc受体配体融合蛋白产生的示意图。

双特异流式细胞测定

为了证实所述融合蛋白能够同时结合FcγRI和EGFR，开发出一种流式细胞测定法(图4)。在该测定中，将不同浓度的H22-EGF融合蛋白或双特异抗体BsAb H447(H22×H425，鼠单克隆抗体M425的人源化形式，它能在配体结合位点(E.Merck)处与EGFR结合)与A431细胞(表达EGF受体(EGFR)的细胞系，ATCC，Rockville，MD)一起培养。洗涤之后，加入含有由FcγRI的胞外区和人IgM的Fc部分组成的融合蛋白的上清液。最好加入藻红蛋白(PE)标记的mAb(32.2)，它结合FcγRI的位点不同于由mAb22结合的位点。然后通过FACSCAN分析所述细胞。或者，用过量(100μg/ml)全鼠mAb 425(E.Merck)抑制其与EGFR的结合，并通过PE-标记的抗人IgG检测bsAb或融合蛋白的结合。

ADCC

用⁵¹Cr致死试验测定由融合蛋白介导的ADCC。将EGFR超量表达细胞系A431，用作由在γ-干扰素(IFN-γ)中培养24小时的人单核细胞溶解的靶。在和效应细胞和抗体混合于U形底微量滴定板中之前，用100μCi的⁵¹Cr标记所述靶1小时。在37℃下培养5小时，然后收集上清液并分析其放射性。细胞毒性用以下公式计算：溶胞％＝(实验CPM-靶渗漏CPM/洗涤剂溶解CPM-靶渗漏CPM)×100％。比溶解度＝有抗体的溶解％-无抗体的溶解％。将融合蛋白介导ADCC的能力与相应BsAb的能力进行比较。同样在有25％人血清的条件下进行以上测定，以证实存在于人血清中的IgG或其它因子不会抑制融合蛋白介导的ADCC。结果

纯化

用H22-EGF重链构件转染表达H22κ链的NSO细胞，并筛选抗霉酚酸和黄嘌呤的克隆进行扩增，在抗人κ柱(Sterogene，Carlsbad，CA)上从上清液中亲合纯化所述融合蛋白。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白。该纯化蛋白以50-55kDa的表观分子量迁移，表明该融合蛋白是以单体形式而非二硫链连接的二聚体形式表达。另外，在表观分子量25kDa处发现一条带，可能是游离的轻链。

结合特异性

为了证实所述融合蛋白可同时结合FcγRI和EGFR，设计了一种双特异FACS测定。图5表明，用下述例3方法制备的化学交联的、全人源化BsAb H447(H22(抗-FcγRI)×H425)和H22-EGF融合蛋白可同时以依赖于剂量的形式结合于A431上的EGFR及可溶性FcγRI。

在配体结合位点结合EGFR的鼠源mAb、M425抑制融合蛋白或H22×H425结合的能力，证实了所述融合蛋白的EGFR特异性。在有或没有过量M425的条件下，将各种浓度的BsAb H447或H22-EGF融合蛋白与A431细胞一起培养。图6表示，BsAb和所述融合蛋白的结合能被M425抑制，证实了该融合蛋白对EGFR的特异性。

ADCC

以A431细胞为靶，分析所述融合蛋白介导ADCC的能力。将在有IFN-γ的条件下培养24小时的人单核细胞用作效应细胞。图7表明，全抗体、H425、BsAb H447(H22×H425)和融合蛋白能介导依赖于剂量的A431细胞溶解。图8表明，由全抗体介导的ADCC能被25％人血清(25％HS)抑制，而由融合蛋白介导的ADCC不受人血清抑制，在这一特定实验中，人血清可加强融合蛋白介导的ADCC。上述结果支持了所述分子的临床用途，因为已证实该融合蛋白可致死EGFR-超量表达细胞，即使体内存在FcγRI表达效应细胞时也是如此。

H22-EGF融合蛋白的生长抑制特性

尽管EGF可以刺激表达其受体的正常细胞生长，EGF还可以抑制超量表达EGF-R的肿瘤细胞的生长(Barnes，D.W.(1982)J.CellBiol.93：1，Macleod，C.L.等(1986)J.Cell Physiol.127：175)。用下述方法检测EGF和H22-EGF融合蛋白抑制A431细胞生长的能力。

将2×10⁴A431细胞加至6孔平板中的只有完全培养基或含有各种浓度EGF、H22-EGF、H22和Fab片段或H425的F(ab′)₂片段的培养基中。7天以后用一台血细胞计统计活细胞数。以上测定重复两次，并以平均值+/-标准误差的形式给出结果。

结果如图9所示。所述结果表明，EGF和H22-EGF可以剂量依赖形式显著抑制细胞生长。相反，H425的F(ab′)₂片段仅在高浓度下有某些抑制活性，而H22的Fab片段无生长抑制活性。

因此，H22-EGF可同时结合于FcγRI和EGF，这表明该分子是正确折叠的，并保持了同时结合两种受体所需的柔性。另外，H22-EGF能抑制EGF-R表达肿瘤细胞系A431的增殖，这表明其与EGF类似，H22-EGF融合蛋白可通过EGF-R传导信号。在有FcγRI表达效应细胞的条件下，H22-EGF还能介导A431细胞的有效致死。因此，H22-EGF可介导EGF-R表达细胞的细胞毒性和细胞静止效应。给肿瘤患者施用H22-EGF可导致其体内天然细胞毒性效应细胞的恢复，以通过3种不同方式-细胞毒性、生长抑制和吞噬作用-介导肿瘤细胞的致死。另外，除了细胞介导的肿瘤细胞的细胞毒性之外，由H22-EGF恢复的效应细胞还可以通过分泌炎性细胞因子和/或通过加工和呈递肿瘤抗原主肿瘤特异性T细胞来增殖抗肿瘤免疫性。例3：H22-Heregulin(H22-gp30)融合蛋白介导肿瘤细胞致死

Heregulin(HRG)是一种用于HER3和HER4分子的配体。以上两种受体可与HER2形成异源二聚体，HER2是某些乳腺癌细胞超量表达的分子。当所述分子来自与HER2的异源二聚体时，HRG与HER3和HER4的亲合性显著提高。该实施例表明，包含heregulin和一种对FcγRI的结合特异性的双特异分子能抑制肿瘤细胞系的生长，并在有承载FcγRI的细胞毒性效应细胞的条件下，介导这些细胞的融合蛋白依赖性细胞毒性。

以例2中所述构建H22-EGF融合蛋白相同的方式构建H22-heregulin融合蛋白。简言之，将编码人源化抗FcγRI mAb、H22的Fd片段的基因组DNA同编码β2型HRG的EGF区的cDNA融合。H22-HRG融合蛋白(序列4)的氨基酸序列如图10所示。该融合蛋白包括US 5,367,060中所示heregulin β2的氨基酸171-239。也可采用heregulinβ2的其它部分，以及披露于US 5,367,060等的其它heregulin分子的部分。将所得到的H22 Fd-HRG表达载体转染到预先用一种含有编码H22κ轻链的DNA的载体转染过的骨髓瘤细胞系。所得到的融合蛋白主要以单体形式表达，尽管该蛋白在H22 Fab部分的铰链区含有游离Cys残基。流式细胞测定证实，该融合蛋白可结合于HER2超量表达肿瘤细胞系SKBR-3，并可结合于FcγR-表达细胞。

