CN1252440A

CN1252440A - 用于提高除虫菌素产量的阿维链霉菌调节基因

Info

Publication number: CN1252440A
Application number: CN99123897A
Authority: CN
Inventors: K·J·斯图兹曼-恩格瓦尔; B·S·普里斯
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc; Pfizer Inc
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2000-05-10
Also published as: US6197591B1; AR021485A1; BR9904109A; CA2281935A1; HUP9903073A2; JP2000102394A; EP0997528A1; JP3595210B2; TR199902239A2; ID23542A; IL131845A0; AU758329B2; RU2221042C2; ZA995872B; HUP9903073A3; KR20000023111A; US6689611B1; KR100343357B1; PL335438A1; HU9903073D0

Abstract

本发明涉及生产除虫菌素的组分和方法,主要是应用于动物健康领域。本发明涉及两个新基因的鉴定和分析,此处称为aveR1和aveR2基因,它们在阿维链霉菌中参与调节除虫菌素聚酮化合物合酶(PKS)的表达和除虫菌素的生物合成。本发明是基于这些基因的失活导致阿维链霉菌产生除虫菌素的量增加这一发现。

Description

用于提高除虫菌素产量的阿维链霉菌调节基因

本发明涉及生产除虫菌素(avermectin)的组分和方法，且主要用于动物健康领域。更为特别地是，本发明涉及到两个新基因的鉴定与特性描述，本文中两个新基因被称为aveR1和aveR2基因，其在阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)中与调节除虫菌素聚酮化合物合酶(PKS)的表达及除虫菌素的生物合成有关。本发明是建立在发现此些基因的失活导致阿维链霉菌产生的除虫菌素产量增加的基础之上。

链霉菌种产生各种各样的次级代谢产物，包括除虫菌素，其包括八个相关的一系列有驱虫和杀虫活性的十六元大环内酯。八个不同但紧密相关的化合物为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b。“a”系列化合物指的是天然除虫菌素，其在C25位置的取代基为(s)-仲丁基，“b”系列化合物指的是除虫菌素其在C25位置的取代基为异丙基。“A” 和“B”是指除虫菌素其在C5的取代基分别为甲氧基和羟基。数字“1”指的是除虫菌素其双键位于C22、C23位置，数字“2”指的是除虫菌素其有一个氢位于C22位置与有一个羟基位于C23位置。在相关的除虫菌素中，B1型的除虫菌素被认为具有最有效的抗寄生虫和杀虫活性，因此是最具有商业价值的除虫菌素。

除虫菌素及其通过阿维链霉菌的有氧发酵获得的产品在US 4 310 519和US 4429 042中有所描述。

象许多与次级代谢及其它链霉菌属抗生素的生产有关的基因一样，人们发现除虫菌素(ave)基因和细菌的染色体簇集在一起。用于除虫菌素生物合成的ave基因簇跨越DNA的一个95kb的基因组片段，其包括编码除虫菌素聚酮化合物合酶(PKS)的DNA(MacNeil等，1992，基因115：119-125)。

链霉菌中抗生素生物合成的调节可能以天蓝色链霉菌(链霉菌coelicolor)的最为典型。天蓝色链霉菌产生的四种抗生素包括放线菌紫素(Act)、十一烷基灵菌红素(Red)、钙依赖性抗生素(CDA)和次甲霉素(Mmy)。每一种这样的抗生素都为一个不同的特殊基因簇所编码。基因已被鉴定是与Act基因簇或Red基因簇连接在一起，这些基因簇编码的产物分别特异地调节Act生物合成基因簇和Red生物合成基因簇的表达。许多含有全局地调节多个抗生素生物合成基因簇的基因的部位已被鉴定。例如，两个独立部位的突变，absA和absB，已显示出阻断了天蓝色链霉菌的所有四种抗生素的合成(Brian等，1996，J.Bact.178：3221-3231)。AbsA基因座已被克隆和鉴定，且其基因产物显示出和一般作为天蓝色链霉菌抗生素生物合成的全局负性调节的信号传导途径有关(Brian等，1996，同上)。

Denoya的美国专利5707839及Denoya等人的美国专利5728561涉及链霉菌的编码支链α-酮酸脱氢酶组合物的DNA序列及提高新除虫菌素产量的方法。

通过对阿维链霉菌的I型聚酮化合物合酶表达的调节机理的理解，利用遗传操作来提高除虫菌素的产量将成为可能。

本发明提供了一个含有编码来自阿维链霉菌aveR1基因产物的核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子。在一个优选的实施方案中，aveR1基因产物含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有阿维链霉菌的aveR1 ORF的核苷酸序列，其序列显示于SEQ ID NO：1大约从nt1112到nt2317。在另一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有显示于SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其同源于含有阿维链霉菌aveR1 ORF核苷酸序列的多聚核苷酸分子，此核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1中从大约nt1112到nt2317。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其含有编码同源于SEQ IDNO：2氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其含有一段核苷酸序列，此核苷酸序列是本发明的前面所述aveR1相关的任一多聚核苷酸分子的重要部分。在一优选的实施方案中，aveR1相关的多聚核苷酸分子的重要部分由编码本发明阿维链霉菌aveR1基因产物或aveR1相关的同源多肽的一个肽片段的核苷酸序列组成。在一个特定但非限制的实施方案中，本发明提供了一个多聚核苷酸分子，其由一个编码含有SEQ ID NO：2氨基酸序列亚序列肽片段的核苷酸序列构成。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其包含一个或多个原位自然侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF的核苷酸序列。这些侧翼序列可选自SEQ ID NO：1从大约nt1到nt1111和从大约nt2318到nt5045。本发明进一步提供了一种包含一个或多个核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子，其中核苷酸序列同源于原位自然侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF的核苷酸序列。本发明分离多聚核苷酸分子的每一个侧翼序列或其同系物最好长度至少大约为200nt。在一个非限制的实施方案中，本发明提供了一种分离多聚核苷酸分子其包含前面所述的一个或多个原位自然侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF的核苷酸序列或此核苷酸序列的同源序列，且进一步含有本发明前面所述aveR1相关核苷酸序列，例如阿维链霉菌aveR1 ORF的显示于SEQ ID NO：1大约nt1112到nt2317的核苷酸序列或其重要部分。

本发明进一步提供了一种包含编码来自阿维链霉菌aveR2基因产物的核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子。在一个优选的实施方案中，aveR2基因产物含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子包含阿维链霉菌aveR2 ORF的显示于SEQ ID NO：3大约nt2314到nt3021的核苷酸序列(注：SEQ ID NO：3同等于：SEQ ID NO：1)。在另外一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其同源于含有阿维链霉菌aveR2 ORF的显示于SEQ ID NO：3从大约nt2314到nt3021的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其含有编码同源于SEQ IDNO：4的氨基酸序列的多聚核苷酸分子。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其由一段核苷酸序列构成，此核苷酸序列是本发明的前面所述aveR2相关的任一多聚核苷酸分子的重要部分。在一优选的实施方案中，aveR2相关的多聚核苷酸分子的重要部分由编码本发明阿维链霉菌aveR2基因产物或aveR2相关同源多肽的一个肽片段的核苷酸序列组成。在一个具体但非限制的实施方案中，本发明提供了一个多聚核苷酸分子，其由一个编码含有SEQ ID NO：4氨基酸序列亚序列肽片段的核苷酸序列构成。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其包含一段或多个原位自然侧接于阿维链霉菌aveR2 ORF的核苷酸序列。这些侧翼序列可选自核苷酸序列SEQID NO：3从大约nt1到nt2313和从大约nt3022到nt5045。本发明进一步提供了一种含有一个或多个核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子，其中的核苷酸序列同源于原位自然侧接于阿维链霉菌aveR2 ORF的核苷酸序列。本发明分离多聚核苷酸分子的每一个侧翼序列最好长度至少大约为200nt。在一个非限制的实施方案中，本发明提供了一种分离多聚核苷酸分子其包含前面所述的一段或多个原位自然侧接于阿维链霉菌aveR2 ORF的核苷酸序列或此核苷酸序列的同系物，且进一步含有本发明前面所述aveR2相关核苷酸序列，例如阿维链霉菌aveR1 ORF的显示于SEQ ID NO：3大约nt2314到nt3021的核苷酸序列或其重要部分。

本发明进一步提供了一种包含编码来自阿维链霉菌aveR1和aveR2基因产物的核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子。在一个优选的实施方案中，aveR1和aveR2基因产物分别有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子包含阿维链霉菌aveR1 ORF的显示于SEQ ID NO：1大约nt1112到nt2317的核苷酸序列和aveR2 ORF的显示于SEQ ID NO：3大约nt2314到nt3021的核苷酸序列。在另外一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有SEQ ID NO：1大约nt1112到nt3021的核苷酸序列。在另外一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其同源于含有阿维链霉菌aveR1和aveR2 ORF两个核苷酸序列的多聚核苷酸分子。在一个非限制的实施方案中，本发明提供的分离多聚核苷酸分子其同源于由阿维链霉菌aveR1 ORF显示于SEQ ID NO：1大约nt1112到nt2317的核苷酸序列和aveR2 ORF显示于SEQID NO：3大约nt2314到nt3021的核苷酸序列构成的多聚核苷酸分子。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子，其含有一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码一个同源于SEQ ID NO：2氨基酸序列的第一多肽和一个同源于SEQ ID NO：4氨基酸序列的第二多肽。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子，其核苷酸序列是本发明的前面所述任一含有编码来自阿维链霉菌的aveR1和aveR2基因产物的或如上所述任一同源的多聚核苷酸分子的重要部分。在一个特定但非限制的实施方案中，多聚核苷酸分子的重要部分由aveR1 ORF的显示于SEQ ID NO：1大约nt1112到nt2317的核苷酸序列构成。在另一个特定但非限制的实施方案中，多聚核苷酸分子的重要部分由aveR2 ORF的显示于SEQ ID NO：3大约nt2314到nt3021的核苷酸序列构成。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子其包含一个或多个原位自然侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF和aveR2 ORF的核苷酸序列。这些侧翼序列可选自SEQ ID NO：1从大约nt1到nt1111和从大约nt3022到nt5045。本发明进一步提供了一种包含一个或多个核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子，其中的核苷酸序列同源于原位自然侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF和aveR2 ORF的核苷酸序列。本发明分离多聚核苷酸分子的每一个侧翼序列及其同系物最好长度至少大约为200nt。在一个非限制的实施方案中，本发明提供了一种分离多聚核苷酸分子其含有前面所述的一个或多个原位自然侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF和aveR2ORF的核苷酸序列或此核苷酸序列的同源序列，且进一步含有本发明前面所述编码来自阿维链霉菌aveR1和aveR2基因产物的核苷酸序列，例如，阿维链霉菌aveR1 ORF的显示于SEQ ID NO：1大约nt1112到nt2317的核苷酸序列与阿维链霉菌aveR2 ORF的显示于SEQ ID NO：1大约nt2314到nt3021的核苷酸序列及其重要部分。

本发明进一步提供了寡核苷酸分子用作引物以扩增上述本发明的任一多聚核苷酸分子或其一部分，或者可被用于编码或作为反义分子来调节ave基因表达和除虫菌素的生产。

本发明进一步提供了克隆和表达本发明的任一多聚核苷酸分子或寡核苷酸分子的组分与方法，包括克隆载体，表达载体，转化含有任一所述载体的宿主细胞和新菌株或其衍生的细胞系。在一个非限制的实施方案中，本发明提供了一个含有本发明多聚核苷酸分子的重组表达载体，该多聚核苷酸分子已操纵连接多聚核苷酸分子表达所必要的一个或多个调节元件。在一个特定但非限制的实施方案中，本发明提供了质粒pSE201(ATCC203182)，其含有阿维链霉菌aveR1基因和aveR2基因的完整ORFs。其它的质粒在下面描述。

本发明进一步提供了本发明多聚核苷酸分子编码的基本上纯化或分离的多肽。在一个特定但非限制的实施方案中，此多肽是一个含有SEQ ID NO： 2氨基酸序列的aveR1基因产物。在另一个特定但非限制的实施方案中，此多肽是一个aveR2基因产物其含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。本发明进一步提供的同源于本发明aveR1基因或aveR2基因产物的基本上已纯化分离的多肽。本发明进一步提供基本上已纯化或分离的同源于aveR1或aveR2基因产物或者本发明的同源性多肽的肽片段。

本发明进一步提供了一种制备本发明的基本上纯化或分离的aveR1基因产物、aveR2基因产物、同源多肽或肽片段的方法，其包括在有助于特定的编码基因产物、多肽或肽片段表达的条件下培养用本发明的重组表达载体转化或转染的宿主细胞，并从细胞培养物中回收表达的基因产物、多肽或肽片段。

本发明进一步提供了用于链霉菌种或菌株细胞的遗传修饰的组分与方法，包括遗传构建体例如基因置换型载体。如本发明提供的，遗传修饰链霉菌种或菌株的细胞产生除虫菌素的量经检测不同于没有经过遗传修饰链霉菌种或菌株的细胞产生除虫菌素的量。在一个优选的实施方案中，链霉菌种或菌株的细胞经遗传修饰的除虫菌素的产量与未经遗传修饰链霉菌种或菌株的除虫菌素的产量比较产生了可检测的除虫菌素增加的量。在另一个优选的实施方案中，链霉菌为阿维链霉菌。根据本发明，这些遗传修饰优选包括aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因的突变，与未进行基因突变的同株细胞相比这些突变导致在aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因发生突变的阿维链霉菌菌株的细胞中可检测到除虫菌素产量的增加。aveR1基因或aveR2基因或aveR1基因与aveR2基因的突变可以通过使用常规诱变技术进行，包括暴露于化学诱变剂或照射，或通过本发明提供的遗传构建体例如一个基因置换型载体，通过例如增加、删除或替换核苷酸使aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因变异，或通过引入移动框架，或通过插入一个不同或异源的核苷酸序列到aveR1基因或aveR2基因中，或通过删除aveR1基因或aveR2基因的部分或全部，或通过用不同或异源的核苷酸序列替换aveR1基因或aveR2基因或aveR1基因与aveR2基因的部分或全部，或通过这些突变的组合。本发明进一步提供了链霉菌种或菌株细胞中的aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因的突变的鉴定方法，其突变为携带突变的阿维链霉菌菌株细胞与未携带突变的阿维链霉菌菌株细胞相比可检测到除虫菌素产量的增加，该方法包括：(a)测定链霉菌特定种或菌株细胞的除虫菌素的产量；(b)在此种或菌株细胞的aveR1基因或aveR2基因或aveR1及aveR2两基因中引入一个突变；和(c)比较步骤(b)中的携带基因突变细胞的除虫菌素的产量与步骤(a)未携带突变细胞的除虫菌素的产量；这样如果步骤(b)的携带基因突变细胞的除虫菌素的产量高于步骤(a)未携带突变细胞的除虫菌素的产量，那么aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因的突变带来的除虫菌素产量的可检测增加的能力则得到了证实。在一个优选的实施方案中，链霉菌的菌种为阿维链霉菌。

本发明进一步提供了从链霉菌的特定种或菌株制备遗传修饰细胞的方法，此遗传修饰细胞与未修饰细胞相比较产生了除虫菌素的可检测的增加量，其方法包括在链霉菌的种或菌株细胞中诱变aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因，选择与未携带基因突变的链霉菌的相同种或菌株的细胞相比结果产生了除虫菌素的可检测的增加量的那些细胞。在一个优选的实施方案中，链霉菌的菌种为阿维链霉菌。在如下6.9.1部分描述的一个特定但非限制的实施方案中，用异源基因替代每一个基因的ORF部分使阿维链霉菌的aveR1与aveR2两基因产生突变，导致阿维链霉菌细胞与aveR1和aveR2基因未产生突变的链霉菌相同菌株的细胞相比产生了除虫菌素的可检测的增加量。在如下6.9.2部分描述的一个特定但非限制的实施方案中，通过插入一个异源基因到aveR2 ORF中使阿维链霉菌的aveR2基因产生突变，导致阿维链霉菌细胞与aveR2基因未产生突变的阿维链霉菌相同菌株的细胞相比产生了除虫菌素的可检测的增加量。

本发明进一步提供了链霉菌的新菌株，作为aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因的突变的结果新菌株的细胞与未携带突变的链霉菌相同菌株细胞相比产生除虫菌素的可检测的增加量。在一个优选的实施方案中，链霉菌菌株来自阿维链霉菌。本发明的新菌株在除虫菌素的大规模生产上是非常有用的，如有商用价值的doramectin。

本发明进一步提供了通过链霉菌的培养增加除虫菌素产量的工艺，其包括在培养基中容许或诱导其中的除虫菌素产生的条件下培养链霉菌的特定种或菌株的含有aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因突变的细胞，基因突变导致了链霉菌细胞与该链霉菌种或菌株的未产生基因突变的细胞相比产生了除虫菌素的可检测的增加量，且从培养基中回收除虫菌素。在一个优选的实施方案中，链霉菌的菌种为阿维链霉菌。此工艺对于增加除虫菌素的产率是很有用的。

本发明进一步提供了直接抗本发明的aveR1基因产物、aveR2基因产物、同源多肽或肽片段的抗体。

附图1.A.天蓝色链霉菌组氨酸激酶同系物(absA1)编码的与阿维链霉菌aveR1基因编码的演绎氨基酸序列比较显示32％的序列一致性。B.天蓝链霉菌响应调节物同系物(absA2)编码的与阿维链霉菌aveR2基因编码的演绎氨基酸序列比较显示45％的序列一致性。粗体铅字为高度保守的氨基酸。

附图2.A.含有aveR1和aveR2 ORFs的质粒载体pSE201(ATCC 203182)。B.含有aveR1和aveR2 ORFs的质粒载体pSE210。

附图3.A.基因置换型载体pSE214其含有替换aveR1和aveR2 ORFs的一部分的ermE基因.B.基因置换型载体pSE216含有插入到aveR2 ORFs中的ermE基因。

