CN1280614A - 利用具重组位点的核酸进行重组克隆 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用核酸、载体及体外和体内方法进行的重组克隆方法,可用来经改造过的重组位点和重组蛋白质移动或交换DNA分子区段,得到具有预期特性的嵌合DNA分子和/或DNA区段。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及重组DNA技术。提供了具改造重组位点的DNA和载体以用于重组克隆方法中,使得能用重组蛋白质实现DNA区段的有效和特异重组。这些DNA、载体和方法可用于体外和体内的DNA交换,诸如DNA的亚克隆之类。
相关技术
位点特异性重组酶。位点特异性重组酶是存在于许多生物(如病毒和细菌)中并具内切核酸酶和连接酶特性的蛋白质。这些重组酶(在某些情况下与相关蛋白质一起)识别DNA中碱基的特异序列并交换那些区段侧翼的DNA区段。这些重组酶和相关蛋白质共同地被称为“重组蛋白质”(参阅,如,Landy,A.,生物技术中的最新观点(Current Opinion inBiotechnology 3:699-707(1993))。
来自多种生物的许多重组系统已被描述。参阅,如,Hoess等人,核酸研究14(6):2287(1986);Abremski等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)261(1):391(1986);Campbell,细菌学杂志(J.Bacteriol.)174(23):7495(1992);Qian等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267(11):7794(1992);Araki等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)225(1):25(1992);Maeser和Kahnmann,分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)230:170-176(1991);Esposito等人,核酸研究25(18):3605(1997)。
这其中的许多属于重组酶的整合酶家族(Argos等人,EMBO J.5:433-440(1986))。其中研究得最清楚的可能是来自噬菌体λ的整合酶/att系统(Landy,A.遗传学及发育的最新观点(Current Opinions inGenetics and Devel.)3:699-707(1993)),来自噬菌体P1的Cre/loxP系统(Hoess和Abremski(1990),《核酸和分子生物学》(Nucleic Acidsand Molecular Biology),第4卷,Eckstein和Lilley,Betlin-Heidelberg编:Springer-Verlag;90-109页),及来自酿酒醇母2μ质粒的PLP/FRT系统(Broach等人,细胞29:227-234(1982))。
尽管对于特殊生物这些重组系统的特征已被描述,相关技术只教导了将侧翼有重组位点的重组DNA用于体内重组。
Backman(美国专利号4,673,640)公开了在体内利用λ重组酶通过用野生型重组位点attB和attP进行酶促位点特异性重组而重组编码蛋白质的DNA区段。
Hasan和Szybalski(基因56:145-151(1987))公开了在体内将λInt重组酶用于启动子旁侧的野生型attP和attB位点之间的分子内重组。因为这些位点的取向是互相相反的,这导致启动子区相对于目的基因发生了不可逆翻转。
Palazzolo等人,基因88:25-36(1990),公开了具噬菌体λ臂的噬茵体λ载体,该λ臂含有位于所克隆DNA序列之外、野生型loxP位点之间的限制位点。用这些噬菌体载体侵染表达Cre重组酶的大肠杆菌细胞,会导致loxP位点之间的重组和质粒复制子,包括被克隆的cDNA的体内切除。
Posfai等人(核酸研究22:2392-2398(1994))公开了用于将具选择标记、两侧有两野生型FRT识别序列的部分表达载体插入基因组DNA的方法。存在于细胞中的FLP位点特异性重组酶被用于将载体整合入基因组的预定位点。在复制子有功能的条件下,此克隆基因组DNA可被扩增。
Bebee等人(美国专利号5,434,066)公开了位点特异性重组酶的使用,例如对于含两个loxP位点的DNA,Cre可用于这两位点间的体内重组。
Boyd(核酸研究21:817-821(1993))公开了使用有助于分子间连接的条件促进将平头DNA克隆至去磷酸化载体的方法,此载体含有受存在于大肠杆菌宿主细胞中的Cre位点特异性重组酶作用的野生型loxP位点。
Waterhouse等人(PCT 93/19172和核酸研究21(9):2265(1993))公开了特定抗体的轻和重链被克隆入不同噬菌体载体中loxP和loxP511位点之间并用于转染新大肠杆菌细胞的体内方法。Cre在宿主细胞中作用于两亲代分子上(一质粒,一噬菌体),平衡产生4种产物:两种不同的共合体(通过于loxP或loxP511位点重组而产生),及两个子代分子,其中之一是所需的产物。
与其它相关技术形成对照,Schlake和Bode(生物化学33:12746-12751(1994))公开了在确定染色体位置上交换侧翼均为野生型和间隔子突变的FRT重组位点的表达盒的体内方法。通过将此FLP/FRT系统用于位点特异性重组,可在培养的哺乳动物细胞中发生双交互交换。
转座酶。转座酶这一家族的酶已被用于在复制子之间传递遗传信息。转座子在结构上可变,被描述为简单的或复合的,但一般编码侧翼为相反取向的DNA序列的重组酶基因。转座子的整合可以是随机的或高度特异性的。诸如高度位点特异性的Tn7之类的代表已被应用于在复制子之间体内移动DNA区段(Lucklow等人,病毒学杂志67:4566-4579(1993))。
Devine和Boeke,核酸研究22:3765-3772(1994),公开了构建人工转座子以将DNA区段体外插入受体DNA分子中。该系统使用了酵母TY1类病毒颗粒的整合酶。用标准方法将目的DNA区段克隆于类转座子元件TY1末端之间。在TY1整合酶的存在下,产生的元件随机整合入第二靶DNA分子。
DNA克隆。DNA区段的克隆通常在许多研究实验室中作为日常工作进行,并且在许多遗传分析中是必要的步骤。这些克隆的目的各种各样,然而可以归为两种一般目的:(1)从大DNA或RNA区段(染色体、YAC、PCR片段、mRNA,等等)起始克隆DNA,是在相对少数的诸如pUC、pGem、pBlueScript之类已知载体中进行的,及(2)将这些DNA区段亚克隆入特化载体以进行功能分析。有大量时间和努力花费于将DNA区段从起始克隆载体转移至更特化的载体中。此转移被称为亚克隆。
克隆的基本方法已知许多年,且在此期间改变不多。典型的克隆流程如下:
(1)用一种或两种限制酶消化目的DNA;
(2)在已知的情况下用凝胶纯化目的DNA区段;
(3)必要时,通过用恰当限制酶酶切、用碱性磷酸酶处理、凝胶纯化等制备载体;
(4)将DNA区段连接至载体,作适当的对照以消除未切和自连载体的背景;
(5)将产生的载体引入大肠杆菌宿主细胞;
(6)挑出选择的菌落并小量培养过夜;
(7)小量制备DNA;并
(8)在琼脂糖凝胶上(通常在鉴定性限制酶消化后)或用PCR分析分离的质粒。
用于亚克隆DNA区段的特化载体在功能上是多种多样的。这些载体包括但不局限于:用于在各种各样生物中表达基因的载体;用于调节基因表达的载体;用于提供标志以协助蛋白质纯化或允许在细胞中追踪蛋白质的载体;用于修饰被克隆DNA区段(如产生缺失)的载体;用于探针合成(如核糖核酸探针)的载体;用于制备DNA测序模板的载体;用于蛋白质编码区鉴定的载体;用于各种蛋白质编码区的融合的载体;为了提供大量目的DNA的载体,等等。通常一项特定的研究包括将目的DNA区段亚克隆入数种不同的特化载体中。
如本领域中已知的,简单的亚克隆可在一天内完成(例如,DNA片段不大,且限制位点与亚克隆载体的限制位点相匹配时)。然而,许多其它的亚克隆需费时数周,尤其是那些涉及未知序列、长片段、毒性基因、限制位点的不合适安插、高背景、不纯的酶等等的亚克隆。因而DNA片段的亚克隆经常被认为是困难的工作,尽可能少次数进行。促进DNA区段克隆的数种方法已描述于例如以下文献中。
Ferguson,J.等人,基因16:191(1981),公开了用于酵母DNA片段亚克隆的载体家族。这些载体编码卡那霉素抗性。可将较长酵母DNA区段的克隆部分消化并连接入亚克隆载体。如果最初的克隆载体赋予对氨苄青霉素的抗性,则在转化前无需纯化,因为选择将是针对卡那霉素进行。
Hashimoto-Gotoh,T.等人,基因41:125(1986),公开了在链霉素敏感性基因内有单克隆位点的亚克隆载体;在链霉素抗性宿主内,只有在显性的敏感性基因内有插入或缺失的质粒能在链霉素选择中存活。
因此,使用限制酶和连接酶的传统亚克隆方法费时,且相对不可靠。要花费大量劳动,如果两天或更多天后在候选质粒中不能找到所需的亚克隆,则整个过程随后必须尝试用其它条件重复。尽管位点特异性重组酶已用于体内DNA重组,但这样的酶在体外成功应用预计会遇到多个问题。例如,预计位点特异性和效率在体外是不同的;预计有拓扑学连接产物;且预计DNA底物和重组蛋白质的拓扑结构在体外显著不同(参阅如Adams等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.226:661-73(1992))。体内能进行许多小时的反应预计在酶丧失活性前只能在体外进行明显较短的时间。在所用生物宿主内预期有多种DNA重组产物,导致亚克隆不能有令人满意的可靠性、专一性或效率。因此,预计体外重组反应不足以有效生产所需水平的产物。
因而,长期存在具有优于已知的限制酶和连接酶使用的其它亚克隆体系的需要。
发明概述
本发明提供了在体外或体内利用重组蛋白质和至少一个重组位点获得扩增的、嵌合的或重组核酸分子的核酸、载体和方法。这些方法是高度特异的、快速的,且劳动强度较标准克隆或亚克隆技术低。本发明之改进的特异性、速度和产量可促进用于任何相关目的的DNA或RNA克隆或亚克隆、调节或交换。
本发明涉及可用于通过利用至少一个重组位点和至少一种重组蛋白质移动或交换核酸区段(优选DNA区段或片段)以提供具所需特性和/或DNA区段之嵌合DNA分子的核酸、载体和方法。因而本发明的使用可使得将这样的核酸分子克隆或亚克隆入种种载体中。一般地,将一种或多种亲代核酸分子(优选DNA分子)重组以产生一种或多种子代分子,至少其中之一是所需产物分子,它优选是含所需核酸区段的载体。本发明因而涉及能达到交换和/或选择一种或多种所需产物的核酸分子、载体和方法。
本发明的一实施方案涉及制备嵌合分子的方法,它包括
(a)体外或体内联合
(ⅰ)含侧翼有第一重组位点和第二重组位点之所需核酸区段的一种或多种插入物供体分子,其中的第一和第二重组位点基本上不相互重组;
(ⅱ)含第三重组位点和第四重组位点的一种或多种载体供体分子,其中第三和第四重组位点基本上不相互重组;和
(ⅲ)能重组第一和第三重组位点和/或第二和第四重组位点的一种或多种位点特异性重组蛋白质;
由此使重组发生,以便产生至少一种共整合核酸分子、至少一种含该所需区段的所需产物核酸分子,及任选的副产物核酸分子;然后任选地
(b)选择产物或副产物DNA分子。
在另一实施方案中,本发明涉及制备嵌合分子的方法,它包括:
(a)体外或体内联合
(ⅰ)含侧翼有两个或多个重组位点之所需核酸区段的一种或多种插入物供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;
(ⅱ)含两个或多个重组位点的一种或多种载体供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;和
(ⅲ)一种或多种位点特异性重组蛋白质;
(b)在足以使一个或多个所需区段转移入一种或多种所说的载体供体分子的条件下温育该组合,从而产生一种或多种产物分子。产生的产物分子可任选地选择出来或与其它分子,诸如共整合分子、副产物分子及未反应载体供体分子或插入物供体分子分离。在本发明的优选方面,将插入物供体分子与一种或多种不同的载体供体分子结合,从而产生不同产物分子,这样在一个步骤中将目的核酸转移入许多不同载体内。
根据本发明,上述方法可反过来提供最初的插入物供体分子,随后将它与一种或多种不同载体供体分子联合,以产生新产物或副产物分子。或者,用本发明方法产生的产物分子可用作插入物供体分子,它可直接与一种或多种不同的载体供体分子结合使用,从而产生新的产物或副产物分子。因此,目的核酸分子可被转移或移动至许多所需载体中,从而提供了亚克隆目的分子的一种有效方法。
因而,本发明涉及将产物分子与第二载体供体分子结合以产生第二产物分子。此第二产物DNA分子随后可与第三载体供体分子联合使用,产生第三产物分子。本发明的此过程可重复多次以转移或移动目的插入片段至多种不同载体中。在本发明的此方面,两个或多个不同载体供体分子的联合可再与产物分子联合,从而一步产生不同的产物分子,其中所需核酸区段(来自产物DNA分子)被转移入许多不同载体中。
特别是,本发明涉及用于克隆或亚克隆一种或多种所需核酸分子的方法,包括
(a)体外或体内联合:
(ⅰ)含侧翼有至少两个重组位点的一个或多个所需核酸区段的一种或多种插入物供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;
(ⅱ)含至少两个重组位点的一种或多种载体供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;及
(ⅲ)一种或多种位点特异性重组蛋白质;
(b)在足以允许一个或多个该所需区段被转移入一种或多种所说载体供体分子的条件下温育所说的组合,从而产生一种或多种产物分子;
(c)任选地选择或分离所说的产物分子;
(d)体外或体内结合:
(ⅰ)含侧翼有两个或多个重组位点的所说所需区段的一种或多种所说产物分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;
(ⅱ)含两个或多个重组位点的一种或多种不同的载体供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;及
(ⅲ)一种或多种位点特异性重组蛋白质;及
(e)在足以转移一个或多个该所需区段入一种或多种所说不同载体供体分子的条件下温育所说的组合,从而产生一种或多种不同的产物分子。
依据本发明,载体供体分子可包含能在种种系统或宿主细胞中起作用的载体。用于本发明的优选载体包括原核载体、真核载体或可穿梭于多种原核和/或真核系统之间的载体(例如穿梭载体)。可用于本发明的优选原核载体包括但不局限于在革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌中可增殖和/或复制的载体,所述细菌包括埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、梭菌属、克雷伯氏杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属及假单胞杆菌属的细菌,优选大肠杆菌。可用于本发明的真核载体包括可在酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞(尤其是人)、真菌细胞、昆虫细胞、鱼类细胞等等中增殖和/或复制的载体。感兴趣的特殊载体包括但不局限于克隆载体、测序载体、表达载体、融合载体、双杂交载体(two-hybridvector)、基因治疗载体及反向双杂交载体(reverse two-hybridvector)。这样的载体可用于原核和/或真核系统中,这取决于具体的载体。
按本发明使用的插入物供体分子优选包括两个或多个重组位点,可使得供体分子的插入物(如目的核酸区段)按本发明被转移或移动入一种或多种载体供体分子。本发明的插入物供体分子可通过将两个或多个重组位点加入目的分子的许多技术制备。加入重组位点以制备本发明插入物供体分子的这些方法包括核酸分子突变(如随机或位点特异性诱变)、重组技术(如,将含重组位点的衔接子或核酸分子连接到线性分子上)、扩增(如用含重组位点或其部分的引物)、转座(如用含重组位点的转座子)、重组(如用含重组位点的一个或多个同源序列)、核酸合成(如含重组位点之分子的化学合成或用多种聚合酶或逆转录酶进行的酶促合成)等等。按照本发明,被添加一个或多个重组位点的核酸分子可以是任何来源的核酸分子,并可包括非天然核酸(如RNA;见美国专利号5,539,082和5,482,836)。特别优选的核酸分子是DNA分子(单链或双链)。此外,用于产生插入物供体分子的感兴趣核酸分子可以是线性或环状的,并可进一步包含特定的目的序列(如基因)或可以是分子群(如产生自基因组或cDNA文库的分子)。
因此,本发明涉及许多制备插入物供体分子的方法及用这些方法产生的插入物供体分子。在本发明的一方面,含一个或多个重组位点或其部分的引物被用于核酸合成或核酸扩增以制备本发明的插入物供体分子。因而,本发明涉及合成核酸分子的方法,包括:
(a)将一种或多种核酸模板与具聚合酶活性的多肽和含一个或多个重组位点或其部分的一个或多个引物混合;并
(b)在足以合成与所说模板全部或其部分互补并含一个或多个重组位点的一种或多种核酸分子的条件下温育所说的混合物。按照本发明,含一个或多个重组位点的合成核酸分子可在适当条件下用作模板以合成与含重组位点之模板全部或其部分互补的核酸分子,从而形成含一个或多个重组位点的双链分子。优选地,在含一个或多个重组位点的一个或多个引物存在下完成此第二合成步骤。另一方面,用可含一个或多个重组位点的引物可扩增合成的双链分子。
在本发明的另一方面,可以用许多核酸扩增技术将一个或多个重组位点加入核酸分子中。具体地说,这样的方法包括:
(a)在一种或多种具聚合酶活性之多肽的存在下将第一核酸分子与互补于该第一核酸分子一部分的第一引物分子接触,将第二核酸分子与互补于该第二核酸分子一部分的第二引物分子接触;
(b)在足以形成互补于所说第一核酸分子全部或一部分的第三核酸分子及互补于所说第二核酸分子全部或一部分的第四核酸分子的条件下温育所说的分子;
(c)变性所说的第一和第三及所说的第二和第四核酸分子;并
(d)重复步骤(a)至(c)一次或多次,
其中所说的第一和/或第二引物分子包括一个或多个重组位点或其部分。
在本发明的另一方面,将一个或多个重组位点加入核酸分子的方法可包括:
(a)将一种或多种核酸分子与含一个或多个重组位点或其部分的一个或多个衔接子或核酸分子接触;并
(b)在足以加入一个或多个重组位点至该核酸分子的条件下温育该混合物。优选地,对线性分子按本发明加入这样的衔接子或分子,且这样的衔接子或分子优选被加入到这种线性分子的一个或多个末端。用包括机械(如超声处理或剪切)或酶促(如限制性内切核酸酶之类的核酸酶)在内的任何技术可制备线性分子。因此,本发明的方法可进一步包括用一种或多种核酸酶(优选任何限制性内切核酸酶)消化核酸分子并连接含一个或多个重组位点的衔接子或分子至目的分子。可用平端或粘端分子完成连接。或者,按本发明可以用拓扑异构酶引入重组位点。拓扑异构酶切开并再连接核酸分子,因而可代替核酸酶和连接酶使用。
在另一方面,可通过从头合成而将一个或多个重组位点加入到核酸分子中。因而,本发明涉及包括化学合成一种或多种核酸分子在内的方法,其中通过在合成过程中加入恰当核苷酸序列而加入重组位点。
在本发明的另一实施方案中,可以按下述方法将一个或多个重组位点加入目的核酸分子中,该方法包括:
(a)将一种或多种核酸分子与含一个或多个重组位点或其部分的一种或多种整合序列接触;并
(b)在足以将含该重组位点之整合序列掺入所说核酸分子的条件下温育该混合物。按本发明的此方面,整合序列可包含通过重组或整合将成为目的核酸分子一部分的任何核酸分子。按照本发明这一方面,可以通过使用转座子、插入序列、整合病毒、归巢内含子(homing intron)或其它整合元件进行体内或体外重组(同源重组或非常规重组)或者进行体内或体外装配而将整合序列引入。
另一方面,本发明涉及执行本发明方法的试剂盒,且更特别地涉及克隆或亚克隆试剂盒及用于制备本发明插入物供体分子的试剂盒。上述试剂盒可包含被区室化的载体或贮器以在其中接收和保留许多容器。该容器可包含进行本发明方法的许多组分或这些组分的组合。尤其是,本发明的试剂盒可包含选自一种或多种重组蛋白质或重组酶、一种或多种载体供体分子、一种或多种插入物供体分子及一种或多种宿主细胞(如感受态细胞)的一种或多种组分(或它们的组合)。
制备本发明插入物供体分子的试剂盒可包含许多成分,该试剂盒的成分可依所涉及的具体方法而变化。用于通过扩增合成插入物供体分子的试剂盒可包含选自具聚合酶活性的一种或多种多肽(优选DNA聚合酶,最优选耐热DNA聚合酶)、一种或多种核苷酸及含一个或多个重组位点的一个或多个引物的一种或多种组分(或其组合)。用于插入或添加重组位点至目的核酸分子的试剂盒可包含一种或多种核酸酶(优选限制性内切核酸酶)、一种或多种连接酶、一种或多种拓扑异构酶、一种或多种聚合酶,及含一个或多个重组位点的一种或多种核酸分子或衔接子。用于将重组位点整合入一种或多种目的核酸分子的试剂盒可包含选自含一个或多个重组位点之一个或多个整合序列的一种或多种组分(或其组合)。上述整合序列可包含一种或多种转座子、整合病毒、同源重组序列、一种或多种宿主细胞等等。
本发明还涉及用于执行本发明方法的组合物或执行本发明方法时产生的组合物。尤其是,这样的组合物可包含一种或多种插入物供体分子、一种或多种载体供体分子及一种或多种重组蛋白质(或其组合)。在进一步的方面,本发明的组合物可包含一种或多种共整合分子、一种或多种产物分子及一种或多种副产物分子(或其组合)。
涉及制备插入物供体分子的组合物可依应用于制备所需插入物供体分子的具体方法而变化。通过扩增制备上述分子的组合物可包含一种或多种具聚合酶活性的多肽、一种或多种含一个或多个重组位点的引物、一种或多种核苷酸和一种或多种将扩增的核酸分子(或其组合)。涉及插入或添加重组位点至所需核酸分子的组合物可包括含一个或多个重组位点的一种或多种核酸分子或衔接子、一种或多种连接酶、一种或多种限制性内切核酸酶、一种或多种拓扑异构酶、及一种或多种希望含这种重组位点的核酸分子(或它们的组合)。涉及在所需核酸分子中整合重组位点的组合物可包括含一个或多个重组位点的一种或多种整合序列及希望含重组位点的一种或多种核酸分子。
在本发明特别优选的方面,文库(例如通过从新合成诸如随机序列或简并寡核苷酸之类而产生的基因组DNA或cDNA群或核酸分子群)按本发明被利用。通过插入或添加重组位点至所说的核酸分子群,产生了插入物供体分子群。通过本发明的重组方法,可以很容易将文库移入不同的载体(或载体的组合)中并因而引入不同的宿主系统(原核的和真核的),以评估和分析该文库或来自此文库的特殊序列或克隆。或者,含所需分子的载体可用于体外系统,例如用于RNA和/或蛋白质生产的体外表达系统。在特别优选的方面,一个或多个重组位点被加入到基因文库的核酸分子中,所用方法包括:
(a)将线性核酸分子群与含一个或多个重组位点的一种或多种衔接子混合;并
(b)在足以添加一个或多个所说的衔接子至所说线性分子一个或多个末端的条件下温育该混合物。在优选的方面,核酸分子群是双链DNA分子(优选基因组DNA或cDNA)。用于本发明的线性片段群可通过切割(用机械的或酶促的方法)基因组或cDNA而制备。在优选的方面,衔接子被加入到线性分子的一个或多个末端。
在本发明的另一特别优选方面,cDNA文库被用于制备本发明的插入物供体DNA分子群。特别地,本发明此方面涉及的方法包含:
(a)将RNA、mRNA或polyA+RNA模板群与具逆转录酶活性的一种或多种多肽和含一个或多个重组位点的一种或多种引物接触;
(b)在足以合成互补于所说模板之第一DNA分子群的条件下温育该混合物,其中所说的DNA分子包含一个或多个重组位点。本发明的此方面可进一步包括在足以制备互补于所说第一DNA分子群全部或部分之第二DNA分子群的条件下温育该合成DNA,从而形成含一个或多个重组位点的双链DNA分子群。
在特别优选的方面,本发明的插入物供体分子含至少两个重组位点,当其中的插入物供体分子是线性时,这样的两个或多个重组位点优选位于分子的两末端处或附近。按照本发明,附加重组位点(即两个以上)的使用可促进在插入物供体分子中不同插入物的亚克隆,这依该重组位点的类型和定位而定。
其它的实施方案包括可用于本发明方法中的DNA和载体。尤其是,在一个实施方案中提供了载体供体分子,其中在载体供体内的DNA区段被隔开,(ⅰ)在环状载体供体内是由至少两个重组位点隔开的,或(ⅱ)在线性载体供体内是由至少一个重组位点隔开的,其中重组位点优选被改造以增强重组的特异性或效率。一个载体供体实施方案包括第一DNA区段和第二DNA区段,该第一或第二区段包含选择标记。另一个载体供体实施方案包括第一DNA区段和第二DNA区段,该第一或第二DNA区段含有毒性基因。第三个载体供体实施方案包括第一DNA区段和第二DNA区段,该第一或第二DNA区段含有至少一个选择标记的无活性片段,当第一或第二重组位点与至少一个选择标记的另一无活性片段重组时,选择标记的无活性片段能重组成有功能的选择标记。
根据本领域已有知识、本发明的附图和描述及权利要求,本发明的其它优选实施方案对常规技术人员是显而易见的。
附图简述
图1描述了本发明的一个一般方法,其中起始(亲代)DNA分子可以是环状的或线性的。其目的是为了用新的亚克隆载体D交换最初的克隆载体B。在一实施方案中理想的是选择AD而排除掉所有的其它分子,包括共合体(Cointegrate)。方格和圆圈是重组位点:例如loxP位点、att位点等等。例如,区段D可包含表达信号、新药物标记、新复制起点、或用于绘图或测序DNA的特化功能。
图2A描述了在体外将插入物供体质粒(在此是pEZC705)与载体供体质粒(在此是pEZC726)重组并获得产物(Product)DNA和副产物(Byproduct)子代分子的方法。两个重组位点是载体供体上的attP和loxP。由这些位点限定的一个区段上有启动子已被来自转座子Tnlo之tetOP操纵子/启动子替代的卡那霉素抗性基因。参阅如Sizemore等人,核酸研究,18(10):2875(1990)。在缺乏tet阻遏物蛋白时,大肠杆菌RNA聚合酶由tetOP转录卡那霉素抗性基因。如果tet阻遏物存在,则它与tetOP结合并阻断卡那霉素抗性基因的转录。pEZC726的另一区段具有由组成型启动子表达的tet阻遏物基因。因为在与tetR同一区段上有氯霉素乙酰转移酶基因,故由pEZC726转化的这些细胞是抗氯霉素的,但对卡那霉素敏感。重组酶介导的反应导致tetR基因与受调节的卡那霉素抗性基因分离。此分离只在接收所需重组产物的细胞中导致卡那霉素抗性。通过添加被称为整合酶的重组酶可驱动第一重组反应。通过添加重组酶Cre至共合体(在此是pEZC7共合体)可驱动第二重组反应。
图2B描述了pEZC705的限制性图谱。
图2C描述了pEZC726的限制性图谱。
图2D描述了pEZC7 Coint的限制性图谱。
图2E描述了Intprod的限制性图谱。
图2F描述了Intbyprod的限制性图谱。
图3A描述了将插入物供体质粒(在此是pEZC602)与载体供体质粒(在此是pEZC629)重组并获得产物(在此是EZC6产物)和副产物(在此是EZC6副产物)子代分子的体外方法。两个重组位点是loxP和loxP 511。由这些位点限定的一个pEZC629区段是启动子已被来自转座子Tn10之tetOP操纵子/启动子替代的卡那霉素抗性基因。在缺乏tet阻遏物时,大肠杆菌RNA聚合酶由tetOP转录卡那霉素抗性基因。如果tet阻遏物存在,则它与tetOP结合并阻断卡那霉素抗性基因的转录。pEZC629的另一区段具有由组成型启动子表达的tet阻遏物基因。因为在与tetR相同的区段上有氯霉素乙酰转移酶基因,故由pEZC629转化的细胞是抗氯霉素的,但对卡那霉素敏感。反应导致tetR基因与受调节的卡那霉素抗性基因分离。此分离使接收所需重组产物的细胞有卡那霉素抗性。通过添加同一重组酶Cre驱动第一和第二重组反应。
图3B描述了EZC6Bypr的限制性图谱。
图3C描述EZC6Prod的限制性图谱。
图3D描述pEZC602的限制性图谱。
图3E描述pEZC629的限制性图谱。
图3F描述EZC6 coint的限制性图谱。
图4A描述利用重组克隆体外方法将氯霉素乙酰转移酶基因亚克隆入载体以便在真核细胞中进行表达。插入物供体质粒pEZC843含大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶基因,该基因被克隆于loxP和attB位点之间,使得loxP位点位于该基因的5′端。载体供体质粒pEZC1003含与loxP位点并列的巨细胞病毒真核启动子。将超螺旋质粒与λ整合酶和Cre重组酶体外联合。温育后,用重组反应溶液转化感受态大肠杆菌细胞。将转化的等分试样铺于含卡那霉素的琼脂平板上以选择产物分子(在此是CMVProd)。
图4B描述pEZC843的限制性图谱。
图4C描述pEZC1003的限制性图谱。
图4D描述CMVByprod的限制性图谱。
图4E描述CMVProd的限制性图谱。图4F描述CMV coint的限制性图谱。图5A描述pEZC1301的载体图。图5B描述pEZC1305的载体图。图5C描述pEZC1309的载体图。图5D描述pEZC1313的载体图。图5E描述pEZC1317的载体图。图5F描述pEZC1321的载体图。图5G描述pEZC1405的载体图。图5H描述pEZC1502的载体图。图6A描述pEZC1603的载体图。图6B描述pEZC1706的载体图。图7A描述pEZC2901的载体图。图7B描述pEZC2913的载体图。图7C描述pEZC3101的载体图。图7D描述pEZC1802的载体图。图8A描述pGEX-2TK的载体图。图8B描述pEZC3501的载体图。图8C描述pEZC3601的载体图。图8D描述pEZC3609的载体图。图8E描述pEZC3617的载体图。图8F描述pEZC3606的载体图。图8G描述pEZC3613的载体图。图8H描述pEZC3621的载体图。图8I描述GST-CAT的载体图。图8J描述GST-phoA的载体图。图8K描述pEZC3201的载体图。图9A描述5.2kb PCR产物的示意图。图9B描述pEZC1202的载体图。图9C描述5.2kb克隆的载体图。图1OA描述pEZC5601的载体图。
图10B描述pEZC6701的载体图。
图10C描述attL产物的载体图。
图10D描述attR产物。
图11A描述pEZC7102的载体图。
图11B描述pEZC7501的载体图。
图11C描述attL产物。
图12A描述带末端attB位点的amp PCR产物。
图12B描述带末端attB位点的tet PCR产物。
图12C描述amp 7102的限制性图谱。
图12D描述tet 7102的限制性图谱。
发明详述
本发明中出乎意料地发现,可逆和/或可重复的克隆和亚克隆反应能用于加工核酸,通过重组蛋白质和重组位点形成嵌合核酸。按照本发明的重组克隆使用了重组核酸分子和重组蛋白质,该重组核酸分子具至少一个选定的重组位点以在体外和体内移动或交换核酸分子区段。
这些方法使用重组反应产生具所需特征的DNA或RNA分子和/或核酸区段。本发明的方法提供了将目的核酸分子移动或转移到许多载体系统中的一条途径。按照本发明,这种向多种载体系统的转移可独立地、相继地或大量(例如一步转移到许多不同载体中)地完成。本发明的特异性、速度和/或产量有改善,这促进了可用于任何相关目的的DNA或RNA克隆、亚克隆、调节或交换。这样的目的包括DNA或RNA区段的体外重组,转录、复制、分离或基因组DNA或RNA的体外或体内插入或修饰。定义
在以下叙述中,用于重组DNA技术的许多术语被广泛利用。为便于对说明书和权利要求清楚和一致地理解,包括给出这些术语的范围,提供以下定义。
副产物:缺少期望被克隆或亚克隆的区段的子代分子(在重组克隆过程中第二次重组事件后产生的新克隆)。
共整合体:是含两亲代(起始)分子的至少一个本发明重组中间核酸分子。它通常为环状,但在某些实施方案中可以是线性。
宿主:是可作为重组克隆产物受体的任何原核或真核生物。此处所用的术语“宿主”包括可被遗传工程改造的原核或真核生物。对于这样的宿主的例子,参阅Maniatis等人,分子克隆:实验室手册,冷泉港实验室,冷泉港,纽约(1982)。
插入物:包括可用本发明方法加工的所需核酸区段或核酸区段群(图1的区段A)。因此,术语插入物意指包括特殊核酸(优选DNA)区段或区段群。这样的插入物可包括一个或多个基因。
插入物供体:是携带插入物的本发明两亲代核酸分子之一(如RNA或DNA)。插入物供体分子含两侧均有重组位点的插入物。插入物供体可以是线性或环状的。在本发明的一个实施方案中,插入物供体是环状DNA分子,并还在重组信号之外包含克隆载体序列(见图1)。当插入物群或核酸区段群被用于制备插入物供体时,将得到插入物供体群并可按本发明使用。
产物:是重组克隆过程中第二次重组事件后产生的含A和D序列的所需子代分子之一。产物包含将被克隆或亚克隆的核酸。按本发明,当使用插入物供体群时,产生的产物分子群将包含插入物供体的插入物群全部或一部分,优选包含插入物供体最初分子的代表性群体。
启动子:是通常描述为基因5′区域、位于起始密码子近侧的DNA序列。相邻DNA区段的转录起始于启动子区域。因阻遏剂的作用,诱导型启动子的转录速率下降。尽管在一般代谢条件影响下它可变化,但组成型启动子的转录速率不受特异调节。
识别序列:识别序列是蛋白质、化学物质、DNA或RNA分子(如限制性内切核酸酶、修饰甲基化酶或重组酶)识别并结合的特殊序列。在本发明中,识别序列通常指重组位点。例如,Cre重组酶的识别序列是loxP,它是一个34碱基序列,由8碱基对核心序列及位于两侧的两个13碱基对反向重复序列(用做重组酶结合位点)组成。见Sauer,B.,生物技术最新观点,5:521-527(1994)中的图1。识别序列的其它例子是被重组酶--λ整合酶识别的attB、attP、attL和attR序列。attB是含两个9bp核心型整合酶结合位点和一个7bp重叠区的约25bp序列。attP是含核心型整合酶结合位点和臂型整合酶结合位点及辅助蛋白质--整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)相关位点的约240bp序列。参阅Landy,生物技术的最新观点3:699-707(1993)。这样的位点还可按本发明被改造以增强本发明方法中产物的生产。当所说的改造位点缺少P1或H1结构域使重组反应不可逆(如attR或attP)时,这样的位点可被称为attR′或attp′,以表示这些位点的结构域已按某种方式被修饰。
重组酶:是催化DNA区段在特异重组位点交换的酶。
重组克隆:是此处所述的一种方法,由此可在体外或体内交换、插入、取代、置换或修饰核酸分子区段或这样的分子群。
重组蛋白质:包括切除或整合蛋白质、酶、辅助因子或涉及有关一个或多个重组位点之重组反应的相关蛋白质。参阅Landy(1994),见上文。
阻抑盒:是含存在于亚克隆载体中的选择标记的阻抑物的核酸区段。
选择标记:是使得可选择到或排除掉含有它的分子或细胞的DNA区段(经常是在特殊条件下)。这些标记可编码活性,例如但不局限于RNA、肽或蛋白质的产生,或可提供RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等等的结合位点。选择标记的例子包括但不局限于:(1)编码提供抗其他有毒化合物(如抗生素)之抗性的产物的DNA区段;(2)编码在受体细胞中原本缺乏的产物的DNA区段(如tRNA基因、营养缺陷型标记);(3)编码抑制基因产物活性的产物的DNA区段;(4)编码可容易鉴定的产物的DNA区段(如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)和细胞表面蛋白之类表型标记);(5)可结合原本对细胞生存和/或功能有害的产物的DNA区段;(6)本来会抑制上述1-5中任何DNA区段的活性的DNA区段(如反义寡核苷酸);(7)能与修饰底物的产物(如限制内切核酸酶)结合的DNA区段;(8)可用于分离或鉴定所需分子的DNA区段(如特异性蛋白质结合位点);(9)编码本来无功能的特异核苷酸序列的DNA区段(如用于分子亚群的PCR扩增);(10)缺乏时直接或间接赋与对特殊化合物的抗性或敏感性的DNA区段;和/或(11)编码在受体细胞中有毒的产物的DNA区段。
选择方案:是能够用来从含插入物供体、载体供体、任何中间体(如共合体)及/或副产物之混合物中选择、富集或鉴定所需产物的任何方法。一个优选实施方案的选择方案具至少两个组分,它们在重组克隆中连接或不连接在一起。一个组分是选择标记。另一组分控制选择标记的体外或体内表达,或含有携带选择标记之质粒的细胞的存活。一般地,该控制元件是选择标记的阻抑物或诱导物,但也可使用能控制选择标记表达的其它方法。正如对本领域技术人员所显而易见的,到底使用阻抑物还是激活剂将取决于该标记是正选择还是负选择,以及各DNA区段的正确排列。优选的要求是选择方案能选择或富集仅一种或多种所需产物。正如本文所表明的,DNA分子的选择包括(a)对所需DNA分子进行选择或富集,和(b)排除掉非所需DNA分子的DNA分子而进行选择或富集。
在一个实施方案中,选择方案(可反向进行)可采取三种形式之一,这将以图1的形式论述。因而本文中以选择标记和阻抑物举例说明的第一种形式可选择具区段D并缺乏区段C的分子。第二种形式选择排除具区段C的分子并选择出具区段D的分子。第二种形式的可能实施方案将具有带对待引入体外反应产物的细胞有毒的基因的DNA区段。毒性基因可以是表达为毒性基因产物(毒性蛋白质或RNA)的DNA,或可以是其自身有毒的(后一种情况中,毒性基因被理解为带有其“可遗传性状”的经典定义。)
所说毒性基因产物的例子在本领域中是众所周知的,包括但不局限于限制性内切核酸酶(如DpnⅠ)、细胞凋亡相关基因(如ASK1或bcl-2/ced-9家族成员)、包括人类免疫缺陷病毒(HIV)基因在内的逆转录病毒基因、NP-1之类的防卫素、反向重复或配对的回文DNA序列、例如来自φX174或噬菌体T4的噬菌体裂解基因、rpsL之类抗生素敏感基因、pheS之类抗微生物敏感基因、质粒杀伤基因、产生对细菌有毒之基因产物的真核转录载体基因,例如GATA-1,以及在抑制性功能缺乏时可杀死宿主的基因,如kicB或ccdB。毒性基因还可在体外选择,例如用限制位点。
许多有效连接了可诱导启动子并编码限制性内切核酸酶的基因是已知的,并可用于本发明中。参阅如美国专利号4,960,707(DpnⅠ和DpnⅡ);5,000,333,5,082,784和5,192,675(Kpn Ⅰ);5,147,800(NgoAⅢ和NgoAⅠ);5,179,015(FspⅠ和HaeⅢ);5,200,333(HaeⅡ和TaqⅠ);5,248,605(HpaⅡ);5,312,746(ClaⅠ);5,231,021和5,304,480(XhoⅠ和XhoⅡ);5,334,526(AluⅠ);5,470,740(NsiⅠ);5,534,428(SstⅠ/SacⅠ);5,202,248(NcoⅠ);5,139,942(NdeⅠ);和5,098,839(PacⅠ)。还参阅Wilson,G.G.,核酸研究19:2539-2566(1991);和Lunnen,K.D.,等人,基因74:25-32(1988)。
在第二种形式中,区段D携带选择标记。毒性基因将消除含载体供体、共合体及副产物分子的转化体,而选择标记可用于选择出含产物的细胞并排除掉只含插入物供体的细胞。
第三种形式选择具有顺式位于同一分子上的区段A和D的细胞,并排除掉具有反式位于不同分子上的两区段的细胞。这可通过利用分成各位于区段A和D上的两无活性片段的选择标记而实现。
这些片段相对于重组位点的排列方式使得当区段通过重组接在一起时,它们能重构成有功能的选择标记。例如,重组事件可将启动子与结构基因连接,可连接结构基因的两个片段,或可连接编码存活所需杂二聚体基因产物的基因,或可连接复制子的各部分。
位点特异性重组酶:是重组酶的一种类型,一般至少具有以下4种活性(或它们的联合):(1)一个或多个特异核酸序列的识别;(2)所述序列的切割;(3)涉及链交换的拓扑异构酶活性;及(4)重封闭核酸断裂链的连接酶活性。参阅Sauer,B.,生物技术中的最新观点5:521-527(1994)。保守位点特异性重组与同源重组和转座的区别在于后二者的特异性较高。链交换机制包括在DNA合成缺乏时切割和再连接特异DNA序列(Landy,A.(1989)生化年鉴(Ann.Rev.Biochem.)58:913-949)。
亚克隆载体:是含优选包括恰当复制子之环状或线性核酸分子的克隆载体。在本发明中,亚克隆载体(图1的区段D)还可包含希望掺入终产物中以作用于克隆DNA插入物(图1中的区段A)或与其一起起作用的功能性和/或调节元件。亚克隆载体还可包括选择标记(优选DNA)。
载体:是为插入物提供有用的生物学或生化特性的核酸分子(优选DNA)。例子包括质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒,及能在体外或宿主细胞中复制或被复制、或转运目的核酸区段至宿主细胞中所需位置的其它序列。载体可具有一个或多个限制性内切核酸酶识别位点,在该位点处,序列能以可确定方式切开且不丧失载体的基本生物学功能,并可向其中剪接核酸片段以使其复制和克隆。载体可进一步提供引物位点(例如用于PCR),转录和/或翻译起始和/或调节位点、重组信号、复制子、选择标记等等。显然,不需使用同源重组、转座或限制酶的插入目的核酸片段的方法(例如、但不局限于PCR片段的UDG克隆(美国专利号5,334,575,在此全文引入作为参考)、T:A克隆等等)也可应用于将片段克隆入将按本发明使用的克隆载体。此克隆载体可进一步包含一个或多个选择标记,适用于鉴定转化了该克隆载体转化的细胞。
载体供体:是本发明两亲代核酸分子(如RNA或DNA)之一,它携带含将成为目的产物中一部分的DNA载体的DNA区段。载体供体包含亚克隆载体D(或若插入物体尚不含克隆载体时,它可被称为克隆载体)及侧翼有重组位点的区段C(见图1)。正如上述就选择方案所述,区段C和/或D可包含有助于选择出目的产物子代分子的元件。重组信号可以是相同或不同的,并可通过相同或不同的重组酶起作用。此外,载体供体可以是线性或环状的。
引物:指在核酸分子(如DNA分子)扩增或聚合期间可通过核苷酸单体共价键合延伸的单链或双链寡核苷酸。在优选方面,引物包含一个或多个重组位点或该重组位点的一部分。重组位点的一部分含感兴趣重组位点的至少2个碱基、至少5个碱基、至少10个碱基或至少20个碱基。当使用重组位点的部分时,重组位点的缺失部分可由新合成核酸分子提供。这样的重组位点可以位于引物的一端或两端和/或内部。优选地,附加序列被加入到邻近重组位点的引物上,以增强或提高重组和/或在重组过程中稳定重组位点。这样的稳定序列可以是任何长度的任何序列(优选富含G/C序列)。优选地,这样的序列大小范围是约1-1000个碱基、约1-500个碱基、约1-100个碱基、约1-60个碱基、约1-25个碱基、约1-10个、约2-10个碱基,并优选约4个碱基。优选地,这样的序列长度大于1个碱基并优选长度大于2个碱基。
模板:指将被扩增、合成或测序的双链或单链核酸分子。在双链分子的情况下,优选在这些分子被扩增、合成或测序之前进行链的变性以形成第一和第二链,或可直接用双链分子作模板。对于单链模板,互补于模板一部分的引物在适当条件下杂交,然后具聚合酶活性的一种或多种多肽(如DNA聚合酶和/或逆转录酶)可合成与该模板全部或一部分互补的核酸分子。或者,对于双链模板,可将一个或多个启动子结合一种或多种聚合酶使用,以制备与模板全部或一部分互补的核酸分子。按照本发明,新合成分子可与最初模板长度相等或稍短。此外,在合成或扩增过程中可使用核酸模板群以生产通常代表最初模板群的核酸分子群。
衔接子:是含一个或多个重组位点(或这些重组位点一部分)的寡核苷酸或核酸片段或区段(优选DNA),按本发明可将其加入环状或线性插入物供体分子以及本文所述的其它核酸分子中。当使用重组位点一部分时,缺失部分可由插入物供体分子提供。尽管衔接子优选添加于线性分子的一端或两端处或者附近,但这样的衔接子也可添加于环状或线性分子内的任何位置。优选地,衔接子被置于特殊目的核酸分子两侧(侧翼)。按照本发明,可用标准重组技术(如限制性消化或连接)将衔接子添加入到目的核酸分子上。例如,通过先用适当限制酶消化分子、添加衔接子于切割位点处并再形成于切割位点处含衔接子的环状分子而将衔接子加入环状分子中。或者,可将衔接子直接连接至线性分子的一端或两端,并优选连接至两端,从而产生在一端或两端具衔接子的线性分子。在本发明的一方面,可将衔接子加入线性分子群(如已被切割或消化的cDNA文库或基因组DNA)中,以形成在该群的全部或大部分一端、并优选两端含衔接子的线性分子群。
文库:指核酸分子(环状或线性的)的集合。在一优选实施方案中,基因文库代表生物体DNA组成或其基本部分(“基因组”文库),或为一套代表细胞、组织、器官或生物体表达基因全部或基本部分的核酸分子(cDNA文库)。基因文库还可包含通过从头合成、一个或多个序列诱变等制备的随机序列。这样的基因文库可以包含或不包含于一个或多个载体中。
扩增:指可利用聚合酶增加核苷酸序列拷贝数的任何体外方法。核酸扩增导致核苷酸掺入DNA和/或RNA分子或引物中,从而形成互补于模板的新分子。形成的核酸分子及其模板可用作合成额外核酸分子的模板。如此处所用,扩增反应可由许多轮复制循环组成。DNA扩增反应包括例如聚合酶链式反应(PCR)。一个PCR反应可由5-100个“循环”的DNA分子变性及合成组成。
寡核苷酸:指含共价连接的核苷酸序列的合成或天然分子,各核苷酸通过一核苷酸之脱氧核糖或核糖的3′位置与相邻核苷酸之脱氧核糖或核糖的5′位置之间的磷酸二酯键而连接在一起。
核苷酸:指碱基-糖-磷酸结合体。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的单体单元。术语核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。所说的衍生物包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP。此处所用术语核苷酸还指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及它们的衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的例子包括但不局限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。按照本发明,“核苷酸”可以是未标记的或用众所周知的技术进行了可检测地标记。可检测标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。
杂交:术语“杂交反应”和“杂交”指两互补单链核酸分子(RNA和/或DNA)的碱基配对形成双链分子。如本文所用,尽管碱基配对不是完全互补的,但两个核酸分子可以杂交。因此,本领域众所周知,假若使用恰当的条件,错配碱基不能阻止两核酸分子的杂交。
本文所用的重组DNA技术及分子和细胞生物学领域内的其它术语一般按相应领域内普通技术人员的理解。重组方案
本发明体外或体内方法的一个一般方案如图1所示,其中插入物供体和载体供体可以是环状或线性DNA,但按环状显示。用载体D交换最初的克隆载体B。插入物供体不需包含载体。本发明的方法可使得插入物A转移入许多载体中。按照本发明,可将插入物转移入特殊载体或一步转移入许多载体。此外,可将插入物相继转移入许多载体,例如,通过使用产物DNA分子作为插入物供体与不同载体供体结合可达到这个目的。可将目的核酸分子转移入新载体中,从而产生新产物DNA分子。然后可将新产物DNA分子用作起始物质以转移目的核酸分子到新载体中。这样的相继转移可在许多不同载体中进行多次。因而本发明可用于克隆或亚克隆核酸分子,并由于方便和简单,这些方法特别适用于高流通量应用。按照本发明,希望的是选择出含元件A和D的子代分子而排除掉其它分子,包括一个或多个共合体。方块和圆圈是不同套的重组位点(如lox位点或att位点)。区段A或D可包含用于检测、选择、表达、绘图或测序DNA的至少一个选择标记、表达信号、复制起点、或特化功能,其中D用于此实施方案中。如本文所述,按照本发明,此方案还可反过来进行。然后可将反向反应产生的产物(如插入物供体)与一种或许多载体结合使用,以产生其中许多载体内含插入物的新产物分子。
可作为元件A或D一部分的所需DNA区段例子包括但不局限于PCR产物、大DNA区段、基因组克隆或片段、cDNA克隆或片段、功能元件等,以及编码有用核酸或蛋白质的基因或不完整基因。此外,本发明的重组克隆还可用来制备用于蛋白质表达(天然或融合蛋白质)和/或基因治疗的离体和体内基因转移载体。
图1中,此方案提供了含A和载体D的所需产物,如下所述。首先用重组蛋白质在方块重组位点将插入物供体(含A和B)与载体供体(含C和D)重组,以形成具A-D-C-B的共合体。然后,在圆圈重组位点处发生重组,形成产物DNA(A和D)和副产物DNA(C和B)。然而,若期望,可形成两个或多个不同的共合体以产生两个或多个产物。
在本发明体外或体内重组克隆方法的一个实施方案中,提供了选择至少一种所需产物DNA的方法。参考图2所示质粒pEZC726的图谱可理解这一点。两个作为例证的重组位点是attP和loxP。在由这些位点确定的一个区段上有卡那霉素抗性基因,它的启动子已由来自转座子Tn10的tetOP操纵子/启动子置换。在缺乏tet阻遏物蛋白质时,大肠杆菌RNA聚合酶由tetOP转录卡那霉素抗性基因。如果tet阻遏物存在,它与tetOP结合并阻断卡那霉素抗性基因的转录。pEZC726的另一区段具有由组成型启动子表达的tet阻遏物基因。由于在与tetR相同区段上有氯霉素乙酰转移酶基因,这样由pEZC726转化的细胞是抗氯霉素的,但对卡那霉素敏感。重组反应导致tetR基因与受调节的卡那霉素抗性基因分离开。这一分离导致接受所需重组产物的细胞具有卡那霉素抗性。
为了证实体外方法,构建了两套不同的质粒。只与Cre重组酶一起使用的一套质粒(克隆载体602和亚克隆载体629(图3))含有loxP和loxP511位点。与Cre和整合酶一起使用的第二套质粒(克隆载体705和亚克隆载体726(图2))含有loxP和att位点。用两种酶时得到所需子代质粒的效率比只用Cre的高约60倍。对于只用Cre的反应,24个菌落中有19个含所需产物,而对于整合酶加Cre的反应,38个茵落中38个均含所需产物质粒。
当适于进行重组克隆的特殊目的时,可利用本领域已知的各种各样其它选择方案。依个别偏爱和需要而定,许多不同类型的选择方案可用于本发明的重组克隆或亚克隆方法中。技术熟练人员可充分利用可供使用的许多DNA区段或制备它们的方法以及本领域常规使用的不同选择方法。这样的DNA区段包括但不局限于编码活性的那些DNA,这种活性例如但不局限于RNA、肽或蛋白质的生产,或为该RNA、肽或蛋白质提供结合位点。上文在“选择方案”的定义中给出了用于设计选择方案的DNA分子例子。
另外的例子包括但不局限于:
(ⅰ)用于PCR的新引物位点的产生(例如使事先非并置的两DNA序列并置在一起);
(ⅱ)包括由限制性内切核酸酶或其它DNA修饰酶、化学物质、核酶等作用的DNA序列在内;
(ⅲ)包括DNA结合蛋白质、RNA、DNA、化学物质等所识别的DNA序列在内(例如用作亲和标记以从群体中选择出或排除掉(Davis,核酸研究24:702-706(1996);病毒学杂志69:8027-8034(1995))或为了并置启动子而进行体外转录;
(ⅳ)通过使用随机化的和cDNA衍生的RNA文库体外选择与EB病毒表达RNA相关之核糖体L22蛋白的RNA配基;
(ⅵ)其活性要求特殊取向或并置的功能元件的安置(例如,(a)反式时效果很差的重组位点,当置于顺式状态并有适当蛋白质存在时,能导致破坏某些分子群的重组;(例如,可允许体外RNA合成的启动子序列的重构))。RNA可直接使用,或被逆转录以获得所需DNA构建体;
(ⅶ)通过分子的大小(如分级分离)或其它物理特性选择所需产物;并
(ⅷ)包含可使其鉴定出来的特异修饰(如,甲基化)所要求的DNA序列。
在本发明方法中产物和副产物形成后,可于体外或体内进行选择步骤,这取决于已任选地在特殊重组克隆步骤中设计好了的特殊方案。
例如,可为插入物供体和载体供体分子设计体外选择方法。这样的方案可包括改造起始环状载体内的稀有限制位点,使得重组后稀有切点在副产物中结束。因此,当将结合并切割稀有限制位点的限制酶加入体外反应混合物中时,带有该稀有切点的所有DNA分子,即起始DNA分子、共合体及副产物均被切割,从而在目的宿主细胞内不能复制。例如,区段B和C(见图1)中的切割位点可用于选择去除产物之外的所有分子。或者,如果能选择区段D,例如用B中没有的药物抗性基因,则只有C中的切点是需要的。
类似地,当处理线性DNA分子时可设计体外选择方法。可改造互补于PCR引物序列的DNA序列,使得它们通过重组克隆方法只转移至产物分子。反应完成后,将适当引物加入反应液中并将样品进行PCR。由此扩增全部或部分产物分子。
可与各种各样的宿主细胞,尤其是大肠杆菌细胞系一起使用其它的体内选择方案。一种方案是将阻遏物基因置于亚克隆质粒的一区段上,并将由该阻遏物控制的药物标记置于同一质粒的其它区段上。另一方案是将杀伤基因置于亚克隆质粒的区段C上(图1)。当然必须有培养该质粒的方法,即必须存在杀伤基因不起杀伤作用的环境。有许多需要特殊大肠杆菌菌株的这些已知基因。一种这样的方案是使用限制酶DpnⅠ,它只在识别序列GATC被甲基化时才切割。许多广为人知的通用大肠杆菌菌株可甲基化GATC序列,但存在一些克隆DpnⅠ可被无害表达的突变株。其它的限制酶基因还可作为毒性基因用于选择。在这样的情况下,含相应甲基化酶编码基因的宿主可提供受保护的宿主而用于本发明中。相似地,ccdB蛋白质是DNA回旋酶的强毒性剂,可有效捕获可裂解复合体中的回旋酶分子,导致DNA链断裂和细胞死亡。DNA回旋酶的gyrA亚单元中的突变,特别是gyrA462突变,赋与抗ccdB抗性(Bernard和Couturier,分子生物学杂志(J.Mol.Bio.)226(1992)735-745)。已构建了含gyrA462突变的大肠杆菌菌株DB2。ccdB不杀伤含表达ccdB基因之质粒的DB2细胞。此菌株可获自Life Technologies并已于1997年10月14日保藏于农业研究机构保藏中心(NRRL),1815 NorthUniversity Street,Peoria,IL 61604 USA,保藏号NRRL B-21852。
当然,为其它宿主生物可设计类似选择方案。例如,已改造Tn10的tet阻遏物/操纵子以控制真核生物中的基因表达(Gossen,M.,和Bujard,H.,美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:5547-5551(1992))。因而本文举例说明的用tet阻遏物对药物抗性进行的相同控制或本文所述的其它选择方案可用于选择真核细胞内的产物。重组蛋白质
在本发明中,通过使用重组蛋白质,包括重组酶和相关的辅助因子及蛋白质,可完成DNA区段的交换。本领域中描述了多种重组蛋白质。这些重组酶的例子包括:
Cre:来自噬茵体P1的蛋白质(Abremski和Hoess,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)259(3):1509-1514(1984)),它催化被称为loxP位点(交换位点)的34bp DNA序列之间的交换(即引起重组)(参阅Hoess等人,核酸研究14(5):2287(1986))。Cre可从商业途径得到(Novagen,目录号69247-1)。Cre介导的重组是随意可逆的。从热力学方面考虑,Cre介导的整合(在两分子间重组形成一个分子)比Cre介导的切除(同一分子中两loxP位点之间重组,形成两子代分子)效率低得多,这并不出乎意料。如本领域众所周知,Cre在含镁或亚精胺作为辅因子的简单缓冲液中可起作用。DNA底物可以是线性的或超螺旋的。已描述了许多突变loxP位点(Hoess等人,见上文)。其中之一的loxP511与另一loxP511位点重组,但不与loxP位点重组。
整合酶:来自噬菌体λ的一种蛋白质,可介导λ基因组整合入大肠杆菌染色体。噬菌体λ整合酶重组蛋白质可促进其底物att位点间的重组,这是溶原状态形成或诱导的一部分。重组反应的可逆性在整合和切除重组中以两条独立途径发生。每条途径使用独特但重叠的含att位点DNA的一套15个蛋白质结合位点。涉及4种蛋白质(Int,Xis,IHF和FIS)的协同和竞争相互作用决定了重组的方向。
整合重组涉及Int和IHF蛋白及位点attP(240bp)和attB(25bp)。重组导致形成两新位点:attL和attR。切除重组需要Int、IHF和Xis及位点attL和attR以产生attP和attB。在一定条件下,FIS刺激切除重组。除了这些正常反应之外,应当理解,当置于同一分子上时,attP和attB能促进切除重组产生两种切除产物,一种带attL,一种带attR。类似地,存在Int、IHF和Xis时含attL和attR的分子间的分子间重组可导致整合重组及attP和attB的产生。因而,通过在DNA区段侧翼置入改造的att位点的适当组合,存在恰当重组蛋白质时,可互为逆反应地进行切除或整合重组。
每一att位点含15bp核心序列,功能上比较重要的各序列元件位于此共同核心内、外及跨越其边界(Landy,A.,生化年鉴(Ann.Rev.Biochem.)58:913(1989))。多个att位点间的有效重组要求重组双方间中心共同区的序列相同,然而,现已发现该具体序列是可被修饰的。因而,现在发现核心内有改变的att位点衍生物至少与天然核心序列一样有效地重组。
整合酶可使噬菌体λ上的attP位点(约240bp)与大肠杆菌基因组中的attB位点(约25bp)重组(Weisberg,R.A.和Landy,A.《LambdaⅡ》一书,第211页(1983),冷泉港实验室)),产生侧翼有attL(约100bp)和attR(约160bp)位点的整合λ基因组。在缺乏Xis时(见下文),此反应基本上不可逆。由整合酶和IHF介导的整合反应在含亚精胺的简单缓冲液中可于体外进行。可按Nash,H.A.,酶学方法(Methods ofEnzymology)100:210-216(1983)所述获得整合酶。按Filutowicz,M.,等人,基因147:149-150(1994)中所述可获得IHF。
依据本文提供的教导和指示,还可使用来自多种生物的许多重组系统。参阅如Hoess等人,核酸研究14(6):2287(1986);Abremski等人,生物化学杂志261(1):391(1986);Campbell,细菌学杂志174(23):7495(1992);Qian等人,生物化学杂志267(11):7794(1992);Araki等人,分子生物学杂志225(1):25(1992))。其中的许多属于重组酶的整合酶家族(Argos等人,EMBO J.5:433-440(1986))。也许其中研究得最清楚的是来自噬菌体λ的整合酶/att系统(Landy,A.(1993)遗传学及发育中的最新观点(Current Opinions in Genetics and Devel.)3:699-707)、来自噬菌体P1的Cre/loxP系统(Hoess和Abremski(1990)《核酸和分子生物学》(Nucleic Acids and Molecular Biology),第4卷,Eckstein和Lilley编,Berlin-Heidelberg:Springer-Verlag;第90-109页)、及来自酿酒酵母2μ环状质粒的FLP/FRT系统(Broach等人,细胞29:227-234(1982))。
位点特异性重组酶另一家族--解离酶家族的成员也是已知的(如γ,Tn3解离酶,Hin,Gin和Cin)也是已知的。此重组酶高度相关家族的成员一般局限于分子内反应(如倒置和切除),并可能需要宿主编码的因子。已分离出了对宿主因子的一些要求(Maeser和Kahnmann(1991)分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)230:170-176)及分子内重组的一些约束因素减少的突变体。
相似于λ整合酶及相似于P1 Cre的其它位点特异性重组酶可替代整合酶和Cre。这样的重组酶是已知的。许多情况下本领域中已描述了所说的其它重组酶的纯化。假使它们不是已知的,则可利用就Cre和整合酶所描述的方法使用细胞提取物或部分纯化这些酶。
为举例需要详细描述了Cre和Int,但还有许多相关重组酶系统,按本发明也提供了它们在所述发明中的应用。位点特异性重组酶的整合酶家族可用于为本发明提供可替代的重组蛋白质和重组位点,例如由噬菌体λ、phi80、P22、P2、186、P4和P1编码的位点特异性重组蛋白质。此组蛋白质的序列之间差异极大。尽管存在此多样性,但所有的重组酶可在它们的C端部分对此排布。靠近C末端的40残基区在所有蛋白质中是特别保守的,与酵母2μ质粒Flp蛋白近C末端的区域同源。在此家族内有三个位置非常保守:在高保守C末端区域内相应的排布位置396、399和433处发现有组氨酸、精氨酸和酪氨酸。这些残基参与此家族重组酶的活性位点,提示在链切割和再连接期间酪氨酸433与DNA会形成瞬时共价连接。参阅,如Argos,P.等人,EMBO J.5:433-40(1986)。
一些转座子的重组酶,例如接合转座子(如Tn916)的重组酶(Scott和Churchward,1995,微生物学年鉴(Ann Rev Microbiol)49:367;Taylor和Churchward,1997,细菌学杂志179:1837)属于重组酶的整合酶家族,并在某些情况下显出对特异整合位点的强选择性(Ike等人1992,细菌学杂志174:1801;Trieu-Cuot等人,1993,分子微生物学(Mol.Microbiol)8:179)。
或者,IS231和其它苏云金芽孢杆菌转座因子可用作重组蛋白质和重组位点。苏云金芽孢杆菌是昆虫病原菌,其毒性是由于孢子囊中存在有抗农业害虫及人和动物疾病载体活性的内毒素晶体。编码这些毒性蛋白的大部分基因是质粒产生的,通常在结构上与插入序列(IS231、IS232、IS240、ISBT1和ISBT2)和转座子(Tn4430和Tn5401)有关。数个这样的可移动因子已显示有活性,并参与晶体基因迁移,从而对细菌毒性的变化起一定作用。
iso-IS231因子的结构分析表明它们与产气荚膜梭菌的IS1151有关,与大肠杆菌的IS4和IS186关系较远。象其它的IS4家族成员一样,它们包含其它IS家族和逆转录病毒中存在的保守转座酶-整合酶基元。此外,从大肠杆菌中IS231A收集的有用数据显示了转座的一种非复制方式,对特异目标有优先性。在枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中也获得相似的结果。参阅,如Mahillon,J.等人,Genetica 93:13-26(1994);Campbell,细菌学杂志7495-7499(1992)。
重组酶的非相关家族--转座酶也已用于在复制子之间转移遗传信息。转座子在结构上可变,可以是简单型或复合型,但一般编码侧翼有方向相反地组织的DNA序列的重组酶基因。转座子的整合可以是随机或高度特异的。诸如Tn7之类高度位点特异的代表已应用于在复制子之间有效移动DNA区段(Lucklow等人,1993,病毒学杂志(J.Virol)67:4566-4579)。
相关因子--整合子也转座地促进药物抗性盒从一复制子移入另一复制子。这些因子经常是缺损转座子的衍生物。转座子Tn21含有称为In2的Ⅰ类整合子。来自In2的整合酶(Int Ⅰ1)对此类的所有整合子是普遍的,可介导两个59bp因子间或一个59bp因子与attⅠ位点间的重组,能导致插入受体整合子。整合酶还催化切除重组。Hall,1997,Ciba Found Symp 207:192;Francia等人,1997,细菌学杂志179:4419)。
Ⅱ组内含子是编码催化性RNA及蛋白质的可移动遗传因子。蛋白质成分具有逆转录酶、成熟酶和内切核酸酶活性,而RNA具有内切核酸酶活性并决定内含子将整合的靶位点序列。通过修饰RNA序列部分,可限定因子发生整合的位点。可将外源DNA序列引入内含子末端之间,使得定向于特异位点。称为反寻靶的此过程通过DNA:RNA中间物进行,该中间物被复制成cDNA,最终复制成双链DNA(Matsuura等人,基因及发育(Genes and Dev)1997;Guo等人,EMBO J,1997)。已鉴定了许多内含子编码的寻靶内切核酸酶(Belfort和Roberts,1997,NAR 25:3379)。可容易地采用这样的系统以应用于所述亚克隆方法中。
可以用已知试验确定为驱动重组反应而加入的重组酶量。特别是,可以用滴定试验确定纯化重组酶的适当量或提取物的适当量。改造的重组位点
以上重组酶及相应重组酶位点适于按本发明在重组克隆中使用。然而,当应用于本发明方法中时,野生型重组位点可能包含有会降低重组反应效率或特异性或者产物分子功能的序列。例如,attB、attR、attP、attL和loxP重组位点中在两条链的多种阅读框架内含有多个终止密码子,因而翻译效率降低,如在编码序列必须通过重组位点的情况下即是如此(在loxP和attB位点的每条链上只有一个阅读框架),或者不能进行翻译(在attP、attR或attL内)。
因而,本发明还提供可克服这些问题的改造重组位点。例如,可将att位点改造为具有1个或多个突变,以增强重组反应的特异性或效率及产物DNA的特性(如att1、att2和att3位点);降低逆反应(如从attR中去除P1和H1)。对这些突变体的检测可确定哪些突变体有足够的重组活性,适于按本发明进行重组亚克隆。
因此,为了增强位点特异性重组,可将突变引入重组位点。这样的突变包括但不局限于可使得编码融合蛋白的无翻译终止密码子的重组位点;由相同蛋白质识别但碱基序列不同的重组位点,以使它们大量或广泛地与其同源的对方反应,从而发生多重反应;及阻止重组位点发夹结构形成的突变。由反应混合物中存在的具体重组各方可确定发生哪种特定反应。例如,用含重组位点attR1和attL1;和attB3;attR1;attP3和loxP;和/或attR3与loxP;和/或attR3与attL2的亲代质粒可完成三联蛋白质融合。
将特异突变引入核酸序列有一些众所周知的方法。其中的许多已描述于Ausubel,F.M.等人,分子生物学最新方案(Current Protocols inMolecular Biology),Wiley Interscience,纽约(1989-1996)中。可在寡核苷酸中设计突变,并用于修饰现有的克隆序列或用于扩增反应中。如果有恰当的选择方法可用于分离所需突变型DNA或RNA,则还可应用随机诱变。通过用众所周知的方法将核酸测序可证实所需突变的存在。
以下非限制方法可用于修饰或突变给定重组位点的核心区,以提供可用于本发明的突变位点:
1.用位点特异性(如用attL和attR得到attB)或其它(如同源)重组机制使两亲代DNA序列重组,其中亲代DNA区段含有导致最终突变核心序列的一个或多个碱基改变;
2.直接突变或诱变(位点特异性、PCR、随机、自发等)所需核心序列;
3.诱变亲代DNA序列(位点特异性、PCR、随机、自发等),将它们重组以产生所需核心序列;
4.逆转录编码所需核心序列的RNA;及
5.从头合成(化学合成)具所需碱基改变的序列。
以取决于预期特殊性质的方式可证实突变体重组位点的功能性。例如,通过表达适当融合蛋白可证实重组位点中翻译终止密码子的缺乏。通过将适当分子引入体外反应并如本文所述或按本领域所知分析重组产物,可证实同源各方间重组的特异性。重组位点中的其它所需突变可包括限制位点的存在或缺乏、翻译或转录起始信号、蛋白质结合位点及核酸碱基序列的其它已知功能性。可按已知方法步骤利用在重组位点中有特殊功能作用的遗传选择方案。例如,为(从不相互作用的一对位点)提供确实相互作用的各方而对位点进行修饰可通过对编码毒性物质的DNA序列进行删除或在位点间重组达到。类似地,本领域技术熟练人员可容易地设计选择去除了翻译终止序列的位点、存在或缺乏蛋白质结合位点等等的方案。
因此,本发明提供了含有至少一个DNA区段的核酸分子,该DNA区段具有位于选择标记和/或所需DNA区段侧翼的至少两个改造重组位点,其中至少一个所说重组位点包含具至少一个改造突变的核心区,该突变可促进共整合DNA或产物DNA形成中的体外重组。
虽然在优选实施方案中重组位点序列不同且不相互作用,但应当认识到含相同序列的位点可经加工而抑制相互重组。这方面内容也在本发明范围内。例如,可在这些位点之一附近加上一个蛋白质结合位点。在有识别该位点的蛋白质存在时,重组酶不能进入该位点,因此优先使用其它位点。在共合体中,该位点不再起作用,因为它已被改变,例如从attB改变为attL。在共合体的分离中,可灭活该蛋白质(如通过抗体、加热或改变缓冲液),第二位点可发生重组。
核酸分子可具有赋与该重组至少一种下述增强作用的至少一个突变,该增强作用基本上选自(ⅰ)有利于整合;(ⅱ)有利于重组;(ⅱ)减少对宿主因子的需求;(ⅲ)提高该共合体DNA或产物DNA形成的效率;及(ⅳ)提高该共合体DNA或产物DNA形成的特异性。
核酸分子优选包含衍生自attB、attP、attL或attR的至少一个重组位点,如attR′或attP′。如本文所述,att位点更优选选自att1、att2或att3。
在优选实施方案中,核心区包含选自下组的DNA序列:
(a) RKYCWGCTTTYKTRTACNAASTSGB (m-att) (SEQ ID NO:1);
(b) AGCCWGCTTTYKTRTACNAACTSGB (m-attB) (SEQ IDNO:2);
(c) GTTCAGCTTTCKTRTACNAACTSGB (m-attR) (SEQ IDNO:3);
(d) AGCCWGCTTTCKTRTACNAAGTSGB (m-attL) (SEQ IDNO:4);
(e) GTTCAGCTTTYKTRTACNAAGTSGB(m-attP1) (SEQ IDNO:5);
(f) RBYCW GCTTTYTTRTACWAA STKGD (n-att) (SEQ IDNO:39);
(g) ASCCW GCTTTYTTRTACWAA STKGW (n-attB) (SEQ ID)NO:40);
(h) ASCCW GCTTTYTTRTACWAA GTTGG (n-attL) (SEQ IDNO:41);
(i) GTTCA GCTTTYTTRTACWAA STKGW (n-attR) (SEQ IDNO:42);
(j) GTTCA GCTTTYTTRTACWAA GTTGG (n-attP) (SEQ IDNO:43);或者相应或互补DNA或RNA序列,其中R=A或G;K=G或T/U;Y=C或T/U;W=A或T/U;N=A或C或G或T/U;S=C或G;B=C或G或T/U,如37C.F.R§1.822中所述(该文献在此全部引用作为参考),其中核心区在一个或多个阅读框架中不包含终止密码子。
核心区还优选包含选自下组的DNA序列:
(a) AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT (attB 1) (SEQ ID NO:6);
(b) AGCCTGCTTTCTTGTACAAACTTGT (attB2) (SEQ ID NO:7);
(c) ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT (attB3) (SEQ ID NO:8);
(d) GTTCAGCTTITITGTACAAACTTGT (attR1) (SEQ ID NO:9);
(e) GTTCAGCTTTCTTGTACAAACTTGT (attR2) (SEQ IDNO:10);
(f) GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT (attR3) (SEQ IDNO:11);
(g) AGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGG (attL1) (SEQ IDNO:12);
(h) AGCCTGCTTTCTTGTACAAAGTTGG (attL2) (SEQ IDNO: 13);
(i) ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG (attL3) (SEQ IDNO: 14);
(j) GTTCAGCTTTTTTGTACAAAGTTGG (attP1) (SEQ IDNO: 15);
(k) GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG (attP2,P3) (SEQ ID NO:16);
或者相应或互补DNA或RNA序列。
本发明还提供了用于制备核酸分子的方法,包括提供具至少一个改造重组位点的核酸分子,该重组位点含有与至少上述序列之一具至少80-99%同源性(或其中任何范围或值)的至少一个DNA序列,或任何适合的重组位点,或在本领域所知的严谨条件下可与其杂交的序列。
显然,这种众所周知的体外和体内选择方法有多种类型和可替换方式,为了简洁的缘故,本文不对它们逐一描述。然而,这样的变化和替换方式也包括在内,视为本发明不同的实施方案。
尤为重要的是,作为体外重组反应优选实施方案的结果,通过本重组克隆方法可加工PCR产物之类非生物分子。在一个实施例中,可以将线性分子克隆入环状载体中。
本发明有许多应用。这些用途包括但不局限于改变载体、安置启动子和基因、构建融合蛋白的基因、改变拷贝数、改变复制子、克隆入噬菌体,及克隆如PCR产物(在一端带attB位点,另一端带loxP位点)、基因组DNA和cDNA。载体供体
按照本发明,任何载体可用于构建本发明的载体供体。尤其是,可按本发明将本领域已知载体和那些可购得的载体(及其变体或衍生物)改造成包括可用于本发明方法中的一个或多个重组位点。这样的载体可获处例如 Vector Laboratories Inc.,InVitrogen,Promega,Novagen,NEB,Clontech,Boehringer Mannheim,Pharmacia,EpiCenter,OriGenes Technologies Inc.,Stratagene,Perkin Elmer,Pharmingen,Life Technologies Inc. 及 Research Genetics。 这样的载体可用于例如克隆或亚克隆目的核酸分子。特殊目的载体的通常种类包括原核和/或真核克隆载体、表达载体、融合载体、双杂交或反向双杂交载体、用于不同宿主的穿梭载体、诱变载体、转录载体、用于接收大插入物的载体等等。
其它的感兴趣载体包括病毒起源载体(M13载体、噬茵体λ载体、腺病毒载体及逆转录病毒载体),高、低和可调节拷贝数载体,具有相容性复制子、可联合用于单个宿主的载体(pACYC184和pBR322)以及真核游离型复制载体(pCDM8)。
感兴趣的特殊载体包括原核表达载体,例如:
pcDNAII,pSL301,pSE280,pSE380,pSE420,pTrcHisA,B,C,pRSETA,B,C (Invitrogen,Inc.),pGEMEX-1,pGEMEX-2(Promega,Inc.),the pET vectors (Novagen,Inc.),pTrc99A,pKK223-3,the pGEX vectors,pEZZ18,pRIT2T,pMC1871 (Pharmacia,Inc.),pKK233-2 pKK388-1(Clontech,Inc.),和 pProEx-HT (Life Technologies,Inc.)及其变体和衍生物。载体供体还可由真核表达载体制备,
例如: pFastBac,pFastBac HT,pFastBacDUAL,pSFV,pTet-Splice(Life Technologies,Inc.),pEUK-Cl,pPUR,pMAM,pMAMneo,pBI101,pBI121,pDR2,pCMVEBNA,pYACneo (Clontech),pSVK3,pSVL,pMSG,pCH110,pKK232-8 (Pharmacia,Inc.),p3’SS,pXT1,pSG5,pPbac,pMbac,pMC1neo,pOG44 (Stratagene,Inc.),pYES2,pAC360,pBlueBacHis A,B.C, pVL1392,pBsueBacIII,pCDM8,peDNA1,pZeoSV,pcDNA3 pREP4,pCEP4,pEBVHis (Invitrogen,Inc.) 及其变体或衍生物。
特别感兴趣的其它载体包括pUC18,pUC19,pBlueScript,Psport,粘粒,噬菌粒,YAC(酵母人工染色体),BAC(细菌人工染色体),P1(大肠杆菌噬菌体),pQE70,pQE60,pQE9(quagan),pBS载体,PhageScript载体,BlueScript载体,pNH8A,pNH16A,pNH18A,pNH46A (Stratagene),pcDNA3 (InVitrogen),pGEX,pTrsfus,pTrc99A,pET-5,pET-9,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5(Pharmacia),pSPORT1,pSPORT2,pCMVSPORT2.0 pSV-SPORT1 (LifeTechnologies,Inc.) 及其变体或衍生物。
感兴趣的其它载体包括: pTrxFus,pThioHis,pLEX,pTrcHis,pTrcHis2,pRSET,pBlueBacHis2,pcDNA3.1/His,pcDNA3.1(-)/Myc-His,pSecTag,pEBVHis,pPIC9K,pPIC3.5K,pAO815,pPICZ,pPICZα,pGAPZ,pGAPZα,pBlueBac4.5,pBlueBacHis2,pMelBac,pSinRep5,pSinHis,pIND,pIND(SP1),pVgRXR,pcDNA2.1.pYES2,pZErO1.1,pZErO-2.1,pCR-Blunt,pSE280,pSE380,pSE420,pVL1392,pVL1393,pCDM8,pcDNA1.1,pcDNA1.1/Amp,pcDNA3.1,pcDNA3.1/Zeo,pSe,SV2,pRc/CMV2,pRc/RSV,pREP4,pREP7,pREP8,pREP9,pREP10,pCEP4,pEBVHis,pCR3.1,pCR2.1,pCR3.1-Uni, 和 pCRBac (Invitrogen);λExCell,λgtll,pTrc99A,pKK223-3,pGEX-1λT,pGEX-2T,pGEX-2TK,pGEX-4T-1,pGEX-4T-2,pGEX4T-3,pGEX-3X,pGEX-5X.-1,pGEX-5X-2,pGEX-5X-3,pEZZ18,pRIT2T,pMC1871,pSVK3,pSVL,pMSG,pCH110,pKK232-B,pSL1180,pNEO,和 pUC4K(Pharmacia);pSCREEN-1b(+),pT7Blue(R),pT7Blue-2,pCITE-4abc(+),pOCUS-2,pTAg,pET-32 LIC,pET-30 LIC,pBAC-2cp LIC,pBACgus-2cp LIC,pT7Blue-2 LIC,pT7Blue-2,λSCREEN-1,λBlueSTAR,pET-3abcd,pET-7abc,pET9abcd,pET11abed,pET12abc,pET-14b,pET-15b,pET-16b,pET-17b-pET-17xb,pET-19b,pET-20b(+),pET-21abcd(+),pET-22b(+),pET-23abcd(+),pET-24abcd(+),pET-25b(+),pET-26b(+),pET-27b(+),pET-28abc(+),pET-29abc(+),pET-30abc(+),pET-31b(+),pET-32abc(+),pET-33b(+),pBAC-1,pBACgus-1,pBAC4x-1,pBACgus4x-1,pBAC-3cp,pBACgus-2cp,pBACsuff-1,plg,Signal plg,pYX,Selecta Vecta-Neo,Selecta Vecta-Hyg,和 Selecta Vecta-Gpt (Novagen);pLexA,pB42AD,pGBT9,pAS2-1,pGAD424,pACT2,pGAD GL,pGAD GH,pGAD10,pGilda,pEZM3,pEGFP,pEGFP-1,pEGFP-N,pEGFP-C,pEBFP,pGFPuv,pGFP,p6xHis-GFP,pSEAP2-Basic,pSEAP2-Contral,pSEAP2-Promoter,pSEAP2-Enhancer,pβgal-Basic,pβgal-Control,pβgal-Promoter,pβgal-Enhancer,pCMVβ,pTet-Off,pTet-On,pTK-Hyg,pRetro-Off,pRetro-On,pIRESlneo,pIRESlhyg,pLXSN,pLNCX,pLAPSN,pMAMneo,pMAMneo-CAT,pMAMneo-LUC,pPUR,pSV2neo,pYEX4T-1/2/3,pYEX-S1,pBacPAK-His,pBacPAK8/9,pAcUW31,BacPAK6,pTriplEx,λgt10,λgt11,pWE15,和λTriplEx (Clontech);Lambda ZAPⅡ,pBK-CMV,pBK-RSV,pBluescriptⅡKS +/-,pBlueseriptⅡSK+/-,pAD-GAL4,pBD-GAL4 Cam,pSurfscript,Lambda FIXⅡ,Lambda DASH,Lambda EMBL3,Lambda EMBL4,SuperCos,pCR-Scrigt Amp,pCR-Script Cam,pCR-ScriptDirect,pBS +/-,pBC KS +/-,pBC SK +/-,Phagescript,pCAL-n-EK,pCAL-n,pCAL-c,pCAL-kc,pET-3abcd,pET-llabcd,pSPUTK,pESP-1,pCMVLacⅠ,pOPRSVI/MCS,pOPI3 CAT,pXT1,pSG5,pPbac,pMbac,pMClneo,pMClneoPolyA,pOG44,pOG45,pFRTβGAL,pNEOβGAL,pRS403,pRS404,pRS405,pRS406,pRS413,pRS414,pRS415,和pRS416(Stratagene).
特别引人注意的双杂交和反向双杂交载体包括:pPC86,pDBLeu,pDBTrp,pPC97,p2.5,pGAD1-3,pGAD10,pACt, pACT2,pGADGL,pGADGH,pAS2-1,pGAD424,pGBT8,pGBT9,pGAD-GAL4,pLexA,pBD-GAL4,pHISi,pHISi-1,placZi,pB42AD,pDG202,pJK202,pJG4-5, pNLcxA, pYESTrp 及其变体或衍生物。聚合酶
具有逆转录酶活性的优选多肽(即能催化从RNA模板合成DNA分子的那些多肽)包括但不局限于莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MLV)逆转录酶、劳氏肉瘤病毒(RSV)逆转录酶、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、劳氏相关病毒(RAV)逆转录酶、成髓细胞瘤相关病毒(MAV)逆转录酶、人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶、逆转录病毒逆转录酶、逆转座子逆转录酶、乙肝病毒逆转录酶、花椰菜花叶病毒逆转录酶和细菌逆转录酶。特别优选的是那些具逆转录酶活性、而RNase H活性实质性降低了的多肽(即“RNase H”多肽)。“RNase H活性实质性降低”的多肽表示该多肽的RNase H活性是诸如野生型M-MLV逆转录酶之类野生型或RNaseH+酶的RNase H活性的约20%以下,更优选约15%、10%或5%以下,最优选约2%以下。可用各种各样的试验测定RNase H活性,例如以下文献美国专利号5,244,797,Kotewicz,M.L.等人,核酸研究16:265(1988)及Gerard,G.F.,等人,焦点(FOCUS)14(5):91(1992)中所述的试验,这些文献的公开内容均在此全文引入作为参考。可用于本发明的合适RNase H-多肽包括但不局限于M-MLV H-逆转录酶、RSV H-逆转录酶、AMV H-逆转录酶、RAV H-逆转录酶、MAY H-逆转录酶、HIV H+逆转录酶及可购自例如Life Technologies,Inc.(Rockville,Maryland)的SUPERSCRIPTTM Ⅰ逆转录酶和SUPERSCRIPTTMⅡ逆转录酶。
具有适用于本发明之核酸聚合酶活性的其它多肽包括嗜热DNA聚合酶,例如DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅲ、Klenow片段、T7聚合酶及T5聚合酶,和耐热DNA聚合酶,包括但不局限于嗜热栖热菌(Thermusthermophilus,Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus aquaticus,Taq)DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana,Tne)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima,Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis(Tli或VENT_)DNA聚合酶、激烈热球菌(Pyrococcus furiosu,Pfu或DEEPVENT_)DNA聚合酶、沃氏热球菌(Pyrococcus woosii,Pwo)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillussterothermophilus,Bst)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius,Sac)DNA聚合酶、嗜酸热原菌(Thermoplasmaacidophilum,Tac)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus,Tfl/Tub)DNA聚合酶、红栖热菌(Thermus ruber,Tru)DNA聚合酶、Thermusbrockianus(DYNAZYME_)DNA聚合酶、热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum,Mth)DNA聚合酶,及其突变体、变体和衍生物。
相关领域内的普通技术人员应能理解,本文所述方法和应用的合适修饰和改变是很显而易见的,可不脱离本发明范围或其任何实施方案地进行。现已详述本发明,通过参考以下实施例将对其有更清晰的理解,所附实施例只为了说明的目的,并非旨在限制本发明。
实施例
本重组克隆方法可达到核酸区段的交换,得到对使用者有用的东西,例如克隆载体的改变。这些区段必须在两侧有相互为正确取向的重组信号。在以下实施例中,两亲代核酸分子(如质粒)被称为插入物供体和载体供体。插入物供体包含将与载体供体提供的新载体连接的区段。含两始发分子的重组中间体被称为共合体。第二次重组产生两子代分子,称产物(所需新克隆)和副产物。缓冲液
有多种已知缓冲液可用于本发明的反应中。对于限制酶,建议使用制造商推荐的缓冲液。一些可替代的缓冲液可容易地在文献中找到或可由本领域普通技术人员设计。
实施例1-3。用于λ整合酶的一种示范缓冲液包含50mM Tris-HCl(pH7.5-7.8),70mM KCl,5mM亚精胺,0.5mM EDTA,和0.25mg/ml牛血清白蛋白,及任选的10%甘油。
用于P1 Cre重组酶的一种优选缓冲液含50mM Tris-HCl(pH7.5),33mM NaCl,5mM亚精胺,及0.5mg/ml牛血清白蛋白。
用于类似于λ整合酶和P1 Cre的其它位点特异性重组酶的缓冲液是本领域已知的,或可由技术熟练人员凭经验确定,尤其是可参照上述缓冲液确定。实施例1:用Cre和Cre & Int进行重组克隆
为了以两种不同方式进行体外重组克隆,构建了两对质粒。用loxP和att位点构建的一对质粒pEZC705和pEZC726(图2A)与Cre和λ整合酶一起使用。另一对质粒pEZC602和pEZC629(图3A)含用于Cre的loxP(野生型)位点,及第二个突变型lox位点loxP511,它与loxP有一个碱基不同(共34个碱基中)。对本发明重组克隆的最小要求是每一质粒中有两重组位点,一般是X和Y,及X′和Y′。如果两类位点或任一类位点可重组形成共合体(如X和X′),并且两类位点或任一类位点可重组而从共合体中切出产物和副产物质粒(如Y和Y′),则发生重组克隆。同一质粒上的重组位点不重组,这一点是重要的。已发现可只用Cre进行本重组克隆。只用Cre
构建两质粒以证实这一观点(见图3A)。pEZC629是载体供体质粒。它包含组成型药物标记(氯霉素抗性)、复制起点、loxP和loxP511位点、条件性药物标记(表达受转座子Tn10之四环素抗性操纵子的操纵基因/启动子控制的卡那霉素抗性)、及编码tet阻遏物蛋白质的组成型表达基因tetR。含pEZC629的大肠杆菌细胞抗30μg/ml的氯霉素,但对100μg/ml的卡那霉素敏感。pEZC602是插入物供体质粒,含不同的药物标记(氨苄青霉素抗性)、起点及位于多克隆位点侧翼的loxP和loxP511位点。
此实验包含以下两部分:
第一部分:将pEZC602和pEZC629各约75ng混合于总体积30μl的Cre缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5,33mM NaCl,5mM亚精胺-HCl,500μg/ml牛血清白蛋白)中。将两10μl等份试样转移入新管中。一管中加入0.5μl Cre蛋白质(约4个单位/μl;按Abremski和Hoess,生物化学杂志259:1509(1984)部分纯化)。两管均于37℃温育30分钟,然后70℃10分钟。稀释每一反应的等份试样并将其转化入DH5α。表达后,将等分试样铺于30μg/ml氯霉素;100μg/ml氨苄青霉素加200μg/ml二甲氧基苯青霉素;或100μg/ml卡那霉素的板上。结果:见表1。无Cre的反应物得到1.11×106个氨苄青霉素抗性菌落(来自插入物供体质粒pEZC602);7.8×105个氯霉素抗性菌落(来自载体供体质粒pEZC629);及140个卡那霉素抗性茵落(背景)。加入Cre的反应物得到7.5×105个氨苄青霉素抗性菌落(来自插入物供体质粒pEZC602);6.1×105个氯霉素抗性菌落(来自载体供体质粒pEZC629);及760个卡那霉素抗性菌落(背景菌落和来自重组克隆产物质粒的菌落的混合物)。分析:因为存在Cre时卡那霉素平板上的菌落数高得多,预计它们中的许多或绝大多数含所需产物质粒。
第二部分:从“+Cre”卡那霉素平板上挑出24个菌落,接种于含100μg/ml卡那霉素的培养基中。进行小量制备,并将用SmaⅠ或HindⅢ切割或未切割的小量制备DNA进行电泳。结果:24个小量制备物中有19个显示有产物质粒预计大小的超螺旋质粒。所有的19个均显示有预计的Sma Ⅰ和HindⅢ限制片段。分析:这证实了只有Cre的方案。具体地说,测出得到约70%(24个中有19个)的产物克隆。效率约为0.1%(从6.1×105个氯霉素抗性茵落得到760个卡那霉素抗性克隆)。Cre加整合酶
表1 | ||||
酶 | 氨苄青霉素 | 氯霉素 | 卡那霉素 | 效率 |
无酶 | 1.1×106 | 7.8×105 | 140 | 140/7.8×105=0.02% |
Cre | 7.5×105 | 6.1×105 | 760 | 760/6.1×105=0.12% |
用于证明此方法的质粒与上文所用质粒基本上类似,只是载体供体质粒pEZC726不含loxP511,而代之以attP位点插入物供体质粒pEZC705不含loxP511,而代之以attB位点(图2A)。
此实验包括以下三部分:
第一部分:用Sca Ⅰ切约500ng的pEZC705(插入物供体质粒),在氨苄青霉素抗性基因内将质粒线性化。(这样做是因为过去已用线性状态的attB质粒进行了λ整合酶反应(H.Nash,私人通信)。可是,后来发现两种质粒均是超螺旋时也可很好地进行整合酶反应。)然后,将线性质粒乙醇沉淀并溶于20μlλ整合酶缓冲液(50mM Tris-HCl(约pH7.8),70mM KCl,5mM亚精胺-HCl,0.5mM EDTA,250μg/ml牛血清白蛋白)中。此外,将约500ng载体供体质粒pEZC726乙醇沉淀并溶于20μlλ整合酶缓冲液中。临用前,将λ整合酶(2μl,393μg/ml)解冻并通过加入18μl冷λ整合酶缓冲液进行稀释。将1μl IHF(整合宿主因子,2.4mg/ml,一种辅助蛋白质)稀释到150μl冷λ整合酶缓冲液中。将各DNA等分试样(2μl)与含或不合λ整合酶和IHF各1μl的λ整合酶缓冲液混合,总体积10μl。将混合物于25℃温育45分钟,然后70℃10分钟。将每种反应液的一半加到琼脂糖凝胶上。结果:存在整合酶和IHF时,约5%的总DNA转变成线性共合体形式。分析:整合酶和IHF的活性得到证实。
第二部分:将每种反应液(即含或不含整合酶和IHF)3μl稀释剂27μl Cre缓冲液(上述)中,然后将各反应液分成两个10μl的等分试样(共4份)。往这些反应液的两份中加0.5μl Cre蛋白质(上述),并将所有反应液于37℃温育30分钟,然后70℃10分钟。往每份反应液中加TE缓冲液(90μl;TE:10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA),并用各1μl转化大肠杆茵DH5α。将转化混合物铺于含100μg/ml氨苄青霉素加200μg/ml二甲氧基苯青霉素;30μg/ml氯霉素;或100μg/ml卡那霉素的平板上。结果:见表2。
表2 | ||||
酶 | 氨苄青霉素 | 氯霉素 | 卡那霉素 | 效率 |
无酶 | 990 | 20000 | 4 | 4/2×104=0.02% |
只用Cre | 280 | 3640 | 0 | 0 |
只用整合酶* | 1040 | 27000 | 9 | 9/2.7×104=0.03% |
整合酶*+Cre | 110 | 1110 | 76 | 76/1.1×103=6.9% |
*整合酶反应液还包含IHF
分析:Cre蛋白质削弱了转化作用。当校正这种效果时,与对照反应相比,使用Cre和整合酶时,卡那霉素抗性茵落数目增加超过100倍。这显示特异性大于99%。
第三部分:从整合酶加Cre平板上挑出38个菌落,小量制备DNA,并用HindⅢ酶切以得到诊断作图信息。结果:所有38个菌落均具有预期片段大小。分析:观察到与只用Cre相比,Cre加λ整合酶的方法具有高得多的特异性。结论:Cre加λ整合酶的方法得到证实。其效率和特异性比只用Cre时高得多。实施例2:用体外重组克隆法将氯霉素乙酰转移酶基因亚克隆入用于真
核细胞表达的载体(图4A)
构建插入物供体质粒pEZC843,其中含有克隆于loxP和attB位点之间的大肠杆菌氯霉素乙酰转移酶基因,使得loxP位点置于该基因的5′端(图4B)。构建载体供体质粒pEZC1003,它包含与loxP位点并置的巨细胞病毒真核启动子(图4C)。在10μl反应液中混合1μl等分试样各超螺旋质粒(约50ng小量制备粗DNA),该反应液含等份λ整合酶缓冲液(50mM Tris-HCl,pH7.8,70mM KCl,5mM亚精胺,0.5mM EDTA,0.25mg/ml牛血清白蛋白)和Cre重组酶缓冲液(50mM,Tris-HCl,pH7.5,33mM NaCl,5mM亚精胺,0.5mg/ml牛血清白蛋白),2个单位Cre重组酶,16ng整合宿主因子及32ngλ整合酶。30℃温育30分钟再75℃温育10分钟后,用1μl转化感受态大肠杆菌DH5α(Life Teehnologies,Inc)。将转化反应等分试样铺于含200μg/ml卡那霉素的琼脂平板上,37℃温育过夜。另一几乎相同的对照反应只含载体供体质粒。接受10%对照反应转化液的平板长出一个菌落;接受10%重组克隆反应液的平板长出144个菌落。这些数字表明超过99%的重组克隆菌落含所需产物质粒。6个重组克隆菌落的小量制备DNA有预期大小质粒(5026个碱基对)--CMVProd。对所有6个质粒用NcoⅠ进行限制消化,均有预计克隆于CMV启动子下游的氯霉素乙酰转移酶片段。实施例3:侧翼为无终止密码子的attB位点的亚克隆DNA区段第一部分:背景
以上实施例适于转录融合,其中转录贯穿重组位点进行。然而,attR和loxP位点二者在两条链上均包含多个终止密码子,因此当编码序列必须跨越重组位点时,翻译融合就很困难(在loxP位点的每条链上均只有一个阅读框架可利用)或是不可能的(在attR或attL中)。
亚克隆的主要原因是为了融合蛋白质结构域。例如,谷胱甘肽S-转移酶(GST)结构域与目的蛋白质融合可使得该蛋白质能通过在谷胱甘肽琼脂糖(Pharmacia,Inc.,1995目录)上亲和层析而进行纯化。如果将目的蛋白质与连续组氨酸产品(例如His6)融合,则可以在含金属离子的螯合树脂(Qiagen,Inc.)上通过亲和层析纯化该融合蛋白质。经常期望比较氨基端和羧基端融合的活性、溶解度、稳定性等等。
检查噬菌体λ整合系统的attB位点能否作为loxP位点的替换物,因为它们较小(25bp),且具有一些序列灵活性(Nash,H.A.等人,美国国家科学院院报84:4049-4053(1987))。以前并未指出进行多重突变除去所有终止密码子可得到适用于重组亚克隆的重组位点。
利用λ噬菌体位点特异性重组中的标准命名法(Weisber,《LamdaⅢ》,Hendrix等人编辑,冷泉港实验室,冷泉港,纽约(1989)),可将参与大肠杆菌宿主细胞中重组反应的核苷酸区域表示如下:其中:O代表在噬菌体和大肠杆菌基因组中均发现有的15bp核心DNA序列;B和B′代表与大肠杆菌基因组核心邻近的约5个碱基;P1、H1、P2、X、H2、C、C′、H′、P′1、P′2和P′3代表噬菌体λ基因组内编码蛋白质结合结构域的已知DNA序列。
存在蛋白质Xis(切除酶)时反应是可逆的;在attL和attR之间的重组准确地从其整合状态中切除λ基因组,再生出含attP的环状λ基因组和含attB的线性大肠杆菌基因组。第二部分:构建和检验含突变型att位点的质粒
构建突变型attL和attR位点。重要的是,Landy等人(生化年鉴58:913(1989))观察到attP的P1和H1结构域缺失可促进切除反应并消除整合反应,从而使切除反应不可逆地进行。因此,当在attR中引入突变时,还删除掉P1和H1结构域。本实施例中attR′位点无P1和H1区,并除去了NdeⅠ位点(碱基27630从C改变成G),它包含相当于噬菌体λ同等序列27619-27738的序列(Gen Bank release 92.0,bg:LAMCG,“噬菌体λ的完整序列”)。
