CN1244215B - 改进的腺病毒载体生产和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明针对了提高生长在细胞培养系统中的病毒载体产量的需求。特别是，已经证实对于腺病毒，在贴壁细胞培养系统中采用培养基低速灌流提高了产量。在其它实例中，本发明已经显示，在无血清条件下尤其是在无血清悬浮培养下生长的细胞中，Ad-p53生产有所提高。另外要提高产量重要的是采用洗涤剂裂解。本发明这些方面的组合允许通过一步层析步骤来纯化病毒，所得纯化病毒的质量与采用两次超离心的CsCl条带制得的质量相同。

Description

改进的腺病毒载体生产和纯化方法

发明背景

本发明是1997年11月20日提交的待审查美国临时专利申请No.60/031,329的部分续展申请。上述申请的全部文本被纳入本文作参考并且没有除去权利要求。

1.发明领域

本发明总的涉及细胞培养和病毒生产领域。更具体的说，本发明涉及培养哺乳动物细胞、用腺病毒感染那些细胞并从中生产感染性腺病毒颗粒的改进的方法。

2.相关技术描述

目前正在对表达治疗性蛋白的腺病毒载体在临床上治疗各种癌适应征(包括肺、头部和颈部癌)进行评估。随着临床实验的进展，对临床级腺病毒载体的需求迅速增加。对于300名患者的临床实验，每年计划需求可达约6×10¹⁴PFU。

在传统上，腺病毒以商业上可获得的组织培养瓶或“细胞工厂(cellfactory)”方式生长。收获病毒感染的细胞并冻融，以细胞粗制裂解液的形式从细胞中释放出病毒。然后用两次CsCl梯度超离心纯化制得的粗制细胞裂解液(CCL)。典型报道的100个单托盘细胞工厂的病毒产量约为6×10¹²PFU。很明显，用这一传统方法不能生产所需量的病毒。为了满足增长的需求，必须开发出新的可放大的、经过验证的生产和纯化方法。

通过CsCl梯度超离心的纯化具有很大的局限性，它不能满足对基因治疗用腺病毒载体的需求。因此，为了大量生产腺病毒载体，必须开发出除CsCl梯度超离心外的纯化方法。关于层析纯化病毒的报道非常少，尽管层析技术已经广泛用于纯化重组蛋白。现已评价了体积排阻、离子交换和亲和层析可不同程度地成功纯化逆转录病毒、蜱传脑炎病毒和植物病毒(Crooks等，1990；Aboud等，1982；McGrath等，1978；Smith和Lee，1978；O′Neil和Balkovic，1993)。层析纯化腺病毒的研究就更少了。这方面研究工作的缺少可能部分是由于有效的(尽管不能放大的)CsCl梯度超离心纯化腺病毒的方法存在的缘故。

最近，Huyghe等(1996)报道了用离子交换层析结合金属螯合亲和层析来纯化腺病毒载体。其报道了与CsCl梯度超离心相近的病毒纯度。不幸的是，在两次柱纯化过程后，只回收获得23％的病毒。导致这种低病毒回收率的方法上的因素是为了从细胞中释放出病毒而在裂解细胞时作者所采用的冻融步骤以及两次柱纯化步骤。

显然，需要有一种有效的、可放大的腺病毒载体生产方法，该方法能回收高产量的产品以满足对该产品日益增长的需求。

发明概述

本发明描述了一种生产和纯化腺病毒的新方法。这一新的生产方法不仅提供了可放大性和可验证性，而且提供的病毒纯度与采用CsCl梯度超离心所得病毒纯度相当。

因此，本发明提供了一种生产腺病毒的方法，该方法包括使宿主细胞在低速灌流下的培养基中生长，用腺病毒感染宿主细胞，收获并裂解宿主细胞，产生粗制细胞裂解液，浓缩该粗制细胞裂解液，更换粗制细胞裂解液的缓冲液，降低该粗制细胞裂解液中污染的核酸浓度。

在特定的实例中，本发明还包括用层析从裂解液中分离出腺病毒颗粒。在某些实例中，分离基本上由一步层析步骤组成。在其它的实例中，层析步骤是离子交换层析。在特别佳的实例中，离子交换层析在pH约7.0-10.0下进行。在更佳的实例中，离子交换层析是阴离子交换层析。在某些实例中，阴离子换层析采用DEAE、TMAE、QAE或PEI。在其它较佳的实例中，阴离子交换层析采用Toyopearl Super Q 650M、MonoQ、Source Q或Fractogel TMAE。

在本发明的某些实例中，培养基中的葡萄糖浓度维持在约0.7-1.7g/L之间。在其它某些实例中，缓冲液的交换包括渗滤步骤。

在本发明较佳的实例中，腺病毒包含编码外源基因构建物的腺病毒载体。在某些这样的实例中，基因构建物与一启动子操作性相连。在特定的实例中，启动子是SV40IE、RSV LTR、β-肌动蛋白或CMV IE、腺病毒主要晚期、多瘤F9-1或酪氨酸酶启动子。在本发明某些特别的实例中，腺病毒是无复制能力的腺病毒。在其它实例中，腺病毒缺少至少一部分E1区域。在某些方面，腺病毒缺少至少一部分E1A和/或E1B区域。在其它实例中，宿主细胞能互补复制。在特别佳的实例中，宿主细胞是293细胞。

在本发明的较佳实例中，考虑让外源基因构建物编码治疗性基因。例如，治疗性基因可编码反义ras、反义myc、反义raf、反义erb、反义src、反义fms、反义jun、反义trk、反义ret、反义gsp、反义hst、反义bcl、反义abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFVras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCAI、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF G-CSF、胸苷激酶或p53。

在本发明的某些方面，可用低渗溶液、高渗溶液、冻融、超声破碎、冲击流(impingingjet)、微流体化(microfluidization)或洗涤剂来收获细胞并使细胞场外(exsitu)裂解。在其它方面，可用低渗溶液、高渗溶液或洗涤剂收获细胞并使细胞原位裂解。本文所用的术语“原位”指细胞位于组织培养装置(例如CellCube^TM)内，而“场外”指细胞从组织培养装置中被取出。

在特定的实例中，用洗涤剂来裂解和收获细胞。在较佳的实例中，洗涤剂可以是

或辛基葡糖苷。在本发明的其它方面，裂解可通过感染细胞自身裂解来实现。在本发明的其它某些方面，可用

或

处理细胞裂解液。

在特定的实例中，该方法还包括采用膜过滤的浓缩步骤。在特定的实例中，过滤是切向流过滤。在较佳的实例中，过滤可采用100-300K NMWC的再生纤维素或聚醚砜膜。

本发明还提供了一种腺病毒，该腺病毒根据下述方法制得，该方法包括使宿主细胞在低速灌流下的培养基中生长，用腺病毒感染宿主细胞，收获并裂解宿主细胞，产生粗制细胞裂解液，浓缩该粗制细胞裂解液，更换粗制细胞裂解液的缓冲液，和降低该粗制细胞裂解液中污染性核酸的浓度。

本发明的其它方面提供了纯化腺病毒的方法，该方法包括使宿主细胞生长，用腺病毒感染宿主细胞，通过使细胞与洗涤剂接触来收获并裂解宿主细胞产生粗制细胞裂解液，浓缩该粗制细胞裂解液，交换该粗制细胞裂解液的缓冲液，和降低粗制细胞裂解液中污染性核酸的浓度。

在特定的实例中，洗涤剂可以是

或辛基葡糖苷。在更特定的实例中，洗涤剂在裂解液中的浓度约为1％(w/v)。

在本发明的其它方面，提供了一种根据下述方法制得的腺病毒，该方法包括使宿主细胞生长，用腺病毒感染宿主细胞，通过使细胞与洗涤剂接触来收获并裂解宿主细胞产生粗制细胞裂解液，浓缩该粗制细胞裂解液，交换该粗制细胞裂解液的缓冲液，和降低粗制细胞裂解液中污染性核酸的浓度。

在还有一个实例中，本发明提供了一种纯化腺病毒的方法，该方法包括使宿主细胞在无血清培养基中生长；用腺病毒感染所述宿主细胞；收获并裂解宿主细胞以产生粗制细胞裂解液；浓缩所述粗制细胞裂解液；交换该粗制细胞裂解液的缓冲液；以及降低所述粗制细胞裂解液中污染性核酸的浓度。在较佳的实例中，细胞可作为细胞悬浮培养物独立生长或贴壁依赖型培养生长。

具体而言，本发明第一方面提供了一种生产腺病毒组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a)使宿主细胞在包含葡萄糖的培养基中生长；

b)灌流培养所述细胞；

c)用腺病毒感染所述宿主细胞；和

d)收获和裂解所述宿主细胞，以产生包含所述腺病毒组合物的裂解液。

本发明第二方面还提供了一种制备腺病毒组合物的方法，该方法包括下述步骤：

a)使宿主细胞在灌流反应器、生物反应器中生长或通过分批进料方法生长；

b)用腺病毒感染所述宿主细胞；

c)收获并裂解所述宿主细胞，以产生包含腺病毒的粗制裂解液组合物；和

d)用包括一步或多少层析步骤的方法从所述裂解液中纯化获得腺病毒。

本发明第三方面还提供了一种制备腺病毒组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a)使宿主细胞在培养基中生长；

b)用腺病毒感染所述宿主细胞；和

c)收获和裂解所述宿主细胞，以提供含腺病毒的裂解液；

d)从所述裂解液中纯化获得腺病毒，纯化方法包括减少污染性核酸的含量和层析步骤，其中所述层析步骤基本上包括一步层析步骤。

本发明第四方面还提供了一种生产纯化的腺病毒组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a)使宿主细胞在培养基中生长；

b)通过灌流或分批进料方法向所述宿主细胞提供营养物；

c)用腺病毒感染所述宿主细胞；

d)裂解所述宿主细胞，以提供包含腺病毒的细胞裂解液，其中所述裂解是通过受感染的细胞自身裂解来实现的；和

e)从所述裂解液纯化腺病毒，以提供纯化的腺病毒组合物。

本发明第五方面还提供了一种生产腺病毒组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a)使宿主细胞在包含葡萄糖的培养基中生长；

b)灌流培养所述细胞；

c)用腺病毒感染所述宿主细胞；和

d)收获和裂解所述宿主细胞，以产生包含所述腺病毒组合物的裂解液。

本发明第六方面还提供了一种制备纯化的腺病毒组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a)使宿主细胞在培养基中生长；

b)用腺病毒感染所述宿主细胞；

c)收获和裂解所述宿主细胞，以产生包含腺病毒的裂解液；和

d)从所述裂解液中纯化腺病毒来提供纯化的腺病毒组合物，所述纯化方法包括一个层析步骤且不使用氯化铯密度梯度离心，其中所述层析步骤是单个层析步骤，且在层析步骤后从裂解液中纯化腺病毒的回收率为起始PFU的70％±10％。

本发明第七方面还提供了一种制备纯化的腺病毒组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a)使宿主细胞生长；

b)通过灌流或分批进料方法向所述宿主细胞提供营养物；

c)用腺病毒感染所述宿主细胞；

d)用包括低渗溶液、高渗溶液、冲击流、微流体化、固体剪切、洗涤剂、液体剪切、高压挤压、自身裂解或超声破碎的方法裂解所述宿主细胞，以产生包含腺病毒的粗制的裂解液组合物；和

e)从所述裂解液中纯化腺病毒以提供纯化的腺病毒组合物，所述纯化方法包括一个层析步骤且不使用氯化铯密度梯度离心，其中所述层析步骤是单个层析步骤。在特定的实例中，使宿主细胞适应在无血清培养基中生长。在更佳的实例中，使细胞适应在无血清培养基中生长的方法包括逐步减少生长培养基中的胎牛血清含量。更特别的，无血清培养基所含胎牛血清低于0.03％v/v。

在其它实例中，该方法还包括用层析从所述裂解液中分离出腺病毒颗粒。在较佳的实例中，分离基本上由单步层析步骤组成。更特别的，层析步骤是离子交换层析。

本发明还考虑根据下述方法制得的腺病毒，该方法包括使宿主细胞在无血清培养基中生长；用腺病毒感染所述宿主细胞；收获并裂解所述宿主细胞以产生粗制细胞裂解液；浓缩所述粗制细胞裂解液；交换该粗制细胞裂解液的缓冲液；以及降低所述粗制细胞裂解液中污染性核酸的浓度。

本发明还提供了适应在无血清培养基中生长的293宿主细胞。在某些方面，使细胞适应在无血清培养基中生长的方法包括逐步减少生长培养基中的胎牛血清含量。在特定的实例中，使细胞适应在悬浮培养液中生长。在特定的实例中，本发明的细胞是命名为IT293SF的细胞。这些细胞保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)内，以符合国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的要求。该细胞由Shuyuan Zhang博士以Introgen Therapeutics，Inc.(Houston，Tx.)的名义于1997年11月17日保藏。IT293SF细胞系从本文所述使293细胞系适应无血清悬浮培养液的方法获得。该细胞可培养在添加了100毫克/升肝素和0.1％pluronicF-68的IS 293无血清培养基(Irvine Scientific.Santa Asa，Ca.)中，并能受人腺病毒感染。

从下列详细描述中可明显得出本发明的其它目的、特征和优点。然而，应当理解，详述和具体实施例只是说明了本发明的较佳实例，它们只用来描述，因为本领域技术人员明显能在本发明的精神和范围内对这些详述作各种变化和改动。

附图简述

下列附图组成了本说明书的一部分，它们被包括在内以便进一步证明本发明的某些方面。在参看了这些附图的一张或多张并结合本文所述具体实例的详细描述后，就能更好地了解本发明。

图1A和图1B。采用“高”的(图1A)和“低”的(图1B)培养液灌流速度生产的病毒溶液的HPLC曲线。

图2。CellCube^TM中的粗制细胞裂解液(CCL)的HPLC曲线(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图3A、3B、3C、3D和3E。用不同洗涤剂裂解的CellCube^TM所得裂解液的HPLC曲线。图3A用

图3B用

图3C用

图3D用

图3E用

洗涤剂浓度：1％(w/v)裂解温度：室温。(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图4A和4B。用Benzonase处理前(图4A)后(图4B)的病毒溶液的HPLC曲线。(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图5。1M氯化钠存在下Benzonase处理后的病毒溶液的HPLC曲线。(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图6。在20mM Tris+1mM MgCl₂+0.2M NaCl，pH7.5的缓冲液A条件下AdCMVp53病毒的纯化。

图7。在20mM Tris+1mM MgCl₂+0.2M NaCl，pH9.0的缓冲液A条件下AdCMVp53病毒的纯化。

图8A、8B和8C。纯化所得级分的HPLC分析。图8A为级分3。图8B为级分4。图8C为级分8。(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图9。在20mM Tris+1mM MgCl₂+0.3M NaCl，pH9的缓冲液A条件下AdCMVp53病毒的纯化。

图10A、10B、10C、10D和10E。纯化所得粗制病毒级分以及CsCl梯度纯化的病毒的HPLC分析。图10A为粗制病毒溶液。图10B为流穿液。图10C为峰1。图10为峰2。图10E为CsCl纯化的病毒。(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图11。5cm id柱的HPLC纯化曲线。

图12。SDS-PAGE上检测到的主要腺病毒结构蛋白。

图13。纯化病毒中western印迹试验有可检测水平的BSA浓度。

图14。CellCube^TM产生的粗制细胞裂解液材料的层析情况。

图15。用本发明方法由Toyopearl SuperQ树脂纯化的处理过的病毒溶液的洗脱曲线。

图16A和16B。纯化过程所得病毒级分的HPLC分析。图16A是第一步纯化所得病毒级分的HPLC曲线。图16B是第二步纯化所得病毒级分的HPLC曲线。(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图17。培养液低速灌流下用1％液收获的病毒溶液的纯化。

图18。培养液低速灌流下产生的病毒级分的HPLC分析。

图19A、19B和19C。柱纯化病毒的分析结果。图19A是SDS-PAGE分析。图19B是BSA的western印迹分析。图19C是测定污染性核酸浓度的核酸狭线印迹分析。

图20A、20B、20C、20D、20E和20F。Toyopearl SuperQ 650M树脂的容量研究。图20A表示加样比1∶1时所得的流穿液。图20B是加样比1∶1时所得的纯化病毒。图20C为加样比2∶1时所得的流穿液。图20D为加样比2∶1时所得的纯化病毒。图20E为加样比3∶1时所得的流穿液。图20F为加样比3∶1时所得的纯化病毒。(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图21。等密度CsCl超离心柱纯化的病毒。

图22。柱纯化所得病毒中存在的完整病毒的HPLC曲线。A为完整病毒。B为缺陷型病毒。(实线为A₂₆₀，点线为A₂₈₀)。

图23。AdCMVp53的生产和纯化流程图。

描述性实例说明

现已表明，腺病毒载体可成功用于真核细胞基因表达和疫苗开发。最近，动物研究已经证明重组腺病毒可用于基因治疗。在向不同组织给予重组腺病毒的成功研究中已经证实了腺病毒载体在治疗中的效果。这一成功导致了该载体在人临床实验中的应用。现在，对生产各种治疗用腺病毒载体的需求正在增加。而目前可行的技术却不能充分满足这一需求。因此，本发明提供了大量生产用于这些治疗的腺病毒的方法。

本发明涉及一种开发用来生产和纯化复制缺陷型重组腺病毒的方法。生产方法以使用Cellcube^TM生物反应器为基础来进行细胞生长和生产病毒。发现在细胞生长和培养产生病毒阶段，所给定的灌流速度对下游的病毒纯化有明显影响。更具体的，低至中等的灌流速度提高了病毒生产。此外，由缓冲洗涤剂组成的、在病毒生产阶段末尾用来裂解Cellcube^TM中细胞的裂解溶液也促进了此方法的效果。有了这两个优点，在浓缩/渗滤和核酸酶处理(以降低粗制病毒溶液中污染性核酸的浓度)后，采用一步离子交换层析操作就能纯化收获的粗制病毒溶液。柱纯化病毒的纯度相当于两次CsCl梯度纯化后的病毒纯度。该方法的病毒产物总回收率为70％±10％。这与Huyghe等(1996)报道的结果相比有显著的改善。与两次CsCl梯度超离心相比，柱纯化的优点是更恒定一致、更能放大、更经得起验证、更快，且更廉价。这一新方法在生产基因治疗用腺病毒载体技术中显示出了明显的改进。

因此，本发明的目的是在大规模培养系统和纯化中吸取这些改进之优点来生产和纯化腺病毒载体。下面将详细描述该系统的各组分以及用其进行的腺病毒生产方法。

1.宿主细胞

A)细胞

在一个较佳的实例中，腺病毒载体的生产和增殖取决于一个独特的辅助细胞系(称为293)，该细胞系是通过腺病毒血清5型(Ad5)DNA片段和组成型表达E1蛋白转化人胚肾细胞而得的(Graham等，1977)。由于E3区域可从Ad基因组中分出(Jones和Shenk，1978)，因此，目前的Ad载体在293细胞的帮助下可在E1、E3或这两个区域内携带外来DNA(Graham和Preves，1991；Bett等，1994)。