附图4.A.阿维链霉菌带有五个重叠粘粒克隆标志的除虫菌素聚酮化合物合酶基因簇的BamH1限制性图谱(例如：pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，pSE69)。

本发明涉及到多聚核苷酸分子的鉴定和特征描述，该核苷酸含有编码来源于阿维链霉菌的aveR1和aveR2基因产物的核苷酸序列，并且本发明发现了这些基因的突变能够调节除虫菌素的产量。通过实施例的方式，本发明在下面部分描述了含有aveR1 ORF的核苷酸序列的多聚核苷酸分子，此aveR1 ORF的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1从nt1112到nt2317或存在于质粒pSE201(ATCC203182)中，本发明还描述了含有aveR2 ORF的核苷酸序列的多聚核苷酸分子，此aveR2ORF的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：3(注：SEQ ID NO：3同等SEQ ID NO：1)从nt2314到nt3021或存在于质粒pSE201(ATCC203182)中，另外描述了含有由上述核苷酸衍生的突变序列的多聚核苷酸分子。此处提及的显示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的核苷酸分子及其重要部分，除非另有所述，其分别指提及的存在于质粒pSE201(ATCC 203182)的相应的核苷酸序列及其重要部分。此外，这里提及的显示于SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列及其肽片段，除非另有所述，其分别指相应的存在于质粒pSE201(ATCC203182)中的aveR1-和aveR2-编码核苷酸序列所编码的相关氨基酸序列及其肽片段。

5.1多聚核苷酸分子

这里所提及的术语“多聚核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框架(ORF)”及其类似的术语，是指所提及的DNA和RNA分子，其可以为单链或双链。编码序列或ORF包括但不限于原核序列、cDNA序列、基因组DNA序列以及化学合成的DNA和RNA序列。

本领域技术人员通过如下描述的相关重组技术可进行此处公开的多聚核苷酸分子与寡核苷酸分子的生产和操作，Maniatis等1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，Greene PublishingAssociate & Wiliey interscence，纽约；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；Innis等，(eds)，1995，PCR策略，学院出版社，San Diego；Erlich(ed)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，纽约；和Hopwood等，1985，链霉菌基因操作，实验室手册，John InnesFoundation，Norwish，U.K.，上面所引的所有出版物列于此处作为参考。

5.1.1 aveR1相关的多聚核苷酸分子

本发明提供了一个编码含有来源于阿维链霉菌的aveR1基因产物的核苷酸序列的多核苷酸序列分子。在一个优选的实施方案中，aveR1基因产物含有SEQ IDNO：2的氨基酸序列。在一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有阿维链霉菌aveR1 ORF显示于SEQ ID NO：1从nt1112到nt2317的核苷酸序列。在另一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有SEQ IDNO：1的核苷酸序列。

本发明进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其核苷酸序列同源于含有阿维链霉菌aveR1 ORF显示于SEQ ID NO：1从nt1112到nt2317的核苷酸序列。术语“同源”在这里指含下列核苷酸序列的多聚核苷酸分子：(a)编码SEQ ID NO：1从nt1112到nt2317的相同多肽，但包括一个或多个与遗传密码的简并性相符的核苷酸序列的沉默变化；或(b)在中等严格条件下与编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸分子补体杂交，即在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与结合在滤膜上的DNA杂交，且42℃0.2×SSC/0.1％ SDS洗涤(见Ausubel等编，1989，当代分子生物学实用程序，Vol.1，格林联合出版公司，和John Wiliey &Sons，Inc.，纽约，在2.10.3位置)，对于本发明的实施是很有用的。在一个优选的实施方案中，在高度严格条件下，同源性多聚核苷酸分子与含有编码由SEQ ID NO：2氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸的补体杂交，既在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与结合在滤膜上的DNA杂交，且68℃0.1×SSC/0.1％ SDS洗涤(见Ausubel等，1989，同上)，对于本发明的实施是很有用的。在一个更为优选的实施方案中，在高度严格条件下，同源性多聚核苷酸分子与含有编码由SEQ ID NO：从nt1112到nt2317的核苷酸序列的多核苷酸分子的补体杂交，对于本发明的实施是很有用的。

这里所用的aveR1相关的多聚核苷酸分子是指“对实现本发明有用的”，其中的多聚核苷酸分子可被用于通过位点定点突变例如通过同源重组引入突变至阿维链霉菌的aveR1 ORF中，或使用常规放大技术扩增含有阿维链霉菌的aveR1ORF的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。此同源性多聚核苷酸分子可包括自然产生的存在于链霉菌除了天蓝色链霉菌外的其他种中或存在于阿维链霉菌其它菌株中的aveR1基因，也包括无论自然产生、化学合成或基因工程的突变aveR1等位基因。

本发明进一步提供一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个编码和SEQ ID NO：2氨基酸序列同源的多肽的核苷酸序列。这里所提及的多肽含有和来源于阿维链霉菌aveR1基因产物同源的氨基酸序列，术语“同源”指一个有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但是其中的一个或多个氨基酸残基被一个不同的氨基酸残基保守性取代，由此得到的多肽对于本发明的实施是有用的。保守的氨基酸取代在本技术领域是公知，这种取代的规则包括Dayhof，M.D.，1978，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.，Vol.5，Sup.3，及其它文献所述。具体而言，保守性氨基酸取代通常为发生在一族酸度、极性或侧链体积相关的氨基酸之间的取代。基因编码的氨基酸一般分为四组：(1)酸性的天门冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性的赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，和(4)不带电荷的甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也被共同地归类为芳香氨基酸。一个或多个任意特殊基团取代，例如：用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸或用丝氨酸取代苏氨酸，或其它一些氨基酸用结构相关的氨基酸残基取代，例如：氨基酸用酸度、极性、体积或这些性质组合起来相似的氨基酸取代通常在多肽的功能上有不太重要的影响。

此处所用的aveR1相关的多肽“对于本发明的实施是有用的”，其中的多肽可用于增加抗来自阿维链霉菌的aveR1基因产物的抗体，或用于筛选调节aveR1活性的化合物或链霉菌的除虫菌素产量。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子，其含有的一个核苷酸序列即本发明如上所述的任一aveR1相关核苷酸分子的重要部分。此处所用的aveR1相关核苷酸分子的“重要部分”是指一个由小于阿维链霉菌aveR1基因产物或aveR1相关的同源性多肽的完全编码序列构成的多聚核苷酸分子，但是其含有上述核苷酸序列的至少20％，更优选的是至少30％，并且如上述限定的aveR1相关的多聚核苷酸分子的用途一样，其对于本发明的实施是有用的。

在一个非限制性的实施方案中，aveR1相关的多聚核苷酸分子的重要部分由一段核苷酸序列构成，此核苷酸序列编码本发明的阿维链霉菌aveR1基因产物或aveR1相关同源性多肽的肽片段。aveR1相关多肽的“肽片段”是指由全序列aveR1基因产物或同源性多肽的氨基酸序列的亚序列构成的多肽，其中的亚序列短于aveR1基因产物或同源多肽的全序列，并且如上述限定的aveR1相关多肽的用途一样，亚序列对于本发明的实施是很有用的。在一个优选的实施方案中，本发明进一步提供了一个多聚核苷酸分子其由编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的亚序列肽片段的核苷酸序列构成。本发明的肽片段在长度上最好至少15个氨基酸残基。

这里公开的aveR1相关多聚核苷酸分子可用于aveR1基因产物的表达，aveR1基因突变的新链霉菌菌株的制备，和使用已知的技术在其它的细菌菌种与菌株中鉴定aveR1同系物基因。因此，本发明进一步提供了一个含有一段编码aveR1同系物基因产物的核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子。此处所用的aveR1同系物基因产物被限定为aveR1同系物基因编码的基因产物，其中的aveR1同系物基因依次指来源于链霉菌的不同种或紧密相关的糖多孢菌属的基因，且本领域技术人员根据其与阿维链霉菌aveR1基因的核苷酸序列的同源性大于约80％来识别，或根据通常发现于二组分信号系统的组氨酸激酶成分中含有保守性位点残基来识别。例如，用Nar/Deg亚组真细菌二组份系统进行aveR1同源性比较显示出组氨酸(H)残基100％的保守性，组氨酸(H)残基是自动磷酸化位点，且天冬氨酸(N)残基需有自激酶活性。

鉴定含有aveR1同系物基因的多核苷酸克隆的方法是本领域公知的。例如：含有阿维链霉菌aveR1 ORF的部分的多核苷酸分子可被标记检测和用于筛选由目的微生物获得的DNA构建的基因文库。可依据参比微生物与目的微生物的关系来选择杂交条件的严格性，此实施例中的参比微生物为阿维链霉菌。不同严格条件的要求对于本领域技术人员来说是公知的，这些条件依据文库和标记序列源自的特定微生物有可预知的变化。基因组DNA文库可通过使用下述技术筛选aveR1同系物基因编码序列，在Benton和Dvis，1977，科学，196：180上用于细菌噬菌体文库，Grunstein和Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，72：3961-3965，用于质粒文库，这些文献在此均引作参考。含有已知的显示于SEQ ID NO：1的aveR1 ORF的核苷酸序列的多聚核苷酸分子，或其寡核苷酸分子的特征部分，可在这些筛选实施例中作为探针。此外，可合成寡核苷酸探针，其对应于从纯化的aveR1基因产物的氨基酸序列推导出的核苷酸序列。

鉴定含有aveR1同系物基因编码序列的克隆可用作适当的生物功能的检测。例如：可对克隆进行序列分析以鉴别合适的阅读框架和初始及终止信号。克隆的DNA序列可被插入到相应的表达载体中，其载体然后被转入阿维链霉菌的细胞中产生aveR1^-来用于补体的检测。转化的阿维链霉菌宿主细胞通过例如发酵产物的HPLC分析的方法用于除虫菌素产品的分析，其方法描述在下面的6.6部分。

本发明进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个或多个自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF的核苷酸序列。这样的侧接序列可选自SEQ IDNO：1中nt1到nt1111以及从大约nt2318到nt5045的核苷酸序列。本发明还进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个或多个核苷酸序列同源于自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF的核苷酸序列。此处所用的核苷酸序列与原位自然侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF的核苷酸序列同源，该同源核苷酸序列在温和的严格条件下杂交于自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF的核苷酸序列的补体，即在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与接合在滤膜上的DNA杂交，且42℃0.2×SSC/0.1％ SDS洗涤(见Ausubel等，1989，同上)，并且如同上述所定义的aveR1相关多聚核苷酸分子的用途一样，该同源核苷酸序列对于本发明的实施是很有用的。本发明分离核苷酸分子的旁侧序列或同源序列其长度最好至少200nt。在非限制的实施方案中，本发明提供了一个分离多聚核苷酸分子其含有一个或多个上述核苷酸序列，该核苷酸序列自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF或同源于这样的核苷酸序列，并且分离多聚核苷酸分子进一步含有本发明上面提及的aveR1相关核苷酸序列，例如：显示于SEQ ID NO：1从大约nt1112到nt2317的阿维链霉菌aveR1 ORF或其重要部分的核苷酸序列。

5.1.2 aveR2相关的多聚核苷酸分子

本发明提供了一个编码含有来源于阿维链霉菌的aveR2基因产物的核苷酸序列的分离多核苷酸分子。在一个优选的实施方案中，aveR2基因产物含有SEQ IDNO：4的氨基酸序列。在一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有阿维链霉菌aveR2 ORF显示于SEQ ID NO：3从nt2314到nt3021的核苷酸序列。在另一个非限制的实施方案中，本发明的分离多聚核苷酸分子含有SEQ IDNO：3的核苷酸序列。

本发明进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其核苷酸序列同源于含有阿维链霉菌aveR2 ORF显示于SEQ ID NO：3从nt2314到nt3021的核苷酸序列。术语“同源”在这里指含下列核苷酸序列的多聚核苷酸分子：(a)编码SEQ ID NO：3从nt2314到nt3021的相同多肽，但包括一个或多个与遗传密码的简并性相符的核苷酸序列的沉默变化：或(b)在中等严格条件下与编码含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸分子补体杂交，即在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与结合在滤膜上的DNA杂交，且42℃ 0.2×SSC/0.1％ SDS洗涤(见Ausubel等，1989，同上)，对于本发明的实施是很有用的。在一个优选的实施方案中，在高度严格条件下，同源性多聚核苷酸分子与含有编码由SEQ IDNO：4氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸的补体杂交。例如：在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与结合在滤膜上的DNA杂交，且68℃0.2×SSC/0.1％SDS洗涤(见Ausubel等，1989，同上)，对于本发明的实施是很有用的。在一个更为优选的实施方案中，在高度严格条件下，同源性多聚核苷酸分子与含有编码由SEQ ID NO：3从nt2314到nt3021的核苷酸序列的多核苷酸分子的补体杂交，对于本发明的实施是很有用的。

这里所用的aveR2相关的多聚核苷酸分子是指“对实现本发明有用的”，其中的多聚核苷酸分子可被用于通过位点定点突变例如通过同源重组引入突变至阿维链霉菌的aveR2 ORF中，或使用常规放大技术扩增含有阿维链霉菌的aveR2ORF的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。此同源性多聚核苷酸分子可包括自然产生的存在于链霉菌除了天蓝色链霉菌外的其他种中或存在于阿维链霉菌其它菌株中的aveR21基因，也包括无论自然产生、化学合成或基因工程的突变aveR1等位基因。

本发明进一步提供一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个编码和SEQ ID NO：4氨基酸序列同源的多肽的核苷酸序列。这里所提及的多肽含有和来源于阿维链霉菌aveR2基因同源的氨基酸序列，术语“同源”指一个有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，但是其中的一个或多个氨基酸序列残基被一个不同的氨基酸残基保守性取代，保守性氨基酸取代在上面已被定义，所得多肽对于本发明的实施是有用的。

此处所用的aveR2相关的多肽“对于本发明的实施是有用的”，其中的多肽可用于增加抗来自阿维链霉菌的aveR2基因产物的抗体，或用于筛选调节aveR2活性的化合物或链霉菌的除虫菌素产量。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子，其含有的一个核苷酸序列即本发明如上所述的任一aveR2相关核苷酸分子的重要部分。此处所用的aveR1aveR2相关核苷酸分子的“重要部分”是指一个由小于阿维链霉菌aveR2基因产物或aveR2相关的同源性多肽的完全编码序列构成的多聚核苷酸分子，但是其含有上述核苷酸序列的至少25％，更优选的是至少30％，并且如上述限定的aveR2相关的多聚核苷酸分子的用途一样，其对于本发明的实施是有用的。

在一个非限制性的实施方案中，aveR2相关的多聚核苷酸分子的重要部分由一段核苷酸序列构成，此核苷酸序列编码本发明的阿维链霉菌aveR2基因产物或aveR2相关同源性多肽的肽片段。aveR2相关多肽的“肽片段”是指由全序列aveR2基因产物或同源性多肽的氨基酸序列的亚序列构成的多肽，其中的亚序列短于aveR2基因产物或同源多肽的全序列，并且如上述限定的aveR2相关多肽的用途一样，亚序列对于本发明的实施是很有用的。在一个优选的实施方案中，本发明进一步提供了一个多聚核苷酸分子其由编码SEQ ID NO：4氨基酸序列的亚序列肽片段的核苷酸序列构成。本发明的肽片段在长度上最好至少15个氨基酸残基。

这里公开的aveR2相关多聚核苷酸分子可用于aveR1基因产物的表达，aveR21基因突变的新链霉菌菌株的制备，和使用已知的技术在其它的细菌菌种与菌株中鉴定aveR2同系物基因。因此，本发明进一步提供了一个含有一段编码aveR2同系物基因产物的核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子。此处所用的aveR21同系物基因产物被限定为aveR2同系物基因编码的基因产物，其中的aveR2同系物基因是指来源于链霉菌的不同种或紧密相关的糖多孢菌属的基因，且本领域技术人员根据其与阿维链霉菌aveR2基因的核苷酸序列的同源性大于约80％来识别，或根据通常发现于二组分信号系统的组氨酸激酶成分中含有保守性位点残基来识别。例如，用Nar/Deg亚组真细菌二组份系统进行aveR2同源性比较显示出两个天门冬氨酸(D)残基100％的保守性，其中一个残基是磷酸化位点，一个是保守的赖氨酸残基(K)。

鉴定含有aveR2同系物基因的多核苷酸克隆的方法是本领域公知的。例如：含有阿维链霉菌aveR2 ORF部分的多核苷酸分子可被标记检测和用于筛选由目的微生物获得的DNA构建的基因组文库。可依据参比微生物与目的微生物的关系来选择杂交条件的严格性，此实施例中参比微生物为阿维链霉菌。基因组DNA文库通过上面5.1.1部分描述的技术进行筛选来用于aveR2同系物基因编码序列。含有已知的显示于SEQ ID NO：3的aveR2 ORF的核苷酸序列的多聚核苷酸分子，或其寡核苷酸分子特征部分，可在这些筛选实施例中作为探针。此外，可合成寡核苷酸探针，其对应于从纯化的aveR2基因产物的氨基酸序列推导出的核苷酸序列。

鉴定含有aveR2同系物基因编码序列的克隆可用作适当的生物功能的检测。例如：可对克隆进行序列分析以鉴别合适的阅读框架和初始及终止信号。克隆的DNA序列可被插入到相应的表达载体中，其载体然后被转入阿维链霉菌的细胞中产生aveR2来用于补体的检测。转化的阿维链霉菌宿主细胞通过例如发酵产物的HPLC分析的方法用于除虫菌素产品的分析，其方法描述在下面的6.6部分。