为了检测H22 Fd-HRG融合蛋白的生物学活性，将获自表达该融合蛋白的骨髓瘤细胞的上清液稀释3倍或30倍，并在有IFN-处理的单核细胞的条件下，加至表达HER2、HER3和HER4的PC-3细胞或SKBR-3细胞中，单核细胞与靶肿瘤细胞的比例为100∶1。如例2所述，用IFN-γ处理所述单核细胞，用⁵¹Cr标记靶细胞。按例2所述方法计算比溶度％。结果如图11所示。结果表明，在将所述细胞与稀释3倍的上清液一起培养时，约有45％的SKBR3细胞和高达49％左右的PC-3细胞被溶解。

该融合蛋白能抑制SKBR-3肿瘤细胞的生长，并能在有承载FcγRI的细胞毒性效应细胞的条件下介导这些细胞的融合蛋白依赖性细胞毒性。因此，该例的结果表明，抗FcγRI-heregulin融合蛋白在生理条件下可介导抗肿瘤细胞毒性活性，并表明这种融合蛋白可用于治疗各种癌症。例4：H22-蛉蟾肽融合蛋白介导肿瘤细胞致死

以上述构建H22-EGF融合蛋白类似的方式构建H22-蛉蟾肽融合蛋白。不过，由于蛉蟾肽是一种短肽(14个氨基酸残基)，不用PCR技术扩增编码蛉蟾肽的cDNA，而对编码蛉蟾肽的有义链和反义链的DNA寡聚体进行杂交，以形成其编码区。与H22抗体的重链羧基末端融合的蛉蟾肽的氨基酸序列如下：

-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Gly(序列5)它相当于蛉蟾肽的氨基酸2-14(Anastasi等(1971)Experientia27：166)并含有位于该肽羧基末端的一个额外的甘氨酸残基。具有重叠末端的寡聚体不杂交，而是形成粘端，在N-末端产生一个XhoI位点，在C-末端产生一个NotI位点，以使其可以克隆到上述H22重链表达载体上。

如上述研究H22-EGF和H22-heregulin融合蛋白一样研究H22-蛉蟾肽融合蛋白在肿瘤细胞致死方面的生物学活性。简言之，用⁵¹Cr标记载有蛉蟾肽受体的PC-3肿瘤细胞，并与单核细胞和各种浓度的H22融合蛋白一起培养，按上述方法测定融合蛋白依赖性溶解作用。示于图12中的结果表明，靶细胞被溶解，而且靶细胞的溶解度与测定时融合蛋白的加入量成比例的提高。

还生产出了带有作为一个结合实体的H22和作为另一个结合实体的CD4(AIDS Repository)或gpl20(AIDS Repository)的融合蛋白。例5；由修饰的人源化抗体片段制备双特异抗体材料和方法

表达载体及克隆

用于H22和重链的表达载体(pSVgpt)和用于其轻链的表达载体(pSVhyg)披露于WO 94/10332中，题为“Humanized Antibodies to FcReceptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes”。对于Fab′构件来说，不需改变其轻链。不过，对于其重链来说，必需将CH2和CH3区域除去并代之以终止密码子。所述重链载体包括两个BamHI位点，一个在位于VH和CH1之间的内含子里，另一个在CH3下游。通过所述BamHI限制位点，用仅编码CH1和大部分铰链区的截短形式置换编码其恒定区的DNA。为此，利用聚合酶链式反应(PCR)产生新的重链片段的C-末端，其变化如图1所示。图1[B]表示用于产生截短的单硫氢基形式的变化。

表达

鼠骨髓瘤NSO(ECACC85110503)是一种非-Ig合成系，将其用于表达修饰的H22抗体。用一台BioRad Gene Pulser通过电击法，将最终的表达载体-一种带有编码H22 Fd的DNA和pSVgpt构件与含有编码H22轻链的DNA的pSVhyg构件一起进行共转染。上述多肽是由存在于该载体上的Ig启动子和Ig增强子表达，并由位于所述构件的N-末端的mAb重链信号肽分泌。转染之后1或2天，将霉酚酸和黄嘌呤加入培养基中，以选择摄入了所述DNA的细胞。在FcγRI结合活性得到证实以后，分离单个生长的克隆，并进行亚克隆。

纯化

通过体外培养相应的转染NSO细胞制备H22抗体和全H425(抗EGFR)抗体的单硫氢基形式。通过用Q-Sepharose进行离子交换层析，并接着用SP-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行层析纯化抗体H22的单硫氢基形式。通过SDS-PAGE测定H22抗体的单硫氢基形式。

双特异抗体(BsAb)的产生

用Glennie等所述方法构建BsAb(Glennie，M.J.等，(1987)，Preparation and performance of bispecific F(ab′gamma)²，antibodycontaining thioether-Linked Fab′gamma fragments，J.Immunol.139：2367)。通过在0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH3.5中进行有限的胃蛋白酶蛋白酶解产生H425的F(ab′)₂，并通过离子交换层析纯化F(ab′)₂。通过在30℃下加入20mM巯基乙醇胺(MEA)还原mAbs。将Fab′片段加至50mM乙酸钠、0.5mM EDTA，pH5.3(4℃)中平衡过的Sephadex G-25柱中。将溶于二甲基甲酰胺、并在甲醇/冰浴中冷却的邻苯二马来酰亚胺(D-PDM，12mM)加入(一半体积)到H22和Fab′中，并在冰上培养30分钟。然后在用50mM乙酸钠、0.5mMEDTA，pH5.3(4℃)平衡过的Sephadex G-25上将Fab′-马来酰亚胺和游离的O-PDM分离。为了制备所述BsAbs，以1.2∶1的摩尔比将H22 Fab′-马来酰亚胺加入H425 Fab′中。在Amicon室中在氮气下用Diaflo膜将反应剂浓缩至起始体积(均在4℃下完成)。18小时之后，用1M Tris-HCl，pH8.0将其pH调至8.0。然后用10mM MEA还原该混合物(30分钟，30℃)，并用25mM碘乙酰胺烷基化。用在PBS中平衡过的Superdex200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱将双特异F(ab′)₂和未反应的Fab′s及其它产物分离开。

双特异流式细胞测定

为了证实由O-PDM法产生的BsAb和由DTNB法产生的BsAb能够同时结合FcγRI和EGFR，开发了一种流式细胞测定法(图13)。在该测定中，将不同浓度的两种BsAbs与A431细胞-一种表达EGF受体(EGFR)的细胞系-一起培养。洗涤之后，将含有由FcγRI的胞外区和人IgM的Fc部分组成的融合蛋白一起培养。最后，将所述细胞与由FITC-标记的抗人IgM-特异抗体一起培养。然后通过FACSCAN分析所述细胞。

ADCC

通过⁵¹Cγ致死试验测定BsAb介导的ADCC。将EGFR超量表达细胞系A431用作在γ-干扰素中培养24小时的人单核细胞溶解的靶。在与效应细胞和抗体混合于平底微量滴定板中之前，用100μCi⁵¹Cγ标记靶1小时。在37℃下培养16小时，然后收集上清液并分析放射性。通过以下公式计算细胞毒性：溶胞％＝(实验CPM-靶渗漏CPM/洗涤剂溶解CPM-靶渗漏CPM)×100％。依赖于Ab的溶解＝有抗体的溶解％-无抗体的溶解。结果

