CN1253583C - 在不同条件下利用多种测量方法对双链体或三链体杂交进行均相分析 - Google Patents

在不同条件下利用多种测量方法对双链体或三链体杂交进行均相分析 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于核酸杂交、检测和评价的均相分析方法。所述分析包括：在将电压施加于测试样品之前和过程中从测试样品中得到信号，以及使信号相互关联，每一所述信号都是探针与靶相互结合亲和力的指征。由于可校准电压从而显著地使除完全互补杂交以外的任何杂交去稳定，所述分析能检测探针与靶间的匹配程度。其大小与结合亲和力相关的信号可以是电导和/或荧光强度。优选对两种信号对进行测量和比较，从而增强分析的可靠性。所述分析可以检测单链探针与非变性的双链靶之间形成三链体的特异性杂交，因此无需使靶变性。该分析方法也可应用于双链杂交复合体。

Description

在不同条件下利用多种测量方法对双链体或 三链体杂交进行均相分析
发明领域
本发明涉及核酸的测序或分析方法，更具体地涉及精确分析三链和双链核酸杂交复合体的方法。
相关领域说明
很多年以来人们已经知道，通过将电场施加于样品上，可以分离和鉴定生物分子。
电泳可能是最熟知的分离和鉴定技术的例子，其是建立在电场对生物分子的影响的基础上。在凝胶电泳中，其上施加电场的均一基质或凝胶由例如聚丙烯酰胺构成。施加到凝胶一端的混合物将依据其大小和与电场的相互作用通过凝胶。迁移率取决于物质的独特性质，如构象、大小和电荷。改变凝胶孔径，例如通过形成一定的浓度或pH梯度，或者改变缓冲液的组成(pH、SDS、DOC、甘氨酸、盐)，可影响迁移率。单向和双向凝胶电泳是大多数研究实验室中采用的非常常规的方法。经过凝胶电泳和/或从凝胶中物理提取可纯化目标物。
在Stanley的美国专利5,824,477中公开了最新开发出的方法，其中将电场施加到生物样品上。Stanley的专利公开了检测预定核酸序列在样品中存在与否的方法。该方法包括：(a)利用电极将电压施加到溶液中的样品上，从而使双链核酸样品变性；(b)使变性核酸与针对所述序列的寡核苷酸探针杂交；以及(c)确定杂交是否发生。Stanley的专利公开了为使靶序列变性的有限目的而将电场施加于待测样品。
更为熟知的一种杂交分析是基于荧光标记物的使用。最基本形式是基于荧光强度的分析一般包括使靶与含荧光团的探针接触，从结合探针中去除任何未结合的探针，以及检测洗涤后样品中的荧光。均相分析是对所述基本分析的改进，即均相分析并不需要洗涤步骤或提供非液相载体。
基于某些荧光团在杂交复合体中结合于核酸链之间的能力，一些分析也利用嵌入荧光团检测核酸杂交。
例如，Burke等的美国专利5,824,557公开了检测并量化核酸分子的方法和试剂盒。优选的实施方案取决于将染料嵌入双链核酸的双螺旋或单链核酸中。染料在嵌入之后发出荧光，其强度直接反映了样品中存在的核酸量。尽管Burke等的方法声称可用于检测样品中的核酸量，但是这种方法基于嵌入染料与核酸之间非特异性的结合，使该方法对于检测特异性结合，尤其是存在非靶核酸双链的条件下不实用。
Ishiguro等的美国专利5,814,447公开的方法宣称，对依赖于嵌入剂和核酸双链间非特异性相互作用的方法作了改进，这些方法如Burke等的方法以及由Ishiguro等早期在日本专利公开237000/1993中所描述的方法。早期的发展包括在靶核酸一个特定区域经PCR扩增之前，加入嵌入荧光素，该荧光素嵌入到样品溶液后荧光强度有增加的趋势，以及以给定时间间隔对反应溶液的荧光强度进行检测，从而检测并量化扩增前的靶核酸。该`447专利试图通过提供提高了特异性的分析方法对前期的开发进行改进，该分析的特征在于探针是标记了嵌入荧光素的单链寡核苷酸，该荧光素被嵌入到介于靶核酸与单链寡核苷酸探针之间互补的结合部分。
在正进行的针对更灵敏、精确和快速的分析技术的研究中，一个研究组开发了一种分析，其包括分析电场对核酸杂交双链体荧光强度的影响。参见分别于1997年2月27日和1997年6月6日提交的美国专利申请08/807,901和08/870,370。研究者们指出单碱基对错配的双链体的荧光强度与完全匹配的双链体的荧光强度不同。因此，这些申请旨在公开一种检测核酸序列的方法，其中在检测步骤之前或在此同时将电场施加到液体介质上，并且检测作为电场函数的荧光发射强度变化，指示探针是与完全互补核苷酸序列杂交还是与不完全互补核苷酸序列杂交。
尽管有以上的研究成果，本领域仍需要用于核酸之间和/或核酸类似物间相互作用的简便、高灵敏度、有效并且快速的分析方法。
所有在此引用的参考文献以其全文在此引作参考。
发明概述
本发明提供了一种分析序列特异性杂交的方法，所述方法包含：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含核酸或核酸类似物序列的探针；
将所述探针和所述靶加入杂交介质，以提供检测样品；
将第一刺激物施加到所述检测样品上，以提供第一受激检测样品；
从所述第一受激检测样品中检测第一信号，其中所述第一信号与所述探针和所述靶间的结合亲和力相关；
根据参照样品所显示的参照信号校准所述第一信号，所述参照样品包括与所述靶结合的至少一种参照探针，其中相对于所述靶，各所述探针和所述至少一种参照探针是选自如下组的不同成员：完全匹配、单碱基错配、二碱基错配、三碱基错配、单碱基缺失、二碱基缺失和三碱基缺失；以及
由所述校准来确定所述探针与所述靶之间匹配程度的第一测定值；
将第二刺激物施加到所述第一受激检测样品上，以提供第二受激检测样品；以及
从所述第二受激检测样品中检测第二信号，其中所述第二信号与所述探针和所述靶间的结合亲和力相关；
由所述第二信号检测来确定所述探针与所述靶之间所述匹配程度的第二测定值；以及
比较所述第一测定值和所述第二测定值。
本发明还提供了另一种分析杂交的方法，所述方法包括：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含核酸或核酸类似物序列的探针；
将所述探针和所述靶加入杂交介质，以提供检测样品；
测量所述检测样品在第一条件下的第一信号，以提供关于所述探针和所述靶间杂交的初级测定值，其中所述第一信号与所述探针和所述靶间的杂交相关；
测量所述检测样品在第二条件下的第二信号，以提供关于所述探针和所述靶间杂交的次级测定值，其中所述第二信号与所述探针和所述靶间的杂交相关，条件是当所述第一条件和所述第二条件相似时，在测量所述第一信号后和测量所述第二信号前将刺激物施加到所述检测样品上，其中所述刺激物显著影响所述探针和所述靶间的不完全互补杂交，却不显著影响所述探针和所述靶间的完全互补杂交；以及
比较所述初级测定值和次级测定值，以评价二者间任何的不一致是否表明需要重新测试。
此外，本发明还提供了另一种杂交分析方法，其包括：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含核酸或核酸类似物序列的探针；
