CN1243541A - 表皮细胞的增殖活性化材料 - Google Patents

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Abstract

一种新型表皮细胞增殖活性化材料,它不仅能使人和哺乳动物类的表皮细胞高效率地附着于基床表面并在其表面增殖,而且能促进细胞间的粘结,从而形成平面状层。该材料是由含有以X－射线衍射图表明为α型或α－螺旋型的丝朊为主成分的材料所组成,在作为表皮细胞活性化的基本要求的细胞附着率和增殖性、细胞之间的相互粘结性、细胞层的伸展性等方面均有极优良的性质。

Description

表皮细胞的增殖活性化材料
技术领域
本发明涉及用于促进人和哺乳动物表皮细胞的附着、增殖和细胞层形成的活性化材料。
该活性化材料可作为表皮细胞培养床、又可作为供修复物体上所受皮肤损伤的材料或者创伤被覆材料。
背景技术
作为生命的基本单位的细胞具有表面的或潜在的本身增殖的能力，在多细胞生物中，构成生物体的各细胞向担当各种功能的细胞分化，分别表示规定的增殖形态。
其中，使生物体从外部环境变化保护的表皮中形成细胞，以便以层状被覆该表皮下层的真皮，该细胞具有只附着在其它生物体组织或可代替它的物质上而增殖，并具有制成平面状层的性质。
也就是，在人的表皮的情况下，表皮由好几层构成，表皮通过基底层与在其细胞层下的真皮以波状(凹凸状)相连接而构成，以便具有可保持密切关系的大的接触面。
表皮在其最外面具有称为皮脂膜的油层，该油层具有保持少量水分的功能，在该皮脂膜下形成可含有充分水的角质层(主要是由角蛋白所构成)。
在角质层下，细胞以层状排列，形成细胞层，接着，该细胞层与基底层相连接。
在与这基底层相接触的接触面上，细胞反复地进行分裂，生成新的细胞。
也就是，基底层是细胞诞生、生成的场所。
在基底层生成的表面细胞，逐渐向表面推出，不久，到达皮肤表面，这时，细胞死亡，细胞核消灭，形成角质层。
这样，基底层处于表皮的最深处，并形成复杂的凹凸状，为保持与表面细胞层的密切关系而形成接触面。
在生物体组织外，该基底层经长时间也不可能开始生成、增殖表皮细胞但经过对表皮细胞附着的固体表面基底床的各种探索，结果，近年来已逐渐可能使在生物体以外的表皮细胞进行增殖。
然而，即使用这些方法使表皮细胞增殖时，细胞彼此之间的连接还不能进行，因此，要在生物体表面细胞层形成作为标准的平面状细胞层仍是极为困难的。
过去，作为细胞培养床已开发了聚乙烯等合成高分子物质、胶原等天然高分子物质、而且在合成高分子物质中包含天然高分子物质，但是，还不能说是适于表皮细胞增殖，人们期望有更新的细胞培养床。
最近，作为天然高分子，有人提议用水不溶性的丝被膜所构成的细胞培养床(特公平4-41595号公报)。
这种细胞培养床是使非结晶性的丝被膜以乙醇结晶而所得水不溶的β型丝被膜，其动物细胞的附着率据报导比历来的聚乙烯所制的培养床优越。
然而，在表皮细胞的培养中，当然必须有良好的附着性，而邻近的细胞还必须相互间牢固地附着并制成平面状层。
特别是，当将表皮细胞培养技术用于治疗创伤上时，还希望开发那些能促进平面状细胞层的形成作用的培养床。
本发明目的在于提供新型表皮细胞增殖活性化材料，该材料可使人和哺乳类动物的表皮细胞高效率地粘结于基床表面上并增殖，而且促进细胞间的粘结，从而形成平面状层。
本发明目的还在于提供新型培养床，使人和哺乳类动物的表皮细胞层在生物体外再现形成成为可能。
本发明的目的还在于提供创伤被覆材料，以用于治愈人和哺乳类动物的皮肤创伤。
又，从另一观点来看，本发明目的还在于：通过尝试使表皮细胞在生物体外的发育再现而对表皮机能的基础研究作贡献；并且，由于新型表皮细胞增殖活性化材料而对治愈皮肤创伤的作用机理等研究而作贡献。
通过对丝朊的结晶形态和表皮细胞间的相互作用进行周密研究，本发明人发现主链具有螺旋结构的结晶形态的丝朊、特别是α型或α-螺旋型的丝朊在完成上述目的方面是特别优秀的。
本发明就是基于这种认识而完成的，本发明提供表皮细胞增殖活性化材料、作为细胞增殖的培养床使用的表皮细胞培养床、以及作为创口被覆材料使用的创伤被覆材料。
也就是，本发明存在：(1)由含有X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的丝朊为主成分的材料所组成的表皮细胞增殖活性化材料。
又，本发明存在：(2)在含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的丝朊为主成分的材料中，含有50重量％以下的表明为α-螺旋结晶形态的合成聚氨基酸的表皮细胞增殖活性化材料。