纯化

用截短的H22重链构件和完整的κ链构件共转染NSO细胞。筛选抗霉酚酸和黄嘌呤的克隆进行扩增，并通过Q-Sepharose接着用SP-Sepharose离子交换层析从上清液中纯化蛋白。通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白。纯化的蛋白以50kDa的表观分子量迁移，表明该蛋白是以单体，而不是以二硫链二聚体的形式表达。

由单硫氢基H22与H425的Fab′(抗EGFR)连接组成的BsAb的

构建和特征鉴定

构建BsAb，其单硫氢基形式的H22与一种人源化抗EGFR mAb的H425的Fab′片段连接。该BsAb是以O-PDM为接头用Glennie等的方法形成的(Glennie，M.J.等，(1987)，Preparation andperformance of bispecific F(ab′gamma)²，antibody containing thioether-Linked Fab′gamma fragments，J.Immunol.，139：2367)。将该BsAb的活性与通过DTNB法，用Fab′片段制成的BsAb的活性进行比较，所述Fab′片段是通过全H22的胃蛋白酶消化和还原而制成的。为了证实所述BsAbs能同时结合FcγRI和EGFR，设计出一种FACS测定法。图14表明，O-PDM连接的BsAb和通过DTNB法制成的BsAb能以依赖于剂量的形式同时结合A431上的EGFR和可溶性FcγRI。

以A431细胞为靶分析两种BsAbs介导ADCC的能力。将在有IFN-γ的条件下培养24小时的人单核细胞用作效应细胞。图15表明，上述两种BsAbs以相近的方式介导A431细胞剂量依赖性溶解。上述结果表明，由截短的、单硫氢基形式的H22形成的BsAb，能够在有FcγRI-表达效应细胞的条件下致死EGFR-超量表达细胞。例6：三价抗体的生产材料和方法

细胞系和抗体。M22，520C9，H425、SKBR3和A431

通过离子交换层析(Pharmacia，Piscataway，NJ)从杂交瘤上清液中纯化M22和520C9，并通过蛋白A亲和层析(Pharmacia，Piscataway，NJ)进一步纯化520C9。通过蛋白A亲和层析(Pharmacia，Piscataway，NJ)从杂交瘤上清液中纯化H425。M22-和520C9-生产鼠杂交瘤早先已经披露(Guyre等，(1989)Monoclonal antibodies that bind todistinct epitopes on FcgRI are able to trigger receptor function，J.Immunol.143：5，1650-1655；Frankel等，(1985)Tissue distribution ofbreast cancer-associated antigens defined by monoclonal antibodies，J.Biol.Response Modifiers，4：273-286)。鼠杂交瘤NSO(ECACC85110503)是一种非-Ig合成系，将其用于表达人源化mAb，H425(Kettleborough等，(1991)Humanization of a mouse monoclonalantibody by CDR-grafting：the importance of framework residues onloop conformation，protein Eng.，4：773)。在Iscove′s改进的Dulbecco′s培养基(IMDM，Gibco，Grand Island，NY)中培养一种能超量表达HER2/neu原癌基因的人乳腺癌细胞系SKBR-3(ATCC，Rockville，MD)和一种能超量表达EGFR(ATCC，Rockville，MD)的人鳞状癌细胞系A431(ATCC，Rockville，MD)。

嗜中性白细胞的制备

通过Ficoll Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)梯度分离从单核细胞中分离嗜中性白细胞。为了上调FcγRI，用细胞因子处理嗜中性白细胞。在含有2.5％正常AB型人血清(Sigma，St.louis，MO)、50ng/ml G-CSF(由德国Erlanger大学的R.Repp博士惠赠)和100IRU/mlIFN-γ的AIM V培养基(Gibco，Grand Island，NY)中培养(37℃，5％CO₂)嗜中性白细胞24-48小时。

缀合方法

用Glennie等所述方法构建BsAb(Glennie，M.J.等，(1987)，Preparation and performance of bispecific F(ab′gamma)2，antibodycontaining thioether-linked Fab′gamma fragments，J.Immunol.，139：2367)。通过体外培养相应的杂交瘤细胞制备mAbs M22、520C9(抗HER2/neu，33)和H425(抗EGFR)抗体。通过在0.1M柠檬酸缓冲液，pH3.5中进行有限的胃蛋白酶蛋白酶能产生每种抗体的F(ab′)₂片段，并通过离子交换层析纯化F(ab′)₂。通过在30℃下加入20mM巯基乙醇胺(MEA)30分钟，将mAbs M22和H425还原成Fab′。将该Fab′片段加至在50mM乙酸钠、0.5mM EDTA，pH5.3(4℃)中平衡过的Sephadex G-25柱中。溶于二甲基甲酰胺中的，并在甲醇/冰浴中冷却的邻苯二马来酰亚胺(O-PDM，12mM)加至(1/2体积)所述鼠22 Fab′中。并在冰上培养30分钟。然后在用50mM乙酸钠、0.5mM EDTA，pH5.3(4℃)平衡的Sephadex G-25上将Fab′-马来酰亚胺同游离的O-PDM分离。为了制备BsAb，以1∶1的摩尔比将M22 Fab′-马来酰亚胺加入H425 Fab′中。在氮气下，在Amicon室中用Diaflo膜将反应剂浓缩至起始体积(均在4℃进行)。18小时后，用1M Tris-HCl(pH8)将pH值调至8.0、然后用10mMMEA(30分钟，30℃)还原该混合物，并用25mM碘乙酰胺烷基化。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)平衡过的Superdex200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱上将所述双特异F(ab′)₂同未反应的Fab′s及其它产物分离。以类似方法制备BsAb M22×520C9，不同的是用520C9代替了H425。

分两步制备由M22×H425×520C9组成的三特异抗体(图16)。第一步，按上述方法连接M22和H425，以形成M22×H425 BsAb，所不同的是，用DTNB处理反应物以封闭残余的硫氢基，而不进行最终的还原和烷基化。通过在Superdex200柱上进行凝胶过滤纯化该二价BsAb，还原成F(ab)′₂(SH)，并以1∶1的摩尔比与由O-PDM处理的520C9混合。所得到的三特异F(ab′)3在Superdex200柱上纯化。用TSK 3000柱(ToJo Haas，Japan)通过HPLC大小排斥层析分析TsAb。用上述方法构建出另一种包括m22 Fab′×32.2 Fab′x m22Fab′的TsAb。

双特异流式细胞测定

所述TsAb可同时结合于EGFR和FcγRI或同时结合于HER2/neu和FcγRI。将A431细胞(高EGFR表达细胞)或SKBR-3细胞(高HER2/neu表达细胞)与各种浓度的BsAbs(M22×520C9或M22×H425)或TsAb、M22×H425×520C9一起培养。洗涤该细胞，然后与可溶性FcγRI一起培养。用mAb32.2-FITC检测可溶性FcγRI的结合，mAb32.2-FITC在FcγRI上的结合位点不同于所述22的结合位点。然后通过FACSCAN分析该细胞。

ADCC

将SKBR-3细胞或A431细胞用作由细胞因子激活的嗜中性白细胞溶解的靶。在与嗜中性白细胞和抗体混合于U形底微量滴定板中之前，用100μCi的⁵¹Cr标记靶1小时。在37℃下培养16小时，收集上清液并分析其放射性。通过以下公式计算细胞毒性：溶胞％＝(实验CPM-靶渗漏CPM/洗涤剂溶解CPM-靶渗漏CPM)×100％。比溶解＝有抗体的溶解％-无抗体的溶解％。测定重复3次。