本发明进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个或多个自然原位侧接于阿维链霉菌aveR2 ORF的核苷酸序列。这样的侧接序列可选自SEQ IDNO：3中nt1到nt 2313以及从大约nt3022到nt5045的核苷酸序列。本发明还进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个或多个核苷酸序列同源于自然原位侧接于阿维链霉菌aveR2 ORF的核苷酸序列。此处所用的核苷酸序列与原位自然侧接于阿维链霉菌aveR2 ORF的核苷酸序列同源，该同源核苷酸序列在温和的严格条件下杂交于自然原位侧接于阿维链霉菌aveR2 ORF的核苷酸序列的补体，即在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与接合在滤膜上的DNA杂交，且42℃0.2×SSC/0.1％ SDS洗涤(见Ausubel等，1989，同上)，并且如同上述所定义的aveR2相关多聚核苷酸分子的用途一样，该同源核苷酸序列对于本发明的实施是很有用的。本发明分离核苷酸分子的旁侧序列或同源序列其长度最好至少200nt。在非限制的实施方案中，本发明提供了一个分离多聚核苷酸分子其含有一个或多个上述核苷酸序列，该核苷酸序列自然原位侧接于阿维链霉菌aveR2 ORF或同源于这样的核苷酸序列，并且分离多聚核苷酸分子进一步含有本发明上面提及的aveR2相关核苷酸序列，例如：显示于SEQ ID NO：3从大约nt2314到nt3021的aveR1 ORF或其重要部分的核苷酸序列。

5.1.3 aveR1/aveR2相关的多聚核苷酸分子

本发明提供了一个含有编码来源于阿维链霉菌的aveR1和aveR2两基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子(下面所指aveR1/aveR2)。在一个优选的实施方案中，aveR1和aveR2基因产物分别含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一个非限制的实施方案中，本发明的分离aveR1/aveR2多聚核苷酸分子含有阿维链霉菌aveR1 ORF显示于SEQ ID NO：1从nt1112到nt2317的核苷酸序列，和阿维链霉菌aveR2 ORF显示于SEQ ID NO：1从nt2314到nt3021的核苷酸序列。在另一个非限制的实施方案中，本发明的分离aveR1/aveR2多聚核苷酸分子含有SEQ ID NO：1显示于SEQ ID NO：1从nt1112到nt3021的核苷酸序列，在另一个非限制的实施方案中，分离多聚核苷酸分子含有SEQ IDNO：1的核苷酸序列。SEQ ID NO：1的核苷酸序列在aveR1和aveR2的ORFs之间显示出部分重叠；然而，本发明也包括aveR1和aveR2的ORFs之间无重叠的aveR1/aveR2多聚核苷酸分子。

本发明进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其同源于含有阿维链霉菌aveR1 ORF显示于SEQ ID NO：1从nt1112到nt2317的核苷酸序列和阿维链霉菌aveR2 ORF显示于SEQ ID NO：1从nt2314到nt3021的核苷酸序列的分离多聚核苷酸分子。术语“同源”在这里指含下列核苷酸序列的多聚核苷酸分子：(a)分别编码aveR1和aveR2 ORFs显示于SEQ ID NO：1从nt1112到nt2317和显示于SEQ ID NO：1从nt2314到nt3021的相同多肽，但包括一个或多个与遗传密码的简并性相符的核苷酸序列的沉默变化：或(b)在中等严格条件下与含有编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的第一多肽和编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的第二多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子补体杂交，即在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与结合在滤膜上的DNA杂交，且42℃0.2×SSC/0.1％ SDS洗涤(见Ausubel等，1989，同上)，对于本发明的实施是很有用的。在一个优选的实施方案中，在高度严格条件下，同源性多聚核苷酸分子与含有编码SEQ IDNO：2氨基酸序列的第一多肽和编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的第二多肽的核苷酸序列的多核苷酸补体杂交。即在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与结合在滤膜上的DNA杂交，且68℃0.2×SSC/0.1％ SDS洗涤(见Ausubel等，1989，同上)，对于本发明的实施是很有用的。在一个更为优选的实施方案中，在高度严格条件下，同源性多聚核苷酸分子与含有aveR1和aveR2 ORFs分别显示于SEQ ID NO：1从nt1112到nt2317和显示于SEQ ID NO：1从nt2314到nt3021核苷酸序列的多核苷酸分子的补体杂交，对于本发明的实施是很有用的。

这里所用的aveR1/aveR2相关的多聚核苷酸分子是指“对实现本发明有用的”，其中的多聚核苷酸分子可被用于通过位点定点突变例如通过同源重组引入突变至阿维链霉菌的aveR1 ORF或aveR2 ORF或aveR1和aveR2 ORFs中，或使用常规放大技术扩增含阿维链霉菌的aveR1 ORF或aveR2 ORF或aveR1和aveR2 ORFs的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。此同源性多聚核苷酸分子可包括自然产生的存在于链霉菌除了天蓝色链霉菌外的其他种中或存在于阿维链霉菌其它菌株中的aveR1/aveR2基因，，也包括无论自然产生、化学合成或基因工程的突变aveR1或aveR2等位基因。

本发明进一步提供一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个编码分别和SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4氨基酸序列同源的第一和第二多肽的核苷酸序列。这里所提及的多肽含有和来源于阿维链霉菌aveR1和aveR2基因产物同源的氨基酸序列，术语“同源”指一个分别含有SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列，但是其中的一个或多个氨基酸序列残基被一个不同的氨基酸残基保守性取代，保守性氨基酸取代如上述所限定，所得多肽对于本发明的实施是有用的。

本发明进一步提供了一种分离多聚核苷酸分子，其由一个核苷酸序列即本发明如上所述的任一aveR1/aveR2相关核苷酸分子的重要部分构成。此处所用的aveR1/aveR2相关核苷酸分子的“重要部分”是指一个由小于编码阿维链霉菌aveR1或aveR2基因产物或aveR1和aveR2基因产物相关的同源性多肽的完全编码序列构成的多聚核苷酸分子，但是其含有上述核苷酸序列的至少10％，更优选的是至少20％，并且如上述限定的aveR1/aveR2相关的多聚核苷酸分子的用途一样，其对于本发明的实施是有用的。在一个优选实施方案中，aveR1/aveR2相关的多聚核苷酸分子的重要部分由一段核苷酸序列构成，此核苷酸序列编码本发明的阿维链霉菌aveR1基因产物或aveR2基因产物或其同源性多肽。在一个特殊但非限定的实施方案中，aveR1/aveR2相关多聚核苷酸分子的重要部分由aveR1 ORF显示于SEQ ID NO：1的从约nt1112到nt2317的核苷酸序列构成。在另一个特殊但非限定的实施方案中，aveR1/aveR2相关多聚核苷酸分子的重要部分由aveR2 ORF显示于SEQ ID NO：3的从约nt2314到nt3021的核苷酸序列构成。

本发明进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个或多个自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1/aveR1 ORFs的核苷酸序列。这样的侧接序列可以选自SEQ ID NO：1中nt1到nt1111以及从大约nt3022到nt5045的核苷酸序列。本发明还进一步提供了一个分离多聚核苷酸分子，其含有一个或多个核苷酸序列同源于自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1/aveR2 ORFs的核苷酸序列。此处所用的核苷酸序列同源于一个自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1/aveR2 ORFs的核苷酸序列，其中该同源核苷酸序列在合适的严格条件下杂交于自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1/aveR2 ORFs的核苷酸序列的补体，即在0.5M NaHPO₄，7％的SDS，1mM EDTA，65℃时与接合在滤膜上的DNA杂交，且42℃0.2×SSC/0.1％ SDS洗涤(见Ausubel等，1989，同上)，并且如同上述所定义的aveR1/aveR2相关多聚核苷酸分子的用途一样，该同源核苷酸序列对于本发明的实施是很有用的。本发明分离核苷酸分子的旁侧序列或同源序列其长度最好至少200nt。在非限制的实施方案中，本发明提供了一个分离多聚核苷酸分子其含有一个或多个上述核苷酸序列，该核苷酸序列自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1/aveR2 ORFs或同源于这样的核苷酸序列，并且分离多聚核苷酸分子进一步含有本发明上面提及的aveR1/aveR2 ORFs相关核苷酸序列，例如：编码阿维链霉菌aveR1 ORF或aveR2 ORF或aveR1/aveR2 ORFs显示于SEQ ID NO：1从大约nt1112到nt2317的核苷酸序列。

5.2寡核苷酸分子

本发明进一步提供了寡核苷酸分子，其杂交于本发明上述所提及的任一多聚核苷酸分子，或者杂交于一个多聚核苷酸分子其具有的一段核苷酸序列为本发明上述任一多聚核苷酸分子的补体。此寡核苷酸分子在长度上优选为至少10个核苷酸分子，但是可以延伸为本发明中上述提及的任一多聚核苷酸分子的亚序列长度，而且可以在温和或高度严格条件下杂交于一个或多个上述提及的多聚核苷酸分子。对于较短的寡核苷酸分子，高度严格条件的例子包括在6×SSC/0.5％焦磷酸钠盐中在大约37℃洗涤14个碱基的寡核苷酸，48℃洗涤17个碱基的寡核苷酸，大约55℃洗涤20个碱基的寡核苷酸，并且大约60℃洗涤23个碱基的寡核苷酸。对于更长的寡核苷酸分子，(即大约长于100个核苷酸)，温和且更严格的条件的例子见上述5.1部分关于同源多聚核苷酸分子的描述。杂交条件可根据特定的寡核苷酸分子在本技术领域进行相应地调节。

在一个优选的实施方案中，本发明的一个寡核苷酸分子在高度严格条件下杂交于一个由SEQ ID NO：1核苷酸序列或一段以SEQ ID NO：1核苷酸序列补体构成的多聚核苷酸分子。

本发明的寡核苷酸分子也适用于多种目的，包括作为引物扩增一个aveR1或aveR1基因产物的编码多聚核苷酸分子，或作为反义分子用于调节链霉菌中ave基因及除虫菌素的生物合成。扩增可以通过利用合适的设计引物分子连同诸如聚合酶链反应(PCR)的常规技术来进行，也有其它本领域公知的扩增技术如连接酶链式反应可以被利用。例如：PCR反应中制备含有合适的设计引物、需要被扩增核苷酸序列的模板、合适的PCR酶及缓冲液的上述混合物并通过标准方法扩增得到模板的特殊的aveR1或aveR2-相关的多核苷酸序列。

5.3重组表达系统

5.3.1表达载体

本发明进一步提供了含有本发明提及的多聚核苷酸分子的重组克隆载体以及重组表达载体，这些载体对于克隆和表达所述多聚核苷酸分子是很有用的，载体包括含有阿维链霉菌aveR1 ORF或aveR2 ORF或aveR2和aveR2 ORFs两者的多聚核苷酸分子，在一个非限制性的实施方案中，本发明提供了质粒pSE201(ATCC203182)，其含有阿维链霉菌的完整的aveR1 ORF和完整的aveRORF。

下面提供了本发明前述的全部多聚核苷酸分子和多肽，包括含有阿维链霉菌aveR1 ORF或aveR2 ORF或aveR1和aveR2 ORFs两者的多聚核苷酸分子及其基因产物和所有同源多聚核苷酸分子、同源肽、这些多聚核苷酸分子的重要部分以及这些基因产物和多肽的肽片段，除非另有所述，其定义如上。

各种不同载体被改进用于链霉菌的特定用途，其包括噬菌体、高拷贝数质粒、低拷贝数质粒、自溶性质粒、温度敏感型质粒和大肠杆菌-链霉菌穿梭载体及其它，这些种类中任意一种载体可被用于本发明的实施。大量的抗药性基因从链霉菌中被克隆，这些基因中一些被引入载体中作为选择对照。目前用于链霉菌的载体的例子公开于Hutchinson，1980，Applied Biochem.Biotech.16：169-190。

本发明的重组载体，特别是表达载体，被优先构建使本发明多核苷酸的编码序列与一个或多个编码序列的转录与翻译必要的调节元件连接在一起来产生多肽。此处的术语“调节元件”包括但不限于的核苷酸序列其编码诱导和非诱导的启动子、增强子、操纵子及其它的本领域公知用于控制和调节多核苷酸编码序列表达的因子。同时，此处所用的编码序列和一个或多个调节元件连接在一起，其中的调节元件有效地调节和容许编码序列的转录或其mRNA的翻译或调节和容许转录和翻译二者。

典型的质粒载体可经人工改造而含有本发明的多聚核苷酸分子，其包括pCR-B1unt，pCR2.1(Invitrogen)，pGEM3Zf(promega)，和穿梭载体pWHM3(Vara等，1989，J.Bact.171：5872-5881)及其它。

这些载体的调节元件在其强度与特性上可进行变化。依据利用的宿主载体系统，大量任意合适的转录和翻译元件可被利用。细菌转录调节区域或启动子的非限制性的例子包括β-半乳糖启动子、T7启动子、TAC启动子、λ左和右启动子、色氨酸和乳糖启动子、色氨酸-乳糖融合启动子和更为具体的链霉菌的ermE、melC和tipA启动子等。

含有操纵连接于合适的调节元件的特定编码序列的重组载体的构建方法在本发明领域是公知的，这些方法的任意一个都可以用于本发明的实施。这些方法包括体外重组技术、合成技术和体内基因重组，参考例如：其技术描述于Maniaiatis等，1989，同上；Ausubrl等，1989，同上；Sambrook等，1989，同上Innis等，1995，同上；Erlich等，1992，同上；及Hopwood等，1985，同上。

融合蛋白表达载体可被用于表达aveR1或aveR2基因产物融合蛋白。纯化的融合蛋白可被用于增加抗aveR1或aveR2基因产物的抗血清、研究aveR1或aveR2基因产物的生化活性、人工改造有不同生化活性的aveR1或aveR2融和蛋白或在重组表达系统中协助鉴定与纯化表达的aveR1或aveR2基因产物。适当的融合蛋白表达载体包括掺入了编码β-半乳糖苷酶和trpE融合蛋白、麦芽糖结合蛋白融合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白、多聚组氨酸融合蛋白(载体区域)序列的载体，但不限于这些。

aveR1或aveR2融合蛋白可经人工改造含有对于纯化有用的区域。例如：aveR1-或aveR2-麦芽糖结合蛋白融合体可使用直链淀粉树脂纯化；aveR1-或aveR2-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白可使用谷胱甘肽-琼脂糖颗粒来纯化；aveR1-或aveR2-多聚组氨酸融合蛋白可使用二价镍树脂来纯化。或者，抗载体蛋白或肽的抗体可用于融合蛋白的亲和层析纯化。例如：一个编码单克隆抗体靶表位的核苷酸序列可通过基因工程手段插入操纵连接于调节元件的表达载体中并且被定位，由此表达的表位与aveR1或aveR2多肽融合在一起。例如：一个编码FLAG^TM表位标记的核苷酸序列(国际生物技术公司)，其中的FLAG^TM表位标记是一个亲水性标记肽，核苷酸序列可通过常规技术插到表达载体中对应于aveR1或aveR2多肽的氮端或碳端的点。然后已表达的aveR1或aveR2多肽的FLAG^TM表位融合产物可通过使用商购的抗FLAG^TM抗体来检测与亲和纯化。

编码aveR1或aveR2融和蛋白的表达载体，可经人工改造而含有多接头序列，其多接头序列编码特定的蛋白酶切割位点这样表达的aveR1或aveR2多肽可从载体区域或融合配偶体通过用特殊蛋白酶处理释放出来。例如：融和蛋白载体可包括编码凝血酶或凝血因子Xa切割位点的DNA序列等。

来自含有aveR1或aveR2 ORF的上游信号序列可被通过已知的方法人工改造插到表达载体中来指导运输和分泌已表达的基因产物。信号序列的非限制性的例子包括来自α-因子、免疫球蛋白、外部膜蛋白、青霉素酶和T-细胞受体及其它。

为了有助于本发明克隆或表达载体转化或转染的宿主细胞的选择，载体可经人工改造以进一步含有报道基因产物或其它可选择标记的一段编码序列。象上述的一样，此编码序列最好与调节元件编码序列操纵连接。本发明中有用的报道基因在本领域是公知的，其包括那些编码绿色荧光蛋白的、荧光素酶、 xylE和酪氨酸酶及其它报道基因。编码选择性标记的核苷酸序列在本领域是公知的，且包括那些编码赋予对抗生素或抗代谢物的抗性的基因产物或那些供应营养缺陷型所要的核苷酸序列。这些核苷酸序列的例子包括那些编码红霉素、硫链丝菌肽或卡那霉素及其它抗性的序列。

5.3.2宿主细胞

本发明进一步提供了转化宿主细胞，其含有本发明的多聚核苷酸分子或重组载体，以及新菌株及其细胞系。尽管其它的原核细胞和真核细胞可以被使用，用于实现本发明的宿主细胞最好为链霉菌细胞。这种转化细胞通常包括微生物例如用重组细菌噬菌体DNA或质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌、用重组载体转化的酵母，但不限于这些。

细菌细胞一般优先作为宿主细胞。可以认为本发明的多聚核苷酸分子一般指在链霉菌细胞中行使功能，但也可以被转化入其它细菌或真菌细胞例如用于克隆或表达的目的。通常可使用大肠杆菌菌株，例如DH5α菌株，其可以从美国典型培养物中心(ATCC)，Rockville，MD，美国(保藏号No.31343)或商业来源(Stratrgene)得到。优选的真核宿主细胞包括酵母细胞，然而哺乳动物细胞或昆虫细胞也可被有效地使用。

本发明的重组表达载体最好被转化或转染入基本均一的细胞培养物的一个或多个宿主细胞。表达载体一般通过已知技术被引入宿主细胞，例如：通过原生质体转化、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、微注射、电穿孔、用重组病毒转染、脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖转染、转导、接合或微粒轰击。转化体的筛选可通过常用的方法来进行，象筛选表达选择性标记如抗生素抗性的细胞，如前面所述选择性标记与重组载体连接。