又，本发明存在：(3)具有纤维状、被膜状或粉末状形态的上述(1)或(2)的表皮细胞增殖活性化材料。
又，本发明存在：(4)用含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋结晶形态的丝朊为主成分的材料被覆有机物或无机物的固体表面的表皮细胞增殖活性化材料。
又，本发明存在：(5)由含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的丝朊为主成分的材料所组成的表皮细胞培养床。
又，本发明存在：(6)用含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋结晶形态的丝朊为主成分的材料被覆有机物或无机物的固体表面的表皮细胞培养床。
又，本发明存在：(7)具有被膜状形态的(5)或(6)的表皮细胞培养床。
又，本发明存在：(8)由含有X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的丝朊为主成分的材料所构成的创伤被覆材料。
又，本发明存在：(9)在含有以X-射线衍射图表明的α型或α-螺旋型的丝朊为主成分的材料中含有50重量％以下的表明为α-螺旋型结晶形态的合成聚氨基酸的创伤被覆材料。
又，本发明存在：(10)具有纤维状、被膜状或粉末状形态的(8)或(9)的创伤被覆材料。
又，本发明存在(11)用含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型结晶形态的丝朊为主成分的材料被覆有机物固体表面的创伤被覆材料。
所谓本发明表皮细胞活性化材料是：人和哺乳动物的表皮细胞在基床表面上高效率地附着并增殖，同时由细胞间的粘结制成平面状层从而促进表皮细胞的附着、增殖和形成细胞层的材料。
因此，本发明也含有表皮细胞培养床和创伤被覆材料的概念。
并且，其形状、结构没有特别限制，可采用被膜状(片状乃至薄膜状)、粉末状、珠状、纤维状等各种形状、结构的形态。
又，作为制备表皮细胞增殖活性化材料时所用的材料有如下各种：
a)选自茧丝、生丝、丝织物、绢丝(丝朊纤维)或其未脱胶的原料；
b)由茧丝、生丝、丝织物、绢丝或其未脱胶物分别分离而制备的丝朊或丝胶；
c)选自茧丝、生丝、丝织物、绢丝或其未脱胶物的原料个别分离而制备的丝朊或丝胶混合所得的原料；以及
d)含有丝胶和丝朊的纤维、粉末、薄膜等的用过的制品等；家蚕和野蚕等绢丝虫类所吐的蛋白质纤维物质以及蚕体内的液状丝等。
在这些原料中所含丝胶的量，从相分离观点来看，以总量的40％以下，特别是20％以下为适宜。
又，从成形性观点来看，在上述原料中将所得的具有螺旋结构的合成聚氨基酸(例如：主链的重复单位是以-A-、A-G-、-A-G-S-、-A-G-A-G-S-等表示的物质，这里A是丙氨酸、G是甘氨酸、S是丝胶)以不超过50重量％范围内进行混合。例如：当原料是分别制备的线朊时，在其中以不超过50重量％范围的上述所得的具有螺旋结构的合成聚氨基酸进行混合。
所谓含有本发明的丝朊为主成分的材料就是将含有丝朊的材料按照以下所示的α化处理方法将上述原料中的丝朊转化为α型或α-螺旋型结构的丝朊。
α化处理方法如下：
将含有丝朊和丝胶的上述原料脱胶，随后，在中性盐的存在下溶解于水性溶剂中，将脱盐所得的丝朊水溶液流延在平滑的固体表面上并干燥，因此，制成水溶性的干燥丝被膜。
其次，为了将上述水溶性干燥丝被膜转化为α型或α-螺旋型结构的结晶形态的水不溶性丝被膜(片状或薄膜状)。在室温下调节环境湿度(例如，相对湿度约为80～90％)，以使上述丝被膜的含水率成为40％±15％，放置长时间(例如约12～24小时)。该方法中有如下二个方法：
1)在干燥过程中结晶化的方法
将丝朊水溶液流延在平滑的固体表面后，在干燥过程中，当干燥到丝朊水溶液的含水率达到40％±15％状态时，长时间保持这种状态。
2)干燥后结晶化的方法
一旦使丝朊水溶液干燥后，在室温下约40％±15％的环境下原封不动地长时间保持而使结晶化。
将这样制造的α型或α螺旋型结构的水不溶性丝被膜干燥后，粉碎之，可得到粉末状材料。
这里，必须注意上述丝被膜中的丝被膜的厚度。
当丝被膜的厚度薄时，丝被膜的分子受其所被覆的材质的影响，有时，不一定能满足作为目标的结晶形态。
另一方面，当丝被膜的厚度大时，该被膜易于剥落。
从这个观点看来，丝被膜的厚度以采用0.05～20μm为宜，更好是0.5～10μm。
