CN1234735B

CN1234735B - 影响par-2路径的大豆胰蛋白酶抑制剂影响皮肤色素沉着变化的用途

Info

Publication number: CN1234735B
Application number: CN98801022.4A
Authority: CN
Inventors: S·S·沙皮诺; S·尼梅斯; J·昆; M·塞伯格
Original assignee: Johnson and Johnson Consumer Companies LLC
Current assignee: Johnson and Johnson Consumer Inc
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2018-07-23
Also published as: KR100691395B1; EP0948308B1; US20080249029A1; IL129090A0; AR016780A1; JP2001502360A; DE69821913D1; WO1999004752A2; EP0948308A1; US8039026B1; WO1999004752A9; PL333284A1; CN1234735A; HUP0000216A2; ATE260083T1; DE69821913T2; US20120027706A1; CA2267077A1; WO1999004752A3; JP2009114187A

Abstract

本发明涉及引起皮肤色素沉着改变的方法和组合物。更具体地说，本发明涉及通过利用PAR-2路径能影响黑色素生成并且能用作脱色素剂或使皮肤增黑剂的化合物。

Description

影响PAR-2路径的大豆胰蛋白酶抑制剂影响皮肤色素沉着变化的用途

1、发明领域

本发明涉及引起皮肤色素沉着和/或导致皮肤脱色素的方法和组合物。更具体地说，本发明涉及影响黑素生成并能用作脱色素试剂或皮肤增黑剂的化合物。

2、发明背景

许多年来，皮肤着色一直为人所关心。特别地，除去色素过度沉着的能力是那些希望有统一肤色的人们所关心的一个问题，其中的色素过度沉着，例如通常发现在老年斑、雀斑或老化的皮肤中。而在世界上的某些地方，通常希望皮肤增白。色素沉着不足和色素过度沉着这两种情况都希望得到处理。类似地，对许多人来说，在不导致光损害的前提下，日光照射产生棕褐色外观的能力是非常重要的。

已经提出许多方法用于达到脱色素和增深皮肤颜色的目的。例如，曲酸、氢醌、视黄醛衍生物和其它化合物已经用于脱色素。二羟丙酮等化合物由于能在不受日光照射的情况下使皮肤变成“棕褐色”已经得到应用。

已经发现：在这些以前的解决方法中，有许多是不能接受的。在这些以前的组合物所应用的皮肤区域之间经常有一条明显的界线。因此，为了达到预期的结果，必须精确应用所有的这些化合物。已经发现在这些化合物中有许多十分刺激皮肤，因此，是不宜应用的。

对黑素生成的化学和酶基础的理解已经有许多文件证明。黑素细胞从胚胎神经嵴迁移到皮肤产生分泌粒，产生黑素的黑素粒。在黑素粒中发生黑素生成，所生成的黑素再通过黑素细胞树突分布到角化细胞中。酪氨酸酶是黑素生成中的关键酶，它引发一系列反应使酪氨酸转变成生物多聚体黑素。已知有两种酪氨酸酶相关的蛋白质(TRP’s)：TRP-1和TRP-2。这些蛋白质与酪氨酸酶享有约40％的同源性，在黑素生成中它们具有催化活性和调节作用。黑素细胞中，TRP-1是最丰富的糖蛋白。

尽管黑素生成的化学或酶基础已经有许多文件证明，但它在细胞水平的调节只是部分地被理解。酪氨酸酶和TRP’s与结合溶菌体的膜蛋白(LAMP)基因族具有共同的结构和生物学性质，因此，它们靶向溶菌体膜可能导致它们的活化。在黑素生成的调节中，可能包括发生在细胞质尾部的这些蛋白质的磷酸化和去磷酸化反应。蛋白激酶C(PKC)族的β异构体显示通过活化酪氨酸酶来调节人黑素生成。酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2的基因表达是协调一致的。这三种酶都在人体表皮中表达。在与角化细胞共同培养的黑素细胞中，这些转录体表达的比例分别是45∶45∶10。在单独培养的黑素细胞中，只存在TRP-1转录体，这表明：来源于角化细胞的信号包括在这些基因的协调表达中。角化细胞-黑素细胞相互作用的调整和黑素体转变成角化细胞的机理至今尚不清楚。

蛋白酶激活受体-2(PAR-2)是一个七跨膜域G-蛋白偶合受体，其在序列上与凝血酶受体(TR，亦称为PAR-1和PAR-3)有关但有区别。这两个受体都是通过在细胞外区域的精氨酸-丝氨酸裂解被蛋白水解而活化。新产生的N-末端再作为束缚的配体活化这些受体。两个受体均通过胰蛋白酶活化，但只有TRs通过凝血酶活化。只有PAR-2通过肥大细胞类胰蛋白酶活化。两个受体均可通过与它们新N-末端相对应的肽类来活化，而与受体裂解无关。SLIGRL，小鼠PAR-2活性肽，与活化人类受体是等效的。当TR的功能被充分得到文件证明时，尚没有完全认识PAR-2的生物学性质。最近记载了活化PAR-2在抑制角化细胞生长和分化中的作用(Derian等，“一个新系蛋白酶活化受体对人角化细胞生长和分化的分化调节作用”(“Differential Regulation of Human Keratinocyte Growth andDifferentiation by a Novel Family of Protease-activate Receptors”)，细胞生长与分化(Cell Growth&Differentiation)，第8卷，第743-749页，1997年7月)。

发明概述

根据本发明，我们发现一种影响哺乳动物皮肤色素沉着变化的方法，包括：把影响PAR-2路径的化合物在哺乳动物的皮肤上局涂敷。本发明的组合物包括一个或多个化合物，这些化合物作为胰蛋白酶、类胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或作为PAR-2激动剂，用来增强皮肤色素沉着。或者，它们含有一个或多个化合物，这些化合物作为丝氨酸蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、凝血酶抑制剂、类胰蛋白酶抑制剂或作为PAR-2路径抑制剂或作为PAR-2拮抗剂，用来降低皮肤色素沉着，或“脱色素”。

这里所用的“哺乳动物”是指“包括哺乳类的高等脊椎动物”的任何成员，正如Webster’s医学办公词典(Webster’s Medical Desk Dictionary)407(1986)所定义的，包括但不限于人。这里所用的“受体”应该包括细胞内和细胞外的受体，应该是指那些能够接受和传导信号的分子。术语PAR-2是指蛋白酶活化受体 -2或有关的蛋白酶活化受体。蛋白酶活化受体-2(后面称“PAR-2”)是一种丝氨酸-蛋白酶活化受体，它可在许多组织包括角化细胞和纤维细胞中表达。凝血酶受体(也称PAR-1，后面称“TR”)是丝氨酸-蛋白酶活化受体，在许多组织包括角化细胞中表达。尚不完全了解皮肤中PAR-2和TR的生物学作用。然而，我们发现：角化细胞和黑素细胞的相互作用通过PAR-2路径影响黑素的生成。我们已经发现：凝血酶抑制剂、和/或类胰蛋白酶抑制剂、和/或胰蛋白酶抑制剂和PAR□□拮抗剂可用作脱色素试剂而且不刺激皮肤。PAR-2激动剂和丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和类胰蛋白酶可用作增黑剂。并且，作为增白剂和增黑剂的标靶，PAR-2是有用的。

综上所述，本发明提供了以下技术方案：

一种影响哺乳动物皮肤色素沉着变化的方法，包括把影响PAR-2路径的化合物以色素沉着变化的有效量施用于哺乳动物；所述方法为非治疗疾病的方法。

一个实施方案是其中所述的化合物抑制PAR-2路径。

一个实施方案是其中所述的化合物是PAR-2的拮抗剂。

一个实施方案是其中所述的化合物结合或者阻滞但并不活化PAR-2。

一个实施方案是其中所述的化合物选自：结合或者阻滞但并不活化PAR-2的基于SLIGRL的拮抗剂；结合或者阻滞但并不活化PAR-2的基于SLIGKVD的拮抗剂；和它们的混合物。

一个实施方案是其中所述的化合物为蛋白酶抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物为丝氨酸蛋白酶抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物为凝血酶和/或类胰类蛋白酶和/或胰蛋白酶抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物选自式I或其可药用盐：

其中：A选自C_1-8烷基、羧基C_1-4烷基、C_1-4烷氧羰基C_1-4烷基、苯基C_1-4烷基、取代苯基C_1-4烷基(其中；苯上取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、甲酰基、C_1-4烷氧基羰基、C_1-2烷羰基、苯基C_1-4烷氧基羰基、C_3-7环烷基羰基、苯羰基、取代苯羰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷氧基磺酰基、全氟C_1-4烷基磺酰基、苯基磺酰基、取代苯基磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、10-樟脑磺酰基、苯基C_1-4烷基磺酰基、取代苯基C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷基亚磺酰基、全氟C_1-4烷基亚磺酰基、苯基亚磺酰基、取代苯基亚磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、苯基C_1-4烷基亚磺酰基、取代苯基C_1-4烷基亚磺酰基、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基或取代萘基磺酰基(其中取代在萘环上的基团独立的选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基或取代的萘基亚磺酰基(其中取代在萘环上的基团独立的选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)；羧基末端结合到如式I所示N原子上的D或L型氨基酸，这些氨基酸选自：丙氨酸、天门冬酰胺、2-氮杂环丁烷羧酸、甘氨酸、N-C_1-8烷基甘氨酸、脯氨酸、1-氨基-1-环C_3-8烷基羧酸、四氢噻唑-4-羧酸、5，5-二甲基四氢噻唑-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、2-哌啶酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、叔亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、[1，2，3，4]-四氢异喹啉-1-羧酸和[1，2，3，4]-四氢异喹啉-2-羧酸；