将所述探针和所述靶加入杂交介质，以提供检测样品；
测量所述检测样品通电前的荧光强度，以提供关于所述探针和所述靶间杂交的初级测定值，其中所述通电前荧光强度与所述探针和所述靶间的杂交相关；
将电压施加到所述检测样品上；
在施加所述电压过程中或之后，测量所述检测样品通电后荧光强度，以提供关于所述探针和所述靶间杂交的次级测定值，其中所述通电后荧光强度与所述探针和所述靶间的杂交相关；以及
比较所述初级测定值和所述次级测定值，以评价二者间任何的不一致是否表明需要重新测试。
本发明还提供了一种分析序列特异性杂交的方法，所述方法包括：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含核酸或核酸类似物序列的探针；
将所述探针和所述靶加入杂交介质，以提供检测样品；
将电压施加到所述检测样品上；
在施加所述电压过程中或之后，检测所述检测样品的信号，其中所述信号与所述探针和所述靶间的结合亲和力相关；
根据参照样品所显示的参照信号校准所述信号，所述参照样品包括与所述靶结合的至少一种参照探针，其中相对于所述靶，各所述探针和所述至少一种参照探针是选自如下组的不同成员：完全匹配、单碱基错配、二碱基错配、三碱基错配、单碱基缺失、二碱基缺失和三碱基缺失；以及
由所述校准来确定所述探针与所述靶之间的匹配程度。
附图简述
本发明将结合以下附图进行描述，在这些附图中，类似的参考数字表示类似的元件，并且其中：
图1A和1B是电流随时间和互补性变化的图；
图1C和1D是电流随温度和互补性变化的图；
图2A、2B、2C、3A和3B是电流随温度、互补性和其它因素变化的图；
图4是电流随时间和互补性变化的图；以及
图5A、5B、5C和6是荧光强度图谱。
优选实施方案的详细说明
本发明提供了一种分析靶与探针结合的快速、灵敏、环保而且安全的方法，其中该靶包含核酸序列或核酸类似物序列，该探针包含核酸序列或核酸类似物序列。
与某些先前的分析方法不同，本发明不仅检测杂交是否存在，还提供有关探针和靶之间杂交性质的定量和定性信息。因此，本发明使操作者可以区分是完全匹配、单碱基对错配、两个碱基对错配、三个碱基对错配、单碱基对缺失、两个碱基对缺失还是三个碱基对缺失。
本发明的实施方案包括根据与相同靶结合的其他探针发出的同类信号，校准第一个探针-靶混合物中所测定的信号(如电流和/或荧光强度)，其中其他探针每一个与第一个探针有至少一个碱基的差异。
在某些实施方案中，在测量所述信号之前或在此同时，将低电压施加到样品上。通常，以如下方式选择电压：使其高得足以使不完全匹配的杂交配偶体去稳定，但又不高到使完全匹配的杂交配偶体去稳定。在某些优选的实施方案中，电压是约1V-约20V。
可产生标准曲线，其中所测信号大小(例如，电流和/或荧光强度)是靶和探针之间结合亲和力的函数。因为靶与多种不同探针间的结合亲和力因错配碱基数不同、错配的性质不同(A-G对A-C对T-G对T-C等)、错配碱基在杂交复合体中的位置等因素各有差异，因此，本发明分析可用于对靶测序。
所测信号可以是例如电导。在这类实施方案中，探针和靶间结合亲和力与信号的大小正相关。也就是说，电导随探针和靶间匹配程度而增加，优选在包括0-2个错配和/或缺失的范围内，更优选在包括0-3个错配和/或缺失的范围内。
在其它实施方案中，所测信号可以是检测样品中所含荧光团的荧光强度。在这类实施方案中，根据荧光团是否经信号淬灭或信号放大来显示杂交，可以使探针与靶之间的结合亲和力与所述强度正相关或负相关。因此，由嵌入剂产生荧光强度与探针-靶的结合亲和力正相关，而实施方案中采用与探针共价结合的非嵌入荧光团所产生的荧光强度与探针-靶的结合亲和力负相关。荧光强度随探针和靶间的匹配程度的增加而增加(或者对于非嵌入剂则为减小)，优选在包括0-2个错配和/或缺失的范围内，更优选在包括0-3个错配和/或缺失的范围内。
尽管发明人先前已公开了荧光强度分析杂交的优点(参见于1999年12月21日提交的美国专利申请09/468,679)，但如下面实施例6所示，将电场施加到样品上可增加分析的分辨率。
此外，在本发明特别优选的实施方案中，所述分析包括测量样品的至少两种信号。第一种信号优选为荧光强度，第二种信号优选选自若干电导测量值(或反之)。
在优选的多重测量实施方案中，第一信号可以与第二信号相同或不同。当测量的第一信号与第二信号相同时，第二信号可以根据第一信号和/或用于校准第一信号的相同基准信号进行校准。另外，在测量第一信号之后并且在测量第二信号之前，最好向测试样品施加改变条件的刺激物。该刺激物优选足以显著影响探针与靶之间的不完全互补杂交，但不足以显著影响探针与靶之间的完全互补杂交。
例如，在本发明特别优选的实施方案中，测量的第一信号为通电前的荧光强度(即在向测试样品施加条件改变电压之前测量的强度)，测量的第二信号为通电后的荧光强度(即在已向测试样品施加条件改变电压过程中或之后测量的强度)。
在前述实施方案中的附加测量值提高了分析的可靠性，并且使得对可疑结果能够立即重新测试。如果至少两个测量值结果不一致，一般表明需要重新测试。
本发明可以量化探针与靶之间的结合亲和力。这样的信息在许多方面非常有用，包括设计具有最佳结合特性的反义药物。
与先前的方法不同，本发明的分析优选是均相的。该分析在检测所测信号的大小之前，无需将探针-靶复合体与游离探针和靶分离。该分析无需凝胶分离步骤，因此检测通量有很大提高。定量分析简便准确。因此，这种结合分析可节省大量的时间和花费，而且容易自动化完成。进一步，这种分析使结合中的一些变量，如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相对浓度、嵌入剂浓度、靶序列长度、探针序列的长度以及可能的辅助因子的要求被快速确定。
所述分析可在例如孔内、不透性表面上或生物芯片上的溶液中进行。
此外，本发明的分析在进行时优选无需给靶或探针提供信号淬灭剂。
本发明的优选实施方案特异地检测探针与双链靶之间的三链体杂交，因此无须将靶变性。当PNA探针已知可与某些类型的靶形成三链体时(参见，如Egholm等，365 Nature 566(1993)，和Tomac等，118J.Am.Chem.Soc.5544(1996))，本发明人惊讶地发现，这些PNA探针能够特异地分析单链核酸(如ssDNA和RNA)探针与双链核酸(如dsDNA)靶之间形成的三链体。当检测样品中存在嵌入剂时，三链体的形成和/或稳定性增强。
本发明分析中使用的合适的探针包括，如ssDNA、RNA、PNA以及其它不带电荷或带部分电荷主链的核酸类似物。尽管在某些实施方案中优选反平行探针，但PNA探针也可以是平行的。优选长度为8到20个碱基的探针序列，因为该范围是原核和真核生物已发现的最小的独特DNA序列范围。特别优选12到18个碱基的探针，因为这是人基因组中最小的独特序列的长度。实施方案中，最优选6-30个碱基的探针。不过，多个更短的探针可用于检测具有多个非独特靶序列的核酸序列，这些探针组合用来独特地识别核苷酸序列。可对探针长度进行选择，以与靶的长度相匹配。
