CN1227025C - 改进的加工活化c蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明广义上涉及在加工和纯化期间使活化C蛋白自降解减少的方法。本发明提供活化C蛋白水溶液和加工这类溶液的改进方法，该方法包括在高于150mM的离子强度和约5.5至低于6.3的pH下进行这种加工。

Description

改进的加工活化C蛋白的方法
                   优先权
本发明要求于1997年4月28日申请的美国临时申请第60/045,255号的权益。
                     发明领域
本发明广义上涉及在加工和纯化期间使活化C蛋白自降解减少的方法。
                     发明背景
C蛋白是一种丝氨酸蛋白酶，为天然存在的抗凝剂，它在凝血级联中通过使因子Va和VIIIa失活而调节体内稳态方面起作用。人的C蛋白在体内最初在肝脏中作为461个氨基酸的单一多肽制备。这种前体分子经受了多步翻译后修饰，包括1)切割一个42个氨基酸的信号序列；2)从一条链的酶原中水解去除156位的赖氨酸残基和157位的精氨酸残基，制备2链形式的该分子(即一条155个氨基酸残基的轻链通过一个二硫桥连接至262个氨基酸残基的含丝氨酸蛋白酶的重链)；3)将该轻链的前42个氨基酸中成簇的9个谷氨酸残基进行维生素K依赖性羧化，产生9个γ-羧基谷氨酸(GLA)残基；和4)于4个位点(一个位于轻链中，3个位于重链中)连接碳水化合物。重链含有很好建立的Asp 257、His 211和Ser 360的丝氨酸蛋白酶三联体。最后，在体内在钙离子存在下，在磷脂表面由凝血酶活化这种循环2链酶原。由于去除了重链N末端的十二肽，导致活化，产生了活化C蛋白(aPC)的加工酶活性。活化C蛋白与其它蛋白一起，作为对导致血栓形成的凝血可能是最重要的负调节物起作用。
不幸的是，aPC可以自降解，导致作为抗凝剂的功能性降低。本领域公认的活化C蛋白的降解途径是于重链的380位进行蛋白水解剪除，产一个111个氨基酸的片段。在本领域中该降解产物确定为EAK片段。
先前减少自降解的尝试集中于最大限度地减少EAK片段的形成。最值得注意的是，于1995年7月12日申请的Prouty等的EP 0 662513指出，通过将pH控制至约6.3-7.0；在3M尿素中温育aPC；或将aPC暴露于极端的盐环境中，极端的盐环境的定义是高于0.4M或低于0.05M，而最大限度地减少aPC的自降解。
申请人已经发现了第二种重要的降解途径-导致于10位的组氨酸残基任一端剪除的轻链N末端的自降解。这种降低途径产生两种无活性产物。轻链前9个残基的N末端剪除产生des(1-9)活化C蛋白，而轻链前10个残基的N末端剪除产生des(1-10)活化C蛋白。先前尚未报道过的这种降解途径由于去除了6位和7位的关键的GLA残基，导致抗凝剂活性的丧失。因此，在得到有效的高纯度活化C蛋白药用制剂方面，最大限度地降低des(1-9)和des(1-10)活化C蛋白自降解产物是重要的。这些变异体是先前未知的降解产物，通过常规纯化技术去除这些变异体如果不是不可能，也是极其困难的。最大限度地减少其形成的条件是先前未知的。
申请人鉴定出活化C蛋白的这种重要的自降解途径，使得能够发现提高活化C蛋白的纯度和效力的加工和配制条件。申请人已经证明，于低pH(例如低于6.3)下，有利于des(1-9)aPC或des(1-10)aPC的自降解途径比有利于308-309自降解途径占优势，然而，于低于6.3的pH下使用提高的氯化钠浓度(高于150mM)，显著降低des(1-9)aPC和/或des(1-10)aPC自降解反应的程度。
因此，本发明提供于高于150mM的离子强度和约5.5至低于6.3的pH下加工活化C蛋白的方法。在这些条件下，des(1-9)aPC和des(1-10)aPC的形成显著减少。因此，本发明提供没有不希望的降解的加工活性C蛋白水溶液的改进方法。
                      附图描述
图1提供了活化的人C蛋白的一级结构，以有助于说明本文描述的自降解途径。本文采用的命名基于人活化C蛋白一级序列的编号。本领域技术人员会认识到其它种类的活化C蛋白可能在一级序列中略微变化，由此导致本文定义的命名改变。
                      发明概述