其中与所述氨基酸的氨基末端连接的基团选自：C_1-4烷基、四唑-5-基-C_1-2烷基、羧基C_1-4烷基、C_1-4烷氧基羰基C_1-4烷基、苯基C_1-4烷基、取代苯基C_1-4烷基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4 烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1，1-二苯基C_1-4烷基、3-苯基-2-羟丙酰基、2，2-二苯基-1-羟乙基羰基、[1，2，3，4]-四氢异喹啉-1-羰基、[1，2，3，4]-四氢异喹啉-3-羰基、1-甲氨基-1-环己烷羰基、1-羟基-1-环己烷羰基、1-羟基-1-苯基乙酰基、1-环己烷基-1-羟基乙酰基、3-苯基-2-羟基丙酰基、3，3-二苯基2-羟基丙酰基、3-环己烷基-2-羟基丙酰基、甲酰基、C_1-4烷氧基羰基、C_1-12烷羰基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷基羰基、苯基C_1-4烷基羰基、取代苯C_1-4烷羰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1，1-二苯C_1-4烷基羰基、取代1，1-二苯C_1-4烷基羰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、全氟C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷氧基磺酰基、苯基磺酰基、取代苯基磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_-1烷基、全氟C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、10-樟脑磺酰基、苯基C_1-4烷基磺酰基、取代苯基C_1-4烷基磺酰基、全氟C_1-4烷基亚磺酰基、C_1-4烷基亚磺酰基、苯基亚磺酰基、取代苯基亚磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基或取代萘基磺酰基(其中萘上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基和取代的萘基亚磺酰基(其中萘上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)；或者由两个氨基酸组成的多肽，其中第一个氨基酸是D或L氨基酸，其羧基末端与式I所示的氮结合，这些氨基酸选自：甘氨酸、N-C_1-8烷基甘氨酸、丙氨酸、2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、四氢噻唑-4-羧酸、5，5-二甲基四氢噻唑-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、1-氨基-1-环C_3-8烷基羧酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、3-(C_1-4烷氧基)脯氨酸、4-(C_1-4烷氧基)脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸，2，2-二甲基-4-四氢噻唑羧酸、2，2-二甲基-4-噁唑烷羧酸、2-哌啶酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、叔亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、[1，2，3，4]-四氢异喹啉-2-羧酸、天冬氨酸-4-C_1-4烷基酯和谷氨酸-5-C_1-4烷基酯；第二个D或L氨基酸结合到上述第一个氨基酸的氨基末端，这些氨基酸选自：苯丙氨酸、4-苯甲酰基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-(羧基C_1-2烷基)苯丙氨酸、取代苯丙氨酸(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-联苯基丙氨酸、高苯丙氨酸(homophenylalanine)、八氢吲哚-2-羧酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-噻唑基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺、3-三C_1-4烷基甲硅烷基丙氨酸、环己烷基甘氨酸、二苯基甘氨酸、苯基甘氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、2.2-二环己烷基丙氨酸、2-(1-萘基丙氨酸)、2-(2-萘基丙氨酸)、苯基取代的苯丙氨酸(其中的取代基选自C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C_1-4烷基酯、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷氨基、羧基或C_1-4烷氧羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C_1-4烷基酯谷氨酸、谷氨酸-5-C_1-4烷基酯、环C_3-8烷基丙氨酸、取代的环C_3-8烷基丙氨酸(其中环上的取代基为：羧基、C_1-4烷基酯、环C_3-8烷基丙氨酸、取代的环C_3-8烷基丙氨酸(其中环上的取代基为羧基、C_1-4烷基羧基、C_1-4烷氧基羰基或氨基羰基)、2，2-二苯基丙氨酸和所有氨基酸的所有α-C_1-5烷基的衍生物，其中，所述的第二个氨基酸的氨基末端没有取代或单取代，单取代时的取代基选自：甲酰基、C_1-12烷基、四唑-5-基C_1-2烷基、羧基C_1-8烷基、羧烷氧基C_1-4烷基、苯基C_1-4烷基、取代的苯基C_1-4烷基(其中苯上的取代基团独立的选自一个或多个：C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1，1-二苯基C_1-4烷基、C_1-6烷氧基羰基、苯基C_1-6烷氧基羰基、C_1-2烷基羰基、全氟C_1-4烷基C_0-4烷基羰基、苯基C_1-4烷基羰基、取代苯基C_1-4烷基羰基(其中苯上的取代基团独立的选自一个或多个：C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1，1-二苯基C_1-4 烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基羰基)、10-樟脑磺酰基、苯基C_1-4烷基磺酰基、取代苯基C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷基亚磺酰基、全氟C_1-4烷基亚磺酰基、苯基亚磺酰基、取代苯基亚磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、苯基C_1-4烷基亚磺酰基、取代苯基C_1-4烷基亚磺酰基、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基或取代萘基磺酰基(其中取代在萘环上的基团选自C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基和取代的萘基亚磺酰基(其中取代在萘环上的基团选自C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)；R₁选自氢和烷基、

R₂选自氨基C_2-8烷基、胍基C_2-5烷基、C_1-4烷基胍基C_2-5烷基、二C_1-4烷基胍基C_2-5烷基、脒基C_2-5烷基、C_1-4烷基脒基C_2-5烷基、二C_1-4烷基脒基C_2-5烷基、C_1-3烷氧基C_2-5烷基、苯基、取代苯基(其中苯上取代基独立地选自一或多个：氨基、脒基、胍基、C_1-4烷基氨基、C_1-4二烷基氨基、卤素、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷基、C_1-3烷氧基或硝基)、苄基、苯基取代的苄基(其中取代基团独立地选自一或多个氨基、脒基、胍基、C_1-4烷基氨基、C_1-4二烷基氨基、卤素、全氟C_1-4烷基、C_1-04烷基、C_1-4烷氧基或硝基)、羟基C_2-5烷基、C_1-5烷氨基C_2-5烷基、C_1-5二烷氨基C_2-5烷基、4-氨基环己烷基C_0-2烷基和C_1-5烷基；

P为0或1；

B为

其中，n为0-3，R₃为H或C_1-5烷基，B的羰基部分与E相连； E为杂环，选自噁唑啉-2-基、噁唑-2-基、噻唑-2-基、噻唑-5-基、噻唑-4-基、噻唑啉-2-基、咪唑-2-基、4-氧代-2-喹喔啉-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、苯并[b]噻吩-2-基、三唑-4-基、三唑-6-基、吡唑-2-基、4，5，6，7-四氢苯并噻唑-2-基、萘并[2，1-d]噻唑-2-基、萘并[1-2-d]噻唑-2-基、喹喔啉-2-基、异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、苯并[b]呋喃-2-基、吡嗪-2-基、喹唑啉-2-基、异噻唑-5-基、异噻唑-3-基、嘌呤-8-基、和取代的杂环，其中的取代基选自：C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷基氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基、C_1-4烷氧基羰基、羟基或苯基C_1-4烷氨基羰基。

一个实施方案是其中所述的化合物含有d-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸序列。

一个实施方案是其中所述的化合物是(S)-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[4-[(氨基亚氨甲基)氨基]-1-(2-苯并噻唑基羰基)丁基]-L-脯氨酰胺。

一个实施方案是其中所述的化合物是影响PAR-2路径的天然产品。

一个实施方案是其中所述的化合物是衍生自一或多种豆科、茄科、禾本科和葫芦科的植物。

一个实施方案是其中所述的化合物衍生自豆类。

一个实施方案是其中所述的化合物选自未变性的大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物或它们的混合物。

一个实施方案是其中所述的化合物选自：未变性的大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物中的组分和它们的混合物。

一个实施方案是其中所述的化合物选自大豆奶、大棉豆奶、黑豆奶、大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物、大豆糊、大棉豆糊和黑豆糊和它们的混合物。

一个实施方案是其中所述的化合物是黑素体转移抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物活化PAR-2路径。

一个实施方案是其中所述的化合物是结合并活化PAR-2路径的PAR-2激动剂。

一个实施方案是其中所述的化合物选自：结合并活化PAR-2路径的SLIGRL、SLIGKVD以及SLIGRL和SLIGKVD的衍生物，和它们的混合物。

一个实施方案是其中所述的化合物是活化PAR-2路径的蛋白酶。

一个实施方案是其中所述的化合物是活化PAR-2路径的丝氨酸蛋白酶。

一个实施方案是其中所述的化合物选自：活化PAR-2路径的胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血酶和皮肤中天然存在的蛋白酶。

一个实施方案是其中所述的化合物是黑素体转移的增强物质。

一个实施方案是其中的组合物每天施用两次，至少施用八星期。

一个实施方案是其中的组合物以相对高的剂量施用至少约4-10星期，然后以相对低的剂量持续施用以维持皮肤的光亮作用。

一个实施方案是其中的组合物口服使用。

一个实施方案是其中的组合物非肠道使用。

本发明还提供了一种影响哺乳动物皮肤色素沉着变化的组合物，包括：影响PAR-2路径的、色素沉着变化有效量的化合物。

一个实施方案是其中所述的化合物是PAR-2路径抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物是PAR-2拮抗剂。

一个实施方案是其中所述的化合物结合或阻滞但并不活化PAR-2。

一个实施方案是其中所述的化合物选自：基于SLIGRL的结合或阻滞但并不活化PAR-2的拮抗剂、基于SLIGKVD的结合或阻滞但并不活化PAR-2的拮抗剂和它们的混合物。

一个实施方案是其中所述的化合物是蛋白酶抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物是丝氨酸蛋白酶抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物是凝血酶和/或胰蛋白酶和/或类胰蛋白酶抑制剂或者皮肤中天然产生的活化PAR-2的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物含有d-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸骨架。

一个实施方案是其中所述的化合物选自：(S)-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[4-[(氨基亚氨甲基)氨基]-1-(2-苯并噻唑基羰基)丁基)-L-脯氨酰胺。

一个实施方案是其中所述的化合物是影响PAR-2路径的天然来源产品。

一个实施方案是其中所述的化合物衍生自豆类。

一个实施方案是其中所述的化合物衍生自大豆、大棉豆和/或黑豆。

一个实施方案是其中所述的化合物是黑素体转移抑制剂。

一个实施方案是其中所述的化合物活化PAR-2路径。

一个实施方案是其中所述的化合物选自：活化PAR-2路径的胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血酶和皮肤中天然产生的蛋白酶。

一个实施方案是其中影响PAR-2路径的化合物占所述组合物的重量/体积比含量约为0.0001％-15％。

一个实施方案是其中所述的化合物占所述组合物的含量约为0.001％-5％。

一个实施方案是其中所述的化合物占所述组合物的含量约为0.005％-1％。

一个实施方案是其所含豆奶的重量含量约为1％-99％。

一个实施方案是其所含大豆胰蛋白酶抑制剂、大棉豆胰蛋白酶抑制剂或黑豆胰蛋白酶抑制剂的重量含量约为0.01％-20％。

一个实施方案是包括所述影响色素沉着的化合物和化妆品可接受的载体。

一个实施方案是其中的组合物还含有其它的脱色素试剂。

一个实施方案是其中的组合物还含有酪氨酸酶抑制剂。

一个实施方案是其中的组合物还含有脂质体。

一个实施方案是其中的组合物含有甘油二月桂酸酯、胆甾醇、聚氧乙烯基-10-硬脂醚和聚氧乙烯基-9-月桂醚。

一个实施方案是其中的组合物还含有抗氧化剂。

一个实施方案是其中的组合物还含有防晒剂。

一个实施方案是其中的组合物含有：约1-99％的豆奶、约0.1-20％的乳化剂和有效量的防腐剂。

一个实施方案是其中的组合物还含有的化合物选自：抗氧化剂、防晒剂、增湿剂、漂白剂、脱色素试剂、表面活性剂、发泡剂、调节剂、湿润剂、香味剂、增粘剂、缓冲剂、防腐剂和它们的混合物。