本发明第一个方面是表达部分腺病毒基因组的重组细胞系。这些细胞系能够支持腺病毒重组载体以及具有某些腺病毒基因缺失的辅助病毒的复制，即，“允许”这些病毒和载体生长。重组细胞也指辅助细胞，因为它能弥补无复制能力的腺病毒载体中的缺陷并支持其复制。腺病毒辅助细胞的原型是含有腺病毒E1区域的293细胞系。通过反式提供复制所需E1活性元件，293细胞支持E1功能缺失的腺病毒载体的复制。

本发明的辅助细胞从哺乳动物细胞获得，较佳的是从灵长类细胞(如人胚肾细胞)获得的。尽管各种灵长类细胞是较佳的，人细胞或甚至是人胚肾细胞是最佳的，但是能支持病毒复制的细胞类型应能为本发明实践所接受。其它细胞类型可包括，但不局限于，Vero细胞、CHO细胞或任何建立了组织培养技术的真核细胞，只要这些细胞容许腺病毒生长。术语“容许腺病毒”指腺病毒或腺病毒载体能在该细胞环境内完成整个胞内病毒生命周期。

辅助细胞可从已有的细胞系获得，例如从293细胞系获得，或从头开发。此类辅助细胞表达出的腺病毒基因是反式弥补腺病毒基因组中的缺失或支持另一种缺陷型(如E1、E2、E4、E5和晚期功能缺失)腺病毒载体复制所需的。腺病毒基因组的特定部分E1区域已经用来生产互补细胞系。缺少病毒复制起始区的腺病毒基因组部分在导入细胞系中后，无论它是整合还是游离的，都不会复制，甚至当此细胞受野生型腺病毒超感染时。另外，由于主要晚期单元的转录在病毒DNA复制之后，因此细胞系中不能充分表达腺病毒的晚期功能。因此，覆盖了晚期功能(L1-5)的E2区域将由辅助病毒而不是细胞系来提供。通常，本发明的细胞系将表达E1和/或E4。

本文所用的术语“重组”细胞指其中已经导入基因(如腺病毒基因组或另一细胞的基因)的细胞。因此，重组细胞可与不含导入重组基因的天然存在的细胞区别开来。因此，重组细胞是具有通过“人工”导入的基因的细胞。

使未感染的细胞层或感染了一种或多种辅助病毒的细胞与病毒颗粒接触，然后培养细胞，以测定复制。病毒噬斑或细胞层中无细胞区域的形成是某些病毒产物表达而引起细胞裂解的结果。细胞裂解表明有病毒复制。

可与能复制的病毒一起使用、或可转变成弥补宿主细胞与辅助缺陷型病毒一起使用的其它有用的哺乳动物细胞系是Vero和HeLA细胞，以及中国仓鼠卵巢、W138、BHK、COS-7、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞的细胞系。

B)在选择培养基中的生长

在某些实例中，可采用选择系统来消除不需要细胞的生长。利用带有可选择标记物的永久性转化细胞系，或用编码可选择标记物的病毒载体来转导或感染细胞系，就可实现这一点。在任一情况下，转化/转导的细胞与合适的药物或选择性化合物一起培养将使携带标记物的那些细胞的细胞数量增加。

标记物的例子包括，但不局限于，分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。另外，对于赋予氨甲喋呤抗性的dhfr、赋予霉酚酸抗性的gpt、赋予氨基葡糖苷G418抗性的neo和赋予潮霉素抗性的hygro，可用抗代谢产物抗性作为选择根据。

C)血清戒断(weaning)中的生长

在重组蛋白(Berg，1993)和病毒疫苗(Perrin，1995)的生产中已经采用了将贴壁依赖型细胞通过血清戒断法适应于无血清悬浮培养。关于将293A细胞适应无血清悬浮培养的报道非常少。直到最近，Gilbert报道了将293A细胞适应于无血清悬浮培养，用来生产腺病毒和重组蛋白(Gilbert，1996)。类似的方法已经用于使A549细胞适应无血清悬浮培养来生产腺病毒(Morris等，1996)。然而，适应悬浮培养的细胞中细胞特异性病毒的产量比其亲代贴壁细胞低约5-10倍。

采用类似的血清戒断方法，本发明者已经成功地使293A细胞适应于无血清悬浮培养(293SF细胞)。在该步骤中，通过逐步降低T形烧瓶中的FBS浓度，可使293细胞适应商业上可获得的293培养基。简言之，培养基中初始血清浓度约为10％FBS DMEM培养基(在T-75烧瓶中)，通过逐步降低培养基中FBS浓度，可使细胞适应T烧瓶中的无血清IS 293培养基。在T-75烧瓶中传代6次后，估计FBS％约为0.019％。使细胞在T形烧瓶中再传代培养两次，然后将它们转移到摇瓶中。本文中下述结果表明细胞可在无血清培养基(IS293培养基，IrvineScientific，Santa Ana，CA)中满意地生长。细胞平均倍增时间为18-24小时，此时不更换培养基达到静止细胞浓度约为4-10×10⁶细胞/毫升。

D)使细胞适应悬浮培养

现已采用两种方法来使293细胞适应悬浮培养。Graham通过在裸鼠中连续传代3次使293A细胞适应悬浮培养(293N3S细胞)。发现悬浮293N3S细胞能支持E1腺病毒载体。然而，Garnier等(1994)观察到293N35在悬液中初始滞后阶段相当长，生长速度很低，聚集趋势强。

现已采用的第二种方法是使293A细胞逐步适应悬浮生长(Cold Spring HarborLaboratories，293S细胞)。Garnier等(1994)报道了用293S细胞来生产腺病毒载体的重组蛋白。该文作者发现，在无钙培养基中的293S细胞的聚集要少得多，且在病毒感染时更换新鲜培养基将使蛋白产量有显著增加。发现不更换培养基时，葡萄糖是培养液中的限制性因素。

在本发明中，使已适应无血清条件生长的293细胞再适应悬浮培养。将细胞转移到无血清250毫升旋转悬浮培养容器(100毫升工作体积)中进行悬浮培养，初始细胞密度在约1.18E+5vc/ml至5.22E+5vc/ml之间。在培养基中添加肝素以防止细胞聚集。该细胞培养系统能使细胞密度有所增加，并保持细胞存活。一旦这些细胞在培养中生长，使细胞在摇瓶中传代培养约7次以上。应注意，细胞的倍增时间逐渐减少直至连续传代末期倍增时间约为1.3天，即与用10％FBS培养基作贴壁细胞培养的1.2天相当。在添加了肝素的无血清IS293培养基中，几乎所有的细胞均以单个细胞存在，而不会在悬浮培养液中形成细胞聚集物。

2.细胞培养系统

生产感染性病毒载体的能力对于医药工业，尤其是基因治疗方面越来越重要。在过去的十年中，生物技术的发展导致产生了许多重要的病毒载体，这些病毒载体在治疗、疫苗接种和蛋白生产机理中有潜在的用途。采用哺乳动物培养中的病毒载体比在细菌或其它低等生命形式宿主中产生的蛋白更具优点，因为它们能在翻译后加工复杂的蛋白结构，如依赖于二硫键的折叠和糖基化。

设计和构建在哺乳动物细胞培养中高度有效的载体系统、一组有用的选择标记物、基因扩增方案，以及对涉及从导入的载体获得最终的有生物活性分子的生化和细胞机理更深刻的理解，这些分子生物学技术中的发展大大帮助了用来生产病毒载体的细胞培养技术的发展。

通常，在选择细胞系作为表达系统的宿主前，是不考虑影响生产放大的下游方面(在本例中在细胞裂解之后)的因素的。同样，能长时间维持非常高密度培养的生物反应器系统的发展也不能满足以较低成本提高产量的需求的增长。

本发明将利用最近可得到的生物反应器技术的优点。根据本发明在生物反应器中培养细胞，能大量生产可被本发明腺病毒载体感染的具有完全生物活性的细胞。通过在低速灌流下运行该系统并采用不同方案来纯化感染颗粒，本发明提供了一种易放大的大量生产高度纯化产品的纯化策略。

生物反应器已经广泛用于从悬浮型和贴壁依赖型动物细胞培养来生产生物制品。对于腺病毒载体生产来说，最广泛采用的生产细胞是贴壁依赖型人胚肾细胞(293细胞)。为了获得高的生产细胞密度和高的病毒产量，待开发用于腺病毒载体生产的生物反应器应当有高的体积-培养表面积比(volume-specific culturesurface area)。搅拌罐生物反应器中的细胞培养微载体提供了非常高的体积-培养表面积比，并已经用来生产病毒疫苗(Griffiths，1986)。而且，搅拌罐生物反应器在工业上已经被证实能够放大。Corning-Costar生产的多板式Cellcube^TM细胞培养系统也提供了非常高的体积-表面积比。细胞在密封在一起的组装立方体形培养板两侧面上生长。与搅拌罐生物反应器不同，Cellcube^TM培养单元是一次性使用的。在临床用产品的早期生产中，这是非常希望的，因为与一次性系统有关的资本支出、质量控制和质量保证成本低。考虑到不同系统提供的优点，对搅拌罐生物反应器和Cellcube^TM系统的腺病毒生产进行评价。

A)贴壁依赖型对比非贴壁依赖型培养

动物和人细胞在体外可以两种方式来增殖：使细胞在整个培养空间内悬浮自由生长的非贴壁依赖型；或需要使细胞附着在固体基材上进行增殖的贴壁依赖型(即单层型细胞生长)。

建立的持续生长的细胞系的非贴壁依赖型或悬浮培养是大规模生产细胞和细胞产物中使用最广泛的方式。基于微生物(细菌和酵母)发酵技术的大规模悬浮培养对于生产哺乳动物细胞产物有明显的优点。该方法的操作相对简单，且可直接放大。反应器可提供均匀的条件，从而能精确地监控温度、溶氧和pH，并能确保能对培养物取样。

然而，不能总是用悬浮培养的细胞来生产生物物质。悬浮培养仍被认为具有致肿瘤的潜在可能，因此，作为生产用底物它们的用途限于所得产物在人和动物中的应用(Petricciani，1985；Larsson，1987)。与贴壁依赖型培养相反，悬浮培养中繁殖的病毒有时可以使病毒标记物迅速改变，从而使免疫原性降低(Bahnemann，1980)。最后，与悬浮培养中的相同细胞系相比，有时甚至贴壁依赖培养增殖的重组细胞系可分泌更大量的产物(Nilsson和Mosbach，1987)。由于这些原因，不同类型贴壁依赖型细胞被广泛用于生产不同的生物制品。

B)悬浮用反应器和方法

在搅拌罐中大规模悬浮培养哺乳动物培养物。生物反应器的装置和控制手段以及发酵罐的设计应适应相关的微生物应用。然而，随着生长较慢的哺乳动物培养物中控制污染物的需求增加，改进的无菌设计被迅速采用，从而提高了这些反应器的可依赖性。设备和控制手段基本上与其它发酵罐相同，包括搅拌、温度、溶氧和pH控制。对于在线和离线测定浊度(存在的颗粒的函数)、容量(存在的存活细胞的函数)、葡萄糖/乳酸、碳酸盐/碳酸氢盐和二氧化碳，可采用更先进的探头和自动分析仪。悬浮培养可获得的最大细胞密度相对较低，约为2-4×10⁶细胞/毫升(低于1毫克细胞干重/毫升)，该密度远远低于微生物发酵所实现的数目。

工业上最广泛采用的两种悬浮培养反应器设计是搅拌式反应器和气升式反应器，因为它们操作简单耐用。搅拌式反应器已经成功用于8000升容量规模的干扰素生产(Phillips等，1985；Mizrahi，1983)。细胞在高径比为1∶1至3∶1的不锈钢罐中生长。培养物通常将一个或多个基于带桨的盘或船用推进器形式的搅拌器混合使用。提供剪切力低于桨式的搅拌器系统已有描述。搅拌可由磁耦合驱动机来直接或间接驱动。间接驱动减少了通过搅拌轴的密封处的微生物污染的可能。

气升式反应器最初也被描述用于微生物发酵，后来适用于哺乳动物细胞培养，它依靠气流来混合和向培养物供氧。气流进入形成反应器的上升部分并推动循环。气体离开培养表面，使得没有气泡的密度更大的液体在反应器的下降部分中向下运动。这种设计的主要优点是简单，不需要机械混合。高径比通常为10∶1。气升式反应器很容易放大，气体传递质量良好，产生较低的剪切力。

大多数大规模悬浮培养以分批或分批进料方式操作，它们的操作和放大最简单。然而，也可采用基于恒化器或灌流原理的连续方式。

分批方法是一种封闭的系统，其中可观察到典型的生长曲线。滞后期后是指数生长期、静止期和衰退期。在这种系统中，由于营养物的消耗和代谢物的累积，环境是连续变化的。这就使得分析影响细胞生长和产量以及优化培养过程变得很复杂。通过控制补加入关键营养物，延长生长周期，可提高分批过程的产量。这种分批进料过程仍是一种封闭的系统，因为没有取出细胞、产物和废物。

在仍然是封闭的系统中，通过各种装置(例如细网眼旋转滤器、中空纤维或平板膜滤器、沉降管)滞留细胞，可使新鲜的培养液灌流通过培养物。旋转滤器培养可产生约5×10⁷细胞/毫升的细胞密度。真正的开放系统和最简单的灌流方法是恒化器，其中有培养基的流入和细胞及产物的流出。在反应器中加入预订的恒定速度的培养基，该恒定速度可维持培养物的稀释率低于细胞的最大生长速度(以防止将细胞团块洗出反应器)。含有细胞、细胞产物和副产物的培养液以相同速度排出。

C)非灌流贴壁系统

传统上，贴壁依赖型细胞培养物在小的玻璃或塑料容器底部繁殖。经典的传统技术所提供的有限的表面体积比只适用于实验室规模，它在大规模生产细胞和细胞产物中产生一个瓶颈。在小的培养体积中为细胞生长提供大的可及表面系统的尝试中，已经提出了许多方法：滚瓶系统、堆板增殖器、螺旋膜瓶、中空纤维系统、填充床、板式交换系统和膜导管卷筒(membrane tubing reel)。由于这些系统本身性质上是不均一的，有时基于多种方法，因此它们有下列缺点：放大潜力有限、细胞取样困难、测定和控制关键过程参数的潜力有限、以及很难维持整个培养过程均一的环境条件。

尽管有这些缺点，大规模贴壁依赖型细胞生产的常用方法是滚瓶。由于稍大于T形烧瓶且具有不同的形状，该系统的简单性使得其非常可靠，因此有吸引力。可采用完全自动化的机器装置每天来处理成千上万个滚瓶，从而消除了污染的可能和(否则)需要人工处理带来的不一致性。通过经常更换培养基，滚瓶培养物可获得接近0.5×10⁶细胞/cm²的细胞密度(对应于约10⁹细胞/瓶或接近10⁷细胞/毫升培养基)。

D)在微载体上的培养

在试图克服传统贴壁依赖型培养方法的缺点的努力中，van Wezel(1967)开创了微载体培养系统的概念。在该系统中，细胞在小固体颗粒的表面上繁殖，该固体颗粒通过缓慢搅拌而悬浮于生长培养基中。细胞附着于微载体，并逐渐生长至铺满微载体表面。实际上，这种大规模培养系统将贴壁依赖型培养从单皿方式升级到单元方式，其中将单层培养和悬浮培养结合在一起。因此，将细胞生长所需表面与均匀悬浮培养的优点结合起来提高了产量。

微载体培养与其它大多数贴壁依赖型大规模培养方法相比有几个优点。首先，微载体提供了较高的表面-体积比(可通过改变载体浓度来变化)，从而导致了高细胞密度得率和获得高浓度细胞产物的潜力。当培养物以灌流反应器模式繁殖时，细胞产量可高达1-2×10⁷细胞/毫升。第二，细胞可在一个单元的加工容器中繁殖，而不是采用多个产量低的小容器(即烧瓶或皿)。这就能更好地利用营养物，大大节省了培养基。而且，在单一反应器中的繁殖减少了对设备空间的需求和每个小室处理所需步骤的数目，从而减少了劳动成本和污染的危险。第三，充分混合的均一的微载体悬浮培养使得能对环境条件(如pH，pO₂和培养基组分的浓度)进行监控，从而导致细胞繁殖和产物回收的重复性更佳。第四，可取出典型样品进行显微镜观察、化学测定或计数。第五，由于微载体能在没有悬浮时迅速沉降，因此补料分批过程的使用或细胞的收获相当容易进行。第六，贴壁依赖型培养物在微载体上的繁殖方式使得能将该系统用于其它细胞操作，如不用蛋白水解酶的细胞转移、细胞的共同培育、移植入动物体内，和用倾析器、柱、流化床或中空纤维来保留微载体对培养物进行灌流。第七，微载体培养相对容易用微生物和动物细胞悬浮培育所用的常规设备来放大。

E)哺乳动物细胞的微囊化

一种特别适用于培养哺乳动物细胞的方法是微囊化。哺乳动物细胞被保留在半渗透水凝胶膜内。细胞周围形成的多孔膜允许细胞与胶囊周围的培养基交换营养物、气体、和代谢产物。已经开发出了几种温和、迅速和无毒的方法，其中所得膜是多孔的、牢固的，足以维持整个培养期间的细胞生长。这些方法均以可溶性海藻酸盐液滴接触含钙溶液时形成胶凝为基础。Lim(1982，美国专利4,352,883，纳入本文作参考)作了这样的描述：将细胞浓集在约1％的海藻酸钠溶液中，使该溶液通过小孔，形成液滴，并自由地进入约1％的氯化钙溶液中。然后液滴即被铸在与表面海藻酸盐离子键连接的聚氨基酸层中。最后以螯合剂处理液滴除去钙离子，使海藻酸盐重新液化。其它方法采用细胞在钙溶液中，将钙溶液滴入海藻酸盐溶液中，从而产生了中空的海藻酸盐球体。一种类似的方法涉及将脱乙酰壳多糖溶液中的细胞滴入海藻酸盐中，也形成中空的球体。

微囊化细胞很容易在搅拌罐反应器中繁殖(珠粒直径在150-1500μm范围内)，且利用细眼筛网容易保留在灌流反应器中。胶囊体积与总培养基体积之比可维持在1∶2至1∶10。胶囊内的细胞密度高达10⁸，培养物中的有效细胞密度为1-5×10⁷。

微囊化与其它方法相比的优点包括：保护细胞免受喷射和搅拌产生的剪切力的不利影响，能够容易地保留珠粒以便采用灌流系统，放大较简单，珠粒能用来埋植。

本发明包括天然是贴壁依赖型的细胞。例如，293细胞是贴壁依赖型的，当其悬浮生长时，细胞将相互依附，长成簇块，最终当簇块到达一定大小而培养条件不能维持核心细胞时，每一簇块的内核中的细胞将窒息。因此，需要有一种大规模培养贴壁依赖型细胞的有效方式来有效地利用这些细胞产生大量腺病毒。

F)灌流贴壁系统

灌流贴壁系统是本发明的一种较佳的形式。灌流指生理营养物溶液在稳定的速度下连续流动通过细胞群体。它意味着将细胞保留在培养单元内，这与将细胞和回收的培养基一起洗出的连续流动培养(如恒化器)相反。灌流的思路自本世纪初就已知道，并被用来维持小片段组织存活以延长显微观察。该技术最初用于模拟细胞体内环境，向细胞连续提供血液、淋巴或其它体液。不用灌流，培养中的细胞将经历喂饱和饥饿的交替阶段，从而限制了其生长的完全表达和代谢潜力。