本发明提供活化C蛋白水溶液和加工这类溶液的改进方法，该方法包括在高于150mM的离子强度和约5.5至低于6.3的pH下进行所述加工。
本发明还提供通过层析分离纯化活化C蛋白的方法，该方法包括在所述层析分离期间，用离子强度高于150mM和pH为约5.5至低于6.3的洗脱水溶液洗脱所述活化C蛋白。
本发明还提供通过过滤浓缩活化C蛋白溶液的方法，该方法包括将所述活化C蛋白作为离子强度高于150mM和pH为约5.5至低于6.3的水溶液送至过滤膜。
本发明也提供通过本文所述方法制备的活化C蛋白。
本发明最后提供des(1-9)aPC和/或des(1-10)aPC低于10％(重量)的活化C蛋白药用制剂。
                      发明详述
本说明书中所用的所有氨基酸缩写均为美国专利和商标局接受的、于37C.F.R.§1.822(B)(2)中提出的缩写。
对于本文公开和要求保护的本发明的目的，以下术语如下定义。
aPC或活化C蛋白-是指C蛋白，无论它是重组的还是来自血浆的。aPC包括人C蛋白，并且最好是人C蛋白，尽管aPC也可以包括具有C蛋白蛋白水解、酰胺分解、酯解和生物(抗凝剂或血纤溶酶原酶解)活性的其它种类或衍生物。Gerlitz等的美国专利第5,453,373号和Foster等的美国专利第5,516,650号描述了C蛋白衍生物的实例，这些专利的全部内容通过引用结合到本文中。
APTT-活化的部分促凝血酶原激酶时间。
水性的-包括助溶剂体系以及仅使用水作为溶剂。水性的最好是指仅用水作为溶剂。
层析分离-包括本领域公认和知道的层析技术，包括大小排阻层析、阴离子层析、阳离子层析、疏水层析、反相层析等。
交叉流过滤-是指通过跨滤膜的切向流的分配，其中该产物或者被该膜保留(如在浓缩或渗滤中)，或被该膜通过(如在病毒清除过滤中)。
PC-C蛋白酶原。
加工-是指可用于活化C蛋白生产中的单元操作，诸如柱层析、过滤(切向流过滤、交叉流过滤、死端式过滤)、冻干、泵送或贮存。
r-aPC-通过以下方法生产的重组活化C蛋白：通过在体外活化，或通过直接从原核细胞、真核细胞或转基因动物分泌活化形式的C蛋白，包括例如从人肾293细胞作为酶原分泌，然后通过本领域技术人员熟知的并在Yan的美国专利第4,981,952号和Cottingham的WO97/20043中证明的技术纯化和活化。
本发明涉及加工活化C蛋白的改进方法。本发明特别涉及通过蛋白富集或浓缩以及蛋白纯化操作加工活化C蛋白，而同时减少自降解。本发明的特征在于这类加工，尤其是具有在本文所述的条件下用该蛋白的水溶液进行的这种修饰、富集和纯化操作。
本文要求保护的条件的组合，最大限度地减少des(1-9)aPC和des(1-10)aPC的形成。des(1-9)aPC和des(1-10)aPC非常难以通过已知纯化方法去除，所以最好是在aPC药用制剂的生产期间最大限度的减少其形成。在要求保护的条件下制备的活化C蛋白大致不含des(1-9)aPC和des(1-10)aPC变异体。一般而言，在这些条件下制备的aPC的药用制剂大致不含des(1-9)aPC和des(1-10)aPC，具有的单独的或组合的这些变异体一般低于10％，优选低于8％，更优选低于5％，最优选低于3％(重量)。采用按本文所述制备和要求保护的aPC制备的冻干药用制剂，证明其溶液状态(在冻干之前)的稳定性增加，重建时稳定24-48小时。观察到于2-8℃下在多达5天、于15℃多达50小时、以及于25℃多达40小时，效力的损失不超过5％。在本发明之前，这种稳定性以前不能达到。
小心控制pH、离子强度和最好控制温度，可以将加工期间水溶液中的和制剂中的活性C蛋白的自降解降低至先前不能达到的水平，特别是在缺乏尿素或其它变性剂、组氨酸、赖氨酸盐酸盐或清蛋白的情况下。
在本发明的广泛实践中，设想了加工C蛋白包括种类繁多的单元操作、物理分离和纯化操作，包括层析处理和交叉流过滤(诸如用于纯化该蛋白组合物、浓缩该蛋白溶液或用于溶剂交换)以及可能的化学处理和酶处理。本发明设想的蛋白加工特别包括通过标准层析法(诸如离子交换层析、疏水层析等)的纯化以及通过超滤和相似方法的蛋白浓缩。蛋白加工也计划包括蛋白溶液在准备用于这种纯化和浓缩步骤的存储器等中的保留。为了降低不稳定性，活化C蛋白溶液的所有加工包括各种蛋白纯化和蛋白浓缩步骤，均在本文所述的条件下进行。这类加工步骤涉及最终的蛋白分离，通常作为冻干粉，用于配制为药用制剂。