附图的简要说明

图1A表示根据本发明的方法，用已知的色素沉着试剂和脱色素试剂对含有黑素细胞的表皮等同物进行处理，该表皮等同物的相对色素沉着的增加或减少图。

图1B表示应用本发明的方法和组合物对含有黑素细胞的表皮等同物进行处理，该表皮等同物的相对色素沉着的增加或减少图。

图2表示用PAR-2激动剂和化合物I处理的含有黑素细胞的表皮等同物时得到的一组表皮等同物图象。

图3表示应用本发明的方法和组合物对含有黑素细胞的表皮等同物进行处理，该表皮等同物的相对色素沉着的增加或减少图。

图4A表示当用本发明的组合物处理时，相对于含有黑素细胞的表皮等同物中的色素沉着的剂量/反应图。

图4B表示用紫外光照射含有黑素细胞的表皮等同物后，再用本发明的组合物进行处理得到的反应图。

图5A是凝胶的照片，显示皮肤中TR和PAR-2、黑素瘤细胞和含有黑素细胞的表皮等同物的表达。

图5B是凝胶的照片，显示原始的人黑素细胞对TR和PAR-2的表达。

图6A和图6B是凝胶的照片，显示用不同浓度的化合物I和SLIGRL处理后的不同基因表达。

图7是本发明的不同组合物对豚鼠乳头色素沉着的亮度的作用示意图。

图8是Yucatan猪皮肤的照片，为了使皮肤脱色素，用本发明的组合物对Yucatan猪皮肤进行了处理。

图9表示用本发明的组合物和方法对Yucatan猪皮肤处理过程中的皮肤亮度示意图。

图10A、10B、10C和10D分别是根据本发明的方法，用含有浓度为0、10μM、50μM和250μM的组合物处理Yucatan猪皮肤，F&M着色组织学部分的照片。

图11A、11B和11C是用本发明组合物处理含有黑素细胞的表皮等同物得到的电子显微视图的照片。

图11E、11F和11H是用本发明组合物处理Yucatan猪皮肤得到的电子显微视图的照片。

图11D和11G是Yucatan猪皮肤未处理部位的电子显微视图照片。

图12A、12B、12C、12D和12E是Yucatan猪皮肤的组织学F&M着色部分的照片，其中：12A表示未处理的皮肤；12B表示用本发明的组合物处理8星期后的皮肤；12C表示停止处理1星期后的皮肤；12D表示停止处理两星期后的皮肤；12E表示停止处理4星期后的皮肤。

图13是用本发明的组合物处理Yucatan猪皮肤后，从该皮肤中取出的F&M着色组织学部分的照片。

图14包括用本发明组合物处理人皮肤时，处理前和处理后的紫外和可见光数字照片。

发明详述

我们发现：胰蛋白酶、类胰蛋白酶和PAR-2激动剂可用来增加哺乳动物皮肤的色素沉着，胰蛋白酶抑制剂、和/或类胰蛋白酶抑制剂、和/或和凝血酶抑制剂和PAR-2拮抗剂可用来降低皮肤的色素沉着。按照我们的观点，在此引入作为参考的US 5,523,308号专利中记载了一些化合物，它们作为凝血酶和/或胰蛋白酶和/或类胰蛋白酶抑制剂，在本发明中的方法是有用的。其中一部分这些化合物或它们的药用盐同样记载在：Costanzo等，“探测S1′亚位点的强效凝血酶抑制剂”(“Potent Thrombin Inhibitors That Probe the S1′Subsite：：以杂环活化羰基为基础的三肽过渡态类似物”，药物化学杂志(J.Med.Chem)1996，第39卷，第3039-3043页。其具有下面的结构式：

其中：A选自C_1-8烷基、羧基C_1-4烷基、C_1-4烷氧羰基C_1-4烷基、苯基C_1-4烷基、取代苯基C_1-4烷基(其中；苯上取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、甲酰基、C_1-4烷氧基羰基、C_1-2烷羰基、苯基C_1-4烷氧基羰基、C_3-7环烷基羰基、苯羰基、取代苯羰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、 C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷氧基磺酰基、全氟C_1-4烷基磺酰基、苯基磺酰基、取代苯基磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、10-樟脑磺酰基、苯基C_1-4烷基磺酰基、取代苯基C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷基亚磺酰基、全氟C_1-4烷基亚磺酰基、苯基亚磺酰基、取代苯基亚磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、苯基C_1-4烷基亚磺酰基、取代苯基C_1-4烷基亚磺酰基、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基或取代萘基磺酰基(其中取代在萘环上的基团独立的选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基或取代的萘基亚磺酰基(其中取代在萘环上的基团独立的选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)；羧基末端结合到如式I所示N原子上的D或L型氨基酸，这些氨基酸选自：丙氨酸、天门冬酰胺、2-氮杂环丁烷羧酸、甘氨酸、N-C_1-8烷基甘氨酸、脯氨酸、1-氨基-1-环C_3-8烷基羧酸、四氢噻唑-4-羧酸、5，5-二甲基四氢噻唑-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、2-哌啶酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、正亮氨酸、亮氨酸、叔亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、[1，2，3，4]-四氢异喹啉-1-羧酸和[1，2，3，4]-四氢异喹啉-2-羧酸；

其中与所述氨基酸的氨基末端连接的基团选自：C_1-4烷基、四唑-5-基-C_1-2烷基、羧基C_1-4烷基、C_1-4烷氧基羰基C_1-4烷基、苯基C_1-4烷基、取代苯基C_1-4烷基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1，1-二苯基C_1-4烷基、3-苯基-2-羟丙酰基、2，2-二苯基-1-羟乙基羰基、[1，2，3，4]-四氢异喹啉-1-羰基、[1，2，3，4]-四氢异喹啉-3-羰基、1-甲氨基-1-环己烷羰基、1-羟基-1-环己烷羰基、1-羟基-1-苯基乙酰基、1-环己烷基-1-羟基乙酰基、3-苯基-2-羟基丙酰基、3，3-二苯基-2-羟基丙酰基、3-环己烷基-2-羟基丙酰基、甲酰基、C_1-4烷氧基羰基、C_1-12烷羰基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷基羰基、苯基C_1-4烷基羰基、取代苯C_1-4烷羰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个， C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1，1-二苯C_1-4烷基羰基、取代1，1-二苯C_1-4烷基羰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、全氟C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷氧基磺酰基、苯基磺酰基、取代苯基磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_-1烷基、全氟C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、10-樟脑磺酰基、苯基C_1-4烷基磺酰基、取代苯基C_1-4烷基磺酰基、全氟C_1-4烷基亚磺酰基、C_1-4烷基亚磺酰基、苯基亚磺酰基、取代苯基亚磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基或取代萘基磺酰基(其中萘上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基或取代的萘基亚磺酰基(其中萘上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)；或者由两个氨基酸组成的多肽，其中第一个氨基酸是D或L氨基酸，其羧基末端与式I所示的氮结合，这些氨基酸选自：甘氨酸、N-C_1-8烷基甘氨酸、丙氨酸、2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、四氢噻唑-4-羧酸、5，5-二甲基四氢噻唑-4-羧酸、噁唑烷-4-羧酸、1-氨基-1-环C_3-8烷基羧酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、3-(C_1-4烷氧基)脯氨酸、4-(C_1-4烷氧基)脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸，2，2-二甲基-4-四氢噻唑羧酸、2，2-二甲基-4-噁唑烷羧酸、2-哌啶酸、缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、叔亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、[1，2，3，4]-四氢异喹啉-2-羧酸、天冬氨酸-4-C_1-4烷基酯、谷氨酸-5-C_1-4烷基酯。第二个D或L氨基酸结合到上述第一个氨基酸的氨基末端，这些氨基酸选自：苯丙氨酸、4-苯甲酰基基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-(羧基C_1-2烷基)苯丙氨酸、取代苯丙氨酸(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4 烷氧基羰基)、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-联苯基丙氨酸、高苯丙氨酸(homophenylalanine)、八氢吲哚-2-羧酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-噻唑基丙氨酸、2-噻吩基丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)丙氨酸、3-噻吩基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺、3-三C_1-4烷基甲硅烷基丙氨酸、环己烷基甘氨酸、二苯基甘氨酸、苯基甘氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、2.2-二环己烷基丙氨酸、2-(1-萘基丙氨酸)、2-(2-萘基丙氨酸)、苯基取代的苯丙氨酸(其中的取代基选自C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C_1-4烷基酯、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧羰基)、天冬氨酸、天冬氨酸-4-C_1-4烷基酯谷氨酸、谷氨酸-5-C_1-4烷基酯、环C_3-8烷基丙氨酸、取代的环C_3-8烷基丙氨酸(其中环上的取代基为：羧基、C_1-4烷基酯、环C_3-8烷基丙氨酸、取代的环C_3-8烷基丙氨酸(其中环上的取代基为羧基、C_1-4烷基羧基、C_1-4烷氧基羰基或氨基羰基)、2，2-二苯基丙氨酸和所有氨基酸的所有α-C_1-5烷基的衍生物，其中，所述的第二个氨基酸的氨基末端没有取代或单取代，单取代时的取代基选自：甲酰基、C_1-12烷基、四唑-5-基C_1-2烷基、羧基C_1-8烷基、羧烷氧基C_1-4烷基、苯基C_1-4烷基、取代的苯基C_1-4烷基(其中苯上的取代基团独立的选自一个或多个：C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1，1-二苯基C_1-4烷基、C_1-6烷氧基羰基、苯基C_1-6烷氧基羰基、C_1-2烷基羰基、全氟C_1-4烷基C_0-4烷基羰基、苯基C_1-4烷基羰基、取代苯基C_1-4烷基羰基(其中苯上的取代基团独立的选自一个或多个：C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1，1-二苯基C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基羰基)、10-樟脑磺酰基、苯基C_1-4烷基磺酰基、取代苯基C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷基亚磺酰基、全氟C_1-4烷基亚磺酰基、苯基亚磺酰基、取代苯基亚磺酰基(其中苯上的取代基独立地选自一个或多个，C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、苯基C_1-4烷基亚磺酰基、取代苯基C_1-4烷基亚磺酰基、1-萘基磺酰基、2-萘基磺酰基或取代萘基磺酰基(其中取代在萘环上的基团选自C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基或取代的萘基亚磺酰基(其中取代在萘环上的基团选自C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、酰胺基、硝基、氨基、C_1-4烷氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基或C_1-4烷氧基羰基)；R₁选自氢或烷基、R₂选自氨基C_2-8烷基、胍基C_2-5烷基、C_1-4烷基胍基C_2-5烷基、二C_1-4烷基胍基C_2-5烷基、脒基C_2-5烷基、C_1-4烷基脒基C_2-5烷基、二C_1-4烷基脒基C_2-5烷基、C_1-3烷氧基C_2-5烷基、苯基、取代苯基(其中取代基独立地选自一或多个：氨基、脒基、胍基、C_1-4烷基氨基、C_1-4二烷基氨基、卤素、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷基、C_1-3烷氧基或硝基)、苄基、苯基取代的苄基(其中取代基团独立地选自一或多个氨基、脒基、胍基、C_1-4烷基氨基、C_1-4二烷基氨基、卤素、全氟C_1-4烷基、C_1-04烷基、C_1-3烷氧基或硝基)、羟基C_2-5烷基、C_1-5烷氨基C_2-5烷基、C_1-5二烷氨基C_2-5烷基、4-氨基环己烷基C_0-2烷基和C_1-5烷基；