灌流培养目前的用途是应付高密度(即0.1-5×10⁸细胞/毫升)生长培养细胞的挑战。为了提高密度超过2-4×10⁶细胞/毫升，必须用新鲜的供应物不断地替换培养基，以便弥补营养物的缺陷和除去毒性产物。灌流能更好的控制培养物环境(pH，pO₂，营养物水平等)，是一种显著提高细胞贴壁培养中表面区域利用率的方法。

使用非纺织物作为床基质的灌流式填充床反应器的发展提供了一种维持灌流培养物密度超过10⁸细胞/毫升床体积的方法(CelliGen^TM，New BrunswickScientific，Edison，NJ；Wang等，1992；Wang等，1993；Wang等，1994)。简言之，该反应器包括用来培养贴壁和非贴壁依赖型细胞的改进的反应器。该反应器被设计成填充床带有提供内部再循环的装置。较佳的，将纤维基质载体置于反应器容器中的篮筐中。篮筐的顶部和底部有孔，培养基能流入通过篮筐。一个特别设计的推进器驱使培养基再循环通过纤维基质占据的空间，以确保营养物的均匀供应和废物的排除。这同时保证了悬浮于培养基中的细胞团块总量可忽略不计。此篮筐和再循环的联合还使充氧的培养基无气泡地通过纤维基质中流动。该纤维基质是孔径为10μm至100μm的非纺织物，与各个小室体积相比，其1至20倍的孔体积提供了很高的内部体积。

与其它培养系统相比，该方法提供了几个显著的优点。由于纤维基质载体，保护细胞免受搅拌和发泡的机械应力。流经篮筐的自由培养基向细胞提供了最优调节水平的氧气、pH和营养物。产物可从培养物中连续除去，收获的产物不含细胞，其可在低蛋白培养基中产生，有利于后续纯化步骤。另外，该反应器系统的独特设计还提供了更容易的方式来放大反应器。近来已放大至30升。100升和300升级别正在开发中，而理论计算支持高达1000升反应器。该技术在WO94/17178(1994年8月4日，Freedman等)中有详细描述，该专利全部纳入本文作参考。

Cellcube^TM(Corning-Costar)模型为粘附基质细胞的固定和生长提供了大的苯乙烯(styrenic)表面区域。它是一种填充在胶囊中的无菌的单用途装置，该装置有一系列平行的培养板，这些板连接在一起从而在毗邻板之间产生薄的密封的层流空间。

Cellcube^TM模型的对角线上有彼此相对的入口和出口，它们有助于调节介质的流动。在最初接种后生长前几天，系统内所含培养基通常能满足培养物的需求。初次接种和开始培养液灌流之间的时间长短取决于接种的细胞密度和细胞生长速度。循环培养基中营养物浓度的测定值，是培养状态良好的指标。在建立工艺过程时，需要监测各种不同灌流速度下的营养物成分，以确定最经济、产量最高的操作参数。

系统中的细胞达到了高于传统培养系统中的密度(细胞/毫升)。许多通常采用的基础培养基设计为能支持1-2×10⁶细胞/毫升/天。典型的Cellcube^TM运行表面为85000cm²，模型内含有约6升培养基。培养容器中的细胞密度通常超过10⁷细胞/毫升。在铺满时，每天需要2-4个反应器体积的培养基。

培养物生产阶段的计时和参数取决于特定细胞系的类型和用途。许多培养物生产所需的培养基与培养物生长阶段所需的培养基不同。在传统培养物中，从一个阶段转变成另一个阶段可能需要多步洗涤。然而，Cellcube^TM系统采用了灌流系统。这种系统的优点是能提供不同操作阶段间的微小转变。灌流系统不需要除去生长培养基中血清组分的传统洗涤步骤。

在本发明的一个典型实例中，Cellcube^TM系统用于生长AdCMVp53转染的细胞。根据生产商的建议将293细胞接种入Cellcube^TM中。接种细胞密度在1-1.5×10⁴/cm²范围内。使细胞在pH＝7.20，DO＝60％空气饱和度的培养条件下37℃生长7天。根据Cellcube^TM中的葡萄糖浓度调节培养液灌流速度。在病毒感染前一天，将灌流培养基从含10％FBS的缓冲液变成含2％FBS的缓冲液。在第8天，以感染复数(MOI)为5的病毒感染细胞。在感染后立即停止培养液灌流1小时，然后在病毒产生阶段的其余时间内继续灌流。在感染后45-48小时时收获培养物。当然，这些培养条件是列举性的，可根据特定细胞系的营养需要和生长需求作变化。这种变化不需要作过多实验即可进行，是本领域普通技术人员力所能及的。

G)无血清悬浮培养

在特定的实例中，如上所述，基因治疗用腺病毒载体从贴壁依赖型293细胞培养物(293A细胞)中产生。腺病毒载体生产的放大受到293A细胞的贴壁依赖性限制。为了实现放大，满足将来对腺病毒载体的需求，已经作了很大努力来开发容易放大的其它生产方法。方法包括使293A细胞在微载体培养中生长，使293A生产型细胞适应悬浮培养。微载体培养技术如上所述。该技术有赖于生产型细胞粘附在微载体表面上，而微载体通过机械搅拌悬浮于培养基中。要求细胞粘附可能对微载体培养的可放大性有一些限制。

在本申请之前还没有关于用293悬浮细胞来生产基因治疗用腺病毒载体的应用。而且，报道的悬浮293细胞需要培养基中存在5-10％的FBS以使细胞生长和病毒生产最优。在历史上，尤其是在最近，由于一些国家爆发了牛海绵体脑病(BSE)，细胞培养基中牛源蛋白的存在已受到规章所关注。不得不发展精密复杂的下游纯化方法来除去最终产物中的污染蛋白和外来的病毒。无血清293悬浮培养的开发被认为是生产基因治疗用腺病毒载体的主要的方法改进。

在摇瓶和3L搅拌罐生物反应器中生产病毒的结果表明，293SF细胞的细胞病毒比产量(cell specific virus productivity)约为2.5×10⁴vp/细胞，其约为293A细胞的60-90％。然而，由于更高的静止细胞浓度，293SF培养物的体积病毒产量基本上与293A细胞培养物相等。本发明者还观察到，通过病毒感染时更换新鲜的培养基可明显提高病毒产量。本发明者将评价培养基中的限制因素。

这些发现为可放大的、有效的和容易验证的腺病毒载体生产方法创造了条件。该适应方法不局限于293A细胞，它还同样适用于其它腺病毒载体生产型细胞。

3.细胞收获和裂解方法

腺病毒感染导致受感染的细胞裂解。腺病毒感染的裂解特征允许有两种不同的病毒生产模式。一种是在细胞裂解前收获感染的细胞。另一种方法是在细胞被产生的病毒完全裂解后收获病毒上清液。对于后一种方式，需要较长的培养时间以使细胞完全裂解。这种病毒感染后的长时间培养产生了严重问题，即，产生具有复制能力的腺病毒(RCA)，尤其是目前第一代腺病毒载体(E1缺陷型载体)的可能性增加。因此，选择在细胞裂解前收获感染细胞作为生产方式。表1列出了在收获细胞后裂解细胞的最常用方法。

表1.用于裂解细胞的方法

方法	工艺	评价
			冻融法	在干冰和37℃温水浴之  间循环进行	在实验室规模易于实施。细胞裂解效率高  不能放大  不建议用于大规模生产
固体剪切	French挤压  Hughes挤压	需投资设备资本  有病毒污染问题  缺乏经验
			洗涤剂裂解	非离子型洗涤剂溶液如吐  温、Triton、NP-40等	在实验室和生产规模上均易于实施  有多种洗涤剂可选  在成品中有残余洗涤剂的问题
低渗溶液裂  解	水、柠檬酸缓冲液	裂解效率低
			液体剪切	匀浆器  冲击流  微流体化器	需投资设备资本  有病毒污染问题  有可放大性问题
超声破碎	超声	需投资设备资本  有病毒污染问题  噪音污染  有可放大性问题

A)洗涤剂

细胞受细胞膜约束。为了释放细胞组分，需要破坏打开细胞。根据本发明，实现这一目的的最有利方式是用洗涤剂溶解细胞膜。洗涤剂是两亲性分子，它有脂族或芳族性质的非极性端和带电荷或不带电荷的极性端。洗涤剂比脂类更亲水，因此水溶解度比脂类更大。它们可使水不溶性化合物分散入水性介质中，并可用来分离和纯化天然形式的蛋白。

洗涤剂可以是变性的或非变性的。前者可以是阴离子型，如十二烷基硫酸钠或阳离子型如乙基三甲基溴化铵。这些洗涤剂整个破坏了膜，并通过破坏蛋白-蛋白相互作用使蛋白质变性。非变性洗涤剂可分成非阴离子型洗涤剂如

胆汁盐如胆酸盐以及两性离子洗涤剂如CHAPS。两性离子在同一分子中有阳离子和阴离子基团，正电荷被同一或毗邻分子上的负电荷中和。

变性剂(如SDS)与蛋白(如单体)结合，驱使反应向平衡移动直至饱和。因此，单体的游离浓度确定了所需的洗涤剂浓度。SDS结合是协同性的，即，一个SDS分子的结合提高了另一个分子与该蛋白结合的可能性，并将蛋白变成与其分子量成比例的棒状。

非变性试剂(如

)不与天然构象结合，也没有协同结合机理。这些洗涤剂有刚性的、大的、不穿透入水溶性蛋白的非极性部分。它们与蛋白的疏水部分结合。和其它聚氧乙烯非阴离子洗涤剂不能有效地破坏蛋白之间的相互作用，它们能使蛋白人为地凝聚。然而，这些洗涤剂对蛋白-脂类相互作用的破坏柔和得多，能维持蛋白的天然形式和功能潜力。

洗涤剂的去除可采用多种方式。透析对以单体形式存在的洗涤剂非常有效。透析对易凝聚成胶粒的洗涤剂的效果差，因为胶粒太大，不能通过透析膜。可用离子交换层析来解决这一问题。将破坏的蛋白溶液施加到离子交换层析柱上，然后用无洗涤剂缓冲液洗柱。缓冲液与洗涤剂溶液平衡的结果是洗涤剂被除去。或者，蛋白溶液可以通过密度梯度。当蛋白沉降通过梯度时，洗涤剂将由于化学势能而离开。

通常，一种洗涤剂不足以既用来溶解又用来分析细胞中发现的蛋白胶粒。蛋白质可溶于一种洗涤剂中，然后置于另一种合适的洗涤剂中进行蛋白分析。第一步骤中形成的蛋白洗涤剂胶粒应与纯洗涤剂胶粒分开。当将这些加入过量分析用洗涤剂中时，发现胶粒中有蛋白和两种洗涤剂。洗涤剂-蛋白胶粒的分离可通过离子交换层析或凝聚过滤层析、透析或浮力密度型分离来实现。

-洗涤剂：这一洗涤剂家族(

X-114和NP-40)有相同的基本性质，但是它们具体的疏水性-亲水性特征不同。所有这些非均相洗涤剂均有8碳支链与芳环相连。分子的这一部分贡献了该洗涤剂大部分的疏水性。

洗涤剂用来在非变性条件下溶解膜蛋白。溶解蛋白的洗涤剂的选择取决于待溶解蛋白质的疏水性。疏水性蛋白需用疏水性洗涤剂来有效溶解。

和NP-40在结构和疏水性上非常相似，在大多数情况(包括细胞裂解、脱脂蛋白解离和膜蛋白与脂类增溶)中它们可互换。溶解1毫克膜蛋白通常用2毫克洗涤剂，溶解1毫克脂膜用10毫克洗涤剂。可用来分离疏水性和亲水性蛋白。

洗涤剂：它们与洗涤剂的结构相似，因为它们有不同长度的聚氧乙烯链与疏水链相连。然而，不象

洗涤剂那样，

洗涤剂没有芳环，碳链长度可以变化。用透析很难将

洗涤剂从溶液中除去，但可用除洗涤剂凝胶来除去。在疏水性/亲水性性质上与

最相似。

是HPLC应用中常用的洗涤剂。

可透析非离子型洗涤剂：η-辛基-β-D-葡糖苷(辛基葡糖吡喃糖苷)和η-辛基-β-D-硫代葡糖苷(辛基硫代葡糖吡喃糖苷，OTG)是非变性非离子型洗涤剂，它们很容易从溶液中透析出来。这些洗涤剂可用来溶解膜蛋白，在280nm下的UV吸光度较低。辛基葡糖苷的CMC高达23-25mM，已被用来在1.1-.12％的浓度下溶解膜蛋白。

辛基硫代葡糖苷首先被合成用来提供辛基葡糖苷的替代物。辛基葡糖苷的生产成本昂贵，而且由于它能被β-葡糖苷酶水解，它在生物系统有一些固有的问题。

洗涤剂：

洗涤剂是非变性非离子型洗涤剂。它们是脂肪酸的聚氧乙烯山梨糖醇酯。和在生化应用中用作封闭剂，它们通常被加入蛋白溶液中以防止蛋白与疏水性材料(如塑料或硝基纤维素)的非特异性结合。在ELISA和印迹应用中，它们已被用作封闭剂。通常，这些洗涤剂以0.01-1.0％的浓度使用，以防止与疏水性材料的非特异性结合。

已经显示，

和其它非离子型洗涤剂能除去硝基纤维素表面的一些蛋白。

已被用来溶解膜蛋白、防止蛋白与多孔塑料组织培养板的非特异性结合，以及在ELISA中减少血清蛋白和生物素化蛋白A与聚苯乙烯板的非特异性结合。

这些洗涤剂之间的差别是脂肪酸链的长度不同。衍生于C₁₈链的油酸，而衍生于C₁₂链的月桂酸获得。较长的脂肪酸链使得

洗涤剂的亲水性低于

洗涤剂。两种洗涤剂均易溶于水。

洗涤剂很难通过透析从溶液中除去，但是

可用除洗涤剂凝胶除去。这些洗涤剂中发现的聚氧乙烯链使得它们会被氧化(形成过氧化物)，

和

系列洗涤剂也是如此。

两性离子洗涤剂：两性离子洗涤剂CHASP是胆酸的磺基内酰胺衍生物。当蛋白活性很重要时，两性离子洗涤剂适用于溶解膜蛋白。该洗涤剂可在较宽的pH(pH2-12)下使用，并且由于其CMC高(8-10mM)，它很容易通过透析来从溶液中除去。该洗涤剂在280nm下有低的吸光度，这使得它能用于需要在该波长下监测蛋白的情况。CHAPS与BCA蛋白试验相容，它可通过除洗涤剂凝胶从溶液中除去。蛋白可在CHAPS存在下碘化。

CHAPS已经成功地用来溶解内膜蛋白和受体并维持蛋白功能。当细胞色素P-450溶解在

或胆酸钠中时，将形成凝聚物。

B)不采用洗涤剂的方法

结合本发明的其它有利方面，可采用各种非洗涤剂的方法(尽管不是较佳的)：

冻融法：这是一种广泛采用的以温和而有效的方式裂解细胞的技术。细胞通常在(例如)干冰/乙醇液体中迅速冷冻直至完全冻结，然后转移到37℃水浴中直至完全解冻。多次重复这一循环，以达到完全的细胞裂解。

超声处理：已经发现高频率超声振荡可用来破坏细胞。用超声波破坏细胞的方法还未被完全了解，但是知道当悬浮液受超声振动作用时会产生高的瞬变压力。该技术的主要缺点是会产生相当多的热量。为了使热效应最小，采用特别设计的玻璃容器来盛放细胞悬液。这种设计使得悬液从超声探头处循环流动到悬浮在冰中的烧瓶近壁部而被冷却。

高压挤压：这是一种破坏微生物细胞的常用方法。French挤压细胞采用10.4×10⁷Pa(16000p.s.i.)压力打破细胞。这些装置由不锈钢容器组成，容器通过针阀向外开启。将细胞悬液置于容器内，使针阀处于闭合位置。在翻转容器后，打开阀门，推入活塞，排出容器内的所有空气。使阀处于闭合位置，将容器恢复到最初位置，置于固体基座上，用液压向活塞施加所需压力。当达到压力时，针阀部分打开，微微释放出压力，细胞因膨胀而破裂。在维持压力时保持阀门打开，从而可收集破裂细胞的细流。

固体剪切方法：在Mickle振动器中，在直径为500nm的玻璃珠存在下剧烈振荡悬液(300-3000次/分钟)，可用研磨剂实现机械剪切。该方法将导致细胞器破坏。更可控制的方法是用Hughes压力，其中活塞迫使大多数细胞和研磨剂或深冻细胞浆通过压力容器中的0.25mm直径裂缝。可用高达5.5×10⁷Pa(8000p.s.i.)的压力来裂解细菌制备物。

液体剪切方法：这些方法采用了混合器(采用高速往复或旋转叶片)、匀浆器(采用活塞向上/向下运动)、球磨和微流体化器或冲击流(利用高速通过小直径管道或两股液流的高速撞击)。混合器的叶片以不同角度倾斜，以进行有效地混合。匀浆器通常以几秒钟内的短暂高速冲击进行操作，以使局部产热最小。这些技术通常不适用于微生物细胞，但是甚至是非常温和的液体剪切通常就足以破坏动物细胞。

低渗/高渗方法：使细胞暴露在溶质浓度低得多(低渗)或高得多(高渗)的溶液中。溶质浓度的不同产生了渗透压梯度。在低渗环境中导致水流入细胞使得细胞溶胀破裂。在高渗环境下水流出细胞使得细胞皱缩，随后破裂。

4.浓缩和过滤方法

本发明的一方面采用了从细胞裂解液中粗提纯腺病毒的方法。这些方法包括澄清、浓缩和渗滤。该纯化方法中的最初步骤是使细胞裂解液澄清以除去细胞裂解液中较大的颗粒物质，尤其是细胞成分。裂解液澄清可通过深层过滤或切向流过滤来实现。在本发明的一个较佳实例中，使细胞裂解液通过深层过滤器，该过滤器由相对没有吸附性的物质(如聚酯树脂、砂、硅藻土、胶体、凝胶等)的填充柱组成。在切向流过滤(TFF)中，使裂解液流经通过膜表面，该表面能使溶质从膜表面反扩散到溶液中。膜通常安排在各种类型的过滤装置(包括开槽板框、中空纤维和小管)中。

在澄清和预过滤细胞裂解液后，首先浓缩所得病毒上清液，然后用渗滤更换缓冲液。用切向流过滤通过标称截留分子量为100-300K的超滤膜浓缩病毒上清液。超滤是压力变化的对流过程，它采用半透膜依靠分子大小、形状和/或电荷来分离各种物质。它将溶剂和不同大小的溶质分开，无论溶质分子大小如何。超滤是温和而有效的，它可同时用来对溶液浓缩和脱盐。超滤膜通常有两个不同的层：孔径为10-400埃的薄(0.1-1.5μm)而密的皮层，以及孔隙逐渐增大的开放结构，该结构大部分向超滤膜的渗透侧开放。因此，能通过皮层通孔的任何物质能自由地通过膜。为了最大程度地截留溶质，应选择标称截留分子量远远低于待滞留物质的膜。在大分子浓缩中，膜增浓了所需生物物质的含量，提供了没有截留物质的滤液。微溶质和溶剂一起被对流除去。随着截留溶质浓度的增加，超滤速度降低。