该水性加工溶液的pH为约5.5至低于6.3。更优选的是，为5.7至低于6.3。再更优选的是，pH在约5.6至约6.2之间。甚至更优选的是约5.8至约6.2之间的pH。再更优选的是约5.9至约6.1之间的pH。最优选的pH为约6.0。维持有效pH控制的代表性的缓冲液系统包括Tris-乙酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸盐-甘氨酸和磷酸钠。更优选的缓冲液系统包括柠檬酸钠和磷酸钠。最优选的缓冲液为柠檬酸钠。该缓冲液系统的优选的体积摩尔浓度为10mM-50mM。最优选的体积摩尔浓度为20-40mM。技术人员会认识到可利用许多其它缓冲液系统，它们也可以用来将pH维持在要求保护的范围内。
加工溶液的离子强度是本发明的第二个关键的因素。离子强度一般得自药用可接受盐的加入-最好是加入氯化钠或氯化钾。离子强度最好高于或等于150mM，得自缓冲溶液中高于150mM的盐浓度。优选的是，盐浓度不高于约1000mM，以有利于下游加工。最优选的是，盐浓度为约200mM至1000mM。以前认为，高于50mM并低于400mM的浓度是不可接受的。
确保最小自降解的另一条件是温度。溶液加工期间的加工温度优选为0-10℃之间，更优选在2-8℃之间，在这些温度范围以外，活性C蛋白的自降解发生显著。然而，如果不包括活化C蛋白的完整性，则短时间超过10℃可以耐受。
活化C蛋白的浓度不是本发明的关键。重要的是，在本文所述的条件下于高浓度下加工该蛋白的能力显著增强。优选的蛋白浓度为约1mg/ml至约50mg/ml，更优选为1-30mg/ml，再更优选为1-20mg/ml，最优选为1-10mg/m1，尽管考虑到较高或较低的浓度是可操作的。
按本文所述制备的活化C蛋白可用于治疗各种各样的涉及血管内凝血的获得性疾病状态，包括血栓形成性中风、深静脉血栓形成、肺栓塞、外周动脉血栓形成、源自心脏或外周动脉的栓子、急性心肌梗死、弥散性血管内凝血和急性毛细血管前或毛细血管后闭合，包括移植或视网膜血栓形成。
理想的是用填充剂将活化C蛋白配制为冻干状态。理想的是选择填充剂，使得它提高该分子的固态稳定性。这种赋形剂的实例是蔗糖、海藻糖和棉子糖。技术人员会认识到，可利用许多其它填充剂，它们也可以用于活化C蛋白中。制剂的填充剂浓度是冷冻干燥过程的关键性配制变量。优选的填充剂是蔗糖，待冻干溶液中的其浓度为15-30mg/ml。待冻干溶液中最优选的蔗糖浓度为2.5mg/ml aPC制剂中15mg/ml。待冻干溶液中最优选的蔗糖浓度为5.0mg/ml aPC制剂中30mg/ml。
提出以下实施例，以说明和解释本发明。不应认为本发明的范围限于这些实施例。除非另外陈述，否则所有份数和百分率的参比均基于重量，而所有温度均以摄氏度表示。
                        制备1
                     人C蛋白的制备
用本领域技术人员熟知的技术，诸如在Yan的美国专利第4,981,952号(其全部内容通过引用结合到本文中)中提出的那些方法，在人肾293细胞中生产重组人C蛋白(酶原)。在Bang等的美国专利第4,775,624(其全部内容通过引用结合到本文中)中公开和要求保护了编码人C蛋白的基因。在293细胞中表达人C蛋白的质粒是质粒pLPC，该质粒公开于Bang等的美国专利第4,992,373号，该专利的全部内容通过引用结合到本文中。质粒pLPC的构建也描述于欧洲专利申请第0445 939号和Grinnell等，1987， Bio/Technology 5：1189-1192中，其内容通过引用也结合到本文中。简而言之，将该质粒转染入293细胞中，然后鉴定出稳定的转化子，传代培养并在无血清培养基中培养。发酵后，通过微量过滤获得无细胞培养基。
通过采用Yan的美国专利第4,981,952号的技术(其全部内容通过引用结合到本文中)，从培养基流体中分离人C蛋白酶原。在将培养基吸附至阴离子交换树脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)之前，将澄清的培养基在EDTA中制备为4mM。用4倍柱体积的20mM Tris、200mM NaClpH 7.4和2倍柱体积的20mM Tris、150mM NaCl pH 7.4洗涤后，用20mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2 pH 7.4洗脱结合的重组人C蛋白酶原。洗脱后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断，洗脱的蛋白的纯度高于95％。
