CN1214688A

CN1214688A - 糖修饰的缺口寡核苷酸

Info

Publication number: CN1214688A
Application number: CN97193129A
Authority: CN
Inventors: P·D·库克; B·莫尼亚; K-H·奥特曼; P·马丁
Original assignee: Novartis AG; Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Novartis AG; Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-02-14
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 1999-04-21
Also published as: ZA971208B; CA2246229C; WO1997030067A1; NZ331217A; NO983718L; CZ243498A3; DK0882061T3; CA2749312A1; ES2221039T3; AU725262B2; EP0882061A1; JP4293636B2; BR9707529A; ATE267207T1; IL125759A0; EP0882061A4; SK109198A3; PL328563A1; CA2246229A1; HUP9901118A2

Abstract

本发明提供了一些寡核苷酸,这些寡核苷酸具有增加的核酸酶抗性,具有增加对互补核酸链的结合亲和性的取代基,并且具有激活RNaseH的2’－脱氧－赤型－呋喃戊糖基核苷的亚序列。这些寡核苷酸在诊断学和其它目的的研究中,在调节蛋白质在有机体中的表达上,和在诊断、检测与治疗对寡核苷酸治疗敏感的其它疾病上是有用的。

Description

糖修饰的缺口寡核苷酸

发明所属技术领域

本发明涉及用于激发RNase H活性(用于相反链中的链切割)的寡核苷酸的合成方法和用途。包括在本发明中的是这样一些寡核苷酸，其中所说寡核苷酸的至少一些核苷单位是核酸酶抗性功能化的，所说寡核苷酸的至少一些核苷单位包括加强寡核苷酸与核酸互补链杂交的取代基，以及所说寡核苷酸的至少一些核苷单位包括2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖组分。所说的寡核苷酸可用于治疗学、诊断学和作为研究试剂。

发明背景

已知寡核苷酸与单链的DNA或者RNA分子杂交。杂交是寡核苷酸的核碱基(nucleobase)与靶DNA或者RNA的核碱基的序列特异性碱基对氢键结合。一般认为这样的核碱基对是相互互补的。

在测定寡核苷酸与互补核酸的杂交程度时，通过测定特定的杂交复合体的解链温度，可以比较寡核苷酸与互补核酸结合的相对能力。作为双螺旋的一个特征物理性质，解链温度(T_m)表示当50％螺旋(杂交的)-卷曲(未杂交的)形式出现时的温度(摄氏度)。通过利用紫外光谱测定杂交复合体的形成和断裂(解链)来测量T_m。在杂交期间发生的碱基堆积伴随着紫外吸收的减弱(减色性)。因而，紫外吸收的减弱表明更高的T_m。T_m越高，链之间的键强度越大。

通过利用胞内酶RNase H，寡核苷酸可以用来实现靶RNA的酶促切割。一般认为这样的RNase H切割的机理要求2’-脱氧呋喃核糖基寡核苷酸与靶RNA杂交。所产生的DNA-RNA双螺旋激活RNase H酶，并且该活化的酶切割RNA链。RNA链的切割破坏了RNA的正常功能。一般认为硫代磷酸寡核苷酸经由这类机理操纵。然而，对于有用于RNase H的细胞活化的DNA寡核苷酸来说，优选地，寡核苷酸对核酸酶是相当稳定的以便在细胞中存活足以使RNase H活化的一段时间。对于非细胞用途(如作为研究试剂的寡核苷酸用途)来说，这样的核酸酶稳定性可以是不必要的。

数种出版物描述了RNase H和寡核苷酸的相互作用。尤其感兴趣的是：(1)Dagle等，核酸研究，1990,18,4751；(2)Dagle等，反义研究与发展，1991,1,11；(3)Eder等，生物化学杂志，1991,266,6472；以及(4)Dagle等，核酸研究，1991,19,1805。按照这些出版物，既具有未修饰磷酸二酯核苷间键合也具有修饰硫代磷酸酯核苷间键合的DNA寡核苷酸是细胞RNase H的底物。由于它们是底物，因此它们激活靶RNA的RNase H切割。然而，作者还注意到在非洲蟾蜍属胚胎中，磷酸二酯键合以及硫代磷酸酯键合都易于为外切核酸酶降解。这样的核酸酶降解是有害的，因为它迅速耗尽可供RNase H活化使用的寡核苷酸。

如参考文献(1)、(2)和(4)中所描述的，为了使抗核酸酶降解的寡核苷酸稳定而又能提供RNase H活化作用，人们构建了具有短区段的磷酸二酯键合核苷(位于氨基磷酸酯、烷基膦酸酯或者磷酸三酯键合的区段之间)的2’-脱氧寡核苷酸。当使包含氨基磷酸酯的寡核苷酸抗外切核酸酶稳定时，在参考文献(4)中作者特别提到每一种氨基磷酸酯键合在包含氨基磷酸酯的寡核苷酸的T_m测量值方面导致1.6℃的损失。在T_m值方面的这种减少表明在寡核苷酸和其靶链之间的杂交方面的减少。

其它作者曾评论了在寡核苷酸和其靶链之间的杂交的这种损失所可能有的影响。Saison-Behmoaras等(EMBO杂志，1991,10,1111)观察到尽管寡核苷酸可以是RNase H的底物，但是由于寡核苷酸与mRNA之间的弱杂交，RNase H的切割效率是低的。作者也注意到在寡核苷酸的3’末端包含的吖啶取代保护了寡核苷酸免受外切核酸酶的影响。

美国专利5,013,830(1991年5月7日颁发)揭示了包含RNA寡聚体或者其衍生物的混合寡聚体，该混合寡聚体经由磷酸二酯键合与DNA寡聚体连结。RNA寡聚体也携带2’-O-烷基取代基。然而，正是由于磷酸二酯，使得寡聚体对核酸酶切割敏感。

欧洲专利申请339,842(1989年4月13日递交)揭示了包括2’-O-甲基核糖寡核苷酸硫代磷酸酯衍生物的2’-O-取代的硫代磷酸酯寡核苷酸。上述申请也揭示了缺乏核酸酶抗性的2’-O-甲基磷酸二酯寡核苷酸。

美国专利5,149,797(1992年9月22日颁发)揭示了混合的磷酸酯主链寡核苷酸，其包括为磷酸二酯键所结合的、并为一部分修饰DNA或者RNA序列在每一侧面上侧结合的脱氧核苷酸的内部部分。侧翼序列包括膦酸甲酯、吗啉磷酸酯(phosphoromorpholidate)、哌嗪磷酸酯(phosphoropiperazidate)或者氨基磷酸酯键。

美国专利5,256,775(1993年10月26日颁发)描述了掺入氨基磷酸酯键和硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯键的混合寡核苷酸。

当人们认识到靶RNA链的切割(利用寡核苷酸和RNase H)将是有用的时候，寡核苷酸的核酸酶抗性和杂交的保真性在寡核苷酸治疗学的发展中是十分重要的。因此，长期以来一直感到需要一些方法和材料，当同时保持或者改进杂交性质并提供核酸酶抗性时，这些方法和材料能够激活RNase H。这样的寡核苷酸也要求作为研究试剂和诊断试剂。

发明概要

按照本发明的一个实施方案，本发明提供了由核苷单位的序列形成的寡核苷酸。该寡核苷酸掺入增加寡核苷酸的核酸酶抗性的功能化的至少一个核苷单位。此外，寡核苷酸的至少一些核苷单位是用取代基功能化的，以增加寡核苷酸与靶核糖核酸的结合亲和性，同时至少一些核苷单位具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。

在本发明的优选的寡核苷酸中，增加结合亲和性功能化的核苷单位包括2’-取代基。在优选的实施方案中，2’-取代基包括氟基、C₁-C₂₀烷氧基、C₁-C₉氨基烷氧基(包括氨基丙氧基)、烯丙氧基、咪唑烷氧基和聚乙二醇。优选的烷氧基取代基包括甲氧基、乙氧基和丙氧基。一个优选的氨基烷氧基单位是氨基丙氧基。一个优选的咪唑烷氧基取代基是咪唑丙氧基。一个优选的聚乙二醇取代基是-O-乙基-O-甲基或者甲氧基乙氧基(-O-CH₂-CH₂-O-CH₃)。

本发明的寡核苷酸包括由带电磷键(选自由磷酸二酯和硫代磷酸酯键组成的组中)连接的核苷单位。

本发明的寡核苷酸包括许多携带取代基(增加寡核苷酸与核酸的互补链的结合亲和性)的结合核苷单位。在某些优选的实施方案中，具有携带这样的取代基的核苷单位的寡核苷酸序列可以划分成第一亚序列和第二亚序列，其中第一亚序列具有携带2’-取代-赤型-呋喃戊糖基糖组分的结合核苷单位而第二亚序列具有携带2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分的结合核苷单位。优选地，所说的第二亚序列具有至少三个核苷单位，更优选地，具有至少五个核苷单位。在其它优选的实施方案中有第三亚序列，其中的核苷单位选自那些可由第一亚序列选择的核苷单位。优选的是，第二亚序列位于第一和第三亚序列之间。本发明的这样的寡核苷酸也称作“嵌合体”或者“嵌合的”或“有缺口的”寡核苷酸。

在本发明的其它优选寡核苷酸中，携带增加结合亲和性的取代基的核苷单位位于寡核苷酸的一或两个3’或5’末端。可以有一个至大约八个为取代基取代的核苷单位。优选地，至少五个核苷单位携带2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。

本发明的寡核苷酸的核苷单位包含由磷键(如磷酸二酯和硫代磷酸酯键)与2’-取代和2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分结合的核碱基。本发明的优选的核碱基包括嘌呤和嘧啶(如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷和胸腺嘧啶)以及其它合成的和天然的核碱基(如黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶以及7-甲基鸟嘌呤)。其它嘌呤和嘧啶包括那些在美国专利3,687,808中所揭示的嘌呤和嘧啶、那些在聚合物科学和工程的简明百科全书(第858-859页，Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley和Sons,1990)中所揭示的嘌呤和嘧啶以及那些由Englisch等，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613所揭示的嘌呤和嘧啶。

本发明也提供了用于治疗患有疾病(以产生不需要的蛋白质为特征)的有机体的方法。这些方法包括：使有机体与具有核苷单位的序列的寡核苷酸相接触，所说的核苷单位的序列能够特异地与核酸的互补链杂交，所说的核酸具有至少一个增加寡核苷酸对核酸酶的核酸酶抗性的功能化的核苷单位、具有位于其上以增加寡核苷酸与核酸的互补链的结合亲和性的取代基、以及具有许多有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分的核苷单位。

按照本发明，还提供了包括药学上有效量的寡核苷酸的组合物，所说的寡核苷酸具有能够特异地与核酸的互补链杂交的核苷单位的序列，所说的核酸具有至少一个增加寡核苷酸对核酸酶的核酸酶抗性的功能化的核苷单位，其中许多核苷单位具有位于其上以增加寡核苷酸与核酸的互补链的结合亲和性的取代基，以及其中许多核苷单位具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。该组合物还包括药学上可接受的稀释剂或者载体。

按照本发明，还提供了序列特异性核酸的体外修饰方法，该方法包括使包含RNase H酶和上述核酸的试液与具有核苷单位(能够特异地与核酸的互补链杂交)的序列的寡核苷酸接触，其中至少一个核苷单位是增加寡核苷酸对核酸酶的核酸酶抗性功能化的，其中许多核苷单位具有位于其上以增加寡核苷酸与核酸的互补链的结合亲和性的取代基，并且其中许多核苷单位具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。

也提供了同时增强有机体中的杂交和RNase H酶活化作用的方法，该方法包括使有机体与具有核苷单位(能够特异地与核酸的互补链杂交)的序列的寡核苷酸相接触，其中至少一个核苷单位是增加寡核苷酸对核酸酶的核酸酶抗性功能化的，其中许多核苷单位具有位于其上以增加寡核苷酸与核酸的互补链的结合亲和性的取代基，以及其中许多核苷单位具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。

本发明还提供了用于在有机体或者细胞中检测反常RNA分子的存在或缺乏、或者正常RNA分子的反常或者不适当表达的诊断方法。

附图简要描述

图1是显示本发明的寡核苷酸和参比化合物的剂量反应活性的线状图表。

图2是显示本发明的寡核苷酸和参比化合物的剂量反应活性的柱状图表。

图3是显示几个2’-O-甲基嵌合的寡核苷酸对PKC-αmRNA水平的影响的柱状图表。斜线柱表示8.5kb转录物，空白柱表示4.0kb转录物。

图4是显示几个2’-O-甲基和2’-O-丙基嵌合的寡核苷酸对PKC-αmRNA水平的影响的柱状图表。斜线柱表示8.5kb转录物，空白柱表示4.0kb转录物。

图5是显示附加的2’-O-甲基和2’-O-丙基嵌合的寡核苷酸对PKC-αmRNA水平的影响的柱状图表。斜线柱表示8.5kb转录物，空白柱表示4.0kb转录物。

图6a和6b是显示2’甲氧基乙氧基修饰的、具有SEQ ID NO:30的寡核苷酸对在A549细胞中的PKC-αmRNA水平的影响的线状图表。图6a显示与脱氧硫代磷酸酯化合物(ISIS3521)作比较的ISIS9605的影响。图6b显示与脱氧硫代磷酸酯化合物(ISIS3521)作比较的ISIS9606的影响。

