CN1243248A - 基质定量测定方法及其测定装置 - Google Patents

Abstract

本发明基质定量测定方法及其测定装置,该装置具备含有对被检试料内含有的基质与氧化还原酶的反应量进行电化学检测用的一对电极,该一对电极中的一个极为在单元本体的开口筒状中空部的壁面上形成的膜状电极而另一电极为针状,通过使该针状电极从中空部向外部暂时伸出。对被检体穿刺、从该被检体采取被检试料,从而提供能用微量试料高精度进行基质定量分析的分析单元和高可靠性的基质定量测定方法。

Description

基质定量测定方法及其测定装置

本发明具体涉及根据酶反应对试料中的蔗糖、葡萄糖等基质进行定量测定的方法及所使用的分析单元。

近年来，要求提供能在家庭中容易进行血糖值、尿糖值定量测定分析的方法及其装置。

以往，作为蔗糖、葡萄糖等糖类定量分析方法，开发了旋光度测量法、比色法、还原滴定法以及利用各种色谱法等的方法。但是，这些方法都难以在家庭中应用。例如，若采用旋光度测量法，虽然操作简便，但操作时受温度影响较大。同时，也很难用简易装置高精度测定血液的旋光度。此外，在这些方法中还因对对糖类的特异性不很高，因而测定精度低。

因此，为了能在家庭中也能容易地进行糖类定量分析，正在开发利用含酶特异催化剂作用的生物传感器。

以下，作为利用生物传感器的糖类定量测定方法的一例，对葡萄糖的定量测定方法进行说明。作为电化学的葡萄糖定量法，已知一般有使用作为酶的葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4，以下简称GOD)和使用氧电极或过氧化氢电极进行的方法(例如铃木周一编的“生物传感器”(讲谈社))。

GOD在与电导体共存条件下使作为基质的β-D葡萄糖选择地氧化成葡萄酸-δ-内脂。在氧存在条件下，氧发挥电导体作用、在因GOD引起的氧化反应过程中，使氧还原成过氧化氢。因此，氧的减少量与过氧化氢的增加量和试料中的葡萄糖含量成比例。并且，通过使含葡萄糖的试料在氧存在条件下反应、用氧电极测定此反应的氧的减少量或用过氧化氢电极测定过氧化氢的增加量进行葡萄糖的定量测定。

根据使用上述生物传感器的定量测定方法，虽能从该反应过程进行推测，但是，测定结果很受试料液中所含氧的浓度影响，此外，若试料液中不存在氧，不能进行测定。

因此现正提出为替代氧、以铁氰化钾、二茂铁衍生物、醌衍生物等有机化合物或金属络合物作为电导体而使用的新型葡萄糖传感器。在用此种传感器的测定中，使酶反应结果产生的电导体的还原体在电极上氧化，从该氧化电流量求出试料液中所含葡萄糖等基质的浓度。通过将这样的有机化合物、金属络合物作为电导体使用，能确保使已知量的GOD及其电导体在稳定状态正确地在电极上形成反应层。且也能使反应层在接近干燥状态与电极系统成一体化。基于该技术的使舍型葡萄糖传感器近年来受到更多注目。代表例如日本专利特许第2517153号公报上揭示的生物传感器。在此种使舍型葡萄糖传感器中，能通过仅将试料液导入与测定装置可装拆相连的传感器，容易进行葡萄糖浓度测定。此种方法不限于葡萄糖定量，也能适用于试料液中含有其它基质的定量测定。

在上述生物传感器中，虽然能以数微升试料进行测定，然而，近年来各方面切望提供能以1微升以下更微量试料进行测定的分析单元，但迄今为止、还难以大幅度降低试料量。以往，例如在进行血糖值测定场合，用解剖刀等专用穿刺工具血液渗出后、将采取的血液导入安装于测定装置的传感器内进行测定。在使用微量试料场合，试料干燥将使测量精度降低。为了尽量减少这样的干燥引起的不利影响，要求从采取血液至导入传感器能在短时间内进行。然而，由于用各别专用器具分别进行上述血液采取与测定，使缩短所用时间有限。