FcγRI调制测定

将M22×32.2×M22 BsAb用于调制全血中单核细胞上的FcγRI。测定方法示于所附流程图中(见图23A)。图23B表明，用10μg/ml的该BsAb处理可将FcγRI在单核细胞上的表达水平降至用BsAb处理之前的表达水平的50％左右。

结果

TsAb的构建和生化特性鉴定

按照图16所示的流程图制备TsAb。在该方法的第一步，将M22与H425连接，用DTNB处理，并通过凝胶过滤纯化所得到的双特异F(ab′)₂。在第二步，还原该双特异F(ab′)₂，并与O-PDM处理的520C9Fab′混合，以形成TsAb、M22×H425×520C9。该TsAb示于图17中。在该图中，Fab′-A表示M22，Fab′-B表示H425，Fab′-C表示520C9。

结合(BsFACS)

为了证实TsAb、M22×425×520C9能同时结合FcγRI和HER2/neu，设计出一种双特异FACS测定法。该测定方法示于图18中。图19表明，以上两种TsAb可以依赖于剂量的形式同时结合SKBR-3细胞上的HER2/neu和可溶性FcγRI。该BsAb、M22×H425在该测定中很宽浓度范围内产生可略信号。为了证实TsAb、M22×H425×520C9可同时结合FcγRI和EGFR，用EGFR超量表达细胞系A431进行类似的测定。该测定示于图18B中。图20表明，TsAb、BsAb、M22×H425可以依赖于剂量的方式同时结合于A431细胞上的EGFR和可溶性FcγRI。BsAb、M22×520C9在该测定中在很宽的浓度范围内产生可略信号。

ADCC

以SKBR-3或A431细胞为靶，分析TsAb介导ADCC的能力。将在有IFN-γ和G-SF的条件下培养24-48小时的人嗜中性白细胞用作效应细胞。图21表明，BsAb、M22×520C9和TsAb，M22×H425×520C9能介导SKBR-3细胞溶解，而BsAb，M22×H425不能。另一方面，图22表明BsAb，M22×H425能介导SKBR-3细胞溶解，而BsAb，M22×520C9不能。以上结果表明，在有FcγRI表达效应细胞的条件下，TsAb可致死HER2/neu和EGFR超量表达细胞。

上述三特异抗体包括M22、抗FcγRI mAb的鼠源形式。这种三特异抗体可以用单硫氢基形式的人源化抗FcγRI mAb，H22构建。唯一的差别是，单硫氢基形式是以该抗体的F(ab′)₂片段分泌。该单硫氢基形式是通过用Q-Sepharose然后用SP-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行离子交换层析从培养上清液中纯化的。一旦纯化出所述单硫氢基形式的H22，用该制剂生产的三特异抗体与上述采用M22的F(ab′)₂的片段产生的相同。例7：用H22-抗原融合蛋白增强抗原呈递

该例证实(a)遗传方式嫁接到抗FcγRI抗体的恒定区上的抗原性肽能比单独用该抗原更有效地进行抗原呈递和T细胞刺激，和(b)遗传嫁接到一种抗FcγRI的恒定区上的拮抗肽能明显比单独用该拮抗肽更有效地抑制T细胞刺激。因此，这种融合蛋白可在体内有效加强肽向抗原呈递细胞(APCs)的输送，并可用于各种治疗方法。材料和方法

制剂

用AIM V(GIBCO，Grand Island，NY)作为培养基。破伤风毒素(TT)购自ACCURACTE CHEMICAL公司(Westbury，NY)。小鼠抗FcγRI mAb22的无菌、低内毒素F(ab′)₂片段和双特异Ab、MDXH210(由人源化Ab22的Fab′与抗Her2/neu肿瘤Ag mAb 520C9的Fab′通过化学连接而组成)由MEDAREX，INC.(Annandale，NJ)提供。TT的通用Th表位，TT830-844(QYIKANSKFIGITEL(序列6)，以下称TT830)(Valmori D.等(1994)J.Immunol.152：2921-29)和该表位的突变形式TT833S(QYISANSKFIGITEL(序列9)，833位的Lys换成Ser)由PEPTIDOGENIC公司(Livermore，CA)合成，并纯化至95％以上的纯度。在该研究中，将TT的另一种通用Th表位，TT947-967(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(序列12)，以下称TT947)(纯度＞80％，Valmori D.，同上)用作试验对照肽。在封闭实验中采用市售用于静脉内注射(IVI)的人IgG。

细胞

能表达FcγRI的单核细胞系U937获自ATCC。生产CD4⁺，肽TT830-特异T细胞的方法是在先前披露的用于生产TT-特异T细胞系的方法基础上改进而来(Gosselin E.J.(1992)J.Immunol.149：3477-81)。简单地讲地，单核细胞是用Ficoll Hypaque从外周血液中分离的。50ml AIMV培养基中用10μM TT830刺激150×10⁶单核细胞。在37℃下在5％CO₂培养箱中培养3天，然后用10ml HEPES缓冲的RPMI 1640洗涤烧瓶一次，以除去非结合的(大部分为非特异性细胞)细胞；而特异的T细胞集落及所粘附的单核细胞仍留在烧瓶中。将添加了20U/ml人IL-2(IMMUNEX，Seuttle WA)和1ml(2％，终浓度)的汇集人血清的50ml AIM V加回到烧瓶中。在培养共10-14天后，收获T细胞，并通过Ficoll Hypaque沉淀死亡细胞，以得到活的CD4⁺、Ag-特异T细胞的高度富集群体(95-98％)。如图3所示，已证实该T细胞对TT830肽有特异性。用冷聚集法(Mentzer S.J.等(1986)Cell Immunol.101：132)从白色体块中纯化大量的单核细胞，产生80-90％的纯度。将单核细胞和T细胞以等分试样形式冷冻，以备将来使用，并证实其解冻后可正常发挥作用。

Ag呈递测定

在增殖测定中，将T细胞(5×10⁴)、辐射过的单核细胞(3000rad，10⁵/孔)和各种浓度的肽TT830融合蛋白Fab22-TT830放在一起，以200μl/孔的终体积在平底96孔组织培养板上培养2天。然后将10μl(1μCi/孔)³H-胸苷加至每孔中。培养过夜后，收获所述板，并在液体闪烁计数器中计数。T细胞增殖以3次重复的平均计数/分(CPM)±SD形式给出。从所有数据中扣除背景CPM(T细胞和单核细胞无Ag)。用类似于Sette等的方法(De Magistris(1992)Cell68：625)用APL进行实验。简言之，为了进行抑制测定，用各种浓度的TT833S或Fab22-TT833S处理辐射过的单核细胞过夜。然后加入20nM TT830和T细胞。再培养2天，然后用上述方法测T细胞增殖。在“预脉冲”实验中，在加入10μM TT833S中0.1μM Fab22-TT833S之前用20nM TT830对辐射过的单核细胞进行4小时的脉冲。培养过夜后加入T细胞。再培养2天，然后用辐射过的单核细胞和TT833S或Fab22-TT833S刺激T细胞1天，在Ficoll Hypaque上离心后回收，并用单核细胞和各种浓度的TT830再刺激2天。然后通过掺入³H-胸苷测定T细胞增殖，并用3次重复的平均CPM作图。在某些场合，抑制百分比通过以下公式计算：抑制％＝(CPM_无抑制剂-CPM_抑制剂)/CPM_无抑制剂×100。所有实验均至少重复3次。