p为0或1；

B为

其中，n为0-3，R₃为H或C_1-5烷基，B的羰基部分与E相连；

1-4E为杂环，选自噁唑啉-2-基、噁唑-2-基、噻唑-2-基、噻唑-5-基、噻唑-4-基、噻唑啉-2-基、咪唑-2-基、4-氧代-2-喹喔啉-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、苯并[b]噻吩-2-基、三唑-4-基、三唑-6-基、吡唑-2-基、4，5，6，7-四氢苯并噻唑-2-基、萘并[2，1-d]噻唑-2-基、萘并[1-2-d]噻唑-2-基、喹喔啉-2-基、异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、苯并[b]呋喃-2-基、吡嗪-2-基、喹唑啉-2-基、异噻唑-5-基、异噻唑-3-基、嘌呤-8-基、和取代的杂环，其中的取代基选自：C_1-4烷基、全氟C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羟基、卤素、氨基、硝基、酰胺基、C_1-4烷基氨基、C_1-4二烷基氨基、羧基、C_1-4烷氧基羰基、羟基或苯基C_1-4烷氨基羰基。

更具体地说，按我们的观点，上式含有d-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸骨架的一些化合物应该能有效地抑制PAR-2路径从而引起脱色素。一个特别优选的化合物，其作为凝血酶和胰蛋白酶抑制剂，能有效地是使哺乳动物皮肤脱色素，该化合物是(S)-N-甲基-D-苯丙氨酰-N-[4-[(氨基亚氨基甲基)氨基]-1-(2-苯并噻唑基羰基)丁基]-L-脯氨酰胺((S)-N-Methyl-D-phenylalanyl-N-[4-[(aminoimionmethyl)amino]-1-(2-benzothiazolylcarbonyl)butyl]-L-prolinamide)(化学文摘(CA)命名)(以下称“化合物I”)。我们认为：在US5,523,308中公开的与化合物I类似或功能类似的其他化合物，可能在本发明的组合物和方法中是具有活性作用的。其它的抑制胰蛋白酶的化合物如丝氨酸蛋白酶抑制剂和特别是大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)也在本发明的方法中是有用的。大豆(soybean)、大棉豆和黑豆提取物，以及由这些豆类制得的其它天然产品例如包括但不限于豆奶、豆糊和酱等，也通过此机理减少色素沉着。

丝氨酸蛋白酶抑制剂的另外来源还可从下列科属植物中得到：茄科(如：马铃薯、西红柿和粘果(tomatilla)等)；禾本科(如稻谷、荞麦、高梁、小麦、大麦和燕麦等)；葫芦科(如黄瓜、南瓜属植物、葫芦和丝瓜属植物等)；以及优选的豆科(如大豆、豌豆、兵豆和花生等)。

当不愿被下列理论所束缚时，我们的理论是：能影响皮肤色素沉着的化合物的作用机理是通过直接或间接与角化细胞PAR-2或与其活性蛋白酶相互作用，因而直接或间接影响黑素的生成。也许，在增加色素沉着的情况下，本发明中的化合物诱导皮肤黑素细胞转运黑素体的信号或者角化细胞接受黑素体的信号；在减少黑素沉着的情况下，本发明的化合物减低皮肤中的这些信号。

对于在本发明的组合物和方法中有活性的化合物，可以通过本领域技术人员已知的任何方式，局部施用。如果这些局部活性的药品或化妆品的转运参数需要，对于本发明的局部活性组合物，可优选再含有药物或化妆品可接受的载体，这些载体能够作为转运系统使活性物质局部穿透皮肤。

当本发明的一些组合物特别是蛋白质如胰蛋白酶和STI局部给药时，一种可接受的载体包括脂质体。这些脂质体更优选非离子脂质体并包括：a)甘油二月桂酸酯(优选的含量约为5％-70％重量比)；b)具有胆甾醇中的甾体骨架的化合物(优选的含量约为5％-45％重量比)；和c)一种或多种具有约12-18个碳原子的脂肪酸醚(总共优选的含量约为5％-70％重量比)。其中脂质体化合物成分的优选比例约为37.5∶12.5∶33.3∶16.7。最优选的脂质体组成物质是：甘油二月桂酸酯/胆甾醇/聚氧乙烯基-10-硬脂醚/聚氧乙烯基-9-月桂醚(GDL脂质体)。以组合物的总量为基础，优选含有的脂质体含量约为10mg/mL至100mg/ml，更优选的含量约为20mg/ml-50mg/ml。最优选的比例约为37.5∶12.5∶33.3∶16.7。合适脂质体优选根据实施例1设定的方案制备得到，通过本领域的其它常用方法得到的脂质体也可接受。上面所述的组合物可制备如下：在合适容器中合并所需要的成分，在周围环境条件下，以本领域熟知的、任何通常的高剪切混合方式混合上述物质，得到非离子脂质体。例如这些脂质体的公开在：Niemiec等，“非离子脂质体组合物对毛囊皮脂腺单位中肽类药物局部给药的影响：应用Hamster耳模型的体内试验研究”，12药物研究，1184-88(1995)“Influence of Nonionic Liposomal CompositionOn Topical Delievery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units：An In Vivo Study Usingthe HamsterEarModel”12Pharm.Res.1184-88(1995)(“Niemiec”)，其全部内容在此引入作为参考。我们发现：本发明的组合物中脂质体的存在，可以增强本发明的一些组合物脱色素的能力。

其它优选的制剂包括例如豆奶或其它直接来源于豆类或其它合适植物的液体制剂。例如这些制剂可包括大量的豆奶、维持豆奶物理稳定性的乳化剂和选择性存在的络合剂、防腐剂、润肤剂、湿润剂和/或增稠剂或胶粘剂。

本领域技术人员已知的水包油乳剂、油包水乳剂、基于溶剂的制剂和水性胶均可用作载体用于本发明组合物的使用。

用于制剂的活性化合物来源通常取决化合物的特殊形式。对于小的有机分子和肽类片断可以化学合成，并以适合药/化妆品应用的纯净形式提供。天然提取物产品可通过本领域已知的技术纯化。本领域的普通技术人员还可应用重组的化合物。

在可选择的实施例中，局部活性的药用组合物或化妆品可任意选择地与其它成分结合，这些成分如增湿剂、化妆品辅料、抗氧化剂、漂白剂、酪氨酸酶抑制剂和其它已知的脱色素试剂、表面活性剂、发泡剂、调理剂、湿润剂、香味剂、增粘剂、缓冲剂、防腐剂和防晒剂等。本发明的组合物还可包括有效量的视黄醛衍生物(即可与任一视网膜受体结合的化合物)。包括例如：维A酸、维生素A1、维A酸和/或维生素A1的酯等。

局部活性的药物或化妆品应该有效量地施用从而使哺乳动物皮肤的色素沉着产生变化。这里所述的“有效量”应该是指能足以覆盖需要产生色素沉着变化的皮肤表面区域的量。优选地，所述组合物自由地用于皮肤表面，因此，基于皮肤表面的面积，当在制剂中需要色素沉着产生变化时，局部活性试剂存在的量约为2-200μl/cm²。当应用凝血酶或胰蛋白酶抑制剂时如化合物I或其类似物，无论是合成物质还是天然来源的物质，这些活性物质与组合物的重量/体积比应该约为0.0001％-15％。更优选地，这些物质在组合物中的含量约为0.0005％-5％。最优选地，它们在组合物中的含量约为0.001-1％。当然，对于前述组份，这些是建议的范围。在本发明方法中，对于具有较高处理指数的PAR-2路径激动剂/拮抗剂和/或抑制剂，它们不需要非常高的浓度和剂量就可在本发明方法中有效，设置低范围的目的是能够提高效率。这样的化合物可以是合成的或天然来源的。

在本发明的组合物中，还可应用直接来源于植物的液体衍生物或天然提取物，应用的浓度(重量/体积)约为1-99％。天然提取物和天然衍生物蛋白酶抑制剂如STI的比例有不同的优选范围：约为组合物的约0.01％-20％和更优选的约1％-10％。当然，对于本发明的活性试剂混合物，它们可组合和合并使用在同一制剂中，或应用在不同制剂的系列应用中。

我们意外的发现：当局部活性试剂例如PAR-2激动剂和/或抑制剂和胰蛋白酶和/或凝血酶和/或类胰蛋白酶和/或它们的抑制剂，当局部涂敷于动物皮肤时，色素沉着产生显著的变化。优选地，脱色素试剂(还有本发明中其它影响色素沉着的试剂)以一个相对高的浓度和剂量用于哺乳动物皮肤(对于具有高处理指数的化合物如化合物I以及相关的物质，其含量约为0.005％-1％；液体衍生物和植物提取物约为20％-99％；天然提取物和天然产生的蛋白酶抑制剂如STI或它们的混合物约为1％-20％)，每天1-2次维持一段时间直至皮肤显示色素沉着的变化，这段时间可能约为4-10周或更长。然后，一旦色素沉着发生变化，则可应用低浓度或剂量的活性物质(对于具有高处理指数的化合物如化合物I以及相关的化合物，其含量约为0.00001％-0.005％；液体衍生物和植物提取物约为10％-90％；天然提取物和天然产生的蛋白酶抑制剂如STI或它们的混合物约为0.01％-5％)，并降低用药频率，如约每天约一次直至约每星期两次。本发明中，活性物质的作用是可逆的，因此，为了维持上述作用，必须持续用药或服药。在此只是说明性地公开本发明，如果缺少在此没有特别公开的任何成分、组份或步骤，本发明也可能合适地实施。