此外，一般将传统生物传感器的一对电极配置在同一平面上，因此，在施加电压时容易产生流过的电流密度不均匀，使测定的误差增大。

因此，本发明正是为了解决上述问题，目的在于提供能用微量试料高精度地进行基质定量测定的基质定量测定方法及其测定装置。

在本发明基质定量方法中，作为基质定量测定用的分析单元，具备针状电极、以及在至少其一端面开口的中空部内容纳上述针状电极、并在其内壁上形成膜状电极的筒体。

本发明的基质定量测定方法包括将筒体开口部向被检体按压的步序，使针状电极的尖端部从筒体部向外部暂时伸出、对被检体穿刺、从被检体采取体液等被检试料的步序，将已采取的被检试料向筒体的膜状电极与针状电极间导入的步序，使被检试料内含有的基质与氧化还原酶反应的步序，以及向膜状电极与针状电极间施加电压、对在膜状电极或针状电极上流过的电流进行测定的步序。

本发明分析单元的实施形式为可将针状电极的轴沿中空部轴方向容纳在该中空部内。据此，通过将一对电极配置成相互面对面，在向两极间施加电压时、使流过的电流密度均匀。因此，能对试料的电化学反应进行高精度检测。此时，当缩小针状电极与中空部内面间的间隙、被检试料向中空部内浸透，就能进行测定。

本发明分析单元的其它实施形式为可在针状电极表面的一部分上形成电绝缘层。据此，能使电极面积为一定。此外，能防止在与另一电极、即在中空部壁面上形成的膜状电极间产生短路。

最好在针状电极表面或中空部壁面上形成含有氧化还原酶与电导体的试药层。通过预先将氧化还原酶与电导体配置在电极系统附近，仅通过供给试料就能进行测定。最好在电极表面上直接形成试药层。

在本发明测定装置中，使用如上所述分析单元，具备使分析单元的针状电极的尖端部从本体中空部端面伸出移动的驱动部。在从生物体采取血液等体液时，使生物体的皮肤被中空部开口端面稍稍按压、使针状电极尖端部从该端面暂时伸出，对皮肤刺穿。其后，再次将针状电极容纳在中空部内。使从皮肤渗出的体液附着在针状电极上，利用毛细管现象向中空部内浸透。据此，将体液向电极间供给，可立即进行测定。在此，由于仅须使针状电极的顶端部暂时伸出，故能在驱动部使用弹簧，价格低，且控制简单。

此外，通过再配设把从中空部伸出后的针状电极固定在一定处所、将测定时的膜状电极与针状电极的距离保持一定的机构，能进行高精度测定。

根据本发明，由于使用立体配置的电极系统从而能抑制电流密度的不均匀性，能提供高精度基质定量方法。此外，由于能使试料采取、基质定量迅速进行，能使测定用试料量减少。

对附图的简单说明。

图1为表示本发明一实施例测定装置的结构简图，

图2为表示本发明另一实施例测定装置的结构简图，

图3为该测定装置的纵剖面图，

图4a表示该测定装置采取试料时的状态，图4b表示该测定装置测定时的状态，

图5为本发明又一实施例测定装置主要部分的纵剖面图，

图6为用于该测定装置的支架立体图。

在以下的实施例中，参照附图对作为基质定量测定方法一例的任一种葡萄糖的定量测定法进行具体说明。

首先，说明在本发明中使用电极系统的动作。

图1所示测定装置由分析单元1与装置本体5构成。

分析单元1具有圆筒状构件2及针状导电性构件3。筒状构件2由合成树脂制成，具有其两端面敞开的中空部2a。将中空部2a形成直径为1.2mm、长度为10mm的圆筒状，在其侧壁上形成以银为主体的导电膜4。例如涂敷含银粉末的膏状物，干燥后形成导电膜4。针状构件3以碳为主体，直径为1.0mm、长度为20mm，将其配置在筒状构件2的中空部2a内、使与中空部2a车轴方向一致。在本分析单元1中，针状构件3作为检测被检试料电化学反应的作用电极的功能，导电膜4发挥作为对向电极的功能。

