CN1214624A - 利用热滞后蛋白改良低温外科中的组织破坏 - Google Patents

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Abstract

在致冷冷冻前向细胞内灌注热滞后蛋白,细胞和组织的低温切除破坏得以加强。此蛋白的作用是提高了胞内流质中针状冰晶的生长,该冰晶通过刺穿细胞膜而破坏细胞。此方法降低了冷冻过程中细胞保藏的发生率,从而在低温切除技术中进行更一致和更可控的不需要组织的破坏。

Description

利用热滞后蛋白改良低温 外科中的组织破坏
本发明涉及以前与低温外科不相关的领域，以及热滞后蛋白(Thermalhysteresis proteins)的性质和利用。
                     发明背景
冷冻外科作为一种临床医学方法已获得广泛的接受，并且其应用范围还在迅速扩大。其中包括眼内障性晶状体的切除、视网膜脱离的修复、用以矫正心律失常的部分心脏组织的切除、以及前列腺、肝、脑和其它内脏肿瘤的破坏。低温外科中利用一个冷冻探针的插入以通过高度定位冷冻作用破坏不需要的组织。一旦该组织冻结，可让其解冻。然后机体的免疫系统逐渐分解被破坏的组织并将之排出体外。低温外科具有许多优点，包括其最小限度的侵入性然而高度可控，而且没有剂量限制。
冷冻探针为细圆筒状的器具，它用冷冻剂从内部降温，除尖端外其余部分绝热。由于冷冻剂通过探针循环，组织的冷冻自尖端向外发生，在冷冻组织及非冷冻组织间形成一个运动的冷冻前沿或分界面，该前沿或分界面是严格限定的，并在组织中缓慢传播(传播速度为每分钟几毫米)。可用小的探针处理相对大的区域；例如一3毫米直径的探针可产生直径为3.5厘米的冰球。当病理组织的区域较大且形状复杂时，相应的接近目的组织的冷冻区域可用几个探针同时来产生。复合位点可分开处理或同时处理。由于冷冻探针的插入是组织仅有的物理性侵入，该方法带来的并发症及病人的发病率得以降低，而且这种方法使患者承担较少的痛苦和损伤，所有这些使得在低于传统的侵入性外科的费用的情况下获得治疗效果。
冷冻外科的一个局限性是不能使所有不需要的组织受冷冻或使得许多紧邻不需要的组织的健康组织有受冷冻的危险。然而，最近非侵入性医学成像技术的发展已大大降低了冷冻不足(under-freezing)和过冷冻(over-freezing)的危险。例如手术过程中的超声成像技术可通过在冷冻组织和非冷冻组织间声阻抗的变化来监测冷冻前沿位置以及冷冻组织的大小、形状和位置。磁共振成像技术也得以有效应用，它的便利之处在于以三维方式在200微米的分辨率下对冷冻前沿位置成像。
然而，成像技术已暴露出进一步的局限性：某种条件下活细胞的冷冻只是保藏了细胞而没有破坏它们。对何时保藏细胞而不是破坏它们，或者何时破坏细胞而不是保藏它们的解释，可见于Mazur,P在1970年第168卷第939-949页的《科学》杂志上“低温生物学：生物系统的冷冻”一文中提出的“两因子”(即化学因子和机械因子)理论假说中。此理论认为任一给定温度下冰晶形成的可能性为体积的函数，在较大体积中，冰晶形成的可能性更大。在细胞悬浮液中，此效果导致胞外空间首先形成冰；这是因为胞外空间的体积远大于单个细胞的胞内体积。由于胞外冰的形成，剩下未结冰溶液中溶质的浓度升高，在细胞周围形成高渗溶液。在这些(现象)发生时胞内流质仍以液态形式存在，从而在细胞膜两侧形成化学势。这使得水通过质膜从胞内向胞外流动，留下离子及有机溶质(为膜不透性的)在细胞内。从而细胞脱水并自身变成离渗的，通过化学损害导致细胞的死亡。然而化学损害为时间和温度的函数，水通过细胞膜的输送则是一速度依赖过程。因而较低的冷冻速度将因为细胞更长时间暴露在高渗条件下而增加了化学损害的可能性。相反，胞内自身冰晶的形成则被认为是通过机械损害来导致细胞的死亡，冷冻速度增加至某一水平以上可使得水在迁移出细胞前即形成冰核。因而在高冷冻速度的情况下，随冷冻速度的增加，胞内冰晶形成及随之发生的细胞死亡的可能性增加而非减少。这两个相反的细胞破坏模式在用细胞存活率相对于冷冻速度作图时形成一倒“U”形曲线。除冷冻速度外，其它被认为是影响细胞存活率的因子是：温度梯度、冷冻界面推进的速度、最终冷冻温度、此温度下保持的时间、冷冻后升温的速度和所包括的冷冻-解冻循环数。
