CN1212866C - 可生物降解的聚合物支架结构 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括广泛互连的大孔网络的聚合物支架结构。该聚合物支架结构包含了直径范围0.5-3.5毫米，优选地范围1.0-2.0毫米的大孔。利用一种新方法制备了该聚合物支架结构，该方法有利地结合了颗粒沥滤和相转换的技术，得到了能够控制得到的聚合物支架结构的形态的放大方法。该聚合物支架结构在组织工程领域，特别是作为体外和体内细胞生长的支架结构中具有用途。

Description

可生物降解的聚合物支架结构
本发明的领域
本发明涉及在组织工程中可生物降解的聚合物支架结构的用途。更具体地说，本发明涉及在大孔之间具有高水平互连的新的大孔聚合物支架结构。
发明背景
损伤，遗传畸形和疾病的骨治疗经常需要植入移植物。已知自体移植和异体移植是最安全的移植；但是，由于供应源有限，疾病传播的危险以及这些移植物遇到的排斥，合成的生物材料也已经广泛地用作植入体。在这些生物材料中有一些观察到了体内并发症，如机械不匹配(应力屏蔽)和出现磨损碎片导致植入体周围骨萎缩，骨质疏松或骨溶解的(Woo等人，1976；Terjesen等人，1988)。
组织工程(TE)确定的一条新途径最近引起了很大兴趣。组织工程包括开发能够与生物组织特定地相互作用产生功能性组织等当物的新一代生物材料。基于的前提是可以从病人分离细胞，在细胞培养中扩展，并且接种到从特定的生物材料制备的支架结构形成称为“TE构建体”的支架结构/生物组成。然后，将该构建体移植进同一病人，作为替代组织起作用。当供体器官的得到受限制，或在一些情况中(例如，年轻病人)获得的天然替代物不适当时，一些这样的系统可用于器官组织替代中。支架结构本身可以作为递送来自生长因子，基因和药物的生物活性成分的载体。这一革命性的外科方法具有广泛的用途，对病人的情况和健康护理系统的发展都有好处。
组织工程在骨组织的生长上的应用包括收集生骨干细胞，接种它们，并允许在体外生长产生新的组织。然后，新得到的组织可以用作自体移植体。可生物降解的聚酯-特别是聚(丙交酯-共-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide))已经用作几个不同的细胞群体，例如软骨细胞(正如Freed等人，在生物医学材料研究杂志，27：11-13，1993中所述)，肝细胞(正如Mooney等人，在生物医学材料研究杂志29，959-965，1995中所述)，和最新的骨髓起源细胞(如Ishaug等人，在生物医学材料研究杂志36：17-28，1997和Holy等人，在细胞和材料，7，223-234，1997中所述)的组织工程的支架结构。具体地，制备了这些聚酯的多孔结构，并且用细胞接种；但是，当在这些多孔结构上培养骨髓起源的细胞时，骨的向内生长只发生在3-D聚合物支架结构的外部边缘内(Ishaug等人，出处同上；Holy等人，出处同上)。所以，在这些情况中制备的聚合物支架结构是不适合提供适用于移植或用作自体移植体的组织需要的细胞生长的。
发明概要
已经发现以在小梁骨中可见的互连大小范围是毫米级的大孔为特征的聚合物支架结构在组织工程中特别有用，因为它们允许作为三维组织发育的关键的细胞向内生长。利用结合相转换和颗粒沥滤的技术的新方法可以制备这样的聚合物支架结构。
因此，在本发明的一个方面，提供了包括大小范围0.5毫米到3.5毫米的并且具有相似于人小梁骨中发现的互连的孔特征的大孔的聚合物支架结构。
更具体体，提供了具有至少50％孔隙度和小梁形态的大孔聚合物支架结构，所述的大孔聚合物支架结构包括平均直径范围约0.5到约3.5毫米的大孔，所述的大孔具有由聚合物支柱限定的孔壁，并包括互连所述大孔的大孔性通道。
在本发明的另一方面，提供了制造聚合物支架结构的方法，包括如下步骤：
结合液体聚合物和颗粒以形成颗粒聚合物混合物；
在聚合物非溶剂中浸没颗粒聚合物混合物产生固化颗粒-聚合物混合物；和
在颗粒溶剂中浸没固化颗粒-聚合物混合物足够的时间允许溶解颗粒。
在本发明的另一方面，提供了生长组织的方法，在这一方法中，在三维聚合物支架结构中组织生长弥漫性侵入至少2.5倍于支架结构中的平均大孔大小的深度，该方法包括如下步骤：
将组织细胞接种在聚合物支架结构中，所述的支架结构包含具有0.5-3.5毫米大小范围的大孔，包括连接大孔的大孔性和微孔性通道；和
培养细胞。
在本发明的另一方面，提供了生物相容性聚合物小梁，包括：
具有至少50％孔隙度的大孔聚合物支架结构，所述的大孔聚合物支架结构包括具有直径范围约0.5-3.5毫米的大孔，并且包括在所述的大孔之间的互连。
在本发明的另一方面，提供了组织生长的方法，该方法中组织在三维聚合物小梁中生长并弥漫性侵入至少2.5倍于支架结构的平均孔大小的深度，该方法包括如下步骤：
合成包括孔隙度至少50％的大孔聚合物支架结构的聚合物的生物相容性小梁，所述的大孔聚合物支架结构包括直径范围约0.5-3.5毫米的大孔和所述大孔之间的大孔性和微孔性互连；
将组织细胞接种在聚合物支架结构上；和
培养组织细胞。
在本发明的另一方面，提供了培养三维组织的方法，包括用组织细胞接种大孔聚合物支架结构和培养细胞，所述的支架结构包括互连的大孔，至少50％的大孔的孔直径范围约0.5-3.5毫米。
附图的简要说明
参考附图和计算机数字化的显微图，本发明的实施方案得到了更详细的说明，其中：
图1是说明如下文确定的不同成分的聚合物孔系统一部分的图解；
图2是显示各向同性和各向异性的区域的股骨颈中骨小梁的光学显微图(来自TobinWJ，在J.Bone Jt Surg37A(1)57-72，1955的修饰的光学显微图)。
图3A是本发明的聚合物的光学显微图(视场宽1.8厘米)；
图3B是图3A的聚合物支架结构的20微米切片的光学显微图(视场宽度3.5毫米)；