图7a和7b是显示具有SEQ ID NO:30的寡核苷酸对在裸鼠中的人结肠癌(Colo205)肿瘤异种移植的生长的影响的线状图表。图7a显示脱氧硫代磷酸酯化合物(ISIS3521)的影响。图7b显示2’甲氧基乙氧基修饰的化合物(ISIS12723)的影响。

图8a和8b是显示ISIS5132(图6a)和CGP69845(相同序列的2’甲氧基乙氧基(2’-O-CH₂-CH₂-O-CH₃)形式)(图6b)对在裸鼠中的A549肺肿瘤异种移植的生长的影响的线状图表。

图9是显示一种对照化合物与两种本发明化合物的小鼠血浆浓度的线状图表。血浆浓度对时间作图。

图10是显示一种对照化合物在小鼠的各种组织中的分布的三维柱状图表。具体的组织显示在一个轴上，时间在第二个轴上和剂量百分比在第三个轴上。该化合物通过静脉注射传送。

图11是显示本发明的一种化合物在小鼠的各种组织中的分布的三维柱状图表。具体的组织显示在一个轴上，时间在第二个轴上和剂量百分比在第三个轴上。该化合物通过静脉注射传送。

图12是显示本发明的另一种化合物在小鼠的各种组织中的分布的三维柱状图表。具体的组织显示在一个轴上，时间在第二个轴上和剂量百分比在第三个轴上。该化合物通过静脉注射传送。

发明的详尽描述

按照本发明的目的，提供了新的寡核苷酸，该寡核苷酸增加了核酸酶抗性和与核酸的互补链的结合亲和性，并且是RNase H的底物。本发明的寡核苷酸由许多核苷单位装配。本发明的每一种寡核苷酸包括至少一个增加寡核苷酸的核酸酶抗性功能化的核苷单位。此外，在本发明的一些实施方案中，至少一些核苷单位携带增加寡核苷酸与核酸的互补链的结合亲和性的取代基。另外，至少一些核苷单位包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。

结合上述阐述，本发明的寡核苷酸的每一个核苷单位(可选择地称作为“核苷”或者“亚单位”)可以是“天然的”或者“合成的”组分。因此，在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”指的是由许多结合的核苷单位形成的寡聚体。核苷单位经由磷键(如磷酸二酯或者硫代磷酸酯键)结合在一起。核苷单位由天然或者非天然存在的核碱基和呋喃戊糖基糖组分形成。因此术语“寡核苷酸”有效地包括由天然存在的核苷单位形成的天然存在的产物或者合成的产物。

本发明的寡核苷酸也可以包括修饰的亚单位。修饰可以发生在核苷的核碱基部分上、核苷的糖部分上或者一个核苷与下一个核苷结合的键上。

在本发明中发现：通过在寡核苷酸的核苷单位中掺入取代基，可以增加本发明的寡核苷酸的结合亲和性。优选的取代基是2’取代基，即位于本发明的寡核苷酸的核苷单位的呋喃戊糖基糖组分的2’位置的取代基。目前优选的取代基包括氟基、烷氧基、氨基烷氧基、烯丙氧基、咪唑烷氧基和聚乙二醇。烷氧基和氨基烷氧基一般包括低级烷基，具体地说是C₁-C₉烷基。聚乙二醇具有(O-CH₂-CH₂)_n-O-烷基结构。特别优选的取代基是式(-O-CH₂-CH₂)_n-O-烷基的聚乙二醇取代基，其中n=1，烷基=CH₃。

通过利用在组成本发明寡核苷酸的核苷单位中的一些修饰的核碱基，也能够增加结合亲和性。这样的修饰的核碱基可以包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。预计其它修饰的嘧啶与嘌呤碱基也可以增加寡核苷酸与核酸的互补链的结合亲和性。

2’-取代基的利用增加了本发明的取代的寡核苷酸的结合亲和性。一项已发表的研究(2’-dRIBO-F修饰的寡核苷酸的合成和生物物理研究，关于核酸治疗学的会议，Clearwater,FL,1991年1月13日)曾报道：每个取代的核苷单位(组成在寡核苷酸的五个核苷单位上具有2’-氟基取代基的15链节磷酸二酯寡核苷酸)有1.6℃的结合亲和性增加量。当寡核苷酸的11个核苷单位携带2’-氟基取代基时，每个取代的核苷单位的结合亲和性增加至1.8℃。

在上述的研究中，使15链节磷酸二酯寡核苷酸衍生为对应的硫代磷酸酯类似物。当把15链节磷酸二酯寡核苷酸与硫代磷酸酯类似物比较时，发现硫代磷酸酯类似物仅仅具有15链节磷酸二酯寡核苷酸的结合亲和性的大约66％。换句话说，在使寡核苷酸衍生成为它的硫代磷酸酯类似物的过程中损失了部分结合亲和性。然而，当使2’-氟基取代基位于15链节硫代磷酸酯寡核苷酸的11个核苷时，2’-取代基的结合亲和性不仅克服了所注意到的由15链节寡核苷酸衍生为它的硫代磷酸酯类似物所产生的减少。在这一化合物(即有11个核苷单位为2’-氟基取代基取代的15链节硫代磷酸酯寡核苷酸)中，结合亲和性增加至每个取代基2.5℃。在这一研究中，没有设法包括具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分(其将引起互补于该研究的寡核苷酸的RNA靶的RNase H酶促切割)的核苷单位的适当的连续序列。

为了引起靶RNA的RNase H酶促切割，本发明的寡核苷酸必须包括节段或者亚序列(其中它是DNA型节段)。换句话说，本发明的寡核苷酸的至少一些核苷亚单位必须具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。具有三个以上核苷亚单位(包含连续地结合的2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基)的亚序列是必要的以便在本发明的寡核苷酸与靶RNA的杂交方面引起RNase H活性。目前，优选的是在本发明的寡核苷酸中具有三个或多个包含连续2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亚单位的亚序列。特别优选是至少五个包含连续2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亚单位的利用。

RNase H的作用机理是：DNA-RNA双螺旋的识别，其后为该双螺旋的RNA链的切割。如以上“发明背景”部分所指出的，本领域的其它研究者曾利用修饰的DNA链来向DNA链传递核酸酶稳定性。为了达此目的，他们利用了修饰的磷键(其传递增加的核酸酶稳定性但是降低杂交性能)。

本发明识别一定的标准，该标准必须满足确定RNase H识别和引起RNA链的切割。首先是在切割位点的RNA链必须具有其经由磷键(携带负电荷)连接的核苷单位。此外，在切割位点的核苷的糖组分必须是β-呋喃戊糖基糖组分，并且也必须是2’内向构象。符合这一标准的最理想的核苷是由磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键连接的2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基β-核苷。

对于用于制备这样的结构单位来说，合适的核碱基包括嘌呤和嘧啶(如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷和胸腺嘧啶)以及其它合成的和天然的核碱基(如黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤)。其它嘌呤和嘧啶包括那些在美国专利3,687,808中所揭示的嘌呤和嘧啶、那些在聚合物科学和工程的简明百科全书(第858-859页,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley和Sons,1990)中所揭示的嘌呤和嘧啶以及那些由Englisch等，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613所揭示的嘌呤和嘧啶。

本发明的寡核苷酸在至少一个核苷的2’位置上包含甲氧基乙氧基(-OCH₂CH₂OCH₃)修饰。已显示出这一修饰增加了寡核苷酸与其靶的亲和性以及寡核苷酸的核酸酶抗性。按照本发明的寡核苷酸优选包含大约5至大约50个核苷单位。在本发明的上下文中可以理解为寡核苷酸包括非天然存在的寡聚体(如前所描述，具有5至50个核苷单位)。更加优选的是本发明的寡核苷酸包含大约15至大约25个核苷单位。正如将得到理解的，“核苷单位”是通过磷键与邻近的亚单位适当地结合的核碱基和糖的结合物。术语“亚单位”与术语“核苷单位”可互换使用。为了引起RNase H响应(如上所说明)，总的来说寡核苷酸的序列总长度将是多于三个(优选为五个或更多个)核苷单位(包含连续地结合的2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基)的亚序列。

目前优选的是在寡核苷酸中掺入包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亚序列，结果是在寡核苷酸中其它包含2’-取代的呋喃戊糖基的核苷亚序列位于包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亚序列的任一侧面上。在这样一种构建中，包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亚序列也称作为“中央区”，而包含2’-取代的呋喃戊糖基的核苷亚序列称作为“侧翼区”。

在本发明的一些实施方案中，如果核苷单位的其余部分的每一个包括增加结合亲和性的2’-取代基，那么包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亚序列将定位在具有2’-取代基的核苷单位的第一亚序列和具有2’-取代基的核苷单位的第二亚序列之间。其它构建也是可能的，包括在本发明的寡核苷酸的3’或者5’末端之任一处定位包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亚序列。

按照本发明所利用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便地按常规制得[Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504]。这样合成的设备由数个卖主(包括Applied Biosystems)出售。也可以使用这样合成的任何其它方法。寡核苷酸的实际合成完全属于本领域技术人员的技能之一。利用类似的技术制备其它寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物)也是众所周知的。利用类似的技术和市售的修饰亚酰胺化物(amidite)和可控孔度玻璃(CPG)产品(如生物素、荧光素、吖啶或者咖啡因修饰的亚酰胺化物和/或CPG(由Glen Research,Sterling VA提供))合成荧光标记的、生物素酰化的或者其它连结的寡核苷酸，这也是众所周知的。

本发明的化合物可以用作为诊断剂、治疗剂和用作为研究试剂以及试剂盒。通过在合适的药学上可接受的稀释剂或者载体中加入有效量的本发明的寡核苷酸，它们能够用于药物组合物。它们还能够用于治疗具有以产生不需要的蛋白质为特征的疾病的有机体。可以使有机体与本发明的寡核苷酸(具有能够特异地与靶核酸链(编码不需要的蛋白质)杂交的序列)相接触。

一般认为治疗组合物的配制和其随后的施用属于本领域技术人员的技能之一。一般来说，对于治疗学，以每kg体重的0.01μg至100g的用量范围(取决于患者的年龄和正在治疗的疾病严重程度)，给需要这样治疗的患者施用按照本发明的寡核苷酸(通常在药学上可接受的载体中)。此外，该治疗法可以持续一段时间，时间长短取决于具体疾病的性质及其严重程度以及患者的整个状况，并且可以从每日一次扩展至每20年一次。在治疗之后，患者在他/她的状况方面的变化和疾病的症状减轻得到监控。可以或者增加寡核苷酸的剂量(如果患者不对当前的剂量水平作出明显的反应)，或者减少剂量(如果观察到疾病的症状减轻，或者如果疾病消失)。

在某些情况下，可以更有效的是利用与其它传统治疗用药程式结合的本发明的寡核苷酸治疗患者。例如，可以结合AZT给正在接受AIDS治疗的患者施用寡核苷酸，或者可以在血管成形术以后利用本发明的寡核苷酸治疗粥样硬化的患者以阻止得到治疗的动脉再闭塞。

在成功治疗之后，可能需要使患者接受维持治疗以阻止疾病复发，其中以维持剂量(用量变化于每kg体重0.01μg至100g，每日一次或多次至每20年一次)施用寡核苷酸。

可以用多种方法施用本发明的药物组合物，这取决于是否需要进行局部或者全身治疗以及取决于将要治疗的区域。用药可以是局部的(包括眼的、阴道的、直肠的、鼻内的、经皮的)、口服的或者肠胃外的。肠胃外用药包括静脉滴注，皮下、腹膜内或者肌内注射，或者鞘内或心室内用药。

局部用药的制剂可以包括经皮的膜片、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药物载体，水性的、粉末的或者油性的基质，增稠剂等等可以是必要的或者需要的。有被避孕套、手套等等也可以是有用的。

口服的组合物包括粉剂或者颗粒剂、在水或者无水介质中的悬浮液或者溶液、胶囊、香囊或者片剂。增稠剂、增香剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或者粘合剂也可以是需要的。

鞘内或者心室内施用的组合物可以包括无菌水溶液，该水溶液也可以包含缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。

肠胃外用药的配制可以包括无菌水溶液，该溶液也可以包含缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。

用药剂量取决于将要治疗的疾病的严重程度和反应性，治疗过程可持续几天至几个月或者直到治愈或达到疾病减轻。最佳剂量程序表可以从患者身体中的药物积累量的测量值计算。一般技术人员就可以容易地测定最佳剂量、配药方法和重复率。最佳剂量可以变化，这取决于个体寡核苷酸的相对效能，并且一般可以基于EC₅₀s(发现其在体外和体内动物模型中是有效的)估计最佳剂量。一般来说，剂量是每kg体重0.01μg至100g，并且可以每日、每周、每月、或者每年施用一次或多次，或者甚至每2至20年施用一次。