在低温外科中，这些参数特别难以控制，这是因为温度控制只能从探针尖端获得，而组织周围的组成成份又不是一致的。在单个处理过程中，整个被处理区域中会发生一个或多个冷冻参数的变化，这是因为不断增大的冷冻区域导致不同的组织部分经受取决于这些部分至探针尖端的距离的不同的冷冻速度、最终冷冻温度和维持时间。除此之外，实施此方法的方式在不同的医生间和不同的诊所间也是不同的。因而，典型的低温外科手术的结果经常是不可预料的，并且难以控制。
                       发明总结
现在已发现利用低温外科进行的细胞破坏可用不依赖于冷冻速率、最终冷冻温度和相关的热史参数(thermal history parameters)的方式获得，按照该方式，首先向细胞内灌注一种或多种热滞后蛋白，然后在继续向细胞内灌注热滞后蛋白的过程中用一冷冻探针冷冻细胞。该方法利用该蛋白质的活性控制冰晶生长的方式和方向，本发明部分在于发现以此蛋白质的作用取代其他因子来影响冰晶形成的速度、机制和定位。该蛋白质通过提高和限制胞内冰晶的生长以形成针状冰晶。这些冰晶通过细胞的机械破坏而导致细胞的死亡，并确保这些效果发生在整个冷冻条件的范围内，以及排除此范围各部分对化学损害的依赖的必要。
本发明中的这些和其他一些特征及优点在下面的描述中会变得更明显。
             本发明详细描述及优选实施例
天然大分子种类的被称为“抗冻蛋白”(antifreeze proteins)、“热滞后蛋白”(thermal hystersis proteins)、“抗冻糖蛋白”(antifreeze glycoproteins)和“抗冻多肽”(antifreeze polypeptides)的存在已众所周知并在文献中大量报道。例如抗冻糖蛋白的发现，最初由DeVries A.L.等在1969年3月7日的《科学》(Science)第163卷第1073-1075页中“一些南极鱼类的抗冻性”一文所报道。DeVries等观察到一些鱼类能一年四季生活于平均水温为-1.87℃水中，这是由于虽然在它们的血液中缺少足够量的氯化钠以及其他一些低分子量物质，但仍能通过一般的冰点降低法降低冰点。DeVries等将这些种类的鱼的生存归因于某种糖基化蛋白质的存在，这些蛋白质分子量范围从约2,500道尔顿至约34,000道尔顿，它们现在是指抗冻糖蛋白或“AFGPs”。进一步研究表明许多北温带和北冰洋鱼种在它们的血液中携有抗冻化合物。其中有些化合物为糖蛋白，而其它一些化合物则没有糖基半分子，称之为抗冻多肽或抗冻蛋白(“AFPs”)，它们的分子量范围从约3,300道尔顿至12,000道尔顿。而且，这些化合物在降低冰点的同时并不影响到熔点，因而称之为“热滞后蛋白”。
抗冻蛋白和抗冻糖蛋白可从广范的来源分离到，这些来源以及从它们中获得的各类蛋白的结构已在文献中大量报道。这些蛋白的来源包括鱼类和非鱼类，列于下面的表Ⅰ和表Ⅱ中。
                          表Ⅰ鱼类的热滞后蛋白
蛋白类型、组成和大小 来源鱼种 鱼种的俗名
抗冻糖蛋白(AFGPs)：含有丙氨酸，苏氨酸和半乳糖-N-乙酰半乳糖胺二糖：分子量：2,700-36,000道尔顿 Antarctic notothenioids：Pagothenia borchgrevinkiTrematomus borchgrevinkiTrematomus bernachiiDissostichus mawsoni北半球海洋鳕鱼(Northern ocean gadoids)：格陵兰鳕鱼(Gadus agac)大西洋鳕(Godus morhua)霜鳕(Microgadustomcod)北鳕(Boreogadus saida)细身宽突鳕(Eligenus gracilis) 南极鳕鱼(Antarctic cod)格陵兰鳕鱼(Greenland cod)大西洋鳕鱼(Atlantic cod)大西洋雄鳕鱼(Atlantic tomcod)北极鳕鱼(Arctic polar cod)橘黄鳕鱼(Saffron cod)
抗冻多肽(AFPs)Ⅰ-型：富含丙氨酸；分子量3,000～5,000道尔顿 右眼比目鱼(Righteye flounders)：美洲黄盖鲽(Pseudopleuronectusamericanus)锈泥鲽(Limanda ferruginea)杜父鱼(Cottids)：Myoxycephalus scorpiusMyoxycephalus aenaeusMyoxycephalus scorpiodes 冬比目鱼(Winter flouinder)黄尾比目鱼(Yellowtail flounder)短角床杜父鱼(Shorthorn sulpin)Grubby sculpin北极床杜父鱼(Arctic sculpin)