图3C是图3A的聚合物支架结构的孔壁的扫描电子显微图。
图4A是当以每秒1％变形的速度进行压缩测试时，说明聚合物的压力/强度曲线的图；
图4B是说明聚合物浓度对聚合物支架结构的机械特性的影响的图。第一个弹性区的杨氏模量称为Y1，第二个弹性区的杨氏模量称为Y2；
图5是利用在DMSO中的0.05克/毫升浓度的PLGA75∶25制备的支架结构的孔壁结构的扫描电子显微图；
图6是利用在DMSO中的0.2克/毫升浓度的PLGA75∶25制备的支架结构的孔壁结构的扫描电子显微图；
图7A是利用小于0.35毫米的颗粒获得的PLGA75/25支架结构的扫描电子显微图；
图7B是利用0.54-0.8毫米的颗粒获得的PLGA75/25支架结构的扫描电子显微图；
图7C是利用0.8-2.0毫米的颗粒获得的PLGA75/25支架结构的扫描电子显微图；
图8是在缺乏颗粒时制备的PLGA75/25膜的扫描电子显微图；
图9A是在T混合物＝11℃，和T非溶剂＝0℃时获得的PLGA75/25泡沫的扫描电子显微图；
图9B是在T混合物＝-20℃和T非溶剂＝0℃时获得的PLGA75/25泡沫的扫描电子显微图。
图9C是在T混合物＝-20℃，和T非溶剂＝40℃时获得的PLGA75/25泡沫的扫描电子显微图；
图10是涂覆PLGA75/25支架结构的叶状CaP的扫描电子显微图；
图11是培养42天的Dex+支架结构的共焦显微图(视场宽度＝1.8毫米)；
图12是利用四环素染色的Dex+支架结构的紫外光照射的光学显微图(视场宽度＝2.0厘米)；
图13是骨钙蛋白免疫标记的支架结构的光学显微图(视场宽度＝1.1厘米)；
图14是苏木精和曙红染色的Dex+培养的支架结构切片的光学显微图(视场宽度＝0.8厘米)；
图15是苏木精和曙红染色的Dex-培养的支架结构切片的光学显微图(视场宽度＝0.6厘米)；
图16A是现有技术中利用小于0.35毫米的颗粒产生的PLGA75/25膜支架结构的扫描电子显微图；
图16B是现有技术中用大小为0.54-0.8毫米的颗粒产生的PLGA75/25膜支架结构的扫描电子显微图。
图16C是现有技术中用大小为0.8-2.0毫米的颗粒产生的PLGA75/25膜支架结构的扫描电子显微图。
图16D是利用小于0.35毫米的颗粒产生的PLGA75/25中间体支架结构的扫描电子显微图；
图16E是利用大小范围0.54-0.8毫米的颗粒产生的PLGA75/25中间体支架结构的扫描电子显微图。
图16F是利用大小范围0.8-2.0毫米的颗粒产生的PLGA75/25中间体支架结构的扫描电子显微图。
图16G是利用小于0.35毫米的颗粒产生的PLGA75/25骨状支架结构的扫描电子显微图。
图16H是利用大小范围0.54-0.8毫米的颗粒产生的PLGA75/25骨状支架结构的扫描电子显微图；和
图16I是大小范围0.8-2.0毫米的颗粒产生的PLGA75/25骨状支架结构的扫描电子显微图。
发明的详细说明
图1是显示通过大孔性互连而互相连接的两个大孔的聚合物支架结构的一部分的图解说明。两个大孔也通过微孔通道(也称为微孔)与周围的大孔连接。用于本发明生产的聚合物支架结构的叙述中的这些和其它几个术语定义如下。
支架结构：作为组织工程或相关应用的细胞载体而设计的装置。这一装置优选地具有供细胞定居的多孔的形态。在我们的特定实例中，支架结构具有开孔形态。
大孔：由聚合物壁隔开的聚合物支架结构内的空间。大孔通常的直径是0.5-3.5毫米。
孔壁：隔开大孔的聚合物支柱(strut)。当聚合物支柱形成各向异性的束时，其中大孔的互连将同一束中的支柱相互分开，孔壁的结构定义为“片状”。当支柱是各向同性的，没有形成束并且主要由大孔性互连将它们广泛地相互隔开时，孔壁定义为“支柱状”。当制成切片时，片状和支柱状孔壁结构具有纳孔。
微孔性互连(也称为微孔或微孔通道)：在片状孔壁中发现的空间。聚合物的每个支柱或片层是由称为微孔的延伸平行孔结构相互分开的。这些孔的大小小于200微米。微孔负责整个支架结构的互连性。
大孔性互连：在片状排列孔壁之间或聚合物支柱之间的通道。它们主要负责大小范围200微米到2毫米的大孔的互连性。
纳孔：在聚合物块中发现的空间。来自孔壁支柱或孔壁片层结构的大块聚合物物质的横断面具有圆的凹腔，这些凹腔可能或可能没有在整个聚合物大块物质中穿孔。这些纳孔可能是聚合物大块中陷入的非溶剂产生的，或聚合物大块的自我催化降解产生的。纳孔分布在支架结构的壁中。当它们穿越整个大块物质时，它们只负责大孔的全面互连性。
互连：相互连接大孔的流动通道。互连包括大孔性互连(通道)，微孔性互连(通道)，和上面定义的穿越整个块物质的纳孔。
本发明提供了包括大孔和互连的大孔聚合物支架结构。大孔的直径范围0.5-3.5毫米，互连如小梁骨中所见。本文公开的聚合物支架结构的形态(也称为泡沫结构)是基于小梁骨的形态的。
小梁骨是骨中代谢最活跃的位点(如Rodan GA，骨13，S3-S6 1992所述)。小梁骨的特有的开孔状几何结构有利地影响了骨形成和再吸收，所以在骨组织工程中是相当令人感兴趣的：确实，理想的骨组织工程的支架结构的设计也应该允许快速的骨形成和再吸收。所以骨小梁的形态可作为模型制造本文公开的新聚合物支架结构。
骨小梁的结构取决于发现骨的解剖学位点，和较小程度地取决于病人的年龄。
Martin RB(生物医学工程CRC重要综述，10(3)，179-222，1984)描述骨小梁为“间断的壁和支柱的复合系统”的。在小梁之间发现的空间称为“髓空间”。小梁的方向是无规则的；但是，有时可以看见小梁的几何结构是球状结构，并且该球状结构是在骨上作用了压力之后的。小梁的方向给定的区域是各向异性的，而小梁随机放置的区域是各向同性的(例如，图2)。
Whitehouse和Dyson(出处同上)以及Martin(出处同上)详细地叙述了股骨中小梁骨的孔隙度。表1.1表示了Whitehouse和Dyson确定的所有股骨区域的不同孔隙度和小梁宽度。