可以在各种有机体(范围从单细胞原核和真核有机体到多细胞真核有机体)中实施这样的治疗。利用DNA-RNA转录或者RNA-蛋白质转译作为其遗传、代谢或者细胞运转的基础部分的任何有机体对这样的治疗和/或预防治疗是敏感的。从表面上看来，各种有机体(如细菌、酵母、原生动物、藻类、植物以及高等动物(包括温血动物))都可以以这种方式治疗。此外，由于多细胞真核生物的每个细胞也包括DNA-RNA转录和RNA-蛋白质转译作为它们的细胞活性的完整部分，因此这样的治疗学和/或者诊断学也可以在这样的细胞群体上实践。此外，真核细胞的许多细胞器(例如线粒体和叶绿体)也包括转录和转译机制。同样地，单细胞、细胞群体或者细胞器也可以包括在有机体(能够利用本发明的治疗或者诊断寡核苷酸治疗)的定义之内。如本文所使用的，治疗学指的是包括疾病的根除，有机体(如细菌、原生动物或者其它感染)的杀灭，或者异常的或不需要的细胞生长或表达的控制。

在本发明的上下文中，“杂交”将意指在互补核碱基之间的氢键结合，该结合可以是Watson-Crick、Hoogsteen或者反向Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键的形成配对的互补核碱基。“互补的”和“可特异地杂交的”(如本文所使用的)指的是在两个包含核苷单位的核酸之间的序列互补性，其中一个核酸是寡核苷酸而另一个核酸是靶DNA或RNA分子。例如，如果在寡核苷酸的一定位置的核碱基能够与在DNA或者RNA分子的相同位置的核碱基实现氢键结合，那么就认为该寡核苷酸和DNA或者RNA分子在该位置是相互互补的。当足够数量的在每一个分子中的对应位置为能够相互氢键结合的核碱基所占据时，寡核苷酸和DNA或者RNA分子是相互互补的。因此，“可特异地杂交的”和“互补的”是用来表明足够程度的互补性以致在寡核苷酸和靶DNA或者RNA分子之间发生稳定的和特异性的结合的术语。可以理解为寡核苷酸不必100％地互补于可与其特异地杂交的靶DNA序列。当寡核苷酸与靶DNA或者RNA分子的结合干扰靶DNA或者RNA的正常功能从而造成效用的丧失，并且有足够程度的互补性从而在需要特异性结合的条件下(即在生理学条件下在体内测定或者治疗处理的情况下或者在体外测定的情况下，在这些测定得以完成的条件下)避免寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合时，寡核苷酸是可特异地杂交的。

为说明起见，本发明的化合物已用于利用ras萤光素酶反式激活的ras萤光素酶融合系统。如在国际公开号WO92/22651(1992年12月23日公开，并且与这一申请共同转让，其中的整个内容并入本文作为参考)中所描述的，ras致癌基因是编码相关蛋白质(定位于质膜的内表面)的基因家族的成员。Ras蛋白质显示出在氨基酸水平方面是高度保守的，显示出以高亲和性和特异性与GTP结合，并且显示出具有GTP酶活性。虽然ras基因产物的细胞功能是未知的，但是它们的生化性质以及它们的与一类转导信号的蛋白质(被认为是GTP结合蛋白或者G蛋白质)之间的重要的序列同源性表明ras基因产物在基本的细胞调节功能(与胞外信号穿过质膜的转导有关)中起着根本作用。

指定为H-ras、K-ras以及N-ras的三个ras基因已在哺乳动物基因组中得到鉴定。哺乳动物ras基因通过在它们的编码序列之内的单点突变获得诱导转化的性质。在天然存在的ras致癌基因中的突变已定位于密码子12、13和61。最通常检测到的激活ras突变(在人体肿瘤中发现)是在H-ras基因的密码子12(其中从GGC至GTC的碱基变化导致在ras蛋白质产物的GTP酶调节域中发生甘氨酸至缬氨酸的取代)中。一般认为这种单一的氨基酸变化消除了ras蛋白质功能的正常控制，由此把一种正常调节的细胞蛋白质转化成为一种具有连续活性的细胞蛋白质。据认为正常ras蛋白质功能的去调节负责从正常向恶性生长的转化。

本发明的寡核苷酸也曾用于调节raf基因的表达，raf基因是一种天然存在的细胞基因，其有时转化成为活化形式(其已在反常细胞增殖和肿瘤形成中得到暗示)。

本发明的寡核苷酸也是可特异地与核酸(与蛋白激酶C(PKC)有关)杂交的。已发现这些寡核苷酸调节PKC的表达。

下列实施例与方法用来说明本发明，但并无意于限制本发明。实施例1寡核苷酸合成

利用标准的亚磷酰胺化学(具有碘氧化)在自动DNA合成仪(AppliedBiosystems model 380B)上合成未取代的和取代的寡核苷酸。对于硫代磷酸酯寡核苷酸，用0.2M 3H-1,2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮1,1-二氧化物的乙腈溶液代替标准的氧化瓶以便于亚磷酸酯键的逐步硫杂化。使硫杂化等待步骤增加至68秒，其后进行加帽步骤。在从CPG柱上切割下来和去封闭(在浓氨水中在55℃下(18小时))之后，通过用2.5体积乙醇从0.5 M NaCl溶液中沉淀两次纯化寡核苷酸。在20％丙烯酰胺、8M尿素、454mM Tris-硼酸盐缓冲液(pH=7.0)中完成分析的凝胶电泳。基于聚丙烯酰胺凝胶电泳，鉴定出寡核苷酸和硫代磷酸酯大于80％全长材料。实施例2具有位于中央2’-脱氧硫代磷酸酯区侧翼的2’-取代区的寡核苷酸

利用RNA流程在DNA测序仪上以正常方式制备序列5’GCGTTTTTTTTTTGCG 3’(SEQ ID NO:28)的15链节RNA靶。利用2’-取代的核苷前体，制备一系列在2’-脱氧区的侧翼区中具有2’-取代的核苷单位的互补硫代磷酸酯寡核苷酸，其中核苷前体按已知文献的方法制备(即2’-O-甲基)，或者按国际公开号92/03568(1992年3月公开)的方法制备。在DNA合成仪上以正常方式加入2’-取代的核苷作为它们的5’-O-二甲氧基三苯甲基-3’-亚磷酰胺。互补寡核苷酸具有5’CGC AAA AAAAAA AAA ACG C 3’(SEQ ID NO:29)的序列。2’-取代基定位于这些寡核苷酸的CGC和CG区中。下列的2’-O-取代基得到利用：2’-氟基、2’-O-甲基、2’-O-丙基、2’-O-烯丙基、2’-O-氨基丙氧基、2’-O-(甲氧基乙氧基乙基)、2’-O-咪唑丁氧基和2’-O-咪唑丙氧基。实施例3Ras萤光素酶报道基因装配

利用PCR技术装配本研究所描述的ras萤光素酶报道基因。合成寡核苷酸引物以用作为突变(密码子12)和非突变(野生型)人H-ras基因两者的外显子1的5’区的PCR克隆的引物。H-ras基因模板购自在Bethesda,MD的美国典型培养物保藏中心(ATCC号41000和41001)。寡核苷酸PCR引物##5’-ACA-TTA-TGC-TAG-CTT-TTT-GAG-TAA-ACT-TGT-GGG-GCA-GGA-GAC-CCT-GT-3’(有义)(SEQ ID NO:15)和5’-GAG-ATC-TGA-AGC-TTC-TGG-ATG-GTC-AGC-GC-3’(反义)(SEQ ID NO:16)用于利用突变和非突变H-ras基因作为模板的标准PCR反应。可预计这些引物将产生具有对应于正常和突变H-ras的序列-53至+65(与转译起始位点有关)(位于NheⅠ和HindⅢ限制性内切核酸酶位点的侧翼)的145个碱基对的DNA产物。利用标准过程凝胶纯化、沉淀、洗涤上述PCR产物，并使之再悬浮于水中。

设计用于P.pyralis(萤火虫)萤光素酶基因的克隆的PCR引物以便PCR产物编码除氨基末端蛋氨酸残基(其将为两个氨基酸所取代，即一个氨基末端赖氨酸残基，其后为亮氨酸残基)外的全长萤光素酶蛋白质。用于萤光素酶基因的克隆的寡核苷酸PCR引物是5’-GAG-ATC-TGA-AGC-TTG-AAG-ACG-CCA-AAA-ACA-TAA-AG-3’(有义)(SEQ IDNO:17)和5'-ACG-CAT-CTG-GCG-CGC-CGA-TAC-CGT-CGA-CCT-CGA-3’(反义)(SEQ ID NO:18),##用于利用市售的包含萤光素酶报道基因的质粒(pT3/T7-Luc)(Clontech)作为模板的标准PCR反应。可预计这些引物将产生对应于萤光素酶基因的大约1.9kb(位于HindⅢ和BssHⅡ限制性内切核酸酶位点的侧翼)的产物。利用标准过程凝胶纯化、沉淀、洗涤这一片段，并使之再悬浮于水中。

为了完成ras萤光素酶融合报道基因的装配，用适当的限制性内切核酸酶消化ras和萤光素酶PCR产物，并通过利用限制性内切核酸酶NheⅠ、HindⅢ和BssHⅡ三部分连接进入包含类固醇诱导的小鼠乳房肿瘤病毒MMTV启动子的表达载体来克隆ras和萤光素酶PCR产物。所产生的克隆导致与萤火虫萤光素酶基因符合读框融合的H-ras 5’序列(-53至+65)的插入。所产生的表达载体编码ras萤光素酶融合产物(其在类固醇诱导的MMTV启动子的控制下得到表达)。实施例4用质粒DNA转染细胞

如Greenberg(分子生物学的当前方案，Ausubel等编著，JohnWiley和Sons,NY)所述完成转染，具有下列改进：以5×10⁵细胞/平皿将HeLa细胞涂布于60mm培养皿上。每个平皿中加入总计为10μg的DNA，其中9μg是ras萤光素酶报道基因质粒，1μg是在组成型Rous肉瘤病毒(RSV)启动子的控制之下表达大鼠糖皮质激素受体的载体。在通过用包含3mM EGTA的Tris-缓冲盐水[50mM Tris-Cl(pH7.5),150mM NaCl]洗涤16-20小时之后除去磷酸钙-DNA共沉淀。然后在细胞中加入补加10％胎牛血清的新鲜培养基。此时，在用地塞米松激活报道基因表达之前用反义寡核苷酸预处理细胞。实施例5细胞的寡核苷酸处理

在质粒转染之后立即用OptiMEM(GIBCO)洗涤细胞三次，并将其预热至37℃。在每个培养皿中加入包含10μg/mL N-[1-(2,3-二油氧基(dioleyloxy))丙基]-N,N,N,-三甲基氯化铵(DOTMA)(Bethesda ResearchLabs,Gaithersburg,MD)的2 mL OptiMEM，同时直接加入寡核苷酸并在37℃下培养4小时。然后除去并用适当的细胞生长培养基(包含寡核苷酸)替代OptiMEM。此时，通过用地塞米松处理细胞至0.2μM终浓度来激活报道基因表达。在类固醇处理后的12-16小时收获细胞。实施例6萤光素酶测定

如Greenberg(分子生物学的当前方案，Ausubel等编著，JohnWiley和Sons,NY)所述，通过用去污剂Triton X-100溶胞来从细胞中提取萤光素酶。用Dynatech ML1000发光计来测量当萤光素(Sigma)增加至625μM时的峰值发光。对于每一抽提物，利用不同量的抽提物进行多次萤光素酶测定以保证在测定的线型范围中收集数据。实施例7ras萤光素酶基因表达的反义寡核苷酸抑制作用

利用在前述实施例中所描述的ras萤光素酶报道基因系统，检测一系列硫代磷酸酯寡核苷酸(定向活化H-ras的密码子12点突变)。这一系列包含基本序列和该基本序列的类似物。如上述国际公开号WO92/22651中所报道的，上述基本序列具有已知活性。在基本序列和它的类似物两者中，每一核苷单位掺入硫代磷酸酯键以提供核酸酶抗性。每一类似物掺入包含2’-O-甲基取代基和2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分的核苷单位。在类似物中，包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖的亚单位的亚序列在两个末端上侧接2’-O-甲基取代的亚单位的亚序列。根据包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖的核苷的亚序列的长度相互区别类似物。2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷亚序列集中在活化的ras的密码子12点突变的点突变处。

寡核苷酸序列、序列参考号和序列ID号(所有都是硫代磷酸酯类似物)都显示在表1中。在这个表中，那些用＂M＂鉴定的核苷包含2’-O-甲基取代基和用“d”鉴定的核苷都是2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷。

表1

嵌合的2’-O-甲基P=S寡核苷酸寡核苷酸序列 SEQ ID NO:2570 C_dC_dA_d C_dA_dC_d C_dG_dA_d C_dG_dG_d C_dG_dC_d C_dC_d 13975 C^MC^MA^M C^MA^MC^M C^MG^MA_d C^MG^MG^M C^MG^MC^M C^MC^M 13979 C^MC^MA^M C^MA^MC^MC^MG_dA₂ C_dG^MG^M C^MG^MC^M C^MC^M 13980 C^MC^MA^M C^MA^MC^M C_dG_dA_d C_dG_dG^M C^MG^MC^M C^MC^M 13985 C^MC^MA^M C^MA^MC_d C_dG_dA_d C_dG_dG_d C^MG^MC^M C^MC^M 13984 C^MC^MA^M C^MA_dC_d C_dG_dA_d C_dG_dG_d C_dG^MC^M C^MC^M 1

