CN1252261C

CN1252261C - 无细胞蛋白质合成用转录模板的设计、构建及使用其的稀释分批式麦胚芽无细胞蛋白质的合成法

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Publication number: CN1252261C
Application number: CNB018148093A
Authority: CN
Inventors: 远藤弥重太; 泽崎达也; 小笠原富夫
Original assignee: CellFree Sciences Co Ltd
Current assignee: CellFree Sciences Co Ltd
Priority date: 2000-08-30
Filing date: 2001-08-28
Publication date: 2006-04-19
Anticipated expiration: 2021-08-28
Also published as: EP1314781A1; AU2001280202B2; CN1449444A; AU8020201A; WO2002018586A1; CA2421012A1; US20040121346A1; US7981617B2; KR20030031993A; EP1314781A4; JP4762481B2

Abstract

本发明的目的旨在提供下述的在设计和构建具有通用性、翻译模板活性高且可简单构建的无细胞蛋白质合成用的转录模板时使用的3’端PCR引物、5’端PCR引物以及使用它们的转录模板的构建方法。作为3’端PCR用引物，提供具有可与存在于传病媒介的抗药性遗传基因等的标记基因的转录终止子序列与Ori之间的碱基序列形成互补链的各种传病媒介固有的碱基序列的多核苷酸；作为5’端PCR用引物，提供满足仅使用其中一种引物时由所构建的DNA不引起转录的条件的两种引物，也就是，具有与从启动子的5’端开始至少含有启动子功能一部分的碱基序列互补的序列的多核苷酸和具有与从启动子的3’端开始至少含有一部分RNA聚合酶识别部位的碱基序列互补的序列的多核苷酸。

Description

无细胞蛋白质合成用转录模板的设计、构建及使用其的稀释分批式麦胚芽无细胞蛋白质的合成法

技术领域

本发明涉及了在无细胞蛋白质合成系统中使用的、用于从遗传基因合成翻译模板的转录模板的一般设计原理及其结构，以及使用该转录模板的、简便且高效率的麦胚芽无细胞蛋白质合成法。

背景技术

基因组计划即将结束，其研究课题的中心在迅速从遗传基因的结构分析转到遗传基因功能分析。一般认为细胞内的蛋白质并不是单独发挥功能，其功能是通过与多种多样的蛋白质因子、核酸、低分子种以及细胞膜成分等互相协调、相互作用来表达的，进而作为其相互作用的总和发挥着生物学功能。

后基因组计划的一个中心课题是分析多种多样的蛋白质因子的复合体的结构与功能的关系。研究中所获得的成果，可以预见在包括结构生物学和生物化学的基础生物学等的研究，及作为其应用的医学领域中的遗传基因翻译产物与病因的关系阐明，乃至在医药开发以及生产的广阔领域中提供重要的理论。

作为使高效率地在细胞内进行的蛋白质合成反应在生物体外进行的方法，迄今为止，例如：从生物体中提取细胞内所具备的含有作为蛋白质翻译装置的核糖体等的成分，并在该核糖体提取液中加入翻译模板、构成基质的氨基酸、能量源、各种离子、缓冲液，以及其它有效因子，在试管内合成蛋白质，也就是所谓的无细胞蛋白质合成方法等的研究正在积极的进行中。(特开平6-98790，特开平6-225783，特开平7-194，特开平9-291，特开平7-147992)。

在用于无细胞蛋白质合成的反应系即无细胞蛋白质合成系中使用的蛋白质合成用的细胞提取液或生物体组织提取液的配制中，使用大肠杆菌、麦胚芽或家兔网状红血球等。由于无细胞蛋白质合成系在合成肽的速度和翻译反应的准确性的两个问题上，保持了与生物体细胞相媲美的性能，而且具有不需要复杂的化学反应工序和繁杂的细胞培养工序的优点，因此迄今为止一直在研制其实际应用的系统。然而，一般说来从生物体细胞提取的细胞提取液，其蛋白质的合成性极其不稳定，因此蛋白质合成效率低，另外还因为细胞提取液在保存中的品质也显著下降，因此在无细胞蛋白质合成系中获得的合成量很少，只有放射性同位体标识等可检测程度的量，因此无细胞蛋白质合成系不能作为实际生产蛋白质的生产方法。

作为以往的高效率无细胞蛋白质合成方法，可以例举出由Spirin等人研制的连续型无细胞蛋白质合成方法[Spirin，A.et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123-142]。他们报告了一种通过将整合有目的基因的表达质粒添加在使用从大肠菌、麦胚芽或家兔网状红血球配制的细胞提取液的转录以及翻译的共轭无细胞蛋白质的合成系中，从而可更高效率地合成蛋白质。其中报道有：在利用使用大肠菌提取液的转录以及翻译的共轭无细胞蛋白质合成系的连续型无细胞蛋白质合成法中，每1ml反应系得到最高达到1mg左右的产物。

但是，使用大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系，以整合有目的遗传基因的表达质粒为模板，尤其在将该质粒以环型使用时，虽可发挥蛋白质的高合成能力，但是如果使用由直链质粒和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)(以下简称为PCR)构建的直链转录模板，则由于大肠杆菌提取液中混入的DNA分解酶的作用，在2小时左右的短时间内模板DNA将被分解，可合成的蛋白质的量降低到与以往的分批法同等水平，也就是每1ml反应系中可合成的蛋白质的量为数十μg。于是，在以往方法从大肠杆菌、麦胚芽或家兔网状红血球配制的无细胞蛋白质合成用的细胞提取液或组织提取液中，因混入一组核酸分解酶、翻译抑制蛋白质因子、蛋白质分解酶等，由于这些分解元素的作用，在蛋白质合成反应中产生翻译反应系失活或者惰性化([Ogasawara，T.，et al.，(1999)EMBOJ.，18，6522-6531]。所以即使是使用任意的细胞提取液或组织提取液的蛋白质合成系，其合成效率低、获得的蛋白质量也少。

最近发明者等提供了解决这些无细胞蛋白质合成系缺点的方法，即①无细胞蛋白质合成用细胞提取物制剂以及无细胞蛋白质合成法(WO00/68412号公报)；②具有通用性以及高效率功能的模板分子及其利用方法(WO01/27260号公报)，并成功地进一步提高了无细胞麦胚芽蛋白质合成系中蛋白质合成效率。在发明者研制的麦胚芽无细胞蛋白质合成系中，不含有核酸分解酶以及翻译反应抑制因子群[Madin K.et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564](WO00/68412号公报)，所以，迄今为止被视为难题的利用直链DNA作为转录模板的高效率蛋白质合成的实现也成为可能。

另一方面，通过利用以往的PCR法的模板DNA的构建法，配制上述高效率麦胚芽无细胞蛋白质合成系中使用的转录模板。在这种方法中，采用了包含作为RNA聚合酶识别以及结合部位的传病媒介的启动子部位的整个领域、有助于翻译扩增与mRNA稳定化的结构、以及与它们相接直至目的遗传基因ORF(翻译框)的一部分的物质作为引物。通过使用这种引物，试验了从目的遗传基因构建无细胞蛋白质合成用转录模板。因此在采用PCR法的现有转录模板的构建方法中，由于除了作为目的完整长链的转录模板外，由于反应中产生的非特异DNA的扩增，所以聚积了具有启动子序列的短链DNA片段。由于排除这种DNA断片相当困难，因此如果以采用上述引物的PCR产物作为转录模板进行RNA合成，则所得到的大部分分子就变为属于非特异性短链DNA的转录产物的低分子RNA。在这些RNA分子中还含有5′翻译起始序列的RNA片段，这些片段被识别为mRNA进行翻译，其结果是，除目的遗传基因的翻译产物外，还出现了大量的低分子翻译产物，从而成为导致目的翻译产物的收量和纯度下降的原因。

于是，在以往的翻译模板的构建法中，由于使用了通过设计并使用含有与全长的启动子互补的碱基序列的5′端引物而构建的转录模板，因而存在着目的遗传基因的转录效率极低、且产生的翻译模板噪声高的很大缺点。

另外即使使用按这种方法构建的转录模板，由于在转录反应与翻译反应中的最佳的镁浓度显著不同，因此认为在使用现有分批麦胚芽无细胞蛋白质合成系的转录以及翻译一体型的高效率合成蛋白质是不可能的。而且作为转录基质残留物的4种核苷三磷酸(4NTPs)或作为副产物的焦磷酸对翻译反应产生强烈的抑制作用，这也是导致无细胞蛋白质合成系合成效率低的原因。

随着基因组项目的进行，今天已经搞清许多基因的结构，另外分离了数万种cDNA克隆。作为面向21世纪的基础科学及应用科学中遗传基因的功能与结构的分析、全体蛋白质分析、药品制造等的第一步，首先需要简便、高效率地从这些庞大的遗传基因中合成作为遗传基因产物的蛋白质。作为实现这一目标的主要技术，期待着确立①保持高翻译模板活性的mRNA的设计；②合成mRNA用的转录模板的构建技术；以及将之加以应用的简便的③无细胞翻译技术。