一旦表达载体被导入宿主细胞，aveR1-、aveR2-或aveR1/aveR2-相关的编码序列是整合和维持在染色体上还是游离基因上可通过标准方法来进行证明。例如通过Southern杂交分析、限制性酶分析、PCR分析包括反转录酶PCR(rt-PCR)或通过免疫学分析以检测目的基因产物，含有和/或表达重组aveR1-、aveR2-或aveR1-/aveR2-相关编码序列的宿主细胞可以通过至少四种本领域公知标准方法的任一种来鉴定，其方法包括(1)DNA-DNA，DNA-RNA或反义RNA-RNA杂交；(2)检测标记基因功能的存在；(3)通过测定宿主细胞中aveR1-或aveR2-特异性mRNA转录的表达来估计转录水平，和(4)检测成熟多肽产物的存在，例如根据免疫测定或根据aveR1或aveR2生物活性的存在。

5.3.3重组aveR1或aveR2基因产物的表达和鉴定

一旦aveR1、aveR2或aveR1/aveR2相关的编码序列稳定地插入到合适的宿主细胞，转化的宿主细胞就克隆增殖，且产生的细胞生长在有助于产生最大产量的aveR1和/或aveR2相关基因产物的条件下。这些条件通常包括使生长细胞达到高密度。此处的表达载体含有可诱导的启动子，合适的诱导条件例如温度梯度、营养消耗、义务诱导剂的增加(例如：碳水化合物的类似物，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))、过量代谢副产品或其类似物的积累等等都被作为诱导表达所采用的条件。

被表达的aveR1和/或aveR2相关基因产物滞留在宿主细胞中，收集细胞并裂解，在本领域公知的提取条件下从裂解物中分离和纯化产物以尽量减少蛋白的降解，例如：在4℃，或者存在蛋白酶抑制剂，或二者都有。表达的aveR1和/或aveR2基因产物从宿主细胞中分泌出来时，营养耗尽的培养基很容易被收集且产物从中得到了分离。

被表达的aveR1-和/或aveR2-相关基因产物可以通过标准方法从细胞裂解液或培养基中分离或进一步纯化，其方法包括但不限于下述方法的任意组合：硫酸铵沉淀、按大小进行分级分离、离子交换层析、高效液相层析、密度梯度离心以及亲和层析。被表达的aveR1-和/或aveR2-相关基因产物显示生物活性时，制品纯度的增加可通过合适的测定在纯化过程的每一步得到监控。表达aveR1-和/或aveR2-基因产物是否显示出生物活性，可依据例如大小或aveR1或aveR2特异抗体的反应活性或依据融合标记的存在来检测。

本发明因而提供了一个本发明多核苷酸编码的基本上纯化或分离的多肽。在一个特定的非限制性的实施方案中，该多肽为含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的来源于阿维链霉菌的aveR1基因产物。在另一个特定的非限制性的实施方案中，该多肽为含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的来源于阿维链霉菌的aveR2基因产物。本发明进一步提供了基本上纯化或分离的多肽，其与本发明aveR1或aveR2基因产物同源。本发明进一步提供了本发明aveR1或aveR2基因产物或同源多肽的肽片段。本发明分离或基本上纯化的多肽可用于多种目的例如筛选改变aveR1或aveR2基因产物功能的化合物，由此调节除虫菌素的生物合成，以及增加直接作用于aveR1或aveR2基因产物的抗体。

此处所用的“基本上纯化的”多肽是其中的多肽构成了特定制品中的主要重量。此处所用的“分离”多肽是其中的多肽构成了特定制品中的至少90％的重量。

本发明进一步提供了一种制备方法以制备基本上纯化或分离的aveR1基因产物、aveR2基因产物、同源多肽或本发明的肽片段，还包括培养转化或转染了重组表达载体的宿主细胞，上述重组表达载体包括含有编码aveR1基因产物、aveR2基因产物、同源多肽或肽片段的核苷酸序列的多聚核苷酸分子，其中的核苷酸序列在适合于特定基因产物、多肽或肽片段的表达的条件下与一个或几个调节元件操纵相连。而且还包括从细胞培养基中以基本上纯化或分离的形式回收基因产物、多肽或肽片段。

一旦获得足够纯度的aveR1或aveR2基因产物，可以利用标准方法进行特征鉴定，包括SDA-聚丙烯酰胺凝胶电泳、大小排阻色谱法、氨基酸序列分析、在除虫菌素生物合成途径中产生适当产物的生物活性等等，例如：aveR1或aveR2基因产物的氨基酸序列可以通过常规肽序列测定技术进行测定。aveR1或aveR2基因产物可以利用亲水性分析或利用类似的软件算法去检测aveR1或aveR2基因产物的亲水或疏水区。可以通过结构分析来检测aveR1或aveR2基因产物中假设的特殊二级结构，诸如X-射线结晶技术(Engstrom，1974，生物化学.Exp.Biol.11：7-13)，计算机模型(Fletterick和Zoller编，1986，现代分子生物学通讯，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)以及核磁共振(NMR)等生物物理技术来绘制图谱及研究aveR1或aveR2基因产物和它们底物的作用位点。从这些研究中获得的信息可以用来选择aveR1或aveR2 ORF新的突变位点从而有助于开发含有更多的所需除虫菌素产物特性的链霉菌新菌株。

5.4 aveR1和aveR2突变体的构建

本发明进一步提供了用于遗传修饰链霉菌的种或菌株细胞的组分和方法，其中包括遗传构建体例如基因置换型载体。在一个优选的实施方案中，经过遗传修饰的链霉菌的种或菌株细胞产生大量的除虫菌素经检测其不同于未经上述修饰的链霉菌的种或菌株细胞产生除虫菌素的量。在一个更优选的实施方案中阿维链霉菌菌株细胞经遗传修饰与未经遗传修饰的同株细胞相比产生可检测出增加量的除虫菌素。根据本发明，这些遗传修饰包括aveR1基因或aveR2基因或aveR1与aveR2两基因的突变，这些突变导致携带突变的阿维链霉菌菌株的细胞与未携带突变的相同阿维链霉菌菌株的细胞相比可检测到除虫菌素产量的增加。

根据本发明，可以通过现有或未来将发展的技术将突变导入aveR1基因或aveR2基因或aveR1及aveR2两基因中。例如：应用常规诱变技术可以实现随机诱变包括将链霉菌细胞暴露于紫外线或X射线下或化学诱变剂例如N-甲基-N｀-亚硝基胍、乙基甲基磺酸盐、亚硝酸或氮芥进而选择aveR1和/或aveR2基因的一个或多个突变而使细胞显现可检测的除虫菌素产量的增加。参见上述的Ausubel，1989突变技术综述。

此外，aveR1或aveR2或aveR1及aveR2基因突变可通过各种已知的重组技术包括易错聚合酶链式反应或盒式诱变等定点诱变的方法来进行。例如利用同源重组的定点诱变可以被用来特异性地改变aveR1或aveR2 ORF或旁侧序列，或改变aveR1和aveR2的ORF或旁侧序列，从而特异性地在这些基因中导入一个或多个突变。另外，描述于US5605793的其它方法，包括随机片段化，诱变的重复循环以及核苷酸改组等可用来产生具有编码aveR1和/或aveR2突变的多聚核苷酸分子的大文库。

对于本发明的实施有用的aveR1或aveR2或aveR1及aveR2两基因的突变包括aveR1或aveR2或aveR1及aveR2或旁侧调节区域的一个或几个核苷酸的增加、删除或替换，或其中的一些组合，并且得到所期望的结果即携带了突变基因的阿维链霉菌菌株的细胞与未携带突变的阿维链霉菌菌株的细胞相比可检测到除虫菌素产量的增加。这样的突变可以导致插入一个或多个新的限制性位点、终止密码子或移码框架到单个或两个ORF序列或插入到参与转录的旁侧调节序列区。其它有用的突变包括插入一个不同或异源的核苷酸序列到单个的aveR1或aveR2或aveR1及aveR2基因中，或删除aveR1或aveR2或aveR1及aveR2基因的全部或部分，还包括用不同或异源的核苷酸替换全部或部分单个的aveR1或aveR2或aveR1及aveR2两基因，并且这些突变产生了所期望的结果，即已携带了突变基因的阿维链霉菌菌株的细胞产生除虫菌素的细胞与未携带突变的阿维链霉菌菌株的细胞相比可检测到除虫菌素产量的增加。

定点诱变是很有用的，特别是用来改变aveR1或aveR2基因产物的一个或多个保守氨基酸残基或改变aveR1和aveR2基因产物的一个或多个保守氨基酸残基。例如：对于来源于阿维链霉菌的aveR1和aveR2基因产物的演绎氨基酸序列与来源于天蓝链霉菌的相似基因产物比较，可以显示出这两个种之间高度保守的氨基酸残基的位点，如附图1A和1B所示。缺失或非保守性替换一个或多个保守氨基酸残基的定点诱变可以特别有效地产生所需要的除虫菌素产量改变的新突变株。

在一个优选的实施方案中，通过同源重组的方式利用本发明提供的遗传工程构建产物如基因置换型载体将一个或多个突变引入aveR1或aveR2或aveR1及aveR2基因中。遗传工程构建产物包括整个aveR1 ORF或一个同源多聚核苷酸分子或者其核心部分，或者整个aveR2 ORF或一个同源多聚核苷酸分子或者其核心部分，或aveR1与aveR2 ORFs或一个同源多聚核苷酸分子或者其核心部分，或自然原位侧接于阿维链霉菌aveR1 ORF或aveR2 ORF或aveR1及aveR2 ORFs的核苷酸序列或其结合部位，并且遗传工程构建产物可以用于导入一个突变到aveR1基因或aveR2基因或aveR1及aveR2基因中，从而这些突变的结果可以检测到已携带了上述突变基因的阿维链霉菌菌株的细胞产生除虫菌素的细胞与未携带突变的阿维链霉菌菌株的细胞相比可检测到除虫菌素产量的增加。

在一个特定的非限制性实施方案中，用于本发明的实施的遗传工程构建产物是一个质粒，其为含有下述核苷酸序列的多聚核苷酸分子，该核苷酸序列除了进一步含有一个或多个突变即一个或多个核苷酸的缺失、插入、替换或其组合以外，其与阿维链霉菌的aveR1 ORF或aveR2 ORF或aveR1及aveR2 ORFs或其重要部分的核苷酸序列相同，该质粒可以用于转化链霉菌细胞。从而导入突变到aveR1基因或aveR2基因或aveR1及aveR2两基因中，分别破坏或改变aveR1基因或aveR2基因或aveR1及aveR2基因的生物功能的活性，由此已携带了上述突变基因的阿维链霉菌菌株的细胞产生除虫菌素的细胞与未携带突变的阿维链霉菌菌株的细胞相比可检测到除虫菌素产量的增加。这样的质粒优选地进一步含有一个选择性标记。

一旦转化到链霉菌宿主细胞中，遗传构建体的多聚核苷酸分子就通过同源重组特异定位到aveR1基因或aveR2基因，或同时定位到aveR1和aveR2两个基因，或者替换aveR1基因或它的一部分，或者替换aveR2基因或它的一部分，或者同时替换aveR1和aveR2基因或它们的一部分或者插入到aveR1基因或aveR2基因中。这一重组事件的结果是，宿主细胞的aveR1基因或者aveR2基因，或者aveR1和aveR2两基因，或者它们编码的基因产物，被部分地或完全地失活。利用这一基因构建体上所带的选择性标记，能够挑选出被转化的细胞，使用如下6.6节所述的标准方法进行筛选，将转化细胞与同一菌株的没有被这样转化的细胞相比可检测到除虫菌素产量的增加。

在下面6.9.1节所列举的特定非限制性的实施例中，一个基因置换型载体通过使用异源核苷酸序列(ermE)分别替换aveR1和aveR2基因的ORF的一部分，破坏了这两个基因。在下面6.9.2节所列举的另一个特定非限制性实施例中，一个基因置换型载体通过将异源核苷酸序列(ermE)插入aveR2基因的ORF中，破坏了aveR2基因。这些基因置换型载体被分别转化入一株阿维链霉菌的细胞中，通过同源重组整合到染色体上。对这两个新的链霉菌转化株的发酵分析表明，带有这些基因突变的细胞的产除虫菌素量比不带这些基因突变的同一菌株的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加。

本发明还提供了一种鉴定链霉菌一个种或一个菌株中aveR1基因或aveR2基因，或者同时aveR1和aveR2这两个基因的突变的方法，这种基因突变使得带有这些基因突变的链霉菌的种或菌株的细胞的产除虫菌素量比不带这些基因突变的链霉菌的同一种或菌株的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加。方法如下：(a)测量特定的链霉菌的种或株的细胞的产除虫菌素量；(b)向步骤(a)中的链霉菌的种或株的细胞的aveR1基因或aveR2基因，或者aveR1和aveR2这两个基因中引入突变；(c)比较步骤(b)中产生的带有基因突变的细胞与步骤(a)中的不带有基因突变的细胞的产除虫菌素量；因此如果步骤(b)中所产生的带有基因突变的细胞的产除虫菌素量比步骤(a)中的不带有基因突变的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加，那么就鉴定出了aveR1基因或aveR2基因，或者aveR1和aveR2这两个基因的可使得产除虫菌素量增加的突变。在一个优选的实施例中，链霉菌的种是阿维链霉菌。

本发明还提供了一种从链霉菌的一个种或菌株制备遗传修饰细胞的方法，这些被修饰细胞和同一种或菌株的未修饰细胞相比产生可检测出的增加的除虫菌素曼。方法如下：在链霉菌的一定种或菌株的细胞中突变aveR1基因或aveR2基因，或者aveR1和aveR2这两个基因，然后挑选出比同一种或菌株的链霉菌的不带有基因突变的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加的突变细胞。在优选的实施例中，链霉菌的种是阿维链霉菌。

本发明还提供了新的链霉菌菌株作为aveR1基因或aveR2基因，或者同时aveR1和aveR2这两个基因的一个或多个突变的结果，这些细胞与同一种或菌株的链霉菌的不带有基因突变的细胞相比产生了可检测出的除虫菌素的增加量。在一个优选的实施例中，链霉菌的种是阿维链霉菌。本发明提供的新菌株可用于除虫菌素的大规模生产，比如可用于合乎商业需要的doramectin的生产。

本发明还提供了通过链霉菌的培养产生增加量的除虫菌素的方法。该方法如下：在允许或诱导除虫菌素从细胞中产生的培养条件下在培养基中培养链霉菌的一定种或菌株的细胞，这些细胞含有aveR1基因或aveR2基因，或者同时aveR1和aveR2这两个基因的一个突变，这种基因突变使得带有这些基因突变的链霉菌的种或菌株的细胞的产除虫菌素量与不带这些基因突变的链霉菌的同一种或菌株的细胞相比产生了可检测出除虫菌素量的增加，而后从培养基中回收除虫菌素。在一个优选的实施例中，链霉菌的种是阿维链霉菌。本方法可用于增加除虫菌素的生产。

5.5.反义寡聚核苷酸和核酶

本发明范围内的寡聚核苷酸序列还包括通过结合以降解和/或抑制aveR1或aveR2 mRNA翻译作用的反义寡聚核苷酸，硫代磷酸酯和核酶。

反义寡聚核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，通过结合到靶mRNA上直接阻断mRNA的翻译和阻止蛋白质的翻译。例如，至少大约15个碱基且与编码AveR1或AveR2多肽的DNA序列的一定区域互补的反义寡聚核苷酸可以通过比如传统的磷酸二脂法合成。

核酶是能够催化特异RNA裂解的酶性RNA分子。核酶的作用机制包括核酶分子与互补的靶RNA分子序列特异性杂交和随后的核酸内切裂解。能专一和高效地催化aveR1或aveR2 mRNA序列内切裂解的基因工程锤头状基元核酶分子也在本发明所述的范围内。

任何可能的RNA靶内的特异性核酶裂解位点开始可以通过筛选带有包括GUA，GUU和GUC序列的核酶裂解位点的靶分子来鉴定。一旦鉴定后，就可以通过预测象二级结构这样的使寡聚核苷酸序列不合适的结构特征来评价含有裂解位点的靶基因区对应的15个和20个核糖核苷酸之间的短的RNA序列的合适性。侯选的靶分子的合适性可以通过使用例如核糖核酸酶保护法检测它们与互补寡聚核苷酸杂交的能力来评价。

本发明所述的反义寡聚核苷酸和核酶都能够用已知的方法来制备。这些方法包括化学合成法，如固相氨基磷酸盐化学合成法。另外，反义RNA分子还能够通过编码该RNA分子的DNA序列的体内或体外转录产生。这些DNA序列能够被连接到广泛范围内的载体上，这些载体可结合如T7或SP6聚合酶启动子等合适的RNA聚合酶启动子。

本发明所述的对寡聚核苷酸的各种修饰能够用来作为增加它们的细胞内稳定性和半寿期的方法。可能的修饰方法包括但不限于向分子的5′端或3′端加上核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸旁侧序列，或在寡聚核苷酸骨架内使用硫代磷酸酯或2′-O-甲基替换磷酸二酯酶键合。

5.6.抗体

本发明还提供了结合aveR1基因产物，aveR2基因产物，或同源多肽，或本发明的肽片段的多克隆抗体和单克隆抗体。这些抗体能够用作亲和试剂来纯化天然的aveR1或aveR2的基因产物，或分析aveR1或aveR2基因产物的活性或生物功能。

抗体能够使用本发明所述的任一aveR1-或aveR2-相关多肽作抗原来制备。包括但不限于奶牛，马，兔子，山羊，绵羊，和鼠的各种宿主动物都能够根据已知的方法用来产生抗AveR1或抗AveR2的特异性抗体。已知被使用的各种佐剂都可用来增加抗体的产生量。

多克隆抗体能够从被免疫动物获得，并可用标准方法检测它抗AveR1或抗AveR2的特异性。另外，AveR1或AveR2的单克隆抗体能够用任何从连续细胞系在培养基中产生抗体分子的方法制备。这些方法包括但不限于Kohler和Milstein最初叙述的杂交瘤技术(自然，1975，256：495-497)；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor，等，1983.Immunology Tody 4：72：Cote，等，1983，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 80：2026-2030)；和EB病毒-杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体与癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。另外，能够采用生产单链抗体的技术(见例如，美国专利4,946,778)来产生AveR1或AveR2特异性的单链抗体。这些出版物在此引作参考。