表1.1：股骨小梁骨孔隙度和小梁宽度
区域 孔隙度(％空间/骨) 小梁宽度(毫米)
中间 71.5±5.0 0.23±0.060
旁侧 79.0±5.0 0.23±0.053
转子间弓 88.2±3.2 0.14±0.029
转子间弓内部 84.5±1.8 0.18±0.024
更大的转子 90.5±1.0 0.31±0.026
已经研究了小梁骨的结构，如小梁宽度，孔隙度，各向异性和通常的模式如连接性和星体积。小梁骨公开的光学和扫描电子显微图表明小梁(即孔)勾勒的髓空间是1到几毫米范围，并且由大小范围为约0.3到1毫米的孔互连。
当本发明中形成的聚合物生产的小梁的用途是生理应用时，优选地从任何生物相容性聚合物制备聚合物支架结构。术语“生物相容性”，正如本文所用，指对细胞没有毒性和允许细胞定居其上的聚合物。适当的聚合物的例子包括聚(丙交酯)，各种比例的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，聚苯乙烯，聚(乙交酯)，聚(丙烯酸酯)，聚(异丁烯酸甲酯)，聚(羟基乙基异丁烯酸酯)，聚(乙烯醇)，聚(碳酸酯)，聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)，聚(酸酐)，聚(乙烯)，聚(丙烯)，聚(羟基丁酸酯)，聚(羟基戊酸酯)，聚(氨基甲酸酯)，聚醚氨酯，聚醚型氨基甲酸酯，多芳基化合物，聚(酰亚胺)，聚(酸酐-共-酰亚胺)，聚(氨基酸)和聚(磷腈)。在与细胞移植相关的本发明的支架结构的应用中，可生物降解的脂族聚酯如聚乳酸(polylactic acid)及其衍生的聚合物代表了特别有用的一类聚合物，因为它们已经被批准应用于人的临床。在这点上，用作支架结构的优选的聚合物是PLGA，特别是含有高于50％聚(DL-交酯)的混合物如PLGA85∶15和PLGA75∶25。
本发明的支架结构的适当用途是根据聚合物组成和结构变化的。例如，可生物降解的聚合物支架结构适用于体外的用途和/或体内的细胞移植。在移植人体内之前，基质可以作为支持物或支架结构以在体外培养细胞。支架结构也可以直接用于体内，而没有预先接种细胞。在两种用途(有或没有预先的细胞接种)中，本发明的可生物降解聚合物基质特别实用于三维组织的生长，并且可用于结缔组织，如骨，软骨，牙周组织，以及牙齿组织和其它器官，如肝或胸的组织的生长。
本发明的聚合物支架结构的明显特征是存在的大孔至少50％的直径范围为0.5-3.5毫米，这是在人小梁骨中发现的代表性范围。优选地，大孔的直径至少1.0毫米，最优选地，大孔的直径范围约1.0-3.5毫米。
除了其大孔结构，支架结构的特征中还有高水平的互连度，互连度增强了细胞在支架结构中的渗透和将营养流动到细胞。至少0.35毫米的大孔性互连在聚合物支架结构中提供了“开放细胞”的环境，这对于促进组织在支架结构中全面生长，即三维组织生长是重要的。
大孔是由可能或可能不基于片层结构的有孔聚合物壁勾勒的。孔壁的总厚度不大于约0.4毫米，优选地不大于约0.3毫米。孔壁的互连程度是取决于加工的温度的其它因子的。
一个惊人的和出乎意料的结果是通过大孔和微孔性互连，每个大孔与大量的邻近大孔流动联系。
本文叙述了利用新的相转换颗粒沥滤的方法在不同温度获得具有不同孔壁结构的支架结构。
如利用Northern Eclipse成象分析软件估计，对于所有获得的支架结构，聚合物支架结构的孔隙度至少是50％的水平，优选地水平高于50％。本发明的聚合物支架结构的孔隙度水平也与“开放细胞”特性相关，在大孔之间产生了明显的重叠(产生大孔通道)，确定了本发明的支架结构的高度互连特性，进一步增强了它作为细胞生长的支架结构的用途。在这点上，孔隙度水平优选地大于约75％，而最优选的孔隙度水平大于85％。
本发明的支架结构的特征使它特别适用于组织工程，更值得注意地可用于细胞移植，因为它提供了细胞以三维方式通过支架结构的互连大孔网络可以定居的生物相容性的支架结构。这在考虑任何产生组织，特别是需要新血管生成的组织如骨组织的细胞的移植时是重要的。另外，当用于细胞移植时，支架结构是可生物降解的，其降解是可以控制的，所以细胞生长可以和支架结构的降解同时进行。
本领域技术人员能够理解的是，为了进一步增强用作细胞生长的支架结构的特性，可以修饰本发明的聚合物支架结构。通常影响用作细胞生长的支持物的结构的修饰也适用于修饰本发明的聚合物支架结构。这样的修饰的作用是增强生物学应答，并且包括例如利用胶原，磷酸钙，糖蛋白，蛋白质，肽，碳水化合物和多糖，或通过酸/碱处理修饰表面。另外，聚合物支架结构可以作为增强细胞功能的活性分子如蛋白质，生长因子的递送的存储器。
利用颗粒沥滤方法和相转换方法结合的新方法可以制造本发明的聚合物支架结构。在开始的步骤中，将选定的聚合物支架结构制备成液体聚合物。如本文所用，术语液体聚合物指单独或混合另一液体的液体形式的聚合物。这可以通过混合溶剂中的聚合物形成聚合物溶液进行。通常用于制备聚合物溶液的任何溶剂可以用于这一目的，包括二甲亚砜(DMSO)，二氯甲烷，乙酸乙酯，氯仿，丙酮，苯，2-丁酮，四氯化碳，氯仿，正庚烷，正己烷和正戊烷。正如本领域技术人员认识到的，非细胞毒性溶剂如DMSO可优选地用于制备溶液，从而对细胞生长没有不利影响。在聚合物溶液中的聚合物的浓度将随着用于制造支架结构的聚合物的特性而变化。或者，加热聚合物到熔点也可以形成液体聚合物。
然后，将液体聚合物与适当大小的与方法中的颗粒沥滤相相关的颗粒混合。具有相当于聚合物支架结构中大孔的需要直径的直径的颗粒是适当的，具体地，颗粒具有的直径范围0.5-3.5毫米。更优选地，颗粒具有的直径大于1.0毫米，最优选地颗粒具有的直径在1.0和2.0毫米之间。适当的与聚合物混合的颗粒的例子包括，多糖(如葡萄糖)，有机和无机盐，适当大小的蛋白质和脂，它们可以溶解于不是聚合物的溶剂的溶剂(即聚合物非溶剂)。与聚合物溶液混合的颗粒的量同样随着用于制造本发明的支架结构的聚合物的特性而变化。