抗冻多肽(AFPs)Ⅱ-型：富含胱氨酸；与C-型凝集素同源，分子量：12,000道尔顿 杜父鱼(Cottid)：美绒杜父鱼(Hemitripterus americanus)彩虹胡瓜鱼(Osmerus mordex)大西洋鲱(Clupea harengus harengus) 绒杜父鱼(Sea raven)胡瓜鱼(Smelt)鲱鱼(Herring)
抗冻多肽(AFPs)Ⅲ-型：无胱氨酸，不富含丙氨酸；分子量：6,000道尔顿 绵鳚(Eel pouts)：Macrozoares ame^canusRhigophila dearborn；南(北)极狼绵鳚(Lycodes polaris) 渔洋条鳕(Ocean pout)南极绵鳚(Antarctic eel pout)北极绵鳚(Arctic eel pout)
                       表Ⅱ非鱼源热滞后蛋白
A．非甲虫类的昆虫：目 种
    弹尾目(Collembola)翅目(Plecoptera)直翅目(Orthoptera)半翅目(Hemiptera)长翅目(Mecoptera)鳞翅目(Lepidoptera)B．鞘翅目(甲虫类)Coleoptera(Beatles)科 7种Arcynopteryx compactaParcoblara pennsylvanica马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus)Boreus westwoodi枞色卷蛾(Choristoneura fumiferana)种
    伪步行虫科(Coleoptera(Beatles)叩头虫科(Elateridae)树皮扁虫科(Cutujidae)赤翅科(Pyrochridae)萤科(Lampyridae)瓢虫科(Coccinellidae)木蠹虫科(Scolytidae)天牛科(Cerambycidae)C．非昆虫类节肢动物动物 伪步行虫(Tenebrio molitor)Meracantha contractaUloma impressaPlatydema spAmpedus lineatusAmpedussp.Lepidotus discoideusMelanotus sp.角虫(Cucujus clavipes)Dendroides canadensisPhotinus spCoccinella novemnotata松六齿小蠹(Ips acuminatus)(Rhagium inquisitor)种
    蜘蛛蜈蚣螨D．其它无脊椎动物贝类 逍遥蛛种(Philodromus sp.)管巢蛛种(Clubiona sp.)Bolyphantes index铗尾石蜈蚣(Lithobius forficatus)Alaskozetes antarcticus贻贝(Mytilus edulis)
研究最深入和在本发明的实施中所用的优选蛋白质是从鱼类中分离到的。如表Ⅰ中所示，这些蛋白质包括糖基化蛋白(AFGPs)和非糖基化蛋白(AFPs)，后者被分为三个普通种类，文献中命名和本领域中的专业人员称之为Ⅰ-型，Ⅱ-型和Ⅲ-型。
虽然有各种变化存在，AFGPs一般由一系列重复的三肽单位(丙氨酰-苏氨酰-丙氨酰组成，并有二糖β-D-半乳糖基-(1→3)-α-N-乙酰基-D-半乳糖胺接在苏氨酸残基的羟基基团上。例如，相对低分子量的AFGPs含有脯氨酸和精氨酸残基，分别取代了一些丙氨酸和苏氨酸残基。对来自于代表鱼类的AFGPs的色谱研究揭示了八个主要的分子量成分的存在，如表Ⅲ中所示。
                          表Ⅲ来自于Pagothenia borchgrevinki中的AFGPs的分子量组分
    组分号12345678     分子量33,70028,80021,50017,00010,5007,9003,5002,600