图1显示剂量-反应数据，其中用表1的硫代磷酸酯寡核苷酸处理细胞。使寡核苷酸2570定向突变(活化的)H-ras RNA的密码子12点突变。其它核苷具有位于其上以增加结合亲和性(与各种长度的有间隙的2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷的区段)的2’-O-甲基取代基。对照寡核苷酸是随机的20链节硫代磷酸酯寡核苷酸。结果表示为在转染的、未用寡核苷酸处理的细胞中的萤光素酶活性的百分比。如图所示，用逐渐增加浓度的寡核苷酸2570处理细胞导致ras萤光素酶活性(在表达突变形式的ras萤光素酶的细胞中)的依赖剂量的抑制作用。与正常形式的ras萤光素酶相比，寡核苷酸2570对突变形式的ras萤光素酶显示大约三倍选择性。

如同在图1中所进一步看见的一样，寡核苷酸3980、3985和3984之每一个都显示出比寡核苷酸2570大的ras萤光素酶活性的抑制作用。最大的抑制作用由具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷的7链节亚序列的寡核苷酸3985显示。寡核苷酸3980(具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷单位的5链节亚序列)显示出第二大的抑制作用，其次是寡核苷酸3984(具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷单位的9链节亚序列)的抑制作用。

图2显示类似于图1的结果，除它是以柱状图表形式表示外。在图2中可进一步看见寡核苷酸3975和寡核苷酸3979的活性。这些寡核苷酸具有长度分别为1和3个核苷的2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷单位的亚序列。如从图2可明显看出，任一寡核苷酸都显示出重要的活性。在最高浓度剂量下观察到寡核苷酸3979(具有3链节脱氧亚序列)具有可测量的活性。

与寡核苷酸2570相比，寡核苷酸3980、3985和3984的活性的增加归因于结合亲和性(由定位于这些化合物上的2’-O-甲基取代基传递给这些化合物)的增加和Rnase H活化(通过在核苷的主序列中掺入2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷的亚序列传递给这些化合物)。与本发明的活性化合物相比，令人感兴趣的是注意到与那些活性寡核苷酸2570、3980、3985和3984等同但具有磷酸二酯键(而不是本发明的活性寡核苷酸的硫代磷酸酯键)的序列不显示任何活性。这是因为磷酸二酯化合物是核酸酶的底物，该核酸酶降解磷酸二酯化合物从而阻止它们可能激活RNase H。

其它糖修饰：除2’-O-甲基取代基外的其它2’糖修饰对在嵌合的寡核苷酸中的反义活性的影响已得到检验。这些修饰与T_m值(当使具有2’-修饰核苷侧翼7链节脱氧亚序列(或7链节脱氧缺口)的17链节寡核苷酸与25链节寡核糖核苷酸补体杂交(如实施例8所描述)时获得)一同列在表2中。观察到这些寡核苷酸的在2’位置的烷基长度和T_m之间的关系。随着烷基长度的增加，T_m减少。2’-氟基嵌合的寡核苷酸显示出该系列的的最高T_m值。

表2

T_m与反义活性2’修饰的、具有7-脱氧缺口的17-链节

CCACACCGACGGCGCCC(SEQ ID NO:1)的相互关系2’修饰 T_m(℃) IC₅₀(nM)脱氧 64.2 150O-戊基 68.5 150O-丙基 70.4 70O-甲基 74.7 20氟基 76.9 10

利用实施例9所描述的反式激活报道基因分析方法检测这些2’修饰的寡核苷酸的抗H-ras的反义活性。所有这些2’修饰的嵌合化合物都抑制ras表达，其中2’-氟基7链节的带缺口的化合物具有最大活性。具有5链节中央脱氧缺口的2’-氟基嵌合寡核苷酸也具有活性。

将具有SEQ ID NO:1(具有2’-O-丙基亚序列侧翼5链节或者7链节脱氧亚序列)的嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸与2’-O-甲基嵌合寡核苷酸比较。在T24细胞中的ras表达受到2’-O-甲基和2’-O-丙基嵌合寡核苷酸(具有7链节脱氧缺口和均匀硫代磷酸酯主链)的抑制。当使脱氧缺口减少至五个核苷时，仅有2’-O-甲基寡核苷酸抑制ras表达。

在癌细胞中的H-ras基因表达的反义寡核苷酸抑制作用：如同实施例10所描述的一样，两个互补于ras AUG区的硫代磷酸酯寡核苷酸(2502,2503)与具有相同序列和以2’-O-甲基亚序列为侧翼的7链节脱氧亚序列的嵌合寡核苷酸(4998,5122)一同得到检测。这些嵌合寡核苷酸显示在表3中。

表3具有2’-O-甲基末端(粗体)和中央脱氧缺口(AUG靶)的嵌合硫代磷酸酯寡

核苷酸寡核苷酸 #脱氧序列 SEQ ID NO:2502 20 CTTATATTCCGTCATCGCTC 24998 7 CTTATATTCCGTCATCGCTC 22503 20 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG 35122 7 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG 3

化合物2503抑制71％的在T24细胞中的ras表达，嵌合化合物(4998)甚至更强烈地抑制ras mRNA(达到84％抑制)。化合物2502(也互补于AUG区)降低26％的ras RNA水平，这一寡核苷酸的嵌合形式(5122)显示出15％的抑制作用。两个定向突变体密码子12的寡核苷酸也包括在这一测定中。化合物2570(SEQ ID NO:1)降低82％的ras RNA，这一寡核苷酸(具有7链节脱氧亚序列(3985))的2’-O-甲基嵌合形式降低95％的rasRNA。

也检测寡核苷酸2570和2503以便测定它们对在HeLa细胞(其具有野生型(即未活化的)H-ras密码子12)中的ras表达的影响。当这两种寡核苷酸抑制在T24细胞(具有激活的密码子12)中的ras表达时，仅有可特异地与ras AUG杂交的寡核苷酸(2503)抑制在HeLa细胞中的ras表达。可特异地与活化的密码子12杂交的寡核苷酸2570(SEQ ID NO:1)并不抑制在HeLa细胞中的ras表达，因为这些细胞缺乏活化的密码子12靶。

寡核苷酸2570(互补于活化H-ras的密码子12区的17链节硫代磷酸酯寡核苷酸)与嵌合硫代磷酸酯2’-O-甲基取代的寡核苷酸3980、3985和3984(它们具有与2570一样的序列，并且具有分别为5、7和9个核苷单位的脱氧亚序列(显示在表1中))一同被检测在T24细胞中的ras表达的抑制作用。均匀2’-脱氧寡核苷酸2570和三种嵌合寡核苷酸都降低T24细胞中的ras mRNA水平。化合物3985(7链节脱氧缺口)和3984(9链节脱氧缺口)降低81％ras mRNA；化合物3980(5链节脱氧缺口)降低61％rasmRNA。具有这一序列的、但是具有2’-氟基取代的核苷侧翼5链节脱氧(4689)或者7链节脱氧(4690)亚序列的嵌合寡核苷酸抑制在T24细胞中的ras mRNA表达，其中7链节的脱氧亚序列是优选的(82％抑制作用，与5链节脱氧亚序列的2’-氟基嵌合体的63％抑制作用相比较而言)。

癌细胞的增殖的反义寡核苷酸抑制作用：检测三种具有相同序列(SEQ ID NO:1)的17链节寡核苷酸(互补于活化ras的密码子12区)对T24癌细胞增殖的影响(如实施例11所描述)。寡核苷酸3985是具有以2’-O-甲基取代的核苷为侧翼的7链节脱氧亚序列的均匀硫代磷酸酯，4690是具有以2’-氟基取代的核苷为侧翼的7链节脱氧亚序列(缺口)的均匀硫代磷酸酯(C^FC^FA^FC^FA^FC_dC_dG_dA_dC_dG_dG_dC^FG^FC^FC^FC^F,SEQ IDNO:1，用^“F”识别的核苷包含2’-氟基取代基，用“_d”识别的核苷是2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基核苷)。与它们对ras mRNA表达的影响有很好相关性的这些寡核苷酸对癌细胞增殖的影响由Northern印迹分析显示出来：寡核苷酸2570抑制61％的细胞增殖，2’-O-甲基嵌合寡核苷酸3985抑制82％的细胞增殖，2’-氟基嵌合类似物抑制93％的细胞增殖。

在这些寡核苷酸对细胞增殖的剂量-反应研究中，显示出在25nM至100nM范围中抑制作用是依赖剂量的。44nM、61nM和98nM的IC₅₀值可以分别归因于寡核苷酸4690、3985和3984。随机寡核苷酸对照在所检测的剂量下没有任何效应。

ISIS 2570对细胞增殖的影响是细胞型特异性的。这种寡核苷酸对T24细胞增殖的抑制作用比相同寡核苷酸对HeLa细胞的抑制作用强烈四倍(100nM寡核苷酸浓度)。使ISIS 2570定向活化(突变的)ras密码子12，该活化密码子存在于T24中但在HeLa细胞(具有野生型密码子12)中缺乏。

嵌合主链修饰的寡核苷酸：以前的实施例中所讨论的寡核苷酸都具有均匀硫代磷酸酯主链。以上所讨论的2’修饰的嵌合寡核苷酸在均匀磷酸二酯主链中都是没有活性的。合成嵌合寡核苷酸(ISIS 4226)而使之具有2’-O-甲基取代区侧翼5链节脱氧缺口，其中缺口区具有P=S键而侧翼区具有P=O键。另一在缺口中具有P=O主链和在侧翼区中具有P=S的嵌合寡核苷酸(ISIS 4223)也得到制备。这些寡核苷酸都显示在表4中。

也合成了具有均匀2’-脱氧核苷单位的寡核苷酸。这些寡核苷酸在分子的中央区中具有与单个磷酸二酯键(ISIS 4248)、两个磷酸二酯键(ISIS4546)、三个磷酸二酯键(ISIS 4551)、四个磷酸二酯键(ISIS 4593)、五个磷酸二酯键(ISIS 4606)或者十个磷酸二酯键(ISIS-4241)之任一配合的硫代磷酸酯键。这些寡核苷酸也都显示在表4中。

表4具有2’-O-甲基侧翼(粗体)和中央脱氧缺口的嵌合主链(P=S/P=O)寡核苷

酸

(主链键由s(P=S)或者o(P=O)指示)寡核苷酸 #P=S 序列 SEQ ID NO:2570 16 CsCsAsCsAsCsCsGsAsCsGsGsCsGsCsCsC 14226 5 CoCoAoCoAoCsCsGsAsCsGoGoCoGoCoCoC 14233 11 CsCsAsCsAsCoCoGoAoCoGsGsCsGsCsCsC 14248 15 CsCsAsCsAsCsCsGsAoCsGsGsCsGsCsCsC 14546 14 CsCsAsCsAsCsCsGoAoCsGsGsCsGsCsCsC 14551 13 CsCsAsCsAsCsCsGoAoCoGsGsCsGsCsCsC 14593 12 CsCsAsCsAsCsCoGoAoCoGsGsCsGsCsCsC 14606 11 CsCsAsCsAsCsCoGoAoCoGoGsCsGsCsCsC 14241 6 CsCsAsCoAoCoCoGoAoCoGoGoCoGsCsCsC 1

在37℃下在HeLa细胞粗提物中培养寡核苷酸以测定它们对核酸酶降解的灵敏度(如Dignam等，核酸研究，1983,11,1475-1489中所描述)。具有5链节磷酸二酯中央区和硫代磷酸酯/2’-O-甲基取代的侧翼区的寡核苷酸(4233)具有7小时的T_1/2。具有5链节硫代磷酸酯中央区和硫代磷酸酯/2’-O-甲基取代的侧翼区的寡核苷酸具有30小时的T_1/2。在具有1至10个磷酸二酯二酯键的寡核苷酸系列中，具有单个磷酸二酯键的寡核苷酸(4248)对核酸酶的稳定性如同均匀硫代磷酸酯寡核苷酸(ISIS2570，其在5小时之后在HeLa细胞抽提物中不显示任何降解)一样。具有2链节、3链节和4链节磷酸二酯中央区的寡核苷酸分别具有大约5.5小时、3.75小时和3.2小时的T_1/2，具有5链节或者10链节磷酸二酯中央区的寡核苷酸分别具有1.75小时和0.9小时的T_1/2。

嵌合主链修饰的寡核苷酸的反义活性：不要求均匀硫代磷酸酯主链是反义活性的。ISIS 4226和ISIS 4233与ISIS 2570(均匀硫代磷酸酯/均匀脱氧)、ISIS 3980(均匀硫代磷酸酯，具有脱氧中央区的2’-O-甲基侧翼区)以及ISIS 3961(均匀磷酸二酯，具有脱氧中央区的2’-O-甲基侧翼区)一同在ras萤光素酶报道基因系统中被检测对ras表达的影响。所有具有P=S(核酸酶抗性的)中央区的寡核苷酸都抑制ras表达。也分析了上述两种具有硫代磷酸酯键(在分子的中央包含1个磷酸二酯键(ISIS 4248)或者10个磷酸二酯键(ISIS 4241))的均匀2’-脱氧寡核苷酸的活性。包含单一P=O的寡核苷酸具有与包含所有硫代磷酸酯键(均匀P=S寡核苷酸)的寡核苷酸恰好一样的活性，而包含10个P=O键的相同寡核苷酸则是完全无活性的。