本发明无须使用危险、操作烦琐、耗时，而且需要经常再生的放射性探针。本发明的探针优选的是数年都安全稳定的探针。相应的，探针可大量地制备或订购和储存。
优选未标记的探针和靶，但在另一些实施方案中，嵌入剂与探针共价结合。在这样一些实施方案中，该嵌入剂优选地结合于探针的任一端。
其它实施方案中，嵌入剂尽管可在分析中插入探针与靶之间，但并不与探针共价结合，而是以非共价形式与探针有义键合。
本发明使用的优选嵌入剂包括，如YOYO-1、TOTO-1、溴化乙啶、乙啶同型二聚体-1、乙啶同型二聚体-2和吖啶。通常，嵌入剂是能够嵌入双链和/或三链核酸复合体链间的成分。优选的实施方案中，嵌入剂(或其一个组分)在核酸不存在时基本上是无荧光的，只有在嵌入双链或三链核酸复合体时，被合适波长辐射激发和嵌入的荧光才显示100倍到10000倍的增强。
其它实施方案中，嵌入剂在嵌入和被适当波长的辐射激发后，可能表现荧光波长移位。确切的荧光波长可依赖于被嵌入核酸的结构，如DNA对RNA，双链体对三链体等。
选择相当于所用荧光团最大激发的激发波长(通过常规实验和/或常识)，优选200到1000nm。优选发射波长为200到1000nm的嵌入剂。优选的实施方案中，利用氩离子激光器，用波长范围在400nm到540nm之间的光辐射荧光团，在500到750nm之间检测到荧光发射。
本发明的分析可在极广的温度范围下进行，如5℃到85℃之间。某些现有技术分析要求提高温度，使花费增加并延迟分析。另一方面，本发明可在室温或以下的温度进行(如低于25℃的温度)。
本发明的分析是极其灵敏的，因此无需对靶进行PCR扩增。例如，至少在荧光强度实施方案中，可以对含有约10fmol靶和约10fmol探针的体积为约20微升的检测样品进行分析。本发明实施方案的灵敏度足以分析5×10-9M浓度的靶，优选浓度不高于5×10-10M。本发明实施方案的灵敏度足以分析5×10-9M浓度的探针，优选浓度不高于5×10-10M。
测量电导可以区别40微升中仅含约1pmol探针和1pmol靶的样品。当减少样品体积时，将可使用甚至更少量的探针和靶。
毫无疑问，上述数值并不意味着本方法不能检测更高的浓度。
对于每一浓度的被测探针和靶，可以容许一个宽范围的嵌入剂浓度。例如，当对5×10-10M的探针和5×10-10M的靶进行杂交时，嵌入剂YOYO-1的最佳浓度在25nM至2.5nM的范围。在探针和靶都是5×10-8M的浓度时，优选的YOYO-1浓度范围为1000nM至100nM。
所述分析的灵敏度足以将单碱基对错配探针-靶复合体与二碱基对错配探针-靶复合体区别开来，并且优选足以将二碱基对错配探针-靶复合体与三碱基对错配探针-靶复合体区别开来。当然，所述分析的灵敏度足以将完全匹配探针-靶复合体与任何一种上述错配复合体区别开来。
杂交介质可以是任何已知的适宜于保存核酸的常规介质。参见如Sambrook等“分子克隆：实验手册”第2卷(1989)。例如，液相介质可包括核苷酸、水、缓冲液以及标准盐浓度。
互补碱基间的杂交在多种情况下进行，各情况在温度、盐浓度、静电强度和缓冲液组成方面有所不同。这些条件和使用方法的例子是本领域所已知的。
优选的，杂交复合体在约15℃到约25℃的温度下形成约1到约5分钟。不需要更长的反应时间，但温育几个小时对杂交复合体也没有副作用。
可以(尽管不是必要，特别是对于含有嵌入剂的实施方案)使用某些试剂促进溶液中的杂交。这些试剂优选的例子包括单链结合蛋白，如Rec A蛋白、T4基因32蛋白、大肠杆菌单链结合蛋白、大或小的核酸沟结合蛋白、二价离子、多价离子、viologen以及嵌入剂如溴化乙啶、放线菌素D、补骨脂素及当归素。这些助剂可被证明在极端操作条件下是有用的，例如在异常pH值或极端高温下。
本发明分析可被用于，如识别折叠核酸序列中可及区域，以确定杂交复合体中错配的碱基对数目以及基因组制图。
在用嵌入剂探测荧光强度的实施方案中，强度随探针与靶之间结合亲和力的增大而增加。在用非嵌入荧光团探测荧光强度的实施方案中，强度随探针与靶之间结合亲和力的增大而减小。不管荧光团是否嵌入，本发明方法都不需要测量荧光极性，与荧光各向异性方法不同。
本发明将通过以下实施例进行详细阐述，但应当理解本发明并不只限于以下实施例。
实施例
实施例1
DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)合成来自人囊性纤维化基因的外显子10(Nature 380，207(1996))的有义和反义50聚体ssDNA靶序列，HPLC纯化。等摩尔量的互补寡核苷酸在95℃变性10分钟，然后慢慢退火，使温度在1个半小时内下降到21℃。双链DNA(dsDNA)寡核苷酸溶解在双蒸水中，终浓度为1pmole/μl。
野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)的有义链的序列为：5’-TGG CACCAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGAATA TA-3’。
野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)的反义链的序列为：5’-TAT ATTCAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGGTGC CA-3’。
dsDNA(SEQ ID NO：1)的熔点(Tm)预计为65.2℃。
SEQ ID NO：2是与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)类似的50聚体的突变dsDNA靶序列，只是在氨基酸位置第507处有一个碱基对的突变(下划线)，其中将野生型序列CAT变为C GT。
SEQ ID NO：2的有义链序列为：5’-TGG CAC CAT TAA AGAAAA TAT C GT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：2的反义链序列为：5’-TAT ATT CAT CAT AGGAAA CAC CAA AGA  CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3’。
dsDNA(SEQ ID NO：2)的熔点(Tm)预计为66.0℃。
SEQ ID NO：3是与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)类似的50聚体的突变dsDNA靶序列，只是在氨基酸位置第506和507处有连续的两个碱基对的突变(下划线)，其中将野生型序列CAT突变为 ACT。