染色和流式测定法。

染色方法由以前公开的方法(Gosselin E.J.等(1990)J.Immunol.144-1817-22)改进而来。简言之，在4℃下向96孔板的每一孔中加入30μl RPMI+1mg/ml BSA，其含有各种浓度的蛋白Fab22-TT830、Fab22-TT833S或BsAb MD×H210中的一种。在4℃下培养1小时后，对所述板进行离心，弃上清液，在4℃下用PBS/BSA洗涤细胞3次。然后用40μl/孔的FLTC-标记的F(ab′)₂山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories，INC.，WestGroue，PA)培养细胞1小时，接着用PBS/BSA洗涤3次，并重悬于含有1％多聚甲醛(KODAK，Rochester，NY)的PBS/BSA中。然后通过FAC Scan(BECTON DICKINSON&CO.，Mountain View，CA)检测细胞，并测平均荧光强度(MFI)。

细胞因子测定

在经过2天刺激后从Ag呈递测定的96孔板中收集上清液，并冷冻待用。通过特异ELISA测所述样品中的IFN-γ和IL-4含量。用于IFN-γ和IL-4-特异ELISA的Ab对，购自PHARMINGEN(Sandiego，CA)。用厂商提供的方法进行ELISA。

H22-TT肽融合蛋白的产生

为了产生融合蛋白Fab22-TT830和Fab22-TT833S，用以下方法将编码每种肽的合成寡核苷酸分别引入人源化抗FcγRI mAb22(H22)重链的铰链区。

表达和克隆载体

通过将mAb22的CDR区嫁接到人IgG1构架中将其人源化(参见上述及Graziano R.F.等(1995)J.Immunol.155：4996-5002)。对H22重链的基因组克隆的表达载体(pSVgpt)进行修饰，以便插入其它分子(此处为TT肽)的编码序列。将该载体的含有CH1、铰链区和新合成的XhoI和NotI克隆位点的BamHI片段(见图2)插入pUC19的BamHI位点，以形成载体pUC19/H22 CH1(X+N)。按下述方法将该载体用于克隆编码TT肽的寡核苷酸序列。

将编码破伤风毒素(TT)肽的寡核苷酸序列设计成在其编码区的N-末端有一个XhoI位点，在其C-末端有一个NotI位点(图24A)。合成所述寡核苷酸并通过GENOSYS Biotechnologies(TheWoodlands，TX)进行纯化。然后对合成的寡核苷酸进行退火，并连接到克隆载体pUC19/H22CH1(X+N)上。通过限制酶切作图筛选整合了TT肽的编码序列的克隆。从pUC19上切除含有CH1、铰链区、和TT830或TT833S的BamHI片段，并将其插入已含有VH的表达载体上。H22重链与TT肽融合的最终表达构件如图24B所示。

H22-TT融合蛋白的表达

鼠骨髓瘤NSO(ECACC 85110503)是一种非Ig合成系，将其用于表达H22-TT融合蛋白。首先，用含有H22轻链编码序列的pSVhyg载体转染NSO细胞。然后用含有与TT编码序列的读框融合的H22 H-链Fd序列的表达载体构件转染H22轻链表达NSO细胞(图24B)。用一台BioRad Gene Pulser电击装置实施上述转染，采用200v和960μFarad进行。在转染后1或2天，将霉酚酸(0.8μg/ml；SIGMA)和黄嘌呤(2.5μg/ml；SIGMA)加入培养基中，以筛选已成功摄入所述表达载体的转染体。根据通过流式细胞测定法证实的培养物上清液与U937细胞上的FcγRI的结合活性分离单克隆。通过有限稀释对阳性克隆进行亚克隆。

Fab22-TT融合蛋白的纯化

在滚瓶培养物中扩增表达Fab22-TT830融合蛋白的克隆pW5和表达Fab22-TT833S融合蛋白的克隆pM4。对上清液进行澄清和浓缩。通过在抗H22亲合柱上进行亲合层析实现小规模纯化。在非还原条件下进行的5-10％丙烯酰胺梯度凝胶SDS-PAGE分析证实，所述融合蛋白的纯度大于90％，并具有预计为50kDa的分子量。通过280nm处的光吸收测定蛋白浓度，所采用的消光系数为IgG Fab′＝1.53。结果

H22 Fd-TT融合蛋白结合于U937细胞

首先，测定H22融合蛋白、Fab22-TT830和Fab22-TT833S结合FcγRI的能力。将先前披露的含有相同FcγRI结合部分(人源化mAb22的Fab′)的双特异Ab，MDXH210(Valnone F.H.等(1995)J.Clin.Oncol.13：2281-92)用作正对照。通过用FITC-标记的对人IgG特异的山羊Ab染色和流式细胞测定法测融合蛋白和MDXH210与组成型表达FcγRI的U937细胞的结合。如图24A和24B所示，融合蛋白Fab22-TT830和Fab22-TT833S以类似于MDXH210的剂量依赖性方式结合于U937细胞。鼠源抗人FcγRI mAb22 F(ab′)₂可完全抑制融合蛋白的结合，证实了融合蛋白对FcγRI的特异性。

H22Fd-TT融合蛋白可将TT肽的呈递提高100-1000倍

在Ag呈递测量中，使用融合蛋白Fab 22-TT830，以测定当Th表位TT830表达于H22的恒定区中时，是否能被单核细胞有效呈递给自身T细胞。如图26所示，为了获得相同水平的T细胞增殖，Fab22-TT830的需要量比单用TT830肽少大约1000倍。另外，图26表明，Fab22-TT830的呈递比完整TT的呈递效率高10,000倍左右，这表明加强了的Fab22-TT830呈递，与TT830肽相反不只由于Fab22-TT830的分子量较大或稳定性较高。另一种抗原性TT表位TT947不能刺激T细胞，证实该T细胞对TT830肽有特异性。以上结果清楚地表明，表达于H22恒定区里的Th表位能被有效地、特异地呈递。

抑制单核细胞上的FcγRI可消除H22Fd-TT融合蛋白对Ag呈

递的加强作用

为了直接测定用融合蛋白所产生的肽呈递的加强作用是由FcγRI介导的，在加入Fab22-TT830或TT830肽之前，通过用mAb22 F(ab′)₂处理单核细胞1小时，抑制Fab22-TT830与Ag-呈递单核细胞上FcγRI的结合。由所述融合蛋白产生的肽呈递加强作用，可被mAb22F(ab′)₂消除，而TT830的呈递不受影响(图27)。mAb22 F(ab′)₂与FcγRI的结合，不能使游离肽的呈递加强这一事实表明，单是mAb22与FcγRI的结合不会以加强Ag呈递的方式改变单核细胞的功能状态。因此，所述肽与抗-FcγRI Ab22的结合看来是为观察到的Ag呈递作用加强所必需的，这表明加强呈递作用可能是通过FcγRI有效捕获Ag的结果。

人IgG的存在不会影响H22对肽呈递的加强作用

在生理条件下，用IgG饱和FcγRI的配体结合区，IgG可以抑制AgAb向该受体的有效导向。用mAb22的衍生物触发FcγRI功能的独特优点是，Ab22结合于该配体结合区以外的表位。因此，由mAb22引发的功能，如ADCC、吞噬作用和Ag呈递不受生理水平的IgG抑制(Gosselin E.J.，同上；Guyre P.M.(1989)J.lmmunol.143-1650-55)。类似地，由融合蛋白Fab22-TT830增强的TT830的呈递作用不受IgG的抑制(图28)，这表明H22-基础融合蛋白也是在体内将肽Ags导向FcγRI的有效途径。