本发明包括了含有AveR1或AveR2多肽特异性结合位点的抗体片段，这些抗体片段能够由已知的方法产生。这些片段包括但不限于由胃蛋白酶消化完整抗体分子所产生的(Fab′)₂片段，通过还原(Fab′)₂片段的二硫键产生的Fab片段。另外，能够构建Fab的表达文库(Huse等，1989，科学246：1275-1281)以容许对具有所要的AveR1或AveR2多肽特异性的Fab片段进行快速鉴定。

制备单克隆抗体和抗体片段的方法在本技术领域是公知的，在其它地方有更多的叙述，如Harlow和Lane，1988，抗体：实验手册，冷泉港；J.W.Goding，1986，单克隆抗体：规则与应用，学院出版社，伦敦。上面所引的所有出版物列于此处作为参考。

5.7.除虫菌素的应用

除虫菌素是具有高活性的抗寄生的试剂，它作为驱肠虫剂，杀寄生虫剂，杀虫剂和杀螨剂具有特殊的用途，用本发明所述的成分和方法制备的除虫菌素用于上述的这些用途。

根据本发明所述制备的除虫菌素如在本技术领域公知的那样能用来治疗人体的各种疾病或不适，特别是当这些疾病或不适是由寄生虫感染引起的时候。参见例如，Ikeda和Omura，1997，Chem Rev.97(7)：2591-2609。

根据本发明所述制备的除虫菌素能用来有效治疗各种疾病，包括例如蠕虫病，蠕虫病经常是由一组线虫寄生物引起的，它能够导致人体的疾病，在猪，绵羊，家禽，马和牛中导致严重的经济损失，以及影响家养动物的健康。因此，根据本发明所述制备的除虫菌素能用来有效抵抗影响人类的线虫，以及影响各种动物的线虫，如狗体内的恶丝虫属，和感染人体的各种寄生虫，包括胃肠寄生虫如钩虫属，板口线虫属，蛔虫属，类原线虫属，毛线虫属，毛细线虫属，鞭虫属，蛲虫属和在血液或其它组织或器官中发现的寄生虫，如丝虫和类原线虫属和毛线虫属的肠外期。

根据本发明所述制备的除虫菌素还能用来治疗外寄生感染，包括例如，由蜱，螨，虱，蚤，绿头苍蝇，叮咬昆虫，或可迁徙的双翅目幼虫导致的哺乳动物或鸟类的节肢动物感染，这些感染能够影响牛和马，以及其它动物。

根据本发明所述制备的除虫菌素还能用作杀虫剂对付家居害虫，例如蟑螂，衣蛾，皮蠹，家蝇和其它害虫，以及储存粮食和农作物的昆虫类害虫，包括蛛螨，蚜虫，毛虫，蝗虫等直翅目昆虫，以及其它害虫。

能够用本发明所述的除虫菌素治疗的动物包括绵羊，牛，马，鹿，山羊，猪，包括家禽在内的鸟类，以及狗和猫。

可将本发明制备的除虫菌素以适于特定用途的配方给药于所治疗的特定种类的宿主动物以及所涉及的寄生物或昆虫。当用作杀寄生物的试剂时，本发明所述的一种除虫菌素可以胶囊，丸剂，片剂或口服液的方式口服给药，或以输液，注射或植入物的方式给药。这些配方可以根据标准的兽医学常规方法获得。因此，胶囊，丸剂或片剂可以通过混合活性成分与适度细的填料或附加的含有分解剂和/或粘和剂的载体例如淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁等来制备。口服液配方能够通过分散活性成分在含有分散剂或水浸剂等的水相溶液中来制备。针剂配方能够以含有别的物质例如足够的盐和/或葡萄糖使溶液与血液等渗的无菌溶液的形式来制备。

这些配方会根据依病人而定的活性化合物的量、或要治疗的宿主动物的种类、感染的类型和严重程度、宿主的体重而变化。总的来说，对口服给药来说，每千克体重的病人或动物所给活性成分的剂量为从大约0.001到10毫克，一次给予或从1到5天的时间内分多次给予都能满足需要。然而，基于临床症状，医生或兽医可能决定给予较高或较低范围的剂量。

另外，据本发明制备的除虫菌素，能够和动物饲料一起使用，为此，可将其与正常动物饲料混合制备成添加剂或预混合液。

当用作杀虫剂来杀灭农业害虫时，本发明所述的混合物可以根据农业实践标准制成喷雾剂，粉剂，乳剂等。

下面所列的实施例仅用于说明，并非是限制本发明的范围。

6.实施例：aveR1和aveR2基因基因的分离

下面的实施例叙述了编码aveR1和aveR2基因产物，参与除虫菌素生物合成的调节的阿维链霉菌的两个新基因的分离和鉴定。

6.1.用于DNA分离的阿维链霉菌的培养

在半浓度YPD-6培养基上分离阿维链霉菌ATCC 31272(单菌落分离物2号)的单菌落，半浓度YPD-6培养基含有：Difco酵母提取物5g；Difco细菌用蛋白胨5g；葡萄糖2.5g；MOPS[3-(N-吗啡啉)丙磺酸]5g；Difco细菌用琼脂粉15g。用蒸馏水将最终体积加到1升，将pH值调到7.0，培养基在121℃高压灭菌25分钟。将在上述培养基上生长的菌丝体接种到25mm×150mm试管中的10mlTSB培养基(将Difco胰酶大豆肉汤溶于1升蒸馏水，121℃高压灭菌25分钟)中，在试管中300转/分钟、28℃振荡培养48-72小时。

6.2.阿维链霉菌的染色体的分离

将如上所述培养的等份菌丝体试样(0.25ml或0.5ml)置于1.5ml微量离心管中，在12,000×g离心60秒收集细胞。弃去上清，将细胞重新悬浮于0.25ml含有2mg/ml溶菌酶的TSE缓冲液(20ml 1.5M蔗糖，2.5ml 1M Tris HCl，2.5ml1M EDTA，pH8.0，75ml蒸馏水)中。样品在37℃振摇培养20分钟，然后加到AutoGen 540^TM自动核酸分离仪(Ingrated Seperation Systems，Natick，MA)中，根据制造商的说明使用Cycle 159程序(仪器软件)分离基因组DNA。

或者，将5ml菌丝体加到17mm×100mm的试管中，在3000rpm离心5分钟收集细胞，移弃上清。细胞重新悬浮于1ml TSE缓冲液中，在3000rpm离心5分钟，移弃上清。细胞重新悬浮于含有2mg/ml溶菌酶的1ml TSE缓冲液中，在37℃振摇培养30-60分钟。培养后，加入0.5ml 10％的SDS，在37℃培养细胞直至裂解完全。裂解物在65℃培养10分钟，冷却至室温，分入两个1.5mlEppendorf管中，用0.5ml苯酚/氯仿(50％预先用0.5M pH8.0 Tris平衡的苯酚；50％氯仿)抽提一次。移出水相，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2-5次。加入1/10体积的3M pH4.8的醋酸钠溶液来沉淀DNA，将混合物冰浴10分钟，15,000rmp，5℃离心10分钟，将上清移于干净的试管中，加入1倍体积的异丙醇。混合物然后冰浴20分钟，15,000rmp，5℃离心20分钟，移弃上清，DNA沉淀70％乙醇清洗1次。沉淀干燥后，用TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA pH8.0)重新悬浮DNA。

6.3.阿维链霉菌质粒DNA的分离

将一份菌丝体样(1.0ml)加到1.5ml微量离心管中，12,000×g离心60秒收集细胞。弃去上清，细胞重悬浮于1.0ml 10.3％蔗糖中，12000×g离心60秒，弃去上清。细胞然后重新悬浮于含2mg/ml溶菌酶的1ml TSE缓冲液中，37℃振摇培养20分钟，加到AutoGen 540^TM自动核酸分离仪上，根据生产商的说明使用Cycle 106程序(仪器软件)分离质粒DNA。

或者，将1.5ml菌丝体加到1.5ml微量离心管中，12,000×g离心60秒收集细胞。弃去上清，细胞重新悬浮于1.0ml 10.3％蔗糖中，12,000×g离心60秒收集细胞，弃去上清。细胞重新悬浮于含有2mg/ml溶菌酶的0.5ml TSE缓冲液中37℃培养15-30分钟。培养后，加入0.25ml碱性SDS(0.3N NaOH，2％SDS)55℃培养细胞15-30分钟或培养细胞直到溶液呈清亮状。然后向DNA溶液加入醋酸钠溶液(0.1ml，3M，pH4.8)，冰浴10分钟。DNA样品在14,000rpm，5℃离心10分钟。将上清液移入一个干净的试管中，加入0.2ml苯酚∶氯仿(50％苯酚∶50％氯仿)，轻轻混合。DNA溶液在14,000rpm，5℃离心10分钟，将上层液移入一个干净的Eppendorf管中。加入异丙醇(0.75ml)，轻轻混合，然后室温温育20分钟。DNA溶液在14,000rpm，5℃离心15分钟，移弃上清，DNA沉淀用70％乙醇清洗，干燥，然后重新悬浮于TE缓冲液中。

6.4.从大肠杆菌分中离质粒DNA

将转化的大肠杆菌单菌落接入含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中(细菌用胰蛋白胨10g；细菌用酵母提取物5g；NaCl 10g，加蒸馏水至1升，pH7.0，在121℃高压灭菌25分钟)。培养物温育过夜，将1ml试样加入1.5ml微量离心管中。将培养液样品加到AutoGen 540^TM自动核酸分离仪上，根据制造商的说明使用Cycle 3程序(仪器软件)分离质粒DNA。

6.5.阿维链霉菌原生质体的制备和转化

在半浓度的YPD-6培养基上分离阿维链霉菌单菌落。将菌丝体接入含10mlTSB培养基的25mm×150mm试管中，在300rpm，28℃振荡培养48小时。将1ml菌丝体接种到50ml YEME培养基中。每升YEME培养基中含有：Difco酵母提取物3g；Difco细菌用蛋白胨5g；Difco麦芽提取物3g；和蔗糖300g。在121℃高压灭菌25分钟后加入：2.5M MgCl₂ 6H₂O(单独在121℃高压灭菌25分钟)2ml；和甘氨酸(20％)(经过滤除菌)25ml。

菌丝体在30℃生长48-72小时，并在50ml离心管(Falcon产)中3,000rpm，20分钟离心收集。弃去上清，菌丝体重新悬浮在P缓冲液中，P缓冲液含有：蔗糖205g；K₂SO₄ 0.25g；MgCl₂·6H₂O2.02g；水600ml；K₂PO₄(0.5％)10ml；微量元素溶液20ml；CaCl₂·2H₂O(3.68％)100ml；MES[2-(N-吗啡啉)乙磺酸]缓冲液(1.0M，pH6.5)10ml；[每升微量元素溶液含有：ZnCl₂2 40mg；FeCl₃·6H₂O 200mg；CuCl₂·H₂O 10mg；MnCl₂·4H₂O 10mg；Na₂B₄O₇·4H₂O 10mg；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 10mg]。将pH值调到6.5，最后体积加到1升，培养基用0.45微米的滤膜加热过滤。

菌丝体在3,000rpm离心20分钟，弃去上清。菌丝体重新悬浮在20ml含有2mg/ml溶菌酶的P缓冲液中。菌丝体在35℃振摇培养15分钟，在显微镜下检查原生质体形成的程度。当原生质体完全形成后，将原生质体在8,000rpm离心10分钟。移弃上清，将原生质体重新悬浮于10ml P缓冲液中。将原生质体在8,000rpm离心10分钟，移弃上清，将原生质重新悬浮于2ml P缓冲液中，向每一2.0ml降温小管(Nalgene产)中加入大约1×10⁹个原生质体。

将一个含1×10⁹个原生质体的降温小管在8,000rpm离心10分钟，移弃上清，将原生质体重新悬浮于0.1ml P缓冲液中。将2-5μg要转化的DNA加到原生质体中，随后立即加入0.5ml工作T缓冲液。T缓冲液母液含有：PEG1000(Sigma产)25g；蔗糖2.5g；和水83ml。用过滤除菌的1N NaOH将PH调到8.8，T缓冲液母液经过滤除菌，贮存在4℃。T缓冲液在使用的当天制备，含有：T缓冲液母液8.3ml；；K₂PO₄(4mM)1.0ml；CaCl₂·2H₂O(5mM)的0.2ml；TES(1M，pH8)0.5ml。使用T缓冲液的各个组分都经过滤除菌，在4℃贮存。

在向原生质体中加入T缓冲液的20秒内，还加入1.0ml P缓冲液并将原生质体在8,000rpm离心10分钟。弃去上清，将原生质体重新县浮于0.1ml P缓冲液中。然后将原生质体铺平板于RM14培养基上，RM14培养基含有：蔗糖205g；K₂SO₄ 0.25g；MgCl₂·6H₂O10.12g；葡萄糖10g；Difco酪蛋白氨基酸0.1g；Difico酵母提取物5g Difco燕麦片琼脂粉3g；Difco细菌用琼指粉22g；和水800ml。溶液在121℃高压灭菌25分钟。高压灭菌后加入下列无菌的贮备液：K₂PO₄(0.5％)10ml；CaCl₂·2H₂O(5M)5ml；L-脯氨酸(20％)15ml；MES[2-(N-吗啡啉)乙磺酸]缓冲液(1.0M，pH6.5)10ml；微量元素溶液(同上)2ml；环已酰胺贮存液(25mg/ml)40ml；和1N NaOH 2ml。向每块平板加入25ml RM14培养基，平板在使用前干燥24小时。

原生质体在95％的湿度，30℃培养20-24小时。为挑选红霉素抗性的转化体，在RM14重生平板上均匀涂上1ml含有125μg红霉素(使红霉素的最终浓度为5μg/ml)的覆盖缓冲液。每100ml覆盖缓冲液含有：蔗糖10.3g；微量元素溶液(同上)0.2ml；MES(1.0M，pH6.5)1ml。原生质体在95％的温度，30℃培养7-14天直到能见到红霉素抗性(Erm^r)的菌落。

6.6.阿维链霉菌菌株的发酵分析

将在半浓度的YPD-6培养基上生长4-7天的阿维链霉菌菌丝体，接种到含有8ml生长培养基和两个直径55mm玻璃珠的1×6英寸的试管中。生长培养基含有：可溶性淀粉(稀释的已煮淀粉或KOSO，Japan Corn Starch Co.，Nagoya)20g/ml；药性培养基(Trader′s Protein，Memphis TN)15g/L；Ardamine pH(Champlain，Inc.Clifton，NJ)5g/L；CaCO₃ 2g/L；2×支链脂肪酸，培养基中含有终浓度为50ppm的2-(±)-甲基丁酸，60ppm的异丁酸和20ppm的异戊酸。将pH值调至7.2，培养基在121℃高压灭菌25分钟。

试管在17度倾角、215rpm、29℃振荡培养3天。2ml等份试样的种子培养液接入含25ml生产培养基的300ml锥形瓶中。生产培养基含有：可溶性淀粉(稀释的已煮淀粉或KOSO)160g/L；营养豆粉(Archer DanielsMidland，Decatur，IL)10g/L；Ardamine pH 10g/L；K₂HPO₄ 2g/L；Mg₂SO₄·4H₂O2g/L；FeSO₄·7H₂O 0.02g/L；MnCl₂ 0.002g/L；ZnSO₄·7H₂O0.002g/L；CaCO₃ 14g/L；和2×支链脂肪酸(如上)。将pH值调至6.9，培养基在121℃高压灭菌25分钟。

接种后，锥形瓶在29℃，215rpm振荡培养12天。培养后，取出2ml试样，用8ml甲醇稀释，混合，在1250×g离心10分钟以沉降碎片。然后使用贝克曼氏Ultrasphere ODS(25cm×4.6mmID)柱，用高效液相色谱(HPLC)分析上清液，柱流速为0.75ml/min，吸光度检测在240nm处。流动相是86/8.9/5.1的甲醇/水/乙腈。

6.6.阿维链霉菌PKS基因的鉴定和分离

制备阿维链霉菌(ATCC 31272)染色体DNA的粘粒文库并和从红色糖多孢菌聚酮化合物合酶(PKS)基因片段制备的酮合酶(KS)探针杂交。粘粒文库建立的详细叙述可见于上述Sambrook等，1989的文献。链霉菌染色体DNA文库建立的详细叙述见于Hopwood等，1985，如上述。含有酮合酶杂交区的粘粒克隆可通过与pEX26(由Dr.P.Leadley，Cambridge，UK惠赠)质粒2.7kb Nde I/Eco47III酶切片段杂交来鉴定。用限制性内切核酶Nde I和Eco47III消化大约5μg的pEX26质粒。反应混合物加到0.8％ SeaPlaque^TM GTG琼脂糖凝胶(FMC生物制品，Rockland，ME)上。电泳后从胶上切下2.7kb Nde I/Eco47III酶切片段，采用快速方法使用GELase^TM(Epicentre Technologies)试剂盒从胶中回收DNA。依照供应商的说明，使用BRL Nick翻译体系(BRL LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)用[α-³²P]脱氧胞苷酸(脱氧胞苷酸5’-三磷酸，三乙氨基季铵盐，[α-³²P])(NEN-Dupont，Boston，MA)标记2.7kbNdeI/Eco47III片段。典型的反应是在0.05毫升体积中进行。加入5μl终止缓冲液后，依照供应商的说明使用G-25 Sephedax Quick Spin^TM柱(BoehrigerMannheim公司)从未标记的核苷酸中回收标记的DNA。