使针状构件3与导电膜4分别与装置本体5相连。装置本体5具有在分析单元1的针状构件3与导电膜4间施加一定电压的施加电压部6以及检测从针状构件3流过电流的电流检测部7。

实际用上述测定装置确认分析单元的动作。

分别使一定量含GOD和铁氰化钾的溶液与数种β-D-葡萄糖浓度不同的溶液混合，分别调制成β-D-葡萄糖浓度不同的试料液，将制成的试料液放置一定时间后引入中空部2a的开口部。

导入中空部2a的开口部的试料液因毛细管作用向内部浸透、向针状构件3与导电膜4间供给。

以导电膜4为基准、向针状构件3施加500mv电压，此刻、通过测定流过针状构件3的电流值、观察与试料液的葡萄糖浓度成比例的响应电流。

如上所述，通过用分析单元1测定氧化电流，能测定被检试料的葡萄糖浓度。尤其在分析单元中，由于能将作用电极与对向电极配置成面对面，这样，和将两电极配置在同一平面上的分析单元相比，能使电极表面的电流密度均匀。因此，能进一步提高基质的定量测定精度。

此外，上述电流起因于以下的电化学反应。在GOD的存在条件下，试料液中的氰铁酸离子和葡萄糖反应，其结果，葡萄糖氧化成葡萄酸内酯，氰铁酸离子还原成氰亚铁酸离子。此氰亚铁酸离子浓度与葡萄糖浓度成比例。当向酶反应后的试料液施加电压时，氰亚铁酸离子氧化成氰铁酸离子。在本测定中，在针状构件3中测出此氧化电流。

以上，通过使用具备在筒体内壁上形成的膜状电极和容纳在筒体内部的针状电极的电极系统，能正确定量测定基质。在以下的实施例中，进而对具备同样的电极系统，以及具备从生物体上直接采取体液功能的测定装置的具体例进行说明。

实施例1

本实施例的测定装置的简要结构如图2所示。本测定装置使用具备含膜状电极4的筒状构件2与针状构件3的分析单元。但是本测定装置具有使针状构件3从筒状构件2的开口部伸出的驱动部11，针状构件3同时发挥作为穿刺器具的功能。

在本测定装置的分析机构10上配设向分析单元两极间施加电压的加电压部12，检测流过电极电流的电流检测部14，对上述进行控制的控制部13，以及把用电流检测部14检测的电流值和相对预先存储的基质浓度的电流量的关系即检测量线进行比较、算出基质浓度的演算部15，以及显示所得的算出值等的显示部16。

控制部13测知针状构件3的穿刺，此后经过一定时间(例如30秒)，向施加电压部12发出以导电膜为基准对针状构件3施加一定电压(例如500mv)的指令信号。电流检测部14根据控制部13的指令信号、用施加电压检测流经针状构件3的电流，即电导体的氧化电流量。

具体的测定装置一例如图3所示。使上述驱动部和分析机构在装置本体20上一体化。

在装置本体20和筒体21内容纳与筒体21的内壁形状大致一致的筒状针保持体24。将帽23拧合在筒体21的一端面上，将筒状构件26可装拆地嵌合在筒体21的另一端面上。

与实施例1同样，在筒状构件26的内壁面上形成作为对向电极的导电膜27。进而，在导电膜27的表面上形成未图示的、含GOD与铁氰化钾的试药层。

针保持体24通过弹簧22与帽23相连。在针保持体24的顶端上安设以碳为主体的针25。此外，从装置本体20卸下帽23将针保持体24取出后进行针25的装拆。针25发挥作用电极功能。