当已经完全将颗粒与液体聚合物混合形成颗粒聚合物混合物时，将聚合物进行相转换步骤，在此步骤中将聚合物从液体转换成固体。将颗粒聚合物混合物浸没在聚合物非溶剂，即聚合物不溶于其中的溶剂中完成这一步骤。这样的聚合物非溶剂包括例如，水，醇，1-4二噁烷和腈。
为了获得特定形态的固体聚合物支架结构，在相转换步骤中可以将聚合物混合物放置于模子中。优选地，例如通过冷冻聚合物颗粒浆液可以将液体聚合物固定在颗粒周围。这样，可不使用模子，并且从所有外表面同时发生了相转换过程。例如当聚合物溶剂是DMSO时，将聚合物冷却到小于或等于12℃的温度，这是DMSO的冷冻温度。也可以利用冷却温度如小于0℃的温度。在方法的这一步骤中利用低温(例如，-20℃或-80℃)的结果是随后形成了不同形态的聚合物支架结构(例如实施例4)，如较厚的表层结构，如实施例1所述，这种结构在用作三维细胞生长的支架结构之前是可以除去的。除了冷却，也可以利用其它稳定聚合物-颗粒混合物的方法，例如胶凝化(增加黏度)。
在聚合物混合物从液体转换成固体相之后，将聚合物进行颗粒沥滤。在方法的这一步骤中，将聚合物浸没在颗粒溶剂，即，溶解完全分散于聚合物的颗粒但不溶解聚合物本身的溶剂中。当然，适当的颗粒溶剂取决于颗粒和聚合物的特性。适当的颗粒溶剂的例子包括水，醇，1-4二噁烷和腈。特定的溶剂的温度可能根据对得到的聚合物的支架结构的最小影响而变化。但是，该温度通常在颗粒溶剂的冷冻点和聚合物的玻璃转变温度之间，从而聚合物在非溶剂温度的影响下不会熔融或变得粘稠。在一个实施例中，当颗粒溶剂是水，聚合物是PLGA75∶25时，利用的颗粒溶剂温度在0℃和45℃之间。
将聚合物浸没在颗粒溶剂中适当时间，以使分散在整个聚合物支架结构中的颗粒完全溶解。通常，至少需要24小时才能达到聚合物支架结构中的颗粒完全溶解，而优选地至少48小时。为了加快颗粒的有效溶解，在溶解过程中需要以频繁的间隔将聚合物浸没在新鲜的溶剂中，例如约8-9小时的间隔或利用循环溶剂浴。
在利用同时是聚合物非溶剂和颗粒溶剂的溶剂时，相转换和颗粒沥滤过程可以在一个步骤中进行。在一个实施例中利用了双蒸馏水(ddH2O)。
在适当颗粒溶解时期之后可以从颗粒溶剂中移取聚合物支架结构，在使用之前可以真空干燥或在乙醇(如70％乙醇)中消毒，漂洗，和在培养基中培养，备用。如果不是立即使用聚合物支架结构，需要在干燥器中干燥存储，防止滞留水分和聚合物可能的降解。
本发明的方法有利地产生具有独特特征的聚合物支架结构，特别是产生了具有互连的大孔网络的聚合物支架结构。本发明的两步骤方法的另一个明显的优点是它提供了控制得到的聚合物支架结构的形态的放大手段。用另一句话说，本方法提供了两个阶段，颗粒沥滤和相转换，在这两个阶段中影响聚合物支架结构的形态。例如，在本方法的颗粒沥滤和相转换阶段可以改变大孔的大小和分布并且由颗粒大小和分布，和在较小的程度上由加工支架结构的温度控制大孔的大小和分布。另外，改变相转换的速度可以影响互连的形成和大小。改变一系列变量包括温度，聚合物非溶剂的类型和聚合物的浓度可以改变相转换的速度。所以，支架结构的最后形态是可以控制的。优选地，得到的形态相似于人的小梁骨的形态。
在本发明的另一方面，提供了利用本文叙述的聚合物支架结构培养三维生长的细胞的方法。本发明的聚合物支架结构的新的互连大孔结构特别适用于组织工程，特别是骨组织工程，其是目前利用的骨修复治疗的一个有前途的替代方法。在这点上，利用本领域技术人员已知的传统方法可以将骨髓派生的细胞接种到聚合物支架结构中(如Maniatopoulos，细胞组织研究254，317-330，1988中所述)。将细胞接种到聚合物支架结构上并且在适当的生长条件下培养。将适于建立生长的培养基提供给培养物。
如上所述，各种类型的细胞可以在本发明的聚合物支架结构中全面生长。但是，本发明的聚合物支架结构特别适用于生骨细胞，建立骨基质的细胞的生长。在组织工程中，细胞可以是任何起源的。有利地，细胞是人起源的。本发明的在本发明的三维聚合物支架结构中生长细胞的方法使得接种的例如生骨细胞在体外时期渗透聚合物支架结构以制成骨基质，这些细胞弥漫分布在聚合物支架结构的结构中，特别是分布的深度至少2.5倍于平均大孔大小的深度。生骨细胞的渗透和作为结果的骨基质的确立可以通过机械的，超声波的，电场或电子手段增强。
下面的特定实施例叙述的是本发明的实施方案，它们只作为例子，不构成对本发明的限制。
实施例1-制备PLGA75∶25聚合物支架结构
利用固有黏度0.87dL/g的PLGA75∶25(从Birmingham聚合物公司得到)可以制备本发明的PLGA75∶25聚合物支架结构。将1毫升在DMSO中的0.1克/毫升PLGA75∶25与2克葡萄糖结晶(颗粒大小范围0.8毫米到2毫米)在铝模中混合。将PLGA75∶25-DMSO混合物冷却到-20℃。将PLGA75∶25-DMSO混合物的这一温度称为T混合物。然后，在0℃，将冷冻的PLGA75∶25块浸没在聚合物的非溶剂，ddH2O的冰-水混合液中。水的这一温度称为T非溶剂。将块保留在ddH2O中48小时，在这过程中约每8小时更换ddH2O。然后，从水中移取得到的支架结构，在0.01毫米汞柱下真空干燥72小时，并且在真空下在干燥器中4℃储藏直到使用。然后，全面分析利用上面的条件获得的支架结构。
如图3A所示，利用解剖显微镜在低倍数(16×)下观察2毫米厚的聚合物支架结构切片的大孔结构。在整个聚合物支架结构中，可以观察到均一分布了大小范围约0.8-1.5毫米的互连大孔。大孔具有椭圆形态和含有微孔的厚孔壁(约300微米的厚度)。