下面几个实施例可进一步说明本发明的特性以及实施本发明的方式，但本发明的组合物和方法并不局限于这些实施例。

实施例1：影响色素沉着的蛋白酶抑制剂

为了研究PAR-2路径对于色素沉着可能的作用，应用体外的表皮等同物系统。所用的表皮等同物系统含有黑素细胞。在进行该项研究中，一个有用的表皮等同物系统是购自MatTek公司的黑素皮肤系统(MelanoDerm system)。该系统含有正常的人黑素细胞，还有正常的来源于人体的表皮角化细胞，该细胞培养成高度分化的多层人表皮模型。在下列实施例中，用试验的化合物处理等同物三天，在开始处理后的第四天收集样品。收集的等同物用DOPA(酪氨酸酶酶解物)和H&E(一种标准的组织学着色方法)着色，或用本领域技术人员已知的另一种着色方法Fontana-Mason(F&M)着色。F&M着色是一种银着色技术，能干净地、清楚地标记具有高活性地还原硝酸银性质的黑素。

应用含黑素细胞的多层人表皮等同物系统作为研究蛋白酶抑制剂影响黑素生成的体外模型系统。所用的表皮等同物为黑素皮肤，购自Ashland的MatTek，MA。已知这些等同物受紫外光B(“UVB”)照射时，色素沉着增加；这些等同物与增白剂如苯甲醛和氢醌接触时，色素沉着减少。使这些黑素皮肤表皮等同物与苯甲醛(来自St.Louis，MO的Sigma)和氢醌(来自Sigma)相接触以及曝露在UVB射线下。UV射线照射时，在照射室中进行，应用UVB FS光源，除去盖板(plate cover)，在照射室的下部放置磷酸盐缓冲盐水(PBS，来自Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)。用UVX辐射计(UVP Inc.，San Gabriel CA)测量UVB的强度。用0.1-0.12J/cm²的强度处理等同物，应用直至0.3J/cm²的强度处理等同物时，没有发现会影响活力。

在紫外光照射/接触试验化合物的第四天，固定等同物，分成若干部分并着色，或者不分份作为一个整体着色。黑素皮肤等同物用福尔马林固定后置于石蜡块中，应用下列标准方法对黑素皮肤等同物各部分着色：(1)H&E，(2)DOPA+H&E和(3)Fontana-Mason(“F&M”)，应用本领域技术人员已知的标准技术。或者对整个黑素皮肤等同物着色。捕获它们的图象进行图象分析。进行实验时至少每个实验三个等同物，每个等同物至少分成三部分。每个实验重复三次。DOPA是酪氨酸酶酶解物。F&M识别还原硝酸银的分子，主要识别黑素。应用Optomax Inc，Hollis，NH的Optomax图象分析系统对F&M着色部分进行图象分析。或者在 Gateway 2000P5-100电脑(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)上应用Empire图象数据库1.1捕获图象。应用4.0版Image Pro Plus进行图象分析。测定的参数如下：(1)个体黑素细胞的着色程度，和(2)对于Optomax系统，每个区域着色的黑素细胞数目，或者(1)黑素细胞中银沉积的表面积，和(2)对于Image Pro系统，着色黑素细胞的数目。应用Optomax系统时，在60个黑素细胞中，测量了个体黑素细胞中银沉积的表面积，每次处理时，用三份相同的等同物，各个等同物分成多个部分。在这些部分中，计算出每个区域黑素细胞的数目。单个黑素细胞银沉积的平均表面积乘上每个区域色素沉着的黑素细胞数目，得到的积定义为“色素沉着因子”(pigmentation factor)。指定一个值为未处理对照，相对于它们的对照值，把处理组的值正常化处理。应用Image Pro系统时，对于整个等同物，测定硝酸银沉积的表面积和黑素细胞的数目。指定一个值为未处理对照，相对于它们的对照值，把处理组的值正常化处理。

图1A表示如上所述，当与苯甲醛(50M)和氢醌(50M)接触以及受UVB照射(0.12J/cm²)时，通过整个等同物/Image Pro系统计算和测量的相对色素沉着的增加或减少图。

人体表皮等同物还与蛋白酶抑制剂的混合物接触，所述的蛋白酶抑制剂如下面的表A所述。蛋白酶抑制剂来源于Indianapolis，IN的Boehringer Mannheim。应用来自Boehringer Mannheim的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂，其含有胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、胰腺提取物和胰蛋白酶的抑制剂。大豆胰蛋白酶抑制剂(“STI”)来自Sigma，将其溶于50mg/ml脂质体载体或1×PBS中。本体外实施例所用的其它蛋白酶抑制剂溶于1×PBS中，应用上述Niemic等所述的方法制备GDL脂质体，但作了下列改变：非离子脂质体制剂中，二月桂酸甘油酯(Emulsynt GDL ISP Van Dyk)/胆甾醇(Croda)/聚氧乙烯基-10-硬脂醚(Brij76，ICI)/聚氧乙烯基-9-月桂醚的比例是：37.5∶12.5∶33.3∶16.7。制备脂质体时，用pH为7.4的0.05M Hepes缓冲液(Gaithersburg，MD的Gibco-BRL)作为水相。对于这些蛋白酶抑制剂的混合物和丝氨酸蛋白酶抑制剂的不同组合物，测试它们影响黑素生成的能力。正如图1B所示，一些丝氨酸蛋白酶抑制剂，特别是STI(大豆胰蛋白酶抑制剂)能非常有效地抑制黑素的生成。

表A

实施例2：蛋白酶活化受体参与色素沉着

实施例1证实了STI能减少色素沉着。STI抑制胰蛋白酶。因为已知胰蛋白酶能活化TR和PAR-2，我们测试了TR和PAR-2参与色素沉着的可能性。将黑素皮肤人上皮等同物每天用下面表B中陈列的TR和PAR-2激动剂以及拮抗剂处理，处理3天。在第四天，将样本收集、固定，进行DOPA、H&E或F&M着色。组织学检查和整个等同物测定显示了处理后色素沉着的变化。图2描述了本实施例的结果。如图所示，PAR-2肽激动剂SLIGRL减少了色素在单个黑素细胞中的沉着。用是凝血酶和胰蛋白酶抑制剂处理的化合物I导致色素沉着减少。

图3显示了本实施例中的试验结果，表示用TR和PAR-2试剂处理的黑素皮肤等同物中的色素沉着水平。作为一种PAR-2激动剂，SLIGRL能极大地增加色素沉着，这表明PAR-2可能参与色素沉着。水蛭素是一种凝血酶特异抑制剂，TFLLRNPNDK是一种TR选择性激动剂，它们对色素沉着都没有任何影响。然而，作为一种特异性较差的TR抑制剂，SFLLRN表现出减轻或减少色素沉着的倾向。这表明TR参与色素沉着的可能性较小。

表B

TR和PAR-2试剂	描述
		凝血酶	活化TR
胰蛋白酶	活化TR和PAR-2
		TFLLRNPNDK	TR肽激动剂-仅活化TR
SLIGRL	PAR-2肽激动剂-仅活化PAR-2
		SFLLRN	TR肽激动剂-活化TR，与PAR-2进行交叉反应
FSLLRN	不规则肽-非活性的
		水蛭素	凝血酶特异性抑制剂
化合物I	凝血酶和胰蛋白酶抑制剂

实施例3：蛋白酶活化受体信号传导与黑色素生成之间的剂量-反应关系

用与实施例2相同的方法，将黑素皮肤等同物用SLIGRL，这种PAR-2肽活化剂，以不断增加的浓度0、10和50μM处理。在第四天进行F&M着色。如附图4A所示，SLIGRL，这种PAR-2肽活化剂，其浓度的增加导致色素沉着增加。作为PAR-2肽活化剂，胰蛋白酶具有相同的效果。用化合物I，这种凝血酶和胰蛋白酶的抑制剂，以从0.1pM到1μM不断增加的浓度进行处理，结果导致色素沉着降低(见附图4A)。相对于未处理对照组，用UVB照射进行预处理增加了黑色素的生成。化合物I也能减少UVB诱导的色素沉着(见附图4B)。本实施例证实了色素沉着的增加和减少与PAR-2信号传导调节之间的剂量-反应关系。本实施例还证实了化合物I能抑制色素沉着和阻止UV诱导的色素沉着。

实施例4：PAR-2在角化细胞、但不在黑素细胞中表达

以前已经证实了PAR-2和TR能在角化细胞和成纤维细胞中表达。本实施例证实了PAR-2在角化细胞、但不在黑素细胞中表达。此外，还证实了TR在角化细胞和黑素细胞中都能表达。为了证实上述结论，将黑素皮肤人上皮等同物、人初生黑素细胞组织(新生儿和成人，从Clonetics of San Diego，CA得到)和得自ATCC of Rockville，MD的Cloudman S91小鼠黑素瘤细胞在培养基中生长，使用“RNA Stat-60”试剂提取总的RNAs，“RNA Stat-60”试剂可从“Tel-Test B”公司中获得，如Chomczymski在“通过胍翁酸硫氰酸盐-苯酚-氯仿提取法来分离RNA的单步法”162生化年报(Anal.Biochem.)，156-69(1987)中描述的。然后将足够量的不含RNase的DNase加入到从每份样本中提取的RNA中，这样通过使用Promega公司出版(1995年5月)的使用说明“不含RNase的DNase”中提供的操作步骤，每一各自产物能得到200ng DNA酶化的RNA，不含RNase的DNase可以商品名“RQ1不含RNase的DNase”从Promega公司中购得。依据Gibco-BRL(现为现代生命技术)出版(1992年4月)的使用说明“Superscript逆转录酶II”中提供的操作步骤，使用无规则六聚物，例如可从生命技术公司购得的无规则引物将得到的200ng DNA酶化的RNA逆转录(“RT”)。