通过将蛋白在NaCl中制备为3M，然后吸附至在20mM Tris、3M NaCl、10mM CaCl2 pH 7.4中平衡的疏水互作树脂(ToyopearlPhenyl 650M，TosoHaas)，完成该蛋白的进一步纯化。用2倍柱体积无CaCl2的平衡缓冲液洗涤后，用20mM Tris pH 7.4洗脱重组的人C蛋白酶原。通过去除残留的钙制备用于活化的洗脱蛋白，。使该酶原通过金属亲和柱(Chelex-100，Bio-Rad)，以去除钙并再次结合至阴离子交换树脂(Fast Flow Q，Pharmacia)。串联布置这两个柱子，并在20mMTris、150mM NaCl、5mM EDTA pH 7.4中平衡。将该蛋白上柱后，用1倍柱体积的相同缓冲液洗涤Chelex-100柱，然后将该蛋白从该串联柱上分离出来。用3倍柱体积的平衡缓冲液洗涤阴离子交换柱，然后用0.4M NaCl、20mM Tris-乙酸盐pH 6.5洗脱该蛋白。根据UV280nm消光度E0.1％＝1.81，测量重组人C蛋白的蛋白浓度。
                         制备2
                     重组人C蛋白的活化
在50mM HEPES pH 7.5存在下，于4℃将牛凝血酶偶联至活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia)。在已经装入柱子的树脂上，用约5000单位凝血酶/ml树脂进行该偶联反应。将凝血酶溶液通过该柱循环约3小时，然后向循环溶液中加入2-氨基乙醇(MEA)至0.6ml/L浓度。将含MEA的溶液再循环10-12小时，以确保完全封闭该树脂上未反应的胺。封闭后，用10倍柱体积的1M NaCl、20mM Tris pH 6.5洗涤凝血酶偶联树脂，以去除所有的非特异性结合的蛋白，并在活化缓冲液中平衡后用于活化反应。
纯化的rHPC在DETA(以螯合任何残留的钙)中制备为5mM，并用20mM Tris pH 7.4或20mM Tris-乙酸盐pH 6.5稀释至2mg/ml的浓度。使该物质通过于37℃用50mM NaCl和或者20mM Tris pH7.4或者20mM Tris-乙酸盐pH 6.5平衡的凝血酶柱。调节流速，以允许rHPC和凝血酶树脂之间的接触时间约为20分钟。收集流出液，并立即分析其酰胺分解活性。如果该物质的比活(酰胺分解)与建立的aPC标准不相当，则将其再次在凝血酶柱上循环，以将rHPC完全活化。然后用20mM上述缓冲液1∶1稀释该物质料。
通过在活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)凝血测定中测量凝血时间的延长，测定活化C蛋白的抗凝剂活性。在稀释缓冲液(1mg/ml放射免疫级BSA、20mM Tris pH 7.4、150mM NaCl、0.02％NaN3)中，制备C蛋白范围为125-1000ng/ml的标准曲线，同时在该浓度范围内以几个稀释度制备样品。向每个样品杯中加入50μl冷的马血浆和50μl重建的活化部分促凝血酶原激酶时间试剂(APTT试剂，Sigma)，于37℃温育5分钟。温育后，向每个杯中加入50μl适当的样品或标准。用稀释缓冲液取代样品或标准，以测定基础凝固时间。将50μl 37℃的30mM CaCl2加入每种样品或标准后，立即启动fibrometer(CoA筛止血分析仪(Screener Hemostasis Analyzer)，American Labor)的计时器。从标准曲线的线性回归等式计算样品中活化C蛋白的浓度。凝固时间是三次平行测定的最小值的平均值，包括标准曲线样品。根据UV 280nm消光度E0.1％＝1.85，测量重组活化C蛋白的蛋白浓度。
                       实施例1
                    aPC的层析分离