发明内容

本发明的一种实施方式是一种3′端引物的碱基序列，该碱基序列在通过PCR法制作供无细胞蛋白质合成法中使用的、用以制作具有3′端非翻译序列的翻译模板分子的转录模板时使用，其特征在于，该碱基序列是：碱基序列(1)，其含有可以与在克隆了遗传基因的传病媒介的抗药性遗传基因等标记遗传基因的转录终止子序列和含有一部分Ori的序列之间存在的碱基序列形成互补链的碱基序列；碱基序列(2)，其为在序列表的序列编号1中记述的序列；碱基序列(3)，其含有在序列表的序列编号1中记述的碱基序列的主要部分；可以与上述(1)～(3)中的任意一种碱基序列在严格条件下进行杂交的碱基序列；或与这些碱基序列互补的碱基序列。

本发明的一个实施方式是一种5′端引物的碱基序列，其在由PCR法制作供无细胞蛋白质合成方法中使用的、用以制作翻译模板分子的转录模板时使用，其特征在于，该碱基序列为：碱基序列(4)，其含有与RNA聚合酶的启动子序列具有部分互补性的碱基序列；碱基序列(5)，其为序列表的序列编号2或序列表的序列编号3中记述的碱基序列；碱基序列(6)，其含有序列表的序列编号3中记述的碱基序列；碱基序列(7)，其含有上述(5)或(6)的碱基序列的主要部分；可以与上述(4)～(7)中的任意一种碱基序列在严格条件下进行杂交的碱基序列；或与这些碱基序列中的任意一种互补的碱基序列。

本发明的另一实施方式涉及一种转录模板的构建方法，该方法是使用具有不同的2种碱基序列的2种多核苷酸(A)、(B)作为5′端引物通过PCR构建转录模板的方法，该碱基序列是在由PCR法制作供无细胞蛋白质合成方法中使用的、用以制作翻译模板分子的转录模板时使用的碱基序列，该方法的特征在于，在该方法中，该两种PCR用引物的碱基序列满足仅由该引物中的任意一种所构建的DNA不发生转录的条件，该引物之一是多核苷酸(A)，其包含的碱基序列具有与从启动子的5′端开始至少含有一部分启动子功能部位的碱基序列互补的序列，但不具有与该启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的至少一部分互补的序列；该另一种引物是多核苷酸(B)，其包含的碱基序列具有与从启动子的3′端开始至少含有一部分RNA聚合酶识别部位的碱基序列互补的碱基序列，但不具有与该启动子的5′端的至少启动子功能部位互补的碱基序列。

本发明的另一个实施方式涉及上述转录模板的构建方法，该方法中使用含有如下碱基序列的多核苷酸：通过在多核苷酸(B)的碱基序列上继续插入GA或GAA序列，在其下游连接提供mRNA翻译扩增的碱基序列，进一步连接翻译起始密码子ATG、或与目的遗传基因的ORF(可译框)的一部分的或不含有ORF的ORF上游的碱基序列互补的碱基序列，如此得到的碱基序列。

本发明的另一实施方式涉及上述转录模板的构建方法，其特征在于：在多核苷酸的翻译部的起始密码子与ORF之间整合组氨酸标记物、GST(谷胱苷肽S-转换酶)、myb等标记物或表位合成用的碱基序列。

本发明的另一实施方式涉及一种转录模板的构建方法，其特征在于：在由PCR法制作供无细胞蛋白质合成方法使用的、用以制作翻译模板分子的转录模板的方法中，作为该转录模板的5′端引物，使用含有序列表的序列编号2中记述的碱基序列的多核苷酸，和含有通过在序列表的序列编号3中记述的碱基序列上连接源自烟草花叶病毒的Ω(オメガ)序列与作为翻译起始密码子的ATG而得的碱基序列的多核苷酸，以及含有通过在序列表的序列编号5中记述的碱基序列上连接作为翻译起始密码子的ATG、并在其后连接作为转录目的的遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列而得的碱基序列的多核苷酸；作为该转录模板的3′端引物，采用含有序列表的序列编号1中记述的碱基序列的多核苷酸。

本发明的另一个实施方式涉及一种由PCR法制作转录模板用的引物组，该引物组中，作为5′端的引物含有多核苷酸(A)、多核苷酸(B)、多核苷酸(C)，作为3′端引物含有具有可以与在克隆了遗传基因的传病媒介的抗药性遗传基因等标记遗传基因的转录终止子序列和含有一部分Ori的序列之间存在的碱基序列形成互补链的碱基序列的多核苷酸，所述多核苷酸(A)包含的碱基序列具有与从启动子的5′端开始至少含有一部分启动子功能部位的碱基序列互补的序列，但不具有与该启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的至少一部分互补的碱基序列；所述多核苷酸(B)包含的碱基序列具有与从启动子的3′端开始至少含有一部分RNA聚合酶识别部位的碱基序列互补的碱基序列，但不具有与该启动子的5′端的至少启动子功能部位互补的碱基序列；所述多核苷酸(C)是通过在可退火多核苷酸(B)的碱基序列上继续连接翻译起始密码子ATG、或者与目的遗传基因的ORF(可译框)的一部分的或不含有ORF的ORF上游的碱基序列互补的碱基序列而形成的。

本发明的另一个实施方式是上述的引物组，该引物组中的多核苷酸(B)是具有如下碱基序列的多核苷酸：通过在具有与从启动子的3′端开始至少含有一部分RNA聚合酶识别部位的碱基序列互补的碱基序列、但不具有与该启动子的5′端的至少启动子功能部位互补的碱基序列的碱基序列之后，继续插入GA或GAA序列，在其下游进一步连接提供mRNA翻译扩增的序列，进一步连接翻译起始密码子ATG、或与不含有目的遗传基因ORF的ORF上游(5′端)的碱基序列互补的碱基序列，如此得到的碱基序列。

本发明的另一实施方式是引物组，该引物组是为由PCR制造供无细胞蛋白质合成方法中使用的用以构建翻译模板分子的转录模板时所需的引物组，其中，作为5′端引物含有：具有序列表的序列编号2中记述的碱基序列的多核苷酸；具有由在序列表的序列编号3中记述的碱基序列上连接源自烟草花叶病毒的Ω序列与作为翻译起始密码子的ATG而得到的碱基序列的多核苷酸；以及具有由在序列表的序列编号5中记述的碱基序列上连接作为翻译起始密码子的ATG、并在其后连接作为转录目的遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列而得到的碱基序列的多核苷酸；作为3′端的引物含有具有序列表的序列编号1记述的碱基序列的多核苷酸。

本发明的另一实施方式是一种转录模板，该模板是无细胞蛋白质合成方法中使用的高效率mRNA合成用的转录模板，其是通过上述任意一种构建方法制作而得的。

本发明的另一实施方式是一种转录模板，该模板是无细胞蛋白质合成方法中使用的高效率mRNA合成用的转录模板，其是使用上述任意一种引物组并通过PCR进行合成的。

本发明的另一实施方式是无细胞蛋白质合成方法，该方法中，将由上述任意的构建方法制作的转录模板或者由上述任意的转录模板转录的mRNA作为翻译模板使用。

本发明的另一实施方式是上述无细胞蛋白质的合成方法，该方法在合成mRNA后通过凝胶过滤进行精制。

本发明的另一实施方式是一种转录以及翻译连续型稀释方式的无细胞蛋白质合成法，其特征在于：由上述任意的构建方法制作转录模板，通过转录溶液进行转录反应后，添加无细胞蛋白质合成用的反应溶液，将添加后的反应溶液中至少镁的浓度降低到翻译最佳浓度，同时降低该反应溶液中的转录基质及转录副产物的浓度，延长翻译反应的持续时间。

本发明的另一实施方式是转录及翻译一体型稀释方式的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：由上述任意的构建方法制作转录模板，在通过无细胞蛋白质合成用反应溶液进行转录反应后，添加稀释溶液稀释，将该反应溶液中的至少镁浓度降低到翻译最佳浓度，同时降低该反应溶液中的转录基质及转录副产物的浓度，延长翻译的持续时间。

本发明的另一实施方式是转录及翻译连续型稀释方式的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：在反应容器中添加cDNA，实施上述任意的转录模板的构建方法，在该反应容器中制作转录模板，由含有RNA聚合酶与4种核苷三磷酸的转录用溶液进行转录反应后，进一步添加无细胞蛋白质合成用反应溶液，将反应溶液中至少镁浓度降低到翻译最佳浓度，进行翻译反应。

本发明的另一实施方式是转录及翻译一体型稀释方式的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：在反应容器中添加cDNA，实施上述任意的转录模板的构建方法，在该反应容器中制作转录模板，添加含有RNA聚合酶和4种核苷三磷酸的无细胞蛋白质合成用反应溶液进行转录反应后，添加稀释溶液进行稀释，将该合成溶液中至少镁的浓度降低至翻译最佳浓度，进行翻译反应。

本发明的另一实施方式是上述任意的无细胞蛋白质的合成方法，该方法中将镁浓度降低至翻译最佳浓度，将镁浓度降低为约1mM到约6mM。

本发明的另一实施方式是上述任意的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：转录反应在约30～45℃下实施，且翻译反应在约20～30℃下实施。

本发明的另一实施方式是上述任意的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：使用麦胚芽提取物。

附图说明

图1是表示实施例1中由PCR制造具有3′端非翻译序列的、翻译模板活性高的mRNA的转录模板时所用的引物的设计图。(a)表示作为ORF而整合了GFP遗传基因的源自pUC19的pEU结构，和利用PCR法构建转录模板时所用的引物。(b)表示SP6 RNA聚合酶产生的转录产物。(c)使用这些mRNA的分批麦胚芽无细胞蛋白质合成系中，以¹⁴C-亮氨酸的摄入作为蛋白质合成指标进行测定的结果。图中所谓Cap是在mRNA的5′端上添加7mGpppG而合成的带有Cap的mRNA，所谓Circular是将环状质粒作为转录模板而构建的mRNA。