采用超滤膜的渗滤或缓冲液交换是除去和交换盐、糖类、从结合物质中游离的非水性溶剂的分离、除去低分子量物质、迅速改变离子和pH环境的理想手段。通过以相同于超滤速度的向溶液中加入待起滤溶剂，可最有效地除去微溶质。这能在恒定体积下从溶液中洗去微小物质，纯化了滞留的物质。本发明在用

处理前用渗滤步骤来更换病毒上清液的缓冲液。

5.病毒感染

在一个实施例中，本发明采用腺病毒感染细胞以产生有治疗意义的载体。通常，在生理条件下将病毒简单地接触合适宿主细胞，使细胞吸收病毒。尽管列举的是腺病毒，但是本方法可有助于采用其它病毒载体(如下所述)。

A)腺病毒

腺病毒特别适于用作基因转移载体，因为其DNA基因组的大小中等，易于操纵，滴度高，靶细胞范围广，且感染率高。大约36kB的病毒基因组与100-200碱基对(bp)的末端反向重复序列(ITR)相连，其中含有病毒DNA复制和包装所需的顺式(cis)作用元件。含有不同转录单元的基因组早期(E)和晚期(L)区域被病毒DNA复制起点分开。

E1区(E1A和E1B)编码起调节病毒基因组和几个细胞基因转录作用的蛋白。E2区(E2A和E2B)的表达导致病毒DNA复制蛋白的合成。这些蛋白参与了DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。晚期基因(L1、L2、L3、L4和L5)的产物(包括大多数病毒衣壳蛋白)仅仅在主要晚期启动子(MLP)引起的单个初级转录物显著加工后才表达。MLP(位于16.8图谱单元)在感染晚期是特别有效的，该启动子导致的所有mRNA具有5′三联前导序列(TL)，使得它们成为较佳的翻译mRNA。

为使腺病毒最适于基因治疗，必须使其携带容量最大化，从而能插入大的DNA片段。另外也非常希望减少某些腺病毒产物的毒性和免疫反应。通过辅助病毒和/或辅助细胞，除去大部分腺病毒基因组，提供反式缺陷型基因产物，就能在载体中插入大部分异源DNA。这种策略也将减少腺病毒基因产物的毒性和免疫原性。

大量替换DNA是可行的，因为病毒DNA复制所需的顺式(cis)元件均在线形病毒基因组任一端的末端反向重复序列(ITR)(100-200bp)内。含有ITR的质粒可在非缺陷型腺病毒存在下复制(Hey等，1984)。因此，腺病毒载体中包括这些元件应能够复制。

另外，病毒衣壳化的包装信号在病毒基因组左端194-385bp(0.5-1.1图谱单元)间(Hearing等，1987)。该信号模拟了噬菌体λDNA中的蛋白识别位点，其中靠近左端但在粘性末端序列外的特异性序列介导了与DNA插入头部结构所需的蛋白的结合。Ad的E1取代载体的研究证明，病毒基因组左端450bp(0-1.25图谱单元)片段能指导293细胞中的包装(Levero等，1991)。

以前，已经表明腺病毒基因组的某些区域可掺入哺乳动物细胞的基因组中，并且表达编码基因。这些细胞系能够支持由细胞系编码的腺病毒功能缺失的腺病毒载体的复制。另外，还有关于通过“辅助”载体(如野生型病毒或条件性缺陷突变株)来补充复制缺陷型腺病毒载体的报道。

复制缺陷型腺病毒载体可通过辅助病毒来反式互补。然而，单单这一观察不能分离复制缺陷型载体，因为存在着提供复制功能所需的辅助病毒将污染任何制品。因此，需要有一个附加元件，该元件可为复制缺陷型载体的复制和/或包装增加特异性。本发明提供的这一元件衍生于腺病毒的包装功能。

已经知道，腺病毒的包装信号在常规腺病毒图谱的左端(Tibbetts，1977)。近期研究表明，基因组E1A(194-358bp)区缺失的突变株甚至在弥补早期(E1A)功能的细胞系中的生长都很差(Hearing和Shenk，1983)。当补偿性DNA(0-353bp)重组入突变株右端时，病毒可正常包装。进一步的突变分析鉴定出了Ad5基因组左端中有一个短的重复的位置依赖型元件。发现如果该重复序列存在于基因组的任一端(但不向Ad5DNA分子内部移动时)，则其一个拷贝就足以进行有效包装(Hearing等，1987)。

利用突变型包装信号，就可以产生以不同效率包装的辅助病毒。突变通常是点突变或缺失。当包装效率较低的辅助病毒在辅助细胞中生长时，病毒被包装，但是与野生型病毒相比速度降低，从而允许辅助病毒繁殖。然而，当这些辅助病毒和含有野生型包装信号的病毒一起在细胞中生长时，野生型包装信号优先于突变型被识别。给予有限量的包装因子，则与辅助病毒相比，含有野生型信号的病毒被选择性包装。如果偏好性足够大，应可获得接近均一性的原种。

B)逆转录病毒

尽管用腺病毒感染细胞来生产在治疗上显著的载体是本发明的一个较佳实例，但是本发明也考虑可采用逆转录病毒感染细胞以生产该载体。逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征是能够在被感染细胞中通过逆转录过程使其RNA变成双链DNA(Coffin，1990)。然后所得DNA作为原病毒稳定地整合入细胞染色体中并指导病毒蛋白的合成。整合导致接受的细胞及其后代中保留了该病毒基因序列。逆转录病毒基因组含有三个基因-gag，pol和env，它们分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜成分。gag基因上游所发现的序列(称为Y)起着基因组包装进入毒粒的信号作用。在病毒基因组的5′和3′端有两个长末端重复序列(LTR)。它们含有强的启动子和增强子序列，并且也是整合入宿主细胞基因组所需的(Coffin，1990)。

为了构建逆转录病毒载体，将编码启动子的核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列，产生一个复制缺陷型病毒。为了生产毒粒，构建一个含有gag，pol和env基因但没有LTR和Y组件的包装细胞系(Mann等，1983)。当将含有人cDNA以及逆转录病毒LTR和Y序列的重组质粒导入该细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)中时，Y序列使得重组质粒的RNA转录物包装进入病毒颗粒，然后该病毒颗粒被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选方法进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能感染各类细胞。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等，1975)。

最近，依据在病毒包膜中化学加入半乳糖残基对腺病毒进行的化学修饰，现已开发出一种逆转录病毒载体能特异性靶向的新方法。该修饰能通过脱唾液酸糖蛋白受体来特异性感染细胞(如肝细胞)，这应当是所希望的。

还设计出靶向重组逆转录病毒的不同的方法，其中采用了抗逆转录病毒包膜蛋白和特异性细胞受体的生物素化抗体。用链亲和素通过生物素组分来连接抗体(Roux等，1989)。利用抗I类和II类主要组织相容性复合体的抗体，证明携带这些表面抗原的各种人细胞可被亲嗜性病毒体外感染(Roux等，1989)。

C)其它病毒载体

本发明中可采用其它病毒载体作为表达构建物。可采用从病毒如牛痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)以及疱疹病毒获得的载体。这些病毒在用于基因转移入不同哺乳动物细胞中提供了几个有利的特性。

6.病毒载体的基因工程改造

在某些实例中，本发明还涉及病毒载体的操纵。这些方法涉及应用含有(例如)编码感兴趣基因的异源DNA的载体构建物、其表达方法、在合适的辅助细胞内复制载体、获得从中产生的病毒颗粒、以及用重组病毒颗粒感染细胞。该基因可以只是编码希望大量生产(即大规模体外生产方法)的蛋白。或者，基因可以是治疗性基因，例如来处理癌细胞、表达免疫调节基因以抵抗病毒感染、或代替基因缺陷基因的功能。在基因治疗载体的含义中，基因是异源DNA，包括从病毒基因组以外来源获得的并提供载体骨架的DNA。最后，病毒可作为活病毒疫苗，并表达感兴趣抗原来生产抗该抗原的抗体。基因可从原核或真核来源(如细菌、病毒、酵母、寄生虫、植物或甚至是动物)获得。异源DNA也可从多个来源(即多基因构建物或融合蛋白)获得。异源DNA也可包括一个来源获得的调节序列和另一来源的基因。

A)治疗性基因

目前认为p53是肿瘤抑制基因(Montenarh，1992)。在化学致癌、紫外辐射和几种病毒(包括SV40)转化的许多细胞中，发现了高水平的突变型p53。p53基因是各种人肿瘤中突变型灭活的常见靶，并且已记载为人类普通癌症中最常见的突变基因(Mercer，1992)。它在50％以上的人NSCLC中(Hollestein等，1991)和各种其它肿瘤中发生突变。

p53B基因编码393个氨基酸的磷蛋白，该蛋白可与宿主蛋白(如大的T抗原和E1B)形成复合体。该蛋白发现于正常组织和细胞中，但与转化的细胞或肿瘤组织相比，浓度通常极低。令人感兴趣的是，野生型p53在调节细胞生长和分裂中似乎很重要。在一些情况下，已经显示野生型p53的过度表达在人肿瘤细胞系中有抗增殖作用。因此，p53可作为细胞生长的负调节剂(Weinberg，1991)，并可直接抑制无控制性细胞生长，或直接或间接地激活抑制该生长的基因。因此，野生型p53的缺乏或灭活可能对转化有贡献。然而，一些研究表明，突变型p53的存在是基因转化潜力全部表达所必需的。

在许多细胞类型中，野生型p53被认作是重要的生长调节剂。错义突变是p53基因中常见的，并且已知可发生在至少30个不同的密码子中，这通常会产生使细胞表型偏移但纯合性不减少的显性等位基因。另外，许多这些显性负等位基因在生物体中看来是可耐受的，并可在种系中传代。各种突变型等位基因的范围看来从最小的功能异常到强外显性的显性负等位基因(Weinberg，1991)。

Casey及其同事已经报道了将编码野生型p53的DNA转染入两个人乳房癌细胞系中恢复了这些细胞中的生长抑制控制(Casey等，1991)。在野生型(而非突变型)p53转染人肺癌细胞系中也证实有相似效果(Takahasi等，1992)。p53看来比突变型基因更显性，当它和突变型基因一起转染入细胞中时，它会选择抗增殖。转染的p53的正常表达对具有内源野生型p53的正常细胞无害。因此，正常细胞可接受该构建物而不会有负作用。因此，建议用野生型p53表达构建物处理p53有关癌症将会减少恶性细胞数目或其生长速度。而且，最近的研究提示，一些p53野生型肿瘤也对外源p53表达的作用敏感。

真核细胞周期的主要跃迁由依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDK)触发。一个CDK(依赖于细胞周期蛋白的激酶4(CDK4))调节整个G₁期的进程。该酶的活性可能是针对G₁晚期的磷酸化Rb。CDK4的活性受激活性亚基D-型细胞周期蛋白和抑制性亚基(如p16^INK4)(已经生化鉴定为特异性结合和抑制CDK4的蛋白)的控制，因此可调节Rb磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。由于p16^INK4蛋白是CDK4的抑制剂(Serrano，1993)，因此该基因的缺失可能会提高CDK4的活性，导致Rb蛋白的高度磷酸化。也知道p16可调节CDK6的功能。

p16^INK4属于一类新描述的CDK抑制蛋白，该类中还包括p16^B、p21^{WAF1，CIP1，SDI1}、和p27^KIP1。p16^INK4基因对应于图谱的9p21，许多肿瘤类型中通常缺失该染色体区域。p16^INK4基因的纯合缺失和突变是人肿瘤细胞系中常见的。这一证据表明，p16^INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，由于观察到原发非培养肿瘤中的p16^INK4基因变化频率比培养的细胞系低得多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994a；Kamb等，1994b；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)，这种解释已经受到挑战。用质粒表达载体转染恢复野生型p16^INK4的功能减少了某些人癌细胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arpa，1995)。

C-CAM在几乎所有上皮细胞中表达(Odin和Obrink，1987)。C-CAM的表观分子量为105kD，其最初是通过与中和细胞凝聚的特异性抗体反应从大鼠肝细胞的质膜中分离获得(Obrink，1991)。最近的研究表明，C-CAM在结构上属于免疫球蛋白(Ig)超家族，其序列与癌胚抗原(CEA)高度同源(Lin和Guidotti，1989)。利用杆状病毒表达系统，Cheung等(1993a；1993b和1993c)证实C-CAM的Ig第一结构域对于细胞粘附活性很关键。

已知细胞粘附分子(即CAM)参与调节器官发育和细胞分化的分子相互作用的复杂网络(Edelman，1985)。最近的资料表明，CAM的异常表达可能涉及几种肿瘤的致肿瘤作用；例如，主要在上皮细胞中表达的E-钙粘着蛋白的表达减少与几种肿瘤的发展相关(Edelman和Crossin，1991：Frixen等，1991；Bussemakers等，1992；Matsura等，1992；Umbas等，1992)。另外，Giancotti和Ruoslahti(1990)证实，通过基因转移提高α₅β₁整联蛋白表达能减少中国仓鼠卵巢细胞在体内的致肿瘤性。现在已经知道C-CAM可在体外和体内抑制肿瘤生长。

本发明可采用的其它肿瘤抑制剂包括RB、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、BRCA1、VHL、FCC、MMAC1、MCC、p16、p21、p57、C-CAM、p27和BRCA2。本发明还可采用细胞程序死亡的诱导物如Bax、Bal、Bcl-Xs、Bik、Bid、Harakiri、Ad E1B、Bad和ICE-CED3蛋白酶。

各种酶基因是本发明所感兴趣的。这些酶包括胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷酯酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶和人胸苷激酶。

激素是能用于本文所述载体中的另一组基因。其中包括生长激素、催乳素、胎盘催乳激素、促黄体生成素、促卵泡激素、绒膜促性腺素、促甲状腺素、leptin、促肾上腺皮质素(ACTH)、血管紧张肽I和II、β-内啡肽、β-促黑色素细胞素(β-MSH)、缩胆囊素、内皮素I、高良姜黄素(galanin)、肠抑胃肽(GIP)、胰高血糖素、胰岛素、促脂解素、后叶激素运载蛋白、促生长素抑制素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、β-降钙素基因相关肽、高血钙恶性因子(1-40)、甲状旁腺素相关蛋白(107-139)(PTH-rP)、甲状旁腺素相关蛋白(107-111)(PTH-rP)、胰高血糖素样肽(GLP-1)、胰抑制素、胰肽、肽YY、PHM、肠促胰液肽、血管活性肠肽(VIP)、催产素、加压素(AVP)、催产加压素、脑啡肽酰胺、metorphinamide、α促黑素细胞素(α-MSH)、心钠素(5-28)(ANF)、糊精、(血清)淀粉状蛋白P成分(SAP-1)、促肾上腺皮质素释放激素(CRH)、生长素释放因子(GHRH)、促黄体素释放激素(LHRH)、神经肽Y、K物质(神经激肽A)、P物质和促甲状腺素释放激素(TRH)。

可考虑插入本发明载体中的其它类基因包括白细胞介素和细胞因子。白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF和G-CSF。

本病毒载体适用的疾病例子包括，但不局限于，腺苷脱氨酶缺陷、乙型血友病中人血凝血因子IX缺陷和囊性纤维化(涉及囊性纤维化跨膜受体基因的替换)。本发明包括的载体还可用来通过转移编码血管生成抑制剂或细胞周期抑制剂的基因来治疗过度增生疾病(如类风湿性关节炎或再狭窄)。前体药物激活剂(如HSV-TK)基因的转移也可用来治疗过度增生疾病(包括癌症)。

B)反义构建物

致癌基因如ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl和abl也是合适的靶。然而，为了治疗，这些致癌基因将表达成反义核酸，从而抑制了致癌基因的表达。术语“反义核酸”指与编码致癌基因的DNA和RNA基础序列互补的寡核苷酸。当将反义寡核苷酸导入靶细胞中时，它特异性地结合其靶核酸，干扰转录、RNA加工、转运和/或翻译。寡核苷酸靶向双链DNA将形成三螺旋；靶向RNA则形成双螺旋。

反义构建物可被设计成与基因的启动子和其它控制区、外显子、内含子或甚至外显子-内含子边界结合。反义RNA构建物或编码该反义RNA的DNA可用来抑制体外或体内宿主细胞(例如宿主动物，包括人)内的基因转录或翻译。包含“互补核苷酸”的核酸序列是能根据标准Watson-Crick互补规则进行碱基配对的那些序列。即，较大的嘌呤将与较小的嘧啶碱基配对，只形成鸟嘌呤与胞嘧啶对(G:C)，腺嘌呤与胸腺嘧啶对(A:T)(DNA情况下)或腺嘌呤与尿嘧啶对(A:U)(RNA情况下)的组合。

本文所用的术语“互补”或“反义序列”指在其整个长度内基本上互补、有很少碱基错配的核酸序列。例如，当15个碱基的核酸序列有13或14个位置核苷酸互补，而只有1或2个错配时，则称核酸序列是互补的。自然，“完全互补”的核酸序列将是整个长度内全部互补、没有碱基错配的核酸序列。

尽管在反义构建物含义中可采用全部或部分基因序列，但是从统计学上讲，任何17个碱基长的序列应在人基因组中只出现一次，因此，足以指定一个独特的靶序列。尽管更短的寡聚物更容易制备并提高了体内可及性，但是在确定杂交特异性中涉及许多其它因素。寡核苷酸与其互补靶的结合亲和力和序列特异性随长度增加而增加。可考虑采用有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多碱基对的寡核苷酸。只需通过体外测试构建物，测定内源基因的功能是否受影响或具有互补序列的相关基因的表达是否受影响，就容易确定给定反义核酸是否在靶向相应宿主细胞基因中有效。

在某些实例中，可采用包括其它元件的反义构建物，例如包括C-5丙炔嘧啶的那些构建物。已经表明，含有尿嘧啶和胞嘧啶的C-5丙炔类似物的寡核苷酸可以高亲和力结合RNA，并且是基因表达的强效反义抑制剂(Wagner等，1993)。

定向核酶可作为定向反义基因输递的另一种方案。术语“核酶”指能靶向和切割致癌基因DNA和RNA中特定碱基序列的RNA为基的酶。核酶可以RNA寡核苷酸掺入核酶序列的形式直接靶向细胞，或作为编码所需核酶RNA的表达构建物导入细胞。核酶可以反义核酸所述的相同方式来使用。

C)疫苗抗原

其它治疗基因可包括编码抗原(如病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原)的基因。病毒包括小RNA病毒、冠状病毒、披膜病毒、黄病毒、弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、乳多空病毒、细小病毒、疱疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒和海绵体形式的病毒。较佳的病毒靶包括流感病毒、单纯疱疹病毒1型和2型、麻疹、天花、脊髓灰质炎病毒或HIV。病原体包括锥虫、绦虫、线虫、蠕虫。同样，肿瘤标记物，如胎抗原或前列腺特异性抗原也可以这种方式定向。较佳的实例包括HIV env蛋白和乙型肝炎表面抗原。给予本发明疫苗接种用的载体需要载体伴随的抗原基本没有免疫原性，能长期表达转基因，这是强免疫反应所希望的。较佳的，个体的疫苗接种只需几次，例如每年或两年一次，以提供长期的抗感染因子的免疫保护力。