本发明提供一种具有为表皮细胞活性化所需基本条件的细胞附着率和增殖性、细胞相互之间的粘结性、细胞层的伸展性等方面均有极为优良的性质的材料。
因此，可期望本发明对于表皮科学中的重要诸问题、也就是：在形成表皮细胞层时所发生的生物化学反应的研究；或表皮细胞培养技术在创伤皮肤医疗方面的应用等具有大的贡献。
附图的简单说明：
图1表明本发明实施例1的丝朊的α型X-射丝衍射图像；
图2表明本发明中比较例1的丝朊的β型X-射线衍射图像；
图3表明本发明实施例1的细胞的相位显微镜照片；
图4表明本发明中比较例1细胞的相位显微镜照片；
图5表明本发明中比较例2的细胞的相位显微镜照片；
图6是本发明实施例1的细胞模式图；
图7是本发明中比较例1的细胞模式图；
图8是本发明中比较例2的细胞模式图。
以下对本发明基于实施例作更详细的说明，当然，本发明并不受实施例的限制。
实施例1
将家蚕的生丝在0.1％Na2CO3水溶液、溶比100倍的条件下煮沸2小时，洗净后，干燥，以此进行脱胶。
将基本上除去丝胶的绢丝(丝朊的含有率在97％以上)溶解于一种氯化钙、乙醇、水的摩尔比为1∶2∶8的溶液中，再将其在水中透析而脱盐，制成丝朊的水溶液。
将该水溶液放入细胞培养用的容器(聚苯乙烯制；平底、直径35mm)中，在室温下干燥，在容器底上形成丝朊被膜(薄膜状)。
其次，将在其底上形成上述丝朊被膜的细胞培养用容器放置在室温、相对湿度约为90％的条件下，从而将丝朊被膜的含水率调整到约40％。
随后，在这状态下静置20小时，以进行α化处理。
随后，将经α化处理所得丝朊被膜的一部分剥离取出，并拍摄其X-射线衍射图。
结果，示于图1。
从X-射线衍射图可见，已可以表明，已获得转变为α型结晶结构的丝朊被膜(再者，关于鉴定α型结晶结构的详细情况可参照《高分子论文集》Vol.33，No.8(1976)，第453～462页)。
其次，在形成转变为α型结晶结构的丝朊被膜的上述细胞培养容器中，加入悬浮有约5万个人的表皮细胞的1ml培养液[培养液：表皮细胞用培养剂，极东制药工业有限公司K110]，将它放在含有5％水蒸气饱和的二氧化碳气体、95％空气的、37℃的培养箱内静置培养。
图3表示培养开始后5小时和培养开始后20小时的细胞相位的显微镜照片(100倍)。
又，培养20小时后，除去在容器上附着的发育中的细胞上的培养液，用生理盐水将浮游细胞和死亡细胞洗去，随后，加入胰蛋白酶溶液，保持在37℃下，分离附着的表皮细胞。
而且，在显微镜下，测量其所附着的表皮细胞数，研究表皮细胞附着的程度[表皮细胞附着率{％)]。
结果示于表1。表1
    细胞培养床材料     表皮细胞
    丝被膜(α型)     98％
    丝被膜(β型)     86％
    未处理(聚乙烯)     71％
这里，表皮细胞附着率(％)＝20小时后的附着细胞数/开始时放入细胞培养容器中的数×100。
再者，作为补充试验，进一步以含有表示α-螺旋型的结晶形态的合成聚氨基酸35重量％的混合物与上述的转变为α型结晶结构的丝朊被膜一样地进行了静置培养。
结果，与图3和表1的丝被膜(α型)基本相同。
实施例2
在这实施例中，在对照前，和丝朊β型结晶粉末的创伤被覆材料进行比较。
丝朊的α型和β型结晶粉末按下方法制得。
首先，将实施例1处理所得丝朊水溶液流延在丙烯酸酯板上并风干，制成厚度约30μm的非结晶被膜。
随后，按下述方法使其α型和β型结晶化。
在结晶化中，α化是在室温、相对湿度约90％的室内放置一天，以便使丝朊被膜的含水率约为40％。
β化是通过将70％的乙醇水溶液喷雾在丝朊被膜上而进行的。
将这些α型和β型丝朊被膜干燥，以物理方法粉碎，分别制成平均颗粒大小50μm以下。
为了了解作为创伤被覆材料这些丝朊的α型和β型结晶粉末的治愈效果，用狗(无毛犬)作为对象进行实验。
将无毛犬背部皮肤由三个部位各剥离1cm2的面积，直剥到真皮。
然后，在三个部位的创伤部分分别滴下数滴0.05％葡糖酸洗必太溶液，以进行消毒。
其次，在三个部位的创伤部分中，一个部位以α型结晶粉末被覆；另一部位以β型结晶粉末被覆。
剩下的一个部位以消毒后的原状态作为对照区。
随后，将这三个部位的创伤部分用有透湿性的薄膜状保护材料(商品名是泰卡达姆(テガダ一ム)]加以保护。
一星期后创伤部分的皮肤组织再生状况示于表2。
表2
受伤后   肉眼观察     创作被覆材料
的日数     α型    β型 对照区
  7天 炎症的程度     -     -     +