在测定开始前，如图3所示，使针保持体24的固定部24a连接固定在设于筒体21的内壁上的阶梯部29上。此时弹簧22被压缩。

使用者把筒状构件26的开口部按压在被检体皮肤上并按压开关28。据此，使阶梯部29与固定部24a的接合松开，针保持体24因弹簧22的弹力向图的下方移动。如图4a所示，使安设在针保持体24的顶端上的针25从筒状构件26的开口部伸出，对被检体的皮肤进行穿刺、当用针25刺穿被检体的皮肤时，体液就从该处渗出。

在针25刺穿了被检体皮肤后，因弹簧22的复元力欲沿反方向、即图3所示状态回复。但是，针保持体24上的固定部24a因阶梯部30被固定，如图4b所示，将针25与导电膜27固定成面对面。

因穿刺而渗出的体液附着在针25上或因毛细管现象沿筒状构件26内浸透而将体液向电极系统供给。当体液到达在导电膜27上形成的试药层上时，将试药层溶解，因试药层中的酶而激发反应。

这样，根据本实施例，用针25穿刺被检体的皮肤，进而，将此针25用于传感器的作用电极。因此，能使采取被检试料和将该元素向电极系统供给大致同时进行。此外，能避免试料干燥，使由此引起的测定误差减少。因此能用微量试料进行高精度测定。

在此，测定时通过使穿刺后的针保持体24的固定部24a固定于阶梯部29，成为使向筒状构件27供给的试料量大致一定，使响应电流的波动减少。

实施例2

在实施例1的测定装置中，虽然筒状构件27的装拆方便，但为进行针25的装拆，须将帽23卸下后，将针保持体24取出。由于在每次测定时须进行此作业，在进行多项测定的场合十分麻烦。因此，在本实施例中，对在与实施例1同样的测定装置上附加针安装机构的测定装置进行说明。

图5表示本实施例测定装置的主要部分、本测定装置是从装置本体40的开关19一侧将弹簧22一侧的筒体一部分切去、成为装上图6所示的支架35。在支架35上设置多个分别具有与筒体内壁大致一致形状的槽，将针34容纳固定在各槽内。

使针保持体33与为用手动使针保持体33沿图中上下方向移动的操纵杆32相连，在装置本体40的侧壁上形成操纵杆32的导向槽36。在槽36的上端上设置钩37，并将操纵32连接固定在图示位置。

按如下方式进行针34的装拆。在欲将针34取下时、支架35的槽露出在筒体上。当用操纵杆32使已固定于阶梯29或30上的针保持体33上升至图5所示位置为止时，针34即容纳在支架35的槽内。接着，当使支架沿垂直于图面方向移动时，保持部33a松开，并将针34从针保持体33卸下。当使支架35同样移动、使已容纳未使用的针34的槽露出在筒体部上时，进行针34的更换。当在此状态下将操纵杆32的固定解除后，用弹簧22的弹力使已安装新针34的针保持体33向图中下方移动、用阶梯部30固定。

使用者可使用按以上方式安装的针34、进行与实施例1同样的测定。

实施例3

如上述实施例所示，当直接从被检体采取体液进行体液中基质浓度测定时，存在因采取的体液量产生测定值变化的可能性。因此，在本实施例中，对与试料的采取量无关能正确测定的装置进行说明。

被检试料与作用电极接触面积的不同是上述产生测定值变化的一个主要原因。因此，通过规定此接触面积能进行更正确的测定。

分别把与在实施例1中使用的同样的针的顶端部分(约1mm)以及固定于该针保持体24的根部分(约1mm)除去，用电绝缘膜被覆。

用这样得到的针与实施例2同样进行血液中葡萄糖浓度测定。其结果，通过观察依赖于血液中葡萄糖浓度的响应电流，确认使发生的响应电流偏差大幅度降低。

通过如上那样将作为作用电极25的一部分用电绝缘材料被覆，规定作用电极面积，能达到高精度测定。此外，还能防止与配置在筒状构件26的壁面上的导电膜27间发生短路，能够使测定稳定。