然后，在Tissue-Tek浸没培养基(Miles#4583)中浸没聚合物支架结构，在-20℃，在恒冷切片机中切片。在玻璃片(VWR Canlab)上收集一系列20微米厚的切片(50个切片)。利用解剖显微镜，在低倍数(16×)下将切片照相，并且扫描。图3B是鉴定支架结构的孔成分，大孔，大孔性互连(通道)和微孔性互连(通道)的扫描支架结构切片。在聚合物支架结构的外表面观察到了聚合物薄膜(即，表层)。将图像转换成TIFF胶片，利用Northern Eclipse成像分析软件，在PC计算机上分析。利用“单个测量”菜单测量每个扫描切片的孔壁大小(面积，周长，直径等等)。利用“数据测量”途径计算每个扫描玻片的孔壁支柱的面积和数目。
利用上面提到的扫描图象的倍数确定象素/毫米比例，通过校正系统将这些测量数据从象素单位转换成毫米。大孔的大小是利用软件工具在聚合物支架结构切片的数字化图象上从一个孔壁到邻近的孔壁手划一条线确定的。正如利用Northern Eclipse图象分析软件确定的，得到的聚合物支架结构的特征如下：
大孔大小                  1.79+/-0.42毫米
大孔性互连                0.37+/-0.15毫米
孔壁厚度                  0.29+/-0.13毫米
微孔                      0.10+/-0.05毫米
孔隙度                    86.7+/-2.43％
利用汞孔隙度计(Quantachrome Autoscan 60)同样估计了聚合物基质的孔隙度。将具有5立方厘米细胞主干体积的固体透度计用于0.015到0.020克范围的样品。从汞侵入的体积计算孔的体积的值。从汞侵入体积计算的孔隙度为89.6％。利用Northern Eclipse图象分析软件估计的孔隙度(～87％)基本等同于汞孔隙度计测量的～90％的孔隙度，当分析孔直径大于～75微米的聚合物支架结构时，汞孔隙度计方法是不精确的。
同样可以利用扫描电子显微镜(SEM)分析制备的聚合物支架结构。将支架结构以约2毫米的厚度制成横断面切片，并且在氩气下用金喷洒涂覆(Polaron仪器公司，Doylestown，PA)。在日立2500SEM上，加速电压15kV进行扫描电子显微成象。利用SEM显微图确定了大孔的直径约1到1.5毫米，虽然并不总是观察到每个大孔之间清楚的分离能够说明这些聚合物支架结构的非常开放的互连结构。
正如图3C所示，利用SEM证实了如光学显微镜下观察到的孔壁的微孔特性。
聚合物支架结构的机械测试如下。制备了1.5厘米直径和高度的圆柱形聚合物支架结构，利用Instron机械测试仪测试。在单轴伺服水力测试机器(Instronl331型装载框架，具有Series2150控制器)进行机械实验。将1千克载荷室(Sensotec，31/4680型)用于所有压缩测试。利用DC线性变化差示转化器(LVDT，intertechnology SE374型)测量调节器的偏差。在数字储存示波器(Gould，1425型)上测试的过程中，展示了来自载荷室和LVDT的信号。将信号输入加速苹果IIe计算机的16道，12位模拟-数字(A/D)转换器中。这些实验捕获数据的速度是430对数据点/秒。聚合物支架结构的压缩发生的速度是0.1毫米/秒。正如图4A所示，压缩强度对聚合物支架结构变形百分数的曲线显示了两个模量。第一个弹性区的杨氏模量(称为Y1)是0.76±0.12MPa，第二个弹性区的杨氏模量(称为Y2)是0.18±0.016MPa。
实施例2-聚合物浓度对聚合物支架结构的影响
利用实施例1中详细描述的方案确定DMSO中PLGA75∶25的浓度对得到的聚合物支架结构的影响。如实施例1所述当所有其它条件维持恒定时，利用三个不同的DMSO中PLGA75∶25的浓度(0.05克/毫升，0.1克/毫升和0.2克/毫升)制造聚合物基质。
利用剃刀将制备的每个聚合物支架结构切成一半。发现不管DMSO中PLGA75∶25的起始浓度多少，每个上面都有表层结构。测定3个不同的聚合物支架结构的机械特征，并且在图4B中说明。观察到在利用0.05毫克/毫升的DMSO中的PLGA制备的聚合物支架结构中杨氏模量有明显的下降，而最硬的支架结构是利用2毫克/毫升的PLGA75∶25获得的。
在光学显微镜和SEM下观察这些支架结构。在光学显微镜下，在三个聚合物支架结构之间可以检测到结构上没有差异。但是，当在SEM下观察时，利用在DMSO中的0.05克/毫升PLGA产生的支架结构比利用在DMSO中的0.2克/毫升PLGA具有更多的片层壁结构和更多的微孔性互连(参见图5)，后者观察到了较少的微孔孔互连(参见图6)。
实施例3-颗粒对聚合物支架结构的影响
如下确定改变与PLGA聚合物混合的葡萄糖颗粒的量和大小对聚合物支架结构的影响。保持实施例1所述的所有其它条件恒定，将不同量的葡萄糖颗粒(0.5克，1克和2克)分别与1毫升聚合物溶液混合。利用筛过的颗粒(标准测试筛，VWR，West Chester，PA)同样测定颗粒大小对最后支架结构的形态的影响：1)NaCl结晶(＜0.35毫米)，2)蔗糖结晶(0.54毫米＜结晶大小＜0.8毫米)和3)葡萄糖结晶(0.8毫米＜结晶大小＜2毫米)。通过光学显微镜观察得到的聚合物支架结构。当将聚合物溶液与颗粒混合时，可以看见对于小量的颗粒(即，0.5克/毫升)，聚合物溶液没有完全浸没在颗粒床中。在相转换成膜结构后得到这一聚合物溶液层，其相似于没有利用颗粒时看到的。更大的颗粒溶液密度(即，2.0克/毫升)完全浸润了聚合物溶液，以致得到的支架结构中分布了大孔，而没有这一膜结构。
大孔的大小直接与利用的颗粒的大小成比例，例如，大孔大小是～0.33毫米，利用的颗粒＜0.35毫米(例如图7A)，和大孔的大小0.75毫米，利用的颗粒大小范围是0.54到0.8毫米(例如，图7B)。最后对于大于0.8毫米的颗粒，观察到的大孔是～1.4毫米(例如，图7C)。当没有颗粒与聚合物-DMSO溶液混合时，如图8说明，得到的聚合物结构是含有微孔的厚表层组成的中空的圆筒。这一表层非常相似于正常相转换方法得到的膜结构。