D)控制区域

为了使病毒载体有效表达编码治疗性基因的转录物，应使编码治疗性基因的多核苷酸在启动子和聚腺苷酸化信号的转录控制下。“启动子”指被宿主细胞合成机制或导入的合成机制识别的DNA序列，它是引发基因特异性转录所需的。聚腺苷酸化信号指被宿主细胞合成机制或导入的合成机制识别的DNA序列，它是在mRNA转录物末端加入一系列核苷酸所需的，以便进行合适的加工和将转录物运输到细胞核外细胞质中进行翻译。术语“在转录控制下”指启动子在相对于多核苷酸正确位置中以控制RNA聚合酶引发和表达多核苷酸。

本文所用的术语启动子指一组转录控制组件，它们簇集在RNA聚合酶II起始位点的周围。关于启动子怎样组织的许多思路来自对几种病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的那些启动子。这些研究及加上最近的更多的工作已表明，启动子由不连续的功能组件组成，每一组件包括约7-20bp的DNA，并含有一个或多个转录激活剂或阻遏蛋白的识别位点。

每一启动子中至少有一个组件的作用是确定RNA合成起始位点的位置。了解最多的例子是TATA盒，但是在一些启动子中没有TATA盒，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点的不连续元件本身有助于固定起始位置。

其它启动子元件调节转录引发的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp区域内，但是最近表明许多启动子在起始位点下游也含有功能性元件。启动子元件间的间距经常是灵活的，因此当元件相互对换或移动时，启动子功能仍保留。在tk启动子中，启动子元件间的间距可在活性开始下降前提高到相隔50bp。看来各个元件可协同或独立起作用以激活转录，这取决于启动子。

用来控制治疗性基因表达的具体启动子并不被认为是关键，只要它能在靶向细胞中表达多核苷酸即可。因此，当靶向人细胞时，最好使多核苷酸密码区的位置毗邻能在人细胞中进行表达的启动子并在其控制下。通常来讲，这种启动子可包括人或病毒启动子。表2中提供了启动子一览表。

表2

启动子
	免疫球蛋白重链
免疫球蛋白轻链
	T-细胞受体
HLA DQα和DQβ
	β-干扰素
白细胞介素-2
	白细胞介素-2受体
MHC II类5

MHC II类HLA-DRα
	β-肌动蛋白
肌酸激酶
	前白蛋白(运甲状腺素蛋白)
弹性蛋白酶I
	金属硫蛋白
胶原酶
	白蛋白基因
α-胎儿蛋白
	τ-珠蛋白
β-珠蛋白
	c-fos
C-HA-ras
	胰岛素
中性细胞粘着分子(NCAM)
	α<sub>1-抗胰蛋白酶</sub>
H2B(TH2B)组蛋白
	小鼠或I形胶原
葡萄糖-调节的蛋白(GRP94和GRP78)

MHC II类HLA-DRα
	大鼠生长激素
人血清淀粉状蛋白A(SAA)
	肌钙蛋白I(TN I)
血小板衍生生长因子
	杜兴氏肌营养不良
SV40
	多瘤
逆转录病毒
	乳头状瘤病毒
乙型肝炎病毒
	人免疫缺陷型病毒
巨细胞病毒
	Gibbon猿白血病病毒

启动子还可称为可诱导型启动子。可诱导型启动子是灭活的或活性较低的启动子(除非在诱导物存在下)。可包括作为本发明一部分的启动子的一些例子包括，但不局限于，MTII、MMTV、胶原酶、溶基质素、SV40、小鼠MX基因、α-2-巨球蛋白、MHC I类基因h-2kb、HSP70、增殖蛋白、肿瘤坏死因子或促甲状腺素α基因。相关的诱导物显示在表3中。应当理解，任何可诱导型启动子可用于本发明实践，所有这些启动子均在本发明权利要求的精神和范围内。

表3

元件	诱导物
		MT II	佛波酯(TPA)  重金属
MMTV(小鼠乳腺肿瘤因子)	促糖皮质激素
		β-干扰素	聚(rI)X  聚(rc)
腺病毒5E2	Ela
		c-jun	佛波酯(TPA)，H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
胶原酶	佛波酯(TPA)
		溶基质素	佛波酯(TPA)，IL-1
SV40	佛波酯(TPA)
		小鼠MX基因	干扰素，新城疫病病毒
GRP78基因	A23187
		α-2-巨球蛋白	IL-6
波形蛋白	血清
		MHC I类基因H-2kB	干扰素
HSP70	Ela，SV40大T抗原
		增殖蛋白	佛波酯-TPA
肿瘤坏死因子	FMA
		促甲状腺素α基因	甲状腺素

在各种实例中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子和Rous肉瘤病毒长末端重复序列可用来高水平地表达感兴趣的多核苷酸。同样也可考虑采用本领域中所熟知的其它病毒或哺乳动物细胞或噬菌体启动子来表达多核苷酸，只要其表达水平足以产生抑制生长的效果。

利用性质熟知的启动子，可对多核苷酸在转染后的表达水平和方式进行优化。例如，选择在具体细胞中有活性的启动子(如酪氨酸酶(黑色素瘤)、α胎儿蛋白和白蛋白(肝肿瘤)、CC10(肺肿瘤)和前列腺特异性抗原(前列腺肿瘤))将允许治疗性基因的组织特异性表达。

增强子最初作为增强转录的基因元件被检测到，它在同一DNA分子上距启动子较远的位置上。在原核生物转录调控的经典研究中很少有能跨越长距离作用的先例。以后的研究工作表明，有增强子活性的DNA区域的组成非常类似于启动子。即，它们由多个单独的元件组成，每个元件与一个或多个转录蛋白结合。

增强子和启动子之间基本的不同在于操作性。增强子整个区域必需能远距离刺激转录；而启动子区域或其组成元件不需如此。另一方面，启动子必需有一个或多个元件指导在特定位点和以特定取向引发RNA合成，而增强子则没有这些特征。启动子和增强子经常重叠和毗邻，通常看上去有非常类似的组件组成。

另外，还可用其它任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库(EPDB))来推动特定构建物的表达。采用T3、T7或SP6胞质表达系统是另一种可行的实例。如果提供合适的噬菌体聚合酶作为递送复合体的一部分或作为附加的基因表达载体，真核细胞能够支持某些噬菌体启动子的胞质转录。

当采用cDNA插入物时，通常希望包括入聚腺苷酸化信号以使基因转录物实现适当的聚腺苷酸化。认为聚腺苷酸化信号的性质并不是本发明实施成功的关键，可采用任何此类序列。已经发现SV40、牛生长激素和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的聚腺苷酸化信号可在许多靶细胞中起很好的作用。

7.基因转移方法

为了产生本发明的辅助细胞系以及和其一起使用的重组腺病毒载体，必须向细胞内递送各种基因(即DNA)构建物。实现递送的一种方法是利用感染性病毒颗粒经由病毒转导，例如用本发明的腺病毒载体来转化。另外可采用逆转录病毒或牛乳头瘤病毒，它们均能用感兴趣的基因永久性转化宿主细胞。在其它情况下，待传递的核酸没有感染性，即，它被包含在感染性病毒颗粒内。这种遗传物质必需依靠非病毒方法来传递。

本发明还考虑用几种非病毒方法将表达构建物传递到培养的哺乳动物细胞中。它们包括磷酸钙沉淀(Graham和Van DerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接微量注射(Harland和Weintraub，1985)、载有DNA的脂质体(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979)、细胞超声处理(Fechheimer等，1987)、用高速度显微粒子进行基因轰击(Yang等，1990)、以及受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。

构建物一旦被传递到细胞内，编码治疗性基因的核酸可定位于不同位置并表达。在某些实例中，编码治疗性基因的核酸可以稳定地整合入细胞基因组中。该整合可通过同源重组(基因替换)而在相互的位置和方向上，或是可以整合入随机的非特异性的位置上(基因增加)。在还有的实例中，核酸能以分离的DNA游离片段稳定地保持在细胞内。这种核酸片段或“附加体”编码的序列足以能维持于宿主细胞周期之外或与细胞同步进行复制。表达构建物怎样传递到细胞内、核酸保留在细胞内何处，这均取决于所采用的表达构建物的类型。

在本发明的一个实例中，表达构建物可以简单地由裸露的重组DNA或质粒组成。构建物的传递可采用从物理或化学上渗透入细胞膜的上述任何方法。这对于体外传递来说尤其适合，但是这也同样适用于体内。Dubensky等(1984)成功地将多瘤病毒DNA以磷酸钙沉淀的形式注射入成年和新生小鼠的肝脏和脾脏中，表现出活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明将磷酸钙沉淀的质粒直接注射入腹腔内将导致转染基因表达。预计编码CAM的DNA也可以类似方式转染到体内并表达CAM。

本发明中将裸露的DNA表达构建物转染到细胞中的另一个实例涉及颗粒轰击。该方法依靠将包裹DNA的显微粒子加速到高速，从而使得粒子能穿透细胞膜进入细胞而不会杀死细胞(Klein等，1987)。已经开发出了几种用来加速微小颗粒的装置。一种装置依靠高电压放电产生电流，再由电流来提供动力(Yang等，1990)。所用显微粒子由生物惰性物质(如钨或金珠粒)组成。

在本发明的另一个实例中，表达构建物可以包裹在脂质体内。脂质体是泡囊结构，其特征是有磷脂双层膜和内部水性基质。多层脂质体有多层由水性基质隔开的类脂层。它们是在磷脂悬浮在过量水性溶液中时自发形成的。脂质成分经过自身重排形成封闭的结构，并将水和溶解的溶质捕获在脂质双层内(Ghosh和Bachhawat，1991)。

脂质体介导的核酸传递和外来DNA在体外表达非常成功。Wong等(1980)用β-内酰胺酶基因证明了脂质体介导的传递和外来DNA表达在培养的仔鸡胚胎、HeLa和肝瘤细胞中的可行性。Nicolau等(1987)成功地实现了在静脉注射后将脂质体介导的基因转移到大鼠体内。另外还包括各种商业上的方法，包括“脂质转染”技术。

在本发明的某些实例中，脂质体可以与凝血病毒(HVj)复合。已经表明，这能使脂质体包裹的DNA与细胞膜融合并能促进其进入细胞(Kaneda等，1989)。在其它实例中，脂质体可以与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或联合使用(Kato等，1991)。在其它实施例中，脂质体可以与HVJ和HMG-1复合或联合使用。由于这些表达构建物已经成功用来在体外和体内传递和表达核酸，因此它们适用于本发明。

可用来将编码治疗性基因的核酸传递到细胞中的其它表达构建物是受体介导的传递载体。它们利用几乎所有真核细胞中都有的受体介导胞吞作用来选择性地摄取大分子。由于不同受体的细胞类型特异性分布，因此这种传递可以有很高的特异性(Wu和Wu，1993)。

受体介导的基因靶向载体通常由两组分组成：细胞受体特异性的配体和DNA结合试剂。几种配体已经被用于受体介导的基因转移。性质鉴定最广泛的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)以及运铁蛋白(transferring)(Wagner等，1990)。最近，合成的新糖蛋白(它识别于ASOR相同的受体)已经被用作基因转移载体(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，另外，表皮生长因子(EGF)也已经被用于将基因转移给磷状癌细胞(Myers，EPO 0273085)。

在其它实例中，传递载体可以包含一个配体和一个脂质体。例如，Nicolau等(1987)用乳糖苷神经酰胺(一种半乳糖为末端的脱唾液酸神经节苷脂)掺入脂质体中，发现肝细胞对胰岛素基因的摄取有所增加。因此，还可用许多带有或不带有脂质体的受体-配体系统将编码治疗性基因的核酸特异性地传递到细胞(如前列腺、上皮或肿瘤细胞)中。例如人前列腺特异性抗原(Watt等，1986)可用作介导前列腺组织中核酸传递的受体。

8.除去核酸污染物

本发明用核酸酶来除去污染性核酸。典型的核酸酶包括

或本领域常用的其它任何DNA酶或RNA酶。

诸如

酶降解核酸，并且没有蛋白水解活性。

迅速水解核酸的能力使得该酶可理想地用来降低细胞裂解液的粘度。核酸能与细胞衍生的颗粒(如病毒)粘附是众所周知的。此粘附会由于团聚作用而干扰分离、改变颗粒大小或电荷，从而使得给定纯化方案回收到的产物非常少(如果有的话)。

非常适用于在纯化时减少核酸载荷，从而消除了干扰，提高了产量。

与所有内切核酸酶一样，

水解特殊核苷酸间的内部磷酸二酯键。在完全消化后，溶液中所有游离的核酸的长度减少至2-4个碱基。

9.纯化方法

本发明采用了许多不同的纯化方法来纯化本发明的腺病毒载体。这些方法包括以沉降和层析为基础的那些方法，它们在下文中有更详细的描述。

A)密度梯度离心

密度梯度离心有两种方法，速率区带方法和等密度方法，当需要定量分离颗粒混合物的所有组分时，两种方法均可采用。它们也可用于浮力密度测定和估计沉降系数。

速率区带方法分离颗粒的依据是颗粒大小或沉降速度间的差异。该方法是：小心地将样品溶液置于液体密度梯度顶部上，该液体密度的最高密度超过待分离颗粒中的密度最高的颗粒。然后离心样品直至获得所需程度的分离，即经足够长时间颗粒通过梯度形成不连续的区域或条带(根据颗粒的相对速度分开)。由于该方法是时间依赖性的，因此离心必须在任一分离区域沉淀到达试管底部前终止。该方法已经用于分离酶、激素、RNA-DNA杂交体、核糖体亚单位、亚细胞细胞器，用来分析多核糖体样品的大小分布，以及用来脂蛋白分级。

将样品置于连续密度梯度顶部，该连续密度梯度跨越了待分离颗粒密度的全部范围。因此，梯度的最大密度必须始终超过最致密颗粒的密度。在离心时，颗粒发生沉降，直至颗粒的浮力密度等于梯度的密度(即当式2.12中的p_p＝p_m)。此时，无论继续离心多长时间也不再发生沉降，因为颗粒浮在密度大于其自身的一个物质垫上。

等密度离心与速率区带方法相反，它是一种平衡方法，颗粒带以其自身特有的浮力密度形成区带。当(可能)颗粒混合物中的所有成分并非都需要时，可以选择一梯度范围，使混合物中不需要的成分沉降至离心管底部，而感兴趣的颗粒沉降到其各自的等密度位置。该方法包括速率区带和等密度方法的组合。

等密度离心仅仅取决于颗粒的浮力密度，而不取决于其形状或大小，并且与时间无关。因此密度非常接近(例如在蔗糖溶液中p＝1.3g cm^-3)的可溶性蛋白通常不能用该方法来离心，而亚细胞细胞器(例如，在蔗糖溶液中，高尔基体，p＝1.11gcm^-3、线粒体，p＝1.19g cm^-3和过氧化物酶体，p＝1.23g cm^-3)可用该方法来有效地分离。

另一种使待分离颗粒混合物分层到预先形成的梯度上的方法是，首先使样品与梯度液混合以产生密度均一的溶液，梯度在离心时通过沉降平衡自己形成。在该方法(指平衡等密度方法)中，经常采用重金属(如铯或铷)盐、蔗糖、二氧化硅胶体或三碘苯甲酰氨基葡萄糖。

例如，使氯化铯浓溶液与样品(如DNA)混合均匀。离心氯化铯浓溶液导致氯化铯分子沉降形成一个浓度梯度，因此形成了密度梯度。最初均匀分布在整个试管中的样品分子(DNA)现在上升或沉降，直至它们到达溶液密度等于其自身浮力密度的区域(即其等密度位置)，在该处它们形成区域。该技术的缺点是通常需要非常长的离心时间(例如36至48小时)来建立平衡。然而，它通常用于分析性离心以测定颗粒的浮力密度、双链DNA的基础组成和分离线形和环形DNA。

许多离心方法可作改进，即通过在生物合成时掺入重同位素(如¹⁵N)(Leselson和Stahl用来阐述大肠杆菌中DNA复制机制的方法)，或与重金属离子或染料(如溴乙锭)结合，提高不同形式的DNA之间的密度差。等密度梯度也已用来分离和纯化病毒，以及分析人血浆脂蛋白。

B)层析

在本发明的某些实例中，希望生产纯化的腺病毒。纯化方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法涉及细胞微环境的分级，以从混合物的其它成分中分离出腺病毒颗粒。在将腺病毒颗粒从其它成分中分离出来后，可用层析和电泳方法来纯化腺病毒，以获得完全的纯化。特别适于制备本发明的纯腺病毒颗粒的分析性方法是离子交换层析、体积排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳。与本发明结合使用的特别有效的纯化方法是HPLC。

本发明的某些方面涉及腺病毒载体的纯化，在特别的实例中涉及腺病毒载体的基本纯化。本文所用的术语“纯化的”是指可从其它成分中分离出来的组合物，其中腺病毒颗粒被纯化至相对于其天然可获得形式的任何程度。因此，纯化的腺病毒颗粒也指游离于其天然存在环境的腺病毒成分。

通常，“纯化的”是指腺病毒颗粒已经过分级除去了其它各种成分，且颗粒组合物基本上保留了其表达的生物活性。当采用术语“基本上纯化”时，该术语指组合物中颗粒、蛋白或肽形成了组合物的主要成分，例如构成了组合物中大约50％或更多的组成部分。

在参看了本文公开后，定量测定蛋白或肽的纯化程度的各种方法对于本领域技术人员来说是已知的。这些方法例如包括用SDS/PAGE分析来测定活性级分的比活或测定级分中多肽的量。一种测定级分纯度的较佳的方法是算出级分的比活，与最初抽提物的比活比较，从而算出纯度，这里用纯化倍数来评价。当然，用来表示活性量的实际单位将取决于纯化后所选择的具体的测定方法，以及表达的蛋白或肽是否表现出可检测的活性。

通常，并不总需要提供最纯化状态的腺病毒。实际上，未基本纯化的产物可用于某些实例。采用较少纯化步骤的组合或用相同总纯化方案的不同形式，就可实现部分纯化。例如，可以理解，采用HPLC装置的阳离子交换树脂柱通常可获得比采用低压层析系统的相同方法更高倍数的纯化。相对纯化程度较低的方法的优点是蛋白产物的总回收量高，或保持了表达蛋白的活性。

当然也知道，本领域技术人员已知的层析方法和其它纯化方法也可用来纯化本发明腺病毒载体表达的蛋白。离子交换层析和高效液相层析是纯化腺病毒颗粒中所用的典型的纯化方法，它们在下文中有进一步详细的描述。

离子交换层析。离子交换层析的基本原理是物质对交换剂的亲和力取决于物质的电性质和溶剂中其它带电荷物质的相对亲和力。因此，可通过改变pH来改变物质的电荷或加入竞争性物质(其盐是一个例子)，来洗脱结合的物质。由于不同物质有不同的电性质，因此，释放条件将随各种结合的分子而变化。通常，为了获得良好的分离效果，所选方法是连续的离子强度梯度洗脱或分步洗脱。(单单pH梯度并不经常使用，因为很难在不同时增加离子强度下建立pH梯度。)对于阴离子交换剂，可使pH和离子强度逐渐增加，或单单使离子强度增加。对于阳离子交换剂，使pH和离子强度增加。洗脱步骤的实际选择通常是根据试差法的结果和稳定性考虑。例如，对于不稳定的物质，最好保持相当恒定的pH。