制得SEQ ID NO:1的嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸，该寡核苷酸在7链节脱氧中央区(缺口)中具有硫代磷酸酯主链以及在侧翼区中具有磷酸二酯键(其或者是2’-O-甲基或者是2’-O-丙基取代的)。具有2’-O-丙基取代的磷酸二酯侧翼区的寡核苷酸能够抑制ras表达。实施例8解链曲线

利用Gilford 260分光光度计(与IBM PC计算机接口)和GilfordResponseⅡ分光光度计在260nm测量吸光度-温度曲线。缓冲液包含100mM Na⁺、10mM磷酸盐和0.1mM EDTA,pH7。寡核苷酸浓度是4μM，每一链由85℃下的吸光度测定，并按照Puglisi和Tinoco，酶学方法，1989,180,304-325计算消光系数。T_m值、双螺旋形成的自由能和缔合常数获自数据拟合(用线型斜率基线对一个二状态模型进行拟合)。Petersheim,M.和Turner,D.H.，生物化学，1983,22,256-263。所报道的参数是至少三个实验的平均值。对于一些寡核苷酸来说，双螺旋形成的自由能也获自T_m-log₁₀(浓度)图中。Borer,P.N.,Dengler,B.,Tinoco,I.,Jr.和Uhlenbeck,O.C.，分子生物学杂志，1974,86,843-853。实施例9ras反式激活报道基因系统

表达质粒pSV2-oli(在组成型SV40启动子的控制之下包含活化的(密码子12,GGC-＞GTC)H-ras cDNA插入片段)是来自Bruno Tocque博士(Rhone-Poulenc Sante,Vitry，法国)的礼物。将这一质粒用作为模板以便在类固醇诱导的小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子的调节之下构建(由PCR)H-ras表达质粒。为了获得H-ras编码序列，由PCR扩增H-ras基因的570bp编码区。用在它们的5’区中的独特的限制性内切核酸酶位点设计PCR引物以便有利于克隆。凝胶纯化、消化和在克隆之前再一次凝胶纯化包含H-ras密码子12突变癌基因的编码区的PCR产物。通过克隆插入表达质粒pMAMneo(Clontech Laboratories,CA)的插入片段完成这一构建。

ras效应报道基因pRDO53用于检测ras表达。Owen等，美国国家科学院院报，1990,87,3866-3870。实施例10体内ras表达的Northern印迹分析

人泌尿膀胱癌细胞系T24得自美国典型培养物保藏中心(RockvilleMD)。在McCoy的5A培养基(具有L-谷氨酰胺(Gibco BRL,GaithersburgMD)，补加10％的热灭活的胎牛血清和各为50U/mL的青霉素和链霉素)中培养细胞。将细胞接种在100mm平板上。当它们达到70％融合时，利用寡核苷酸处理它们。用10mL预热的PBS和5mL OptiMEM减少血清培养基(包含2.5μL DOTMA)洗涤平板。然后加入寡核苷酸至所需的浓度。在4小时的处理之后，以McCoy的培养基代替上述培养基。在寡核苷酸处理后48小时收获细胞，并利用标准的CsCl纯化方法分离RNA。Kingston,R.E.，分子生物学当前方案(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman和K.Strahl编著)，JohnWiley和Sons,NY。

人上皮样癌细胞系HeLa 229得自美国典型培养物保藏中心(Bethesda,MD)。在Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)(补加10％胎牛血清和100U/mL青霉素)中的6孔平板上维持HeLa细胞作为单分子层。利用寡核苷酸的处理和RNA的分离本质上如同以上描述的对T24细胞的操作一样。

Northern杂交：在1.2％琼脂糖/甲醛凝胶上电泳10μg的每种RNA,并且利用标准方法将其转移(一夜)到GeneBind 45尼龙膜(PharmaciaLKB,Piscataway,NJ)上。Kingston,R.E.，分子生物学当前方案(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman和K.Strahl编著)，John Wiley和Sons,NY。使RNA与膜UV交联。利用Prime(一种基因标记试剂盒(Promega,Madison WI))合成双链的³²P-标记的探针。ras探针是活化的(突变的)H-ras mRNA(在密码子12具有GGC-＞GTC突变)的cDNA克隆的SalI-NheⅠ片段。对照探针是G3PDH。在68℃下使印迹与QuickHyb杂交溶液(Stratagene,La Jolla,CA)预杂交15分钟。加入与100μl的10mg/mL鲑精DNA混合的热变性的放射性探针(2.5×10⁶计数/2mL杂交溶液)，并使膜在68℃下杂交1小时。在室温下在2×SSC/0.1％SDS中两次洗涤印迹15分钟，以及在60℃下用0.1XSSC/0.1％SDS一次洗涤印迹30分钟。使印迹放射自显影，并利用ImageQuant PhosphorImager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)量化信号的强度。首先使Northern印迹与ras探针杂交，然后通过在0.1×SSC/0.1％SDS中煮沸15分钟来剥离该印迹，并使之与对照G3PDH探针再杂交以检查是否正确加样。实施例11癌细胞的增殖的反义寡核苷酸抑制作用

基本上如实施例10所述用寡核苷酸培养和处理细胞。将细胞接种在60mm平板上，当它们达到70％融合时，在DOTMA存在的情况下利用寡核苷酸处理细胞。时间过程实验：在第1天，用终浓度为100nM的单一剂量的寡核苷酸处理细胞。在第3天更换生长培养基一次，同时利用计数室每天计算细胞数目，计数5天。剂量-反应实验：在细胞中加入各种浓度的寡核苷酸(10、25、50、100或者250nM)，并在其后的3天收获和计算细胞。检测寡核苷酸2570、3985和4690对T24癌细胞增殖的影响。实施例12嵌合的(带脱氧缺口的)2’-O-甲基寡核苷酸对PKC-αmRNA表达的抑制作用

合成具有SEQ ID NO:4的寡核苷酸作为均匀硫代磷酸酯嵌合的寡核苷酸(具有脱氧中央区或者不同长度的以2’-O-甲基取代的亚序列为侧翼的脱氧缺口)。由Northern印迹分析检测这些寡核苷酸(500nM浓度)对PKC-αmRNA水平的影响。在所有情况下，8个或者多个核苷的脱氧缺口引起PKC-αmRNA水平的最大限度降低(两个转录物)。具有4个核苷长度的脱氧缺口的这些寡核苷酸减少大约83％的PKC-αmRNA，具有6个或者多个核苷长度的脱氧缺口的上述寡核苷酸则几乎引起PKC-αmRNA的完全减少。

具有4链节或者6链节脱氧缺口的2’-O-甲基取代的嵌合寡核苷酸对于PKC-αmRNA减少具有200nM至250nM的IC₅₀(引起PKC-αmRNA水平减少50％所需要的寡核苷酸浓度)，如同均匀脱氧寡核苷酸一样(所有都是均匀硫代磷酸酯)。具有8链节脱氧缺口的2’-O-甲基取代的嵌合寡核苷酸具有大约85nM的IC₅₀。

比较这一嵌合寡核苷酸(SEQ.ID NO:4)的几个变体的降低PKC-αmRNA水平的能力。这些寡核苷酸显示在表5中。

表5

嵌合的2’-O-甲基/脱氧P=S寡核苷酸

粗体=2’-O-甲基；s=P=S键，o=P=O键寡核苷酸序列 SEQ ID NO:

3522 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 4

5352 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 4

6996 AoAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCoC 4

7008 AsAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCsC 4

7024 AsAoAoAoCoGsToCsAoGsCoCsAsTsGoGoToCoCsC 4

这些寡核苷酸对PKC-αmRNA水平的影响显示在图3中。寡核苷酸7008、3522和5352都显示出PKC-αmRNA的减少，其中5352具有最大活性。

合成一系列2’-O-丙基嵌合的寡核苷酸而使之具有SEQ ID NO:4。这些寡核苷酸显示在表6中。

表6

嵌合的2’-O-丙基/脱氧P=S寡核苷酸

粗体=2’-O-丙基；s=P=S键，o=P=O键寡核苷酸序列 SEQ ID NO:

7199 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 4

7273 AoAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCoC 4

7294 AsAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCsC 4

7295 AsAoAoAoCoGsToCsAoGsCoCsAsTsGoGoToCoCsC 4

比较这些2’-O-丙基取代的嵌合寡核苷酸与2’-O-甲基取代的嵌合寡核苷酸。在降低PKC-αmRNA水平方面，寡核苷酸7273和7294比它们的2’-O-甲基对应物具有更大活性。这一结果显示在图4和5中。实施例13降低PKC-αmRNA表达的附加寡核苷酸

设计和合成定向于人PKC-α3’非翻译区的附加的硫代磷酸酯寡核苷酸。这些序列显示在表7中。

表7

定向于PKC-α3’-UTR的嵌合的2’-O-丙基/脱氧P=S寡核苷酸

粗体=2’-O-丙基；s=P=S键，o=P=O键寡核苷酸序列 SEQ ID NO:

6632 TsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsC 5

6653 TsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsC 5

6665 ToToCoTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsToToToC 5

7082 TsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsC 6

7083 TsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsC 6

7084 ToCoToCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsToToToC 6

在降低PKC-αmRNA水平方面，寡核苷酸6632、6653、7082和7083都具有最大活性。实施例14具有SEQ ID NO:30的寡核苷酸对PKC-αmRNA水平的影响

在阳离子脂类DOTMA/DOPE存在的情况下用500nM硫代磷酸酯寡核苷酸处理A549细胞4小时，洗涤该细胞并使之再恢复20小时。提取全部RNA，同时在1.2％凝胶上分离每份20μg，并且将其转移到尼龙膜上。用³²P放射性标记的PKC-αcDNA探针探测这些印迹，然后剥离并用放射性标记的G3PDH探针再探测这些印迹以确认相等的RNA加样。每种寡核苷酸[3520(SEQ ID NO:31)、3521(SEQ ID NO:30)、3522(SEQ ID NO:4)以及3527(SEQ ID NO:32)]都是双份使用的。用PhosphorImager(Molecular Dynamics,Sunnyvale CA)检定和量化两种主要的PKC-α转录物(8.5kb和4.0kb)。ISIS 3521(SEQ ID NO:30)引起较小转录物减少大约80％和引起较大转录物减少90％以上。

合成具有SEQ ID NO:30和8链节脱氧中央区(其每侧为具有2′-OCH₂CH₂OCH₃修饰的核苷侧翼)的两种寡核苷酸。为了容易合成，最后的核苷是脱氧核苷。这些化合物(显示在表8中)的不同之处在于其中之一(ISIS 9606)具有均匀硫代磷酸酯主链，而另一化合物(ISIS 9605)在中央区(主链键7-14)中具有硫代磷酸酯主链以及在侧翼区中具有磷酸二酯主链。检测这些寡核苷酸的抑制PKC-αmRNA在A549细胞中表达的能力，并与硫代磷酸酯化合物(ISIS 3521)比较。结果显示在图6a和6b中。计算三种化合物的IC₅₀(产生50％抑制作用的寡核苷酸浓度)。硫代磷酸酯化合物(ISIS 3521)显示出大约170nM的IC₅₀。两种甲氧基乙氧基化合物(ISIS 9605和9606)显示出大约25nM的IC₅₀。具有甲氧基乙氧基修饰的化合物的效能的这种6-7倍增加表明了令人惊讶的活性。由于它们的极低IC₅₀，因此甲氧基乙氧基化合物9605和9606是优选的。

表8

具有SEQ ID NO:30的寡核苷酸

ISIS# 序列

3521 GsTsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsCsA

9605 GoToToCoToCsGsCsTsGsGsTsGsAsGoToToToCoA

9606 GsTsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsCsA12723 GoToToCoToCsGsCsTsGsGsTsGsAsGoToToToCoA粗体=2’-OCH₂CH₂OCH₃s=硫代磷酸酯(P=S)键o=磷酸二酯(P=O)键实施例152’-甲氧基乙氧基寡核苷酸ISIS 12723对人Colo-205结肠肿瘤在裸鼠中的生长的影响

通过在皮肤之下注射5×10⁶Colo-205细胞，实现在裸鼠中的皮下的人Colo-205结肠癌异种移植。用ISIS 12723(SEQ ID NO:30，一种具有8链节脱氧中央区(在其每侧为具有2’-OCH₂CH₂OCH₃修饰的6链节亚序列侧翼)、在中央区中具有硫代磷酸酯主链(主链键7-14)以及在侧翼区中具有磷酸二酯主链的寡核苷酸)或者ISIS 3521(SEQ ID NO:30，均匀脱氧硫代磷酸酯)处理小鼠，每天一次静脉内施用，剂量为0.006、0.06、0.6或者6.0mg/kg。在这一研究中，与盐水空白对照剂的对照相比，ISIS12723抑制肿瘤生长达95％以上(图7b)，与对照相比ISIS 3521抑制肿瘤生长达83％以上(图7a)。因此甲氧基乙氧基化合物ISIS 12723是优选的。实施例16嵌合寡核苷酸对c-raf表达的抑制作用