通过菌落杂交法筛选出大约1800个粘粒克隆。鉴定出十个与红色糖多孢菌KS(酮合酶)探针强烈杂交的克隆。含有粘粒DNA的大肠杆菌菌落在LB液体培养基中培养，依照制造商的说明在AutoGen 540^TM自动核酸分离仪上使用Cycle3程序(仪器软件)从各培养液中分离粘粒DNA。限制性内切酶图谱和Sourth杂交分析显示有五个克隆含有互相重叠的染色体区域。通过分析重叠的粘粒和杂交构建出阿维链霉菌基因组的5个粘粒(pSE65，pSE66，pSE67，pSE6S，pSE69)的BamH I限制内切酶图谱(图4)。

6.8.调节基因ORFs的鉴定

下列方法用于源自pSE68克隆的亚克隆片段。用Xba I和Eco I酶消化pSE68质粒(5μg)。反应混合物加到0.8％SeaPlaque^TM GTG琼脂糖凝胶(FMC生物制品)上，电泳后从胶上切下一个大约19kb的Xba I/EcoR I片段，采用快速方法使用GELase^TM(Epicentre Technologies)试剂盒回收DNA。用Xba I和EcoR I酶消化大约5μg的pGEM7Zf(+)质粒(Promega)。大约0.5μg的19kb XbaI/EcoR I酶切片段和0.5μg的消化的pGEM7Zf(+)质粒混合在一起，根据供应商的说明，在20μl体系中和1单位连接酶(New England Biolabs.Inc.，Beverly，MA)一起在15℃保温过夜。保温过夜后，5μl的连接混合物在70℃孵育10分钟，冷却至室温，然后根据制造商的说明转化感受态大肠杆菌DH5α细胞(BRL)。从抗氨苄青霉素的转化体中分离质粒DNA，通过限制酶切分析证实～19kb Xba I/EcoR I酶切片段的插入。该质粒被命名为pSE200。

依照制造商的说明采用Erase-a-Base系统(Promega)通过外切核酸酶III消化来进一步修饰pSE200质粒。用ClaI酶消化5μg pSE200质粒。Cla I酶产生5′突出，依照制造商的说明通过加上α-硫代磷酸酯脱氧核糖核苷酸来保护该突出不被外切核酸酶消化。然后用EcoR I酶消化pSE200质粒，用核酸酶S1在从30秒到12分的不同时间内消化各等份试样。pSE200质粒被核酸酶S1处理后的样品连接过夜，依照制造商的说明转化大肠杆菌HB101(BRL公司产)感受态细胞。从氨苄青霉素抗性的转化体中分离质粒DNA，插入DNA片段的大小可以通过限制酶切分析来鉴定。鉴定出的一个含有～5.9kb插入片段的分离物，命名为pSE201(图2A)，贮存于ATCC(美国标准培养物收藏中心)(接收号：203182)。鉴定出的第二个分离物含有～8.8kb插入片段，命名为pSE210(图2B)。

依照制造商的说明用质粒DNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离大约10μg的pSE201质粒。pSE201质粒用ABI 373自动DNA测序仪(PerkinElmer，Foster City，CA)测序，收集序列数据并用遗传计算机组程序(GCG，Maldison，WI)对它进行编辑。调节基因aveR1和AveR2 ORFs的序列完全相同显示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中。aveR1 ORF为从SEQ ID NO.1的1112位核苷酸到2317位核苷酸。aveR2 ORF为从SEQ ID NO：1的2314位核苷酸到3201位核苷酸。

从阿维链霉菌的aveR1 ORF推断出的氨基酸序列与从天蓝色链霉菌推断出的asbA1基因产物(Brian等，1996，J.细菌学178：3221-3231)比较有32％的同一性(图1A)。从阿维链霉菌的aveR2 ORF推断出的氨基酸序列与从天蓝色链霉菌推断出的asbA2基因产物比较有45％的同一性(图1B)。

6.9基因置换型载体的构建和使用

向链霉菌基因中引入突变的技术的一般叙述见于：Kieser和Hopwood，1991，Meth.Enzym.204：430-458。更详细的叙述见于：Anzai等1998，J.Antibiot.XLI(2)：226-233；Stutzman-Engwall等，1992，J.Bacteriol.174(1)：144-154；Oh和Chater，1997，J.Bact.179：122-127。这些出版物在此引作参考。

6.9.1 aveR1和aveR2基因的失活

如下所述，通过用红色糖多孢菌的红霉素抗性基因(ermE)置换pSE210(图2B)质粒中的一个988bpBgl II/Stu I酶切片段可以失活aveR1和AveR2这两个基因。用Bgl II酶和Stu I酶消化大约5μg的pSE210质粒释放一个～10.8kb的片段。Bgl II酶切片段在终浓度为100μM的dNTPs，1×Klenow酶缓冲液和1U Klenow酶(Boehringer Mannheim)中37℃培养30分钟，以填平末端。从琼脂糖凝胶中纯化的～10.8kb片段，在1×碱性磷酸酶缓冲液和1U碱性磷酸酶中50℃培养1小时来对末端脱磷酸。培养后如6.3节所述，脱磷酸片段经苯酚/氯仿抽提纯化后重新悬浮于TE缓冲液中。通过用Bgl II酶消化从pIJ4026质粒(由John Innes Institute，Norwich，UK.提供；也见于Bibb等，1985，基因41：357-368)中分离ermE基因，然后ermE片段在终浓度为100μM的dNTPs，1×Klenow酶缓冲液和1U Klenow酶中37℃培养30分钟，以填平Bgl II末端。0.5μg的从琼脂糖凝胶中纯化的～1.7kb的ermE基因片段，与0.5μg的～10.8kb片段混合并连接。依照制造商的说明用连接混合物转化感受态大肠杆菌HB101细胞(BRL公司)。从氨苄青霉素抗性的转化体中分离质粒DNA，ermE基因的插入由限制酶切分析来证实。该质粒命名为pSE214(图3A)，被转化到大肠杆菌DM1(BRL公司)中，从氨苄青霉素抗性的转化体中分离质粒DNA。插入的ermE基因置换了988bp的Bgl II/Stu I酶切片段，从aveR1基因中去掉了725个碱基对，从aveR2基因中去掉了232个碱基对。

pSE214质粒在阿维链霉菌中不能自主复制，被用作基因置换型载体用于如下所述的整合基因置换。根据如上所述的Oh和Chater，1997的步聚，向8μl的pSE214(1μg)质粒中加入2μl的1MNaOH来变性，37℃培养30分钟，然后快速在冰上冷激，然后加入2μl的1M盐酸，用变性的pSE214质粒转化阿维链霉菌的原生质体。转化体在要求红霉素基因表达的选择性条件下再生从而诱导质粒的整合基因重组到宿主细胞染色体上。既然质粒不能自主复制，红霉素抗性转化体应该含有整合到染色体上的质粒序列，或者通过ermE基因侧边的两个DNA片段之一和它们在染色体上的同源对应序列之间的单一同源重组事件，这会导致整个的pSE214载体的整合，或者通过双交换即在突变基因侧边的第二个DNA片段和它在染色体上的同源对应片段之间发生了第二次重组事件，这会导致pSE214质粒上的aveR1/aveR2(失活的)序列交换到染色体上以及野生型等位基因和载体序列同时从染色体上丢失。分离到的红霉素抗性转化体经PCR筛选来验证载体主链的存在。所有转化体都失去了载体主链，说明发生了双交换事件，染色体上的aveR1/aveR2基因序列被aveR1/aveR2缺失序列置换掉了。用HPLC分析红霉素抗性转化体的发酵产物。含有aveR1/aveR2基因缺失的阿维链霉菌菌株产生的除虫菌素总量平均为对照的3.4倍(表1)。

6.9.2 aveR2基因的失活

如下所述，通过向pSE210质粒(图2B)的Bgl II位点插入ermE基因，并在阿维链霉菌中使用构建的质粒作为基因置换载体，可以失活aveR2基因。用BglII酶消化大约5μg的pSE210质粒。然后线性化的pSE210质粒在1×碱性磷酸酶缓冲液和1U碱性磷酸酶中50℃培养1小时来对末端脱磷酸。用Bgl II酶消化从pIJ4026质粒中分离ermE基因，电泳，然后从胶中纯化～1.7kb的ermE基因片段。约0.5μg的线性化的pSE210和0.5μg的ermE基因片段混合并连接。依照制造商的说明用连接混合物转化感受态大肠杆菌HB101细胞(BRL公司)。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，ermE基因的插入由限制酶切分析来证实。该质粒命名为pSE216(图3B)，根据制造商的说明将其转化到大肠杆菌DM1(BRL公司)中，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA。

pSE216质粒在阿维链霉菌中不能自主复制，被用作基因置换载体用于如下所述的整合基因置换。向8μl的pSE216质粒DNA中加入2μl的1M NaOH来变性，37℃培养30分钟，然后快速在冰上冷激，然后加入2μl的1M盐酸(Oh和Chater，1997，同上)。用变性的pSE216质粒转化阿维链霉菌的原生质体。转化体在要求红霉素基因表达的选择性条件下再生从而诱导质粒的整合基因重组到宿主细胞的染色体上。既然质粒不能自主复制，红霉素抗性转化体应该含有整合到染色体上的质粒序列，或者通过ermE基因侧边的两个DNA片段之一和它们在染色体上的对应序列之间的单一同源重组事件，这会导致整个的pSE216载体的整合，或者通过双交换即在突变基因侧边的第二个DNA片段和它在染色体上的同源对应片段之间发生了第二次重组事件，这会导致pSE216质粒上的aveR2(失活的)序列交换到染色体上以及野生型等位基因和载体序列同时从染色体上丢失。分离到的红霉素抗性转化体经PCR筛选来验证载体主链的存在。所有转化体都失去了载体主链，说明发生了双交换事件，染色体上的aveR2基因序列被失活的aveR2序列置换掉了。用HPLC分析红霉素抗性转化体的发酵产物。含有失活的aveR2基因的阿维链霉菌菌株产生的除虫菌素总量平均为对照株的3.1倍(表1)。

表一

	对照5个培养物的平均	aveR1/aveR2缺失4个培养物的平均	aveR1/aveR插入6个培养物的平均
	对照5个培养物的平均	aveR1/aveR2缺失4个培养物的平均	aveR1/aveR插入6个培养物的平均	除虫菌素总的相对量	1	3.4	3.1

如下的生物材料保存于美国典型培养物中心(ATCC)，地址：12301Parklawn Drive.Rockville，MD，20852，USA，1998年9月接受，保藏号为：

质粒保藏号.

质粒pSE 201 203182

所有的专利，专利申请，和出版物完全地列于此处作为参考。

本发明不局限于此处的实施例所描述的范围，这些实施例是本发明各个方面的单个示例，具同等功能的方法和材料也属于本发明的范围。事实上，除此处展示和描述的对本发明的各种变更也显而易见在技术上来源于前面的描述和附加的方案。这些变更被认为落在后面所附的权利要求的范围内。

序列表<110>PFIZER PRODUCTS INC.<120>增加阿维菌素产量的阿维链霉菌调节基因<130>PC9944A<140><141><150>60/100,134<151>1998-09-14<160>4<170>Patentrn Ver.2.0-beta<210>1<211>5045<212>DNA<213>阿维链霉菌<220><221>CDS<222>(1112)..(2317)<223>aveR1 ORF<400>1cgagttgctg gtcatcggcg tactcctccc ggcgactccg cccggtactc gaccgcggca 60gcggtcagcc gcatgaacgc ctcttcgaga gacacggtct tccgcgtcac ctcgtgcacc 120gtcacggcgt gcgccgcgac gagttcgccg atccgctccg cggcggcggc caccttcagg 180ctgccgtcgg agcagtcggt gaccgtgatt cccgcgccga ccagcacgtc gcgcagccgc 240cgcggttccg gagtgcgcac ccgcaccccc acgtccgtgt acctgtcgat gaactcgctc 300atgctggtgt ccgcgaggag ccgaccgcgg ccgatgatga cgaggtggtc cacggtgagc 360gccgcctcgc tcatcagatg gctggacacg aagacggtgc gtccctgtgc cgccaggtcc 420cgcatgaggt gccgcagcca caggacgcct tccgggtcga gcccgttgac cggctcgtcg 480agcaccagga cggcggggtc gccgagcagc gccgcggcga ttcccagccg ctgactcatg 540cccagcgaga acgtccccgc ccgccggcgc acggcgctcc gcaggcccgc cagctcgatc 600acctcacgga cgcggcgggg cgggatccgg ttgctgcggg ccagccagcg caagtggttc 660agcgcggttc ggccggggtg caccgccctg gcgtcgagca gtgcccccac cgtccgcagc 720gggtcgcgga gccgctggta gggcgcgccg tcgatgcgta cctcgccggc cgtcgggcgg 780tccaggccca gcatcatgcg catcgcggtg gacttcccgg cgccgttggg gccaaggaat 840ccggtcaccc gaccggtccg tacctggaag gtaagaccct ccacaacggt ggtggtcccg 900tagcgcttgg tcaggtccgt gacttcgatc atgccggtga tggtccgtga cgacaggctc 960ccgccgcgtc ccgctcgggg ctgactgccc cttctccacc cccggttgga gaatgaccgc 1020cacccgcggc cgcgcatcag gctgcaggag gagcggcttt gaccaccgct ggacggaggc 1080ggagcggcgt acgcctggat atggtcgagc g gtg cat gca ggt acc gcg gtg 1132

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75 80 85gtg ctg gcg gtg acc gcc gtg gcc gtc gtg cgg gac gcg gcg tgg gac 1420Val Leu Ala Val Thr Ala Val Ala Val Val Arg Asp Ala Ala Trp Asp

90 95 100ccg ttc ctg tcg gcg gcg ttc gcc ctc tac acc gtc gcc gtc acg gtg 1468Pro Phe Leu Ser Ala Ala Phe Ala Leu Tyr Thr Val Ala Val Thr Val

105 110 115ccc tcg cgc cac tgg tgg caa cgc tgg tta ccc ggc ctg gcg atc gct 1516Pro Ser Arg His Trp Trp Gln Arg Trp Leu Pro Gly Leu Ala Ile Ala120 125 130 135ttg ctg acc gtg gcc ggc ctt gcc gga gca gcg cgt gcc ggc gag gcc 1564Leu Leu Thr Val Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Arg Ala Gly Glu Ala

140 145 150ttc tgg tgg cgc ggc agc ccc ggt ctg ctg ctg ctc ggc ttc gcc gca 1612Phe Trp Trp Arg Gly Ser Pro Gly Leu Leu Leu Leu Gly Phe Ala Ala

155 160 165ctg ctc ggc gcc tgg caa ctg gga cgc gcc gcg cgg cag agg cgc gca 1660Leu Leu Gly Ala Trp Gln Leu Gly Arg Ala Ala Arg Gln Arg Arg Ala

170 175 180ttc gcc gtc cgg gcg gcc gag cag ctc gca caa cgg gcc gtc acg gag 1705Phe Ala Val Arg Ala Ala Glu Gln Leu Ala Gln Arg Ala Val Thr Glu

185 190 195gaa cgc ctg cgg ata gcc cgc gaa ctg cat gac gtc gtc acg cac agc 1756Glu Arg Leu Arg Ile Ala Arg Glu Leu His Asp Val Val Thr His Ser200 205 210 215atg ggc ctg atc gcg gtc aag gtc ggc gtc gcc aac cac gtg ttg cac 1804Met Gly Leu Ile Ala Val Lys Val Gly Val Ala Asn His Val Leu His

220 225 230atc agg ccg cag gag gcg tac gac gcg ctc cag gtc atc gaa cgc acg 1852Ile Arg Pro Gln Glu Ala Tyr Asp Ala Leu Gln Val Ile Glu Arg Thr

235 240 245agc cgc acc gcg ctg aac gac atg cgc cgg atg ctc ggt gtg ctg cgt 1900Ser Arg Thr Ala Leu Asn Asp Met Arg Arg Met Leu Gly Val Leu Arg

250 255 260acg tcc gag ggt gag cgg cag tca gcg gct ctc ggc ccg ctg cct ggc 1948Thr Ser Glu Gly Glu Arg Gln Ser Ala Ala Leu Gly Pro Leu Pro Gly

265 270 275gcc ctt gct ctc cct gac ctc gtc ggg cag gcc ggc gcg cag ctg act 1996Ala Leu Ala Leu Pro Asp Leu Val Gly Gln Ala Gly Ala Gln Leu Thr280 285 290 295atg cgc ggt gtc gag agt ctg ccc gac gga gtc gcg ctg gcc gtc tac 2044Met Arg Gly Val Glu Ser Leu Pro Asp Gly Val Ala Leu Ala Val Tyr

300 305 310cgg atc gtg cag gag gcg ctc acc aat gtc gcc aag cac gcc ggc ccg 2092Arg Ile Val Gln Glu Ala Leu Thr Asn Val Ala Lys His Ala Gly Pro

315 320 325gag gcc cgc tgc cgg gtg gcg gtc gat gcg aac ggc cac ggc gtc cgg 2140Glu Ala Arg Cys Arg Val Ala Val Asp Ala Asn Gly His Gly Val Arg

330 335 340ctc gag ata acc gac gac gga ggc gac cgg agc ccc ctc gcg ccg aag 2188Leu Glu Ile Thr Asp Asp Gly Gly Asp Arg Ser Pro Leu Ala Pro Lys

345 350 355ccc ggc ggc cac gga atc gtc ggc atg cgc gaa cgc gtc gcc ctg tac 2236Pro Gly Gly His Gly Ile Val Gly Met Arg Glu Arg Val Ala Leu Tyr360 365 370 375ggc ggc acc ttc gcc gcc gga ccg cgt cca gag ggc ggc ttc gcg gta 2284Gly Gly Thr Phe Ala Ala Gly Pro Arg Pro Glu Gly Gly Phe Ala Val

380 385 390cac gcg tcc ctg ccg tac gag gag aac aca tga cccggcccgc cgatccgccc 2337His Ala Ser Leu Pro Tyr Glu Glu Asn Thr