实施例4

在使作为作用电极的针状电极移动、使测定时的试药层与作用电极的距离发生偏差时，测定精度降低。例如，在如实施例2那样，当在导电膜27上配置试药层时，在穿刺后的针25的位置从规定位置偏移场合，试药层与作用电极的距离变化。据此，使试料导入时的作用电极界面附近状态(例如作用电极附近的电导体浓度分布及其随时间的变化等)与通常场合不同，可能给测定结果造成误差。

因此，通过在针25上配置试药层，即使万一在穿刺后的针25的位置偏离设定位置的场合，能在每次测定时将作用电极界面附近状态保持大致相同。

实际上，在针25的一定部位上涂敷含GOD与铁氰化钾溶液、干燥后形成试药层，用此针25与实施例2同样进行血液中葡萄糖浓度测定。其结果，通过观察依赖于血液中葡萄糖浓度的响应电流，确认使发生的响应电流偏差大幅度降低。

此外，在上述实施例中，已对分析单元与测定装置的具体例作了说明，然而，这些构件的形状、配置等不受实施例所限，通过使在筒体构件内面上形成的膜状电极与针状电极立体地面对面，也能获得同样的效果。例如，在上述实施例中，将针状构件作为作用电极、膜状电极用作对向电极，然而，也可使此作用电极与对向电极位置对调。作为用于作用电极的材料，除了碳以外，凡在使电导体氧化时其自身不被氧化的导电材料均能使用。作为用于对向电极的材料，除了银以外，也能使用碳、白金等一般常用的导电材料。不用说，也可通过将电绝缘性材料表面用导电材料被覆使用。但是，不言而喻，对针状构件要求具有能耐受穿刺的强度。

此外，在上述实施例中，虽然指出向电极系统施加500mv的电压，然而可不受此限制。

作为氧化还原酶，可相对定量测定的基质进行适当的选择。

作为氧化还原酶，例如可列是果糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、醇酸氧化酶、乳酸氧化酶、胆甾酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶以及氨基酸氧化酶等。

作为电导体，可列我铁氰化钾、对苯醌、吩嗪硫酸甲酯、亚甲基蓝、二茂铁衍生物等。此外，即使把氧作为电导体的场合也能得到响应电流。作为电导体可使用上述一种或两种以上。

通过使试药层在作用电极上固定化，也可以使酶或电导体不溶化。在固定化场合最好是交联固定法或吸附法。

Claims (6)

1.一种基质定量测定方法，其特征在于包括以下步序：制备具有针状电极和在至少其一端开口的中空部内容纳所述针状电极并在其内壁上形成膜状电极的筒体的分析单元的步序；将上述筒体开口部向被检测体按压的步序；使上述针状电极尖端部从上述筒体开口部暂时伸出、对被检测体内穿刺、从上述被检测体采取被检测试料的步序；将采取的被检测试料向上述筒体膜状电极与针状电极间导入的步序；使包含在上述被检测试料内的基质与氧化还原酶反应的步序；以及向上述膜状电极和针状电极间施加电压，对从上述膜状电极或针状电极上流过的电流进行测定的步序。

2.一种基质测定装置，基于上述基质与氧化还原酶的反应量对被测试料中含有基质的量进行电化学测定，其特征在于具备具有至少其一端面开口的筒状中空部的单元本体、在所述单元本体中空部内壁面上形成的膜状电极和容纳在上述单元本体中空部内的针状电极以及使上述针状电极尖端部从上述中空部向外部暂时伸出的机构。

3.根据权利要求2所述装置，其特征在于在上述针状电极表面的一部分上形成电绝缘层。

4.根据权利要求2所述装置，其特征在于在上述针状电极表面上形成含有电导体和上述氧化还原酶的试药层。

5.根据权利要求2所述装置，其特征在于进而在上述单元本体中空部内壁面上形成氧化还原酶和电导体的试药层。

6.根据权利要求2所述装置，其特征在于进而具备把从上述单元本体中空部伸出后的上述针状电极固定在规定处所的机构。

Images