H22Fd-TT融合蛋白加强Ag呈递后能提高IFN-γ和IL-4

的产量

激活以后，T细胞不仅通过增殖进行克隆扩增，而且产生诸如IFN-γ和IL-4之类的细胞因子，以发挥其B细胞分化和单核细胞激活的效应功能(Paul W.E.和Seder，R.A.(1994)Cell76：241：251)。因此，检测由H22融合蛋白加强Ag呈递后IFN-γ和IL-4的产生。如图28A和28B所示，Fab22-TT830能提高IFN-γ和IL-4的产量，尤其是在次优Ag浓度下。然而，在该实验中，细胞因子产量的提高(约20倍)低于T细胞增殖的提高(约600倍)。

因此，人单核细胞能有效加工并呈递表达于抗FcγRI mAb H22的恒定区里的Th表位导致增进T细胞激活和细胞因子产生。

APL、TT833S和Fab22-TT833S的呈递不能刺激T细胞增殖

含有1或2个不同于天然T细胞表位的氨基酸的肽由Allen及其同伴命名为改变的肽配体(APL)，已证实其为T细胞激活的激动剂、部分激动剂或拮抗剂(Sette等，(1994)Ann.Rev.Immunol.12：413和Evavold等(1993)Immunol.Today 14：602)。特异T细胞通过TCR对APL的识别，在某些场合可触发部分信号传导并导致(i)由超级抗原抑制T细胞刺激(Evavlold等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：2300)，T cell anergy(Sloan-Lancaster等(1993)Nature 363：156和Sloan-Lancaster等(1994)J.Exp.Med.185：1195)，或(ii)调制Th1/Th2分化(Nicholson等(1995)Immunity3：397；Pfeiffer等(1995)J.Exp.Med.181：1569；和Windnhagen等(1995)Immunity 2：373)。业已证实，部分激动剂可刺激某些T细胞功能，如由T细胞产生IL-4，但不能刺激其它功能，如T细胞增殖(Evabold等(1991)Science 252：1308)。部分激动剂还能诱导无反应。某些APL在与TCR相互作用时，不会触发任何可检测到的信号变化，但可以作为TCR拮抗物，抑制对野生型肽抗原应答的T细胞增殖，因此被称为TCR拮抗物(De Magistris等(1992)Cell68：625和Ruppert等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2671)。

该实施例证实，破伤风毒素的T细胞表位TT830的一种拮抗肽TT833S和Fab-TT833S不能刺激T细胞增殖。如图30所示，即使TT833S的剂量高达100μM，Fab22-TT833S的剂量高达1μM时，也未见TT830-特异T细胞有明显增殖。这表明，将TT830肽的833位上的Lys换成Ser可消除该T细胞表位的T细胞反应性。另外，当肽TT830和TT833S同时被呈递给TT830-特异T细胞时，应答TT830的T细胞增殖能被TT833S以依赖于剂量的方式加以抑制，表明TT833S可作为TT830-特异T细胞的拮抗物(图31)。

在抑制T细胞激活方面Fab22-TT833S至少比TT833S有效100

倍

该例比较了TT833S和Fab22-TT833S在抑制对TT830应答的T细胞增殖方面的相对效率。如图32所示，在抑制TT830刺激的T细胞增殖方面，Fab22-TT833S的效果比TT833S大100倍左右。这表明，当APL、TT833S以mAbH22的恒定区表达时，可由APC正确而有效地呈递。融合蛋白Fab22-TT833S对T细胞增殖的拮抗效率提高，可能反应了FcγRI能比游离肽更有效地介导Ag捕获。

T细胞激活的抑制是通过竞争T细胞受体结合而不是MHC II型结

合介导的

APL TT833S和融合蛋白Fab22-TT833S的拮抗效果可能是通过在MHC-结合水平或TCR-结合水平或两种水平上竞争而实现的。为了研究有关机理，进行最初由Sette及其同事所披露的“预脉冲”实验(DeMagistris，M.T.等(1992)Cell 68：625-634)。该实验条件使激动剂(TT830)能在没有抑制剂(TT833S)竞争的条件下结合于MHC II型，因此，仅有TCR拮抗剂，而不是纯MHC封阻剂能有效抑制激动剂刺激的T细胞增殖。用次佳(20nM)TT830对Ag-呈递单核细胞进行4小时的脉冲，以使得TT830在没有TT833S竞争的条件下与MHC II型结合。然后将APL、TT833S或Fab22-TT833S与预脉冲过的单核细胞一起再培养16小时。加入相应的T细胞，并用上述方法测定其增殖。即使在MHC封阻剂的作用很小的条件下，T细胞增殖仍然被抑制(图33)。因此，抑制可能是竞争T细胞受体而不是MHC II型结合的结果。

TT833S和Fab22-TT833S的呈递不能刺激T细胞产生IL-4和

IFN-γ

在某些情况下，APL能刺激T细胞细胞因子产生而不是增殖(Evavold B.D.和Allen P.M.(1991)Science 252：1308-1310)。为了证实TT833S的呈递是否会刺激细胞因子产生，测定自Ag呈递测定获得的上清液中的IL-4和IFN-γ的含量。如图34所示，TT833S和Fab22-TT833S均不能有效由T细胞刺激产生IFN-γ和IL-4。

TT833S和Fab22-TT833S的呈递不会使T细胞无反应性

Allen及同事报导，TCR与某些APL-MHC II型复合体的相互作用，会导致T细胞的无反应性(Sloan-Lancaster J.等(1993)Nature 363：156-159，Sloan-Lancaster J.等(1994)J.Exp.Med.180：1195-1205)。用一种类似于他们方法的实验方案测定TT833S的呈递是否也会导致T细胞无反应性。如图35所示，在与APC和TT833S或Fab22-TT833S培养1天、2天或4天后，回收的T细胞应答随后的抗原刺激，而单独与APC一起培养的T细胞也是如此。因此，通过单用肽或Fab22-TT833S呈递的拮抗物，不会导致T细胞无反应性。另外，从没有肽、TT833S或Fab22-TT833S的培养物中回收到相同百分比的活T细胞)约50％，表明TT833S的呈递也不含增加T细胞死亡。

发现用一种抗FcγRI mAb22基础融合蛋白将抗原性肽导向FcγRI，可提高免疫性1000倍左右，这表明该融合蛋白可用于作为感染性疾病和癌症等的肽基础疫苗。提高肽基础疫苗的抗原效力的一般做法，是将肽改造到对特定APC表面分子特异的人mAb的恒定区中。

而且，发现所述FcγRI导向的拮抗肽即使在APCs首先用天然肽脉冲时也能抑制TT830特异的T细胞的增殖，这种情况类似于在体内试图改善自身免疫反应时所遇到的情形，这一发现表明，拮抗肽的定向呈递可被用作T细胞介导的自身免疫病等疾病的Ag-特异性治疗。以APL-为基础的治疗可作为类风湿关节炎和多发性硬化等由T细胞介导的自身免疫病的抗原特异性免疫疗法。另外，可将具有对FcγRI和一种肽在结合特异性的融合蛋白用于通过诱发抗原特异性无反应性治疗所述免疫疾病，所述肽是一种涉及以过度免疫反应为特征的免疫疾病的抗原的部分激动剂。因此，本发明提供了用于治疗各种免疫学疾病的方法，该方法通过提供一种能够加强抗原的抗原呈递的方法而实现的，该抗原或刺激T细胞、抑制T细胞增殖和/或细胞因子分泌或诱导T细胞无反应性。