将得到的RT产物经聚合酶链反应(“PCR”)扩增，反应使用约0.5单位(每100μl反应物)耐热的DNA聚合酶和约0.1μmol/反应物的TR和PAR-2特异引物或甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(G3PDH)引物，DNA聚合酶可以商品名“Taq聚合酶”从Perkin-Elmer-Cetus公司购得，TR和PAR-2特异引物描述在表C和Marthinusset al.，1995中，此文献在此引入以作参考，G3PDH引物可从Clontech实验室，PaloAlto公司，CA中获得，实验依据Marthinuss et al.，1995提供的操作步骤或Clontech实验室的引物所附的使用说明。

为了比较一定基因在角化细胞和黑素细胞中的表达水平，依据本领域众所周知的方法，用2％琼脂糖/溴化乙锭凝胶测定PCR产物。当需要更好的可见性时，依据众所周知的技术，用乙醇将得到的PCR产物沉淀。当使用G3PDH引物时，只用了10％PCR反应产物。用得自表皮等同物并且没有逆转录的RNA样本作为每一PCR扩增的阴性对照。在凝胶相关路径中没有谱带表示样本中没有基因组DNA污染物。当阳性对照物不能商购获得时，用逆转录的人皮肤RNA样本作为阳性对照。RT-PCR产物在凝胶上的迁移与阳性对照组完全相同，并且与报导的扩增物尺寸完全一样。

通过测定G3PDH的mRNA水平来比较每一RT-PCR反应产物各自的相对质量，G3PDH是每一反应产物都有的一种“看家”基因。如附图5和6所示，在所以进行测定的时间点，G3PDH基因的表达相似，这使得能够比较感兴趣基因的基因表达水平。

附图5A表明，正如所预期的那样，TR和PAR-2在所有的皮肤和黑素皮肤等同物(“MD”)中都表达。然而，S91黑瘤细胞(“S91”)不表达PAR-2或TR。为了进行进一步研究，我们测定了新生儿初生黑素细胞(“mel-NB”)和成人黑素细胞(“mel-A”)能否表达TR和PAR-2。如附图5B所示，人初生黑素细胞表达TR但不表达PAR-2。因此，我们提出在黑素皮肤等同物中，PAR-2激动剂和拮抗剂能与角化细胞但不能与黑素细胞互相作用，TR激动剂和拮抗剂既能与角化细胞又能与黑素细胞相互作用。因此角化细胞-黑素细胞相互作用是指，在此作用期间角化细胞-PAR-2信号转化成色素沉着终点。

表C中说明了所使用的DNA引物，PCR扩增反应所需MgCl₂的量，以及PCR周期的长度。

表C：RT-PCR测定中使用的DNA引物

引物(见下面所附的序列目录)	量 MgCl₂ (mM)	周期 (min) ℃	周期数目	DNA 序列ID号
					酪氨酸酶正义 TCAGCCCAGC ATCCTTCTTC	1.25	1 94 2 55 3 72	35	1
酪氨酸酶反义 CAGCCATTGT TCAAAAATAC- TGTCC	1.25	1 94 2 55 3 72	35	2
					TRP-1正义 5′CCACTCTAA TAAGCCCAAAC	2.5	1 94 2 55 3 72	35	3
TRP-1 反义 5′CTCAGCCAT TCATCAAAGAC	2.5	1 94 2 55 3 72	35	4
					TRP-2正义 5′AAAAGACAT ACGAGATTGCC	2.5	1 94 2 55 3 72	35	5
TRP-2 反义 5′CACAAAAAG ACCAACCAAAG	2.5	1 94 2 55 3 72	35	6
					胰蛋白酶正义 5′ATCC/TACT CCTGATCCTTA CC	2.5	1 94 2 45 3 72	35	7
胰蛋白酶反义 5′TGTCATTGT T/CCAGAGTCT /- CT/GC/GC	2.5	1 94 2 45 3 72	35	8
					PAR-2正义 - CGGAAAGGGGT TGGGGTAGAA- CCAGGCTTTTC C(5′)	2.5	.5 94 1 55 3 72	30	9
PAR-2 反义- GGCCAACGGCG	2.5	.5 94 2 55 3 72	30	10

ATGTTTGCCTT - CTTCCTGGGG( 3′)
					TR正义 CCTCTGAGTGC CAGAGGTACG- TCTACAG (5′)	2.5	.5 94 1 55 3 72	30	11
TR- 反义- CCTAAGTTAAC AGCTTTTTGTA T- ATGCTGTTATT CAGG(3′)	25	.5 94 1 55 3 72	30	12
					凝血酶正义 AACCTGAAGGA GACGTGGAC (3′)	2.5	.5 94 1 55 3 72	35	13
凝血酶反义 CAGGAGCCCAG AATATGAGTG (5′)	2.5	.5 94 1 55 3 72	35	14

实施例5：化合物I脱色素作用需要角化细胞-黑素细胞接触

实施例4的结果表明，单独的黑素细胞可能不能对PAR-2拮抗剂的脱色素作用有反应。实际上，化合物I不能影响由对苯二酚和苯甲醛减少的人初生黑素细胞或霍乱毒素诱导的S91细胞的色素沉着水平。既然PAR-2不能在黑素细胞中表达，我们测定了化合物I脱色素作用需要角化细胞-黑素细胞相互作用的可能性。比较初生黑素细胞组织与固定在表皮等同物(表皮，缺乏黑素细胞)上的同一组织，固定后能产生角化细胞与黑素细胞没有任何接触的共培养物。也比较这些组织与黑素皮肤等同物，其中黑素细胞存在于等同物的基底层中。将组织用如表D所示的化合物I、PAR-2激动剂SLIGRL、TR激动剂TFLLRNPNDK处理3天，在第四天用DOPA着色。在表D中，角化细胞用“K”表示，黑素细胞用“M”表示，没有角化细胞-黑素细胞接触用“非K-M接触”表示。如表D所示，在用这些试剂处理的初生黑素细胞和共培养物中，没有观察到影响色素沉着的作用。在黑素皮肤等同物中，化合物I减少了色素沉着，SLIGRL诱导色素沉着，而TFLLRNPNDK没有任何影响。这些结果表明PAR-2对色素沉着的影响需要角化细胞-黑素细胞接触。

表D

处理黑素细胞共培养物黑素皮肤

(非K) (非K-M接触) (K-M接触)

化合物1	没有影响	没有影响	变亮
				SLIGRL	没有影响	没有影响	变暗
TFLRNPNDK	没有影响	没有影响	没有影响

实施例6：化合物I影响黑素细胞基因表达

将黑素皮肤等同物用凝血酶和胰蛋白酶抑制剂即化合物I或PAR-2激动剂SLIGRL以不断增加的浓度进行处理。用实施例4中的方法，通过RT-PCR来测定从未处理和用化合物I处理的等同物中提取的RNAs。设计如表C中列举的基因特异性引物，使用如实施例4中的人G3PDH的Clontech引物。用来测定其表达水平的黑素生成基因是酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2。

如附图6A所示，在用化合物I处理的样本中观察到，TRP-1mRNA表现出剂量-依赖性减少，TRP-2mRNA表现出剂量-依赖性增加，然而，酪氨酸酶的表达没有受影响。这些变化与此抑制剂的剂量-依赖性增白作用有关。两种模式的基因表达都导致变白效应。TRP-2酶将氨基二氧环己二烯丙酸转化为5，6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)，而不是5，6-二羟基吲哚(DHI)。此过程产生褐色的、分散地很好的真黑素，完全不同与不溶性黑色的真黑素，并且使皮肤产生较浅的色调。TRP-1稳定了黑素生成复合物，使色素能够产生。TRP-1水平的降低导致酪氨酸酶的活性下降和色素沉着的减少。缺乏这种蛋白导致白化。然而，增加SLIGRLR的浓度不能影响黑素生成基因的表达(附图6B)

TRP-1和TRP-2是黑素细胞特异性的。化合物I抑制胰蛋白酶和凝血酶。水蛭素是一种特异性凝血酶抑制剂，其对色素沉着没有影响，参见实施例2。因此，我们决定测定胰蛋白酶和凝血酶是否在皮肤中表达。如表C所述，设计一种检测脑和胃胰蛋白酶的探针，用其检测两种mRNAs在整个皮肤mRNA样本和黑素皮肤等同物中的表达，整个皮肤mRNA样本是从Invitrogen of Carlsbad，CA中得到的。用相同的表达检测方法检测凝血酶的表达。胰蛋白酶和凝血酶都没有在正常的黑素细胞中表达(附图5A，B)。这些数据表明，如果胰蛋白酶活化PAR-2，其可能仅由角化细胞产生。如附图6A所示，用化合物I处理导致胰蛋白酶的表达增加。SLIGRL虽然不能影响黑素生成基因表达(附图6B)，但也增加等同物中胰蛋白酶的表达。我们推断，虽然在皮肤里胰蛋白酶可能是一种天然的PAR-2活化剂并且可能影响色素沉着，但是其mRNA水平与色素沉着无关。这表明在表皮中，另一种还未经确认的、能被化合物I和STI以及类似物抑制的丝氨酸蛋白酶，是一种天然的PAR-2活化剂。能诱导或抑制这种蛋白酶的化合物可分别用作增黑剂和增白剂。

实施例7：凝血酶和胰蛋白酶抑制剂和PAR-2激动剂在体内影响色素沉着

将两只天竺鼠用溶在70∶30乙醇∶丙二醇载体中的化合物I以1和10μM的浓度处理其色素沉着的一只乳头，每天处理两次，每周处理5天，处理7周。将每只天竺鼠的另一个乳头仅用载体处理以作为对照。处理7周后，色度测量显示各自的的剂量-依赖性增白效果分别是+9.6L*和约18L*单位。同时没有观察到刺激作用的可见信号。

将每组有三只的四组天竺鼠各自用化合物I、SFLLRN、FSLLRN和SLIGRL以10μM的浓度处理，每天处理两次，每周处理5天，处理8周。处理6周后，色度测量显示化合物I具有增白作用，PAR-2激动剂SLIGRL具有变黑作用。本实施例的结果在附图7中描述。

实施例8：凝血酶和胰蛋白酶抑制剂和和PAR-2激动剂在体内影响色素沉着

将一头Yucatan小猪用化合物I、SFLLRN、FSLLRN和SLIGRL以10μM的浓度处理，每一种化合物在猪的两个位点上施用，每天处理两次，每周处理5天，处理8周。处理8周后进行色度测量。用化合物I处理导致明显的增白效果。PAR-2激动剂SLIGRL导致如色度测量所示的变黑效果。SFLLRN和FSLLRN没有显著作用。