实施例4-加工温度对聚合物支架结构的影响
研究了在T非溶剂(0℃)恒定时，三个不同的T混合物(11℃，-20℃和-80℃)的影响。利用1)T混合物＝11℃和2)T混合物＝-20℃和T混合物＝-80℃获得了两种主要不同的支架结构。利用T混合物＝11℃和T非溶剂＝0℃获得的支架结构是无表层的，显示了非常开放的结构。正如图9A所示，大孔大小似乎是扩展了，利用SEM估计为～2.72毫米。孔壁具有较少的微孔，但具有较多的大孔性互连，提供给支架结构一个更开放的结构。对于T混合物＝-20℃和-80℃获得的支架结构都具有表层结构。对于T混合物＝-20℃，大孔似乎小于更高的T混合物获得的支架结构上的大孔，通过SEM估计约为～1.8毫米。孔壁是片层，大孔性互连较少，但微孔性互连较多(例如，图9B)。观察到更低的T混合物时大孔大小降低。在T混合物＝11℃和T混合物＝-20℃产生的支架结构之间，大孔大小的差异特别重要，而在T混合物＝-20℃和T混合物＝-80℃产生的支架结构之间观察到了较小的大孔大小的差异。当大孔大小随着T混合物缩减时，孔壁的结构也如上所述改变了。T混合物的差异可能已经影响聚合物沉淀的速度，所以影响孔壁结构的复杂性。
同时在T混合物恒定-20℃时，研究了不同的T非溶剂(40℃，20℃和0℃)。在这种情况下，在所有支架结构之间的主要不同是它们的孔壁厚度。与勾勒每个大孔的聚合物支柱相比，更低的T非溶剂产生更厚和更复杂的孔壁，而更高的T非溶剂产生薄和紧密的孔壁。图9B和图9C显示了在T非溶剂＝0℃和40℃时的支架结构的不同形态。在T非溶剂＝0℃和T非溶剂＝20℃产生的支架结构可以观察到最大的结构差异。在T非溶剂＝20℃或40℃获得的支架结构观察到了更小的差异。更低的T非溶剂(0℃)提供片层孔壁(例如，图9B)，更高的T非溶剂(40℃)提供了支柱状孔壁形态(例如，图9C)。
通过SEM估计了在不同T非溶剂产生的支架结构的孔壁的厚度。在T非溶剂＝0℃时，估计孔壁为0.29毫米，而在T非溶剂＝20℃时，孔壁的大小约为0.10毫米；在T非溶剂＝20℃和40℃之间没有测量到明显的差异。将上面提到的各种温度产生的所有支架结构切片，测量孔大小和孔壁厚度。利用Northern Eclipse成象分析软件估计它们的孔隙度。获得下面的结果：
聚合物溶液温度(℃) 非溶剂温度(℃) 孔大小±标准偏差(mm) 孔壁厚度±标准偏差(mm) 孔隙度(％)
-80 0 1.71±0.22 0.28±0.16 80.4±134
RT 1.63±0.32 0.24±0.10 83.8±1.79
40 1.91±0.43 0.16±0.05 84.6±3.65
-20 0 1.76±0.42 0.29±0.13 86.7±2.43
RT 2.21±0.43 0.10±0.05 85.7±0.97
40 1.96±0.41 0.12±0.04 93.1±2.45
11 0 2.02±0.54 0.11±0.05 93.4±2.07
RT 2.41±0.54 0.15±0.06 91.7±1.63
40 2.72±0.41 0.17±0.08 95.6±1.7
实施例5-聚合物支架结构的表面修饰
通过酸/碱处理；胶原沉积；和磷酸钙沉积可以进一步表面修饰实施例1所述获得的支架结构。方法和结果如下；
利用酸/碱处理增强表面电荷和改变表面拓扑结构。将支架结构维持在几种乙酸浓度(0.1M，1M，5M)下24小时。将支架结构也维持在各种浓度的NaOH下24小时，观察表面聚合物链的水解。在SEM下，5M乙酸或0.1MNaOH处理24小时的支架结构出现表面拓扑结构的变化，出现了纳孔。
设计胶原沉积实验增强聚合物表面的细胞粘连。在0.1％胶原中维持支架结构1小时，5小时，8小时和24小时。
进行磷酸钙沉积实验增强支架结构表面的细胞粘连。在37℃，在完全补充的培养基(如实施例6所述)维持支架结构1星期。通过Von Kossa染色可以看见支架结构表面上的磷酸钙结晶。
进一步进行CaP沉积实验，其中在室温下，将支架结构浸在1.5毫摩尔/升的Na2HPO4中2小时，进一步在饱和的Ca2+溶液中平衡过夜。然后，在SEM下观察支架结构，观察到在支架结构上有叶状形态的结晶(图10)。
实施例6-在聚合物支架结构上培养骨髓起源的细胞
如上所述制备PLGA75∶25聚合物支架结构：在0.1克/毫升二甲亚砜(DMSO，BDH，多伦多，ON)中的PLGA75∶25溶液中将2克/毫升葡萄糖结晶分散。在11℃冷冻聚合物浆液。然后，沉淀聚合物，在40℃，在ddH2O中，从沉淀的聚合物萃取葡萄糖结晶。干燥支架结构到质量恒定(10微米Hg，72小时)，在70％EtOH消毒1/2小时，在α-MEM中漂洗3次，在37℃，在无菌的α-MEM中平衡6天。
利用其它文章(如Maniatopoulos等人，出处同上，和Davies等人，细胞和材料，1：3-15，1991所述)所述的方案和培养基，将第一代初级骨髓起源细胞接种到0.25立方厘米的支架结构上。简要地说，从幼小成年雄性Wistar大鼠(约150克)的两个股骨收集骨髓派生的细胞，放入完全补充的培养基(FSM)：补充了15％胎牛血清，50％毫克/毫升抗坏血酸，10毫摩尔/升β-甘油磷酸和抗生素(0.1毫克/毫升青霉素G，0.05毫克/毫升庆大霉素和0.3毫克/毫升两性霉素)：10-8摩尔/升地塞米松(Dex)的α-MEM加入只有Dex+培养物的FSM。
在培养物中维持细胞6天，在第2天和第5天利用FSM再补充。在第6天将Dex-细胞利用PBS中的0.01％胰蛋白酶胰蛋白酶化，同时将可见钙化信号的Dex+培养物利用PBS中0.01％胰蛋白酶和10微摩尔/升乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶化。然后在独立的预浸湿的支架结构上以7.5×105个细胞/支架结构接种Dex-细胞。在37℃和5％CO2维持培养物42天，并且每2-3天再补充FSM。在Dex+细胞培养物的FSM中每次再补充Dex的浓度是10-8M。