例8：功能性单链抗-FcγRI-抗-CEA双特异分子

该例证实，含有与一种抗癌胚(抗-CEA)抗体融合的人源化抗-FcγRI抗体的一种重组双特异单链分子能结合于FcγRI和CEA。

图37是制备的编码双特异单链分子(构件321和323)的哺乳动物表达构件示意图，所述双特异分子具有对FcγRI的结合特异性和对癌胚抗原(CEA)的结合特异性。由构件321编码的双特异单链分子H22-抗-CEA的氨基酸序列(序列16)和编码该融合蛋白的核酸(序列15)如图40所示。由构件323编码的双特异单链分子H22-抗-CEA与由构件321编码的融合蛋白的差别仅在于H22的VH和VL链进行了转换。

还制备了一种编码对FcγRI有一种结合特异性的单链抗体的哺乳动物表达构件(构件225)。由构件225编码的单链抗体H22的氨基酸序列(序列14)和编码该单链抗体的核酸序列(序列13)如图39所示。

将上述每种构件克隆到pcDNA3(In Vitregen)的Hind III和XbaI位点上，其表达是由CMV启动子启动。上述每种构件还包括编码来自C-myc和六-组氨肽的肽的核酸序列，将其用于从细胞培养物中纯化重组蛋白。所述C-myc尾端相当于人C-myc的氨基酸410-420(Evan等(1985)Mol.Cell.Biol.5：3610)。Casey等(1994，J.Immunol.Methods 179：105)和Chester等(1994，Lancet 343：445)进一步披露了被称为MFE-23的抗CEA单链抗体。

将所述单链双特异分子H22-抗-CEA和单链H22抗体用于下面进行的结合试验。用CEA涂ELISA平板，并用5％PBA封闭。将由编码所述单链分子的构件转染的细胞(转染瘤)的上清液加入所述平板中，并加入可溶性FcγRI/IgM-μ(获自CDS转染细胞的上清液，如上所述)，通过与碱性磷酸酶(AP)缀合的山羊抗人IgM一起培养所述平板，用PNPP展开，并在405-650nm波长下对该平板读数来测定其结合。

结果如图38所示。结果表明，由构件321和323编码的单链双特异H22-抗-CEA分子能结合FcγRI和CEA。另一方面，单链H22抗体(由构件225编码)如所预料的，不能结合FcγRI和CEA。等同方案

本领域技术人员将会意识到或可以肯定，仅用常规实验即可提出本文所披露发明的具体实施方案的等同方案。这种等同方案欲由以下权利要求书所包括。

序列表(1)一般资料：(i)申请人：

(A)名称：Medarex，Inc.

(B)街道：1545 Route 22 East

(C)市：Annandale

(D)州：New Jersey

(E)国家：USA

(F)邮编：(ZIP)：08801-0953(ii)发明名称：由抗Fc受体抗体组成的治疗化合物(iii)序列数：16(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)本申请资料：(vi)在优申请资料：

(A)申请号：US 08/484,172

(B)申请日：1995年6月7日(vii)相关地址：

(A)收件人：LAHIVE&COCKFIELD

(B)街道：60 State Street，Suite 510

(C)市：Boston

(D)州：Massachusetts

(E)国家：USA

(F)邮编：02109-1875(viii)律师/代理机构资料：

(A)姓名：Arnold，Beth E.

(B)注册号：35，430

(C)文件/档案号：MXI-043CPPC(2)序列1资料： (i)序列特征：

(A)长度：24bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：1..24

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCAThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 241 5(2)序列2资料：(i)序列特征：

(A)长度：27bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：1..19(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：ACT CAC ACA TGC CCA CCG T GAGGATCC 27Thr His Thr Cys Pro Pro1 5(2)序列3资料：(i)序列特征：

(A)长度：42bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)特征：

(A)名称/链：CDS

(B)位置：1..34(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：ACT CAC ACA TGC TCG AGC CTT CAC GGC GGC CGC TGAGGATCCThr His Thr Cys Ser Ser Leu His Gly Gly Arg 421 5 10(2)序列4资料：(i)序列特征：

(A)长度：300个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Asn

20 25 30Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe65 70 75 80Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Arg Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220Lys Thr His Thr Cys Ser Thr Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His Leu225 230 235 240Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu

245 250 255Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys

260 265 270Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala

275 280 285Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln Lys Arg

290 295 300(2)序列5资料：(i)序列特征：

(A)长度：14个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Gln Arg Leu Gly Asn Gln Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly1 5 10(2)序列6资料：(i)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽 (v)片段类型：内(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15(2)序列7资料：(i)序列特征：

(A)长度：54bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：TCGAGCCAGT ACATCAAGGC GAATTCCAAG TTCATCGGCATCACCGAGCT CTGA 54(2)序列8资料：(i)序列特征：

(A)长度：53bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CGGTCATGTA GTTCCGCTTA AGGTTCAAGT AGCCGTAGTGGCTCGAGACT CCG 53(2)序列9资料：(i)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Gln Tyr Ile Ser Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15(2)序列10资料：(i)序列特征：

(A)长度：54bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：TCGAGCCAGT ACATCAGCGC GAATTCCAAG TTCATCGGCATCACCGAGCT CTGA 54(2)序列11资料：(i)序列特征：

(A)长度：53bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CGGTCATGTA GTCGCGCTTA AGGTTCAAGT AGCCGTAGTGGCTCGAGACT CCG 53(2)序列12资料：(i)序列特征：

(A)长度：21个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15Ala Ser His Leu Glu

20(2)序列13资料：(i)序列特征：

(A)长度：913bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)位置：11..911(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：AAGCTTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTG GCC ACA 49

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr

1 5 10GCT ACC GGT GTC CAC TCC GAT ATC CAA CTG GTG GAG AGC GGT GGA GGT 97Ala Thr Gly Val His Ser Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

15 20 25GTT GTG CAA CCT GGC CGG TCC CTG CGC CTG TCC TGC TCC TCG TCT GGC 145Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly30 35 40 45TTC AGT TTC AGT GAC AAT TAC ATG TAT TGG GTG AGA CAG GCA CCT GGA 193Phe Ile Phe Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60AAA GGT CTT GAG TGG GTT GCA ACC ATT AGT GAT GGT GGT AGT TAC ACC 241Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr

65 70 75TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGA AGA TTT ACA ATA TCG AGA GAC AAC 289Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

80 85 90AGC AAG AAC ACA TTG TTC CTG CAA ATG GAC AGC CTG AGA CCC GAA GAC 337Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp

95 100 105ACC GGG GTC TAT TTT TGT GCA AGA GGC TAC TAT AGG TAC GAG GGG GCT 385Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala110 115 120 125ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC CCG GTC ACC GTG AGC TCA GGA GGT 433Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly GlyGGC GGC TCC GGA GGT GGA GGC AGC GGA GGG GGC GGA TCC GAC ATC CAG 481Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG 529Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

160 165 170ACC ATC ACC TGT AAG TCC AGT CAA AGT GTT TTA TAC AGT TCA AAT CAG 577Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln

175 180 185AAG AAC TAC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG 625Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys190 195 200 205CTG CTG ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGT GTG CCA AGC AGA 673Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