AFPs间的差别程度大于AFGPs间的差别。如表Ⅰ中所示，三个类型的AFPs间差别在于它们的残基含量。Ⅰ-型AFPs富含丙氨酸残基(约为65％)，其余的主要由极性残基如天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，丝氨酸和苏氨酸组成。其分子量范围从约3,300至6,000。Ⅱ-型AFPs被认为富含胱氨酸(实际上是半胱氨酸)残基，与C-型凝集素同源。来自于绒杜父鱼(sea raven)的Ⅱ-型AFPs含有7.6％的胱氨酸，14.4％的丙氨酸，19％的天冬氨酸和谷氨酸，8％的苏氨酸。其分子量大小从约14,000至约16,000。Ⅲ-型AFPs缺乏胱氨酸残基，丙氨酸残基也不丰富。没有任何明显优势的氨基酸成份存在，极性氨基酸和非极性氨基酸的含量相当。其分子量大小从约5,000道尔顿至6,700道尔顿。本段中所有百分比均以摩尔数为基础。
昆虫来源的抗冻蛋白主要是Ⅱ-型AFPs，具有氨基酸残基典型组分的是来自于枞色卷蛾(Choristoneura fumiferana)(云杉芽卷蛾)和伪步行虫(Tenebrio molitor)(甲虫)的抗冻蛋白。这些抗冻蛋白列于表Ⅳ，为了比较，表中也包括绒杜父鱼(sea raven)的的氨基酸组成。
抗冻蛋白和抗冻糖蛋白可通过传统的方法从鱼或昆虫的血清或其他体液中提取。这些蛋白质的分离和纯化可可通过层析方法轻易地完成，也可通过吸收，沉淀，以及蒸发的方法完成。其他的方法，其中许多已在文献中描述，它们对本领域技术人员来说是非常容易明白的。
                          表ⅣⅡ-型AFPs氨基酸组成比较
氨基酸残基 云杉芽卷蛾组分(SpruceBudworm FraetionI)Ⅱ     甲虫 绒杜父鱼(sea raven)
天冬氨酸(酰胺)苏氨酸丝氨酸脯氨酸谷氨酸(酰胺)甘氨酸丙氨酸半胱氨酸缬氨酸甲硫氨酸异亮氨酸亮氨酸酪氨酸苯丙氨酸赖氨酸组氨酸色氨酸精氨酸     9.56.013.05.011.015.08.06.03.00.01.26.51.02.23.10.00.08.0     5.32.311.10.012.411.45.028.02.30.01.02.20.00.015.43.10.00.0     10.77.98.26.79.18.114.47.61.25.41.76.21.22.02.12.52.82.3
热滞后蛋白也可通过合成的方法产生，用传统的化学合成方法或是用包括DNA重组的方法。形成这些蛋白质的基因的DNA编码序列已阐明并被大量报道。例如，见DeVries,A.L.等《生物化学杂志》(J.Biol.chem.)246：305(1971)；Lin Y.等《生物化学生物物理研究通讯》(Biochem.Biochem.Biophys.Res.Commun.)46:87(1972)；Yang D.S.C等《自然》(Nature)333:232(1988)；Lin,Y.《美国科学院进展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:2825(1981)；Davies P.L.,等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)79:335(1982)；Gourlie B.等《生物化学杂志》(J.Biol.chem.)259:14960(1984)；cott,GK.,等《加拿大鱼类水生生物科学杂志》(Can.J.Fish.Aquat.Sci.)；Scott,G.K.,等《分子进化杂志》(J.Mol.Evol.)27:29(1988)。成功地把AFP基因微注射到其它物种而非其来源种中亦已见于报道。例如见：Zhu,Z.等(Angew：Ichthyol)l:31(1985);Chourrout D等《水产养殖》(Aquaculture)51:143(1986)；Dumman R.A.等Trans Am.Fish.Soc.116:87(1987)；Fletcher G.L.等《加拿大鱼类水生生物杂志》45:352(1988)；Maclean N.D.等《(生物技术》(BioTechnology)5:257(1987)；Stuart G.W.等《发育》(Development)103:403(1988)；McEvoy,T等《水产养殖》(Aquaculture)68:27(1988)；OzatoK等《细胞分化》(Cell Differ)19:237(1986)。