将两头Yucatan猪用化合物I以不断增加的浓度处理七周半或10周，每天处理两次，每周处理5天。活性化合物以四种浓度使用，即：0、10、50和250μM。每一浓度的化合物在猪背相反两侧的两个位点上进行处理。色度测量在处理前开始，以后每两周测量一次。在实验末期定期拍照。用250、50和10μM活性化合物处理的位点分别在处理的第4、5和6周观察到了明显的增白效果。到第8周，两组最高剂量处理的位点的增白效果相似。这些结果在附图8中显示。附图9显示了在处理期间其中一头猪的色度记录(L*，测定增白)。观察到了时间和浓度依赖性的饱和作用。本实施例证实了在与人皮肤色素沉着最相似的动物模型系统中，化合物I明显的脱色素作用。

在这些实验的后期，用活组织来进行组织学和电镜学(EM)分析。将组织样本用H&E和F&M着色。H&E着色表明在皮肤结构中没有刺激、炎症反应或变化，这证实了长期使用化合物I的安全性。F&M着色表明在处理过的样本中，基底层和整个表皮的色素沉着都减少了。这些结果在附图10中显示。未处理和用载体处理的样本(附图10A)色度相同，都是最暗的。10μM处理(附图10B)样本表现出色素沉着减少，50和250μM处理样本(分别是附图10C、10D)的颜色是最浅的。

本实施例的结果表明，化合物I以较高浓度短期间使用，或以较低浓度长时间使用，可以获得最大的增白效果。因此，为了达到所需的皮肤增白效果，至少有两种不同的用药方案可以采用。

实施例9：超微结构实验证实了化合物I在体内和体外对皮肤的作用

对用化合物I处理的黑素皮肤等同物和猪皮肤位点进行超微结构分析。使用电镜测定用化合物I处理的黑素皮肤等同物的暗色体的形成和分布。相对于未处理的对照组，处理过的样本含有更多的暗色体，但是含有更少的成熟的暗色体，即能显著诱导黑色素生成的暗色体(附图11A，11B)。在处理过的角化细胞中，含有暗色体的树突能容易地识别(附图11C)，但是在对照组的角化细胞中则很难发现。这表明在处理过的样本中，有异常的暗色体形成，并且减缓或减少暗色体向角化细胞的迁移。

使用电镜分析从用化合物I如实施例8所述处理8周的Yucatan猪中得到的皮肤样本。与对照组相比，处理位点的角化细胞中的暗色体较小并且色素沉着更少(附图11D、11E和11F)。此外，在处理过的皮肤中暗色体的分布也是反常的。与未处理对照组中暗色体的随机分布相比，在处理过的皮肤中，暗色体主要是在表皮-真皮边缘处检测到的(附图11G，11H)。虽然不能排除其它机理，但是我们认为用化合物I处理过的角化细胞不能从存在的树突中积极地摄取或吸收暗色体。

实施例10：化合物I在体内对脱色素的影响是可逆的

将Yucatan猪用化合物I以250□M的浓度处理8周，每天处理两次，每周处理5天，在8个位点上处理。在处理的末期，所有的位点都表现出明显的脱色素效果，见附图12B。在接下来的4周内(从实验的第9周开始)，监视处理位点的颜色，每周进行两个处理位点的活组织检查。未处理位点也进行活组织检查。在处理后的第一周和第二周可以看到脱色素效果，到第四周观察到了完全的逆转。皮肤F&M着色皮肤切片的组织学测定证实了能明显观察到的色素再沉着(如附图12所示)。象在处理后第一周那么早时，色素再沉着就已经被组织学测定所证实。对于角质层的色素沉着，目测法与组织学证实是相关联的。本实施例证实了化合物I对色素沉着机构不引起持久的损坏，并且在体内其作用是可逆的。附图12A表明未用化合物I处理的位点的两个F&M着色的组织学切片。图12B表明用化合物I处理8周的位点的两个F&M着色的组织学切片。图12C表明用化合物I处理8周、停止处理后1周的位点的切片。图12D表明用化合物I处理8周、停止处理后2周的位点的切片。图12E表明用化合物I处理8周、停止处理后4周的位点的切片。如附图12E所示，处理后4周，在切片中色素又完全再沉着了。

实施例11：制备含有STI的天然产物

实施例1证实了在任何增白制剂中含有大豆胰蛋白酶抑制剂对于其脱色素活性是可取的。基于分析测试，已经证明大豆奶和大豆糊中富含有大豆胰蛋白酶抑制剂。

为了制备大豆糊，先将大豆在去离子水或纯化水中浸泡几小时。大豆完全水化后将其磨碎，如果需要的话，再加入少量的水使糊光滑。为了制备大豆奶，除了加入更多的水以外，其它步骤同上。(磨碎步骤是为了提取大豆奶)。收集大豆奶后，将大豆奶过滤以除去大豆皮残渣。

制备的大豆奶、大豆糊和大豆酱能用作含有STI的天然产物，并且能用来增白皮肤的颜色。

实施例12：用能影响PAR-2路径的天然产物进行处理诱导脱色素作用

将两头Yucatan猪用不同的大豆和大棉豆产物处理8周和10周，每天处理两次，每周处理5天。这些天然产物包括大豆糊、大豆蛋白的酸水解产物、大豆酱、天然和煮沸过的大豆奶和可商购获得的大豆提取物(Actiphyte^TM ofActive Organics，Dallas Texas)、以及纯化的STI、及从大豆和大棉豆(limabean)中得到的不同的胰蛋白酶抑制剂制剂。在处理的第7周，除了用煮沸过的大豆奶和大豆蛋白的酸水解产物处理的位点，其它所有的位点都比周围皮肤明显变白。从处理位点取得的活组织F&M着色后的组织学分析证实了大豆和大棉豆产物的脱色素作用。附图13是此组织学数据的一个实例。煮沸过的大豆奶和大豆蛋白的酸水解产物缺乏脱色素活性的原因被解释为，大豆蛋白在其中分别被变性和降解。我们推理，在大豆和大棉豆产物中的活性脱色素剂分别是大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)和大棉豆胰蛋白酶抑制剂。(实施例1表明了STI在体外的脱色素作用)。本实施例证实了具有胰蛋白酶抑制剂活性的天然提取物可用作能影响PAR-2路径的增白剂。

实施例13：脂质体制剂中的STI能使人老年斑的颜色变浅

一个在其手背上有三个老年斑的人以如下方式处理8周，每天处理两次：最靠近手臂的老年斑用含有20mg/ml的脂质体的安慰剂处处理。中间的老年斑不处理。第三个老年斑用包含在脂质体(20mg/ml)中的1％的STI处理。

GDL脂质体用Niemiec，et al.，在上面提供的方法制备，只是下面这些步骤有变化：非离子性脂质体制剂，含有甘油二月桂酸酯(Emulsynt GDL，ISP Van Dyk)/胆固醇(Croda)/聚氧化乙烯-10-硬脂醚(Brij76，ICI)/聚氧化乙烯-9-月桂醚，其比例是37.5∶12.5∶33.3∶16.7。Hepes缓冲液，0.05M，PH 7.4(Gibco-BRL ofGaithersburg，MD)用作制备脂质体的水相。在处理的第0、4和8周拍摄紫外和可见光数字照片。L*(亮度)值是从使用Adobe Photoshop的影像中计算出的。

如附图14所示，处理8周后，用STI处理的老年斑变亮。图14是四张照片的组合。左边一半是8周处理前(上面)和处理后(下面)，手的可见光照片。在此定向，上面的老年斑是用安慰剂处理的，中间的老年斑是未处理的，下面的老年斑是用STI处理的。右边一半是同一只手在同一时间的紫外光照片。紫外光能使皮肤较深处的色素被观察到，这证明STI的增白效果不是皮肤表面的。附图14清楚地显示了STI制剂能使下面的老年斑变亮。经计算，STI处理位点增加了15个L*单位，这进一步证实了这种处理能使老年斑变白。

实施例14：含有大豆奶的脱色素制剂

在生成大豆奶的过程中，发现具有很好的润肤作用的大豆奶适于用在皮肤保养剂中。因为在任何水包油乳剂中水都是主要成份，因此在许多其它皮肤保养剂中，我们假定大豆奶可以作为这些制剂中去离子水的替代物。然而，我们预计由于大豆奶中油和水的不融和性，这种类型的制剂将是物理不稳定的。令人惊奇的是，我们发现用大豆奶代替水是物理稳定的。使用大豆奶的制剂应当含有约1％-99％的大豆奶，更优选含有约80％-95％的大豆奶。这种以及类似的制剂优选含有约0％-5％(更优选约0.1％-2％)的粘性助剂、约20％的一种或多种润肤剂和/或约0.1％-10％(更优选约3％-5％)的乳化剂，并且可选择地含有约0％-5％(更优选约1％-2％)的扩展剂、防腐剂、螯合剂或湿润剂。防腐剂应当以有效量存在以保持奶的完整性和维持组合物的活性。应加入足够量的增稠剂以使身体能分担制剂而又不使其过于粘以致于阻碍了其覆盖性，例如以约0-10％、更优选约3％-5％的量加入。防晒剂、抗氧化剂、维生素和其它脱色素剂以及其它皮肤局部保养组分也可以加入到本发明的组合物中。

以大豆奶代替水的一个特别优选脱色素制剂的实例展现在下面表E中。

表E

组分	功能	％重量/重量
			大豆奶	载体，脱色素剂	84.9％
辛烯基丁二酸铝淀粉	粘性助剂	0.75％
			环甲聚硅氧烷	扩展剂	2％
PEG-6癸/辛酸甘油三酯	润肤剂/乳化剂	3％
			苯氧基乙醇	防腐剂	0.75％
蔗糖椰子脂酸酯	润肤剂/乳化剂	1％
			Na2EDTA	螯合剂	0.1％
甘油	湿润剂	2.5％
			聚丙烯酰胺；异链烷烃； Laureth-7	增稠剂	5％

STI、大豆糊和其它含有胰蛋白酶抑制剂的天然提取物可以加入到这种制剂中以增加丝氨酸蛋白酶抑制剂的浓度。制剂中所用的活性成份的水平可以是0.01％-15％。其它脱色素剂，包括PAR-2抑制剂、酪氨酸酶抑制剂、对苯二酚、大豆产物、抗坏血酸及其衍生物、以及其它皮肤保养剂也可以加入到这种制剂中。