离子交换剂是一种固体，它具有与离子静电结合的化学键合的带电荷基团；它能使这些离子与水溶液中的离子发生交换。离子交换剂可用于柱层析以根据电荷来分离分子；实际上，分子的其它特征通常是重要的，因此层析行为对电荷密度、电荷分布及分子大小敏感。

离子交换层析的原理是带电荷分子可逆地吸附到离子交换剂上，通过改变离子环境可使该分子结合或洗脱。离子交换剂上的分离通常在两阶段内实现：首先，用产生稳定和紧密结合的条件，使待分离的物质与交换剂结合；然后，用不同pH、离子强度的缓冲液或与结合物质竞争结合位点的组合物和缓冲液成分洗柱。

离子交换剂通常是含有共价连接的带电荷基团的三维网状结构或基质。如果基团带负电，则它将交换阳离子，是阳离子交换剂。用于阳离子交换剂的典型的基团是磺酸基团SO₃ ^-。如果H⁺与基团结合，则称交换剂是酸型交换剂；它能(例如)用一个Na⁺交换一个H⁺或用一个Ca²⁺交换两个H⁺。磺酸基团称为强酸型阳离子交换剂。其它常用的基团是酚式羟基和羧基，这两种均是弱酸型阳离子交换剂。如果带电荷基团是正电荷，例如季氨基基团，它是强碱型阴离子交换剂。最常用的弱碱型阴离子交换剂是芳族或脂族氨基基团。

基质可用各种材料制成。常用的材料是葡聚糖、纤维素、琼脂糖和苯乙烯和乙烯基苯的共聚物(其中二乙烯基苯与聚苯乙烯链交联并含有带电荷基团)。表4给出了许多离子交换剂的组成。

离子交换剂的总容量以其每毫克干重吸收可交换基团的能力来衡量。该数目由生产商提供，它非常重要，因为如果超过容量，离子将通过柱而不结合。

表4

有效容量是在特定实验条件(即pH、离子强度)下的容量。例如，离子交换剂带电荷的程度取决于pH(对于强离子交换剂，pH的影响较弱)。另一个因素是离子强度，因为带电荷基团附近的小离子会与样品分子竞争这些基团。当样品是大分子时，这种竞争是相当有效的，因为小离子的扩散系数更高就意味着遭遇的次数更多。显然，随着缓冲液浓度的增加，竞争将变得更激烈。

基质的孔隙度是一个重要的特征，因为带电荷基团在基质的内部和外部，且基质也起着分子筛的作用。大分子可能不能穿透孔；这样，容量将随分子体积的增大而减少。聚苯乙烯为基材的树脂的孔隙度由二乙烯基苯的交联量来决定(孔隙度随着二乙烯基苯量的增加而减少)。对于Dowex和AG系列，二乙烯基苯的百分数用X后的数字表示，因为，Dowex 50-X8是8％二乙烯基苯。

离子交换剂有各种颗粒大小，称为筛眼尺寸。筛眼较细意味着表面-体积比增加，因而对于给定体积的交换剂，意味着容量增加和交换时间减少。另一方面，细筛眼意味着流速较慢，这可能增加扩散。用非常细的颗粒(直径约10μm)和高压力来维持足够的流速称为高效或高压液相层析，或简称为HPLC。

这些具有不同性能(电荷、容量、孔隙度、筛眼)的交换剂的集合使得很难选择合适的一种交换剂来实现特定的分离。在下述实施例中描述了怎样来确定柱材料类型以及结合和洗脱条件。

当用离子交换层析作为方法时，可以作许多选择。首先选择交换剂是阴离子型还是阳离子型。如果待结合到柱上的物质有一种电荷(即正电荷或负电荷)，选择很明确。然而，许多物质(如蛋白、病毒)既带负电荷又带正电荷，而净电荷取决于pH。在这种情况下，主要因素是该物质在不同pH值下的稳定性。大多数蛋白有一个稳定性pH范围(即在该范围内它们不变性)，在该范围内它们可带正电或负电。因此，如果蛋白在大于等电点的pH值下稳定，则应用阴离子交换剂；如果它在小于等电点的pH值下稳定，则需要用阳离子交换剂。

强和弱交换剂之间的选择也根据pH对电荷和稳定性的影响。例如，如果需要非常低或高pH值方能电离的弱离子化物质进行层析，则需要强离子交换剂，因为它能在整个pH范围内起作用。然而，如果物质是不稳定，则弱离子交换剂是较佳的，因为强离子交换剂通常能使分子变形从而变性。当然，物质稳定时的pH必须与特定弱交换剂带电荷的pH狭窄范围匹配。弱离子交换剂也特别适合将带高电荷分子与带电荷较少的分子分开，因为带弱电荷的离子通常不能与其结合。如果电荷差别非常小，那么弱交换剂也显示出能更好地分辨物质。如果大分子有非常强的电荷，则不可能将其从强交换剂上洗脱下来，而弱交换剂则可能是较佳的。通常弱交换剂比强交换剂更有用。

Sephadex和Bio-gel交换剂为在低离子强度下不稳定的大分子提供了特别的优越性。由于这些物质中的交联维持了基质的不可溶性(甚至使基质具有高度极性)，因此可离子化基团的密度可以比纤维素离子交换剂高几倍。电荷密度增加就意味着亲和力增加，因此吸附可在较高的离子强度下进行。另一方面，这些交换剂保留了它们的一些分子筛性能，因此有时分子量差别抵消了电荷差别引起的分布；分子筛效应也能增强分离。

小分子可在小孔径基质(交联度高)上获得最佳的分离，因为有效容量大，而大分子则需要大孔径。然而，除了Sephadex类型外，大多数离子交换剂没有提供匹配孔隙度和分子量的机会。

纤维素离子交换剂已经证明是纯化大分子(如蛋白质和多核苷酸)中最佳的交换剂。这是因为基质是纤维状的，因此所有功能团均在表面上，即使是最大的分子也能接近。然而，在许多情况下，珠粒形式(如DEAE-Sephacel和DEAE-BiogelP)更有用，因为其流速更佳，且分子筛效应有助于分离。

选择筛眼大小总是困难的。小的筛眼尺寸提高了分辨力，但是降低了流速，从而提高了区域扩散而降低了分辨力。因此，通常是根据经验来确定合适的筛眼大小。

由于缓冲液本身由离子组成，它们也会交换并影响pH平衡。为了避免这些问题，采用了以下缓冲液原则：阴离子交换剂用阳离子缓冲液，阳离子交换剂用阴离子缓冲液。由于离子强度是影响结合的因素，因此应选择缓冲能力高的缓冲液，这样，其离子强度就不需要太高。另外，为了有最佳的分辨力，大致上已经发现，用来将样品加到柱中的离子条件(所谓的起始条件)应接近洗柱所用的条件。

高效液相层析(HPLC)的特点是分离非常迅速，具有分辨非常好的峰。这可通过采用非常细的颗粒和维持足够流速的高压来实现。分离可在几分钟内实现，最多一小时。而且，只需要非常少的样品体积，因为颗粒非常小而且密集，因此孔隙体积占床体积的很少一部分。另外，样品浓度不需要很高，因为条带非常窄，样品稀释极少。

10.药物组合物和制剂

当用上述方法进行纯化时，本发明的病毒颗粒可考虑在体外、活体外或体内给药。因此，希望制备复合物作为适用于指定应用的药物组合物。通常，这需要制备基本上无热原质和对人体或动物有害的任何其它杂质的药物组合物。通常也希望采用合适的盐和缓冲液来使复合物稳定，并使靶细胞摄取复合物。

本发明的水性组合物包含溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中的表达构建物和核酸。该组合物也可称为接种体。术语“药学或药理上可接受的”指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”包括所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌素和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些用于药物活性物质的介质和试剂是本领域技术人员所熟知的。除了与活性组分不相容的任何常规介质或试剂外，它们均可考虑用于治疗性组合物中。补充活性组分也可掺入组合物中。

作为游离基础或药理上可接受的盐的活性化合物溶液可配制在水中与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合。分散液也可配制于甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及油中。在通常的保藏和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。

本发明的病毒颗粒可包括用于治疗方案(包括给予人体)的典型的药物制剂。本发明的治疗性组合物可通过任何常用途径来给药，只要通过该途径可以达到靶组织。途径包括口服、鼻内、颊、直肠、鞘或局部。另外，给药可以通过正位、皮内、皮下、肌内、腹腔膜内或静脉内注射。这些组合物通常作为药学上可接受的组合物给予，其包括生理上可接受的载体、缓冲液或其它赋形剂。对于抗肿瘤的应用，可考虑肿瘤内直接注射、注射切除后肿瘤床、区域性(即淋巴)或全身性给药。也可能希望通过导管连续几小时或几天灌输到疾病部位，如肿瘤或肿瘤部位。

本发明的治疗性组合物最好能以可注射组合物(液体溶液或悬浮液)的形式给药，还可制成适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。这些制剂还可乳化。用于该目的的典型的组合物包括药学上可接受的载体。例如，组合物中每毫升磷酸缓冲盐溶液可含有大约100毫克人血清白蛋白。其它药学上可接受的载体包括水溶液、无毒赋形剂，包括可采用盐、防腐剂、缓冲液等。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、盐溶液、肠胃外载体如氯化钠、Ringer葡萄糖等。静脉内载体包括液体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。根据众所周知的参数调节药物组合物的pH和各成分的确切浓度。

其它制剂适用于口服给药。口服制剂包括典型的赋形剂，例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。组合物的剂型可以是溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末。当局部给药时，剂型可以是乳膏、软膏、油膏或喷雾剂。

治疗剂的有效用量根据目的来确定，例如(i)抑制肿瘤细胞增殖、(ii)消除或杀死肿瘤细胞、(iii)疫苗接种或(iv)基因转移以长期表达治疗性基因。术语“单位剂量”指用于主体的生理上不连续的单位，每单位含有结合上述给药方式(即，合适的途径或治疗方案)计算的能产生所需反应的预定量的治疗性组合物。根据治疗数量和单位剂量的给药量取决于待治疗的对象、对象的状态以及所需的结果。尤其对于腺病毒来说，希望用多基因治疗方案。

在本发明的某些实例中，可用编码肿瘤抑制基因的腺病毒载体来治疗癌症患者。腺病毒载体在基因治疗癌症中的典型用量是10³-10⁵PFU/剂(10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵)，其中剂量可分几次注射入固体肿瘤的几个不同部位。肿瘤方案还可涉及在3-10周内分几轮给予基因转移载体。为了获得连续的治疗效果，需要较长的载体给药时间，从几个月到几年。

在本发明的其它实例中，编码治疗性基因的腺病毒载体可用来对人或其它哺乳动物疫苗接种。通常，在疫苗接种的例子中，给予人或哺乳动物能产生所需效果的有效量的病毒，从而实现长期表达转基因并发生强的宿主免疫应答。认为一系列注射(例如在基本注射后进行两次加强注射)就足以诱导出长期免疫应答。根据所需结果，典型剂量将在10⁶至10¹⁵PFU/每次注射之间。低剂量抗原通常诱导出强的细胞介导应答，而高剂量抗原通常诱导出抗体介导的免疫应答。治疗性组合物的确切用量还取决于医师的判断，对每一个体是特有的。

11.实施例

包括下列实施例是为了说明本发明的较佳实例。本领域技术人员应理解，下述实施例中公开的代表了本发明者发现的在发明实践中起很好作用的方法，因此，他们可被认为构成了较佳的实践方式。然而，在参考了本文公开后，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围下，在本文公开的具体实例中可以作许多变化并且仍然能获得相同或相似的结果。

实施例1

材料和方法

A)细胞

本研究中用Master Cell Bank的293细胞(人上皮性胚胎肾细胞)。

B)培养基

细胞生长阶段采用Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，4.5g/L葡萄糖)加上10％胎牛血清(FBS)。对于病毒生产阶段，将DMEM中的FBS浓度降低至2％。

C)病毒

AdCMVp53是经基因工程改造过的、无复制能力的人5型腺病毒，它在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子的控制下表达人野生型p53蛋白。

D)Celligen生物反应器

用总体积为5升(工作体积为3.5升)的Celligen生物反应器(New BrunswickScientific，Co.Inc.)通过微载体培养来生产病毒上清液。在生物反应器中用13g/L玻璃包裹的微载体(SoloHill)来培养细胞。

E)在Celligen生物反应器中生产病毒上清液

融溶来自Master Cell Bank(MCB)的293细胞并在Cellfactorise(Nunc)中增殖。细胞通常在铺满率约为85-90％时分裂。将细胞接种到生物反应器中，接种浓度为1×10⁵细胞/毫升。通过间歇搅拌使细胞附着于微载体。在细胞接种后6-8小时时开始以30rpm的速度连续搅拌。培养细胞7天，过程参数设定为pH＝7.20、溶氧(DO)为60％的空气饱和度、温度为37℃。在第8天，用AdCMVp53感染细胞，MOI为5。病毒感染50小时后，将搅拌速度从30rpm增加到150rpm，以使细胞裂解并将病毒释放到上清液中。在感染后74小时时收获病毒上清液。然后过滤病毒上清液以进一步浓缩/渗滤。

F)Cellcube^TM生物反应器系统

另外用Cellcube^TM生物反应器系统(Corning-Costar)来生产AdCMVp53病毒。该系统由一次性细胞培养模件、充氧器、培养液再循环泵和灌流用培养液泵组成。所用细胞培养模件的培养表面积为21550cm²(1mer)。

G)在Cellcube^TM中生产病毒

融溶来自Master Cell Bank(MCB)的293细胞并在Cellfactorise(Nunc)中增殖。细胞通常在铺满率约为85-90％时分裂。按照生产商的建议，将细胞接种到Cellcube^TM中。接种细胞密度在1-1.5×10⁴细胞/cm²范围内。在pH＝7.20、DO＝60％空气饱和度的培养条件下，使细胞在37℃下生长7天。根据Cellcube^TM中的葡萄糖浓度调节培养液灌流速度。在病毒感染前一天，将灌流培养基从DMEM+10％FBS换成DMEM+2％FBS。在第8天，用AdCMVp53病毒感染细胞，感染复数(MOI)为5。在感染1小时后立即停止培养液灌流，病毒生产阶段的其余时间恢复灌流。在感染45-48小时后收获培养物。

H)裂解溶液

在Cellcube^TM中病毒生产阶段的最后，用20mM Tris+0.25M NaCl+1mMMgCl₂(pH＝7.5)缓冲液中1％浓度吐温-20(Fisher Chemicals)来裂解细胞。

I)澄清和过滤

首先用深层过滤器(Preflow，GelmanSciences)使Celligen生物反应器的病毒上清液和Cellcube^TM的病毒溶液澄清化，然后使它们通过0.8/0.22μm滤膜(SuporCap100，GelmanSciences)过滤。

J)浓缩/渗滤

用切向流过滤(TFF)来浓缩Celligen生物反应器的病毒上清液以及Cellcube^TM的病毒溶液并进行缓冲液交换。用300K标称截留分子量(NMWC)的Pellicon II微型盒(Millipore)进行浓缩和渗滤。首先将病毒溶液浓缩10倍。然后用恒定体积的渗滤方法使4份样品体积缓冲液对20mM Tris+1.0M NaCl+1mM MgCl₂(pH＝9.00)的缓冲液交换。

对于柱纯化的病毒进行类似的浓缩/渗滤。采用100K NMWC的Pellicon II微型盒而不是300K NMWC的盒。病毒对20mM Tris+0.25M NaCl+1mMMgCl₂(pH＝9.00)的缓冲液或Dulbecco磷酸缓冲盐溶液(DPBS)进行渗滤。

K)Benzonase处理

用浓度为100μ/ml的Benzonase^TM(American International Chemicals)处理经浓缩/渗滤的病毒溶液，室温过夜以降低病毒溶液中的污染性核酸浓度。

L)CsCl梯度超离心

在Beckman超离心机(XL-90)中用SW40转头，通过两次CsCl梯度超离心来纯化粗制的病毒溶液。首先，将7毫升粗制病毒溶液铺层在一步CsCl梯度顶部(分别由等体积2.5毫升的1.25g/ml和1.40g/ml CsCl溶液制成)。使CsCl梯度在室温下35000rpm离心1小时。回收梯度界面处的病毒条带。然后，通过等密度CsCl梯度进一步纯化回收的病毒。其做法是使病毒溶液与至少1.5倍体积的1.33g/mlCsCl溶液混合。室温下35000rpm离心CsCl溶液18小时。回收的下侧条带是完整的病毒。立即用20mM Tris+1mM MgCl₂(pH＝7.50)缓冲液对病毒透析，以除去CsCl。将透析后的病毒保藏在-70℃下以便进一步使用。

M)离子交换层析(IEC)纯化

用IEC纯化经Benzonase处理过的病毒溶液。用强阴离子型树脂ToyopearlSuperQ 650M(Tosohaas)来纯化。最初的方法进展采用有XK16柱(Pharmacia)的FPLC系统(Pharmacia)。进一步放大研究采用有XK50柱(Pharmacia)的BioPilot系统(Pharmacia)。简言之，将树脂填入柱中，用1N NaOH灭菌，然后加入缓冲液B，继之以用缓冲液A调节。缓冲液A和B分别由20mM Tris+0.25M NaCl+1mMMgCl₂(pH＝9.00)和20mM Tris+2M NaCl+1mMMgCl₂组成。将病毒溶液样品加入调节过的柱，然后用缓冲液A洗柱直至UV吸收达到底线。用10倍柱体积的线性NaCl梯度洗脱从柱上洗下纯化的病毒。

N)HPLC分析

开发了一种HPLC分析程序用来评价病毒生产和纯化的效果。三(羟甲基)氨基甲烷(tris)购自FisherBiotech(目录号BP 154-1；Fair Lawn，New Jersey，USA)；氯化钠(NaCl)购自Sigma(目录号S-7653，St.Louis，MO，USA)。两者均可直接使用而不需进一步纯化。HPLC分析在Beckman的Analytical Gradient System上进行，Gold Workstation Software(126二进制泵和168二极管阵列检测器)装备了阴离子交换柱(购自TosoHaas，7.5cm×7.5cm ID，10μm粒径，目录号为18257)。用1-ml Resource Q(Pharmacia)阴离子交换柱来评价Huyghe等开发的方法(采用他们的HEPES缓冲液系统)。该方法仅对生物反应器系统进行试验。

用于本HPLC系统的缓冲液是：缓冲液A：10mM tris缓冲液，pH9.0；缓冲液B：含1.5M NaCl的缓冲液A，pH9.0。使缓冲液通过Corning的0.22μm瓶顶滤膜(目录号为25970-33)过滤。所有样品均在注射前过滤通过0.8/0.22μm AcrodiscPF(来自Gelman Sciences，目录号为4187)。

将体积为60-100μl的样品注入HPLC柱中。在注射后，用20％缓冲液B以0.75毫升/分钟的流速洗柱(TosoHaas)3分钟。然后开始梯度，使B液在6分钟内从20％提高至50％。然后在3分钟内使梯度在50％变为100％B液，然后在100％B液下进行6分钟。然后再在4分钟内使盐浓度逐步变回20％，在20％B下再维持6分钟。Adp53的滞留时间为9.5±0.3分钟，A₂₆₀/A₂₈₀约为1.26±0.03。每次进行层析后通过注入100μl 0.15M NaOH洗柱，然后进行梯度洗净柱。