表皮的再生     +     +     -
-表示基本没有；+表示有
用α型结晶粉末和β型结晶粉末被覆创伤部分比不用创伤被覆材料的对照区的治愈效果大。
另一方面，将α型结晶粉末与β型结晶粉末相比较时，用肉眼观察，看不出明显的差异，但用另一方法进行观察组织图像的致密性时，表明前者的α型结晶粉末比后者的β型结晶粉末有更良好的治愈过程。
比较例1(β化处理)
除用β化处理(在α化处理之前，将在容器底上形成的丝朊被膜干燥，随后，进行70％乙醇水溶液喷雾后，在室温下干燥)代替实施例1的α化处理外，按照实施例1相同的方法制成结晶化丝朊被膜。
其X-射线衍射图示于图2。
培养开始后5小时和20小时的细胞的相位显微镜照片(100倍)示于图4。
在这里，与实施例1相同，研究了培养开始后20小时的表皮细胞附着率(％)。
其结果示于表1。
比较例2(聚乙烯)
直接使用市售的聚苯乙烯容器(具体说是：Becton Dickinson andCompany公司的FALON 100g)，按实施例1同样方法将人的表皮细胞静置培养。
又，培养开始后5小时和20小时的细胞的相位显微镜照片(100倍)示于图5。
这里也和实施例1同样地研究了培养开始后20小时的表皮细胞附着率(％)。
其结果示于表1。
如图6～图8(图3～5是从上所见的模式图；分别是α型、β型和聚乙烯)和表1所示那样，当用本发明的表皮细胞增殖活性化材料(培养床)培养人的表皮细胞时，与比较例1、2相比可知：在对培养床表面的细胞附着性、增殖均匀性的同时，还在细胞相互间的粘结性、细胞层的成长伸展性方面都极为优越。
其原因可认为是：具有螺旋型结构的表皮细胞增殖活性化材料的表面形成与生物体表皮的基底层膜(基底膜)相类似的微细凹凸面，使向该材料表面的细胞配位紧密地附着并能均匀而有效率地进行增殖，结果，形成以生物体表皮的细胞层为标准的细胞层。
顺便提一下，有这样的现象：在图6(α型)中细胞间的间隙几乎没有；图7(β型)中，细胞间的间隙相当大；而图8(聚乙烯)则除细胞间的接触少之外，其细胞的外形也不均匀。
本发明促进人和哺乳动物表皮细胞的附着、增殖和细胞层的形成，因此，除作为表皮细胞培养床，创伤被覆材料外，还可用于在形成表皮细胞层时的生物化学反应研究，用于创伤皮肤医疗、牲畜等许多方面。

Claims (11)

1.表皮细胞增殖活性化材料，其特征在于，由含有以X-射线衍射的图表明为α型或α-螺旋型丝朊为主成分的材料所组成。
2.表皮细胞增殖活性化材料，其特征在于，在含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的丝朊作为主成分的材料中，含有50重量％以下的表明为α-螺旋结晶形态的合成聚氨基酸。
3.根据权利要求1或2所记载的表皮细胞增殖活性化材料，其特征在于，它具有纤维状、被膜状或粉末状形态。
4.表皮细胞增殖活性化材料，其特征在于，将有机物或无机物的固体表面用含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋的结晶形态的丝朊为主成分的材料进行被覆。
5.表皮细胞培养床，其特征在于，由含有用X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的丝朊作为主成分的材料所构成。
6.表皮细胞培养床，其特征在于，将有机物或无机物的固体表面用含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋的结晶形态的丝朊作为主成分的材料进行被覆。
7.根据权利要求5或6所记载的表皮细胞培养床，其特征在于，具有被膜状的形态。
8.创伤被覆材料，其特征在于，由含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的丝朊为主成分的材料所构成。
9.创伤被覆材料，其特征在于，含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的丝朊作为主成分的材料中，含有50重量％以下的表明为α-螺旋型结晶形态的合成聚氨基酸。
10.根据权利要求8或9所记载的创伤被覆材料，其特征在于，具有纤维状、被膜状或粉末状的形态。
11.创伤被覆材料，其特征在于，将有机物的固体表面用含有以X-射线衍射图表明为α型或α-螺旋型的结晶形态的丝朊作为主成分的材料进行被覆。
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