图2是表示对照例1中的利用由以往方法设计的5′端引物的转录模板的构建方法，转录产物，以及其翻译活性。(a)是作为构建转录模板用的质粒模板与PCR用引物的模式图；(b)表示主要的PCR产物；(c)是表示预测由作为PCR产物而得到的转录模板通过SP6RNA聚合酶转录所得的RNA分子种的模式图；

图3是表示对照例1中的利用按照以往方法设计的5′端的引物所构建的转录模板而得到的转录产物的琼脂糖凝胶电泳图。各泳道是使用由分别整合3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模板质粒制作的转录模板而得到的mRNA。左侧泳道为分子量标记。*表示全长的转录产物。

图4是表示对照例1中使用按照以往方法设计的5′端引物所构建的转录模板而得到的转录产物，实施无细胞蛋白质合成后的翻译产物的放射自显影图。各泳道是使用由分别整合3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模板质粒制作的转录模板而得到的转录产物通过翻译而得到的翻译产物。左侧泳道为分子量标记。*表示全长的转录产物，箭头表示低分子产物。

图5是表示实施例2中使用RNA聚合酶启动子序列分断型引物的转录模板的构建方法，转录产物，以及其翻译活性。(a)是作为构建转录模板用的质粒模板与PCR用引物的模式图；(b)表示主要的PCR产物；(c)是表示预测由作为PCR产物而得到的转录模板通过SP6RNA聚合酶转录所得的RNA分子种的模式图；

图6是表示实施例2中由使用RNA聚合酶启动子序列分断型引物构建的转录模板所得到的转录产物的琼脂糖凝胶电泳图。

各泳道是使用由分别整合3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模板质粒制作的转录模板而得到的mRNA。左侧泳道为分子量标记。

图7是表示实施例2中使用由RNA聚合酶启动子序列分断型引物所构建的转录模板而得到的转录产物，实施无细胞蛋白质合成后的翻译产物的放射自显影图。各泳道是使用由分别整合3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、1gkDa、44kDa及27kDa)的模板质粒制作的转录模板而得到的转录产物通过翻译而得到的翻译产物。左侧泳道为分子量标记。

图8表示实施例2中利用由RNA聚合酶启动子序列分断型引物构建的转录模板转录所得的mRNA，经过透析式麦胚芽无细胞蛋白质合成方法进行蛋白质合成。各泳道是使用由分别整合3种cDNA或GFP遗传基因(如图中所示翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模板质粒制作的转录模板而得到的转录产物通过翻译而得到的翻译产物。左侧泳道为分子量标记。*表示各转录产物。

图9表示实施例3中利用稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成方法合成蛋白质。(a)是测定以往的分批法(●-●)与稀释法(○-○)中的蛋白质内¹⁴C-亮氨酸的摄入的时效变化的结果，纵轴的放射能读数基于等量的胚芽提取液量；

(b)是所得到的蛋白质的放射自显影图。

图10表示实施例4中利用转录与翻译一体型稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成方法合成蛋白质。(a)是蛋白质内的¹⁴C-亮氨酸摄入的时效变化的测定结果。图中小□-□、中□-□、大□-□表示转录反应阶段中RNA合成基质浓度，分别为1.5mM、2.5mM、3.0mM。●-●是以往的分批法；○-○表示稀释法。(b)是所得到的蛋白质的放射自显影图。

图11表示由cDNA库制作蛋白质库的制作方法概图。

具体实施方式

在迄今为止开发的无细胞蛋白质的合成系中，与利用大肠菌提取物的合成系相比，利用麦胚芽提取物的合成系的核酸分解酶活性特别低，而且翻译活性稳定、且具有高性能[Madin K.et a1.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]，因此以质粒为模板的转录与翻译一体型方式可高效率地合成蛋白质(WO00/68412号公报)。

以下，以麦胚芽无细胞蛋白质合成系以及该合成系中可以发挥作用的转录模板的设计方法和构建方法为例说明本发明。然而本发明的基本原理并不限定于这里所表示的方法，也可应用在利用源自其它微生物或动物细胞的细胞提取物的无细胞蛋白质合成系，及其所使用的转录模板的设计与构建上。

(转录模板构建中使用的引物结构)

发明者等通过使用经过稳定化和高效化处理的麦胚芽提取液的无细胞蛋白质合成系，研制出了高翻译模板活性所必需的mRNA的5′及3′端非翻译结构，正在申请专利(WO01/27260号公报)。尤其是搞清了在mRNA中添加长链的3′端非翻译结构，对提高无细胞蛋白质合成反应效率是极其有效的。

(1)3′端引物的结构

为了通过PCR法构建能有效增强翻译模板活性、且具有尽可能短的3′端非翻译结构的mRNA的转录模板，以整合有作为模型遗传基因的水母的绿色荧光蛋白质(Green Fluorescent Protein)(GFP)遗传基因的质粒[参照图1的(A)]为模板实施了PCR。

在PCR法中，GFP遗传基因的转录模板扩增用的5′端引物使用了具有碱基序列

5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3′的多核苷酸。

3′端引物使用下述3种引物(参照图1)进行了比较。引物III(序列表的序列编号1)是可以与在抗药性标记遗传基因(在图1中为Amp^r)的转录终止子序列与DNA复制起始碱基序列(Ori)之间存在的碱基序列形成互补链的碱基序列，引物I及II是参考序列。

引物 I：5′GGGAAGATAAACAGTATTTT 3′(mRNA1转录用)

引物 II：5′CCCTCGAGGCGTGGGCCCCA 3′(mRNA2转录用)

引物III：5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA 3′(mRNA3转录用)

研究结果发现，引物III作为转录模板构建用的3′端引物是最理想的，可以提供为得到具有高翻译模板活性的mRNA所需的最佳转录模板。

作为在利用PCR法合成用于无细胞蛋白质合成法的、作为翻译模板分子的3′端非翻译序列的转录模板的碱基序列时所用的3′端引物，可以优选地例举出具有上述序列表的序列编号1中记述的碱基序列的引物III。但是并不仅限于此，只要是由含有可以与在克隆了遗传基因的传病媒介的抗药性遗传基因等标记遗传基因的转录终止子序列和含有一部分DNA复制起始碱基序列(Ori)的序列之间存在的碱基序列(例如各个传病媒介固有的碱基序列)形成互补链的碱基序列的碱基序列构成的引物即可，并不具有特定的碱基序列。也可以是例如具有包含序列表的序列编号1中记述的碱基序列的主要部分的碱基序列、具有可以与这些碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列、或者具有与它们互补的碱基序列的引物。在这里，所谓的“在严格条件下杂交”意味着，例如：在6×SSC、0.5％SDS以及50％甲酰胺溶液中42℃下加热后，在0.1×SSC、0.5％SDS溶液中68℃下清洗的条件下依然可以观察到呈阳性的杂交信号。例如：通过Molecular Cloning：A Laboratory Manual(戈德尔哈博实验室，1989)等记述的方法，可得到这样的碱基序列。

如果使用本发明涉及的上述3′端引物，则通过PCR法可简便得到对增强翻译模板活性有效、且具尽可能短的3′端非翻译结构的mRNA的转录模板。由PCR法扩增长链DNA，在其反应性质上一般说来往往是比较困难的，但是通过采用本发明则可通过PCR法构建以往被认为是困难的添加了长链非翻译领域的mRNA的转录模板。

(2)由PCR法使用以往方式的5′端引物进行转录模板的设计及构建

作为模型遗传基因，利用了分别在质粒pUC19上克隆了源自鼠肝脏的3种cDNA(分别为将18kDa、25kDa、44kDa的蛋白质进行编码的cDNA)，以及将GFP(27kDa的蛋白质)进行编码的cDNA。

在第一阶段的PCR中，作为5′端引物使用了具有来源于烟草花叶病毒的Ω序列的碱基序列(5′ACATTCTACAACTACA 3′；序列表的序列编号5)的下述引物3。在以下所示的碱基序列中，下划线部分的ATG是ORF的起始密码子，X是遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列。作为遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列使用了上述各cDNA的从5′端开始的连续19个核苷酸构成的碱基序列，不过，X的数量也可以为约13个～约30个。

引物3：5′ACATTCTACAACTACA ATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′

作为PCR用的3′端引物，使用了上述mRNA3转录用引物III(序列表的序列编号1)。

在第2阶段的PCR中，作为5′端引物，使用了与RNA聚合酶的启动子碱基序列的全范围对应的下述引物1，

引物1：5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3′

以及接在该碱基序列后的、含有Ω序列和遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列(XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX，19碱基)的以下序列(引物2)。这里，作为遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列，使用了由从上述各cDNA的5′端开始的连续19个核苷酸构成的碱基序列，不过，X的数量也可以是约13个～约30个。

引物2：5′GCATTTAGGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTA

CCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACAT

TCTACAACTACA ATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′

作为PCR用的3′端引物，使用了以上述mRNA3转录用的引物III(序列表的序列编号1)的碱基序列为基础，在启动子序列上挪动3个碱基而设计、制作的下述引物IV(序列表的序列编号4)。