利用Genbank c-raf序列HUMRAFR(Genbank列表x03484)设计和合成具有SEQ ID NO:7的嵌合寡核苷酸，并利用Northern印迹分析检测其对c-rafmRNA在T24膀胱癌细胞中表达的抑制作用。这些嵌合寡核苷酸具有6、8或者10个脱氧核苷中央“缺口’’区(其以两个2’-O-甲基修饰的核苷区为侧翼)，并显示在表9中。主链是均匀硫代磷酸酯。如实施例20中所描述的，在Northern印迹分析中，所有这三种寡核苷酸(ISIS6720,6链节脱氧缺口；ISIS 6717,8链节脱氧缺口；ISIS 6729,10链节脱氧缺口)对c-rafmRNA在T24细胞中的表达都显示出大于70％的抑制作用。这些寡核苷酸是优选的。具有8链节脱氧缺口的寡核苷酸(6717)显示出大于90％的抑制作用因而是更优选的。

表9

嵌合的2’-O-甲基P=S脱氧“缺口”寡核苷酸

粗体=2’-O-甲基寡核苷酸序列靶位点 SEQ ID NO:6720 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3’UTR 76717 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3’UTR 76729 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3’UTR 7

合成附加的嵌合寡核苷酸而使之具有一或多个2’-O-甲基修饰区和均匀硫代磷酸酯主链。这些都显示在表10中。所有都是硫代磷酸酯；粗体区表示2’-O-甲基修饰区。

表10

嵌合的2’-O-甲基P=Sc-raf寡核苷酸寡核苷酸序列靶位点 SEQ ID NO: 7848 TCCTCCTCCCCGCGGCGGGT 5’UTR 87852 TCCTCCTCCCCGCGGCGGGT 5’UTR 87849 CTCGCCCGCTCCTCCTCCCC 5’UTR 97851 CTCGCCCGCTCCTCCTCCCC 5’UTR 97856 TTCTCGCCCGCTCCTCCTCC 5’UTR 107855 TTCTCGCCCGCTCCTCCTCC 5’UTR 107854 TTCTCCTCCTCCCCTGGCAG 3’UTR 117847 CTGGCTTCTCCTCCTCCCCT 3’UTR 127850 CTGGCTTCTCCTCCTCCCCT 3’UTR 127853 CCTGCTGGCTTCTCCTCCTC 3’UTR 139355 CGGGAGGCGGTCACATTCGG 5’UTR 19

当用Northern印迹分析检测ISIS 7848、7849、7851、7856、7855、7854、7847和7853抑制C-rafmRNA的能力时，它们都显示出大于70％的抑制作用，因而都是优选的。其中7851、7855、7847和7853显示出大于90％的抑制作用因而是更优选的。

制备和检测具有各种2’修饰的附加的嵌合寡核苷酸。这些显示在表11中。所有都是硫代磷酸酯；粗体区表示2’修饰区。

表11

嵌合的2’修饰P=S c-raf寡核苷酸寡核苷酸序列靶位点修饰 SEQ ID

NO:6720 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3’UTR 2’-O-甲基 76717 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3’UTR 2’-O-甲基 76729 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3’UTR 2’-O-甲基 78097 TCTGGCGCTGCACCACTCTC 3’UTR 2’-O-甲基 149270 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3’UTR 2’-O-丙基 79058 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3’UTR 2’-氟基 79057 TCTGGCGCTGCACCACTCTC 3’UTR 2’-氟基 14

其中，寡核苷酸6720、6717、6729、9720和9058是优选的。寡核苷酸6717、6729、9720和9058是更优选的。实施例17具有SEQ ID NO:7的2’-甲氧基乙氧基寡核苷酸对c-raf mRNA表达的影响

合成两种具有SEQ ID NO:7和包含2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分(其每侧为具有2’-O-CH₂-CH₂-O-CH₃修饰的6核苷单位亚序列侧翼)的中央8核苷单位亚序列的寡核苷酸。这些化合物的不同之处在于它们之一，ISIS 10755(也已知为CIBA 1440)具有均匀硫代磷酸酯主链；另一个，ISIS 10754(也已知为CIBA 1439或者CGP 69845)在中央区中具有硫代磷酸酯键(键7-14)以及在侧翼区中具有磷酸二酯键。检测这些寡核苷酸的抑制c-raf mRNA在T24细胞中表达的能力。计算IC₅₀(产生50％抑制作用的寡核苷酸浓度)，结果与T_m数据(显示这些寡核苷酸与其补体的亲和性)一同显示在表12中。由于它们的极低IC₅₀，因此ISIS 10755和ISIS10754是优选的。通过众所周知的固相合成技术可以方便地按常规制得按照本发明利用的寡核苷酸。(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。)用于这样合成的设备由包括Applied Biosystems的数个卖主出售。也可以使用用于这样合成的任何其它方法；上述寡核苷酸的实际合成完全属于本领域技术人员的技能之一。

表12

在T24细胞中的反义活性和T_mISIS# 修饰 T_m(℃) IC₅₀(nM)SEQ ID NO:5132 脱氧/P=S 62.2 125 710755 2’-O-CH₂CH₂OCH₃/P=S 76.1 20 710754 2’-O-CH₂CH₂OCH₃/P=S/P=O 77.5 20 7实施例18ISIS 5132和CGP 69845对A549人肺腺癌肿瘤的影响

在雄性Balb/c裸鼠中实现皮下的人A549肺腺癌异种移植，并用ISIS5132(SEQ ID NO:7)或者SEQ ID NO:7的甲氧基乙氧基(2’-O-CH₂-CH₂-O-CH₃)形式(CGP 69845)进行处理，两者都是每日以静脉注射方式施用，用药剂量变化于0.006至6.0mg/kg之间。在所有剂量下ISIS 5132都以依赖剂量的方式减少肿瘤的大小，结果如图6a和6b所示。甲氧基乙氧基(2’-O-CH₂-CH₂-O-CH₃)寡核苷酸(CGP 69845)在低剂量下具有与ISIS 5132类似的影响，甚至在6.0mg/kg的剂量下具有比ISIS 5132大的抑制作用。实施例19A549异种移植

在裸鼠的大腿内以皮下方式植入5×10⁶个A549细胞。每日一次由静脉注射施用悬浮在盐水中的寡核苷酸(ISIS 5132和CGP 69845，也已知为ISIS 10754)，用药剂量为0.006至6.0mg/kg。在第9、12、17和21天测量所产生的肿瘤，并计算肿瘤体积。实施例20c-raf mRNA表达的抑制作用的Northern印迹分析

人泌尿膀胱癌细胞系T24得自美国典型培养物保藏中心(RockvilleMD)。使细胞生长在具有L-谷氨酰胺(Gibco BRL,Gaithersburg MD)的McCoy的5A培养基(补加有10％热灭活胎牛血清以及各50U/mL的青霉素和链霉素)中。将细胞接种在100mm平板上。当它们达到70％融合时，用寡核苷酸处理它们。用10mL预热的PBS和5mL OptiMEM减少的血清培养基(包含2.5μL DOTMA)洗涤平板。然后加入具有Lipofectin的寡核苷酸至所需的浓度。在4小时处理之后，用McCoy的培养基替换上述培养基。在寡核苷酸处理后24至72小时收获细胞，并利用标准CsCl纯化方法分离RNA。Kingston,R.E.,分子生物学当前方案(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman和K.Strahl编著)，John Wiley和Sons,NY。通过于CsCl垫层上离心细胞溶解产物分离全部RNA。通过1.2％琼脂糖-甲醛凝胶电泳RNA样品，并由毛细管扩散将其转移到杂交膜上(历时12-14小时)。在Stratalinker(Stratagene,La Jolla,CA)中通过暴露于紫外光下使RNA与膜交联，并使之与随机引发的³²P标记的c-rafcDNA探针(得自ATCC)或者作为对照的G3PDH探针杂交。利用PhosphorImager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)量化RNA。实施例21Rev基因表达的寡核苷酸抑制作用

用于这一分析的嵌合寡核苷酸显示在下列的表13中。

表13

定向于HIV rev基因的嵌合的2’-O-丙基/脱氧P=S寡核苷酸

粗体=2’-O-丙基；s=P=S键；o=P=O键寡核苷酸序列 SEQ.ID NO:8907 UoAoGoGoAoGoAsUsGsCsCsUsAsAoGoGoCoUoUoU 208908 GoCoUoAoUoGoUsCsGsAsCsAsCsCoCoAoAoUoUoC 218909 CoAoUoAoGoGoAsGsAsUsGsCsCsUoAoAoGoGoCoT 22

转染和萤光素酶测定：使3T3细胞维持在具有葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和10％胎牛血清(GIBCO)的DMEM中。对于所有实验，都在前一天晚上以75,000个细胞/孔将细胞接种于6孔平板(Falcon)中。利用标准CaPO₄方法完成转染。对于每组平行实验，沉淀15μg/mL的pSG5/rev质粒、18μg/mL pHIVenu-luc以及2μg/mL Rep6，并将200μL此沉淀物滴在每一孔上。在37℃下使沉淀物在细胞上培养7小时。然后吸出培养基，用PBS洗涤细胞一次，并加入新鲜的完全培养基用于一夜培养。在培养之后，除去培养基，用2mL OPTIMEM(GIBCO)和1mL包含2.5μg/mL Lipofectin(GIBCO-BRL)的OPTIMEM洗涤细胞，并加入寡核苷酸。在37℃下培养上述混合物4小时，此时自细胞中吸出上述混合物并加入完全培养基。在这一处理后两小时，在所有孔中加入0.2μM/mL地塞米松(Sigma)以使得pHIVenu-luc的MMTV启动子可以诱导。

24小时后进行萤光素酶分析，具体步骤如下：用PBS洗涤孔两次，并通过在200μL裂解缓冲液(1％曲通、25mM N-甘氨酰甘氨酸、pH7.8、15mM MgSO₄、4mM EGTA和1mM DTT)中的刮削(scraping)来收获细胞。通过5分钟的、11,500rpm的、低温下的微量离心(microfuging)来澄清上述裂解物。然后在微量滴定板中将100μL裂解物与50μL分析缓冲液(25mM N-甘氨酰甘氨酸、pH7.8、15mMMgSO4、4mM EGTA、15mM磷酸钾、pH7.8、1mM DTT以及7.5mMATP)混合。利用微量滴定发光读数器(Dynatech Laboratories)进行Luc检测。通过注射50μL 1X萤光素酶溶液(Sigma)开始反应。从10X贮存物(在10mM DTT中的10mM萤光素)，在使用前用萤光素缓冲液(25mM N-甘氨酰甘氨酸、pH7.8、15mM MgSO₄、4mM EGTA和4mMDTT)稀释上述1X溶液。计数样品20秒。萤火虫Luc光发射的动力学的特点为持续几秒的闪光期，其后为持续几分钟的更低光强发射期。

Rev和RRE RNA合成：pSG％-Rev包含与T7启动子相邻的Rev基因。BgⅢ线性化的pSG5-Rev用作为转录(利用T7 RNA聚合酶)的DNA模板。用于产生RRE RNA的模板由PCR产生。对于RNA合成，以0.2至1.0mg/mL浓度(具有各为5mM ATP、CTP和GTP,0.5mMUTP,10mM DTT,40mM Tris-HCl,pH7.5,6mM MgCl₂,4mM亚精胺，500U/mL在20U/μL下的RNAsin,2500μCi/mL在10μCi/mL下的α³²P UTP和1000U/mL T7 RNA聚合酶)利用DNA模板。在37℃下培养上述反应1小时。通过加入甲酰胺加样缓冲液终止转录反应，并且在包含8M尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行该反应。按照Schwartz等(基因，1990,88,197)的方法从凝胶上洗脱RNA。实施例22抗病毒筛选的免疫测定

将NHDF细胞以15,000个细胞/孔(在无血清FGM中)的密度接种在96孔培养平板中。在感染之前，用寡核苷酸在FGM中预处理所建立的单分子层一夜。在预处理之后，用新鲜的、预热的FGM冲洗细胞三次，在100μL FGM/孔中加入病毒以便产生0.05PFU/细胞的MOI。在37℃下培养2小时之后，除去病毒，同时加入包含寡核苷酸的新鲜培养基(100μL/孔)。在感染后2天用包含寡核苷酸的新鲜培养基交换培养基，在感染后6天将细胞固定在无水乙醇中，并且使之在抗体染色的制备中干燥。将一个改进的方案用于一些测定(其中FGM补加有低水平的FBS(0.2％))，并将感染之后的培养期从6天缩短为3天。更短的测定消除了感染之后2天交换培养基的必需性。两种测定都为50％有效浓度(EC50s)产生了可比值。

在包含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中封阻固定的细胞，并且在PBS-1％BSA中以1∶2000稀释度加入小鼠单克隆抗体(1H10，由EisaiCo.,Ltd.，日本供给)。1H10抗体识别高丰度的大约65kDa大小的晚期HCMV多肽。用生物素酰化的山羊抗小鼠免疫球蛋白G abd链霉亲和素偶联的β-半乳糖苷酶(GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD)使结合的单克隆抗体的检测变得更为方便。将氯酚红β-D-吡喃半乳糖苷用作为半乳糖苷酶的底物，通过用BioTex EL312e型微型平板读数器测量个体孔的575nm的光密度来测定活性。

用于这一测定中的寡核苷酸显示在下列的表14中。

表14

嵌合的2’-O-甲基P=S寡核苷酸对CMV复制的抑制作用

粗体=2’-O-甲基寡核苷酸序列 SEQ ID NO:4325 GCG UUT GCT CTT CTT CUU GCG 234326 GCG UUU GCT CTT CTU CUU GCG 24实施例23在HCV H8Ad17蛋白质测定中的寡核苷酸270和330的评估