实施例15：水包油脱色素乳剂

表F是水包油脱色素乳剂的两个实例。在表F的第4栏描述了一种含有STI的制剂，其中STI能用任何天然得到的丝氨酸蛋白酶抑制剂，或任何含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的天然提取物或成份替代。表F的第5栏是含有化合物I的相似制剂。在此组合物中，化合物I可以用相似的化合物、丝氨酸蛋白酶抑制剂或具有高处理指标的PAR-2抑制剂替代，无论活性成份是通过合成得到的还是天然得到的。在这些制剂中，组分的推荐的含量范围也陈列在表F中。这些制剂中的去离子水可以用大豆奶替代。

表F

CTFA名	功能	％重量/重量	％重量/重量	范围S
					cetearyl葡萄糖苷	表面活性剂	1.4	1.4	0.1-2.8
苯甲酸C_12-15烷基酯	表面活性剂	4.0	4.0	1-6
					羟基硬脂酸辛基酯	润肤剂	1.0	1.0	0-5
二甲聚硅氧烷	扩展剂	1.0	1.0	0-5
					环甲聚硅氧烷	扩展剂	1.0	1.0	0-5
十六烷醇	润肤剂	2.5	2.5	0-4
					丁化羟基甲苯	抗氧化剂	0.1	0.1	0-0.5
甲氧基桂皮酸辛基酯	防晒剂	6.0	6.0	0-10
					对羟基苯甲酸丙酯	防腐剂	0.5	0.1	0-0.5
维生素E醋酸酯	抗氧化剂	0.5	0.5	0-0.5
					生育酚醋酸酯	抗氧化剂	0.5	0.5	0-0.5
甘油	润湿剂	3.0	3.0	0-20
					D-泛醇	维生素前体	0.5	0.5	0-5
EDTA二钠	螯合剂，增白剂	0.1	0.1	0.01-1
					对羟基苯甲酸甲酯	防腐剂	0.2	0.2	0-0.3
卡波姆	增稠剂	0.35	0.35	0-3
					去离子水或大豆奶	载体/增白剂	76.35	77.5	50-80
STI和天然提取物	增白剂	1.0	0	0-15
					化合物I	增白剂	0	0.25	0-1

为了制备此制剂，将各脂质相组分合并并且在85℃混合，然后冷却至60℃。在一个单独的容器中，将卡波姆缓慢地加入到水或大豆奶中。混合10分钟后，加入其余的水相组分并且将化合物加热到60℃。合并两相，混合10分钟，冷却至室温。当然，在本实施例和下面的实施例以及本发明的方法和组合物的其它实施方案中，在同一制剂中可以加入一种或多种脱色素剂。

实施例16：脱色素组合物(水包油乳剂)

水包油脱色素乳剂的另外两个实例展现在表G中。在表G的第3栏描述了一种含有STI的制剂，其中STI能用任何天然得到的丝氨酸蛋白酶抑制剂，或任何含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的天然提取物或成分替代。表G的第4栏是含有化合物I的相似制剂。在此组合物中，化合物I可以用相似的化合物、丝氨酸蛋白酶抑制剂或具有高处理指标的任何PAR-2抑制剂替代，无论活性成份是通过合成得到的还是天然得到的。在这些制剂中，组分的推荐的含量范围也陈列在表G中。这些制剂中的去离子水可以用大豆奶替代。

表G

CTFA名	功能	％重量/重量	优选的含量范围
				乙醇	溶剂	12.0	5-20
丙二醇	溶剂	3.0	1-10
				羟乙基纤维素	增稠剂/聚合物	0.2	0-3
丙烯酸酯/丙烯酸 C_10-30烷基酯交联聚合物	增稠剂/聚合物	1.0	0-3
				泛醇(98％)	维生素前体/润湿剂	1.5	0.1-3
香料	香料	0.5	0-0.5
				异十六烷	扩展剂	4.0	0-5
维生素E醋酸酯	抗氧化剂	1.0	0-2
				氢氧化钠	中和剂	0.35	0.1-0.5
甘油	润湿剂	3.0	0-20
				去离子水或大豆奶	载体/增白剂	71.95	60-80
化合物I	增白剂	0.25	0-1
				STI或天然提取物	增白剂	0	0-15

为了制备此制剂，将羟乙基纤维素缓慢地加入水或大豆奶中，并且搅拌直到完全溶解。在一个单独的容器中，加入丙烯酸酯/丙烯酸C_10-30烷基酯交联聚合物并且搅拌直到完全溶解。将两个容器中的组份合并并且混合20分钟。然后加入维生素E醋酸酯并且混合，再加入异十六烷和泛醇(98％)。混合5分钟后，将STI或天然提取物或化合物I与丙二醇一起加入，搅拌5分钟。然后加入甘油并且将制剂搅拌20分钟。最后，用氢氧化钠将pH值调到，对STI是8(6-8.5)，或对化合物I是7(5.5-8.5)。

实施例17：脱色素组合物(油包水乳剂)

表H中是油包水脱色素乳剂的一个实例。在表H的第4栏描述了一种含有STI的制剂，其中STI能用任何天然得到的丝氨酸蛋白酶抑制剂，或任何含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的天然提取物或成分替代。表H的第5栏是含有化合物I的相似制剂。在此组合物中，化合物I可以用相似的化合物、丝氨酸蛋白酶抑制剂或具有高处理指标的PAR-2抑制剂替代，无论活性成份是通过合成得到的还是天然得到的。在这些制剂中，组分的推荐的含量范围也陈列在表H中。这些制剂中的去离子水可以用大豆奶替代。

表H

相	CTFA名	功能	％重量/重量	％重量/重量	优选的含量范围
						油相	矿物油	润肤剂	25.0	25.0	40-80
	脱水山梨糖醇一油酸酯	表面活性剂	5.0	5.0	1-6
							硬脂醇	润肤剂	25.0	25.0	20-60
	二甲聚硅氧烷	扩展剂	1.0	1.0	1-5
							十六烷醇	润肤剂	2.0	2.0	0.1-10
	氢化卵磷脂	抗氧化剂	3.0	3.0	0-10
							Parsol MCX	防晒剂	3.0	3.0	0-10
	对羟基苯甲酸丙酯	防腐剂	0.5	0.5	0.01-0.5
							维生素E醋酸酯	抗氧化剂	0.5	0.5	0.01.-0.5
水相	甘油	润湿剂	3.0	3.0	0-20
							对羟基苯甲酸甲酯	防腐剂	0.2	0.2	0.01-0.3
	水或大豆奶	载体/增白剂	30.8	31.55	20-45
							STI	增白剂	1.0	0	0-10
	化合物I	增白剂	0	0.25	0-1

为了制备此制剂，将硬脂醇和矿物油在70℃熔化。加入其它的油相组份并且加入到75℃。然后，加入已经先溶于水或大豆奶体相并且加热到70℃的水相组份，将混合物搅拌直到其凝固。

有关脱色素组合物(水凝胶)

表J中是脱色素水凝胶制剂的两个实例。在表J的第3栏描述了一种含有STI 的制剂，其中STI能用任何天然得到的丝氨酸蛋白酶抑制剂，或任何含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的天然提取物或成分替代。表J的第4栏是含有化合物I的相似制剂。在此组合物中，化合物I可以用相似的化合物、丝氨酸蛋白酶抑制剂或具有高处理指标的任何PAR-2抑制剂替代，无论活性成份是通过合成得到的还是天然得到的。在这些制剂中，组分的推荐的含量范围也陈列在表J中。这些制剂中的去离子水可以用大豆奶替代。

表J

CIFA名	功能	％重量/重量	％重量/重量
					辛苯昔醇-13	表面活性剂	0.2	0.2	0.05-0.5
2，4-己二烯酸	防腐剂	0.1	0.1	0-0.3
					苯甲醇	防腐剂	1.0	1.0	0-2
EDTA二钠	螯合剂/防腐剂	0.05	0.05	0.01-0.2
					抗坏血酸	抗氧化剂	0.1	0.1	0-0.2
焦亚硫酸钠	抗氧化剂	0.2	0.2	0-0.3
					卡波姆	增稠剂	1.5	1.5	0-3.0
20％NaOH溶液	中和剂	2.45	2.45	0.1-5
					去离子水或大豆奶	载体/增白剂	93.4	94.15	85-98
STI或天然提物	增白剂	1.0	0	0-15
					化合物I	增白剂	0	0.25	0-1

I.简言之，我们已经证实，活化角化细胞受体PAR-2会导致色素沉着增加。优选地，通过使用胰蛋白酶或SLIGRL或SLIGKVD或其它SLIGRL或SLIGKVD衍生物，可以达到完成这种活化。我们还证实，通过使用丝氨酸蛋白酶抑制剂或PAR-2拮抗剂以及暗色体迁移阻滞剂，可以达到增白效果。其它本领域技术人员已知的能抑制暗色体向角化质细胞迁移的化合物也能用作脱色素剂。

化合物I是一种胰蛋白酶和凝血酶抑制剂，例如能抑制暗色体向角质化细胞迁移。STI通过相同机理起作用。未被释放的暗色体在黑素细胞中的积聚能诱导负反馈机理，减缓了新的暗色体的形成。作为黑素细胞中主要的糖蛋白，TRP-1的产生被下调，，导致酪氨酸酶不稳定。这导致黑色素生成减少，并且导致颜色转化成浅棕色，例如TRP-1∶TRP-2的比例下降。用化合物I处理后，或用STI处理后，暗色体在黑素细胞中的积聚已经减少了，并且改变了黑色素的含量，这也增加了化合物I或STI的增白效果。

Claims

1.影响PAR-2路径的大豆胰蛋白酶抑制剂在制备影响哺乳动物皮肤色素沉着变化的组合物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述大豆胰蛋白酶抑制剂在组合物中的重量含量为0.01％-20％。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述的大豆胰蛋白酶抑制剂选自未变性的大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物或它们的混合物。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述的大豆胰蛋白酶抑制剂选自：未变性的大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物中的组分和它们的混合物。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述的大豆胰蛋白酶抑制剂选自大豆奶、大棉豆奶、黑豆奶、大豆提取物、大棉豆提取物、黑豆提取物、大豆糊、大棉豆糊和黑豆糊和它们的混合物。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其中的组合物每天施用两次，至少施用八星期。

7.根据权利要求6所述的用途，其中的组合物以相对高的剂量施用至少4-10星期，然后以相对低的剂量持续施用以维持皮肤的光亮作用。

8.根据权利要求1或2所述的用途，其中的组合物口服使用。

9.根据权利要求1或2所述的用途，其中的组合物非肠道使用。