本发明具体研究的热滞后蛋白质是那些分子量相对较低的蛋白质，如那些分子量介于约2,000至约10,000之间的，优选约2,600至约6,000,最优选约3,000至约4,000之间的蛋白质。
本发明的实施中，热滞后蛋白最便于以液体形式给药，如一种溶液或一组织相容流质中的悬浮液。优选水溶液或生理盐水[水中含约0.9％(重量/体积)氯化钠]溶液。为取得最佳效果，溶液或悬浮液中此蛋白的浓度范围一般从约1mg/mL至约30mg/mL，优选从约1mg/mL至约20mg/mL，最优选从约5mg/mL至15mg/mL。使用时可通过血管系统由目的器官注射、摄食、灌注以注入目的组织中，或使该组织与溶解的蛋白达到饱和和平衡的方法给药。
一旦组织中灌入热滞后蛋白，可根据已知技术进行该组织的冷冻切除。将冷冻探针推进到组织的中央，或者将两个或多个冷冻探针置于组织内所选择的部位以形成符合被切除组织外形的冷冻区域。探针用复合腔完全包围以允许在其尾端和背端以一超冷流质环绕。液氮是常用的超冷流质，在-196℃时于冷冻探针的尖端内沸腾。沸腾使得在液氮和冷冻探针的金属片间产生一绝热气体薄膜，此金属片限制微探针周围的最低温度约为-160℃。当尖端为-160℃时，从探针表面向外至2cm处的组织温度达-20℃或更低。这种一般描述的探针在本领域已熟知，并于文献中广泛公开，包括美国专利号第5,147,355号，授予Friedman等(布莱汉和妇女医院(Brigham and WomensHospital)，波士顿，马萨诸塞州，美国，1992年9月15日)，和美国专利号第5,437,673号，授予Baust等(低温医学科学(Cryomedical Sciences)公司，洛克菲勒，马里兰州，美国，1995年8月1日)，以上二者以参考文献形式在此处被引用。
本发明实施中优选把冷冻探针和同时成像技术(Simultaneous imagingtechnques)、显著超声和磁共振成像(notably ultrasound and magnetic resonanceimaging)合并使用。这些技术以传统的方式使用，它们的使用并不干扰冷冻探针的操作。例如，超声成像可以二维或三维方式进行，后者是通过计算机重构二维超声数据以形成三维图像。超声成像是通过将一超声转导器置于靠近目的组织部位而获得。例如在前列腺成像中，超声转导器可经直肠放置。对上面讨论的液氮冷冻探针，温度低于-20℃的组织区域被一约3毫米厚、其内部温度升至0℃的环包围。此环的超声图像是一亮回声(bright echo)。在磁共振成像中则不需将转导器邻于冷冻探针放置。冷冻的组织由于根本不产生信号，因而在MRI扫描上呈黑色，由于图像的剩余部分不受冷冻区域的影响，可检测到冷冻区域的全部范围。
更进一步的有关这些成像方法的使用的叙述可于下列出版物中找到，所有这些出版物均以参考文献形式在此处被引用：
Onik,G,等，“转移性结肠癌处理中超声引导的肝低温手术”《癌》(Cancer)67(4):901-907(1991)。
Onik,G.,等，“经直肠的超声引导的经皮肤的根治性低温手术切除前列腺”《癌》72(4):1291-1299(1993)
Rubinsky,B.,“用超声进行低温手术成像”《机械工程》MachamicalEngineering)108(3):48-51(1986)。
Rubinsky,B等，“用质子核磁共振NMR监测脑和前列腺的低温手术”《低温生物学》(Cryobiology)30:191-199(1993)
下用的实施例用来描述而不是为了限制或限定或加以限制本发明的范围。
                       实施例材料与方法
在下面的实施例中，研究了两个重要的热学变量，即致冷速度和细胞冷冻后的最终温度对细胞破坏程度的影响。该细胞是Narayan,P.等1992年发表于《泌尿科学杂志》(J.Urol.)第148卷第5期第1600-1604页“人原发前列腺腺癌细胞系(ND-1)的建立和特征”所建立的腺癌细胞系(ND-1)的人前列腺癌细胞培养物，生长于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)上，补充10％的胎牛血清，100单位/mL的青霉素和100mg/mL的磷酸链霉素，置于75cm3的三角瓶中，在含5％CO2湿空气中37℃温育。一旦细胞发生贴壁，吸出生长培养基，加入3mL 0.05％的蛋白胨使细胞从三角瓶的壁上脱离。产生的细胞悬浮液离心以吸除胰蛋白酶，细胞再用生理盐水缓冲液重悬浮。将大约50μL的含盐细胞悬浮液放于显微镜载玻片上，该载玻片经特别设计具有用于存悬浮液的硅室。