引物IV：5′GTCAGACCCCGTAGAAAAGA 3′

(3)使用了启动子序列分断型引物的转录模板的设计及构建

在低背景的转录模板的设计及构建中，作为5′端引物，设计、使用了分别与RNA聚合酶的启动子序列具有部分互补性的两种具有不同的碱基序列的引物。其中一种引物是多核苷酸(A)、例如下述的引物①，其包含的碱基序列具有与从启动子的5′端开始至少含有一部分启动子功能部位的碱基序列互补的序列，但不具有与该启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的至少一部分互补的碱基序列；该另一种引物是多核苷酸(B)、例如下述的引物②，其包含的碱基序列具有与从启动子的3′端开始至少含有一部分RNA聚合酶识别部位的碱基序列互补的碱基序列，但不具有与该启动子的5′端的至少启动子功能部位互补的碱基序列。亦即，上述两种引物是分别具有与启动子碱基序列的不同部分的碱基序列互补的碱基序列的启动子序列分断型引物。该两种启动子序列分断型引物的特征在于，使用该两种引物通过PCR构建的DNA可以发生转录，但仅使用任意一种引物所构建的DNA不发生转录。这里举例示出的启动子序列分断型引物①以及②是SP6启动子序列分断型引物。但涉及本发明的启动子分断型引物并不仅限于上述种类，也可根据各种各样的启动子的碱基序列进行制作。

引物①：5′GCGTAGC ATTTAGGTGACACT 3′(序列表中的序列编号2)

(下划线部分是与SP6启动子的5′端互补的序列，但缺少与3′

端互补的序列ATA)。

引物②：在5′ GGTGACACTATAGAA(序列表中的序列编号3)后连接Ω

序列(71碱基)以及由经克隆的遗传基因产生的ATG。

(下划线部是与SP6启动子的3′端互补的序列，但缺少与5′

端的互补序列ATTTA)。

引物③：与上述引物3相同。

作为模型遗传基因，利用了在pUC19上分别克隆了3种来源于鼠肝脏的cDNA以及对GFP进行编码的cDNA。在第一阶段的PCR中，作为5′端引物，使用了在源于Ω序列的碱基序列5′ACATTCTACAACTACA 3′(序列表的序列编号5)后含有与从目的遗传基因翻译起始密码子ATG开始的22个碱基的ORF的5′端互补的序列的引物(全长：38碱基)；作为3′端引物，使用了mRNA3转录用的引物III(序列表的序列编号1)。而且在第二阶段的PCR中，作为5′端引物使用了引物①及②；作为3′端引物，使用了上述引物IV(序列表的序列编号4)(引物的摩尔比①∶②∶IV＝100∶1∶100)。PCR不一定必须分为2个阶段，即使将整个工序在一个阶段实施，本发明的本质也不发生任何变化。

通过比较使用上述以往方式的5′端引物构建起来的转录模板，与根据上述本发明的使用启动子分断型的5′端引物构建起来的转录模板发现，在采用启动子分断型引物时，翻译模板的合成效率以及无细胞蛋白质合成效率都得到了提高。

如引物①及引物②那样的启动子序列分断型引物，对于利用PCR法构建即使对转录反应后目的尺寸的mRNA不进行分离也可使用于无细胞蛋白质合成系的、具有5′端非翻译序列且翻译活性高的mRNA的翻译模板是非常有用的。即：由使用启动子序列分断型引物利用PCR法而得到的转录模板转录的mRNA中，几乎不含有混杂在使用以往型的引物所得到的mRNA中导致非特异性的短链mRNA。在无细胞蛋白质合成方法中，非特异性短链mRNA作为目的蛋白质的强力合成抑制剂而发生作用，从而构成了使合成量显著降低的原因。但是如果使用本发明涉及的翻译模板，由于没有短链mRNA的影响，因此可更高效率地进行无细胞蛋白质的合成。另外，由使用启动子序列分断型引物利用PCR法而得到的转录模板转录的mRNA，在合成后无需对目的尺寸的mRNA进行分离即可应用于无细胞蛋白质合成系中，因此可简便地进行该mRNA的合成以及从该mRNA合成蛋白质。

用于构建成为上述无细胞蛋白质合成法中使用的翻译模板分子合成用的转录模板的DNA碱基序列的5′端PCR用的引物，其碱基序列可以是：含有与RNA聚合酶的启动子序列具有部分互补性的碱基序列的碱基序列；序列表的序列编号2或序列表的序列编号3中记述的碱基序列；含有序列表的序列编号3中记述的碱基序列的碱基序列；含有这些碱基序列的主要部分的碱基序列；在严格条件下可与这些碱基序列杂交的碱基序列；或这些序列的互补碱基序列。

如果采用本发明涉及的上述5′端引物，则通过PCR法可简便地得到将成为背景的转录产物量控制到最小限度的转录模板。在使用上述5′端引物构建转录模板时，也可使用例如具有作为上述5′端的PCR用引物的碱基序列的不同的碱基序列的两种引物。而且，作为3′端引物，优选使用本发明涉及的上述3′端引物。

在此，上述两种5′端引物满足仅用任意一种引物所构建的DNA不发生转录的这种条件。优选的是，该引物之一是多核苷酸(A)，其包含的碱基序列具有与从启动子的5′端开始至少含有一部分启动子功能部位的碱基序列互补的序列，但不具有与该启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的至少一部分互补的序列；该另一种引物是多核苷酸(B)，其包含的碱基序列具有与从启动子的3′端开始至少含有一部分RNA聚合酶识别部位的碱基序列互补的碱基序列，但不具有与该启动子的5′端的至少启动子功能部位互补的碱基序列。

上述多核苷酸(B)也可以是具有下述碱基序列的多核苷酸：在上述多核苷酸(B)序列后继续插入GA或GAA序列，在其下游连接给予mRNA翻译扩增的序列，再进一步连接翻译起始密码子ATG，或与目的遗传基因的ORF(翻译框)的一部分或不含有ORF的ORF上游(5′端)的碱基序列互补的序列，如此连接而成的碱基序列。给予mRNA翻译扩增的碱基序列可例举出，如由烟草花叶病毒的Ω序列或苜蓿花叶病毒的前导序列来源的碱基序列(AMV)，或其直接结合的AMV-Ω序列，或Ω序列来源的29碱基Ω序列等，但是不限于此，可以是能给予翻译扩增的碱基序列。

另外作为上述的5′端引物，可使用包含上述多核苷酸(A)与多核苷酸(B)以及多核苷酸(C)的3种多核苷酸的引物，该多核苷酸(C)是在可对多核苷酸(B)进行退火的碱基序列之后连接翻译起始密码子ATG或与目的遗传基因的ORF的一部分或不含ORF的ORF上游(5′端)的碱基序列互补的碱基序列而构成的。目的遗传基因的ORF(翻译框)的一部分是由该ORF的5′端开始连续的约13碱基至约30碱基构成的碱基序列。在此，多核苷酸(B)可以是具有如下碱基序列的多核苷酸：通过在具有与从启动子的3′端开始至少含有一部分RNA聚合酶识别部位的碱基序列互补的碱基序列、但不具有与该启动子的5′端的至少启动子功能部位互补的碱基序列的碱基序列之后，继续插入GA或GAA序列，在其下游进一步连接提供mRNA翻译扩增的序列，进一步连接翻译起始密码子ATG、或与目的遗传基因ORF的一部分或不含有ORF的ORF上游(5′端)的碱基序列互补的碱基序列，如此得到的碱基序列。

另外在上述5′端引物的翻译部分的起始密码子与ORF间，可整合组氨酸标记、谷胱苷肽S-转换酶(GST)、myb等标记，或表位合成用的碱基序列。如果使用由这样的引物制作而成的转录模板，则在最终得到的翻译产物中，上述标记或者表位作为该翻译产物的精制用或标记用等而被附加。

上述两种引物的组合或上述3种引物的组合，可以作为用于制作各种遗传基因的转录模板的、具有通用性的5′端引物。以下将把引物的组合称作引物组。另一方面，在上述引物组的基础上，作为3′端引物，使用含有可与在克隆了遗传基因的传病媒介的标记基因(例如：在含有抗药性遗传基因等)的转录终止子序列与含有一部分Ori的序列之间存在着的碱基序列形成互补链的碱基序列的多核苷酸，如此组合成的引物组，也可作为用于由PCR制作各种各样基因的转录模板的、具有通用性的、有用的引物组。

(转录及翻译一体型稀释方式蛋白质的合成方法及转录和翻译连续型稀释方式蛋白质的合成方法)

使用由本发明涉及的引物通过PCR法制作的转录模板，则可简便且高效率地合成蛋白质。例如：使用通过上述原理及方法构建的转录模板合成而得的mRNA作为翻译模板，添加含有对于蛋白质合成来说是足够量的麦胚芽提取液的无细胞蛋白质合成反应溶液，进行无细胞蛋白质合成，则与使用以往的转录模板合成的mRNA进行蛋白质的合成相比，合成反应可长时间地持续。由该转录模板合成mRNA时，可利用众所周知的转录反应。无细胞蛋白质的合成方法也可根据现有方法进行[Madin K.et.al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564](WO00/68412号公报)。另外，如果对合成的mRNA采用凝胶过滤等方法进行精制，则可进一步提高蛋白质的合成效率。