395 400ggtgccccgg tccgggtcct catcgccgac gaccaggcgc tgctgcgcgg cagcctgcgg 2397gtgctcgtcg acaccgagcc cggcctggtg gccacgtcgg aggcggcgac cggcacggag 2457gcggtgcggc ttgcccggca ggatccgccg gacgtggtcc tgatggacgt gcggatgccc 2517gaaatggatg gcatcgaggc gacccggcag atctgcggtt cccccgagac cgcggacgtc 2577aaagtgctga tcctgacgat gttcgacctg gacgagtacg tctacgccgc gctgcgggcc 2637ggtgccagcg gcttcctgct gaaggacacg ccgcccagcg agttgctcgc ggcggtacgg 2697gtcatcgccg ccggcgaggc gctgctggca ccggccgtga cgcggcgcct gatcgcggag 2757ttcgtccacc gcccggagcc ctcgcgaccg ctgcgtcgca ccctggacgg cgtgaccgag 2817cgcgaacgtg aagtcctcac cctcatcgcc tgcggcctgt ccaacaccga gatcgccgag 2877cggctgtatc tcggcattgc caccgtgaag acccacgtca gccacctgct caccaagctc 2937gccacccgcg atcgcgctca gttggtgatc gtcgcgtacg agagcggcct ggtcacggtg 2997gcgcgaccac cgatcggttc ctgaggggcg ccggcgcaca cggtgcacgg cctgggcggg 3057gccgttcaga atggatcacc cgggtacacg aggcgcagtt cgtcgacatg gctcatgagg 3117tactcaccgg ggcactgggt ggatgccggg gcccgggact gcttcttgcg cggctggtgg 3177ccccagacgc tgctgatgcc gaagcggacg gccaggacgt ccacgaggac gtcgagtgtt 3237gtgagttgct tgggcgtcgg gtggtcgtag cgtgcccact ggttctgcca gcgcggtccg 3297aagtcgccgg tgagcacgat gccgagattg ccggcgttga agagttcagc gtgtgagccc 3357tcgatgccga gtggccgccc ctcgtagatc gtcccggcgc cgtcgatgat gtagtggtaa 3417ccgatgtcgg ccttgtcgtc cgcgaagtgc gcccgctgga tcgtgcgcgg gccctcatgc 3477gtgtacgtga cggggtcggc cgagtggtgg atggtgatcc agcggtagac ggaggccagg 3537ggccggttct cgctgagcgg tacgggactg ccgcggtagg gcggtggcgc gagggggccg 3597gaggcggcct cgtggaaatc ccaggtacgc agcggggggt cgatctgcgg cggggccgcc 3657ccccaggtgg cgcggccgac gacggacacg gtcagcggcc ctcgcggtgt catggcccac 3717aactcgtagt cgccgctcgc cggatgcagg aagcgcgact cgtcccagca ggcggcgacg 3777gggccgtgcg cggtgtcgac cggccgggtg ccgcaggacg tcagcctcag gggagtccgg 3837tgcgggcgct gccccgagac cggcgcgttg aaccggccga tgtcggtgat cacggtggtg 3897cggagttccg acaggtcgta gccgtcgcgg gggcattcga gggagcgcgg cggcggttcc 3957acgaccctga gcgccgcatc gcaccggggg cagacgagaa cgagcacctc gcgggcgacc 4017agctccgtcg tcgtaccggg cgggagccgg tggtggcggg gcagatcgag tggcgtgcgg 4077ccgggccgca gttcggtcac gggcacgggg tcggtggctt cggcggcggg tgccagctcg 4137tggtcggcgc aggcgaccgt ccaggcacgc gtcccggcgt cgggaaccat gagggtgccc 4197agcgcgtccg tcgtggccgc gatcccggaa tgccgtcctc ccgatggcgg gatgagccgt 4257acggtgaatc cggggatcgg gctgccgtcg cggcgcagga tcaccagggc cgtgtccgac 4317ggtggtgaga gttcggcggc cagccccgcc tcgacgaagt gcagcaagcg gtgtgtcagt 4377tgcagtacct cgggagagtc cggcgcgagc atggcctcgg cacggctgcg cacgctctcg 4437aacgcgccgc cgagtgcgaa gcgcaggaag tcgacggcga acgcgacgat ctccccggcg 4497acgaagccga ccgcggcgtc ggcgaagcga ggcgggccga agccaggtgc cagggggagc 4557gccggcgctc cggcactggt cctggtggcg gcgacgaacg cggtgcaacg ccggtccacg 4617gcgccgtcgt agtactcacg cagctgcgcc gccagcgagc ggtgcgggtc gaaggactcg 4677ccgaggttca ccccgtcgat gtcgcccagc agccgcggcg tcgaagcgtg gcgggcgacc 4737cagtggtcca gcgaccgacc gcggtccgcg gccggcaccc cgggcgcgtg gcgggcgcgg 4797acgtacgcgg cgagggcgcg cccgaggtca ccgctccagg tgagggcgag atccgctcga 4857ggggccgggt ccagggggcc gggcgtctgc cggtcggccc cgtcgatgcc ggccagcacc 4917tgcgccaggt cgagccgctc gaagccgtgc tgcacccgca gcagcgcggc cagccgggcg 4977gcccggcggg gcagctccca ggacgagccc ggcgtctggt cgtacggggg gatgttccgc 5037cggttctg 5045<210>2<211>401<212>PRT<213>阿维链霉菌<400>2Val His Ala Gly Thr Ala Val Asp Pro Asp Asp His Pro Ile Leu Ala1 5 10 15Arg Arg Leu Ser Arg Arg Arg Leu Ile Ala Leu Asp Gly Val Leu Val

20 25 30Phe Ala Tyr Ala Cys Ala Leu Leu Ser Thr Gly Pro Thr Gly Ile Ser

35 40 45Ser Ser Ser Ala Pro Pro Leu Pro Ala Pro Val Pro Trp Glu Arg Leu

50 55 60Val Leu Ile Ala Ala Ala Thr Ala Pro Val Ala Val Arg Arg Ile Trp65 70 75 80Pro Leu Pro Val Phe Ala Val Val Leu Ala Val Thr Ala Val Ala Val

85 90 95Val Arg Asp Ala Ala Trp Asp Pro Phe Leu Ser Ala Ala Phe Ala Leu

100 105 110Tyr Thr Val Ala Val Thr Val Pro Ser Arg His Trp Trp Gln Arg Trp

115 120 125Leu Pro Gly Leu Ala Ile Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Leu Ala Gly

130 135 140Ala Ala Arg Ala Gly Glu Ala Phe Trp Trp Arg Gly Ser Pro Gly Leu145 150 155 160Leu Leu Leu Gly Phe Ala Ala Leu Leu Gly Ala Trp Gln Leu Gly Arg

165 170 175Ala Ala Arg Gln Arg Arg Ala Phe Ala Val Arg Ala Ala Glu Gln Leu

180 185 190Ala Gln Arg Ala Val Thr Glu Glu Arg Leu Arg Ile Ala Arg Glu Leu

195 200 205His Asp Val Val Thr His Ser Met Gly Leu Ila Ala Val Lys Val Gly

210 215 220Val Ala Asn His Val Leu His Ile Arg Pro Gln Glu Ala Tyr Asp Ala225 230 235 240Leu Gln Val Ile Glu Arg Thr Ser Arg Thr Ala Leu Asn Asp Met Arg

245 250 255Arg Met Leu Gly Val Leu Arg Thr Ser Glu Gly Glu Arg Gln Ser Ala

260 265 270Ala Leu Gly Pro Leu Pro Gly Ala Leu Ala Leu Pro Asp Leu Val Gly

275 280 285Gln Ala Gly Ala Gln Leu Thr Met Arg Gly Val Glu Ser Leu Pro Asp

290 295 300Gly Val Ala Leu Ala Val Tyr Arg Ile Val Gln Glu Ala Leu Thr Asn305 310 315 320Val Ala Lys His Ala Gly Pro Glu Ala Arg Cys Arg Val Ala Val Asp

325 330 335Ala Asn Gly His Gly Val Arg Leu Glu Ile Thr Asp Asp Gly Gly Asp

340 345 350Arg Ser Pro Leu Ala Pro Lys Pro Gly Gly His Gly Ile Val Gly Met

355 360 365Arg Glu Arg Val Ala Leu Tyr Gly Gly Thr Phe Ala Ala Gly Pro Arg

370 375 380Pro Glu Gly Gly Phe Ala Val His Ala Ser Leu Pro Tyr Glu Glu Asn385 390 395 400Thr<210>3<211>5045<212>DNA<213>阿维链霉菌<220><221>CDS<222>(2314)..(3021)<223>aveR2 ORF<400>3cgagttgctg gtcatcggcg tactcctccc ggcgactccg cccggtactc gaccgcggca 60gcggtcagcc gcatgaacgc ctcttcgaga gacacggtct tccgcgtcac ctcgtgcacc 120gtcacggcgt gcgccgcgac gagttcgccg atccgctccg cggcggcggc caccttcagg 180ctgccgtcgg agcagtcggt gaccgtgatt cccgcgccga ccagcacgtc gcgcagccgc 240cgcggttccg gagtgcgcac ccgcaccccc acgtccgtgt acctgtcgat gaactcgctc 300atgctggtgt ccgcgaggag ccgaccgcgg ccgatgatga cgaggtggtc cacggtgagc 360gccgcctcgc tcatcagatg gctggacacg aagacggtgc gtccctgtgc cgccaggtcc 420cgcatgaggt gccgcagcca caggacgcct tccgggtcga gcccgttgac cggctcgtcg 480agcaccagga cggcggggtc gccgagcagc gccgcggcga ttcccagccg ctgactcatg 540cccagcgaga acgtccccgc ccgccggcgc acggcgctcc gcaggcccgc cagctcgatc 600acctcacgga cgcggcgggg cgggatccgg ttgctgcggg ccagccagcg caagtggttc 660agcgcggttc ggccggggtg caccgccctg gcgtcgagca gtgcccccac cgtccgcagc 720gggtcgcgga gccgctggta gggcgcgccg tcgatgcgta cctcgccggc cgtcgggcgg 780tccaggccca gcatcatgcg catcgcggtg gacttcccgg cgccgttggg gccaaggaat 840ccggtcaccc gaccggtccg tacctggaag gtaagaccct ccacaacggt ggtggtcccg 900tagcgcttgg tcaggtccgt gacttcgatc atgccggtga tggtccgtga cgacaggctc 960ccgccgcgtc ccgctcgggg ctgactgccc cttctccacc cccggttgga gaatgaccgc 1020cacccgcggc cgcgcatcag gctgcaggag gagcggcttt gaccaccgct ggacggaggc 1080ggagcggcgt acgcctggat atggtcgagc ggtgcatgca ggtaccgcgg tggaccccga 1140cgaccatccg atcctggccc ggcgactgag ccggcgccga ctcatcgccc tggacggcgt 1200gctcgtattc gcctacgcat gcgcgctgct gtcgaccggg ccgacaggca tctcgtcgtc 1260gtccgcgccg ccgctcccgg ccccggtgcc gtgggagcgg ctcgtgctca tcgccgcggc 1320cactgcgcct gtcgccgtac ggcggatctg gccgttgccc gtgttcgcgg tcgtgctggc 1380ggtgaccgcc gtggccgtcg tgcgggacgc ggcgtgggac ccgttcctgt cggcggcgtt 1440cgccctctac accgtcgccg tcacggtgcc ctcgcgccac tggtggcaac gctggttacc 1500cggcctggcg atcgctttgc tgaccgtggc cggccttgcc ggagcagcgc gtgccggcga 1560ggccttctgg tggcgcggca gccccggtct gctgctgctc ggcttcgccg cactgctcgg 1620cgcctggcaa ctgggacgcg ccgcgcggca gaggcgcgca ttcgccgtcc gggcggccga 1680gcagctcgca caacgggccg tcacggagga acgcctgcgg atagcccgcg aactgcatga 1740cgtcgtcacg cacagcatgg gcctgatcgc ggtcaaggtc ggcgtcgcca accacgtgtt 1800gcacatcagg ccgcaggagg cgtacgacgc gctccaggtc atcgaacgca cgagccgcac 1860cgcgctgaac gacatgcgcc ggatgctcgg tgtgctgcgt acgtccgagg gtgagcggca 1920gtcagcggct ctcggcccgc tgcctggcgc ccttgctctc cctgacctcg tcgggcaggc 1980cggcgcgcag ctgactatgc gcggtgtcga gagtctgccc gacggagtcg cgctggccgt 2040ctaccggatc gtgcaggagg cgctcaccaa tgtcgccaag cacgccggcc cggaggcccg 2100ctgccgggtg gcggtcgatg cgaacggcca cggcgtccgg ctcgagataa ccgacgacgg 2160aggcgaccgg agccccctcg cgccgaagcc cggcggccac ggaatcgtcg gcatgcgcga 2220acgcgtcgcc ctgtacggcg gcaccttcgc cgccggaccg cgtccagagg gcggcttcgc 2280ggtacacgcg tccctgccgt acgaggagaa cac atg acc cgg ccc gcc gat ccg 2334

Met Thr Arg Pro Ala Asp Pro

1 5ccc ggt gcc ccg gtc cgg gtc ctc atc gcc gac gac cag gcg ctg ctg 2382Pro Gly Ala Pro Val Arg Val Leu Ile Ala Asp Asp Gln Ala Leu Leu

10 15 20cgc ggc agc ctg cgg gtg ctc gtc gac acc gag ccc ggc ctg gtg gcc 2430Arg Gly Ser Leu Arg Val Leu Val Asp Thr Glu Pro Gly Leu Val Ala

25 30 35acg tcg gag gcg gcg acc ggc acg gag gcg gtg cgg ctt gcc cgg cag 2478Thr Ser Glu Ala Ala Thr Gly Thr Glu Ala Val Arg Leu Ala Arg Gln40 45 50 55gat ccg ccg gac gtg gtc ctg atg gac gtg cgg atg ccc gaa atg gat 2526Asp Pro Pro Asp Val Val Leu Met Asp Val Arg Met Pro Glu Met Asp

60 65 70ggc atc gag gcg acc cgg cag atc tgc ggt tcc ccc gag acc gcg gac 2574Gly Ile Glu Ala Thr Arg Gln Ile Cys Gly Ser Pro Glu Thr Ala Asp

75 80 85gtc aaa gtg ctg atc ctg acg atg ttc gac ctg gac gag tac gtc tac 2622Val Lys Val Leu Ile Leu Thr Met Phe Asp Leu Asp Glu Tyr Val Tyr

90 95 100gcc gcg ctg cgg gcc ggt gcc agc ggc ttc ctg ctg aag gac acg ccg 2670Ala Ala Leu Arg Ala Gly Ala Ser Gly Phe Leu Leu Lys Asp Thr Pro

105 110 115ccc agc gag ttg ctc gcg gcg gta cgg gtc atc gcc gcc ggc gag gcg 2718Pro Ser Glu Leu Leu Ala Ala Val Arg Val Ile Ala Ala Gly Glu Ala120 125 130 135ctg ctg gca ccg gcc gtg acg cgg cgc ctg atc gcg gag ttc gtc cac 2766Leu Leu Ala Pro Ala Val Thr Arg Arg Leu Ile Ala Glu Phe Val His

140 145 150cgc ccg gag ccc tcg cga ccg ctg cgt cgc acc ctg gac ggc gtg acc 2814Arg Pro Glu Pro Ser Arg Pro Leu Arg Arg Thr Leu Asp Gly Val Thr

155 160 165gag cgc gaa cgt gaa gtc ctc acc ctc atc gcc tgc ggc ctg tcc aac 2862Glu Arg Glu Arg Glu Val Leu Thr Leu Ile Ala Cys Gly Leu Ser Asn

170 175 180acc gag atc gcc gag cgg ctg tat ctc ggc att gcc acc gtg aag acc 2910Thr Glu Ile Ala Glu Arg Leu Tyr Leu Gly Ile Ala Thr Val Lys Thr

185 190 195cac gtc agc cac ctg ctc acc aag ctc gcc acc cgc gat cgc gct cag 2958His Val Ser His Leu Leu Thr Lys Leu Ala Thr Arg Asp Arg Ala Gln200 205 210 215ttg gtg atc gtc gcg tac gag agc ggc ctg gtc acg gtg gcg cga cca 3006Leu Val Ile Val Ala Tyr Glu Ser Gly Leu Val Thr Val Ala Arg Pro

220 225 230ccg atc ggt tcc tga ggggcgccgg cgcacacggt gcacggcctg ggcggggccg 3061Pro Ile Gly Ser