然后在一称之为“直接固化镜台”(directional solidification stage)的装置上对细胞进行冷冻和观察，用此装置可进行所有热学变量的精确控制。该装置在Rubinsky 1985年7月30日的美国专利第4,531,373号中已有描述，并在此处以参考文献形式被引用。此装置由在一普通平面上用平的热传导平面相连接的间隙宽度为3mm的一对铜板组成。每块平板含有一冷冻剂流动通道，一个隔热器，一个热电偶，和穿过两板间隙的显微镜光学路径。将一显微镜载玻片横穿两热传导平面放置，并通过一步进电机将其沿此表面以一恒定的速度移动，穿过此间隙并贯穿显微镜光学路径。该板以冷冻剂和加热器维持在一预定的温度，其中一板维持在给定样品的冷冻温度以上，另一板则维持在冷冻温度以下，此安排使得横穿间隙中产生一线性温度梯度。将一样品放在载玻片上，载有样品的载玻片开始时放于两板中较暖的那块板上方。然后通过步进电机使得此载玻片沿着较冷的板的方向移动，从而导致样品温度根据样品相对于两板的位置而降低。结果是横穿样品的温度梯度、样品经历的温度范围、冷冻前沿速度和冷冻速率被高精确度地控制。一旦样品到达低温板，将样品在此低温下保持一规定的时间。然后将载有样品的载玻片以一控制的速度从冷板移到热板上以重新加热。如果用很薄的样品，此装置可通过显微镜观察细胞，从而可观测到这些细胞在冷冻和解冻时发生的变化。
                        实施例1
此实施例描述了在缺乏热滞后蛋白时癌细胞的冷冻。
本研究中，直接固化镜台的高温板维持在37℃，而低温板的温度保持在-5℃至-40℃间。设置(样品在)两板间的运动速度以使致冷速度为1℃/min,5℃/min,25℃/min,这些致冷速度是冷冻切除过程中冷冻组织的冷冻前沿位置的典型冷冻速度。一旦样品达到最低温度，将它们在此温度下保持5分钟，然后迅速返回热板。进行两组实验：其中一组的细胞只经过一个冷冻-解冻循环，而另一组细胞则经过两个相同的冷冻-解冻循环。这样，每一个实验条件下至少进行三个实验。
解冻细胞和不经过冷冻的对照细胞的生活力用锥虫蓝测试和两色荧光细胞活力测试的方法评定。在锥虫蓝测试中，通过将细胞悬浮液和等体积的0.3％锥虫蓝混合来估测膜的完整性。活细胞数(不被染色)相对于死细胞数(被染色)的比例可由血细胞计数器获得。以两色荧光细胞活力测试得到的内源脂活性和质膜完整性为基础确定活细胞相对于死细胞比例。使用了由分子探针公司(Molecular Probes,Inc.,Eugene,俄勒冈州，美国)提供的试剂盒，该试剂盒含有细胞渗透钙黄绿素AM及不透膜的Ethidium homodime(EthD-1)。在活细胞中，钙黄绿素AM经酶促转化成荧光钙黄绿素，产生强烈的单色绿色荧光(约530nm)。膜已破坏的细胞被EthD-1标记，在荧光素与核酸结合后，在死细胞中产生一亮红色荧光(约600nm)，而被活细胞完整的质膜排除。
两色荧光细胞活性测试是通过重新悬浮冷冻和解冻后的细胞进行的，在Dulbecco磷酸盐缓冲液中，将100μL的重悬浮细胞与200μL的含有5μL钙黄绿素AM、10μM EthD-1和低于0.1％DMSO的混合染料混合。混合液于37℃下温育30分钟，然后在荧光显微镜下研究。利用荧光显微镜通过计数随机选择的染色细胞的样品区域中死细胞和活细胞数来确定活细胞相对于死细胞的比率。在锥虫蓝测试和两色荧光细胞活性测试中，每种随机选择的样品区域的细胞数应超过300个细胞的总数。两种测试的结果都一致地处于有3％-8％的范围内。
利用这些方法，ND-1细胞系在各种致冷速度下冷冻到各种最终温度，然后解冻。然后将关于非冷冻对照的死细胞和正常细胞的百分数以细胞在冷冻速度为1℃/min,5℃/min,25℃/min冷冻时最终温度的函数绘制曲线。