另一方面，如果将使用本发明的引物通过PCR法得到的转录模板与已往报道的转录与翻译一体型无细胞蛋白质的合成方法(WO00/68412号公报)配合进行蛋白质的合成，那么将可以回避用其他途径转录制作成的mRNA添加到无细胞蛋白质合成系中带来的繁杂性。在使用该转录模板的转录及翻译一体型麦胚芽无细胞蛋白质合成法中，首先将转录反应在适用于转录反应的条件下进行。理想的是将转录反应在约30～约45℃，更理想的是在约35～约40℃中进行。然后通过在反应溶液中添加适当的稀释溶液达到适于翻译反应的条件后进行蛋白质的合成。翻译反应的温度按照目的蛋白质选择适合的翻译温度，理想的是约20～约30℃。而且，稀释溶液只要是添加了翻译反应所需要的能量源或氨基酸类等的适合于翻译反应的缓冲液即可，添加适当的容量以便该反应溶液中至少镁浓度要降低到翻译最佳浓度，最理想的是应降到约1mM～约6mM。通过添加稀释溶液可同时降低该反应溶液中含有的转录基质及转录副产物的浓度，从而使蛋白质合成反应的持续时间得到延长，并提高合成效率。

具体说来，例如：转录与翻译一体型稀释方式无细胞蛋白质合成方法，首先配制含有容量为48％的小麦胚芽提取液(浓度：200A_260nmunits/ml)、最终浓度如下的组成[1,000units/ml核糖核酸酶抑制剂(RNAsin)、30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、16mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、2.5mM腺苷三磷酸(ATP)、2.5mM鸟苷三磷酸(GTP)、2.5UTP、2.5mMCTP、1500units/ml的SP6RNA聚合酶、16mM磷酸肌酸、1.48mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)、25μg/ml的转录模板的DNA]所构成的反应溶液，并将该反应液在30℃进行3小时的转录反应。然后用稀释液稀释反应液。稀释溶液由30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、0.4mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.94mM的ATP、0.25mM的GTP、16mM磷酸肌酸、0.380mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)构成。通过这种稀释主要成分如下。即：麦胚芽提取液为原液的8％(原液浓度200A_260nmunits/ml)、30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、3mM醋酸镁、1.2mM ATP等。另外，由于GTP、UTP、CTP在转录反应中的消耗量不明，因此未计算它们稀释后的各浓度。

在上述转录和翻译一体型稀释方式的无细胞蛋白质合成方法中，作为翻译反应所必需的细胞提取物的麦胚芽提取物，因为最初阶段已经添加在反应溶液中，因此在转录反应中也存在该提取物。该提取物无需在最初阶段添加，而在mRNA合成后添加稀释溶液时，为了使最终浓度能达到适合于翻译反应的浓度，可以与稀释溶液同时或混合在稀释溶液中而添加到无细胞蛋白质合成系中。这种方法在这里被称作转录与翻译连续型稀释方式无细胞蛋白质合成法。

转录与翻译一体型或转录与翻译型连续型稀释式无细胞蛋白质合成法不含有繁杂的操作，因此简便，而且可直接使用由PCR法构建的转录模板，在无细胞体系中高效率地合成蛋白质。而且，如果将目的遗传基因产物以与组氨酸标记和谷胱苷肽S-转换酶溶合的蛋白质的形式合成，通过使用与其相对应的配位体的固化物，可以高效率地精制遗传基因产物。

例如：如图11所示，使用具有可在所有遗传基因上通用的上述本发明涉及的具有通用性的引物组(5′端的3种或3′端的1种)，通过转录与翻译一体型或转录与翻译连续型的稀释方式合成无细胞蛋白质法可一次性简便、高效率地合成多种蛋白质。

首先在反应容器中加cDNA。这时作为反应容器，使用市场销售的例如96穴槽浓度滴定盘等多穴槽浓度滴定盘，，在每个穴槽内分别加入对不同蛋白质进行编码的cDNA，可一次性合成多种蛋白质。如此在多穴槽浓度滴定盘的各个穴槽中加不同种的cDNA，可用作cDNA库。cDNA库也可使用市场销售的产品。对上述cDNA库添加上述引物组进行PCR。结果形成了转录模板。

然后在实施转录与翻译一体型稀释方式的蛋白质合成法时，在各容器中加入含RNA聚合酶、4NTPs、麦胚芽提取物等的无细胞蛋白质合成用反应溶液(例如：参考下述的实施例5)，将温度保持在约30℃～约45℃，更理想的是在约35℃～约40℃，进行所需时间的转录反应。然后添加稀释溶液，将镁浓度降低到翻译反应最佳浓度后，将温度保持在约20℃～约30℃进行翻译反应，其结果可得到作为翻译产物的蛋白质。

在转录模板制作结束后，实施转录与翻译连续式稀释方式的蛋白质合成法时，在各容器中加入含有RNA聚合酶、4NTPs的转录用溶液(例如：参照下述实施例4)将温度保持在约30℃～约45℃，更理想的是保持在约35℃～约40℃，进行所需时间的转录反应。然后添加含有麦胚芽抽出物的无细胞蛋白质合成用反应溶液(例如参照实施例4)，将温度保持在约20℃～约30℃进行翻译反应。

然后，如上所述在上述转录用溶液中经过所需时间的转录反应后，将翻译模板已经形成的转录反应后的溶液静静地叠层放置于预先添加有上述无细胞蛋白质合成用反应溶液的另一反应容器(例如，多穴槽浓度滴定盘)中，使得该转录反应后的溶液为下层，该无细胞蛋白质合成用反应溶液为上层，进行无细胞蛋白质合成反应。在这种方法中，在上层和下层之间形成的界面上，两层溶液中含有的物质发生扩散，逐渐将上层与下层相互混合。因此可缓缓地连续地进行翻译反应，可长时间地进行蛋白质的合成。

以上根据本发明，通过利用麦胚芽高效率无细胞蛋白质合成系，及本发明涉及的mRNA转录模板的构建方法，以及转录与翻译一体型稀释方式无细胞蛋白质合成方法或转录与翻译连续型无细胞蛋白质合成法，首次成功完成了迄今为止被视为困难的由PCR法进行简便、高效率的无细胞蛋白质的合成。另外，使用包括启动子的部位、翻译扩增结构以及ORF的一部分的、以往的单链引物而构建的无细胞蛋白质合成模板用DNA，则由于除目的遗传基因翻译产物以外还产生大量的低分子翻译产物，导致翻译效率低下，但是通过本发明可消除这一缺点。采用上述启动子序列分断型引物、由PCR法构建无细胞蛋白质合成用转录模板的原理，并不仅仅局限于使用麦胚芽提取物的无细胞蛋白质的合成系，也可作为使用大肠菌等其它细胞提取物的无细胞蛋白质的合成系中的模板设计原理。

若根据本发明，则无论是被哪种传病媒介克隆了的遗传基因，如果准备了具有与该基因互补的序列的5′端和3′端的固有引物，则通过使用可对所有基因通用的、具有通用性的上述各引物组，对被克隆了的任意基因都可简便、高效率地进行无细胞蛋白质的合成。因此本发明还在于提供了，随着基因组项目的结束而所带来作为庞大数量的遗传基因的功能解析与结构解析的基础的遗传基因产物(蛋白质)的生产所需要的基本的重要技术。

实施例

以下举出实施例和对照例更详细地说明本发明，但本发明并不仅限于下述的实施例。

实施例1

转录模板构建用引物的设计和高翻译模板活性的RNA的构建

(着眼于mRNA的3′端非翻译序列合成的转录模板构建法)

为了可得到对于增强翻译模板活性有效、且具有最短的3′端非翻译结构的高翻译效率的mRNA，使用PCR法构建了转录模板。

作为PCR中所用的模板是通过通常方法在pEU上克隆了水母的GFP遗传基因而得的，所述pEU如图1(a)所示，是作为麦胚芽无细胞蛋白质合成系用的质粒而研制的(WO01/27260号公报)。这种质粒的结构是，在5′端上游为SP6 RNA聚合酶的启动子序列，然后是作为翻译起始反应序列的烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列，然后连接GFP遗传基因，在3′端下游插入复制起始点(Ori)，然后在其下游插入作为标记遗传基因的抗氨苄青霉素遗传基因(Amp^r)[图1(a)]。

所使用的5′端引物是含有SP6启动子序列的引物(5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′)，3′端的引物为引物I、II或III(序列表的序列编号1)[图1(a)]，其序列如下。这些引物是委托AMASIRM FALMASIR公司制造的。

引物 I：5′GGGAAGATAAACAGTATTTT3′(mRNA1转录用)

引物 II：5′CCCTCGAGGCGTGGGCCCCA3′(mRNA2转录用)

引物III：5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA3′(mRNA3转录用)

使用上述整合有水母GFP遗传基因的pEU作为模板，使用上述引物在以下条件下进行了PCR。

PCR用反应溶液

1 ×ExTaq缓冲剂

200μM dNTP(脱氧核糖核苷3磷酸)

10nM 引物(5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA3′)

10nM 引物I、或II或III

0.025U ExTaq DNA聚合酶

50pg/μl 模板质粒DNA

PCR的反应条件

98℃下1分钟

↓

循环进行(98℃下10秒钟→60℃下30秒钟→72℃下5分钟)30次

↓

72℃下4分钟

↓

4℃

然后将上述得到的PCR产物作为转录模板，使用SP6RNA聚合酶并使用按下述配制的转录用溶液在37℃下反应2小时，作为转录产物，得到了mRNA。

转录用溶液(mRNA溶液)