在α-MEM中溶解盐酸四环素粉末(Sigma，St.Louis，MO)制备90毫克/毫升的储备液。制备含有15％胎牛血清，50毫克/毫升抗坏血酸，10毫摩尔/升α磷酸甘油和9毫克/毫升的四环素的α-MEM的新的含四环素的完全补充培养基(TFSM)。利用TFSM在40天的时候最后再补充培养基。在42天利用α-MEM洗涤培养物(10次，每次～3分钟)，并且在Karnovsky固定剂(2.0％低聚甲醛，2.5％戊二醛和0.1摩尔/升可甲基酸钠缓冲液，pH7.2-7.4)中固定过夜。利用少数培养物用于SEM观察，在一系列递级乙醇溶液(70％，100％)中脱水。在0.01毫米Hg冷冻干燥2天。在0.1摩尔/升可甲基酸缓冲盐中保留所有其它培养物，用于组织学或聚焦观察。
如下进行聚焦观察：将样品放置在0.1摩尔/升的可基酸缓冲盐(从BDH得到)中的定做的室中。用玻璃盖片封闭该室。利用BHS滤器，在Bio-Rad MRC-600聚焦激光显微镜中的光学断面检测荧光信号。如图11所示，利用Dex(+)细胞接种的支架结构显示了荧光标记深达约1毫米。在支架结构中没有观察到更深的荧光，因为聚焦显微镜的观察范围的深度不够。因此，可以将支架结构做成厚度约2毫米的切片。从两侧通过聚焦显微镜分析。观察穿过整个支架结构的荧光。同样观察了Dex(+)细胞接种的细胞接种支架结构的切片的荧光标记(参见图12)。在紫外光下观察利用Dex(-)和Dex(+)接种的聚合物支架结构的横断面。在整个支架结构中，只在Dex(+)切片上观察到明亮的荧光信号。特定地，在培养物中利用的聚合物支架结构的0.5厘米的深度通过荧光信号观察到骨基质的建立。在这一测试中的限制因子是聚合物支架结构的深度；所以增加聚合物支架结构的深度将增加细胞渗透的深度，由此，在这一聚合物支架结构中可以形成骨基质。
同时将支架结构中的骨钙蛋白免疫标记。利用最后稀释度1∶6000的山羊抗大鼠骨钙蛋白抗血清(生物医学技术公司，Stoughton MA)通过免疫组织化学方法测定Dex+和Dex-培养物中的骨钙蛋白的表达。测试的最后是利用浓度1∶250的与辣根过氧化物酶抗血清共轭的猴抗山羊IgG第二次抗体标记。对过氧化物酶(载体实验室，Burlingame CA)利用的底物试剂盒是3，3-二胺联苯胺(DAB)，补充了氯化镍染以便色。图13显示了利用Dex+细胞接种的骨钙蛋白标记的支架结构，并且在培养物中维持6星期。获得的支架结构的组织学切片如下：在Tissue Tek中包埋样品以6毫米的厚度垂直切片。同样，从组织学切片观察支架结构内的细胞生长。在低的倍数下，整个支架结构切片可以通过LM观察。在Dex+和Dex-培养物中，在整个支架结构中发现了覆盖了细胞。在支架结构的外表面以及中部，在所有的大孔中可以看见苏木精和曙红染色。图14和15显示了低倍放大的Dex+和Dex-培养的泡沫。正如在更高倍数下看见的，在Dex-培养物上建立的基质的量远远比Dex+培养物丰富。在Dex+培养物中，只发现了在孔壁的衬着少数细胞层，产生了紧密附着孔壁的基质，而在Dex-培养物中，整个大孔体积中充满了基质。
实施例7-在聚合物支架结构上接种人髓细胞
如实施例1所述制备PLGA75∶25基质。将这些支架结构在70％的乙醇中消毒30分钟，然后利用Parker等人(J.of Bone Min.Res.，12(1)，S300：F298，1997)详细叙述的方案和含地塞米松(dex)的培养基，利用来自年轻供体的人骨髓基质细胞接种这些支架结构。
实施例8：大孔大小和互连对细胞侵入的影响
制备三个不同的支架结构形态：1)只通过颗粒沥滤获得的支架结构，指现有技术的膜支架结构形成部分，表示在图16A，16B和16C，在下面简要地讨论，2)如实施例1所述利用低加工温度，通过颗粒沥滤相转换获得的支架结构，称为中间体支架结构和3)如实施例4所述利用更高的加工温度，通过颗粒沥滤相转换获得的支架结构，称为骨状支架结构。从这三个基本的加工途径的每条途径，产生了三个不同大孔大小的支架结构，所以获得了总共9个不同的支架结构。图16A到16I叙述了这9个结构。
只利用颗粒沥滤技术(如Mikos等人，生物材料14，323-330，1993所述)产生了膜支架结构，参见图16A，16B和16C所示的现有技术。简要地说，在氯仿中的PLGA75/25(Birmingham聚合物)溶液中接种筛过的颗粒；1)NaCl(大小＜0.35毫米)，2)蔗糖结晶(大小范围0.54到0.8毫米)或3)葡萄糖结晶(大小范围0.8到2毫米)。将聚合物结构保留在室温下允许氯仿蒸发，然后，在ddH2O中溶解颗粒。
通过从沉淀的聚合物萃取如上所述的不同颗粒，如实施例1和4所述生产中间体和骨状支架结构。在-20℃的聚合物溶液温度和室温下的非溶剂产生了中间体支架结构，而在11℃的聚合物溶液温度和室温下的非溶剂温度产生了骨状支架结构。在70％的乙醇中消毒得到的支架结构30分钟，然后用细胞接种。
通过聚焦显微镜证实了细胞在支架结构中的定居，利用实施例6中所述的骨钙蛋白标记测试证实了整个支架结构中的细胞分化。观察的结果如下：
表2：支架结构大小和细胞定居方式
支架结构/颗粒 颗粒大小
＜0.35mm             0.54-0.8mm            0.8-2.0mm
膜状 大孔大小 0.33 0.58 1.1
互连大小 0.01 0.09 0.9
细胞深度 0.3 0.5 1.5
骨钙蛋白 表面 表面 表面
中间体 大孔大小 0.33 0.75 1.4
互连大小 0.07 0.15 0.45
细胞深度 0.3 1.5 贯穿
骨钙蛋白 表面 表面 表面
骨状 大孔大小 0.35 0.7
互连大小 0.2 0.35 0.65
细胞深度 1.2 贯穿 贯穿
骨钙蛋白 贯穿 贯穿 贯穿