210 215 220TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC 721Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser

225 230 235CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAT CAA TAC CTC TCC 769Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser

240 245 250TCG TGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA TCT AGC TGC 817Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Cys

255 260 265TCG AGC GGA GGC GGG GGT AGC GAT ATC GCG GCC GCA GAA CAG AAA CTC 865Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu270 275 280 285ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGC GCC GCA CAT CAC CAT CAT CAC CAT 913Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His

290 295 300(2)序列14资料：(i)序列特征：

(A)长度：301个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ile Phe

35 40 45Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val

100 105 110Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr

115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln145 150 155 160Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr

180 185 190Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

195 200 205Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

210 215 220Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro225 230 235 240Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr

245 250 255Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Cys Ser Ser Gly

260 265 270Gly Gly Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu

275 280 285Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His

290 295 300(2)序列15资料：(i)序列特征：

(A)长度：1679bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：

(A)名称/键：COS

(B)位置：11..1667(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：AAGCTTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTG GCC ACA 49

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr

15 20 25GTT GTG CAA CCT GGC CGG TCC CTG CGC CTG TCC TGC TCC TCG TCT GGC 145Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly30 35 40 45TTC ATT TTC AGT GAC AAT TAC ATG TAT TGG GTG AGA CAG GCA CCT GGA 193Phe Ile Phe Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

95 100 105ACC GGG GTC TAT TTT TGT GCA AGA GGC TAC TAT AGG TAC GAG GGG GCT 385Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala110 115 120 125ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC CCG GTC ACC GTG AGC TCA GGA GGT 433Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140GGC GGC TCC GGA GGT GGA GGC AGC GGA GGG GGC GGA TCC GAC ATC CAG 481Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

255 260 265TCG AGC GGA GGC GGG GGT AGC GAT ATC AAA CTG CAG CAG TCT GGG GCA 865Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala270 275 280 285GAA CTT GTG AGG TCA GGG ACC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT 913Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser

290 295 300GGC TTC AAC ATT AAA GAC TCC TAT ACG CAC TGG TTG AGG CAG GGG CCT 961Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro

305 310 315GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA TGG ATT GAT CCT GAG AAT GGT GAT 1009Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp

320 325 330ACT GAA TAT GCC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT TTT ACT ACA GAC 1057Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp

335 340 345ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC CTG CAG CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAG 1105Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu350 355 360 365GAC ACT GCC GTC TAT TAT TGT AAT GAG GGG ACT CCG ACT GGG CCG TAC 1153Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr

370 375 380TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT 1201Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

385 390 395GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCA GAA AAT 1249Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn

400 405 410GTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG 1297Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys

415 420 425GTC ACC ATA ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG 1345Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp430 435 440 445TTC CAG CAG AAG CCA GGC ACT TCT CCC AAA CTC TGG ATT TAT AGC ACA 1393Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr

450 455 460TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGA TCT 1441Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

465 470 475GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT 1489Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala

480 485 490GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAA CGG AGT AGT TAC CCA CTC ACG TTC GGT 1537Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

495 500 505GCT GGC ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG GCG GCA GGC TCG AGC GGA GGC 1585Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Gly Ser Ser Gly Gly510 515 520 525GGG GGT AGC GAT ATC GCG GCC GCA GAA CAG AAA CTC ATC TCA GAA GAG 1633Gly Gly Ser Asp Ile Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

530 535 540GAT CTG AAT GGC GCC GCA GAT CAC CAT CAT CAC CAT TGATTCTAGA 1679Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His

545 550(2)序列16资料：(i)序列特征：

(A)长度：553个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Asp Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ile Phe

35 40 45Ser Asp Asn Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

85 90 95Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val

100 105 110Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Arg Tyr Glu Gly Ala Met Asp Tyr

115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln145 150 155 160Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr

180 185 190Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

195 200 205Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

245 250 255Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Cys Ser Ser Gly

260 265 270Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val

275 280 285Arg Ser Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn

290 295 300Ile Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Gly305 310 315 320Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr

325 330 335Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser

340 345 350Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala

355 360 365Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp

370 375 380Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly385 390 395 400Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr

405 410 415Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile

420 425 430Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln

435 440 445Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu

450 455 460Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser465 470 475 480Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

485 490 495Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

500 505 510Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

515 520 525Asp Ile Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

530 535 540Gly Ala Ala His His His His His His545 550

Claims

1.一种重组多特异分子，包括抗Fc受体部分和抗靶部分。

2.如权利要求1的重组多特异分子，其中抗Fc受体部分或抗靶部分至少一个是人源化的。

3.如权利要求2的重组多特异分子，其中所述抗Fc受体部分是一种抗体片段。

4.如权利要求2的重组多特异分子，其中所述抗靶部分是一种抗体片段或一种配体。

5.如权利要求2的重组多特异分子，其中所述抗Fc受体部分在效应细胞上以不由内源免疫球蛋白结合的位点结合Fc受体。

6.如权利要求2的重组多特异分子，其中所述抗Fc受体部分结合Fcγ受体。

7.如权利要求6的重组多特异分子，其中所述Fcγ受体是FcγRI受体。

8.如权利要求4的重组多特异分子，其中所述靶是癌细胞。

9.如权利要求4的重组多特异分子，其中所述靶是感染剂。

10.如权利要求4的重组多特异分子，其中所述靶是产生抗体细胞。

11.如权利要求8的重组多特异分子，其中所述靶是乳腺癌或卵巢癌细胞。

12.如权利要求11的重组多特异分子，其中所述靶是HER 2/neu表达细胞。

13.如权利要求12的重组多特异分子，其中所述抗靶部分是抗体520C9。

14.如权利要求4的重组多特异分子，其中所述配体是表皮生长因子。

15.一种多价分子，包括1)至少一个抗Fc受体部分，和2)至少一个抗靶部分。

16.一种多特异分子，具有一个抗FcR、一个抗靶部分和一个抗增强因子部分。

17.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗靶部分结合癌细胞。

18.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗靶部分结合癌。

19.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗靶部分结合肉瘤。

20.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗靶部分结合病原体。

21.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗靶部分以不同于所述第一FcR单克隆抗体的表位与FcR结合。

22.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗靶部分结合可溶性蛋白/肽。

23.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗靶部分结合任何能够产生免疫反应的分子或单克隆抗体。

24.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗FcR部分与Fc受体的结合不受人免疫球蛋白G的抑制。

25.如权利要求15或16的多价分子，其中所述抗FcR部分与FcR特异结合。

26.如权利要求16的多价分子，其中所述抗EF部分与T细胞表面抗原特异性结合。

27.如权利要求16的多价分子，其中所述抗EF部分结合CD3。

28.如权利要求16的多价分子，其中所述抗EF部分结合FcR上的第二表位。

29.如权利要求16的多价分子，其中所述抗EF-部分结合靶细胞。

30.如权利要求16的多价分子，其中所述抗EF部分结合第二FcR。

31.如权利要求16的多特异分子，其中所述抗EF部分特异结合于与骨髓相关的细胞毒性触发分子。

32.一种多特异分子，具有一个特异结合FcγRI的部分、一个特异结合所述靶抗原的一个表位的部分，和一个特异结合同一靶细胞上的第二个位点的部分。

33.一种治疗癌症的方法，包括施用治疗有效量的多价多特异分子。

34.一种治疗自身免疫病的方法，包括施用治疗有效量的多价多特异分子。

35.一种治疗、清除不希望的病原体的方法，包括施用治疗有效量的多价多特异分子。