	(μl)	最终浓度
	(μl)	最终浓度	PCR产物5×缓冲剂25mM NTPs111U/μl RNase抑制剂50U/μl SP6 RNA聚合酶离子交换水(Milli Q)	2.55310.7512.75	0.4μl/μl1×3mM4.4U/μl1.5U/μl
合计	25			2.55310.7512.75	0.4μl/μl1×3mM4.4U/μl1.5U/μl

另外，这里使用的5×缓冲剂的组成如下表所示。

5×缓冲剂 (1×的最终浓度)

400mM HEPES-KOH pH7.6 80mM

80mM醋酸镁 16mM

10mM精脒 2mM

50mM二硫苏糖醇 10mM

图1(b)中示出由上述设计构建的转录模板转录的具有不同碱基数的3′端非翻译序列mRNA分子的模式图。mRNA1是使用引物I构建的，mRNA2是使用引物II构建的，mRNA3是使用引物III(序列表的序列编号1)构建的。

图中的Cap是在mRNA的5′端上添加7mGpppG合成的带有Cap的GFPmRNA，因为是使用mRNA2用的引物II构建的，所以具有561碱基的3′端非翻译序列。而且，该图中Circular是以环状质粒为转录模板而构建的GFP mRNA。主要包括1900碱基和5900碱基构成的两种长链的3′端非翻译序列。这些序列根据WO01/27260号公报已经公布的方法制作，并分别作为对照实验用于无细胞蛋白质的合成反应。

使用上述构建的转录模板所得到的mRNA，在分批式麦胚芽无细胞蛋白质合成系中经3小时的翻译反应后，研究了其翻译反应活性。该翻译反应是根据Madin等人的方法[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]以及WO00/68412号公报中记述的方法实施的。而且蛋白质的合成以¹⁴C-亮氨酸的摄入为指标进行测定，纵轴的放射能读数表示采用等量的胚芽提取液量时所得的数值。其结果如图1(c)所示，由使用引物III(序列表的序列编号1)构建的模板转录的mRNA3(5′端为Ω序列，在3′端具有1896碱基的非翻译序列的GFPmRNA)具有高的翻译效率，其效率可与带有Cap的mRNA或由Circular质粒转录的具有长链的3′端非翻译序列的mRNA媲美。

麦胚芽无细胞蛋白质合成系中使用的、以便在mRNA上添加3′端非翻译序列的转录模板DNA碱基序列的构建中，将诸如引物III(序列表的序列编号1)的碱基序列那样的、可以与存在于克隆了遗传基因的传病媒介的抗氨苄青霉素遗传基因的转录终止子序列和Ori之间的碱基序列形成互补链的碱基序列作为引物来设计而使用的方法是有效的。

对照例1

转录模板构建用引物的设计与由PCR法构建的转录模板的结构

(采用以往方法的转录模板的构建法)

为了通过PCR法得到具有5′及3′端非翻译结构的mRNA转录模板，因而设计并构建了PCR中使用的引物。

作为mRNA的5′端非翻译结构，如已在WO01/27260号公报中公布的那样，将来源于苜蓿花叶病毒(AMV)的碱基序列、烟草花叶病毒(TMV)的Ω序列、由它们直接结合所得的AMV-Ω序列、以及剪短了Ω序列的29碱基Ω序列添加到mRNA中，对提高无细胞蛋白质合成反应的效率是极其有效的。在此选用这些5′端非翻译结构中的TMVΩ序列作为5′端非翻译序列。作为3′端非翻译序列使用了上述实施例1中示出的1896碱基构成的序列(参照图1)。

首先研究了使用作为转录模板的5′端序列构建法经常使用的3种引物的以往的PCR法(图2)。在图2(a)中，有关这里所尝试的PCR法的概况，示出了整合有对目的蛋白质编码的遗传基因的质粒的结构、5′端序列构建用的3种引物(引物1、2、3)与3′端序列构建用的引物III的模式图。将引物1、2、3的碱基序列表示如下。在引物3的碱基序列中X表示目的遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列。引物III与实施例1中使用的引物相同。这些引物是与实施例1相同的方法制作的。

引物1：5′GCATTTAGGTGACACTATAGAA 3′

引物2：5′GCATTTAGGTGACACTATAGAAGTATTTTTACAACAATTACCAA

CAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAAC

TACA ATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′

引物3：5′ACATTCTACAACTACA ATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′

作为转录模板构建用的模板，使用了在pUC19上整合有由cDNA库选出的遗传基因的质粒。在质粒中，分别以与实施例1相同的方法插入源自鼠肝脏的3种cDNA以及GFP遗传基因(翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)。使用上述引物并进行与实施例1相同的PCR法，将所得到的PCR产物作为转录模板，与实施例1相同的试验方法进行2小时的转录反应后得到了转录产物。

在图2(b)中表示以往PCR法得到的主要扩增产物与非特异地产生的短链DNA副产物，而在(c)中示出将该副产物以原状态作为转录模板合成的转录产物的模式图。在图2(c)中，(1)中表示的mRNA是全长的mRNA，可产生全长的翻译产物；(2)中示出的mRNA产生低分子翻译产物；(3中示出的mRNA由于缺少Ω序列，因此而没有翻译模板活性。如果从转录反应中涉及的生物化学特性考虑，那么可以预想，所合成的RNA分子大多数来源于DNA链长较短的PCR产物。

图3表示上述转录产物进行常规的琼脂糖电泳方法的结果。各组表示使用由分别整合有3种cDNA或GFP遗传基因(翻译产物的分子量为25kDa、18kDa、44kDa及27kDa)的模板质粒制作的转录模板所得到的转录产物，即mRNA。而且*表示全长的转录产物。从图3可知，ORF越大的遗传基因其转录效率越低，而且使用这种方法转录的大部分产物是低分子RNA，所以由PCR法非特异地产生的短链DNA分子种含有启动子序列。这种现象很好的与上述图2(b)及(c)的预测的结果吻合。

然后，从上述的各种转录产物中不分离目的尺寸的mRNA，通过在将转录产物脱盐后添加到麦胚芽无细胞蛋白质合成系中进行3小时反应，得到翻译产物，并按常规方法对其放射自显影图进行检测[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230][Madin K.et.al.(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]。翻译反应是根据上述[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]及WO00/68412号公报记述的方法实施。其结果示于图4。如图4中*所示，发现对应于不同的mRNA量的少量的翻译产物。在翻译产物中，转录产物量多的18kDa蛋白质(参照图3)的合成量虽高，但大半翻译产物是分离在图4箭头所示出的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的低分子领域的低分子。这表示：在低分子转录产物中，保持了作为5′端的翻译起始增强结构的Ω序列和ORF的5′端的一部分而缺少ORF的3′端部分的mRNA的含量高。由于这些mRNA片断具有与翻译起始因子很强的亲和性，因此作为目的蛋白质的强力的合成抑制剂发生作用，而成为明显降低合成收量的原因。

实施例2

高效率转录模板构建用引物的设计与采用PCR的高效率转录模板的构建

(着眼于RNA聚合酶启动子序列的转录模板构建法)

根据对照例1中示出的以往方法为基础的引物设计方法，如果在反应后不将目的尺寸的mRNA单独分离，将不能得到在通过PCR法构建无细胞蛋白质合成系中可使用的具有5′端非翻译序列的翻译活性高的mRNA转录模板时所用的有效引物。因此，充分灵活运用RNA聚合酶性质的原理，即：RNA聚合酶可识别由完整的碱基序列构成的启动子而不能识别由不完整的碱基序列构成的启动子的这一事实，设计、制造这种有效的引物，进而实施采用该引物的转录模板的构建方法(图5)。

在图5(a)中示出了，本试验中的PCR方法中使用的整合有对目的蛋白质进行编码的遗传基因的质粒的结构，5′端序列构建用的3种引物(引物①、②及③)和3′端序列构建用的引物III的模式图。以下示出各引物的碱基序列。这些引物使用与实施例1相同的方法制作。这里设计的引物①具有与从启动子的5′端开始至少含有一部分启动子功能部位的碱基序列互补的序列，但不具有与启动子的3′端的RNA聚合酶识别部位的至少一部分互补的碱基序列；引物②具有与从该启动子的3′端开始至少含有RNA聚合酶识别部位的一部分的碱基序列互补的碱基序列，但不具有与从该启动子的5′端开始至少启动子的功能部位互补的碱基序列。即引物①及②是启动子序列分断型的引物。引物③与上述引物3相同，引物III与实施例1中使用的引物相同。而且由于PCR分2阶段进行，作为3′端非翻译序列构建用引物，还合成并使用了引物IV(序列表的序列编号4)。引物IV是以上述引物III(序列表的序列编号1)的碱基序列为基础，在质粒中挪动3碱基而得到的，以下述碱基序列示出。而且在下述引物序列中，X表示整合在质粒中的遗传基因固有的ORF的5′端序列。

引物①：5′GCGTAGCATTTAGGTGACACT 3′

引物III：5′AGCGTCAGACCCCGTAGAAA 3′

引物IV：5′GTCAGACCCCGTAGAAAAGA 3′

引物③：5′ACATICTACAACTACA ATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3′

引物②：5′GGTGACACTATAGAAGTATITITACAACAATTACCAACAA

CAACAACAAACAACAACAACATTACATTITACATICTACAACT

ACA ATG3′

图5(b)示出了使用这种引物扩增的主要PCR产物的模式图。图5(b)中的(2)及(3)示出的DNA由于通过RNA聚合酶的识别的可能性极其低，所以预测出在事实上不能进行RNA合成。而且可以预见采用通过这种方法没计的引物所构建的转录模板将变成如图5(c)。