SEQ ID NO：3的有义链的序列为：5’-TGG CAC CAT TAA AGAAAA TAT  ACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：3的反义链的序列为：5’-TAT ATT CAT CAT AGGAAA CAC CAA AGA  GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3’。
dsDNA(SEQ ID NO：3)的熔点(Tm)预计为65.2℃。
本实施例中使用的PNA探针由Commonwealth Biotechnologies公司(Richmond，VA，USA)合成、HPLC纯化并通过质谱分析确认。PNA探针首先被溶解在0.1％的TFA(三氟乙酸)到浓度为10mg/ml，加入双蒸水使其稀释至1mg/ml。最终PNA的储藏溶液制成水溶液浓度1pmole/μl。
1号探针是15聚体反平行PNA探针，其设计成与50聚体野生型靶DNA有义链(SEQ ID NO：1)的一个15核苷酸区段完全互补，从氨基酸位置505到510序列是完全重叠的(Nature  380，207(1996))。该探针结构(SEQ ID NO：8)为：5’-H-CAC CAA AGA TGATAT-Lys-CONH2-3’。
杂交反应混合物(80μl)含有以下成分：2pmole的靶dsDNA、2pmole的PNA探针、0.5xTBE和250nM的DNA嵌入剂YOYO-1(分子探针，Eugene，OR，USA)。将样品放置在3mm石英杯中，1或5伏DC(V)通电15秒。电流分析包括在将电压施加到溶液上的同时检测电流。将温度传感器置于各溶液中，以测量进行电流分析时的温度。在1伏时，在通电的最初2秒观察到电流峰。在以后的13秒，电流迅速降低。在采用5伏的实验中，电流在整个通电过程(15秒)中保持相对稳定。
进行了一系列实验，其中在DNA或PNA不存在时(对照)，或当野生型SEQ ID NO：1、突变体SEQ ID NO：2或突变体SEQ ID NO：3与1号反平行PNA探针反应时，观察到了电导值。图1A和1B绘出了在各个实验中得到的电导数据。图1A显示了施加1V电的结果，图1B显示了施加5V电的结果。由完全互补序列(SEQ ID NO：1+1号探针)组成的dsDNA：PNA杂合三链体使得YOYO-1最大嵌入，在整个15秒的1V施加过程中产生最大的电导值(图上显示为负的电流值)。反平行PNA探针与单碱基对错配的dsDNA(SEQ ID NO：2+1号探针)和与两个碱基对错配的dsDNA(SEQ ID NO：3+1号探针)的三链体杂交在施加电压的最初1秒期间，其标准化电导峰分别比完全匹配的dsDNA：PNA三链杂合体(SEQ ID NO：1+1号探针)所观察到的值低79％和96％(图1A)。当把整个15秒施加电压期间的电导值平均时，在完全互补三链体和含碱基对错配的三链体之间，得到了类似的百分比降低。在图1A中，与完全匹配的dsDNA：PNA杂合体相比，单碱基对和两个碱基对错配的dsDNA：PNA杂合体的平均电导值分别降低65％和91％。图1A中表示的所有实验在室温(23℃)下进行。随着探针与双链靶之间的错配程度增加，YOYO-1嵌入的水平降低，电导水平也降低。当重复上述实验并施加更高电压(5V)时，也观察到这些关系。与完全匹配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)相比，在施加5V电压的过程中，单碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ IDNO：2+1号探针)和两个碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ IDNO：3+1号探针)的标准化平均电导值分别低52％和67％(图1B)。图1B中表示的所有实验在室温(23℃)下进行。
当在增至50℃和65℃的温度下重复实验时，观察到类似的电流分析值。在50℃，在对完全匹配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：1+1号探针)施加1V 15秒时，产生-0.25μA平均电流，相比之下，单碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)和两个碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)分别产生-0.15μA平均电流(低40％)和-0.06μA平均电流(低76％)(图1C)。在65℃，当施加1V电15秒时观察到类似的结果。完全匹配的核酸杂合体产生-0.37μA平均电流，相比之下，单碱基对和两个碱基对错配的杂合体分别产生-0.16μA平均电流(低57％)和-0.01μA平均电流(低97％)(图1C)。在高温下施加5伏电压产生类似结果。对于完全匹配的杂合体、单碱基对错配的杂合体和两个碱基对错配的杂合体，在50℃进行的实验分别产生-0.27mA、-0.13mA(低52％)和-0.08mA(低70％)的平均电流，对于相同的三组，在65℃进行的实验分别产生-0.31mA、-0.14mA(低55％)和-0.10mA(低68％)的平均电流(图1D)。对所有前述实验，dsDNA在与1号反平行PNA探针进行三链杂交前没有变性。
在杂交混合物加热至65℃并立即冷却之后，在不同温度下进行类似的实验。在冷却至室温(23℃)之后，向完全匹配的样品(SEQ IDNO：1+1号探针)施加1V电压15秒，产生-0.18μA的平均电流。通过比较，对于单碱基对错配的dsDNA：PNA三链杂合体(SEQ ID NO：2+1号探针)和两个碱基对错配的dsDNA：PNA三链杂合体(SEQ ID NO：3+1号探针)，可以分别观测到-0.06μA的电流值(低67％)和-0.05μA的电流值(低72％)(数据没有列出)。在将样品从65℃冷却至50℃时，若继之施加1V电压15秒，可以观测到类似的结果。完全匹配的样品(SEQ ID NO：1+1号探针)产生-0.23μA的平均电流，相比之下，单碱基对和两个碱基对错配的样品分别观测到-0.11μA的平均电流(低52％)和-0.01μA平均电流(低96％)(数据没有列出)。当冷却至23℃或50℃之后施加5V电压时，在完全匹配的三链杂合体(SEQ IDNO：1+1号探针)、单碱基对错配的三链杂合体(SEQ ID NO：2+1号探针)和两个碱基对错配的三链杂合体(SEQ ID NO：3+1号探针)中产生的平均电流在23℃时分别为-0.15mA、-0.09mA(低40％)和-0.07mA(低53％)，而在50℃时分别为-0.23mA、-0.09mA(低61％)和-0.09mA(低61％)(数据没有列出)。