开发了一种使用亲和性纯化的人多克隆抗HCV血清和¹²⁵I结合的山羊抗人IgG的Western印迹分析以替代以前用来评价寡核苷酸对HCV核心蛋白质水平的影响的ELISA分析。用H8细胞以3.5×10⁵个细胞/孔接种六孔平板。使细胞生长一夜。在包含5μg/mL Lipofectin的Optimem中用寡核苷酸处理细胞4小时。用2mL H8培养基饲养细胞，并使之恢复一夜。为了收获细胞，用2mLPBS(溶解在100μL Laemmli缓冲液中)洗涤细胞一次，并且通过刮削收获细胞。对于电泳，煮沸细胞溶解产物，同时将10-14μL细胞裂解物加样在16％聚丙烯酰胺凝胶的每一条泳道上。在电泳之后，将蛋白质以电泳方式转移到PVDF膜上。将膜封阻在包含2％山羊血清和0.3％Tween-20的PBS中，同时用一级抗体(人抗核心抗体2243和野兔抗G3PDH抗体)培养一夜，在缓冲液中洗涤膜5×5分钟，然后用二级抗体(¹²⁵结合的山羊抗人抗体和¹²⁵I结合的山羊抗野兔抗体)培养4-8小时。在缓冲液中洗涤膜5×5分钟，用塑料密封，并在PhosphorImager暗盒中暴光一夜。在PhosphorImager(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)上量化带，使之标准化至G3 PDH表达水平，同时结果以未处理的对照细胞的百分比绘制成图。

由这一Western印迹分析评估的寡核苷酸显示在表15中。在所显示的序列中，大写字母表示碱基序列，小写字母(o或者s)表示核苷间连键，分别为磷酸二酯(P=O)或者硫代磷酸酯(P=S)。粗体=2’-O-丙基。*=2’-O-丁基咪唑。+=2’-O-丙胺。

表15寡核苷酸# 序列 SEQ ID NO:270A GsTsAsCsCsAsCsAsAsGsGsCsCsTsTsTsCsGsCsG 25270B GsTsAsCsCsAsCsAsAsGsGsCsCsTsTsTsCsGsCsG 25

** **270C GoToAoCoCoAoCoAoAoGoGoCoCoToToToCoGoCoG 25

++ ++270D GoToAoCoCoAoCoAoAoGoGoCoCoToToToCoGoCoG 25330A GsTsGsCsTsCsAsTsGsGsTsGsCsAsCsGsGsTsCsT 26330B GsTsGsCsTsCsAsTsGsGsTsGsCsAsCsGsGsTsCsT 26

** **330C GoToGoCoToCoAoToGoGoToGoCoAoCoGoGoToCoT 26

++ ++330D GoToGoCoToCoAoToGoGoToGoCoAoCoGoGoToCoT 26实施例242,6-二氨基-9-(2-O-十八烷基-β-D-呋喃核糖基)嘌呤的合成

将2,6-二氨基-9-(β-D-呋喃核糖基)嘌呤(50g,180mmol)和氢化钠(7g)在DMF(1L)中加热至煮沸并沸腾2小时。在150℃下加入碘十八烷(100g)并使反应混合物冷却至RT。在RT下搅拌上述反应混合物11天。蒸发溶剂并由硅胶色谱法纯化残渣。用5％MeOH/CH₂Cl₂洗脱产物。蒸发适当的组分以产生产物(11g)。¹H NMR(DMSO-d₆)δ0.84(t,3,CH₂)；1.22(m,32,O-CH₂-CH₂-(CH₂)₁₆)；1.86(m,2,O-CH₂CH₂)；3.25(m,2,O-CH₂)；3.93(d,1,4’H),4.25(m,1,3’H)；4.38(t,1,2’H)；5.08(d,1,3’-OH)；5.48(t,1,5’-OH)；5.75(s,2,6-NH₂)；5.84(d,1,1’-H)；6.8(s,2,2-NH₂)；以及7.95(s,1,8-H)。实施例252’-O-十八烷基鸟苷的合成

在RT下用腺苷脱氨酶(1.5g)处理在0.1M磷酸钠缓冲液(50mL,pH7.4)、0.1M Tris缓冲液(1000mL,pH7.4)和DMSO(1000mL)中的2,6-二氨基-9-(2-O-十八烷基-β-D-呋喃核糖基)嘌呤(10g)。在第3天、第5天和第7天加入附加份量(分别为500mg、880mg和200mg)的腺苷脱氨酶。搅拌反应总计9天,并由硅胶色谱法的纯化产生产物(2g)。一种分析样品自重结晶而得。MeOH ¹H NMR(DMSO-d₆)δ0.84(t,3,CH₃),1.22[s,32,O-CH₂-CH₂-(CH₂)₁₆],5.07(m,2,3’-OH和5’-OH)；5.78(d,1,1’-H)；6.43(s,2,NH₂),7.97(s,1,8-H)和10.64(s,1,NH₂)C₂₈H₄₉N₅O₅的分析计算值：C,62.80；H,9.16；N,12.95。实测值：C,62.54；H,9.18；N,12.95。实施例26N2-异丁酰-2’-O-十八烷基鸟苷的合成

使在吡啶(150mL)中的2’-O-十八烷基鸟苷(1.9g)在冰浴中冷却，并且用三甲基甲硅烷基氯化物(2g,5当量)和异丁酰氯化物(2g,5当量)处理。搅拌反应混合物4小时，在此期间使之加热至室温。冷却溶液，加水10mL，并再搅拌30分钟。加入浓缩的氨水(10mL)，并在真空下浓缩上述溶液。由硅胶色谱法(用3％MeOH/EtOAc洗脱)纯化残渣从而产生1.2g的产物。¹H NMR(DMSO-d₆),δ0.85(t,3,CH₃),1.15(m,38,O-CH₂CH₂(CH₂)₁₆,CH(CH₃)₂),2.77(m,1,CH(CH₃)₂,4.25(m,2,2’-H和3’-H)；5.08(t,1,5’-OH),5.12(d,1,3′-OH),5.87(d,1,1’-H),8.27(s,1,8-H),11.68(s,1,NH₂)和12.08(s,1,NH₂)。C₃₂H₅₅N₅O₆的分析计算值：C,63.47；H,9.09；N,11.57。实测值：C,63.53；H,9.20；N,11.52。在把这一产物掺入寡核苷酸之前，按照国际公开号WO94/02501(1994年2月3日公开)所描述的方法将该产物转变为N²-异丁酰-5′-二甲氧基三苯甲基-2’-O-十八烷基鸟苷，然后转变为亚磷酰胺。实施例27用于mRNA超表达的检测的诊断测定

在合成之后通过用多核苷酸激酶在5’末端进行³²P标记来放射性标记寡核苷酸。Sambrook等[“分子克隆，实验室手册”，冷泉港实验室出版社，1989，第2卷，pg.11.31-11.32]。在能够发生特异性杂交的条件下使放射性标记的寡核苷酸与怀疑有mRNA超表达的组织或者细胞样品(如来源于患者的样品)相接触，同时洗涤样品以除去未结合的寡核苷酸。维持一种类似的对照，其中在使得特异性杂交可以发生的条件下使放射性标记的寡核苷酸与正常细胞或者组织样品相接触，并洗涤样品以除去未结合的寡核苷酸。在样品中残留的放射性表明结合的寡核苷酸的存在，并利用闪烁计数器或者其它常规方法进行量化。在得自正常和病变细胞的样品中残留的放射性的比较表明存在mRNA的超表达。

本发明的放射性标记的寡核苷酸也有用于放射自显影术。利用放射性标记的寡核苷酸处理组织切片，并如同以上描述一样洗涤该组织切片，然后按照标准的放射自显影术方法使之暴露于照相乳胶。也维持一个利用正常细胞或者组织样品的对照。当被显影时，乳剂在将要量化的超表达mRNA的区上产生银粒图象。通过用正常细胞与病变细胞所观察到的银粒的比较来测定mRNA超表达的程度。

用于mRNA表达的荧光检测的类似分析利用本发明的寡核苷酸，该寡核苷酸用荧光素或者其它荧光标记标记。利用具有碘氧化的标准亚磷酰胺化学在自动DNA合成仪(Appliced Biosystems Model 380B)上合成标记的DNA寡核苷酸。β-氰乙基二异丙基亚磷酰胺购自Applied Biosystems(Forster City,CA)。荧光素标记的亚酰胺化物购自Glen Research(Sterling,VA)。如同用于放射性标记寡核苷酸的方法所描述的一样(除利用荧光显微镜代替闪烁计数器来检测荧光外)进行寡核苷酸和生物样品的培养。在正常和病变细胞的样品中所观察到的荧光的比较使mRNA超表达的检测能够进行。实施例28反常mRNA表达的检测

用第一³²P或者荧光素标记的寡核苷酸(其定向于野生型(正常)mRNA)培养怀疑有反常mRNA表达的组织或者细胞样品。在特异性杂交能够发生的条件下用第二标记的寡核苷酸(其定向于反常mRNA)培养细胞或者组织的同一样品，洗涤样品以除去未结合的寡核苷酸。上述样品中残留的标记表明存在结合的寡核苷酸，同时可以利用闪烁计数器、荧光计或者其它常规方法量化该标记。如果在第二而非第一样品的情况下观察到结合，那么表明存在反常mRNA。

双重标记也能够与特异地检测反常mRNA表达的本发明的寡核苷酸和方法一起利用。在特异性杂交能够发生的条件下，用第一32P标记的寡核苷酸(其定向于野生型mRNA)和第二荧光素标记的寡核苷酸(其定向于反常mRNA)培养单一组织样品。洗涤样品以除去未结合的寡核苷酸，并由闪烁计数和荧光测定法检测上述标记。如果样品没有结合32P标记的寡核苷酸(即不是放射性的)但是确实维持有荧光标记(即是荧光的)，那么表明存在反常mRNA。实施例29在小鼠中的寡核苷酸的血浆吸收和组织分布

制备下列寡核苷酸：UsGsCsAsTsCsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT,SEQ ID NO:27UsGsCsAsTsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT,SEQ ID NO:27UsGsCsAsTsCsCCCCAGGCsCsAsCsCsAsT,SEQ ID NO:27

其中粗体类型表示2’-O-丙基取代基，“s”表示硫代磷酸酯键合，“s”的缺乏表示在各自的寡核苷酸中的磷酸二酯键。第一种寡核苷酸鉴定为ISIS 3082，第二种为ISIS 9045，第三种为ISIS 9046，显示在图9、10、11和12中。如同Graham等，核酸研究，1993,16,3737-3743的方法一样，氚化寡核苷酸。

动物和实验方法：对于所研究的每一寡核苷酸，随机地分配二十只重约25g的雄性Balb/c小鼠(Charles River)到四组处理之一中。在一周驯化之后，小鼠接收³H放射性标记的寡核苷酸(大约750nmoles/kg；变化于124-170μCi/kg)的单一尾静脉注射(在磷酸盐缓冲的盐水(pH7.0)中施用)。在上述剂量溶液中的寡核苷酸浓度是大约60μM。从每一组中收集眼窝后流血(以0.25、0.5、2或者4小时后剂量)和末端流血(1、3、8或者24小时后剂量)。在氯胺酮/赛拉嗪麻醉以后通过心脏穿刺来收集末端流血。保存一小份的每一种血液样品用于放射性测定，并将余下的血液转移到涂布EDTA的收集管中并经离心获得血浆。以一定时间间隔(0-4、4-8和8-24小时)从上述组(终止在24小时)中收集尿和粪便。

终止时，从每一只小鼠中收集肝、肾、脾、肺、心脏、脑、骨胳肌肉样品、部分小肠、皮肤样品、胰腺、骨(包含骨髓的两股骨)和两个淋巴结并称其重量。称重粪便，然后利用Brinkmann Polytron匀化器(Westbury,NY)使之以1∶1比例与蒸馏水均匀混合。分离血浆、组织、尿以及粪便匀浆用于利用燃烧的放射性分析和完整的寡核苷酸含量的测定。在收集之后所有样品立即冻结在干冰上并存储在-80℃下直到分析。

在血浆、组织以及排泄物中的放射性的分析：将血浆和尿样品直接称重至闪烁药水瓶中，并在加入15mL BetaBlend(ICN Biomedicals,CostaMesa,CA)之后由液体闪烁计数直接分析该样品。将所有其它样品(组织、血液和匀化的粪便)称重至燃烧舟皿中，并在Biological MaterialsOxidizer(Model OX-100；R.J.Harvey Instrument Corp.,Hillsdale,NJ)中氧化该样品。在20mL混合物(由15mL BetaBlend和5mL Harvey氚混合物(R.J.Harvey Instrument Corp.,Hillsdale,NJ)组成)中收集³H₂O。每日通过燃烧掺加有³H-甘露糖醇溶液的样品来测定燃烧效率，该燃烧效率变化于73.9-88.3％之间。利用Beckman LS 9800或者LS 6500液态闪烁系统(Beckman Instruments,Fullerton,CA)进行液体闪烁计数。用自动淬灭校正计数样品10分钟。将每分钟蜕变值校正为燃烧方法的效率。