使用这些引物进行了转录模板的构建。首先，作为转录模板构建用的模板，使用了在pUC19中整合有由cDNA库中选择的遗传基因的与对照例1相同的质粒。使用上述引物通过二阶段的PCR法在下述条件下制作了转录模板。在PCR法中，作为聚合酶使用了宝公司制造的ExTaq DNA聚合酶。

第一阶段PCR用混合物(最终浓度)

1× ExTaq缓冲剂

200μM dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)

10nM 引物③

10nM 引物III

0.025U ExTaq DNA聚合酶

50pg/μl 模板质粒DNA

第二阶段PCR用混合物(最终浓度)

1× ExTaq缓冲剂

200μM dNTP

100nM 引物①

100nM 引物IV

1nM 引物②

0.025U ExTaq DNA聚合酶

0.05μl 第一阶段的PCR产物

PCR的反应条件

(第一阶段及第二阶段的PCR采用相同的条件实施。)

98℃下1分钟

↓

循环进行(98℃下10秒钟→60℃下30秒钟→72℃下5分钟)30次

↓

72℃下4分钟

↓

4℃

然后将上述得到的PCR产物作为转录模板，使用SP6RNA聚合酶使按下述配制的转录用溶液在37℃下反应2小时，得到作为转录产物的mRNA。

转录用溶液(mRNA溶液)

	(μl)	最终浓度
	(μl)	最终浓度	PCR产物5×缓冲剂25mM NTPs111U/μl RNase抑制剂50U/μl SP6 RNA聚合酶离子交换水(Milli Q)	105310.755.25	0.4μl/μl1×3mM4.4U/μl1.5U/μl
合计	25			105310.755.25	0.4μl/μl1×3mM4.4U/μl1.5U/μl

另外，表中使用的5×缓冲剂的组成与实施例1中使用的相同。

图6示出了采用琼脂糖凝胶电泳法对所得到的转录产物分析的结果。没有发现低分子转录产物的存在，而发现了合成了作为各遗传基因的转录产物而预见的具有电泳迁移率的RNA。

将这些mRNA标样进行脱盐，作为翻译模板添加在分批式麦胚芽无细胞蛋白质合成系中进行蛋白质合成。合成反应根据[Madin K.et.al.(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]以及WO00/68412号公报记述的方法实施。图7中示出在26℃下进行3小时蛋白质合成反应后的放射自显影图进行分析的结果。

若比较图4和图7，发现转录模板存在着明显的差别。即，使用本发明涉及的方法所设计及构建的转录模板与以往法构建的转录模板相比，未发现低分子翻译产物的合成，并对任意蛋白质均可进行高效率的合成。

另一方面，使用通过上述设计及构建的引物由PCR法得到的转录模板，按照WO00/68412号公报记述的透析膜的透析法进行24小时的无细胞蛋白质的合成。将各反应液的1μl通过SDS凝胶电泳，考马氏亮蓝将蛋白质染色，其结果示于图8。图中的*表示由各遗传基因合成的蛋白质带。由各染色带图案发现可高效率地合成任意一种蛋白质。通过测定带的染色强度可以发现每1ml反应溶液，其25kDa蛋白质的合成量为0.5mg、18kDa蛋白质的合成量为3.2mg、44kDa蛋白质的合成量为1.2mg、27kDa蛋白质的合成量为1.3mg。

实施例3

(使用由PCR法构建的转录模板的稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成法)

利用实施例2的透析膜的连续型无细胞蛋白质合成法，虽具有高效率，但操作十分繁杂。因此，作为更简便的方法，在含有低浓度胚芽提取液的无细胞蛋白质合成用反应溶液中实施了以往的分批式无细胞蛋白质合成反应。

在这种方法中，使用了在以往的分批方式无细胞蛋白质合成系中使用的组成的反应溶液[Madin K.et.al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，559-564]。首先作为反应溶液，应配制由含有容量的48％容量的麦胚芽提取液(200A_260nmunits/ml)的、具有下列最终组成的反应溶液：1000units/ml核糖核酸酶抑制剂(RNAsin)、30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、1.2mMATP、0.25mMGTP、16mM磷酸肌酸、0.380mM精脒以及20种L型氨基酸(各0.3mM)、600μg/ml的对GFP进行编码的mRNA。该mRNA为使用上述实施例2中记述的启动子序列分断型引物，用与实施例2记述的方法相同的方法由PCR法所得的转录模板所转录的mRNA，在5′端具有Ω序列而不具有CAP结构，担载着1896碱基的3′端非翻译序列。在26℃将上述反应溶液预保温(预培养)15分钟后，通过添加5倍量的稀释溶液[30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、2.65mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、1.2mMATP、0.25mM GTP、16mM磷酸肌酸、0.380mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)]，加以稀释(稀释方式)。

另外，在以氨基酸的摄入为指标测定蛋白质合成时，使用在稀释溶液中每1ml添加4μCi¹⁴C-亮氨酸的溶液。在稀释后再次在26℃下开始蛋白质的合成反应。将其结果示于图9(a)中。纵轴的放射能读数基于等量的麦芽提取液量。¹⁴C-亮氨酸进入蛋白质中也就是蛋白质合成反应，在以往的分批方式(●-●)中，在1个小时内停止反应；但在本发明涉及的稀释方式(○-○)中合成反应持续9小时。与以往的分批方式相比可合成约8倍量的蛋白质。而且将所得到的蛋白质的放射自显影图示于图9(b)中。图中左侧泳道表示分子量标记物，箭头是表示作为合成产物的GFP。在放射自显影图中也可以明确的是，在本发明所提供的稀释方式中合成反应可以持续9小时。另一方面，从其迁移率来看，合成产物是以全长的蛋白质的形式被合成并积蓄在反应溶液中。

这里所表示的稀释方式的无细胞蛋白质合成法不包括复杂的操作，使用在PCR中构建的转录模板，可高效率地合成无细胞蛋白质。

实施例4

使用由PCR法构建的转录模板的转录与翻译连续型稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成法)

实施例3中的稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成方法，具有高的翻译效率，但也存在着必须将其它途径转录的mRNA添加在无细胞蛋白质合成系中的这种操作的繁杂性。因此，实施了一种将以往转录系及翻译系和稀释方式组合的、新的转录及翻译连续型稀释方式无细胞蛋白质合成法。

首先配制了下述示出的转录反应用溶液。这里使用的PCR产物是，使用在上述实施例2中记述的启动子序列分断型引物以及对Amp^r与Ori间具有互补性的3′侧引物，通过与实施例2相同的方法构建的转录模板中，插入作为遗传基因的GFP而得的结构。在37℃下通过将该转录用溶液保温3小时后，合成了mRNA。

转录用溶液(mRNA溶液)

另一方面，通过仅改变上述转录用溶液的组成中的NTPs的最终浓度，调制成2.5mM或1.5mM，并分别进行转录反应。而且，这里使用的5×缓冲剂的组成与实施例1中使用的组成相同。

所得到的mRNA溶液由于镁离子、ATP、GTP浓度比翻译反应的最佳浓度高，所以仅仅通过添加无细胞蛋白质合成用麦胚芽提取液而不经过别的处理地继续进行的话在同一系内不能进行翻译反应。为此，在所得到的mRNA溶液25μl中添加了下述无细胞蛋白质合成用反应溶液。由此镁离子的浓度可稀释到翻译反应的最佳浓度，即达到3.19mM为止，可合成蛋白质。

反应溶液

	(μl)	最终浓度
	(μl)	最终浓度	麦胚芽提取物1000mM HEPES-KOH pH7.84000mM醋酸钾1000mM醋酸镁10mM精脒50mM二硫苏糖醇2.5mM氨基酸混合物100mM ATP20mM GTP500mM磷酸肌酸111U/μl Rnase抑制剂15μg/μl tRNA40μg/μl肌酸激酶100μCi/ml ¹⁴C-亮氨酸离子交换水(Milli Q)	1223.5011.516.61.304.8021.5375.8	8％30mM100mM3.19mM0.4mM2.5mM0.3mM1.2mM0.33mM16mM0.74U/μl0.2μg/μl0.4μg/μl4μCi/ml

而且通过该稀释操作，使抑制翻译反应的转录基质的残余成分核糖核苷三磷酸以及副产物的焦磷酸降低到1/6。在该稀释操作后，反应温度设定为翻译最佳温度26℃，持续保温。将其结果示于图10。

在图10(a)中，示出了由氨基酸的摄入测定出的GFP的合成结果。NTPs浓度在使用2.5mM(中□-□)或3mM(大□-□)的转录溶液时，显示出合成反应可持续9小时，与分批方式(●-●)相比，可合成约8倍量的蛋白质。该合成效率与实施例3中示出的mRNA添加型稀释方式无细胞蛋白质合成系(○-○)的程度相同。

另一方面，图10(b)中示出了所得到的蛋白质的放射自显影图。从该图也确认了在转录与翻译连续型稀释方式中，合成反应可持续9小时，并且由其电泳迁移率可以看出合成产物以全长蛋白质的形式被合成，并积蓄在反应液中。在转录反应中使用的核糖核苷酸浓度在2.5mM(中□-□)时，所合成的蛋白质量呈最大值。在SDS-凝胶电泳后，可得到考马氏亮蓝染色法染色的蛋白质图案，根据测定GFP染色带的强度得出，每1ml反应液的GFP的合成量为0.82mg。