实施例2

Cellcube^TM中培养液灌流速度对病毒产生和纯化的影响

对于灌流细胞培养系统(如Cellcube^TM)，培养液灌流速度对产物的产量和质量起很重要的作用。检测两种不同的培养液灌流策略。一种策略是维持Cellcube^TM中的葡萄糖浓度大于等于2g/L(高灌流速度)。另一种是维持葡萄糖浓度大于等于1g/L(低培养液灌流速度)。

发现两种不同灌流速度间的培养参数(如pH，DO)没有显著变化。如表5所示，在用1％吐温-20裂解溶液收获后产生大约等量的粗制病毒(纯化前)。然而，发现高和低培养液灌流速度生产的病毒溶液在HPLC上的曲线却有很大差别。

表5.培养基葡萄糖浓度对病毒产量的影响

葡萄糖浓度(g/L)	大于等于2.0	大于等于1.0
			粗制病毒产量(PFU)	4×10<sup>12</sup>	4.9×10<sup>12</sup>

如图1所示，用低培养液灌流速度从病毒溶液中产生了一个分离非常好的病毒峰(滞留时间9.39分钟)。发现低培养液灌流速度产生的病毒溶液在一步离子交换层析纯化后就获得了纯度和生物活性足够的病毒。另一方面，发现高培养液灌流速度产生的病毒溶液在9.39分钟滞留时间时没有分离的病毒峰。这说明在高培养液灌流速度下产生的污染物有着与病毒相同的洗脱曲线。尽管污染物的性质未明，但是预计污染物与高培养液灌流速度(高血清进料)下生产性细胞胞外基质蛋白产生的增加有关。这一HPLC上分离较差的性质在IEC纯化过程中产生了困难(如下述实施例所述)。Cellcube^TM中的细胞生长和病毒生产阶段所用的培养液灌流速度对病毒的下游IEC纯化有显著的影响。建议采用低培养液灌流速度。这不仅使粗品的纯化更容易，而且还使生产成本更低(因为培养基消耗减少)。

实施例3

细胞收获和裂解的方法

根据以前的经验，本发明者首先评价了冻融法。在感染45-48小时后从Cellcube^TM收获细胞。首先，使Cellcube^TM与培养系统分离，排空用过的培养基。然后，将50mM EDTA溶液泵入Cube，从培养表面上除下细胞。如此获得的细胞悬液在1500rpm(Bechman GS-6KR)下离心10分钟。将所得细胞沉淀重悬于Dulbecco的磷酸缓冲液(DPBS)中。使细胞悬液在37℃水浴和干冰乙醇浴之间冻融5个循环，将病毒从细胞中释放出来。在HPLC上分析如此制得的粗制细胞裂解液(CCL)。

图2显示了HPLC曲线。在9.32分钟的滞留时间处没有发现病毒峰。而是在滞留时间9.11和9.78分钟时产生了两个峰。该曲线说明CCL中存在其它具有与病毒类似的洗脱时间的污染物并干扰了病毒的纯化。因此，当用FPLC来IEC纯化CCL时，发现纯化效率非常低。

除了纯化效率低外，在细胞收获步骤时，还有明显产品损失进入EDTA溶液(如表6所示)。约20％的产物损失进入弃去的EDTA溶液中。另外，约有24％的病毒粗品在同样弃去的用过的培养基中。因此，只有56％的病毒粗品在CCL中。而且，冻融法是一种变化很大的方法，可放大性非常有限。因此，需要开发一种更有效、产品损失更少的细胞裂解方法。

表6.Cellcube^TM细胞在EDTA收获时的病毒损失

数据从1mer Cellcube^TM产生。

表7用来裂解细胞的非离子洗涤剂的评价

已经采用洗涤剂来释放胞内细胞器。因此，本发明者评价了洗涤剂裂解方法释放腺病毒的效果。表7列出了5种不同的非离子型洗涤剂对它们的细胞裂解进行评价。在感染后48小时后用50mM EDTA从Cellcube^TM中收获细胞。将细胞沉淀重悬于表7所示不同浓度的不同洗涤剂中。

细胞裂解在室温或冰上进行30分钟。在离心除去沉淀和细胞碎片后，获得澄清的裂解溶液。用Benzonase处理裂解溶液，然后用HPLC分析。图3示出了来自不同洗涤剂的裂解溶液的HPLC曲线。Thesit和NP-40的效果与Triton X-100相似。1％吐温-20产生的裂解溶液提供了最佳的病毒分辨力，而发现Brij-58得到的病毒分辨力最差。发现在1％(w/v)的洗涤剂浓度下有更有效的细胞裂解。在检测的洗涤剂浓度下，裂解温度对病毒分辨力没有显著影响。为了使过程简单，建议在室温下进行裂解。用由1％吐温-20的20mM Tris+0.25M NaCl+1mMMgCl₂(pH＝7.50)组成的溶液在Cellcube^TM中进行细胞裂解和病毒收获。

实施例4

浓缩/渗滤对病毒回收率的影响

在浓缩/渗滤前使裂解步骤的病毒溶液澄清化并过滤。评价不同NMWC(包括100K、300K、500K和1000K)的TFF膜的浓缩/渗滤有效性。用300K NMWC的膜获得最高的培养基流通，且滤液中损失的病毒最少。更大的NMWC膜提供了更高的膜通量，但是使滤液中损失的病毒更多，而更小的NMWC膜产生的培养基通量不足。首先使病毒溶液浓缩10倍，然后用恒定体积的方法以20mMTris+0.25M NaCl+1mM MgCl₂(pH＝9.00)缓冲液进行4倍样品体积渗滤。在浓缩/渗滤过程中，跨膜压降保持在小于等于5psi。如表8所示，在浓缩/渗滤步骤中表现出了一致的高水平的病毒回收率。

表8粗制病毒液的浓缩/渗滤

实施例5

加入盐对Benzonase处理的影响

用Benzonase(核酸酶)处理浓缩/渗滤后的病毒溶液，以降低病毒溶液中的污染性核酸的浓度。评价不同的Benzonase工作浓度(包括50、100、200、300单位/毫升)减少核酸浓度的情况。为了使过程简单，处理在室温下进行过夜。在Benzonase处理后，发现可与人基因组DNA探针杂交的污染性核酸明显减少。

表9显示了Benzonase处理前后的核酸浓度减少情况。在Benzonase处理前后在HPLC上分析病毒溶液。如图4A和图4B所示，在Benzonase处理后发现污染性核酸峰大大降低。这与核酸杂交试验的结果相符。用浓度为100u/ml的Benzonase处理粗制病毒溶液，因为这很有效。

表9病毒溶液中污染性核酸浓度的减少

处理条件：Benzonase浓度：100u/ml，温度：室温，时间：过夜

发现Benzonase处理前和处理后的HPLC曲线有相当大的变化。在Benzonase处理后，在9.33分钟的滞留时间处没有检测到分离的病毒峰。同时，在滞留时间为9.54分钟时产生了具有260nm高吸附的主峰。滴定试验结果表明，Benzonase处理不会对病毒滴度产生不利影响，在Benzonase处理后，病毒保持完整并有感染性。其原因是细胞裂解步骤中释放出的细胞核酸与病毒相互作用，并在Benzonase处理时与病毒形成聚集物或吸附到病毒表面上。

为了尽可能地减少Benzonase处理时可能发生的核酸病毒相互作用，在Benzonase处理前在病毒溶液中加入不同浓度的NaCl。当病毒溶液中存在1MNaCl时，Benzonase处理后HPLC曲线没有发生大幅度变化。图5显示了当1MNaCl存在时，Benzonase处理后病毒溶液的HPLC曲线。与图4B所示不同，在Benzonase处理后，滞留时间9.35分钟处仍然存在病毒峰。该结果表明1M NaCl的存在防止了Benzonase处理时核酸与病毒的相互作用，从而有利于进一步将病毒从污染性核酸中纯化出来。

实施例6

离子交换层析纯化

腺病毒表面在生理pH条件下有负电荷存在提示，可以评价阴离子交换剂纯化腺病毒的效果。用强阴离子交换剂Toyopearl Super Q 650M设计一种纯化方法。用FPLC系统评价NaCl浓度和加样缓冲液(缓冲液A)的pH对病毒纯化的影响。

A)方法设计

对于离子交换层析，缓冲液pH是最重要的参数之一，它对纯化效率有很大影响。根据生产病毒时所用的培养基pH和电导率，发明者将20mM Tris+1mMMgCl₂+0.2M NaCl(pH＝7.50)配制成缓冲液A。用缓冲液A调节装填ToyopearlSuper Q 650M(高度为5cm)的XK16柱。

将来自Celligen生物反应器、经Benzonase处理、浓缩/渗滤过的5毫升病毒上清液样品加入柱中。在洗柱后，用大于10倍柱体积的缓冲液B的线性梯度来洗脱，缓冲液B被配制成mM Tris+1mM MgCl₂+2M NaCl(pH＝7.50)。

图6显示了洗脱曲线。洗脱时观察到有分离不满意的三个峰。对照研究采用293细胞条件性培养液(无病毒)，结果表明前两个峰与病毒有关。为了进一步改善分离效果，评价缓冲液pH的影响。将缓冲液pH提高到9.00，同时保持其它条件恒定。与缓冲液pH为7.50时相比，发现分离得到很大改善(如图7所示)。在HPLC上分析级分#3、#4和#8。

如图8所示，发现病毒主要存在于级分#4中，而在级分#3和#8中没有检测到病毒。发现级分#8主要由污染性核酸组成。然而，纯化仍未最优化。级分#3和#4有重叠，级分#4中仍然检测到了污染物。

根据图7中的色谱图，推断可通过提高缓冲液A中的盐浓度来进一步改善病毒的纯化。结果，病毒峰之前的级分#3中存在的污染物移动到流穿液级分中。缓冲液A中的NaCl浓度增加到0.3M，同时保持其它条件恒定，图9显示了在缓冲液A中0.3M NaCl条件下的洗脱曲线。

纯化效率得到大大改善。如所预计的那样，在盐浓度增加的条件下，图7中发现的污染物峰被消除。在HPLC上分析粗制的病毒上清液样品、流穿液、峰#1和峰#2，结果显示在图10中。在流穿液级分中没有检测到病毒。在流穿液中发现了大部分存在于粗制材料中的污染物。峰#1的HPLC分析结果显示单个明确的病毒峰。该HPLC曲线与两次CsCl梯度纯化病毒所得曲线相同。在CsCl梯度纯化的病毒中，滞留时间为3.14和3.61分钟时观察到的峰是与甘油有关的峰。纯化的病毒的A260/A280比值为1.27±0.03。这与两次CsCl梯度纯化的病毒以及Huyghe等(1996)报道的结果相近。峰#2主要由污染性核酸组成。根据纯化结果，发明者建议用下列方法来IEC纯化来自生物反应器的腺病毒上清液。

缓冲液A：20mM Tris+1mM MgCl₂+0.3M NaCl，pH＝9.00

缓冲液B：20mM Tris+1mM MgCl₂+2M NaCl，pH＝9.00

洗脱：10倍柱体积线性梯度

B)放大方法

在设计出该方法后，采用相同的纯化方法将纯化程序从XK16柱(1.6cm I.D.)放大到XK50柱(5cm I.D.，放大10倍)。如图11所示，在XK50柱上获得了类似的洗脱曲线。在HPLC上分析病毒级分，结果表明病毒纯度与XK16柱所得相同。

在放大研究中，发现用电导率来定量测定缓冲液A中的盐浓度将更方便、更一致。大约在室温下(21℃)，缓冲液A的最优电导率在25±2mS/cm范围内。用SDS-PAGE分析该纯化方法产生的样品以及两次CsCl纯化的病毒。

如图12所示，在SDS-PAGE上检测到了所有主要的腺病毒结构蛋白。IEC纯化的病毒显示出的染色与两次CsCl纯化的病毒相同。在纯化时，牛血清白蛋白(BSA)浓度显著减少。如图13所示，纯化病毒中的BSA浓度低于western印迹试验的检测水平。

用核酸狭线印迹测定纯化过程中病毒溶液中污染性核酸浓度的减少情况。将³²P标记过的人基因组DNA用作杂交探针(因为293细胞是人胚肾细胞)。表10显示了纯化过程的不同阶段中的核酸浓度。最终纯化的病毒溶液中核酸浓度减少到60pg/ml，与最初病毒上清液相比，减少大约3.6×10⁶倍。测定纯化病毒的病毒滴度和感染性病毒与全部颗粒之比，在表9中比较了该结果与两次CsCl纯化的结果。两种纯化方法间的病毒回收率和颗粒/PFU比值非常接近。柱纯化的病毒溶液的滴度可通过浓缩步骤来进一步提高。

表10.纯化时除去污染性核酸

实施例7

其它纯化方法

除了强阴离子型离子交换层析外，另外还评价了其它模式的层析方法来纯化AdCMVp53病毒(例如体积排阻层析、疏水作用层析、阳离子交换层析或金属离子亲和层析)的效果。所有这些纯化模式的纯化均不如Toyopearl Super Q有效，且产物回收率较低。因此，建议用Toyopearl Super Q树脂来纯化AdCMVp53。然而，其它季铵类化学物质为基的强阴离子型交换剂经过一些方法改进很可能适于纯化AdCMVp53。

实施例8

Cellcube^TM产生的粗制AdCMVp53病毒的纯化

开发出两种不同的生产方法来生产AdCMVp53病毒。一种是根据搅拌罐生物反应器中的微载体培养。另一种是根据Cellcube^TM生物反应器。如上所述，开发出了采用搅拌罐生物反应器产生的粗制病毒上清液的纯化方法。考虑到尽管生物反应器和Cellcube^TM中的病毒生产采用了相同的培养基、细胞和病毒，但是细胞粘附的培养表面却是不同的。

在生物反应器中，细胞生长在玻璃包裹的微载体上，而在Cellcube^TM中细胞生长在适当处理的聚苯乙烯培养表面上。在Cellcube^TM中采用恒定的培养液灌流，而另一方面，生物反应器中则不采用培养液灌流。在Cellcube^TM中，粗制的病毒产物以病毒感染的细胞形式收获，而这与从生物反应器中收获病毒上清液不同。

用上述方法对收获的病毒感染的细胞进行5轮冻融，通过IEC纯化产生的粗制细胞裂解液(CCL)。与生物反应器中的病毒上清液不同，Cellcube^TM产生的CCL材料没有获得令人满意的纯化。图14显示了其色谱图。该结果表明Cellcube^TM通过冻融收获的细胞所产生的粗制病毒液不容易用IEC方法纯化。

检查其它纯化方法(包括疏水作用和金属螯合层析)纯化CCL中的病毒的效果。不幸的是，发现两种方法均没有改善纯化。考虑到生产过程中纯化CCL病毒的困难以及与纯化过程中有关冻融步骤的缺点，发明者决定探索其它细胞裂解方法。

A)裂解缓冲液中的粗制病毒溶液的纯化

如实施例1和3中所述，用HPLC分析来筛选不同的洗涤剂裂解方法。根据HPLC结果，将含1％吐温-20的20mM Tris+0.25M NaCl+1mM MgCl₂(pH＝7.50)的缓冲液用作裂解缓冲液。在病毒生产阶段的最后，并不收获感染的细胞，而是在排空用过的培养基后将裂解缓冲液泵入Cellcube^TM中。培育30分钟，使细胞裂解，病毒释放到裂解缓冲液中。

在澄清化和过滤后，浓缩/渗滤病毒溶液，用Benzonase处理以降低污染性核酸的浓度。用Toyopearl SuperQ树脂，采用上述设计出的方法来纯化处理过的病毒溶液。在洗脱时获得了令人满意的分离，其与采用生物反应器的病毒上清液所得分离相似。图15示出了洗脱曲线。然而，当用HPLC分析病毒级分时，检测到除病毒峰外还有另一个峰。结果如图16A所示。

为了进一步纯化病毒，用相同方法再次纯化收集的病毒级分。如图16B所示，在第二次纯化后，病毒级分的纯度得到相当大的改善。另外，还评价了作为第二次纯化候选方法的金属螯合层析。病毒纯度可获得类似于第二次IEC的改善。然而，由于该方法简单，IEC是第二次纯化方法的较佳选择。

如上述实施例2所述，细胞生长和病毒产生阶段采用的培养液灌流所得对于吐温-20粗提病毒的HPLC分离曲线有相当大的影响。对于高培养液灌流速度下产生的病毒粗制溶液，需要用两个离子交换柱来获得所需的病毒纯度。

根据低培养液灌流速度下产生的病毒溶液的HPLC观察到分离得到大大改善，因此可能通过一个离子交换柱就能获得所需的病毒纯度。图17显示了采用低培养液灌流速度下产生的粗制的病毒溶液的洗脱曲线。在洗脱时获得了陡的病毒峰。病毒级分的HPLC分析表明病毒纯度与一次离子交换层析步骤后CsCl梯度纯化的病毒相同。图18显示了该HPLC分析的结果。

用SDS-PAGE进一步分析纯化的病毒、用western印迹分析BSA以及用核酸狭线印迹，以测定污染性核酸的浓度。分析结果分别显示在图19A、图19B和图19C中。所有这些分析表明柱纯化的病毒的纯度与两次CsCl梯度纯化的病毒相当。表11列出了在柱纯化前后的病毒滴度和回收率。为了比较，表中还包括两次CsCl梯度纯化获得的典型的病毒回收率。两种方法获得了相近的病毒回收率。

表11IEC和两次CsCl梯度超离心纯化Cellcube^TM生产的AdCMVp53的比较

A)树脂容量研究

评价Toyopearl Super Q树脂纯化吐温-20收获的病毒溶液(在低培养液灌流速度下产生)时的动态容量。将100毫升树脂装填入XK50柱中。用本文所述的方法使不同量的粗制病毒溶液通过柱进行纯化。

在HPLC上分析病毒穿透和纯化效率。图20显示了HPLC分析结果。当装柱系数大于2∶1的样品/柱体积比时，病毒级分的纯度降低。污染物与病毒一起被洗脱。当装柱系数大于3∶1时，发现病毒穿透进入流穿液部分。因此，建议树脂的工作负载容量在样品/柱体积比为1∶1的范围内。

B)纯化后的浓缩/渗滤

柱纯化后的浓缩/渗滤不仅提高了病毒滴度(如果需要)，而且可更换成病毒产品指定的缓冲液系统。浓缩步骤采用300K NMWC TFF膜。由于纯化病毒中不存在蛋白质和核酸污染物，因此无需明显的跨膜亚降就可实现非常高的缓冲液流通量。

在该步骤中通过将缓冲液改成20mM Tris+1mM MgCl₂+0.15M NaCl(pH＝7.50)可实现约100％的病毒回收率。在浓缩/渗滤步骤中还可将纯化病毒的缓冲液成功地更换成DPBS。浓缩系数可以由最终产品所需的病毒滴度和柱中洗脱下来的病毒溶液的滴度来确定。这一灵活性有助于保持纯化病毒最终产品的一致性。