根据冷冻速度为1℃/min和5℃/min的曲线，表明实验在最终温度介于0℃和约-20℃时，随着最终冷冻温度的降低细胞死亡数逐渐增加(实验在1℃/min的速率进行时，细胞死亡数从13％到87％，当实验在5℃/min的速率下进行时，细胞死亡数从5％到87％)。实验过程中，当最终温度低于约-20℃时，细胞破坏的百分数继续增加，但速度较慢。在1℃/min速率的测试中，终温达-40℃时，死细胞的平均百分率为95％，而在5℃/min速率的测试中，终温相同时的死细胞平均百分率为98％。因而两种致冷速度下，细胞在达-40℃时的冷冻过程中仍没有完全被破坏。
冷冻速度为25℃/min下进行的测试曲线表明在最终温度为-5℃和-15℃间，细胞破坏的百分率成级增加，在此温度范围，不同实验中的破坏率的值扩展到一个宽范围内。这显示了胞内冷冻是发生于一个窄的温度范围内的统计学现象。在冷冻速度为25℃/min的冷冻过程中，细胞的破坏是由于胞内冰晶的形成。因而，在人前列腺腺癌中，从化学破坏向胞内冰晶形成的破坏的过渡可能发生在5℃/min和25℃/min的冷冻速度之间。
                  实施例2
此实施例揭示了热滞后蛋白存在时癌细胞的冷冻。
准备实施例1中所用的同类型细胞的细胞悬浮液。其中一些悬浮液包括浓度为10mg/mL的分子量为3,600道尔顿的来自于美洲黄盖鲽(Pleuronectusamericanus)的热滞后蛋白，其余悬浮液中则不含任何热滞后蛋白。将悬浮液液滴加到玻璃载玻片上，使厚度约为100μm，用盖玻片盖上，在直接固化镜台上冷冻。在本实验中，冷冻过程通过一个放大倍数为40倍的光学显微镜记录于录像带上。进行几组实验，其中细胞在不同致冷速度(范围从1℃/min至25℃/min)下冷冻。
在不含热滞后蛋白的细胞悬浮液中，冷冻过程中形成大的指状冰晶。这显示冰形成时的溶质被冰排斥(rejection ofsolutes)。当冷冻过程继续时，未冷冻细胞被推入指状冰晶间形成的通道。由于通道中的胞外流质含有高浓度的溶质(来自于被冰晶排斥的溶质)，未冷冻细胞开始失水，以使得胞内和胞外溶液的化学势达到平衡，最终由于胞内化学破坏作用而导致了该细胞的破坏。
在含有热滞后蛋白的细胞悬浮液中，冷冻的结果导致了胞外流质中非常细小的微米大小针状冰晶的形成。这些冰晶逐渐使未冷冻细胞变形，导致这些细胞的细胞膜崩溃。然后冰晶进入细胞内部，使细胞内变成超冷状。细胞内部骤然冷冻使得在每个细胞中产生许多小的冰晶，导致胞内冰晶呈现为黑的图像。
推进的冷冻前沿和发生胞内冷冻的部位间的距离小于200μm，发生胞内冷冻的部位的温度高于-2℃，这是根据沿着直接固化镜台的冷冻的线性部位确定的。这些微小的距离和微小的温度差别说明细胞破坏的程度非常近地符合冷冻程度，并且其发生是独立于冷冻速率或最终温度的。
                  实施例3
本实施例描述热滞后蛋白存在下的前列腺癌组织薄片的冷冻。
人前列腺组织由人前列腺正常和发病部分的针状活组织获得。将所研究的组织浸入一种保存溶液(Hank′s平衡盐水溶液，由西格玛化学公司(SigmaChemical Company,圣路易斯，密苏里州，美国)提供，其中加入青霉素G，链霉素和庆大霉素。)中，在部分溶液中加入浓度为10mg/mL分子量为3,600道尔顿的来自于美洲黄盖鲽(Pleuronectus americanus)的热滞后蛋白，而在其它溶液中则没有热滞后蛋白的存在。该组织用切片机切成厚约300μm的薄片，置于一玻璃载玻片上并盖上一盖玻片。然后将组织放在直接固化镜台上让它们在与实施例2相同的冷冻速度下冷冻，并通过一光学显微镜用录像带记录冷冻过程。
在冷冻和解冻后，利用实施例1中所描述的两色荧光细胞活力测试确定细胞的活力。在这一系列测试中，冷冻前后的组织薄片均于250μL含有10μm的EthD-1的Dulbecco酸缓冲液中于37℃轻轻振荡温育30分钟。如上面解释的，此染料在结合到损坏细胞的核酸上后发出红色荧光。在温育之后，向混合液中加入SYTOTM-16[一种来自于分子探针公司(MolecularProbes,Inc.,of Eugene,俄勒冈州，美国)的核酸染色液，250μL,10μM],再于37℃轻轻振荡温育60分钟。此后面加入的染液为一种有高渗透能力和核酸高亲和力的细胞渗透性染料，在与核酸结合后发出一种非常亮的绿色荧光(约525nm)。EthD-1和SYTO-16间并不干涉对方的结合位点。通过鉴别那些与仅发出绿色荧光的细胞相比较既产生绿色荧光又产生红色荧光的细胞，人们可以在完整的组织中把活细胞与死细胞区分开。