235ttcagaatgg atcacccggg tacacgaggc gcagttcgtc gacatggctc atgaggtact 3121caccggggca ctgggtggat gccggggccc gggactgctt cttgcgcggc tggtggcccc 3181agacgctgct gatgccgaag cggacggcca ggacgtccac gaggacgtcg agtgttgtga 3241gttgcttggg cgtcgggtgg tcgtagcgtg cccactggtt ctgccagcgc ggtccgaagt 3301cgccggtgag cacgatgccg agattgccgg cgttgaagag ttcagcgtgt gagccctcga 3361tgccgagtgg ccgcccctcg tagatcgtcc cggcgccgtc gatgatgtag tggtaaccga 3421tgtcggcctt gtcgtccgcg aagtgcgccc gctggatcgt gcgcgggccc tcatgcgtgt 3481acgtgacggg gtcggccgag tggtggatgg tgatccagcg gtagacggag gccaggggcc 3541ggttctcgct gagcggtacg ggactgccgc ggtagggcgg tggcgcgagg gggccggagg 3601cggcctcgtg gaaatcccag gtacgcagcg gggggtcgat ctgcggcggg gccgcccccc 3661aggtggcgcg gccgacgacg gacacggtca gcggccctcg cggtgtcatg gcccacaact 3721cgtagtcgcc gctcgccgga tgcaggaagc gcgactcgtc ccagcaggcg gcgacggggc 3781cgtgcgcggt gtcgaccggc cgggtgccgc aggacgtcag cctcagggga gtccggtgcg 3841ggcgctgccc cgagaccggc gcgttgaacc ggccgatgtc ggtgatcacg gtggtgcgga 3901gttccgacag gtcgtagccg tcgcgggggc attcgaggga gcgcggcggc ggttccacga 3961ccctgagcgc cgcatcgcac cgggggcaga cgagaacgag cacctcgcgg gcgaccagct 4021ccgtcgtcgt accgggcggg agccggtggt ggcggggcag atcgagtggc gtgcggccgg 4081gccgcagttc ggtcacgggc acggggtcgg tggcttcggc ggcgggtgcc agctcgtggt 4141cggcgcaggc gaccgtccag gcacgcgtcc cggcgtcggg aaccatgagg gtgcccagcg 4201cgtccgtcgt ggccgcgatc ccggaatgcc gtcctcccga tggcgggatg agccgtacgg 4261tgaatccggg gatcgggctg ccgtcgcggc gcaggatcac cagggccgtg tccgacggtg 4321gtgagagttc ggcggccagc cccgcctcga cgaagtgcag caagcggtgt gtcagttgca 4381gtacctcggg agagtccggc gcgagcatgg cctcggcacg gctgcgcacg ctctcgaacg 4441cgccgccgag tgcgaagcgc aggaagtcga cggcgaacgc gacgatctcc ccggcgacga 4501agccgaccgc ggcgtcggcg aagcgaggcg ggccgaagcc aggtgccagg gggagcgccg 4561gcgctccggc actggtcctg gtggcggcga cgaacgcggt gcaacgccgg tccacggcgc 4621cgtcgtagta ctcacgcagc tgcgccgcca gcgagcggtg cgggtcgaag gactcgccga 4681ggttcacccc gtcgatgtcg cccagcagcc gcggcgtcga agcgtggcgg gcgacccagt 4741ggtccagcga ccgaccgcgg tccgcggccg gcaccccggg cgcgtggcgg gcgcggacgt 4801acgcggcgag ggcgcgcccg aggtcaccgc tccaggtgag ggcgagatcc gctcgagggg 4861ccgggtccag ggggccgggc gtctgccggt cggccccgtc gatgccggcc agcacctgcg 4921ccaggtcgag ccgctcgaag ccgtgctgca cccgcagcag cgcggccagc cgggcggccc 4981ggcggggcag ctcccaggac gagcccggcg tctggtcgta cggggggatg ttccgccggt 5041tctg 5045<210>4<211>235<212>PRT<213>阿维链霉菌<400>4Met Thr Arg Pro Ala Asp Pro Pro Gly Ala Pro Val Arg Val Leu Ile1 5 10 15Ala Asp Asp Gln Ala Leu Leu Arg Gly Ser Leu Arg Val Leu Val Asp

20 25 30Thr Glu Pro Gly Leu Val Ala Thr Ser Glu Ala Ala Thr Gly Thr Glu

35 40 45Ala Val Arg Leu Ala Arg Gln Asp Pro Pro Asp Val Val Leu Met Asp

50 55 60Val Arg Met Pro Glu Met Asp Gly Ile Glu Ala Thr Arg Gln Ile Cys65 70 75 80Gly Ser Pro Glu Thr Ala Asp Val Lys Val Leu Ile Leu Thr Met Phe

85 90 95Asp Leu Asp Glu Tyr Val Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Gly Ala Ser Gly

100 105 110Phe Leu Leu Lys Asp Thr Pro Pro Ser Glu Leu Leu Ala Ala Val Arg

115 120 125Val Ile Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu Ala Pro Ala Val Thr Arg Arg

130 135 140Leu Ile Ala Glu Phe Val His Arg Pro Glu Pro Ser Arg Pro Leu Arg145 150 155 160Arg Thr Leu Asp Gly Val Thr Glu Arg Glu Arg Glu Val Leu Thr Leu

165 170 175Ile Ala Cys Gly Leu Ser Asn Thr Glu Ile Ala Glu Arg Leu Tyr Leu

180 185 190Gly Ile Ala Thr Val Lys Thr His Val Ser His Leu Leu Thr Lys Leu

195 200 205Ala Thr Arg Asp Arg Ala Gln Leu Val Ile Val Ala Tyr Glu Ser Gly

210 215 220Leu Val Thr Val Ala Arg Pro Pro Ile Gly Ser225 230 235

Claims

1.一种分离的多聚核苷酸分子，包含来自阿维链霉菌的编码aveR1基因产物的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的分离的多聚核苷酸分子，其中的aveR1基因产物包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的分离的多聚核苷酸分子，含有SEQ ID NO：1从大约nt 1112到大约nt 2317的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的分离的多聚核苷酸分子，含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

5.一种分离的多聚核苷酸分子，其与包含SEQ ID NO：1从大约nt 1112到大约nt 2317的核苷酸序列的多聚核苷酸分子同源。

6.如权利要求5所述的分离的多聚核苷酸分子，对本发明的实施是有用的，在中等严格条件下与含有编码SEQ ID NO：2氨基酸序列多肽的核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

7.如权利要求6所述的分离的多聚核苷酸分子，在高度严格条件下与含有编码SEQ ID NO：2氨基酸序列多肽的核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

8.如权利要求7所述的分离的多聚核苷酸分子，它在高度严格条件下与含有SEQ ID NO：1从大约nt 1112到大约nt 2317核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

9.一种分离的多聚核苷酸分子，包含编码具有与SEQ ID NO：2氨基酸序列同源的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

10.一种分离的多聚核苷酸分子，其核苷酸序列由权利要求1，2，3，4，5，6，7，8或9所述的多聚核苷酸分子的重要部分组成。

11.一种分离的多聚核苷酸分子，含有的核苷酸序列原位自然侧接于阿维链霉菌的aveR1 ORF，选自SEQ IDNO：1的大约nt 1到大约nt 1111或从大约nt 2318到大约nt 5045的核苷酸序列，或一个同源于所述侧翼序列的核苷酸序列。

12.一种分离的多聚核苷酸分子，含有一个从阿维链霉菌中获得的编码aveR2基因产物的核苷酸序列。

13.如权利要求12所述的分离的多聚核苷酸分子，其中aveR2基因产物含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

14.如权利要求13所述的分离的多聚核苷酸分子，含有SEQ ID NO：3从大约nt 2314到大约nt 3021的核苷酸序列。

15.如权利要求14所述的分离的多聚核苷酸分子，含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

16.一种分离的多聚核苷酸分子，其同源于含有SEQ ID NO：3从大约nt 2314到大约nt 3021的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。

17.如权利要求16所述的分离的多聚核苷酸分子，该多聚核苷酸分子对本发明的实现是有用的，它在中等严格条件下与含有编码SEQ ID NO：4氨基酸序列多肽的核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

18.如权利要求17所述的分离的多聚核苷酸分子，它在高度严格条件下与含有编码SEQ ID NO：4氨基酸序列多肽的核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

19.如权利要求18所述的分离的多聚核苷酸分子，它在高度严格条件下与含有SEQ ID NO：3从大约nt 2314到大约nt 3021的核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

20.一种分离的多聚核苷酸分子，含有的核苷酸序列编码的多肽氨基酸序列与SEQ ID NO：4的氨基酸序列同源。

21.一种分离的多聚核苷酸分子，构成它的核苷酸序列是权利要求12，13，14，15，16，17，18，19或20所述的多聚核苷酸分子的重要部分。

22.一种分离的多聚核苷酸分子，含有的核苷酸序列原位自然侧接于阿维链霉菌的aveR2 ORF，选自SEQ IDNO：3的大约nt 1到大约nt 2313和从大约nt 3022到大约nt 5045的核苷酸序列，或一个同源于所述侧翼序列的核苷酸序列。

23.一种分离的多聚核苷酸分子，含有从阿维链霉菌中获得的编码aveR1和aveR2基因产物的核苷酸序列。

24.如权利要求23所述的分离的多聚核苷酸分子，其中aveR1基因产物含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中aveR2基因产物含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

25.如权利要求24所述的分离的多聚核苷酸分子，含有阿维链霉菌示于SEQID NO：1大约nt 1112到大约nt 2317的aveR1 ORF，和示于SEQ ID NO：1大约nt 2314到大约nt 3021的aveR2 ORF的核苷酸序列。

26.如权利要求25所述的分离的多聚核苷酸分子，含有显示于SEQ ID NO：1从大约nt 1112到大约nt 3021的核苷酸序列。

27.如权利要求26所述的分离的多聚核苷酸分子，含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

28.一种分离的多聚核苷酸分子，同源于含有阿维链霉菌显示于SEQIDNO：1从大约nt 1112到大约nt 2317的aveR1 ORF的核苷酸序列和示于SEQ ID NO：1从大约nt 2314到大约nt 3021的aveR2 ORF的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。

29.如权利要求28所述的分离的多聚核苷酸分子，该多聚核苷酸分子对本发明的实施是有用的，它在中等严格条件下与含有编码SEQ ID NO：2氨基酸序列第一多肽和编码SEQ ID NO：4氨基酸序列第二多肽的核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

30.如权利要求29所述的分离的多聚核苷酸分子，它在高度严格条件下与含有编码SEQ ID NO：2氨基酸序列第一多肽和编码SEQ ID NO：4氨基酸序列第二多肽的核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

31.如权利要求30所述的分离的多聚核苷酸分子，它在高度严格条件下与含有阿维链霉菌aveR1 ORF SEQ ID NO：1从大约nt 1112到大约nt 2317核苷酸序列和aveR2 ORF SEQ ID NO：1从大约nt 2314到大约nt 3021核苷酸序列的多聚核苷酸分子的补体杂交。

32.一种分离的多聚核苷酸分子，含有的核苷酸序列编码的第一个多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列同源，第二个多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：4的氨基酸序列同源。

33.一种分离的多聚核苷酸分子，组成它的核苷酸序列是权利要求23，24，25，26，27，28，29，30，31或32所述的多聚核苷酸分子的重要部分。

34.一种分离的多聚核苷酸分子，含有的核苷酸序列原位自然侧接于阿维链霉菌的aveR1和aveR2 ORFs，选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列的大约nt 1到大约nt 1111和大约nt 3022位到大约nt 5045，或同源于一个所述侧翼序列的核苷酸序列。

35.一种寡核苷酸分子，它在高度严格条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1构成的多聚核苷酸分子杂交，或与核苷酸序列SEQ ID NO：1的补体构成的多聚核苷酸分子杂交。

36.一种重组载体，包含：(a)一个含有编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸分子；(b)一个与(a)中多聚核苷酸分子同源的多聚核苷酸分子；或(c)一个多聚核苷酸分子，它含有的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列同源；或(d)一个多聚核苷酸分子，组成它的核苷酸序列是(a)，(b)或(c)所述的多聚核苷酸分子的重要部分。

37.如权利要求36所述的重组载体，其中的多聚核苷酸分子可与一个或多个调节元件操纵连接。

38.如权利要求36所述的重组载体，进一步含有编码一个选择性标记或报道基因产物的核苷酸序列。

39.如权利要求36所述的重组载体，含有SEQ ID NO：1的从大约nt 1112到大约nt 2317的核苷酸序列。

40.如权利要求36所述的重组载体，含有SEQ ID NO：3的从大约nt 2314到大约nt 3021的核苷酸序列。

41.如权利要求36所述的重组载体，含有SEQ ID NO：1从大约nt 1112到大约nt2317所示的阿维链霉菌aveR1 ORF和显示于SEQ ID NO：1从大约nt 2314到大约nt 3021的阿维链霉菌aveR2 ORF的核苷酸序列。

42.如权利要求41所述的重组载体，是质粒pSE201(ATCC 203182)。

43.一种转化的宿主细胞，含有权利要求36所述的重组载体。

44.一种基本上纯化或分离的多肽，含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或一个与它同源的多肽或肽片段。

45.一种制备基本上纯化或分离的多肽的方法，该多肽含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或一个与它同源的多肽或肽片段的氨基酸序列，包括在有助于多肽或肽片段表达的条件下培养权利要求43所述的转化细胞，和从细胞培养物中回收表达的多肽或肽片段以得到基本纯化或分离的形式。

46.一种多聚核苷酸分子，包括：(a)从阿维链霉菌中获得的一个编码aveR1基因产物或aveR2基因产物的核苷酸序列；或(b)与(a)中的多聚核苷酸分子同源的核苷酸序列；或(c)由(a)或(b)中的多聚核苷酸分子的重要部分构成；或(d)含有原位自然侧接于阿维链霉菌的aveR1 ORF或的aveR2 ORF的核苷酸序列；这个多聚核苷酸分子还含有至少一个突变，导致含有aveR1基因或aveR2基因突变或aveR1和aveR2两基因突变的阿维链霉菌菌株细胞比不带有基因突变同一菌株的细胞产除虫菌素量有可检测出的增加。

47.如权利要求46所述的多聚核苷酸分子，含有完整的从阿维链霉菌中获得的aveR1 ORF或它的同源多聚核苷酸分子，或它的重要部分；或含有完整的从阿维链霉菌中获得的aveR2 ORF或与它的同源多聚核苷酸分子，或它的重要部分；或含有完整的从阿维链霉菌中获得的aveR1和aveR2 ORFs或与它们同源的多聚核苷酸分子，或它们的重要部分；或含有一个核苷酸序列，原位自然侧接于阿维链霉菌的aveR1 ORF，原位自然侧接于阿维链霉菌的aveR2 ORF，或原位自然侧接于阿维链霉菌的aveR1和aveR2 ORFs；这些多聚核苷酸分子对突变阿维链霉菌的aveR1基因或aveR2基因，或aveR1和aveR2两基因是有用的，这些突变使得含有所述的aveR1基因或aveR2基因，或者aveR1和aveR2两基因的突变的阿维链霉菌菌株细胞比不带这些基因突变的同一菌株的细胞产除虫菌素量有可检测出的增加，

48.一种用于向阿维链霉菌的aveR1基因或aveR2基因或aveR1和aveR2两基因中引入突变的遗传构建体，其含有权利要求46和权利要求47所述的多聚核苷酸分子。

49.如权利要求48所述的遗传构建体，它能通过分别缺失阿维链霉菌的aveR1基因或aveR2基因的一部分，或用不同的或异源的核苷酸序列分别置换aveR1基因或aveR2基因的一部分，来突变aveR1基因或aveR2基因。

50.要求49所述的遗传构建体，它能通过缺失阿维链霉菌的aveR1和aveR2基因的一部分，或用不同的或异源的核苷酸序列置换aveR1基因和aveR2基因的一部分，来突变aveR1和aveR2两基因。

51.要求48所述的遗传构建体，它能通过用不同的或异源的核苷酸序列分别插入aveR1基因或aveR2基因中，来突变阿维链霉菌aveR1基因或aveR2基因。

52.一种鉴定链霉菌的特定种或菌株中aveR1基因或aveR2基因或aveR1和aveR2两基因突变的方法，这种基因突变使得带有这些基因突变的链霉菌的种或菌株的细胞比不带这些基因突变的链霉菌的同一种或菌株的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加，该方法包括：(a)测量特定的链霉菌的种或株的细胞的产除虫菌素量；(b)向步骤(a)中的链霉菌的种或株的细胞的aveR1基因或aveR2基因，或者同时aveR1和aveR2这两个基因中引入突变；(c)比较步骤(b)中产生的带有基因突变的细胞与步骤(a)中的不带有基因突变的细胞的产除虫菌素量；因此如果步骤(b)中所产生的带有基因突变的细胞的产除虫菌素量比步骤(a)中的不带有基因突变的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加，那么就鉴定出了aveR1基因或aveR2基因，或者同时aveR1和aveR2这两个基因的可使得产除虫菌素量增加的突变。

53.如权利要求52所述的方法，其中的链霉菌的种是阿维链霉菌。

54.一种从链霉菌的种或菌株中制备遗传修饰的细胞的方法，这些修饰细胞比链霉菌种或菌株的未经修饰的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加，方法包括在链霉菌的种或菌株的细胞中突变aveR1基因或aveR2基因，或者同时aveR1和aveR2这两个基因，以及筛选比同一种或菌株的不带有基因突变的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加的突变细胞。

55.如权利要求54所述的方法，其中的链霉菌的种是阿维链霉菌。

56.如权利要求54所述的方法，其中的突变是通过缺失aveR1基因或aveR2基因的一部分，或用不同的或异源的核苷酸序列置换aveR1基因或aveR2基因的一部分来实现的。

57.如权利要求54所述的方法，其中的突变是通过同时缺失aveR1和aveR2两基因的一部分，或用不同的或异源的核苷酸序列同时置换aveR1和aveR2两基因的一部分来实现的。

58.如权利要求54所述的方法，其中的突变是通过将不同的或异源的核苷酸序列插入aveR1基因或aveR2基因中来实现的。

59.链霉菌的一个菌株，作为aveR1基因或aveR2基因或者同时aveR1和aveR2这两个基因的单个或多个突变的结果，突变细胞比链霉菌的同一种或菌株的不带有基因突变的细胞产生可检测出的增加的除虫菌素量。

60.如权利要求59所述的菌株，其中链霉菌的种是阿维链霉菌。

61.一种通过链霉菌的培养产生增加量的除虫菌素的方法，该方法包括：在允许或诱导除虫菌素从细胞中产生的培养条件下在培养基中培养链霉菌的种或菌株的细胞，这些细胞含有aveR1基因或aveR2基因，或者同时aveR1和aveR2这两个基因的一个突变，这种基因突变使得带有这些基因突变的链霉菌的种或菌株的细胞的产除虫菌素量比不带这些基因突变的链霉菌的同一种或菌株的细胞的产除虫菌素量有可检测出的增加，从培养基中回收除虫菌素。

62.如权利要求61所述的方法，其中链霉菌的种是阿维链霉菌。

63.一种直接抗aveR1基因产物或aveR2基因产物或同源多肽或本发明的肽片段的抗体。