C)评价IEC纯化AdCMVp53中的缺陷型腺病毒

由于生产细胞中的腺病毒包装效率不到100％，粗制病毒溶液中通常存在一些缺陷型腺病毒。缺陷型病毒的衣壳内没有包装DNA，因此，可在CsCl梯度超离心上根据密度差异将其与完整的病毒中分开。假定两种病毒具有相似的表面化学性质，因此根据离子交换层析可能很难将缺陷型病毒和完整病毒分开。过量缺陷型病毒的存在将影响纯化产品的质量。

为了评价缺陷型病毒颗粒的存在百分数，对纯化并浓缩的病毒进行等密度CsCl超离心。如图21所示，离心后发现完整病毒条带顶部有一条暗淡的条带。回收这两条条带，并以20mM Tris+1mM MgCl₂(pH＝7.50)缓冲液进行透析以除去CsCl。在HPLC上分析透析后的病毒，结果如图22所示。两种病毒显示了相似的滞留时间。然而，缺陷型病毒的A260/A280比值低于完整病毒。这暗示缺陷型病毒中的病毒DNA较少。

在滞留时间为3.02至3.48分钟间所见的峰是由-70℃冷冻前加入病毒中的甘油(10％，v/v)产生的。缺陷型病毒的百分数低于总病毒的1％。这一低的缺陷型病毒百分数不可能影响纯化病毒产物中的全部病毒颗粒与感染性病毒(PFU)之比。用SDS-PAGE分析两种病毒(显示在图19A中)。与完整的病毒相比，缺陷型病毒缺少在24和48.5KD条带处的DNA伴随的核心蛋白。该结果与缺陷型病毒中缺少DNA一致。

D)生产和纯化AdCMVp53病毒的方法综述

根据上述方法改进的结果，发明者提出了如图23所示的生产和纯化AdCMVp53的流程图。其中包括了步骤和累积的病毒回收率，以及以1merCellcube^TM为基础的相应病毒产量。最终的病毒回收率约为70±10％。这比Huyghe等(1996)所报道的用DEAE离子交换层析和金属螯合层析纯化工艺纯化编码p53蛋白的腺病毒的病毒回收率高大约3倍。1mer Cellcube^TM产生了大约3×10¹²PFU的纯化病毒最终产品。这代表了相当于目前采用两次CsCl梯度超离心纯化的生产方法的最终产品产量。

E)放大

已经用4mer Cellcube^TM进行了成功的放大研究，目前正在评价16merCellcube^TM系统中的病毒生产。将采用更大的Peillcon过滤盒对所产生的粗制病毒液进行过滤、浓缩和渗滤。将测定病毒的质量和回收率。在Benzonase处理后，将用20cm和30cm的BioProcess柱分别纯化4mer和16mer的粗制病毒溶液。

实施例9

改进无血清悬浮培养中的Ad-p53生产

293细胞的适应

通过逐步降低T形烧瓶中的FBS浓度，使293细胞适应商业上可获得的IS293无血清培养基(Irvine Scientific；Santa Ana，CA)。融解一小瓶PDWB中的冷冻细胞，置于T-75烧瓶中的10％FBS DMEM中，通过逐步降低培养基中的FBS浓度，使细胞适应T形烧瓶中的无血清IS 293培养基。在T-75烧瓶中传代6次后，估计FBS％约为0.019％。在将细胞转移到摇瓶中之前，再使细胞亚培育两次。

使T形烧瓶中适应无血清的293细胞适应悬浮培养

将T形烧瓶中的上述适应无血清的细胞转移到无血清250毫升旋转悬浮培养(100毫升工作体积)中进行悬浮培养。最初的细胞密度为1.18E+5vc/mL。在细胞培养时，存活率降低，并发现有大的细胞团。在T形烧瓶中再传代2次后，再次尝试对悬浮培养作适应。在第二次试验中，在培养基中补加入浓度为100毫克/升的肝素以防止细胞聚集，且将最初细胞密度增加到5.22E+5vc/mL。在细胞培养时，细胞密度有一些增加，并维持细胞存活。然后，使细胞在摇瓶中再亚培育传代7次以上，在传递过程中细胞的倍增时间逐渐减少，在第七次传代的最后，倍增时间约为1.3天，这与贴壁细胞培养在10％FBS培养基中的1.2天相当。在补充了肝素的无血清IS293培养基中，几乎所有细胞均以单个细胞存在，在悬浮培养中不形成细胞聚集物(表12)。

表12无血清悬浮培养：适应悬浮

摇瓶中无血清悬浮培养的病毒生产和细胞生长

为了测试Ad5-CMVp53载体在无血清悬浮培养中的生产，使适应无血清悬浮培养的上述细胞在250毫升摇瓶中的100毫升无血清IS293培养基(其中补加了0.1％Pluronic F-68和肝素(100毫克/升))中生长。当第3天细胞达到1.36E+06活细胞/毫升时，以MOI为5感染细胞。在感染后，每天用HPLC分析上清液的病毒颗粒/毫升。除了第3天的样品外没有检测到病毒。在第3天为2.2E+09vps/ml。第6天时的pfu/mL为2.6±0.6E+07pfu/mL。估计每个细胞的pfu生产为19，这比加血清培养基中的贴壁培养低大约46倍。在没有感染时检查细胞的生长情况作为对照。

表13.无血清悬浮培养：病毒生产和细胞生长

适应无血清悬浮培养的293细胞库的制备

如上所述，在证明了细胞生产Ad-p53载体后，使细胞在摇瓶中含0.1％F-68和100毫克/升肝素的无血清IS293培养基中增殖，制得每毫升每管含1.0E+07活细胞的适应无血清悬浮培养的细胞库。为了收集细胞，在它们处于对数生长期中间且存活率大于90％时，离心并重悬于无血清、补充强化的IS293培养基中，再次离心洗涤细胞。然后将细胞再重悬于低温冷藏培养基(含有0.1％F-68、100毫克/升肝素、10％DMSO和0.1％甲基纤维素的冷的IS293)中，使得每毫升有1E+07个活细胞。将细胞悬液转移到无菌低温冷藏管中，密封并于-70℃低温冷冻过夜。将小管转移到液氮保藏。支原体试验呈阴性。

为使冷冻的细胞复苏，将一小管解冻在T-150瓶中含0.1％F-68和100毫克/升肝素的无血清IS293培养基中。然后使培养物在250毫升摇瓶内亚培育三次。在另一个研究中，将一小管解冻到250毫升摇瓶的100毫升无血清、补充的IS293培养基中。然后使它们在无血清摇瓶中亚培育2次。在两个研究中，细胞的生长都很好。

摇瓶中无血清悬浮培养中的培养基替换和病毒生产

在前述摇瓶悬浮培养的无血清病毒生产中，无血清悬浮生产的每细胞病毒产量太低而不实用。假设这可能是由于营养物消耗和/或抑制性副产物产生的缘故。为了用新鲜的无血清、补充型IS293培养基代替用过的培养基，在第3天离心细胞，并将细胞重悬于补加了F-68和肝素(100毫克/升)的新鲜无血清IS-293培养基中，细胞密度为1.20E+06vc/mL，用Ad5-CMVp53载体以MOI为5感染细胞。胞外HPLC vps/mL是第3天为7.7E+09vps/mL，第4天为1.18E+10vps/mL，第5天为1.2E+10vps/mL，第6天为1.3E+10vps/mL，第6天时的pfu/mL为2.75±0.86E+08tvps/mL。HPLC病毒颗粒与pfus之比约为47。同样离心细胞，用Cellcube收获中所用的相同类型的洗涤剂裂解缓冲液裂解。第2天时的细胞HPLC vps/mL为1.6E+10vps/mL，第3天为6.8E+9vps/mL，第4天为2.2E+9vps/mL，第5天为2.24E+9vps/mL，第6天为2.24E+9vps/mL。

用新鲜的无血清补充型IS293培养基替换用过的培养基导致Ad-p53载体的产量有显著提高。培养基替换使第3天时的胞外HPLC病毒颗粒产量比原先的水平提高3.6倍，第6天时的胞外pfu滴度比原先水平提高10倍。估计每个细胞的Ad-p53载体产量大约为1.33E+04HPLE vps。

在感染后第2天，胞内HPLC病毒颗粒达到峰值，然后颗粒数目减少。相反，胞外病毒颗粒逐渐增加，直至第6天收获。几乎所有的Ad-p53载体都在感染后2天中产生并位于胞内，然后病毒被释放到细胞外。几乎一半的病毒在感染后第2和第3天之间被释放到细胞外上清液中，而释放速度随时间的推移而降低。

所有被Ad-p53载体感染的细胞在感染6天后丧失存活力，而未感染的细胞有97％存活。在存在感染时，没有更换培养基和交换过培养基的用过的培养基的pH分别为6.04和5.96，而未感染的pH为7.00(表12)。

搅拌式生物反应器中有培养基替换和气体覆盖时的病毒生产和细胞培养

为了提高Ad-p53载体的产量，用5升CelliGen生物反应器来提供更好控制的环境。在5升CelliGen生物反应器中对pH、溶氧以及温度进行控制。将氧气和二氧化碳气体分别与供氧和调节pH的电磁阀相连。为了有较好的混合同时产生低的剪切环境，采用船用浆式推进器。在操作时始终供应空气，以维持生物反应器内的正压。

为了给生物反应器接种，将一小管细胞融解在250毫升摇瓶中的100毫升无血清培养基内，使细胞在250或500毫升摇瓶内繁殖。使生长在数个500毫升烧瓶中的800毫升细胞接种物与10升大玻璃瓶中的2700毫升新鲜培养基混合，并通过气压转移到CelliGen生物反应器中。CelliGen生物反应器的最初工作体积约为3.5L培养物。船用浆式推进器的搅拌速度设定为80rpm，温度为37℃、开始pH为7.1，感染后为7.0，操作时DO始终为40％。

最初细胞密度为4.3E+5vc/mL(97％存活率)，4天后当细胞密度达到2.7E+6vc/mL(93％存活率)时，离心沉降细胞，将细胞重悬于新鲜培养基中并转移到CelliGen生物反应器中。更换培养基后，细胞密度为2.1E+6vc/mL，以MOI为10感染细胞。此后DO降低到低于40％。为了维持DO高于40％，从CelliGen生物反应器中取出约500毫升培养物以降低细胞培养物的需氧量，上层船用浆位于气相和液相界面附近，通过增强表面更新来改善氧传递。此后DO可以维持高于40％直至操作结束。

对于pH控制，用CO₂气体来酸化细胞培养物，用1N NaHCO₃溶液来使细胞培养物成碱性。pH控制值最初设定在7.10。细胞培养物的最初pH大约为7.41。消耗约280ml 1N NaHCO₃直至细胞培养物的pH稳定在约pH7.1处。在用病毒感染细胞培养物后，pH控制降低至pH7.0，关闭CO₂气体供应管路以减少NaHCO₃溶液的消耗。为调节pH而消耗太多NaHCO₃溶液将使细胞培养物体积不利地增加。此后消耗70毫升1N NaHCO₃溶液，在运行的大多数时间内，pH在7.0至7.1范围内。控制温度在35℃至37℃之间。

在感染后，细胞的存活率稳步下降直至感染后第6天收获。在收获这天，没有细胞存活。与摇瓶中的1.3E+10vps/mL相比，CelliGen生物反应器的单位体积病毒产量为5.1E+10HPLC vps/mL。Celligen生物反应器中控制的环境使Ad-p53载体的产量比更换培养基的摇瓶提高4倍。这是因为感染时细胞密度从1.2E+6增加到2.1E+6vc/mL，而每个细胞的病毒产量从1.3E+4增加到2.5E+4vps/mL。2.5E+4vps/mL与补加血清的贴壁细胞培养中的3.5E+4vps/细胞相当。

搅拌式和喷射式生物反应器中的病毒生产和细胞培养

在第一个研究中，使细胞在搅拌式生物反应器中成功地生长来生产病毒，由生物反应器顶部空间中的气体覆盖来供应氧气和二氧化碳。然而，该方法的气体传递效果较差，从而限制了细胞培养系统的放大。因此，在第二个研究中，为了测试无血清悬浮培养放大的可行性，调查喷射式生物反应器中的细胞生长和Ad-p53生产，供应纯氧和二氧化碳，使其鼓泡通过补加了F-68(0.1％)和肝素(100毫克/升)的无血清IS293培养基。

使纯氧鼓泡通过液体培养基，以便向细胞提供溶解氧，纯氧供应由电磁阀控制以保持溶氧高于40％。为了有效供氧并同时尽量减少对细胞的伤害，采用不锈钢烧结的空气扩散器(其标称孔径约为0.22微米)作纯氧传递。另外还向液体培养基供应二氧化碳气体，使其从供应纯氧的同一扩散器和导管中鼓入，以维持pH约为7.0。为了控制pH，还使Na₂CO₃溶液(106g/L)与生物反应器挂钩。另外还向生物反应器的顶部空间供应空气，以维持生物反应器内的正压力。其它生物反应器的结构与第一个研究一样。

从冷冻小管获得接种细胞。将一小管冷冻细胞(1.0E+7vc)融解在T-150烧瓶中的50毫升培养基内，并在500毫升摇瓶中的200毫升培养基内亚培育3次。使生长在2个500毫升摇瓶内的400毫升接种细胞与10L大玻璃瓶内含F-68和肝素的IS293培养基混合，制得3.5L细胞悬浮液，将其转移到5L CelliGen生物反应器中。

生物反应器内的最初细胞密度为3.0E+4vc/mL。该最初细胞密度低于第一个研究。在第一个研究中，用4个500毫升摇瓶作为接种物。即使细胞初始密度较低，细胞也能在喷射式环境下在第7天生长至高达1.8E+6vc/mL，存活率为98％。在7天的生长中，葡萄糖浓度从5.4g/L降低至3.0g/L，乳酸浓度从0.3g/L升高到1.8g/L。

在第7天，当细胞密度达到1.8E+6vc/mL时，从生物反应器中离心出细胞，并重悬于10升大玻璃瓶中含F-68和肝素的3.5L新鲜的无血清IS293培养基中。用1.25E+11pfu Ad-p53感染293细胞并转移到Celligen生物反应器中。在生物反应器中，细胞存活率为100％，但是细胞密度只有7.2E+5vc/mL。在培养基交换操作中损失了一些细胞。测得培养基中的病毒滴度在第2天为2.5E+10HPLCvps/mL，第3天为2.0E+10，第4天为2.8E+10，第5天为3.5E+10，收获的第6天为3.9E+10HPLC。第一个具有气体覆盖的CelliGen生物反应器研究产生了5.1E+10HPLC vps/mL。第二次运行时病毒浓度较低可能是由于感染时的细胞密度较低。与第二次运行时的7.2+5vc/mL相比，第一次运行时采用2.1E+6vc/mL。实际上，估计第二次喷射式CelliGen生物反应器中的每个细胞的Ad-p53产量(5.4E+4vps/细胞)(是目前为止所获得的每个细胞产量中最高的。在第一次无喷射无血清CellGen生物反应器和补加血清的T形烧瓶的每个细胞产量分别为2.5E+4vps/细胞和3.5E+4vps/细胞。

在病毒感染后收获的第6天，细胞存活率从100％降低至13％。在感染后的这6天中，葡萄糖浓度从5.0g/L降低至2.1g/L，乳酸浓度从0.3g/L升高到2.9g/L。在操作的整个期间，消耗了约20毫升Na₂CO₃(106g/L)溶液。

实验结果表明在喷射式和搅拌式生物反应器中生产Ad-p53在技术和经济上是可行的。已经很好地建立了喷射式和搅拌式生物反应器的放大和大规模单元操作。

本文公开和要求的所有组合物与方法可通过借鉴本文公开无需进行过多试验即可制得和实施。尽管本发明的组合物和方法已经以较佳实例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述的组合物和/或方法以及方法步骤或步骤次序作改动。更具体地说，显然可用化学和生理上相关的某些试剂代替本文所述的试剂来获得相同或相似的结果。所有这些相似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们被视为包括在附加权利要求定义的本发明精神、范围和内容中。

参考文献

下列参考文献均特别纳入本文作参考，它们为本文所述内容补充了典型的步骤和其它细节.

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Claims (23)

1.一种生产腺病毒组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a)使宿主细胞在包含葡萄糖的培养基中生长；

b)灌流培养所述细胞，灌流速度提供了0.7-1.7g/L的葡萄糖浓度；

c)用腺病毒感染所述宿主细胞；和

d)用洗涤剂收获和裂解所述宿主细胞，以产生粗制细胞裂解液，其中所述洗涤剂是Thesit

NP-40

吐温-20

Brij-58

Triton X-100或辛基葡糖苷；

e)浓缩所述粗制细胞裂解液，更换粗制细胞裂解液的缓冲液，降低所述粗制细胞裂解液中污染性核酸的浓度；

f)用离子交换层析将腺病毒颗粒从所述粗制细胞裂解液中纯化出来。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述腺病毒包含一个含有外源基因构建物的腺病毒载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因构建物与启动子操作性相连。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述启动子是SV40 IE、RSV LTR、β-肌动蛋白、CMV IE、腺病毒主要晚期、多瘤F9-1或酪氨酸酶启动子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述腺病毒是无复制能力的腺病毒。

6.根据权利要求5所述的方法，其中腺病毒缺少至少一部分E1区域。

7.根据权利要求6所述的方法，其中腺病毒缺少至少一部分E1A和/或E1B区域。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞能互补复制。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是293细胞。

10.根据权利要求2所述的方法，其中所述外源基因构建物编码治疗性基因。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗性基因编码反义ras、反义myc、反义raf、反义erb、反义src、反义fms、反义jun、反义trk、反义ret、反义gsp、反义hst、反义bcl、反义abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV、ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCAI、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶或p53。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述治疗性基因编码p53。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子交换层析是阴离子交换层析。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述阴离子交换层析采用DEAE、TMAE、QAE或PEI。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述阴离子交换层析采用ToyopearlSuper Q 650M、MonoQ、Source Q或Fractogel TMAE。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述离子交换层析在pH7.0-10.0范围下进行。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓缩步骤采用膜过滤。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述过滤是切向流过滤。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述过滤采用100-300K NMWC、再生纤维素或聚醚砜膜。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤剂存在于裂解溶液中的浓度为1％w/v。

21.一种制备纯化的腺病毒组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a)使宿主细胞在培养基中生长；

b)通过灌流方法向所述宿主细胞提供营养物，其中细胞的灌流速度提供了0.7-2.0g/L的葡萄糖浓度；

c)用腺病毒感染所述宿主细胞；

d)用选自Thesit

NP-40吐温-20

Brij-58

Triton X-100

或辛基葡糖苷的洗涤剂来裂解所述宿主细胞，以产生包含腺病毒的裂解液；

e)对步骤d)产生的所述裂解液进行浓缩或渗滤，以及用核酸酶进行处理；和

f)从所述裂解液中纯化腺病毒来提供纯化的腺病毒组合物，所述纯化方法包括单个层析步骤且不使用氯化铯密度梯度离心，所述层析步骤是采用DEAE、TMAE、QAE或PEI的阴离子交换层析且在层析步骤后从裂解液中纯化腺病毒的回收率为起始PFU的70％±10％。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述阴离子交换层析采用ToyopearlSuper Q 650M、MonoQ、Source Q或Fractogel TMAE。

23.根据权利要求21所述的方法，其中对腺病毒进行纯化的步骤包括减少污染性核酸的浓度。

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