如表2报道的支架结构的细胞定居需要最小的互连大小为0.35毫米和大孔大小0.7毫米。
在这一实施例中，具有大孔大小1.1毫米的膜支架结构没有定居细胞，而大孔大小0.7毫米的骨状支架结构完全定居了细胞。结论是，这一实施例证明颗粒沥滤相转换技术获得的支架结构允许在整个支架结构形态中定居细胞，而前面公开的支架结构只在浅的孔层内定居细胞。
已经叙述的本发明的优选实施方案说明的是本发明的原理，没有将本发明限制于特定地实施方案。所有实施方案定义的本发明的范围都包括在下面的权利要求和它们的等当内容中。

Claims (30)

1、大孔聚合物支架结构，其包括
限定大孔的聚合物支柱，所述大孔由大孔性通道、包括延伸穿过所述聚合物支柱的微孔通道而互连，从而一给定的聚合物支柱任一侧的大孔通过所述给定的聚合物支柱而相互联系，所述大孔具有约0.5到约3.5毫米的平均直径范围，所述连接大孔的大孔性通道具有约200微米到约2毫米的平均直径，且其中所述微孔通道具有小于约200微米的平均直径，所述大孔聚合物支架结构具有至少50％的孔隙度。
2、如权利要求1所述的聚合物支架结构，其中所述限定大孔的聚合物支柱具有小于0.4毫米的平均厚度。
3、如权利要求1或2所述的聚合物支架结构，其是生物相容性的。
4、如权利要求1或2所述的聚合物支架结构，其是可生物降解的。
5、如权利要求3所述的聚合物支架结构，其中所述聚合物是聚(丙交酯-共-乙交酯)。
6、如权利要求5所述的聚合物支架结构，其中所述聚合物包括75％丙交酯和25％乙交酯比例的聚(丙交酯-共-乙交酯)。
7、如权利要求1、2、5或6所述的聚合物支架结构，其具有至少85％的孔隙度。
8、如权利要求1或2所述的聚合物支架结构，其中所述聚合物是生物相容性的和可生物降解的，并具有至少85％的孔隙度。
9、合成大孔聚合物支架结构的方法，包括如下步骤：
将液体聚合物与颗粒混合形成液体聚合物和颗粒的混合物；
稳定所述的混合物；
将所述的混合物浸没在所述液体聚合物的非溶剂中以沉淀所述液体聚合物，产生固化的混合物；和
将固化的混合物浸没在溶解颗粒的溶剂中以使颗粒溶解，获得所述的大孔聚合物支架结构。
10、如权利要求9所述的方法，其中所述的液体聚合物是通过将聚合物溶解于一种聚合物溶剂中而形成。
11、如权利要求10所述的方法，其中所述的聚合物溶剂是二甲亚砜。
12、如权利要求9、10或11所述的方法，其中颗粒具有的平均直径在约0.5到约3.5毫米的范围。
13、如权利要求12所述的方法，其中所述的颗粒具有的平均直径在约1.0到约2.0毫米的范围。
14、如权利要求9、10、11或13所述的方法，其中所述的颗粒选自多糖、有机盐、无机盐、蛋白质、脂或其组合。
15、如权利要求14所述的方法，其中所述的多糖是葡萄糖。
16、如权利要求13所述的方法，其中所述的颗粒是糖颗粒。
17、如权利要求9、10、13、15或16所述的方法，还包括修饰聚合物支架结构的表面的步骤。
18、如权利要求17所述的方法，其中利用选自酸处理，碱处理，胶原沉积和磷酸钙沉积的处理方法修饰聚合物支架结构的表面。
19、如权利要求9所述的方法，其中所述液体聚合物是通过加热一种聚合物至其熔点而液化所述聚合物来形成的。
20、如权利要求9、10、11、13、15、16或18所述的方法，其中所述液体聚合物的非溶剂选自水、醇、1-4二噁烷和腈。
21、如权利要求9所述的方法，其中所述液体聚合物衍生自聚(丙交酯-共-乙交酯)。
22、大孔聚合物支架结构，其具有限定大孔的微孔性聚合物支柱，所述大孔由大孔性通道而互连，所述大孔聚合物支架结构通过如下方法形成：将液体聚合物与颗粒混合形成液体聚合物和颗粒的混合物，将所述的混合物浸没在所述液体聚合物的非溶剂中以沉淀所述液体聚合物，产生固化的混合物，将固化的混合物浸没在溶解颗粒的溶剂中足够的时间以使颗粒溶解，获得所述的具有限定所述的由所述大孔性通道互连的大孔的微孔性聚合物支柱的大孔聚合物支架结构，其中所述大孔具有约0.5到约3.5毫米的平均直径范围，所述连接所述大孔的大孔性通道具有约200微米到约2毫米的平均直径，且其中所述微孔性聚合物支柱包括延伸穿过所述支柱的具有大于约50微米、小于约200微米的平均直径的微孔通道，所述大孔聚合物支架结构具有至少50％的孔隙度。
23、在具有小梁形态的三维大孔聚合物支架结构中培养组织使其弥漫性分布到至少2.5倍于支架结构中平均大孔大小的深度的方法，包括如下步骤：
提供一种大孔聚合物支架结构，所述的大孔聚合物支架结构包括限定大孔的聚合物支柱，所述大孔由大孔性通道、包括延伸穿过所述聚合物支柱的微孔通道而互连，从而一给定的聚合物支柱任一侧的大孔通过所述给定的聚合物支柱而相互联系，所述大孔具有约0.5到约3.5毫米的平均直径范围，所述连接大孔的大孔性通道具有约200微米到约2毫米的平均直径，且其中所述微孔通道具有小于约200微米的平均直径，所述大孔聚合物支架结构具有至少50％的孔隙度；
用组织细胞接种聚合物支架结构；
培养所述的组织细胞。
24、如权利要求23所述的方法，其中所述的大孔聚合物支架结构是生物相容性的并具有至少85％的孔隙度。
25、如权利要求23或24所述的方法，还包括在接种所述聚合物支架结构之前，利用选自酸处理，碱处理，胶原沉积和磷酸钙沉积的处理方法修饰聚合物支架结构表面的步骤。
26、如权利要求23或24所述的方法，其中所述的组织细胞是生骨细胞。
27、如权利要求26所述的方法，其中所述的组织细胞建立了骨基质。
28、如权利要求27所述的方法，其中所述的组织细胞是人起源的。
29、如权利要求28所述的方法，其中所述的组织细胞选自牙周组织细胞，软骨组织细胞，牙组织细胞，肝组织细胞和乳腺组织细胞。
30、如权利要求23、24、27、28或29所述的方法，其中培养所述的细胞用于体外和体内应用。
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