当使用反平行PNA探针时，在65℃(50聚体dsDNA序列的Tm)对杂交混合物进行预处理然后冷却不会显著影响在23℃或50℃(没有在65℃预热)直接测量的完全互补的dsDNA：PNA三链杂合体与那些含有1或2bp错配的三链杂合体之间观测到的电导差别。显然，在DNA嵌入剂YOYO-1存在下反平行PNA探针能够形成具有dsDNA靶的三链杂合体结构。施加低电压电流(例如1V或5V)可以使完全匹配的dsDNA：PNA三链杂合体序列与那些含有1或2bp突变的三链杂合体区别开来，而无需进行序列的预变性。
实施例2
图2表明，当所用的PNA探针与靶DNA序列方向平行时，本发明的电流分析也可区分完全匹配的dsDNA：PNA三链杂合体与那些含有1或2碱基对错配的杂合体。2号探针是与1号探针序列上相同的15聚体PNA探针，不过合成为符合靶DNA的平行方向，而非常规的反平行方向。2号探针的结构(SEQ ID NO：9)为：5’-H-TAT AGTAGA AAC CAC-Lys-CONH2-3’。
除了用2号探针代替1号探针外，以与实施例1中所述相同的分析条件进行实验。在施加1伏电压时，与在匹配温度下对完全匹配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：1+2号探针)所观察到的平均电流相比，在23℃时，单碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：2+2号探针)和连续两个碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+2号探针)的平均电流分别低25％和32％，在50℃时分别低30％和23％，在65℃时分别低28％和53％(图2A)。
在施加5V电压(代替1V)15秒时得到类似的结果。完全匹配的dsDNA：PNA杂合体在23℃、50℃和65℃分别产生-0.15mA、-0.24mA和-0.17mA的平均电流(图2B)。与完全匹配的杂合体样品所得结果相比，单碱基对错配和两个碱基对错配的不完全互补三链体在23℃分别产生低27％(-0.11mA)和低53％(-0.07mA)的平均电流，在50℃分别产生低21％(-0.19mA)和低46％(-0.13mA)的平均电流，在65℃分别产生无差别(-0.17mA)和低18％(-0.14mA)的平均电流(图2B)。
图2A和2B中所示结果表明，相比于使用1号反平行PNA探针时得到的结果，在使用2号平行PNA探针时，完全匹配的dsDNA：PNA三链体和含单碱基对或两个碱基对错配的dsDNA：PNA三链体之间电导差异的显著性较小(图1)。
但是，通过使用2号平行探针以及在将样品加热至65℃并立即冷却之后施加5V电压的实验，公开了电流测量值，显示了完全匹配的dsDNA：PNA三链体和单碱基对或两个碱基对错配的dsDNA：PNA三链体间的信号差别增大(图2C)。完全匹配的杂合体(SEQ ID NO：1+2号探针)、单碱基对错配的杂合体(SEQ ID NO：2+2号探针)和两个碱基对错配的杂合体(SEQ ID NO：3+2号探针)产生的平均电导值在23℃时分别为-0.19mA、-0.08mA和-0.06mA，在50℃时分别为-0.17mA、-0.09mA和-0.07mA，在65℃时分别为-0.23mA、-0.13mA和-0.08mA。这意味着在与完全互补样品所得的值相比，单碱基对和两个碱基对错配的样品产生的电导在23℃时分别低58％和68％，在50℃时分别低47％和59％，在65℃时分别低43％和65％(图2C)。
因此，在电流分析中，反平行和平行PNA探针均能区分完全互补dsDNA靶和那些含有1个或2个碱基对突变的不完全互补dsDNA靶。
实施例3
3号探针是15聚体的ssDNA，在序列和方向上均与15聚体的1号反平行探针(SEQ ID NO：8)相同。3号探针结构如下：5’-CAC CAAAGA TGA TAT-3’。
将3号ssDNA探针与50聚体野生型和突变型dsDNA靶序列在未经预变性条件下反应，以进一步验证电流分析的特异性。该分析条件与实施例1中所述条件等同。
由于DNA嵌入剂YOYO-1的增强作用，在30℃到65℃之间形成了dsDNA：ssDNA三链体。在用1伏电压处理后，由SEQ ID NO：1和3号探针组成的完全匹配DNA三链体产生最高的电导值(图3A)。相反，当不完全互补探针与靶组合生成单碱基对错配(SEQ ID NO：2+3号探针)和连续的两个碱基对错配(SEQ ID NO：3+3号探针)时，导致平均电导值分别比匹配温度下完全匹配序列所观察到的平均电导值在23℃时分别低14％和64％，在50℃时分别低30％和70％，在65℃时分别低25％和72％(图3A)。向这些样品施加更高电压(5V)，与在1V，特别是在更低温度下得到的结果相比，导致完全匹配和错配样品间的电流差别更大。在用5V处理15秒后，与匹配温度下完全匹配DNA三链体所观察到的平均电流相比，单碱基对错配和两个碱基对错配的DNA三链体的平均电流在23℃时分别低54％和78％，在50℃时分别低68％和70％，在65℃时分别低33％和61％(图3B)。
在类似的电学实验中，在施加1V或5V电压前，杂交混合物加热至65℃，并维持在该温度或立即冷却至50℃或23℃。在23℃、50℃和65℃，对完全匹配的DNA三链体序列(SEQ ID NO：1+3号探针)用1V处理15秒产生最高电导值(图3A)。含单碱基对错配的DNA三链体(SEQ ID NO：2+3号探针)或含两个碱基对错配的DNA三链体(SEQ ID NO：3+3号探针)的电导在23℃分别低21％和63％，在50℃分别低18％和74％，在65℃分别低12％和106％(图3A)。类似地，当向预热样品施加5V电压时，与完全匹配的DNA三链体所产生的平均电导值相比，单碱基对错配的DNA三链体和两个碱基对错配的DNA三链体的平均电导值在23℃时分别低24％和104％，在50℃时分别低42％和44％，在65℃时分别低38％和102％(图3B)。
在电流分析中，反平行PNA探针(图1)和ssDNA探针(图3)表现出相似的行为，这表明用作探针的核酸整体的主链不是特别重要。YOYO-1的存在使dsDNA靶和ssDNA探针形成三链螺旋构象，根据溶液中靶和探针间序列互补的程度，能产生不同的电荷。随探针和靶间错配程度增加，电导降低，从而证明电流分析在不进行预变性情况下使用天然DNA探针时具有可靠性。
实施例4
在实施例1-3中所述的电流分析中，将DNA嵌入剂YOYO-1加入含杂交混合物的溶液中。YOYO-1嵌入促进了dsDNA：PNA三链体和dsDNA：ssDNA三链体的形成。实施例4评估了电流分析中利用与ssDNA探针共价连接的嵌入剂部分的可能性。
吖啶也是一种dsDNA嵌入剂，其也具有嵌入核酸三链体结构的能力，由此稳定三螺旋结构。参见，例如Kukreti等，“Extension of therange of DNA sequences available for triple helix formation：stabilizationof mismatched tripliexes by acridine-containing oligonucleotides.”25Nucleic Acids Research 4264-4270(1977)。用DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)合成了在3’端共价连接了吖啶分子(GlenResearch，Sterling，VA，USA)的ssDNA探针，并经HPLC纯化。
4号探针是15聚体ssDNA，序列和方向与3号15聚体探针相同(因此其序列和取向也与1号15聚体反平行PNA探针(SEQ ID NO：8)相同)，只是在3’端添加了一个吖啶部分。该探针结构为：5’-CAC CAAAGA TGA TAT-吖啶-3’。
杂交反应混合物(80μl)含有以下成分：2pmole的靶dsDNA、2pmole的4号ssDNA探针和0.5xTBE。将样品放置在3mm石英杯中，并在23℃以5伏DC通电11秒。如实施例1所述检测电流和温度。
如图4所示，由于稳定嵌入了共价连接的吖啶部分，4号ssDNA探针能与完全匹配的50聚体dsDNA靶(SEQ ID NO：1)杂交，产生-0.53mA的平均电流。相比之下，当根据对照(无靶DNA的4号探针)校准后，与完全匹配的DNA三链体所得结果相比，含1个碱基对错配的较不稳定DNA三链体(SEQ ID NO：2+4号探针)或含2个碱基对错配的较不稳定DNA三链体(SEQ ID NO：3+4号探针)产生的平均电流分别低52％和66％(图4)。
因此，在电流分析中，对于形成DNA三螺旋，连接到ssDNA探针上的吖啶与未连接的YOYO-1同等有效，根据靶和探针的序列互补程度，所述DNA三螺旋产生不同的电流。
实施例5
如实施例1中所述，合成了来自人囊性纤维化基因的外显子10的有义和反义15聚体ssDNA靶序列，将其纯化，退火。dsDNA寡核苷酸溶解在双蒸水中，终浓度为1pmole/μl。
SEQ ID NO：4是来源于SEQ ID NO：1的15聚体dsDNA靶序列，其设计成与1号探针完全互补。
野生型靶DNA(SEQ ID NO：4)的有义链的序列为：5’-ATA TCATCT TTG GTG-3’。
野生型靶DNA(SEQ ID NO：4)的反义链的序列为：5’-CAC CAAAGA TGA TAT-3’。
dsDNA(SEQ ID NO：4)的熔点(Tm)预计为40.0℃。
SEQ ID NO：5是与野生型靶DNA(SEQ ID NO：4)相类似的15聚体的突变dsDNA靶序列，只是有一个碱基对的突变(下划线)，其中将序列TTT变为TAT。
突变体靶DNA(SEQ ID NO：5)的有义链序列为：5’-ATA TCA TCTATG GTG-3’。
突变体靶DNA(SEQ ID NO：5)的反义链序列为：5’-CAC CA T AGATGA TAT-3’。
dsDNA(SEQ ID NO：5)的熔点(Tm)预计为40.0℃。
SEQ ID NO：6是与野生型靶DNA(SEQ ID NO：4)相类似的15聚体的突变dsDNA靶序列，只是有连续两个碱基对的突变(下划线)，其中序列ATC变为 GGC。
突变体靶DNA(SEQ ID NO：6)的有义链序列为：5’-ATA TC G  GCTTTG GTG-3’。
突变体靶DNA(SEQ ID NO：6)的反义链序列为：5’-CAC CAAAG C  CGA TAT-3’。
dsDNA(SEQ ID NO：6)的熔点(Tm)预计为44.0℃。
SEQ ID NO：7是与野生型靶DNA(SEQ ID NO：4)相类似的15聚体的突变dsDNA靶序列，只是有分开的三个碱基对的突变(下划线)，其中三个单碱基对突变各为三个碱基对所分开，序列ATC、TCT和TGG分别变为A CC、T AT和T AG。
突变体靶DNA(SEQ ID NO：7)的有义链序列为：5’-ATA  CCA T ATTT A GTG-3’。
突变体靶DNA(SEQ ID NO：7)的反义链序列为：5’-CAC  TAA A TATG G TAT-3’。
dsDNA(SEQ ID NO：7)的熔点(Tm)预计为38.0℃。
杂交反应混合物(80μl)含有以下成分：2pmole的靶dsDNA、2pmole的2号平行PNA探针、0.5xTBE和250nM的DNA嵌入剂YOYO-1。反应混合物在95℃温育5到10分钟使其变性，接着保存于65℃直到分析。样品放于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，在65℃监测荧光发射情况。通过一个由软件控制的直接放置在各样品中的温度传感器，同时实现温度检测。最大荧光强度产生于536nm波长，表明YOYO-1嵌入了PNA：DNA杂合体。作为第二分析，在对各样品进行初始激光照射后，对相同样品进行1V DC通电4秒。在通电的最后1秒，这些样品用氩离子激光束再一次照射，并在65℃监测荧光发射情况。各分析样品的荧光强度作为波长的函数进行绘图。
由完全互补序列组成的ssDNA：PNA杂合体(SEQ ID NO：4+2号探针)使得YOYO-1最大嵌入，产生最强的荧光强度(图5A)。单碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体(SEQ ID NO：5+2号探针)、连续两个碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体(SEQ ID NO：6+2号探针)和分开的三个碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体(SEQ ID NO：7+2号探针)在65℃时荧光强度都比完全匹配的ssDNA：PNA杂合体所得的荧光强度低(图5，数据没有列出)。随着探针与靶之间的错配程度增加，YOYO-1嵌入的水平降低，因而荧光强度也降低。当不存在任何DNA和PNA时(仅YOYO-1)，只观察到背景荧光(图5A)。
当在65℃对完全匹配的ssDNA：PNA杂合体以1V通电4秒，荧光强度保持相对恒定，只降低2％(图5A)。相反，与在不加电压情况下照射相同样品所得到的结果相比，向含单碱基对错配(图5B)、两个碱基对错配(图5C)和三个碱基对错配(数据没有列出)的不完全互补双链体施加1V电压产生的荧光强度分别低18％、39％和71％。用低电压电流(例如1V)处理会进一步减小含碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体的稳定性。当在通电情况下，随探针和靶间序列互补程度降低，荧光强度显著降低，从而提供了高度可靠且精确的第二分析，用于区分完全匹配序列和含单碱基对、两个碱基对或三个碱基对突变的序列。
实施例6
实施例5中的杂交分析是在将dsDNA靶序列变性并在高于dsDNA靶序列熔点(Tm)的温度测量ssDNA：PNA杂合体形成之后进行的。实施例6将证明在施加和不施加电压时荧光强度分析的可靠性，从而无需预变性就可区分完全匹配和碱基对错配。
杂交反应混合物(80μl)含有以下成分：4pmole的靶dsDNA、4pmole的1号反平行PNA探针、0.5xTBE和250nM的DNA嵌入剂YOYO-1。样品放于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射80毫秒，并在23℃监测荧光发射情况。通过一个由软件控制的直接放置在各样品中的温度传感器，同时实现温度检测。最大荧光强度产生于536nm波长，表明YOYO-1嵌入了PNA：DNA杂合体。作为第二分析，在对各样品进行初始激光照射后，对相同样品进行20V DC通电4秒。在通电3秒后，这些样品立即用氩离子激光束再一次照射80毫秒，并在23℃监测荧光发射情况。各分析样品的荧光强度作为波长的函数进行绘图。
为嵌入剂YOYO-1所增强，在23℃形成了dsDNA：PNA三链体。当野生型50聚体dsDNA靶序列(SEQ ID NO：1)与1号15聚体反平行PNA探针杂交时，产生最强的荧光强度(图6)。相比之下，单碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)和连续两个碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)在23℃时荧光强度分别比完全匹配的dsDNA：PNA三链体的荧光强度低60％和91％(图6)。当含YOYO-1的反应混合物中不存在任何DNA和PNA时，只观察到背景荧光。
由完全互补的三链体和含单碱基对错配或两个碱基对错配的三链体得到的荧光强度差别明显比完全匹配的双链体和不完全互补的双链体间荧光强度差别大(比较图5和图6)。显然，对于检测碱基对错配，形成三链体的荧光强度分析具有较强的区分能力。
此外，二次施加电压甚至可进一步区分野生型和突变序列。完全匹配的dsDNA：PNA三链体以20V处理3秒所产生的荧光强度光谱基本上与未施加电压的相同样品所产生的荧光强度光谱相同(图6)。但对含单碱基对错配和两个碱基对错配的不完全互补三链体施加20V电压3秒所产生的荧光强度分别比不通电下照射的相同样品所产生的荧光强度低23％和71％(图6)。20V电处理不影响完全互补三链体的稳定性，但降低含碱基对错配的dsDNA：PNA三链体的稳定性，其影响程度取决于探针和靶间的序列互补程度。因此，在荧光强度分析中施加电压，提供了更可靠的分析，用以在不需要序列预变性的情况下区分野生型序列和含单碱基对或两个碱基对突变的序列。
尽管本发明在此做了详细说明，并列举特定的范例，对于本领域技术人员而言，显然在不背离本发明实质和范围的情况下，还可有多种改变和修饰。
                         序列表
<110>皮埃尔·皮卡德(Picard，Pierre)
亚斯曼·I·戴克斯(Daksis，Jasmine)
格伦·H·埃里克森(Erikson，Glen)
<120>在不同条件下利用多种测量方法对双链体或三链体杂交进行均相分析(HOMOGENEOUSASSAY OF DUPLEX OR TRIPLEX HYBRIDIZATION BY MEANS OF MULTIPLE MEASUREMENTS UNDERVARIED CONDITIONS)
<130>E1047/20031
<140>
<141>
<160>9
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：来自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>1
tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>2
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：来自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>2
tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>3
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：来自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>3
tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata 50
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：来自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>4
atatcatctt tggtg  15
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：来自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>5
atatcatcta tggtg 15
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：来自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>6
atatcggctt tggtg  15
<210>7
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：来自人囊性纤维化基因的外显子10
<400>7
ataccatatt tagtg  15
<210>8
<211>15
<212>PNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：ssPNA探针
<400>8
caccaaagat gatat 15
<210>9
<211>15
<212>PNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：ssPNA探针
<400>9
tatagtagaa accac

Claims (53)

1.一种分析序列特异性杂交的方法，所述方法包括：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含核酸或核酸类似物序列的探针；
将所述探针和所述靶加入杂交介质，以提供检测样品；
将第一刺激物施加到所述检测样品上，以提供第一受激检测样品；
从所述第一受激检测样品中检测第一信号，其中所述第一信号与所述探针和所述靶间的结合亲和力相关；
根据参照样品所显示的参照信号校准所述第一信号，所述参照样品包括与所述靶结合的至少一种参照探针，其中相对于所述靶，各所述探针和所述至少一种参照探针是选自如下组的不同成员：完全匹配、单碱基错配、二碱基错配、三碱基错配、单碱基缺失、二碱基缺失和三碱基缺失；以及
由所述校准来确定所述探针与所述靶之间匹配程度的第一测定值；
将第二刺激物施加到所述第一受激检测样品上，以提供第二受激检测样品；
从所述第二受激检测样品中检测第二信号，其中所述第二信号与所述探针和所述靶间的结合亲和力相关；
由所述第二信号的所述检测来确定所述探针与所述靶之间所述匹配程度的第二测定值；以及
比较所述第一测定值和所述第二测定值，
其中在所述检测样品中提供一荧光团；以及其中：(a)所述第一刺激物是电压，所述第一信号是电特性，所述第二刺激物是激发辐射以及所述第二信号是荧光强度；或者(b)所述第一刺激物是激发辐射，所述第一信号是荧光强度，所述第二刺激物是电压以及所述第二信号是电特性。
2.权利要求1的方法，其进一步包括量化所述结合亲和力。
3.权利要求1的方法，其中所述方法是在所述靶无需预变性的情况下进行的均相分析。
4.权利要求1的方法，其中所述方法是在所述靶无需PCR扩增的情况下进行的均相分析。
5.权利要求1的方法，其中所述检测样品进一步包括嵌入剂，所述靶是dsDNA，所述探针特异性地与所述靶杂交形成三链体。
6.权利要求1的方法，其中所述探针是ssDNA或RNA。
7.权利要求1的方法，其中所述探针具有带部分电荷的主链。
8.权利要求1的方法，其中所述探针具有不带电荷的主链。
9.权利要求8的方法，其中所述探针包括ssPNA序列。
10.权利要求1的方法，其中所述探针是经反平行合成而制备的ssPNA。
11.权利要求1的方法，其中所述探针和所述靶长度相同。
12.权利要求1的方法，其中所述探针长度为6-30个核苷酸。
13.权利要求1的方法，其是在孔内或不透性表面上的溶液中进行的。
14.权利要求1的方法，其是在生物芯片上进行的。
15.权利要求1的方法，进一步包括在所述施加所述第二刺激物之前改变所述第一受激检测样品的条件，其中所述改变足以显著影响所述探针与所述靶之间的不完全互补杂交，且不足以显著影响所述探针与所述靶之间的完全互补杂交。
16.权利要求15的方法，其中所述改变包括向所述第一受激检测样品施加电压，并且所述结合亲和力与所述第一信号和所述第二信号间的差别正相关。
17.权利要求16的方法，其中所述电压是约1V-约20V。
18.权利要求16的方法，其中所述电压是直流或交流电压。
19.权利要求1的方法，其中所述第一信号或第二信号是电导。
20.权利要求19的方法，其中所述电导指示所述探针和所述靶间的匹配程度。
21.权利要求20的方法，其中所述电导是相对于加入所述探针和所述靶前的所述杂交介质的参照电导而言的。
22.权利要求20的方法，其中测量了所得到的最大初始安培数。
23.权利要求22的方法，其中测量了安培数由所述最大初始安培数峰值下降的比率。
24.权利要求20的方法，其中测量了在所述施加所述电压期间的安培数。
25.权利要求20的方法，其中所述方法的灵敏度足以将单碱基对错配探针-靶复合体与两个碱基对错配探针-靶复合体区别开来。
26.权利要求20的方法，其中所述方法的灵敏度足以将完全互补的探针-靶复合体与单碱基对错配探针-靶复合体和两个碱基对错配探针-靶复合体区别开来。
27.权利要求20的方法，其中所述检测样品进一步包括嵌入剂，所述靶是dsDNA，所述探针特异性地与所述靶杂交形成三链体。
28.权利要求20的方法，其中所述探针是ssDNA。
29.权利要求20的方法，其中所述探针是PNA。
30.权利要求1的方法，进一步包括：
在所述检测样品中提供一荧光团；以及
根据第二参照信号校准所述第二信号。
31.权利要求30的方法，其中所述荧光团与所述探针共价连接，其连接方式使得所述荧光团不嵌入相邻碱基之间，所述强度随所述探针和所述靶间的匹配程度的增加而降低。
32.权利要求30的方法，其中所述荧光团是嵌入剂，所述强度随所述探针和所述靶间的匹配程度的增加而增加。
33.权利要求30的方法，其中所述荧光团是与所述探针共价连接的嵌入剂。
34.权利要求30的方法，其中所述荧光团是嵌入剂，其被加入到不含所述探针和不含所述靶的所述杂交介质中。
35.权利要求30的方法，其中所述检测样品进一步包括嵌入剂，所述靶是dsDNA，所述探针特异性地与所述靶杂交形成三链体。
36.权利要求15的方法，进一步包括在所述检测样品中提供一荧光团，其中所述改变包括向所述第一受激检测样品施加电压，所述第一刺激物和所述第二刺激物是激发辐射，以及所述第一信号和所述第二信号是荧光强度。
37.权利要求36的方法，进一步包括根据所述第一信号校准所述第二信号，以确定所述靶和所述探针间的匹配程度。
38.权利要求36的方法，其中所述荧光团与所述探针共价连接，其连接方式使得所述荧光团不嵌入相邻碱基之间，并且所述强度随所述探针和所述靶间的所述匹配程度的增加而降低。
39.权利要求36的方法，其中所述荧光团是嵌入剂，所述强度随所述探针和所述靶间的匹配程度的增加而增加。
40.权利要求36的方法，其中所述荧光团是与所述探针共价连接的嵌入剂。
41.权利要求36的方法，其中所述荧光团是嵌入剂，其被加入不含所述探针和不含所述靶的所述杂交介质中。
42.权利要求36的方法，其中所述荧光团是选自如下组的嵌入剂：YOYO-1、TOTO-1、溴化乙啶、乙啶同型二聚体-1、乙啶同型二聚体-2和吖啶。
43.权利要求36的方法，其中所述检测样品进一步包括嵌入剂，所述靶是dsDNA，所述探针特异性地与所述靶杂交形成三链体。
44.权利要求36的方法，其中所述方法是一种均相分析，其在无需给所述靶或所述探针提供信号淬灭剂的情况下进行。
45.权利要求36的方法，其中所述激发辐射是由波长为约200nm到约1000nm的氩离子激光器发射出的。
46.权利要求36的方法，其在温度为5到85℃时进行。
47.权利要求36的方法，其在温度低于25℃时进行。
48.权利要求36的方法，其中所述方法的可靠性不依赖于探针或靶碱基序列，并且不依赖于探针或靶的鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。
49.权利要求36的方法，其中所述检测样品体积约为20μl，含有约10fmole的靶和约10fmole的探针。
50.权利要求1的方法，其中所述检测样品体积约为40μl，含有约1pmole的靶和约1pmole的探针。
51.权利要求36的方法，其中所述样品中所述靶的浓度不高于5×10-10M。
52.权利要求51的方法，其中所述样品中所述探针的浓度不高于5×10-10M。
53.权利要求36的方法，其中所述荧光团是嵌入剂，在嵌入后所述嵌入剂发出荧光时所处的波长转变为第二波长，所述波长与所述第二波长之间的差异表明所述探针与所述靶间形成的复合体是否是双链体或三链体，以及所述靶是否是DNA或RNA。
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