如上所述，使用启动子序列分断型引物以及对Amp^r和Ori间具有互补性的3′引物，通过采用与实施例2相同的方法构建的转录模板，可实施转录与翻译连续型稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质的合成法，进而可高效率、简便地合成蛋白质。

实施例5

(使用由PCR法构建的转录模板的转录与翻译一体型稀释方式麦胚芽无细胞蛋白质合成法)

首先，配制含有容量的48％容量的小麦胚芽提取液(浓度：200A_260nmunits/ml)的、含有下述最终组成[1000units/mlRNA核糖核酸酶抑制剂(RNAsin)、30mM HEPFS-KOH(pH7.6)、95mM醋酸钾、16mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml肌酸激酶、2.5mMATP、2.5mMGTP、2.5mMUTP、2.5mMCTP、1500units/ml的SP6RNA聚合酶、16mM磷酸肌酸、1.48mM精脒、20种L型氨基酸(各0.3mM)、25μg/mlDNA]的反应溶液。这里所用的DNA是使用上述实施例2中记述的启动子序列分断型引物以及对Amp^r与Ori间具有互补性的3′端引物，并按实施例2记述的方法构建的转录模板，作为遗传基因整合有GFP。通过将上述反应溶液在30℃下培养3小时，转录了mRNA。

该合成溶液中的镁离子的浓度以及ATP与GTP的浓度显著高于翻译最佳浓度的浓度值，因此，虽可进行转录反应，但不能进行正常的蛋白质合成反应。为了使蛋白质合成反应开始，通过在mRNA合成后添加上述反应溶液5倍容量的稀释溶液[由30mM HEPES-KOH(pH7.6)，95mM醋酸钾、0.4mM醋酸镁、2.85mM二硫苏糖醇、0.94mMATP、0.25mMGTP、16mM磷酸肌酸、0.380mM精脒，20种L型氨基酸(各0.3mM)构成，在以氨基酸的摄入为指标测量蛋白质合成时，每1ml的本溶液中含有4μCi的¹⁴C-亮氨酸]，使镁离子的浓度直至降低到翻译反应的最佳浓度(3.19mM)。通过这种方法发现，可以进行与实施例4同等的蛋白质的合成。

转录与翻译一体型或转录与翻译连续型稀释方式无细胞蛋白质合成法不含有繁杂的操作，是极其简便的，另一方面，通过直接采用由PCR法构建的转录模板，蛋白质可在无细胞系进行高效率地合成。

工业利用性

根据本发明可设计及构建具有通用性、高翻译模板活性、且可简单构建的无细胞蛋白质合成用的转录模板，而且还确立了使用该转录模板的简便的无细胞蛋白质合成法。即确立了①保持高翻译模板活性的mRNA的设计；②以PCR技术为基础，从遗传基因出发构建用于转录高翻译效率的mRNA的具有通用性且可控制转录背景等的转录模板时使用的引物的设计；③采用已构建的无细胞蛋白质合成用转录模板的简便的无细胞蛋白质合成技术。

若根据本发明，对于被任意传病媒介克隆了的遗传基因，只要准备了具有与该遗传基因互补的序列的5′端与3′端的两种固有引物，则通过采用对全部遗传基因可通用的通用性的引物(5′端的3种与3′端的1种)，对于经克隆的任意的遗传基因均可简便高效率地合成无细胞蛋白质。这里所说明的发明成果，由于具有不需要如以往的连续型无细胞蛋白质合成方法那样复杂的装置和繁杂的操作等优点，所以可提供作为随着基因组项目的结束而带来的庞大数量的遗传基因的功能解析与结构解析的基础的遗传基因产物(蛋白质)的生产所需要的基本的重要技术。尤其作为面对多待测体用全自动无细胞蛋白质合成机械人的研制等无细胞蛋白质合成系统的自动化的重要技术尤为重要。因此，本发明在从包含结构生物化学与生物化学的基础生物学到对作为应用的医药研制及生产等的广大领域内将做出相当大的贡献。

序列表文字部分

序列表的序列编号1：为构建PCR用引物而设计的多核苷酸。

序列表的序列编号2：为构建PCR用引物而设计的多核苷酸。

序列表的序列编号3：为构建PCR用引物而设计的多核苷酸。

序列表的序列编号4：为构建PCR用引物而设计的多核苷酸。

序列表的序列编号5：为构建PCR用引物而根据烟草花叶病毒的Ω序列所设计的多核苷酸。

序列表

<110>远藤弥重太

和研药株式会社

<120>无细胞蛋白质合成用转录模板的设计、构建及

使用其的稀释分批式麦胚芽无细胞蛋白质的合成法。

<130>GP01-1016

<150>JP P2000-261638

<151>2000-08-30

<150>JP P2001-58404

<151>2001-03-02

<160>5

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列描述：为构建PCR用

引物而设计的多核苷酸。

<400>1

agcgtcagac cccgtagaaa 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列描述：为构建PCR用

引物而设计的多核苷酸。

<400>2

gcgtagcatt taggtgacac t 21

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列描述：为构建PCR用

引物而设计的多核苷酸。

<400>3

ggtgacacta tagaa 15

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>序列描述：为构建PCR用

引物而设计的多核苷酸。

<400>4

gtcagacccc gtagaaaaga 20

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为构建PCR用引物而根据烟草花叶病毒的Ω序列

所设计的多核苷酸。

<400>5

acattctaca actaca 16

Claims

1.3′端引物的碱基序列，该引物在由PCR法制作供无细胞蛋白质合成法中使用的、用以制作翻译模板分子的转录模板时使用，其特征在于，该碱基序列为在序列表的序列编号1中记述的碱基序列或与该序列互补的碱基序列。

2.5′端引物的碱基序列，该引物在由PCR法制作供无细胞蛋白质合成方法中使用的、用以制作翻译模板分子的转录模板时使用，其特征在于，该碱基序列为序列表的序列编号2或序列表的序列编号3中记述的碱基序列、或与这些碱基序列中的任意一种互补的碱基序列。

3.转录模板的构建方法，其特征在于：在由PCR法制作供无细胞蛋白质合成方法使用的、用以制作翻译模板分子的转录模板的方法中，作为该转录模板的5′端引物，使用由序列表的序列编号2中记述的碱基序列构成的多核苷酸、由通过在序列表的序列编号3中记述的碱基序列上连接源自烟草花叶病毒的Ω序列与作为翻译起始密码子的ATG而得的碱基序列构成的多核苷酸以及由通过在序列表的序列编号5中记述的碱基序列上连接作为翻译起始密码子的ATG、并在其后连接作为转录目的的遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列而得的碱基序列构成的多核苷酸；并使用含有编码目的蛋白质的DNA的DNA扩增模板。

4.在由PCR制造供无细胞蛋白质合成方法中使用的、用以构建翻译模板分子的转录模板时所需的引物组，其中，含有作为5′端引物的由序列表的序列编号2中记述的碱基序列构成的多核苷酸、由通过在序列表的序列编号3中记述的碱基序列上连接源自烟草花叶病毒的Ω序列与作为翻译起始密码子的ATG而得到的碱基序列构成的多核苷酸以及由通过在序列表的序列编号5中记述的碱基序列上连接作为翻译起始密码子的ATG并在其后连接作为转录目的遗传基因固有的ORF的5′端碱基序列而得到的碱基序列构成的多核苷酸。

5.转录模板，该模板是无细胞蛋白质合成方法中使用的高效率mRNA合成用的转录模板，其是通过权利要求3所述的构建方法制作而得的。

6.转录模板，该模板是无细胞蛋白质合成方法中使用的高效率mRNA合成用的转录模板，其是使用权利要求4中所述的引物组和含有编码目的蛋白质的DNA的DNA扩增模板并通过PCR进行合成的。

7.无细胞蛋白质合成方法，其中，将由权利要求3中所述的构建方法制作的转录模板或者由权利要求5或6中所述的转录模板转录的mRNA作为翻译模板使用。

8.根据权利要求7所述的无细胞蛋白质的合成方法，其中，在合成mRNA后通过凝胶过滤进行精制。

9.转录与翻译连续型稀释方式的无细胞蛋白质合成法，其特征在于：由权利要求3所述的构建方法制作转录模板，通过转录溶液在30℃～45℃下进行转录反应后，添加无细胞蛋白质合成用的反应溶液，使得添加后的反应溶液中镁离子浓度降低到1mM～6mM，在20℃～30℃下进行翻译反应。

10.转录与翻译一体型稀释方式的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：由权利要求3所述的构建方法制作转录模板，通过无细胞蛋白质合成用反应溶液在30℃～45℃下进行转录反应后，添加稀释溶液稀释，将该反应溶液中镁离子浓度降低到1mM～6mM，在20℃～30℃下进行翻译反应。

11.根据权利要求9所述的转录与翻译连续型稀释方式的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：使用编码目的蛋白质的cDNA制作转录模板，并且，所述转录溶液为含有RNA聚合酶与4种核苷三磷酸的转录用溶液。

12.根据权利要求10所述的转录与翻译一体型稀释方式的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：使用编码目的蛋白质的cDNA制作转录模板，并且，所述转录溶液为含有RNA聚合酶与4种核苷三磷酸的转录用溶液。

13.根据权利要求7-12中任一项所述的无细胞蛋白质的合成方法，其特征在于：使用麦胚芽提取物。