将电导率约为14mMho、pH为5.7的aPC溶液上样至9.5cm×9cm(h×d)的S-Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂柱，该柱与25cm×14cm(h×d)的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂柱串联连接。这两个柱子均在20mM柠檬酸钠pH 6.0、150mM NaCl中预平衡。该柱的上样量为每升阴离子交换树脂10克aPC。该柱用大于2倍柱体积的平衡缓冲液洗涤，用20mM柠檬酸钠pH 6.0、400mMNaCl分步洗脱。所有的操作均在2-8℃下进行，线性流速为60cm/hr。
尽管所述aPC具有高活性(根据APTT测定为539单位/mg)，且在层析期间被相当浓缩(峰值＞20g/L)并处于聚集主流中(10克/L)，但该产物仍保持稳定。通过减小和未减小的胰蛋白酶消化轻链的质谱证实了这些观察，所述质谱表明没有可检测的(＜2％)含308-309内源蛋白水解剪除的同种型，也不存在des(1-9)aPC和des(1-10)(＜5％)。
                       实施例2
                      病毒过滤
用切向流过滤(Millopore VirusolveTM 180膜)，过滤20mM Tris、150mM NaCl和20mM EDTA缓冲液中的活化C蛋白(4mg/ml)。用渗滤缓冲液促进aPC通过该滤膜。渗滤缓冲液为20mM柠檬酸钠和150mM NaCl。过滤在20mM Tris、150mM NaCl和20mM EDTA缓冲液中的4mg/ml aPC溶液(10L)。柠檬酸钠和氯化钠缓冲液用作渗滤缓冲液，以产生终体积为21.5L的aPC溶液。
                       实施例3
                      冷冻干燥
通过将适量的蔗糖、氯化钠和柠檬酸钠加入预定体积的r-aPC中，在小瓶中制备溶液，产生2.5mg/ml aPC、15mg/ml蔗糖、325mM氯化钠和20mM柠檬酸钠pH 6.0。用常规冷冻干燥器将溶液冻干，产生适用于重建和给予患者的冻干aPC小瓶。该冻干制剂的des(1-9)aPC和des(1-10)aPC低于10％。
                       实施例4
                      冷冻干燥
通过将适量的蔗糖、氯化钠和柠檬酸钠加入预定体积的r-aPC中，在小瓶中制备溶液，产生5mg/ml aPC、30mg/ml蔗糖、650mM氯化钠和40mM柠檬酸钠pH 6.0。用常规冷冻干燥器将溶液冻干，产生适用于重建和给予患者的冻干aPC小瓶。该冻干制剂的des(1-9)aPC和des(1-10)aPC低于10％。
在前述说明书中已经描述了本发明的原理、优选实施方案和操作模式。然而，本文计划保护的本发明不应解释为限于公开的具体形式，因为它们被认为是说明性的，而不是限制性的。本领域技术人员可以进行变化和修改，而不违背本发明的精神。

Claims (11)

1.冻干人重组活化C蛋白水溶液的方法，所述方法包括在150mM至400mM的离子强度和5.5至6.3的pH下进行冻干。
2.一种制备人重组活化C蛋白制剂的方法，包括在不存在变性剂、组氨酸、赖氨酸盐酸盐或清蛋白的条件下，冻干具有150mM至400mM离子强度和5.5至6.3的pH的人重组活化C蛋白溶液。
3.权利要求1的方法，其中所述pH为5.9-6.1。
4.权利要求2的方法，其中pH为5.9至6.1。
5.权利要求1-4之任一的方法，其中所述pH用柠檬酸钠缓冲。
6.权利要求1-4之任一的方法，其中这种溶液还包含氯化钠。
7.权利要求1-4之任一的方法，其中所述pH用柠檬酸钠缓冲，其中这种溶液还包含氯化钠。
8.一种制备人重组活化C蛋白制剂的方法，包括冻干一包含人重组活化C蛋白和填充剂的溶液，其中，填充剂选自海藻糖、棉子糖、蔗糖或它们的混合物；所述溶液具有150mM至400mM的离子强度和5.5至6.3的pH。
9.权利要求8的方法，其中溶液还包含氯化钠。
10.权利要求8或9的方法，其中所述制剂的des(1-9)活化C蛋白和des(1-10)活化C蛋白的总量低于10％(重量)。
11.权利要求8或9的方法，其中所述制剂的des(1-9)活化C蛋白和des(1-10)活化C蛋白的总量低于5％(重量)。
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