数据的分析：将在样品中的放射性表达为每克样品每分钟蜕变值。这些值由放射性标记的比活性划分以便以每克样品的总寡核苷酸的纳摩尔当量表达数据，然后将其换算成每一器官或者组织的施用剂量的百分率。假设组织密度为1g/mL，则将nmole/g数据转变成总μM浓度。为了计算在每个时间点在血浆、肝或者肾中的完整的寡核苷酸的浓度，平均的总μM浓度除以完整的寡核苷酸在剂量溶液中的百分率(82-97％)，再乘以在每个时间点完整的寡核苷酸的平均百分率(由CGE或者KPLC测定)。然后将这一数据用于由线性回归计算组织的半衰期，并比较不同修饰的寡核苷酸的血浆药动学。利用PCNONLN 4.0(Statistical Consultants,Inc.,Apex,NC)测定药动学参数。在数据的检查之后，选用单区室团状输入、一级输出模型(文库模型1)。

以图表在图9、10、11和12中说明动物血浆吸收与组织分布检测的结果。如在图9中所看见的，在整个二十四小时的检测时期内每种检测寡核苷酸的血浆浓度从初始注射水平降低至较低水平。本发明的寡核苷酸的血浆浓度维持在相当于那些非结合的携带硫代磷酸酯的寡核苷酸的血浆水平。如在图10、11和12中所显示的，从血浆吸收所有检测化合物至组织中。本发明的化合物在各种组织之间有不同的分布。图10显示对照寡核苷酸(鉴定为ISIS 3082，一种硫代磷酸酯寡核苷酸)的分布模式。图11显示本发明的第一种化合物(一种在每一核苷上具有2’-取代基的寡核苷酸，鉴定为ISIS 9045)的分布模式。图12显示本发明的另一种化合物(一种“带缺口的”寡核苷酸，鉴定为ISIS 9046，其在寡核苷酸的“侧翼”区段的每一核苷上具有2’-取代基和磷酸二酯键以及在中央或者缺口区具有2’-脱氧的硫代磷酸酯核苷)的分布模式。实施例302,2’-脱水[1-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿苷]

在DMF(300mL)中加入5-甲基尿苷(核糖基胸腺嘧啶，通过Yamasa,Choshi，日本市售的)(72.0g,0.279M)，二苯基碳酸酯(90.0g,0.420M)和碳酸氢钠(2.0g,0.024M)。随着搅拌，加热混合物至回流，使所放出的二氧化碳气体以一种控制的方式释放。在1小时之后，在减压下浓缩稍稍变暗的溶液。将所产生的糖浆倒入乙醚(2.5L)，并不断搅拌。产物形成树胶。倾析出醚，并使残渣溶解在最小量的甲醇(大约400mL)中。将上述溶液倒入新鲜的乙醚(2.5L)中从而产生稠厚的树胶。倾析出醚，并在真空烘箱(60℃,1mm Hg,24小时)中干燥树胶从而给出粉碎成淡黄褐色粉状(57g,85％粗产率)的固体。NMR光谱与为苯酚所污染的结构(作为它的钠盐(大约5％))是一致的。将上述材料用于进一步的反应(或者利用在乙酸乙酯中的甲醇梯度(10-25％)由柱色谱法能够进一步纯化上述材料从而给出一种白色固体，熔点222-4℃)实施例312’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷

在2L不锈钢压力容器中加入2,2’-脱水-5-甲基尿苷(195g,0.81M)、三(2-甲氧基乙基)硼酸盐(231g,0.98M)和2-甲氧基乙醇(1.2L)，并将其放置在预热的160℃油浴中。在155-160℃下加热48小时之后，打开容器，同时将溶液蒸发至干燥并用MeOH(200mL)研磨。使残渣悬浮在热丙酮(1L)中。过滤不溶盐，用丙酮(150mL)洗涤并蒸发上述滤液。将残渣(280g)溶解在CH₃CN(600mL)中并蒸发。用包含0.5％Et₃NH的CH₂Cl₂/丙酮/MeOH(20∶5∶3)装填硅胶柱(3kg)。将残渣溶解在CH₂Cl₂(250mL)中，并使之在装填到柱上之前吸附在二氧化硅(150g)上。用填充溶剂洗脱上述产物从而产生160g(63％)产物。通过再次加工不纯组分获得附加的材料。实施例322’-O-甲氧基乙基-5'-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷

用吡啶(250mL)蒸发2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(160g,0.506M)，并在吡啶中溶解所干燥的残渣(1.3L)。加入第一小份二甲氧基三苯甲基氯(94.3g,0.278M)，并在室温下搅拌上述混合物一小时。加入第二小份二甲氧基三苯甲基氯(94.3g,0.278M)，并再搅拌上述反应一小时。然后加入甲醇(170mL)以停止反应。HPLC显示大约70％产物的存在。蒸发溶剂，并用CH₃CN(200mL)研磨。将残渣溶解在CHCl₃(1.5L)中，并用2×500mL饱和NaHCO₃和2×500mL饱和NaCl提取。在Na₂SO₄上干燥有机相，过滤并蒸发。获得275g残渣。在3.5kg硅胶柱上纯化上述残渣，装填并用包含0.5％Et₃NH的EtOAc/己烷/丙酮(5∶5∶1)洗脱。蒸发上述纯组分以给出164g产物。从不纯组分中获得大约20g附加产物以给出183g(57％)总产物。实施例333’-O-乙酰-2'-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷

在室温下混合和搅拌2′-O-甲氧基乙基-5′-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷(106g,0.167M)、DMF/吡啶(750mL从562mL DMF和188mL吡啶制备的3∶1混合物)和乙酸酐(24.38mL,0.258M)24小时。通过首先由MeOH的加入淬灭薄层色谱法样品，由薄层色谱法监控上述反应。当上述反应完成时(如以薄层色谱法判断)，加入MeOH(50mL)并在35℃下蒸发上述混合物。将残渣溶解在CHCl₃(800mL)中，并用2×200mL饱和NaHCO₃和2×200mL饱和NaCl提取。用200ml CHCl₃反萃取水相。用硫酸钠干燥合并的有机物，并蒸发从而给出122g残渣(大约90％产物)。在3.5kg硅胶柱上纯化残渣并利用EtOAc/己烷(4∶1)洗脱。蒸发上述纯产物组分从而产生96g(84％)产物。从后一组分中回收附加的1.5g产物。实施例343’-O-乙酰-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基-4-三唑尿苷

通过在CH₃CN(700mL)中溶解3’-O-乙酰-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷(96g,0.144M)来制备第一种溶液并将其放在一边。在CH₃CN(1L)的三唑(90g,1.3M)溶液中加入三乙胺(189mL,1.44M)，冷却至-5℃，并利用塔顶搅拌器搅拌0.5小时。滴加POCl₃(历时30分钟)至维持在0-10℃之间的搅拌的溶液中，将所产生的混合物再搅拌2小时。滴加第一种溶液(历时45分钟)至后一种溶液中。使所产生的反应混合物在冷室中存储一夜。从上述反应混合物中过滤出盐，并蒸发溶液。使残渣溶解在EtOAc(1L)中，通过过滤除去不溶固体。用1×300mL NaHCO₃和2×300mL饱和NaCl洗涤滤液，在硫酸钠上干燥滤液并蒸发。用EtOAc研磨残渣以给出上述标题化合物。实施例352′-O-甲氧基乙基-5′-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷

在室温下搅拌在二噁烷(500mL)和NH₄OH(30mL)中的3’-O-乙酰-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基-4-三唑尿苷(103g,0.141M)的溶液2小时。蒸发二噁烷溶液，并使残渣与MeOH(2×200mL)共沸。使残渣溶解在MeOH(300mL)中，并将其转移到一个2升不锈钢压力容器中。加入以NH₃气体饱和的MeOH(400mL)，并加热容器至100℃并维持2小时(薄层色谱法显示出完全转变)。蒸发容器内含物至干，同时使残渣溶解在EtOAc(500mL)中，并用饱和NaCl(200mL)洗涤一次。在硫酸钠上干燥有机物，并蒸发溶剂以给出85g(95％)上述标题化合物。实施例36N⁴-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷

将2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷(85g,0.134M)溶解在DMF(800mL)中并随着搅拌加入苯甲酸酐(37.2,0.165M)。在搅拌3小时之后，薄层色谱法显示反应完成大约95％。蒸发溶剂，并使残渣与MeOH(200mL)共沸。将残渣溶解在CHCl₃(700mL)中并用饱和NaHCO₃(2×300mL)和饱和NaCl(2×300mL)提取，在MgSO₄上干燥提取物并蒸发以给出残渣(96g)。利用包含0.5％Et₃NH作为洗脱溶剂的EtOAc/己烷(1∶1)在1.5kg二氧化硅柱上用色谱法纯化残渣。蒸发纯产物组分以给出90g(90％)上述标题化合物。实施例37N⁴-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷-3-亚酰胺化物

将N⁴-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷(74g,0.10M)溶解在CH₂Cl₂(1L)中。在氮气环境下，随着搅拌加入四唑二异丙胺(7.1g)和2’-氰乙氧基-四(异丙基)亚磷酸酯(40.5mL,0.123M)。在室温下将所产生的混合物搅拌20小时(薄层色谱法显示反应完成95％)。用饱和NaHCO₃(1×300mL)和饱和NaCl(3×300mL)提取上述反应混合物。用CH₂CL₂(300mL)反萃取上述含水洗涤物，同时混合上述提取物，在MgSO₄上干燥并浓缩该提取物。利用作为洗脱溶剂的EtOAc/己烷(3∶1)在1.5kg二氧化硅柱上用色谱法纯化所获得的残渣。混合纯组分以给出90.6g(87％)上述标题化合物。

序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：ISIS药物公司和Novartis AG

(ⅱ)发明名称：糖修饰的缺口寡核苷酸

(ⅲ)序列数：32

(ⅳ)通讯地址：

(A)收信人：Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz&Norris

(B)街道：One Liberty Place-46th Floor

(C)城市：费城

(D)州：宾西法尼亚

(E)国家：美国

(F)ZIP:19103

(ⅴ)计算机可读形式：

(A)介质类型：3.5英寸盘，720Kb

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：5.1 WordPerfect

(ⅵ)当前申请的数据：

(A)申请号：N/A

(B)申请日：与此一道

(C)分类号：N/A

(ⅶ)在先申请的数据：

(A)申请号：60,011,620

(B)申请日：1996年2月14日

(ⅷ)律师/代理人信息：

(A)姓名：Joseph Lucci

(B)注册号：33,307

(C)证书号：

(ⅸ)电讯信息：

(A)电话：215-568-3100

(B)传真：215-568-3439(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：17个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：18个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：17个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

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(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：47个碱基

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：否

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29个碱基

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：35个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：否

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：33个碱基

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：18个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：21个碱基

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：21个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅳ)反义：是

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：16个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：19个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

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(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32:GAGACCCTGA ACAGTTGATC

Claims

1．一种可特异地与包含以共价键结合的核苷单位的线型序列的DNA或者RNA杂交的寡核苷酸，其中：

所说的序列包含具有2’-O-CH₂-CH₂-O-CH₂糖组分的第一核苷亚序列和具有2’-脱氧糖组分的第二核苷亚序列；并且

所说的第一和第二亚序列的核苷单位是由磷酸二酯或者硫代磷酸酯键共价结合的。

2．权利要求1的寡核苷酸，其中所说的第一和第二亚序列的所说核苷单位是由硫代磷酸酯键共价结合的。

3．权利要求1的寡核苷酸，其中所说的第一亚序列的所说核苷单位是由磷酸二酯键共价结合的，并且所说的第二亚序列的所说核苷单位是由硫代磷酸酯键共价结合的。

4．权利要求1的寡核苷酸，其中所说的第一亚序列的所说核苷单位是由硫代磷酸酯键共价结合的，并且所说的第二亚序列的所说核苷单位是由磷酸二酯键共价结合的。

5．权利要求1的寡核苷酸，其中所说的第二亚序列包含至少三个核苷单位。

6．权利要求1的寡核苷酸，其中所说的第二亚序列包含至少五个核苷单位。

7．权利要求1的寡核苷酸，该寡核苷酸具有5至50个核苷单位。

8．权利要求1的寡核苷酸，该寡核苷酸还包含具有2’-O-CH₂-CH₂-O-CH₃糖组分的第三核苷亚序列，其中所说的第二亚序列位于所说的第一和第三亚序列之间。

9．权利要求8的寡核苷酸，其中所说的第一、第二和第三亚序列的所说核苷单位是由硫代磷酸酯键共价结合的。

10．权利要求8的寡核苷酸，其中所说的第一和第三亚序列的所说核苷单位是由磷酸二酯键共价结合的，并且所说的第二亚序列的所说核苷单位是由硫代磷酸酯键共价结合的。

11．权利要求8的寡核苷酸，其中所说的第一和第三亚序列的所说核苷单位是由硫代磷酸酯键共价结合的，并且所说的第二亚序列的所说核苷单位是由磷酸二酯键共价结合的。

12．权利要求8的寡核苷酸，其中所说的第二亚序列包含至少三个核苷单位。

13．权利要求8的寡核苷酸，其中所说的第二亚序列包含至少五个核苷单位。

14．权利要求8的寡核苷酸，该寡核苷酸具有5至50个核苷单位。