利用这些步骤，录像带显示浸于热滞后蛋白溶液中的组织切片中细胞崩溃的方式和在冷冻过程中的发生阶段与实施例2中细胞悬浮液中的细胞相同。这种崩溃在任何没有用热滞后蛋白处理的组织薄片中都观测不到。这证明当用热滞后蛋白处理时悬浮液中的细胞和组织中的细胞具行为上的相似性。
冷冻和解冻后进行的荧光染色测试显示在热滞后蛋白存在下的冷冻组织中的细胞已完全被破坏，而那些没有热滞后蛋白存在下的冷冻组织中的细胞在所有测试的冷冻条件下只有部分遭到破坏。
上述内容主要是为了描述而提供。显而易见，对那些本领域中的专业人士来说，本文中描述的操作条件、材料、步骤顺序和此过程中其它参数可用各种方式进一步修改或替代，但不会偏离本发明的精神和范围。

Claims (14)

1．一种通过破坏含有含水胞内流质的活细胞的不需要的组织进行活机体的治疗的方法，包括：(a)用一在组织相容溶剂中含有约1mg/mL至约50mg/mL热滞后蛋白的溶液灌注所说组织；以及
(b)利用冷冻探针插入灌注后的组织，并维持足够长时间，通过使所说细胞中产生针状冰晶从而致命性破坏所说细胞，如此选择性冷冻所说组织。
2．一种根据权利要求1的方法，其中所说的热滞后蛋白是具有从南极或北极鱼种中分离和纯化的热滞后蛋白的分子结构的一种蛋白质。
3．一种根据权利要求1的方法，其中所说的热滞后蛋白是具有从包括Antarctic notothenioids、北半球海洋鳕类(Nortnen ocean gadoids)、右眼比目鱼类、杜父鱼类和绵鳚类的组中选出的一个成员中分离和提纯的热滞后蛋白的分子结构的一种蛋白质。
4．一种根据权利要求1的方法，其中所说热滞后蛋白是从包括下列蛋白质的组中选出的一种热滞后蛋白：
(a)从由Pagothenia borchgrevink；Trematomus borchgrevinki；Trematomus bernachii和Dissostichus mawsoni组成的组中选择的一种中分离和纯化出的抗冻糖蛋白；
(b)从由美洲黄盖鲽(Pseudopleuronectus americanus)和锈泥鲽(Limandaferruginea)组成的组中选择的一种中分离和纯化出的Ⅰ-型抗冻多肽；
(c)从美绒杜父鱼(Hemitripterus americanus)中分离和纯化出的Ⅱ-型抗冻多肽；以及
(d)从由Macrozoarces americanus,Rhigophila dearborni和南(北)极狼绵鳚(Lycodes polaris)的组中选择的一种中分离和纯化出的Ⅲ-型抗冻多肽组。
5．一种根据权利要求1的方法，其中所说的热滞后蛋白是从包括下列蛋白质的组中选出的一种热滞后蛋白：
(a)Dissostichus mawsoni和Trematomus bemachii组中选择的一种中分离和纯化出的抗冻糖蛋白；
(b)从美洲黄盖鲽(Pstudopleuronectus americanus)中分离和纯化的Ⅰ-型抗冻多肽；
(c)从美绒杜父鱼(Hemitripterus americanus)中分离和纯化的Ⅱ-型抗冻多肽；
(d)从Macrozoarces americanus中分离和纯化的Ⅲ-型抗冻多肽。
6．一种根据权利要求1的方法，其中所说的热滞后蛋白是一种从美洲黄盖鲽(Pseudopleuronectus americanus)中分离和纯化的抗冻多肽。
7．一种根据权利要求1的方法，其中所说的热滞后蛋白具有从约2,000道尔顿至约10,000道尔顿的分子量。
8．一种根据权利要求1的方法，其中所说的热滞后蛋白具有从约2,600道尔顿至约6,000道尔顿的分子量。
9．一种根据权利要求1的方法，其中所说的热滞后蛋白具有从约3,000道尔顿至约4,000道尔顿的分子量。
10．一种根据权利要求1的方法，其中所说的溶液含有从约1mg/mL至30mg/mL的热滞后蛋白。
11．一种根据权利要求1的方法，其中所说的溶液含有从约5mg/mL至15mg/mL的热滞后蛋白。
12．一种根据权利要求1的方法，其中所说的步骤(b)产生一个由在冷冻组织和非冷冻组织间的运动界面确定的其大小在增长的冷冻区域，所说的方法还包括用成像方法监测所说的界面的位置。
13．一种根据权利要求12的方法，其中所说的成像为超声成像。
14．一种根据权利要求12的方法，其中所说的成像是磁共振成像。
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication