CN1272136A - 体外造血细胞的刺激 - Google Patents
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Abstract
提供了体外刺激造血细胞的量和/或分化的方法、组合物、设备。方法涉及在没有外源性加入的细胞因子的情况下将造血细胞与二肽基肽酶(DPIV)抑制剂接触。
Description
本申请依据美国法典第35卷第119(e)的规定，享有1997年9月29日提交的申请号为60/060,306的美国临时申请的优先权，题目为体外造血细胞的刺激，其全部内容通过在此引述而合并于本篇。
本发明的领域
本发明涉及使用与二肽基肽酶IV(DPIV也称作CD26)结合的试剂体外刺激造血细胞。
本发明的背景
骨髓移植广泛地应用在进行大剂量化疗或放射治疗的患者中。化疗和放射治疗的剂量限制副作用是指它们通过破坏所有造血细胞的前体细胞-骨髓细胞，对造血细胞的有害作用。对骨髓的这种破坏导致骨髓抑制或骨髓消融，使患者在较长一段时间易受机合感染。骨髓移植涉及输注能重建患者造血系统，包括免疫系统的早期骨髓祖细胞。移植减短了化疗或放射治疗后免疫系统恢复通常所需的时间，这样，就减短了机合感染的风险时间。
骨髓细胞含有产生包括淋巴、脊髓、红细胞的全部种类造血细胞的全能干细胞。干细胞能更新自身，也能分化成所有种类造血细胞的祖细胞。祖细胞保留增殖及产生全部种类分化细胞的能力。分化的细胞丧失增殖及表现出对其种类细胞(如巨噬细胞，粒性白细胞，血小板，血红细胞，T细胞和B细胞)特异形态特性的能力。干细胞和祖细胞在其表面表达CD34，而分化的细胞没有表达。骨髓包括干细胞及淋巴(T和B细胞)，脊髓(粒性白细胞、巨噬细胞)和红细胞(血红细胞)种类的祖细胞。使用在骨髓移植中，造血前体细胞可从癌症患者(自身移植)或从组织相容的供体(同种异型供体)中获取。这些细胞可从骨髓，外周血液或从脐带血液中分离。一次可获得的祖细胞的量很小，在很多情况下不足以作成功移植。因此，已发展了几种对从血液分离程序(aphereses，一种从供体的血液中获得有关成分，然后将其余的血液部分返还给供体的程序)或脐带血液中获得的祖细胞在体外扩增骨髓细胞的方法。
能够扩增这些细胞帮助先前的骨髓移植技术成为涉及大剂量化疗和/或放射治疗的癌症治疗的可行的附属方法。然而，存在的造血细胞扩增的方法需要加入适当的细胞因子，以使造血干细胞体外扩增。这种生长因子的高成本不利地影响了此领域的技术人员，为移植或其他目的而进行的体外造血细胞扩增。因此，存在发展造血细胞体外扩增新方法的需要，其中不需要外源加入支持细胞生长及分化的细胞因子。
本发明的概述
本发明提供刺激造血细胞体外生长和分化的方法和组合物。有利的是，本发明的方法不需要外源加入细胞因子以支持造血细胞体外刺激作用。因此，本发明的方法和组合物对于增加体外造血细胞的量和/或促使早期祖细胞的分化是有用的。在培养物中增加造血细胞的量和/或分化可鉴定不同条件下培养物中的这种细胞，并可使用这种培养的细胞来制备体外重组体或从体外自然产生的分子。此外，本发明的刺激的造血细胞对治疗，其特点在于体内造血细胞或其前体细胞减少的病变是有用的。这样的情况常常在免疫抑制的患者中出现，如，由于癌症的化疗和/或放射治疗。
本发明的新颖性基于，至少部分基于发现二肽基肽酶类型IV(DPIV)抑制剂，在没有外源加入的细胞因子或其他生长因子或基质细胞的情况下，对刺激造血细胞的生长和分化是有用的。这种发现与造血细胞刺激作用领域中的定论是抵触的，定论指出对于保持及刺激培养物中的造血细胞的生长和分化，加入细胞因子或产生细胞因子的细胞(基质细胞)是必要因素(参阅如，PCT国际申请编号No.PCT/US93/017173，公布号为WO94/03055)。
依据本发明的一个方面，提供了一种刺激体外造血细胞生长和分化的方法。该方法涉及：(1)将造血细胞与充足量的二肽基肽酶IV抑制剂相接触以增加造血细胞的量和/或分化，在存在抑制剂的情况下培养的细胞，与在对比培养物中的，未与抑制剂接触的，但使用与存在抑制剂培养的造血细胞相同的培养条件，造血细胞的量和分化状况相比；(2)在存在抑制剂及不存在外源加入的细胞因子情况下，并有充分的时间培养造血细胞，增加造血细胞的量和/或这种细胞的分化与存在于对比培养物中的造血细胞的量相比；(3)在存在或不存在基质细胞的情况下培养造血细胞，(4)在存在DPIV抑制剂的情况下培养基质细胞。通常，增加造血细胞的量是指，增加造血细胞的量与当细胞与抑制剂最初接触时存在在的造血细胞的量相比至少约为2倍。通常，存在于对比培养物中的，没有与抑制剂接触但处理方式相同的细胞量，与在与抑制剂接触之前的培养物中的细胞初始量基本相同。较好地，与当造血细胞最初与抑制剂接触时存在造血细胞的量相比，造血细胞增加至少约4倍、10倍、20倍、或更好的为100倍。
如本文所使用的，造血细胞包括造血干细胞，原始干细胞，早期祖细胞，CD34+细胞，间叶细胞，脊髓，淋巴及红细胞的早期种类细胞，骨髓细胞，血细胞，脐带血细胞，基质细胞，和此领域普通技术人员已知的其他造血前体细胞。
如本文所使用的，二肽基肽酶IV(DPIV)抑制剂通常是指抑制DPIV功能活性的分子。因此，本发明的抑制剂包括二肽基肽酶IV酶活性抑制剂。较好地，DPIV酶活性抑制剂通过共价结合或通过形成离子相互作用与DPIV活性位点相联系。这样的抑制剂包括DPIV竞争性抑制剂，如DPIV的过渡态拟似物，DPIV非竞争性抑制剂，如氟代烷基酮。DPIV抑制剂还包括在DPIV蛋白质位点上而不是活性位点上与DPIV选择性结合(共价或离子相互作用)，从而抑制DPIV酶活性的的DPIV非竞争性抑制剂。这样的非竞争性抑制剂是一种与DPIV选择性结合的结合分子，具有在体外刺激造血细胞或胸腺细胞的能力。其他与DPIV选择性结合的并具有在体外刺激造血细胞能力的结合分子包括单克隆抗体，多克隆抗体和前述能：(1)与DPIV结合，(2)在体外刺激造血细胞和/或胸腺细胞的片段。使用在本发明上下文中的DPIV抑制剂可以是固定化或不溶形式的。通常，前述抑制剂可以是单价的，二价的，或多价的。(参阅如美国申请号08/671,756和08/837,305，题目为“交联受体的多价化合物及其应用”，其中描述了DPIV抑制剂的二聚物和其他共轭物)。固定化DPIV抑制剂对于各种固定结构包括传统培养容器(如搅拌烧瓶，搅拌釜式反应器，气升式反应器，悬浮细胞反应器，细胞吸附反应器，细胞捕集反应器，培养皿，多孔板，微型滴定板，测试管，培养烧瓶、袋和中空纤维装置，和细胞泡沫)可以是固定的。这种固定结构较好地由包括如，聚苯乙烯，聚丙烯，丙烯酸酯聚合物，尼龙，布，硝化纤维，琼脂糖，琼脂糖凝胶等等物料构成。
依据本发明的这种方法，当细胞在存在抑制剂的情况下培养时，将在固定化结构中或在含可溶性DPIV抑制剂的选择性细胞培养装置中的造血细胞，与充分量的DPIV抑制剂接触，以增加造血细胞的量和/或使这样的细胞分化。通常，确定造血细胞量的增加和/或其分化状态可使用此领域中普通技术人员已知的传统方法测定。本发明的一个重要优势是培养的造血细胞可在不存在外源加入细胞因子的情况下发生分化和/或量增加。通过提供在不存在外源加入细胞因子的情况下刺激造血细胞的方法，本发明为培养这种细胞提供了显著成本节省，以及通过去除申请人已发现的不再是刺激培养物中造血细胞的必要试剂，有利地减小了污染这种细胞培养物的可能性。
依据本发明的另一方面，提供一种实施本发明方法的装置。装置包括容器和包含在其中或附着在其上的DPIV抑制剂。较好地，容器是消毒容器，是从任何一种前述的此领域中普通技术人员已知的细胞培养容器中选取的。DPIV抑制剂以可溶或固定化形式包含在容器中或直接附着在容器的内表面。如，DPIV可包括磁性颗粒，其上附着着一种或多种不同的DPIV抑制剂。除了含有固定化或可溶的DPIV抑制剂，容器还任意地包括一种或多种细胞培养生长介质组成。这样的组成对此领域中的普通技术人员是熟知的。
依据本发明的另一个方面，提供一套刺激培养物中造血细胞的工具。工具包括上面描述的装置和使用装置刺激体外造血细胞的用法说明。
依据本发明的另一个方面，提供体外刺激造血细胞和扩增抗原-特异T细胞的方法。刺激和扩增步骤可同时实施或顺序实施。下面阐述这种方法的三个具体实施来说明这种方法。通常，具体实施彼此区分在体外刺激的造血细胞的选取上。在每个具体实施中，培养步骤可在存在或不存在加入的细胞因子或基质细胞的情况下实施。使用在每一种具体实施中的较好的复共轭对配合物含有与本发明的DPIV抑制剂共轭的肿瘤特异抗原或病原特异抗原。
这种方法的第一个具体实施是获得抗原特异T细胞，涉及刺激培养物中的骨髓细胞。培养物中骨髓细胞可包括细胞的混合物；然而，较好地，培养物中的骨髓细胞是分离的CD+34细胞或分离的干细胞。依据这个具体实施，方法包括：(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养骨髓细胞(如DPIV单体和/或共轭对配合物)以扩增培养物中早期T种类细胞的量；(2)用充分量的含抑制剂的复共轭对配合物培养早期T种类细胞，其中DPIV抑制剂附着在抗原肽上(如肿瘤-或病原特异抗原)，以扩增培养物中抗原特异T细胞的量。步骤(2)可在存在或不存在特异抗原的情况下实施。步骤(1)和(2)可同时实施或顺序实施。通常，将抗原特异T细胞的量与(除了对比培养物不与复共轭对配合物接触)用如步骤(1)和(2)处理的骨髓细胞的对比培养物相比较。在每个步骤中，细胞在DPIV抑制剂中培养足够长的时间，以增加早期T种类细胞的量和扩增抗原特异T细胞的量，分别与对比培养物中这种细胞的存在量相比。
第二个具体实施目的在于刺激培养物中脐带血细胞。这个具体实施涉及：(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养脐带血细胞(如DPIV单体和/或共轭对配合物)以扩增培养物中早期T种类细胞的量；(2)用充分量的含抑制剂的复共轭对配合物培养早期T种类细胞，其中DPIV抑制剂附着在抗原肽上(如肿瘤-或病原特异抗原)，以扩增培养物中抗原特异T细胞的量。步骤(2)可在存在或不存在特异抗原的情况下实施。步骤(1)和(2)可同时实施或顺序实施。通常，将抗原特异T细胞的量与(除了对比培养物不与复共轭对配合物接触)用如步骤(1)和(2)处理的脐带血细胞的对比培养物相比较。在每个步骤中，细胞在DPIV抑制剂中培养足够长的时间，以增加早期T种类细胞的量和扩增抗原特异T细胞的量，分别与对比培养物中这种细胞的存在量相比。
第三个具体实施目的在于刺激培养物中外周血液干细胞。这个具体实施涉及：(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养外周血液干细胞(如DPIV单体和/或共轭对配合物)以扩增培养物中早期T种类细胞的量；(2)用充分量的含抑制剂的复共轭对配合物培养早期T种类细胞，其中DPIV抑制剂附着在抗原肽上(如肿瘤-或病原特异抗原)，以扩增培养物中抗原特异T细胞的量。步骤(2)可在存在或不存在特异抗原的情况下实施。步骤(1)和(2)可同时实施或顺序实施。通常，将抗原特异T细胞的量与(除了对比培养物不与复共轭对配合物接触)用如步骤(1)和(2)处理的外周血液干细胞的对比培养物相比较。在每个步骤中，细胞在DPIV抑制剂中培养足够长的时间，以增加早期T种类细胞的量和扩增抗原特异T细胞的量，分别与对比培养物中这种细胞的存在量相比。另外，由于已知外周血液含有T细胞，所以，可能在没有刺激步骤(1)的情况下，培养物中抗原特异T细胞的量扩增，如扩增抗原特异T细胞的方法涉及用充分量的含抑制剂的复共轭对配合物培养早期T种类细胞，其中DPIV抑制剂附着在抗原肽上(如肿瘤-或病原特异抗原)，以扩增培养物中抗原特异T细胞的量。这个步骤可在存在或不存在特异抗原的情况下实施。
参考示图和本发明的详细描述，本发明的这些和其他方面，以及应用中的多种优势会更清楚。
附图简要说明图1
分离出新鲜分离骨髓细胞，每个培养皿10,000个细胞在96微型滴定板Iscove改进Dulbecco培养基(IMDM)上，有或没有(对比)指定浓度的Pro-boroPro温育4天。在这个温育阶段最后，在显微镜下计数细胞。在第4天末没有Pro-boroPro的培养物含10,000个细胞，含Pro-boroPro的培养物，在10-6M下有53,000个细胞，在10-8M下有38,000个细胞，在10-10M下有42,000个细胞。含生长因子混合物(GF)的培养物含82,000个细胞。生长因子是在OPTION_巨型细胞肿瘤-调节培养基(IGEN)中提供的。图2
在如图1图例中所示的基本相同的条件下温育脐带血细胞，除了使用指定浓度的Val-boroPro作刺激剂，温育4天后：
A：大量脐带血液；总量细胞计数。对比培养物：0.2×106个细胞；生长因子5×106个细胞；Val-boroPro：3×106(10-6M)，3×106(10-8M)，4×106(10-10M)。
B：CD34+分离细胞：CD34+细胞采用CD34mAb结合玻珠作正选择分离细胞制备含有98％CD34+细胞。温育4天后含10-10M Val-boroPro的培养物含8.5×106个细胞，与生长因子温育物中的4×106个细胞和对比物中的0.6×106个细胞相比。
C：4天培养后残留CD34+细胞的百分数：用Val-boroPro温育的培养物4天培养后含10到15％的CD34+细胞。用生长因子温育的培养物仅有4％的CD34+细胞残留(试验组b)。这说明Val-boroPro除了对CD34+细胞分化成成熟外周血细胞有作用外，还对CD34+细胞生长有刺激作用。观察在Val-boroPro和生长因子存在的情况下培养这些CD34+细胞，从只用Val-boroPro培养观察到的百分数中没有改变培养物中CD34+细胞％可证实这一点，尽管与在只用Val-boroPro的温育物(试验组a)中的8.5×106个细胞相比，在这种组合培养物中细胞的总量已增加到55×106个细胞。图3
与Lys-boroPro单体的作用相比，二聚化的Lys-boroPro(共轭对配合物)显著地增加了对骨髓细胞生长的刺激作用。培养物用如图1图例中所示的构成，除了使用Lys-boroPro和共轭对配合物，温育4天。图4
骨髓细胞用如图1所述温育，除了在4天培养中使用Val-boroPro和共轭对配合物。
A：Val-boroPro与生长因子混合物(GF)提供了相似的骨髓细胞扩增，而二聚物加倍了作用。
B：(试验组a)：用Val-boroPro温育分离的CD34+细胞(98％纯度)提供了多达20倍的细胞生长刺激作用的增加，与用生长因子培养的18倍的增加相比超过了对比培养物。共轭对配合物在10-6M浓度下增加生长因子活性125倍，在10-6M增加96倍。
(试验组b)：4天温育后培养物中残留的CD34+细胞的百分数：对比物63％；GF5％；Val-boroPro43％；均二聚物10％。
本发明的详细叙述
本发明提供了刺激培养物中造血细胞的一种改进方法，具体地，是在没有外源加入细胞因子的情况下刺激体外造血细胞的一种方法。申请人的发明涉及发现，当加入DPIV抑制剂时，对于造血细胞的保持或刺激作用，向培养物中的造血细胞加入细胞因子或细胞因子表达细胞(基质细胞)不是必要因素。因此，由于去除了向细胞培养物中提供细胞因子必要，申请人的发现带来显著的成本节省，以及有利地消除了培养物中这种细胞的潜在污染源。
依据本发明的一个方面，提供了一种体外刺激造血细胞的方法。该方法涉及：(1)将造血细胞与充足量的二肽基肽酶IV(DPIV)抑制剂相接触以增加造血细胞的量和/或这种造血细胞分化，与在对比培养物中的未与抑制剂接触的，但使用与存在抑制剂培养的造血细胞相同的培养条件的，造血细胞的量和分化状况相比；(2)在存在抑制剂及不存在外源加入细胞因子情况下，并有充分的时间培养造血细胞，增加造血细胞的量和/或其分化与存在于对比培养物中的造血细胞的量相比。如本文所用的，刺激造血细胞是指诱导造血细胞生长和/或分化。这样，本发明的方法及组合物和设备对于增加细胞量及促使早期祖细胞分化是有用的。造血细胞：
如本文所用的，造血细胞是指涉及制备血细胞的细胞。造血细胞的示例包括造血干细胞，原始干细胞，早期祖细胞，CD34+细胞，间叶细胞，脊髓，淋巴，红细胞的早期种类细胞，骨髓细胞，血细胞，脐带血细胞，基质细胞，和此领域普通技术人员已知的其他造血前体细胞。
依据此领域中的传统，造血细胞的定义不包括胸腺细胞。从胸腺获得的胸腺细胞不被认为是“造血祖细胞”是因为这样的细胞是从胸腺获得的并且已经定型。申请人已发现本发明的某些方法对于造血细胞和胸腺细胞都是有用的。因此，可以认为本发明的方法可以只用造血细胞实施，只用胸腺细胞实施，或用造血细胞和胸腺细胞一起实施。
骨髓细胞含全能干细胞，其产生包括淋巴，脊髓，红细胞全部种类的造血细胞。干细胞能更新自身，也能分化成所有种类造血细胞的祖细胞。祖细胞保留增殖及产生全部种类分化细胞的能力。分化的细胞丧失增殖及表现出对其种类细胞(如巨噬细胞，粒性白细胞，血小板，血红细胞，T细胞和B细胞)特异形态特性的能力。骨髓包括干细胞及淋巴(T和B细胞)，脊髓(粒性白细胞、巨噬细胞)和红细胞(血红细胞)种类的祖细胞。干细胞和祖细胞在其表面表达CD34，而分化细胞没有表达。因此，鉴定CD34可用来区分分化细胞和未分化细胞。
使用在骨髓移植中，造血前体细胞可从癌症患者(自身移植)或从组织相容的供体(同种异型供体)中获取。这些细胞可从骨髓，外周血液或从脐带血液中分离。通常，在化疗或放射治疗前获取细胞。骨髓一般是从iliac骨栉吸取，是一个时间长且痛苦的过程。骨髓富含CD34+细胞；一般1％到2％的骨髓细胞是前体细胞。外周血液一般含少于1％的CD34+细胞。为了富化CD34+细胞，通过用低剂量的化疗或用某些细胞因子如G-CSF或SCF的预处理，将血液祖细胞从骨髓迁移到外周。脐带血液非常富含早期祖细胞，并很有希望作为造血细胞移植的一个细胞源。
从任何细胞源一次可获取的祖细胞的量很小，在很多情况下不足以作成功移植。因此，已发展了几种在体外培养物中对从血液分离程序(aphereses)或脐带血液中获得的祖细胞进行扩增骨髓细胞的方法。能够扩增这些细胞帮助先前的骨髓移植技术成为涉及大剂量化疗和/或放射治疗的癌症治疗的可行的附属方法。造血干细胞的体外扩增需要加入适当的生长因子及由称为基质细胞提供的某些生长条件。基质细胞给造血祖细胞提供了物理载体及增加干细胞量所需的某些生长因子。
从未分化细胞中分离CD34+细胞(分化细胞)可通过多种不同方法实现。最广泛使用的是依据将这些细胞与固定在固体载体(Cellpro，Baxter)上的抗-CD-34抗体结合的正免疫选择。其他选择方法包括负选择，其中根据肽酶种类特异细胞表面抗原的表达，将不表达CD34+的所有细胞从CD34+细胞中分离。
在本发明的某些具体实施中，造血细胞用不存在加入的细胞因子，基质细胞或胸腺细胞的单体刺激。在其他具体实施中，造血细胞或胸腺细胞用不存在或存在加入的细胞因子或基质细胞的本发明的化合物(较好地，不包括单体)刺激。申请人已使用本发明代表性的单体和共轭物刺激不存在细胞因子和/或基质细胞的分离CD34+细胞(如基质细胞已被移出)。申请人也已说明这样的细胞能在液态培养物中刺激生长和分化。这样，本发明的一个重要优势是本文所公开的方法不需要造血细胞或胸腺细胞刺激作用的基质细胞。本发明的另一个重要优势是本文所公开的方法和化合物对刺激人类干细胞(CD34+)是有用的。对于扩增，这种靶细胞是很重要的靶细胞，因为它们能分化成成熟的细胞类型，具有重要的治疗应用。不存在加入的细胞因子或基质细胞刺激干细胞先前没有报道过。培养造血细胞：
祖细胞的扩增可在多种不同的培养容器中，在不同的培养条件下实施。通常，使用在先有技术方法中的用于培养造血细胞的相同培养条件使用在本文中，除了用DPIV抑制剂替代先有技术培养方法中的细胞因子。培养细胞的先有技术方案示例在下面提供。因此，通过在存在DPIV抑制剂不存在外源加入细胞因子下培养细胞，修改了这种方案以符合本发明的方法。
接下来分离，前体细胞在如PRMI，Iscove的DMEM，TC199，X-VIVO-10的培养基中温育，较好地加入人类或胎牛血清和生长因子的混合物。可以加入血清或血浆的浓度为5％到50％。生长因子包括任何一种或所有白细胞间介素(IL-1到IL-16)，干扰素(INF-α，β和γ)，促红细胞生成素(EPO)，干细胞因子(SCF)，类胰岛素生长因子，纤维原细胞生长因子，血小板衍生生长因子，肿瘤生长因子β，肿瘤坏死因子α，粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，类fms酪氨酸激酶-3配体(Fft-3)，和cKIT配体(cKL)。许多这些生长因子可购得。最常用的生长因子混合物包括G-CSF，GM-CSF，SCF，IL-1，IL-3和IL-6。使用的许多生长因子是通过DNA重组技术制备的并提纯到各种纯度。通过标准生化技术可从肿瘤细胞组的培养基中提纯一些生长因子。广泛使用的生长因子是PIXY321，它是通过重组技术制备的，并表现出GM-CSF和IL-3两种活性。使用在培养物中生长因子的量取决于因子制备的活性和使用生长因子的组合。一般，浓度范围从0.5到500ng/ml。必须确定具体培养条件下每种生长因子的最适宜浓度，因为一些生长因子与其他生长因子协同作用。如上面所提及的，本发明的方法不包括外源加入细胞因子，而是使用DPIV抑制剂刺激培养物中的造血细胞。
如本文所用的，增加造血细胞的量是指，与细胞的类似对比培养物中存在的造血细胞的量相比增加细胞的量至少约2倍，类似对比培养物使用与DPIV抑制剂处理培养物相同的条件，除了这种对比培养物不与DPIV抑制剂接触。较好地，与在类似对比培养物中存在的造血细胞的量相比，造血细胞的量增加至少约4倍，更好地，10倍，最好的至少20倍。
增加造血细胞量的时间段是，至少部分是，随细胞种类变化而变化，并取决于使用的培养容器表面。通常，时间段从约2-3天(对于短期扩增)到适合长期输注的细胞扩增的几周。此领域中普通技术人员已知的常规程序可用来确定培养物中细胞量，是随用DPIV抑制剂培养的细胞的温育时间增加而变化的。一般，用计数细胞数量来测量扩增(细胞量的增加)，如，使用细胞计数器或血细胞计数器，通过测量特异染料的掺入状况或通过确定血细胞比容。这样，获得上述细胞量增加倍数必要的具体生长条件的最优化及DPIV抑制剂量的选择，仅使用常规的试验就可确定。这样的常规试验包括，如(i)温育时间不变变化DPIV抑制剂的量；(ii)DPIV抑制剂量不变变化温育时间；(iii)采用前述最优化试验，以确定预先选择的细胞种类获得预先选择的细胞量增加倍数必需的具体条件；(iv)变化其他因素，如同一性，价位(如一价或二价)，或DPIV抑制剂的状态(可溶的或固定的)，以优化培养条件来获得所需的结果。这样，细胞培养温育时间的长短是变化的，并取决于所需扩增的程度。对于大部分应用，时间范围从约4天到14天。通常，通过从温育开始细胞总量的增加，和/或通过确定培养物中的CD34+细胞的百分数，和/或通过确定与不接触DPIV抑制剂的对比培养物相比细胞总量的增加，来评估液态培养物中的扩增。当细胞在35mm的培养皿中Iscove甲基纤维素培养基中温育10到14天时，其中含适当的生长因子，可确定CFU-GM值。一般的起始密度是1000个细胞/ml。在温育阶段的最后，使用倒置显微镜评定含多于50个细胞的脊髓(CFU-GM)和红细胞(BFU-E)起源的集落数。扩增后，获取细胞，在给患者输注前用新鲜培养基冲洗。造血细胞与DPIV抑制剂接触：
如本文所用的，造血细胞与DPIV抑制剂接触是指，将DPIV抑制剂以使得DPIV抑制剂与细胞直接物理接触的方式引入到培养物中。通常，可溶DPIV抑制剂在培养物中以可溶细胞因子或其他可溶生长因子引入细胞培养物中相同的方式与细胞接触，除了用可溶DPIV抑制剂代替先有技术中较传统的细胞因子。这样，如，可溶DPIV抑制剂可以水溶液加入到细胞培养物中，或以粉末形式(如冻干的)在细胞培养基质中产生水溶溶液。接触几种代表性DPIV抑制剂的示例程序在实例中提供。
通常，不溶DPIV抑制剂以由不溶DPIV抑制剂的物理形式要求的方式在培养物中与细胞接触。不溶DPIV抑制剂是指DPIV抑制剂没有及不能放置在溶液中。因此，不溶DPIV抑制剂是指附着在不溶载体上的DPIV抑制剂。不溶载体可以是细胞培养容器，在这种情况下抑制剂附着在培养容器的培养物接触表面上或，要么，不溶载体可以是颗粒形式的(如磁性颗粒，琼脂糖凝胶)，在这种情况下抑制剂附着在颗粒表面上。因此，接触附着在培养容器表面上的不溶DPIV抑制剂，涉及将细胞放置在培养容器中。加上适当已知的造血细胞生长营养物，但不包括外源加入的细胞因子。接触附着在颗粒上的不溶DPIV抑制剂，涉及将颗粒(干燥的或悬浮的)引入到含造血细胞的培养容器中。或者，可以将造血细胞加入到已含有可溶或不溶DPIV抑制剂的培养容器中。无论DPIV抑制剂的状态是什么(可溶的或不溶的)，造血细胞与抑制剂接触是在不存在外源加入细胞因子的情况下实施。引入DPIV抑制剂：
本发明的DPIV抑制剂是与DPIV结合的分子。通常有两个类型的DPIV抑制剂(1)活性位点抑制剂和(2)非活性位点结合试剂。活性位点抑制剂是指与DPIV催化活性位点结合(共价或离子相互作用)从而抑制DPIV酶活性的试剂。活性位点抑制剂示例包括DPIV竞争性酶抑制剂，如自然DPIV底物的过渡态拟似物(下面所描述的)。非活性位点结合试剂是指与DPIV蛋白质的一个位点而不是活性位点结合(共价或离子相互作用)，并在本文所描述的条件下能刺激造血细胞或胸腺细胞的试剂。某些非活性位点结合试剂与DPIV(如非竞争性DPIV抑制剂)的结合，可通过观察曝露在非活性位点结合试剂后，DPIV酶活性的降低来检测。非活性位点结合试剂的示例包括，当与造血细胞和/或胸腺细胞在本文所描述的条件下培养时，选择性地以使结合试剂能刺激这些细胞方式与DPIV结合的DPIV抗体和其片段。
测定DPIV酶活性的试验已有描述(W.G.Gutheil和W.W.Bachovchin，生物化学32，8723-8731(1993)；Gutheil，W.G.，和W.，B.W.Kinlsq，分析生化223，13-20(1994)；Gutheil，W.G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，6594-6598(1994))。这些方法使用了色谱基因底物(chromatogenic)Ala-Pro-p-硝基苯胺(AppNA)和荧光底物Ala-Pro-7-氨基-4-氟代甲基香豆素(AP-AFC)。AppNA和AP-AFC可购得(如酶系统产物EnzymeSystems Products，Dublin，CA)。这样的方法可用作筛选试验以确定是否DPIV抑制剂抑制了体外DPIV的酶功能。与DPIV活性位点结合的DPIV抑制剂：
DPIV是丝氨酸蛋白酶家族中的一员，其表现出后脯氨酰裂解活性。因此，DPIV的自然底物是一种肽，在它的氨基末端包括，二肽Xaa-Pro，其中依据标准氨基酸命名法Xaa表示任何氨基酸，Pro表示脯氨酸。本发明的活性位点抑制剂抑制DPIV自然底物的结合和/或裂解作用。
本发明的单体活性位点结合抑制剂由通式I表示：
(I) 表面-(L)q-P1R1
其中P1表示第一靶组合成分，较好地是肽，模拟DPIV底物结合位点；
R1表示与DPIV反应中心的功能基团反应的反应基团；
L表示任意存在的接头分子(i)分子量范围在约100道尔顿到约2000道尔顿，(ii)长度范围在约20A到约300A；(iii)含从包括C，O，N，S和磷原子的基团中选取的原子链，由单键，双键或三键连接；(iv)如果附着在一个表面上，表面密度范围在约20A到约300A，即一个接头分子在表面的共价附着和另一个接头分子在表面的共价附着之间的距离。
Q是0或1，即q＝0时，接头是不存在的，单体活性位点结合抑制剂没有通过接头附着在表面上(如组织培养容器表面或磁性颗粒)，当q＝1时，接头是存在的，单体活性位点抑制剂通过接头附着在表面。在这种具体实施中，L被认为是二价接头，因为它将单一结合组合成分共价结合到表面。这样的二价接头对此领域的普通技术人员是已知的，在下面作更详细的描述。
模拟DPIV底物结合位点的肽P1包括DPIV的竞争性抑制剂，如DPIV过渡态拟似物，DPIV的竞争性抑制剂，如氟代烷基酮。这些类型的抑制剂的每一种在下面阐述。在本发明重要的具体实施中，P1是肽或拟肽(peptidomimetic)。
本发明的多价活性位点抑制剂由通式II表示：
其中P1，R1和L为上面所定义的，q＝1；
P2表示第二个靶组合成分，较好地是肽，可与第一靶组合成分相同或不同；
R2表示第二个反应基团，可与第一反应基团相同或不同；
M＝1或0；
N是从0到10的整数；
R＝0或1；
A是可与表面结合的接头的臂，即当r＝0时，接头L没有与表面结合，当r＝1时，接头与表面结合。
在本发明的某些具体实施中，如果P2＝P1，那么R2不存在，与R1相同或不同。通常，n是1，本发明的化合物被认为是共轭对配合物(即P2＝P1)或复共轭对配合物(即P2≠P1)。
在某些具体实施中，L通过表面较远附着(如组织培养容器或磁性颗粒)。在这样的具体实施中，L被认为是多价接头，因为它将两个或多个结合组合成分彼此，以及与表面共价结合。这样的多价接头对此领域普通技术人员是已知的。
结合组合成分R1的示例是一些肽，据报道如果其与反应基团结合形成在后脯氨酰裂解酶的活性位点中带有功能基团的共价复合物，它可用于抑制后脯氨酰裂解酶，示例在下列资料中作了描述：美国专利第4,935,493号，“蛋白酶抑制剂”，颁布给Bachovchin等人(“Bachovchin’493”)；美国专利第5,462,928号，“二肽基-氨基肽酶IV类的抑制剂”，颁布给Bachovchin等人(“Bachovchin’928”)；美国专利第5,543,396号，“脯氨酸磷酸盐衍生物”，颁布给Power等人(“Power’369”)；美国专利第5,296,604号，“用作HIV蛋白酶抑制剂的脯氨酸衍生物和组合物”，颁布给Hanko等人(“Hanko’604”)；PCT/US89/09845，“制备脯氨酸硼酸酯的方法”，及其美国在先申请(USSN07/796,148和07/936,198)，申请人BoehringerIngelheim制药公司(“Boehringer”)；PCT/GM94/02615，“DPIV-丝氨酸蛋白酶抑制剂”，申请人Ferring V.V.(“Ferring”)。前述抑制剂的典型实例在下面描述，包括过渡态拟似物基抑制剂Xaa-boroPro，包括Lys-BoroPro，Pro-BoroPro和Ala-BoroPro，其中“BoroPro”是指脯氨酸的拟似物，其中羧基基团(COOH)被boronyl[B(OH)2]基团替代。本发明可选择的活性位点抑制剂具有类似结构，其中boronyl基团由磷酸盐或氟代烷基酮(下面描述)替代。此领域的技术人员会认同还有其他一些可以作的但不会明显影响这些化合物结合及复合物形成特性的这样的改变。
噬菌体展示文库及合成化合物可从中选取的模拟DPIV底物结合位点的化学组合文库的发展，使得可以确认R1反应基团可共价附着的其他P1靶组合成分，其形成模拟蛋白酶底物结合位点的，并与蛋白酶反应位点中的功能基团形成复合物的结合组合成分。可筛选这样的文库，通过检测存在和不存在假定噬菌体展示文库分子或组合文库分子的情况下的蛋白酶裂解活性，以及确定分子是否抑制蛋白酶自然底物或类似底物的裂解(如在分光光度法测试中容易检测出的生色团底物类似物)，来确认非自然产生的假定的靶组合成分。然后，那些表现出蛋白酶抑制作用的噬菌体文库和/或组合文库可共价结合在本文所公开的反应基团R1上，并再一次测试以确定这些新型分子是否选择性地与蛋白酶结合(如通过重复上面描述的筛选测试)。以这种方式，提供了一种测试确认本发明非自然产生的靶组合成分的简单、迅捷的筛选方法。
通常，本发明的第一结合组合成分，P1，通过羧基基团在氨基酸羧基末端与第一反应基团R1共价结合。如本文所用的，R1是指能与DPIV反应中心的功能基团反应的反应基团。通过与这种靶蛋白酶反应中心的反应，意味着R1与位于活性位点的功能基团形成了共价键或强的离子相互作用。包含在本发明中的R1反应基团包括在颁布给Bachovchin等人的美国专利第4,935,493，“蛋白酶抑制剂”中称作基团“T”的反应基团。这些包括硼酸盐基团，磷酸盐基团，和氟代烷基酮基团，硼酸盐基团示例在下面和实例中描述。磷酸盐和氟代烷基酮基团在下面描述。通常，较好地，靶组合成分的羧基末端与反应基团之间的连接应是L形。又一种较好的情况是，反应基团与活性位点中的功能基团形成共价键，然而，为了在结合组合成分和活性位点之间形成复合物，形成共价键不是必需条件。
贯穿这份申请，使用了传统术语命名异构体，如在下面及在此领域的普通技术人员已知的适当课本中所述的(参阅，生化原理，编辑A.L.Lehninger，99-100页，价值出版公司(1983)纽约，NY；有机化学，Morrison和Boyd，第三版，第四章，Allyn和Bacon公司，MA(1978)，参阅专利合作条约公布的申请WO93/10127，申请号No.PCT/US92/09845)。
所有氨基酸，除了氨基乙酸，含有不对称或手性碳原子并可能含有多于一个手性碳原子。氨基酸的不对称α碳原子称作手性中心，能以两种不同的异构体形式出现。除了它们能产生平面偏振光旋转的方向外，这些形式在所有化学及物理特性上是一致的。这些氨基酸称作具有“光学活性”，即氨基酸能以一个方向或另一个方向旋转平面偏振光。
附着在α碳原子上的四个不同的取代基可以占据空间上两种不同的排列。这些排列彼此不是可叠加的镜像，称作光学异构体，对映体，或立体异构体。给定氨基酸的一种立体异构体的溶液会向左旋转平面偏振光，叫做左旋异构体〔命名为(-)〕；氨基酸的另一种立体异构体会以相同的程度但向右旋转，叫做右旋异构体〔命名为(+)〕。
更系统的分类和命名立体异构体的方法是不对称碳原子(如α碳原子)周围的四面(tetrahedryin)中的四个不同取代基的绝对构型。为了建立这个系统，选择参照化合物(甘油醛)，是含不对称碳原子最小的糖。按照此领域的惯例，甘油醛的两个立体异构体称为L和D。通过x-射线分析已建立了它们的绝对构型。参考甘油醛的绝对构型，命名L和D也已用来命名氨基酸。这样，手性化合物的立体异构体的构型与L-甘油醛构型相关的称为L，立体异构体的构型与D-甘油醛相关的称为D，不论它们旋转平面偏振光的方向是什么。这样，符号L和D指手性碳周围四个取代基的绝对构型。
通常，含手性中心的自然产生化合物是仅以一种立体异构形式存在，是D或是L。自然产生氨基酸是L立体异构体；然而，本发明包括能以D立体异构体构型存在的氨基酸。
在蛋白质中发现的大多数氨基酸能用D和L系统清楚地命名。然而有两个或两个以上的手性中心的化合物可有2n种可能的立体异构体构型，其中n是手性中心数。这些立体异构体有时使用RS系统命名，以更清楚地说明含两个或更多手性中心的氨基酸的构型。如，化合物如苏氨酸异亮氨酸含两个不对称碳原子，因此有四种立体异构体构型。含两个手性中心的化合物的异构体叫做非对映异构体。有关命名氨基酸光学异构体的RS系统的全面讨论在上文生化原理中，编辑A.L.Lehninger，99-100页提供。下面是这个系统的简介。
发明RS系统是为了避免当化合物含两个或多个手性中心时的不明确。通常，当最小或最低等级基团指向远离观察者时，系统以原子数减少的顺序或以价密度减少的顺序，评定不对称碳原子周围的四个不同取代原子来命名。等级在此领域中是熟知的并在Lehninger，99页有描述。如果减小等级顺序是顺时针的，则手性中心周围的构型为R型；如果减小等级顺序是逆时针的，最则构型是S型的。因此每个手性中心可使用这个系统命名。采用这个系统命名苏氨酸，此领域中技术人员会确定命为L-苏氨酸在RS系统中为(2S，3R)-苏氨酸。对于苏氨酸，L-，D-，L-同分异构，和D-同分异构更传统的命名已公用一段时间了，并且此领域中的技术人员仍在使用。而RS系统越来越多地使用在命名氨基酸中，特别是那些含多于一个手性中心的氨基酸中。
在本发明特别推荐的具体实施中，boroProline化合物是Val-boroProline化合物。“Val-boroProline化合物”是指其中羧基末端boroProline通过肽键依据标准肽化学与缬氨酸氨基酸残基共价结合的化合物。缬氨酸氨基酸，任意地，进一步通过肽键与其他氨基酸残基结合，只要其他的氨基酸残基不抑制Val-boroProline化合物与CD26结合的能力。在最好的具体实施中，本发明的化合物是Val-boroProline(也称作“PT-100”)。由于存在于氨基酸残基上的和附着在硼原子上的碳中的手性碳原子，Val-boroPro可以多种异构体形式存在：(a)L-Val-S-boroPro，(b)L-Val-R-boroPro，(c)D-Val-S-boroPro，(d)D-Val-R-boroPro。更好的，化合物是L-Val-S-boroPro或L-Val-R-boroPro。类似地，本发明的其他boroProline化合物能以多种异构体形式存在；然而，通常其中每个氨基酸的手性中心有“L-”构型，R或S构型的boroPro形式是化合物较好的形式。
本发明带第一反应基团P1R1的第一靶组合成分是硼酸脯氨酸，可以认为具有结构：
(a)其中B是硼，
(b)其中Y1和Y2的每一个分别从含羟基基团和在生理性条件下转化成羟基基团的反应基团中选取。
(c)其中-A3-A4-具有结构：
(d)其中D1-A1-A2是含有从下列基团选取的结构的氨基酸：
其中R表示氨基酸的侧链。
这些硼酸脯氨酸通过氨基肽键和/或化学交联试剂与第二靶组合成分P2连接，通过氨基酸侧链R，如抗原肽的侧链，形成上上述的化合物。[P2(R2)m]n-(L)q-P1R1]。示例肽包括自动免疫疾病抗原肽，传染疾病抗原肽和过敏疾病抗原肽。较好的抗原肽是与T细胞表面受体或B细胞表面受体结合的肽，如TCR/CD3，CD2，CD4，CD8，CD10，CD26，CD28，CD40，CD45，B7.1和B7.2。
或者，反应组合成分可以是氟代烷基酮或磷酸盐基团。本发明的反应基团是具有如下通式的氟代烷基酮反应基团：
其中G是H，F或含1到约20个碳原子和任意N，S或O杂原子的烷基基团。如本文所用的，本发明的反应基团是具有如下通式的磷酸盐基团：
其中每个J，分别地，是O-烷基，N-烷基，或烷基(含约1-20个碳原子)和，任意地，可以是n＝N，S，或O的杂原子。含过氟代烷基基团，苯基基团或取代苯基的脯氨酸磷酸盐的并依据本发明的方法能使用的衍生物的其他示例在美国5,543,369(“Power’369”)中作了描述。对于与蛋白酶(如丝氨酸蛋白酶或半光胱氨酸蛋白酶)反应中心反应的，其他有用的反应基团酮酰胺，酮酸，酮酯在PCT/US91/09801，“肽，酮酰胺，酮酸和酮酯”中作了描述，申请人“Georgia技术研究公司(“GA Tech”)，要求1990年12月28日提交的U.S.635,287的优先权。
在某些具体实施中，反应基团是从具有如下通式的基团中选取的：
，α酮酰胺
其中R是烷基或芳基基团并可以是取代的或未取代的，α酮酯；
，α酮酰胺
本发明的反应基团还包括在PCT/GB94/02615，“DPIV-丝氨酸蛋白酶抑制剂”(Ferring)中所描述的反应基团。这些包括上述的boronyl基团[B(OH)2]，以及pyrrolidides和下列反应基团，其中任何基团可以是取代的或未取代的，只要取代基不对反应基团的功能活性或其附着的结合组分：CN，C＝-C，CHO和CH＝NPh有不利影响，其中Ph指苯基。这些实例仅是说明性的，不是限制本发明的范围。如在Ferring中所描述的，含这些典型反应基团的化合物可通过E.Schon等人在生物化学Hoppe-Seyler：372：305-311(1991)中和W.W.Bachovchin等人在生化期刊265：3738-3743(1990)中所描述的常规途径的修正方法来制备。(参阅上面参考的Bachovchin美国专利。)
第二靶组合成分P2，与在与第一靶组合成分结合的相同或不同细胞的表面上的分子相结合。较好地，第二靶组合成分与存在于T细胞表面或B细胞表面上的分子(如受体，主要组织相容性复合体(MHC)分子)结合。在某些具体实施中，第二靶组合成分具有模拟存在于涉及免疫系统调节的细胞上的蛋白酶的底物结合位点的结构。这样，第二靶组合成分可与第一靶组合成分相同，本发明的化合物可用来将DPIV分子交联在相同或不同细胞上。如本发明的化合物可用来交联在第一细胞上的第一蛋白酶(如后脯氨酰裂解酶)和在相同或不同的第二细胞表面表达的第二蛋白酶(如胰岛素，胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶或其他丝氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶)。在某些较好的具体实施中，第一和第二靶组合成分是一致的(即P1＝P2)，第二反应基团R2可以是不存在的(即m＝0)，与第一反应基团R1相同的或不同的(R1≠R2)。包括相同的P1和P2基团和相同的R1和R2基团的化合物被称作“共轭对配合物”，在另一些其他具体实施中，第一和第二靶组合成分是不同，这些化合物被称作“复共轭对配合物”。
在其他具体实施中，第二靶组合成分是选择性与抗原存在细胞表面上的MHC分子结合的抗原。本发明这样的具体实施对抗原(如肿瘤)特异T细胞扩增是有用的。这样，依据本发明的相关方面，上面描述的包括是抗原(如肿瘤-特异抗原)的第二靶组合成分P2的DPIV抑制剂，通常可用来刺激T细胞种类的造血祖细胞(通过第一靶组合成分)，以及特异扩增外周血液T细胞亚群以获取抗原特异T细胞。具体地，这些的化合物对于扩增这种T细胞亚群以丰富抗原特异T细胞是有用的。这样，本发明提供了一种协同体外造血细胞刺激作用和抗原特异T细胞扩增的改进方法。这可治疗抗残留肿瘤细胞，转移性细胞引起的免疫反应，或加强在同种异体移植中抗肿瘤T细胞的活性。它还可用来进行与不利治疗条件有关的对肿瘤抗原，病原抗原和其他抗原特异的外周记忆T细胞体外扩增。这样，依据前述方法可使用的抗原包括病原特性抗原和癌症抗原。
前述方法和组合物也可用来进行，用于基因治疗的含异源核酸(如编码治疗蛋白质或肽的反义寡聚核苷酸，核酸)的逆转录病毒或其他载体转染后的干细胞的体外扩增。异源核酸已被体外引入的干细胞，可使用已知的移植转染细胞到人体中作基因治疗的方法移植到受体中。参阅如美国专利编号No.5,399,346(“基因治疗”)颁布给Anderson等人；PCT国际申请编号No.PCT/US92/1890(公布号No.WO92/15676，“体细胞基因治疗”，要求1991年3月8日提交的美国序列号No.667,169优先权，，发明者I.M.Verma)；PCT国际申请编号No.PCT/US89/05575(公布号No.WO90/06997，“基因工程内皮细胞和其应用”，要求1989年12月8日提交的美国序列号No.283,568，的优先权，发明者Anderson，W.F.等人)。
具有肿瘤抗原特性的抗原一般是从细胞表面，细胞质，核子，细胞器官，及肿瘤组织细胞类似物中获取的。实例包括肿瘤蛋白质特性的抗原，包括由突变癌基因编码的蛋白质；与肿瘤有关的滤过性病毒蛋白质；肿瘤粘液素和糖脂素。肿瘤包括，但不限于此，下列部位的癌症和种类的癌症：唇，鼻咽，咽和口腔，食道，胃，结肠，直肠，肝，胆囊，胆汁树，胰腺，喉，肺和支气管，皮肤恶性黑素瘤，乳腺，宫颈，子宫，卵巢，膀胱，肾，脑和神经系统的其他部位，甲状腺，前列腺，睾丸，Hosgkin症，非Hosgkin淋巴瘤，多骨髓瘤和白血病。与肿瘤有关的滤过性病毒蛋白质是那些上面提及的病毒种类。肿瘤的抗原特性可能是，通常不是由肿瘤前体细胞表达的蛋白质，或可能是通常在肿瘤前体细胞中表达但有肿瘤突变特性的蛋白质。肿瘤抗原特性可以是具有改变活性或亚细胞分布的正常蛋白质的突变体。基因突变产生肿瘤抗原，除了那些上面所定义的，还可能在编码区域，5’或3’非编码区域，或基因内含子中，并可能是点突变，移码，缺失，插入，重复，染色体重排等的结果。此领域中普通技术人员对产生肿瘤抗原的正常基因结构和表达的多种变更是熟悉的。肿瘤抗原的具体实例包括：蛋白质如B细胞淋巴瘤免疫球蛋白个体基因型，黑素瘤突变体依赖细胞周期蛋白的激酶4，黑素瘤的Pmel-17(gp100)，黑素瘤的MART-1(Melan-A)，黑素瘤的p15蛋白，黑素瘤的酪氨酸酶，黑素瘤，甲状腺髓质素，小细胞肺癌，结肠和/或支气管鳞状细胞癌的MAGE1，2和3，膀胱，黑素瘤，乳腺，和鳞状细胞癌的BSGA，黑素瘤的gp75，黑素瘤的癌胚抗原；碳水化合物和/或脂质如乳腺，胰腺，和卵巢癌的muc1粘液素，黑素瘤的GM2和GD2神经节苷脂；癌基因如癌的突变体p53，结肠癌的突变体ras和乳腺癌的HER-2/neu原-癌基因；滤过性病毒产物如宫颈和食道鳞状细胞癌的人类乳突淋瘤病毒蛋白。还考虑到的是，类蛋白肿瘤抗原可由HLA分子作为从整体蛋白质中衍生的特异肽而提呈。蛋白质代谢过程产生抗原肽在此领域中是众所周知的；如参阅美国专利第5,342,774(Boon等人)号。
本发明较好的肿瘤抗原包括黑素瘤肿瘤抗原(如MAGE蛋白质家族(MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3)；MART-1(肽27-35)；和gp100)；和结肠癌抗原(如突变的APC基因产物的肽)。特别推荐的黑素瘤肿瘤抗原序列由Slingluff等人在Curr.Opin.In Immunol6：733-740(1994)中报道：
| 基因/蛋白质 | MHC | 肽 | 序列标志号 |
| MAGE-1 | A1 | EADPTGHSY | 1 |
| CW160l | SAYGEPRKL | 2 | |
| MAGE-3 | A1 | EVDPIGHLY | 3 |
| 酪氨酸酶 | A2 | MLLAVLYCL | 4 |
| YMNGTMSQV | 5 | ||
| A24 | ------ | ||
| gp100/pMel-17 | A2 | YLEPGPVTA | 6 |
| LLDGTATLRL | 7 | ||
| MART-1/Melan-A | A2 | AAGIGIKTV | 8 |
| QDLTMKYQIF | 20 |
MAGE蛋白质家族也报道与不止一种类型的癌症有关：MAGE-1(如黑素瘤，小细胞肺癌，甲状腺髓质癌)，MAGE-2(如黑素瘤，小细胞肺、结肠癌，支气管鳞状细胞和甲状腺髓质癌)，和MAGE-3(如黑素瘤，小细胞肺、结肠、支气管鳞状细胞和甲状腺髓质癌)。关于其他肿瘤抗原(如P1A，联接蛋白37，MAGE-1，MAGE-3，MART1/Aa，gp100，酪氨酸酶)和/或有关选取肿瘤抗原的组织分布的资料参阅，Morioka等人的“人类黑素瘤中获取的十肽(Gln-Asp-Leu-Thr-Met-Lys-Tyr-Gln-lle-Phe)由黑素瘤患者中的CTL识别”，J.Immuol.153：5650(1994)。
特别推荐的肿瘤抗原是突变的APC基因产物的肽，由Townsend等人在自然371：662(1994)中报道：
| 密码子 | 突变 | 新序列 | 序列标志编号 |
| 298 | 2pbdel | SSST/LCTSKADKSSGNQGGBGVFIVVNZWYS | 9 |
| 540 | 1bpdel | SEDL/TAGYCKCFEEFVLASRCK | 10 |
| 1068 | 4pbdel | EQRQ/GIKVQLILFILRALMINTSSSNHIL | 11 |
| DSRNVFLHTGHGEPMVQKQIEWVLIMWLIKM | |||
| 1353 | 8pbdel | HKAV/FRSEISLQKWCSDTQKST | 12 |
| 1398 | 1pbdel | DSFE/SVRLPAPFRVNHAVEW | 13 |
| 1420 | 1pbdel | IISP/VIFQIALDKPCHQAEVKHLHHLLK | |
| QLKPSEKYLKIKHLLLKRERVDLSKLQ | 14 | ||
| 1439 | 1pbdel | RSKT/LHHLLKQLKPSEKYLKIKHLL | 15 |
| LKRERVDLSKLQ | |||
| 1446 | 10pbdel | PPQT/GEKYLKIKHLLLKRERVDLSKLQ | 16 |
| 1488 | 1pbdel | DADT/YYILPRKVLQMDFLVHPA | 17 |
| 1490 | 1pbdel | DTLL/LLPRKVLQMDFLVHPA | 18 |
| 1493 | 11pbdel | LHFA/SRWIFLFIQPECSEPR | 19 |
在可选择的具体实施中，第二靶组合成分是选择性地与表达在细胞(较好的是T细胞或B细胞)表面上的受体结合的配体。具有能由本发明的第二靶组合成分模拟的自然产生配体的受体示例包括从下列基团中选取的受体：CD2、TCR/C3、CD4、CD8、CD10、CD26、CD28、CD40、CD44、CD45、B7.1、和B7.2。依据其他具体实施，第二靶组合成分是选择性地与表达在细胞表面的抗原表位结合的抗体或抗体片段。抗原表位可以是部分任何前述受体。
不论第二靶组合成分的属性是什么，噬菌体展示和其他类型的组合文库都可以用上述方法类似的方法筛选，以鉴别用于形成本发明的化合物的非自然产生的靶组合成分。不与DPIV活性位点结合的DPIV抑制剂(非活性位点结合试剂)：
非活性位点结合试剂是：(i)选择性地与DPIV在不是活性位点的位置上结合的及(ii)能在本文所描述的条件下刺激造血细胞和/或胸腺细胞的试剂。某些非活性位点DPIV结合试剂(如非竞争性DPIV抑制剂)也抑制DPIV的酶活性。对DPIV酶活性的抑制作用可以测定，如通过在存在或不存在假定DPIV抑制剂的情况下，测定DPIV的蛋白酶解裂解酶活性，确定是否抑制剂抑制这种DPIV的酶活性。较好地，这样的结合试剂是选择性地结合DPIV的分离多肽。分离结合多肽包括抗体和抗体片段(如Fab，F(ab)2，Fd和包括选择性地与DPIV结合的CDR3区域的抗体片段)。较好的分离结合多肽是与在DPIV催化位点上或附近的抗原表位结合的多肽。
因此，本发明涉及在本文所公开的条件下，使用能选择性地与DPIV结合并刺激造血细胞和胸腺细胞的抗体或抗体片段。抗体包括多克隆和单克隆抗体，依据传统方法制备。
重要的是，正如此领域中所熟知的，抗体分子只有一小部分，即互补位，涉及抗体与抗原表位的结合(通常参阅，Clark，W.R.(1986)现代免疫试验基础，Wiley&Sons公司，纽约；Roitt，I.(1991)基础免疫学，第7版，Blackwell科学出版社，牛津)。如pFc和Fc区域是补体级联的效应子但不涉及抗原结合。PFc’区域已被酶裂解的，或制备没有PFc’区域的抗体，命名为F(ab’)2片段，保留着整体抗体分子的两个抗原结合位点。同样地，Fc区域已被酶裂解的，或制备没有Fc区域的抗体，命名为Fab片段，保留着整体抗体分子的一个抗原结合位点。Fab片段包括共价键合抗体轻链和一部分表示Fd的抗体重链。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(单一Fd片段可能与多达十种不同的轻链有关并且没有改变抗体的特异性)，Fd在分离中保留着抗原结合能力。
如此领域中所熟知的，在抗体的抗原结合部分中有互补性确定区域(CDRs)，其直接与抗原的表位作用，和构架区域(FRs)，其维持着互补位的三级结构(参阅，Clark，1986；Roitt，1991)。在重链Fd片段和免疫球蛋白IgG的轻链中有分别由三个互补性确定区域(CDR1到CDR3)分离的四个构架区域(FR1到FR4)。CDRs，具体地是CDR3，更具体地是重链CDR3决定着抗体特异性。
哺乳动物抗体的非-CDR区域可用同特异性或异特异性抗体的相同区域替代，并保持着原抗体的抗原表位特异性，目前这一点在此领域中已非常确实。这一点在发展和使用“人化”抗体中非常清楚地表现出来，其中非人类CDRs与人类FR和/或Fc/pFc’区域共价结合制备功能抗体。这样，如PCT国际公告号WO92/04381中公开了制备和使用其中至少部分鼠科FR区域被人类FR区域替代的人化的鼠科RSV抗体。这样的抗体，包括整体抗体的带有抗原结合能力的片段，常称为“嵌合”抗体。
这样，此领域中的普通技术人员将会明了的是，本发明还提供F(ab’)2，Fab，Fv和Fd片段；其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源人类或非人类序列替代的嵌合抗体；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源人类或非人类序列替代的嵌合F(ab’)2片段抗体；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源人类或非人类序列替代的嵌合Fab片段抗体；其中FR和/或CDR1和/或CDR2区域已被同源人类或非人类序列替代的嵌合Fd片段抗体。本发明还包括所谓的单链抗体。这样，本发明涉及与DPIV特异结合并抑制其功能活性的多种大小和种类的多肽。这些多肽也可从不是抗体技术的来源获得。如，这样的多肽结合试剂可通过简并肽文库提供，肽文库可容易地制备成溶液或固定形式或如噬菌体展示文库。也可合成含一种或多种氨基酸的肽的组合文库。另外也可合成肽和非肽合成组合成分的文库。
依据本发明，噬菌体展示在鉴别结合肽应用中是特别有效的。简单地讲，制备噬菌体文库(如使用m13，fd，λ噬菌体)，使用传统工艺展示从4个到约80个氨基酸残基的插入。这些插入可表示完全的简并或偏性排列。然后可选择与DPIV结合的带噬菌体的插入。通过对与DPIV结合的噬菌体几个周期的再选择，可重复这个过程。重复循环致使丰富了带噬菌体特别序列。可实施DNA序列分析以鉴别表达多肽的序列。可以确定与DPIV结合序列的最小线性部分。可使用含包括部分或全部最小线性部分加其上游或下游的一个或多个其他简并残基的插入的偏性文库重复这个过程。这样，DPIV，其胞外域，或类似物可用来筛选肽文库，包括噬菌体展示文库，以鉴别和选择DPIV胞外部分的肽结合对。然后，这样选择的分子在筛选试验中检测，测定结合试剂抑制DPIV功能活性的能力，如DPIV的酶功能活性或刺激造血细胞生长和/或分化的活性。上面提及的选择性结合DPIV的结合试剂，直接或间接地(通过接头)附着在培养容器，或采用上述有关DPIV活性位点抑制剂附着这种表面相同类型的化学反应附着其他表面。接头和靶组合成分P1的附着：
接头以对靶组合成分与它们分别的靶结合对的结合能力没有不利影响的方式，与第一和(任意地)第二靶组合成分P1和P2共价结合。较好地，这样的接头还包括附着靶组合成分与培养容器，其他表面和/或其他靶组合成分的功能基团。较好的接头L的长度是，当它位于一个结合组合成分和第二个结合组合成分或表面之间时，组合成分之间或组合成分与表面之间的最小长度为约20埃。较好地，这个距离为从20到60埃，更好是从30到50埃。接头示例，包括有关接头组合物，大小，和接头和靶组合成分的结合方法的描述在下面提供。通常，这样的接头可以购得(参阅如Pierce目录和手册，Rockford，Ill)，并使用此领域中普通技术人员熟知的传统结合方法与靶组合成分结合。
通常，接头L含至少两个反应基团。同二价交联剂可含两个相同的反应基团，异二价交联剂含两个不同的反应基团。其他含多于两个可以是相同(同多价)或不同(异多价)的反应基团的多价交联剂也可使用。一般，本发明的接头通过氨基或巯基，将靶组合成分P1与第二靶组合成分或表面结合，这是因为这样的功能基团普遍地在用于形成固定蛋白质的载体物质的蛋白质和聚合物中发现。胺反应基团包括酰亚胺酯和N-羟基succinimidyl(NHS)酯。巯基反应基团包括顺丁烯二酰亚胺，烷基和芳基卤化物，α-卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。大多数可购得的异二价交联基含胺反应功能基团。一端是胺反应基团，另一端是巯基反应基团的交联剂相当普遍。其他可购得的交联剂是，通过反应基团而不是氨基或巯基，将靶组合成分P1与另一个靶组合成分，表面或其他靶组合成分结合，如通过羟基，羧基，酚类或碳水化合物类基团。碳化二亚胺也可用来结合羧基和伯胺或酰肼，致使形成酰胺或腙键。靶组合成分P1附着培养容器或其他表面：
依据本发明方法的应用，蛋白质、肽和其他分子能固定在固相基质上。基质可以是琼脂糖，玻珠，聚合物，聚苯乙烯板或球，多孔玻璃或玻璃片，硝化纤维或其他膜物质。一些载体可以是活性的，直接与配体结合。其他载体是用亲核试剂或其他使用交联剂能与蛋白质或其他配体结合的功能基团制备的。
本发明在固相载体上固定DPIV抑制剂可采用常规结合化学作用实施。通常，易接近的第一功能基团(如乙醇基团)包含在化合物中，通过在允许第一和第二功能基团彼此反应形成共价键(如酯键)的条件下，将化合物与含互补的第二功能基团(如羧基基团)的固体载体接触足够长的时间，将本发明的化合物固定。“易接近的”涉及功能基团，其意指功能基团的形式是活性的，并在空间上不妨碍与固体载体反应。附着可以是直接的或是间接的(即通过接头L)。
将本发明化合物固定到固体载体上的功能基团可以引入到肽结合组合成分或这些化合物的接头蛋白质中。如在它们的侧链(如天门冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸残基)含功能基团的氨基酸，可在合成期间掺入到结合组合成分肽中，并定位在距与靶蛋白质结合的反应基团足够远的位置，以避免在化合物和其靶蛋白质反应中固体载体旁边有不需要的空间障碍。或者，本发明的化合物可通过接头分子中的功能接头固定在固体载体上。这样，如使用在本发明这个方面的接头包括，除与第一和第二肽结合组合成分结合的第一和第二接头反应基团外，还有与固体载体结合的其他功能基团。这种类型的多价接头示例在下面演示。这样的多价接头可购得，并且此领域中的普通技术人员只采用常规试验就能合成：
为了预防负反应，较好的是用来结合接头分子与肽结合组合成分的接头反应基团，应与用来结合接头与固体载体的功能基团不同。这样的功能基团可在合成接头分子之后或期间的任何时候引入到接头分子中。这样，通常，在此领域中已建立的，使用接头分子结合如蛋白质或肽与另一个蛋白质或肽、或固体载体的相同类型功能基团，保护/脱保护反应和试剂，反应条件，都可用来将本发明的化合物固定在固体载体上。
包括在详述最后的是演示可购得的典型样品交联剂的表，如从Pierce目录和手册，Rockford，Ill.中。表中还确定了接头是活性的基团，如巯基，羧基。
培养容器和表面：
可以使用的容器很多。可购得的温育容器包括搅拌烧瓶(Corning公司，Corning，纽约)，搅拌釜式反应器(Verax，Lebanon，新罕布什尔)，气鼓式反应器，悬浮细胞反应器，细胞吸附反应器和细胞捕集反应器，培养皿，多孔板，烧瓶、袋和中空纤维装置，细胞泡沫(细胞基质)，最大吸附板(NUNC)和细胞培养系统(如Aastrom细胞制备系统，参阅美国专利第5,635,386号，题目为“在人类造血细胞培养中制备的特异细胞种系的调节方法”，颁布给Palsson等人；美国专利第5,646,043号，题目为“体外复制人类干细胞和/或扩增人类祖细胞的方法”，颁布给Emerson等人)。Aastrom培养装置是使用特异培养基交换培养系统体外扩增人类干细胞的温育箱。据报道，这种装置可用来扩增所有种类的造血细胞包括如，干细胞，祖细胞，基质细胞，但不包括淋巴细胞。通常，使用上述培养容器的细胞培养物通过多种技术保持在吸附状态，包括搅拌，振摇或用玻珠方式吸附。通常，这种容器由一种或多种下列成分构成：聚苯乙烯，聚丙烯，丙烯酸，尼龙，和玻璃。对于其中第一靶组合成分P1附着在容器表面上的具体实施，可使用传统固定技术将组合成分附着在表面上，直接或通过接头L。
上面列出的不溶基质自身不含附着本发明化合物的功能基团，因此必须进行化学修饰，过程称为激活。如聚苯乙烯可通过苯基残基氯甲基化作用被激活(Pierce化学目录和手册；组合肽和非肽文库。手册VCH Weinheim Ed.Giuntha Jung，1996年，16&17章)，产生氯代甲基聚苯乙烯。然后可利用活性苄基氯代物功能基团来引入羧基，氨基，羟基，顺丁二烯二酰亚胺，巯基，N-succinimidyl，和许多其他功能基团。功能基团的引入使得化学作用实施，使得本发明的化合物直接或通过接头间隔单元共价附着。结合反应需要在基质和配体上、或附着或将附着本发明化合物的间隔接头上功能基团相容。如在基质上引入羧基基团使得与自由氨基基团共价结合。衍生聚苯乙烯带有羧基基团能通过与Lys侧链的自由∈氨基基团结合，或通过有一个自由氨基基团的间隔接头直接共价附着Lys-boroPro。或者，衍生聚苯乙烯带有羧基基团能通过如，通过含两个羧基基团的间隔接头结合，一个与Lys-boroPro的∈氨基基团结合，另一个与氨基衍生聚苯乙烯的氨基基团结合附着Lys-boroPro。
产生这样结合的化学作用是众所周知的，并在许多资料中有描述，包括许多公司在如销售基质、活性或非活性的，和接头间隔分子的Pierce化学中的目录中。其他供方包括Sigma，Novabiochem，也在其中。如上述对于聚苯乙烯但对上面所列其他基质特异的附着配体的方法是可以利用的，众所周知的，并在如上所述的资料和固定亲和配体技术.“成功亲和基质制备的全部‘诀窍’”；Shan S.Wong的蛋白质共轭和交联化学中有描述。
可以使用的基质的几种形式包括如玻珠，和特别容易移去基质附着配体的磁性玻珠。抗生素蛋白-生物素化学提供了其他获得相同最终结果的方法，将本发明的化合物附着在不溶基质上。如生物素很容易附着在Lys-boroPro的∈氨基基团上，产物共轭物以高亲和力附着抗生素蛋白或链霉抗生素蛋白。抗生素蛋白和链霉抗生素蛋白的多种不溶衍生物可购得(抗生素蛋白-生物素化学：手册-由Pierce技术协助专家研究)。
或者，靶组合成分P1可附着在有靶组合成分直接或间接附着的表面的颗粒(如颗粒或膜)形式上。可用来制备这种颗粒的物质示例包括硝化纤维，琼脂，琼脂糖，和其他类型配体通常附着的载体物质，如形成亲和色谱物质。在较好的具体实施中，颗粒是磁性颗粒，如在美国专利第4,554,088号，颁布给Whitehead等人，题目为“使用在分离中的磁性颗粒”；第5,382,468号，颁布给Chagnon等人，题目为“生物可降解磁性微束和制备它们的方法”；第4,454,234号，颁布给Czerlinkski，题目为“有被可磁化微粒，其可逆悬浮，和相关工艺”；第4,795,698号，颁布给Owen等人，题目为“磁性-聚合物颗粒”；第4,528,622号，颁布给Ikeda等人，题目为“固定生物蛋白的磁性颗粒及制备相同物的方法”。
依据本发明的另一方面，提供一种实施本发明方法的装置。装置包括容器和包含在其中或附着在其上的DPIV抑制剂。较好地，容器是消毒容器。DPIV抑制剂可以是如上所述可溶或不溶的形式。这样，如DPIV可以干燥状态(如冻干)存在于容器中，无束缚或附着在容器表面，以消毒的形式售给最终用户，以最小化被最终用户污染的可能性(如当将抑制剂引入容器时)，进一步最小化损失抑制剂活性的可能性(如通过提供干燥状态的抑制剂较小可能在储存中损失活性)。或者，DPIV抑制剂可以附着在颗粒上，如磁性颗粒，颗粒可以干燥状态在独立的容器中销售或在细胞培养容器中提供。
依据本发明的另一个方面，提供一套刺激造血细胞体外生长和/或分化的工具。工具包括上面描述的装置和使用装置刺激体外造血细胞的用法说明。任意地，工具还包括培养造血细胞用的其他适当的生长营养物。这样的营养物可以在设备容器中或在独立容器中、以液态或干燥状态提供，营养物内容物可在培养细胞时加入到设备容器中。
依据本发明的另一个方面，提供体外刺激造血细胞和扩增抗原-特异T细胞的方法。刺激和扩增步骤可同时实施或顺序实施。下面阐述这种方法的三个具体实施来说明这种方法。通常，具体实施彼此区分在体外刺激的造血细胞的选取上。在每个具体实施中，培养步骤可在存在或不存在加入的细胞因子或基质细胞的情况下实施。使用在每一种具体实施中的较好的复共轭对配合物含有肿瘤特异抗原或病原特异抗原。
这种方法的第一个具体实施是获得抗原特异T细胞，涉及刺激培养物中的骨髓细胞。培养物中骨髓细胞可能包括细胞的混合物；然而，较好地，培养物中的骨髓细胞是分离的CD+34细胞或分离的干细胞。依据这个具体实施，方法包括：(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养骨髓细胞(如DPIV单体和/或共轭对配合物)以扩增培养物中早期T种类细胞的量；(2)用充分量的含抑制剂的复共轭对配合物培养早期T种类细胞，其中DPIV抑制剂附着在抗原肽上(如肿瘤-或病原特异抗原)，以扩增培养物中抗原特异T细胞的量。步骤(2)可在存在或不存在特异抗原的情况下实施。步骤(1)和(2)可同时实施或顺序实施。通常，将抗原特异T细胞的量与(除了对比培养物不与复共轭对配合物接触)用如步骤(1)和(2)处理的骨髓细胞的对比培养物相比较。在每个步骤中，细胞在DPIV抑制剂中培养足够长的时间，以增加早期T种类细胞的量和扩增抗原特异T细胞的量，分别与对比培养物中这种细胞的存在量相比。
第二个具体实施目的在于刺激培养物中脐带血细胞。这个具体实施涉及：(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养脐带血细胞(如DPIV单体和/或共轭对配合物)以扩增培养物中早期T种类细胞的量；(2)用充分量的含抑制剂的复共轭对配合物培养早期T种类细胞，其中DPIV抑制剂附着在抗原肽上(如肿瘤-或病原特异抗原)，以扩增培养物中抗原特异T细胞的量。步骤(2)可在存在或不存在特异抗原的情况下实施。步骤(1)和(2)可同时实施或顺序实施。通常，将抗原特异T细胞的量与(除了对比培养物不与复共轭对配合物接触)用如步骤(1)和(2)处理的脐带血细胞的对比培养物相比较。在每个步骤中，细胞在DPIV抑制剂中培养足够长的时间，以增加早期T种类细胞的量和扩增抗原特异T细胞的量，分别与对比培养物中这种细胞的存在量相比。
第三个具体实施目的在于刺激培养物中外周血液干细胞。这个具体实施涉及：(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养外周血液干细胞(如DPIV单体和/或共轭对配合物)以扩增培养物中早期T种类细胞的量；(2)用充分量的含抑制剂的复共轭对配合物培养早期T种类细胞，其中DPIV抑制剂附着在抗原肽上(如肿瘤-或病原特异抗原)，以扩增培养物中抗原特异T细胞的量。步骤(2)可在存在或不存在特异抗原的情况下实施。步骤(1)和(2)可同时实施或顺序实施。通常，将抗原特异T细胞的量与(除了对比培养物不与复共轭对配合物接触)用如步骤(1)和(2)处理的外周血液干细胞的对比培养物相比较。在每个步骤中，细胞在DPIV抑制剂中培养足长够时间，以增加早期T种类细胞的量和扩增抗原特异T细胞的量，分别与对比培养物中这种细胞的存在量相比。另外，由于已知外周血液含有T细胞，所以，可能在没有刺激步骤(1)的情况下，培养物中抗原特异T细胞的量扩增，如扩增抗原特异T细胞的方法涉及用充分量的含抑制剂的复共轭对配合物培养早期T种类细胞，其中DPIV抑制剂附着在抗原肽上(如肿瘤-或病原特异抗原)，以扩增培养物中抗原特异T细胞的量。这个步骤可在存在或不存在特异抗原的情况下实施。
实例
下面提供接触几种典型DPIV抑制剂的工艺示例。试验方案
1.获取骨髓或脐带血液置于肝素化试管中，直至使用可在室温储存48小时以内。
2.混合骨髓/血液和磷酸缓冲盐溶液，PH7.4(PBS)储存在4℃。
3.小心地将血液PBS混合物铺在2个体体量的储存在4℃d的Histopaque(Sigma)上。
4.在37℃400g×20分钟离心分离。
5.在界面上小心收集细胞并2次用冷PBSA冲洗。
6.使用台盼蓝计数活细胞。
7.将细胞和1ml培养物安装在塑料培养试管(或96孔或24孔微型滴定板)中，104个细胞/ml CellGro Iscove改进Dulbecco培养基，培养基中含卡那霉素(5μg/ml)，所需浓度的Xaa-boroPro或其他本发明的化合物，存在或不存在巨型细胞肿瘤调节培养基(GCT-CM，Origen)作为生长因子来源。Xaa-boroPro或其他本发明的化合物应稀释到半数浓缩，并仅在细胞在培养试管中后加入到培养物中。
8.细胞在37℃含5％CO2的湿润空气中温育。
9.在所需的时间，小份细胞移出并计数。
10.计数可在显微镜下实施或通过使用MTT测定(比色测定)。
实施这个的试验的结果在所附的示图中作了演示，并在示图简介中进行了描述。
在本申请中所标出的所有专利，专利公布和其他文件都全文参考收入本篇。
此领域中的技术人员可识别出，或仅使用常规试验能确定出许多本文所描述的本发明特殊具体实施的等同物。这样的等同物包括在下面的权利要求书中。
下面列出表格和权利要求书，序列单，和摘要。
可购买到的交联剂的活性
可购买到的交联剂的活性
可购买到的交联剂的活性
可购买到的交联剂的活性
| 活性取向 | 裂解 | ||||||||
| 双试剂交联剂缩写 | -NH2氨基 | -SH巯基 | 碳水化合物 | 非选择性光活性 | -COOH羧基 | 硫醇 | 碱 | 高碘硫酸 | hydroxylomine |
| 磺基-SAMC | X | X | |||||||
| 磺基-SANPAH | X | X | |||||||
| 磺基-SAPB | X | X | |||||||
| 磺基-SLAB | X | X | |||||||
| 磺基-SMCC | X | X | |||||||
| 磺基-SMBP | X | X | |||||||
| 磺基-LC-SMPT | X | X | |||||||
| 活性取向 | 裂解 | ||||||||
| 双试剂交联剂缩写 | -NH2氨基 | -SH巯基 | 碳水化合物 | 非选择性光活性 | -COOH羧基 | 硫醇 | 碱 | 高碘硫酸 | hydroxylomine |
| SNAPAH | X | X | |||||||
| SASD | X | X | X | ||||||
| SDBP | X | ||||||||
| SLAB | X | X | |||||||
| SMCC | X | X | |||||||
| SMBP | X | X | |||||||
| SMPT | X | X | |||||||
| SPDP | X | X | X | ||||||
| 磺基-BSOCOES | X | X | |||||||
| 磺基-DST | X | X | |||||||
| 磺基-EGS | X | X | |||||||
| 磺基-GMBS | X | X | |||||||
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| 活性取向 | 裂解 | ||||||||
| 双试剂交联剂缩写 | -NH2氨基 | -SH巯基 | 碳水化合物 | 非选择性光活性 | -COOH羧基 | 硫醇 | 碱 | 高碘硫酸 | hydroxylomine |
| DSS | X | ||||||||
| DST | X | X | |||||||
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| 活性取向 | 裂解 | ||||||||
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20 25 30Ser Glu Lys Tyr Leu Lys Ile Lys His Leu Leu Leu Lys Arg Glu Arg
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Claims (30)
1.一种体外刺激造血细胞的方法，其包括：
(1)将造血细胞与充分量的二肽基肽酶IV类的抑制剂接触，以增加所说的造血细胞的量和/或所说的造血细胞的分化状况，比较存在于不与抑制剂接触但使用相同培养条件的对比培养物中造血细胞，和存在抑制剂的情况下培养的造血细胞的量和分化状况；
(2)在存在抑制剂和不存在外源细胞因子的情况下培养造血细胞充分长的时间，以增加造血细胞的量和/或造血细胞的分化状况，与存在于对比培养物中的造血细胞的量比较。
2.根据权利要求1的方法，其中增加造血细胞的量包括，与当造血细胞最初与抑制剂接触时存在的造血细胞的量相比增加细胞的量至少2倍。
3.根据权利要求1的方法，其中造血细胞从下列基团中选取包括：造血干细胞，原始干细胞，早期祖细胞，CD34+细胞，间叶细胞、脊髓、淋巴、红细胞的早期种类细胞，骨髓细胞，血细胞，脐带血细胞，基质细胞和造血前体细胞。
4.根据权利要求1的方法，其中二肽基肽酶IV类(DPIV)抑制剂是从下列基团中选取的包括：可溶DPIV抑制剂和固定DPIV抑制剂。
5.根据权利要求1的方法，其中DPIV抑制剂是从下列基团中选取的包括：Lys-boroPro单体，Pro-boroPro单体，Val-boroPro单体和Lys-boroPro共轭物。
6.根据权利要求1的方法，其中抑制剂是固定抑制剂。
7.根据权利要求6的方法，其中固定抑制剂包括附着在是组织培养容器的固定结构上的抑制剂。
8.根据权利要求6的方法，其中固定抑制剂包括附着在是颗粒的固定结构上的抑制剂。
9.根据权利要求1的方法，其中抑制剂的充分量是增加造血细胞量至少2倍所需的量。
10.一种装置，其包括：
(1)容器；
(2)含在其中或附着在其上的DPIV抑制剂。
11.根据权利要求10的装置，其中容器是消毒的。
12.根据权利要求10的装置，其中容器是细胞培养容器，DPIV抑制剂附着在细胞培养容器的表面。
13.根据权利要求10的装置，其中DPIV抑制剂附着在含在容器中的颗粒上。
14.一种组合物，其包括：
(1)磁性颗粒；和
(2)附着在其上的DPIV抑制剂。
15.根据权利要求14的组合物，其中组合物是消毒的。
16.一种体外刺激造血细胞的工具，其包括：
(1)任何权利要求10，11，12和13的装置；和
(2)使用装置体外增加造血细胞量的说明。
17.根据权利要求16的工具，进一步包括一种或多种培养造血细胞的生长营养物，其中所说的生长是在设备容器中或是在独立容器中提供的，营养物内容物可在培养细胞时加入到容器中。
18.一种体外扩增抗原-特异T细胞的方法，其包括：
(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养骨髓细胞以增加培养物中早期T种类细胞的量；和
(2)在充分量的含抑制剂的复共轭对配合物存在可情况下培养早期T种类细胞，DPIV抑制剂附着在抗原肽上，以扩增培养物中抗原-特异T细胞的量。
19.一种体外扩增抗原-特异T细胞的方法，其包括：
(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养脐带血细胞以增加培养物中早期T种类细胞的量；和
(2)在充分量的含抑制剂的复共轭对配合物存在可情况下培养早期T种类细胞，DPIV抑制剂附着在抗原肽上，以扩增培养物中抗原-特异T细胞的量。
20.一种体外扩增抗原-特异T细胞的方法，包括：
(1)在充分量的DPIV抑制剂存在的情况下培养外周血细胞以增加培养物中早期T种类细胞的量；和
(2)在充分量的含抑制剂的复共轭对配合物存在可情况下培养早期T种类细胞，DPIV抑制剂附着在抗原肽上，以扩增培养物中抗原-特异T细胞的量。
21.一种体外扩增抗原-特异T细胞的方法，其包括：
(1)在充分量的含抑制剂的复共轭对配合物存在可情况下培养外周血液细胞，DPIV抑制剂附着在抗原肽上，以扩增培养物中抗原-特异T细胞的量。
22.根据权利要求18，19，20或21的方法，其中DPIV抑制剂是从下列基团中选取的包括：DPIV单体，DPIV共轭对配合物，和前述的组合物。
23.根据权利要求18，19，20或21的方法，其中复共轭对配合物含肿瘤-特异抗原。
24.根据权利要求18，19，20或21的方法，其中复共轭对配合物含病原-特异抗原。
25.根据权利要求18，19，20或21的方法，其中至少一个培养步骤在存在加入的细胞因子或基质细胞的情况下实施。
26.根据权利要求18，19，20或21的方法，其中至少一个培养步骤在不存在加入的细胞因子或基质细胞的情况下实施。
27.根据权利要求18，19，或20的方法，其中步骤(2)在存在抗原肽的情况下实施。
28.根据权利要求21的方法，其中步骤(1)在存在抗原肽的情况下实施。
29.根据权利要求18，19，或20的方法，其中步骤(1)和步骤(2)顺序实施。
30.根据权利要求18的方法，其中骨髓细胞是从包括分离CD34+细胞和分离干细胞中选取的。
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