野生型attL和attR位点重组产生的attB序列是:
B O B′attBwt: 5 ′AGCCT GCTTTTTTATACTAA CTTGA 3 ′ (SEQ.IDNO:60)3 ′TCGGA CGAAAAAATATGATT GAACT 5 ′ (SEQ.IDNO:44)
终止密码子为斜体字并用下划线标出。注意attL、attR和attP的序列可来自attB序列及attL和attR中所含的λ噬菌体边界(同等序列27619-27818)。
当突变型attR1-(attR′)和attL1位点重组时,产生序列attB1(突变用粗体、大铅字表示):
B O B′attB1: 5 ′AGCCT GCTTTTTTGTACAAA CTTGT3′ (SEQ.IDNO:6)3′ TCGGA CGAAAAAACATGTTT GAACA5′ (SEQ.IDNO:45)注意4个终止密码子已去除。
当将附加突变引入attR1(attR′)和attL1序列(粗体)中时,产生attR2(attR′)和attL2位点。attR2和attL2重组产生attB2位点:
B O B′attB2: 5′ AGCCT GCTTTCTTGTACAAA CTTGT 3′ (SEQ.IDNO: 7)3 ′TCGGA CGAAAGAACATGTTT GAACA 5 ′ (SEQ.IDNO:46)
上述attL和attR’位点的重组活性鉴定如下。用attLwt、attL1或attL2替代质粒pEZC705(图2B)的attB位点。用attRwt、attR1(attR’,缺乏P1和H1区)或attR2(attR’,缺乏P1和H1区)置换质粒pEZC726(图2C)的attP位点。因此,所得质粒可由Cre介导通过它们的loxP位点重组,由Int、Xis和IHF介导通过它们的attR′和attL位点重组。混合各对质粒,并与Cre、Int、Xis和IHF反应,转化入大肠杆菌感受态细胞中,并铺于含卡那霉素的琼脂上。结果如表3所示:
表3
载体供体att位点 | 基因供体att位点 | 卡那霉素抗性菌落数* |
attR′wt(pEZC1301)"""attR′1(pEZC1305)"""attR′2(pEZC1309)""" | 无attLwt(pEZC1313)attL1(pEZC1317)attL2(pEZC1321)无attLwt(pEZC1313)attL1(pEZC1317)attL2(pEZC1321)无attLwt(pEZC1313)attL1(pEZC1317)attL2(pEZC1321) | 1(背景)1474701(背景)412800(背景)00209 |
(*各转化物的1%铺于卡那霉素平板上)
以上数据显示虽然野生型att和att1位点重组程度较小,而att1和att2位点相互间的重组水平检测不到。第三部分:当目的DNA区段侧翼的两attB位点之核心区不含终止密码子时,证实有重组。已发现参加质粒的物理状态影响重组效率。
将适当的att位点移入pEZC705和pEZC726以制备质粒pEZC1405(图5G)(attR′1和attR′2)和pEZC1502(图5H)(attL1和attL2)。此实验中的所需DNA区段是克隆于pEZC1502两attL位点之间的一拷贝氯霉素抗性基因。用Int、Xis和IHF(不用Cre,因为不存在loxP位点)体外重组质粒对。每种质粒各100ng温育于10μl反应液中,该反应液含50mM Tris HCl pH约7.8,16.5mM NaCl,35mM KCl,5mM亚精胺,0.25mM EDTA,0.375mg/ml BSA,3%甘油,还包含有8.1ng IHF、43ng Int、4.3ng Xis和2个单位Cre。反应液25℃温育45分钟,65℃10分钟,将1μl等分试样转化入DH5α细胞,并铺于卡那霉素平板上。测定了两亲代质粒均为环状或一质粒环状另一线性时所需卡那霉素抗性菌落的得率,如表4所示:
表4
载体供体1 | 插入物供体1 | 卡那霉素抗性菌落2 |
环状pEZC1405环状pEZC1405线性pEZC1405线性pEZC1405环状pEZC1405 | 无环状pEZC1502无环状pEZC1502线性pEZC1502 | 3026809017200073000 |
1用Qiagen柱纯化DNA,以A260测浓度,用XbaⅠ(pEZC1405)或AlwN Ⅰ(pEZC1502)线性化。每反应液含100ng所示DNA。所有的反应液(共10μl)含3μl酶混合物(Xis,Int,和IHF)。温育后(25℃45分钟,65℃10分钟),将1μl用于转化大肠杆菌DH5α细胞。
2整个转化反应液(1ml)铺于平板上时预计产生的菌落数。实际上用100μl或1μl转化液铺板。
分析:使用突变型attR和attL位点进行重组克隆已证实。将所需DNA区段亚克隆于任一条链上均不含任何终止密码子的attB位点之间。产物DNA(当一亲代是线性时)得率的增加是未预料到的,因为更早的时候观察到当两参加分子均为超螺旋且蛋白质有限时,切除反应更有效(Nunes-Duby等人,细胞50:779-788(1987)。实施例4:无反向重复序列之重组克隆的证明第一部分:基本原理
以上实施例3显示含恰当重组位点(例如,在质粒pEZC1502中的attL1和attL2)(图5H)反向重复序列的质粒可重组以产生侧翼有无终止密码子、且取向相反的attB位点的所需DNA区段。所研究的是反向重复序列的体内和体外影响。例如,侧翼有相反取向之attB位点的所需DNA区段的转录可产生可能形成发夹结构从而抑制翻译的单链RNA分子。
通过将位点置于正向重复排列形式,可避免相似重组位点的相反取向。如果每个亲代质粒均具有正向重复的野生型attL和野生型attR位点,Int、Xis和IHF蛋白质将简单的在分子内反应中去除侧翼有那些位点的DNA区段。然而,以上实施例3中所述突变位点表明抑制分子内反应而使分子间重组按预计进行是可能的。第二部分:用于重组克隆之无反向重复序列的质粒结构
用相反取向的attL2置换质粒pEZC1405(图5G)中的attR2序列以制备pEZC1603(图6A)。用相反取向的attR2置换pEZC1502(图5H)的attL2序列以制备pEZC1706(图6B)。这些质粒中的每一个在核心区内含突变,使att1和att2核心间的分子内反应非常低效(见实施例3,上文)。
在Qiagen柱(Qiagen,Inc.)上纯化质粒pEZC1405、pEZC1502、pEZC1603和pEZC1706。用XbaⅠ将质粒pEZC1405和pEZC1603样品线性化。用AlwNI将质粒pEZC 1502和pEZC1706样品线性化。将100ng质粒混合入含Int(43.5ng)、Xis(4.3ng)和IHF(8.1ng)、终体积10μl的缓冲液(50mM Tris HCl pH约7.8,16.5mM NaCl,35mM KCl,5mM亚精胺,0.25mM EDTA,0.375mg/ml BSA,3%甘油)中。反应液25℃温育45分钟,65℃10分钟,用1μl转化大肠杆菌DH5α。表达后,将等分试样铺于含200μg/ml卡那霉素的琼脂平板上并于37℃温育。
结果用菌落数/μl重组反应液表示,如表5所示:
表5
载体供体 | 基因供体 | 菌落 | 预计产物% |
环状1405 | … | 100 | … |
环状1405 | 环状1502 | 3740 | 3640/3740=97% |
线性1405 | … | 90 | … |
线性1405 | 环状1502 | 172,000 | 171,910/172,000=99.9% |
环状1405 | 线性1502 | 73,000 | 72,900/73,000=99.9% |
环状1603 | … | 80 | … |
环状1603 | 环状1706 | 410 | 330/410=80% |
线性1603 | … | 270 | … |
线性1603 | 环状1706 | 7000 | 6730/7000=96% |
环状1603 | 线性1706 | 10,800 | 10,530/10,800=97% |
分析:在所有的构型,即环状或线性中,pEZC1405×pEZC1502对(att位点为反向重复构型)比pEZC1603×pEZC1706对(att位点突变以避免发夹形成)更有效。pEZC1603×pEZC1706对比pEZC1405×pEZC1502对背景更高,效率更低。尽管效率较低,但预计从pEZC1603×pEZC1706反应液得到的80%或更多菌落含所需质粒产物。在所有情况下,将其中一个成员线性化激发了反应。第三部分:产物质粒结构的证实
将来自线性pEZC1405(图5G)×环状pEZC1502(图5H)、环状pEZC1405×线性pEZC1502、线性pEZC1603(图6A)×环状pEZC1706(图6B)和环状pEZC1603×线性pEZC1706反应液各6个菌落分别挑出并接种于丰富培养基中,小量制备DNA。用SspⅠ进行诊断性酶切,产生了所有24个菌落的预计限制片段。
分析:同一分子上带突变型attL和attR位点的质粒间的重组反应以高度特异性得到所需质粒产物。实施例5:用毒性基因进行重组克隆第一部分:背景
只有在A被dam甲基化酶甲基化的情况下,限制酶DpnⅠ才识别序列GATC并切开该序列。最通常使用的大肠杆菌菌株是dam+。大肠杆菌dam+菌株内DpnⅠ的表达是致死的,因为细胞染色体被切成许多小段。然而,在dam-细胞中DpnⅠ的表达是无害的,因为染色体不被DpnⅠ酶切。
在通常的重组克隆方案中,载体供体含由重组位点分隔的两区段C和D,此时所需产物的选择取决于对存在区段D并缺乏区段C进行选择。在最初的实施例中,区段D含有由区段C上存在阻遏物基因负调控的药物抗性基因(Km)。当C存在时,含D的细胞不能抗卡那霉素,因为抗性基因被关闭了。
DpnⅠ基因是可替代上文实施方案中的阻遏物基因的毒性基因例子。如果区段C表达DpnⅠ基因产物,则转化质粒CD到dam+宿主中将杀死该细胞。如果将区段D转移入新质粒,例如通过重组克隆,则随后的药物标记选择将是成功的,因为毒性基因不再存在。第二部分:用DpnⅠ作为毒性基因构建载体供体利用引物5′ CCA CCA CAA ACG CGT CCA TGG AAT TAC ACT TTA ATTTAG3′ (SEQ ID NO:17)和 5′CCA CCA CAA GTC GAC GCA TGC CGA CAGCCT TCC AAA TGT3′(SEQ ID NO:18), 并以含DpnⅠ基因的质粒(衍生自从Sanford A.Lacks,Brookhaven National Laboratory,Upton,纽约得到的质粒;也可获自美国典型培养物保藏中心,保藏号ATCC67494)作为模板,通过PCR扩增编码DpnⅠ内切核酸酶的基因。
通过用含所需碱基改变的引物扩增已有的attL和attR′结构域,将另外的突变分别引入attL和attR′的B和B′区。突变型attL3(用寡聚Xis 115制备)和attR′3(attR′,用寡聚Xis 112制备)的重组产生具以下序列的attB3(粗体为与attB1不同处):B O B′ACCCA GCTTTCTTGTACAAA GTGGT (SEQ ID NO:8)TGGGT CGAAAGAACATGTTT CACCA (SEQ ID NO:47)
将attL3序列克隆于已有的基因供体质粒中代替attL2,产生质粒pEZC2901(图7A)。将attR′3序列克隆于已有的载体供体质粒中代替attR′2,产生质粒pEZC2913(图7B)。将DpnⅠ基因克隆入质粒pEZC2913中,以置换tet阻遏物基因。产生的载体供体质粒被称为pEZC3101(图7C)。当将pEZC3101转化入dam-菌株SCS110(Stratagene)时,产生了数以百计的菌落。当将同一质粒转化入dam+菌株DH5α时,只产生了1个菌落,即使DH5α细胞的感受态能力比SCS110细胞高约20倍。当将不含DpnⅠ基因的相关质粒转化入相同的这两个细胞系中时,从SCS110细胞产生了28个菌落,而从DH5α细胞产生了448个菌落。这表明DpnⅠ基因在质粒pEZC3101(图7C)上得到表达且它杀死dam+DH5α细胞而非dam-SCS110细胞。第三部分:用DpnⅠ选择证明重组克隆
用一对质粒通过依赖于毒性基因DpnⅠ选择产物而证实重组克隆。用MluⅠ将质粒pEZC3101(图7C)线性化并与环状质粒pEZC2901(图7A)反应。第二对质粒用做对照,所用选择方法基于通过阻遏物基因对药物抗性进行控制:用XbaⅠ将质粒pEZC1802(图7D)线性化并与环状质粒pEZC1502(图5H)反应。将含缓冲液(50mM Tris HCl pH约7.8,16.5mM NaCl,35mM KCl,5mM亚精胺,0.375mg/ml BSA,0.25mM EDTA,2.5%甘油)和蛋白质Xis(2.9ng)、Int(29ng)和IHF(5.4ng)的8μl反应液25℃温育45分钟,然后75℃ 10分钟,用1μl等分试样转化DH5α(即dam+)感受态细胞,如表6中所示。
表6
反应号 | 载体供体 | 选择基础 | 插入物供体 | 菌落 |
1 | pEZC3101/Mlu | DpnⅠ毒性 | … | 3 |
2 | pEZC3101/Mlu | Dpn Ⅰ毒性 | 环状pEZC2901 | 4000 |
3 | pEZC1802/Xba | Tet阻遏物 | … | 0 |
4 | pEZC1802/Xba | Tet阻遏物 | 环状pEZC1502 | 12100 |
从反应#2的4个菌落中小量制备DNA,并用限制酶SspⅠ酶切。所有菌落均得到预计片段。
分析:以毒性基因进行选择的亚克隆得到证实。产生了具预计结构的质粒。实施例6:用尿嘧啶DNA糖基化酶克隆基因及通过重组克隆亚克隆该基因以制备融合蛋白质第一部分:将现存表达载体转变成用于重组克隆的载体供体
可用于将现存载体转变成有功能的载体供体的DNA盒制备如下。用ApaⅠ和KpnⅠ消化质粒pEZC3101(图7C),用T4 DNA聚合酶和dNTP处理以使末端变平,再进一步用SmaⅠ、HpaⅠ和AlwNⅠ消化使不期望有的DNA片段变小,并将含attR′1-CmR-DpnⅠ-attR′-3结构域的2.6kb盒进行凝胶纯化。被纯化盒的浓度估计约为75ng DNA/μl。
质粒pGEX-2TK(图8A)(Pharmacia)可使得谷胱甘肽S转移酶和能读框一致地插入其多克隆位点的任何第二编码序列之间融合。用SmaⅠ消化pGEX-2TK DNA并以碱性磷酸酶处理。将约75ng的以上纯化DNA盒与约l00ng pGEX-27K载体在5μl连接液中连接2.5小时,然后用1μl转化感受态大肠杆菌BRL 3056细胞(DH10B的dam衍生物;可购得的dam-菌株包括来自Life Technologies,Inc.的DM1和来自Stratagene的SCS110)。将转化混合物的等分试样铺于含100μg/ml氨苄青霉素(存在于pGEX-2TK中的抗性基因)和30μg/ml氯霉素(存在于DNA盒中的抗性基因)的LB琼脂板上。挑出菌落并小量制备DNA。通过用EcoRⅠ进行诊断性酶切确定pGEX-2TK中盒的取向。具所需取向的质粒被称为pEZC3501(图8B)。第二部分:以三种阅读框架将报道基因克隆入重组克隆基因供体质粒
尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)克隆是将PCR扩增产物克隆入克隆载体的一种方法(美国专利号5,334,515,在此全文引入作为参考)。简洁地说,就是用在其5′末端胸腺嘧啶碱基位置处含尿嘧啶碱基的引物进行所需DNA区段的PCR扩增。当将该PCR产物与酶UDG温育时,尿嘧啶碱基被特异除去。这些碱基的丢失削弱了PCR产物DNA末端的碱基配对,当于合适温度(如37℃)温育时,所说产物的末端主要是单链。如果在含与PCR产物3′端互补之突出3′尾部的线性克隆载体存在时进行所说的温育,碱基配对使PCR产物有效地与克隆载体退火。当通过转化将退火产物引入大肠杆菌细胞时,体内加工有效地将其转变成重组质粒。
能将任何PCR产物克隆于所有三个阅读框架中的UDG克隆载体如下制备自pEZC320l(图8K)。8个寡核苷酸均获自Life Technologies,Inc.(书写方向均为5′→3′):rf1上(GGCC GAT TAC GAT ATC CCA ACG ACC GAA AAC CTG TATTTT CAG GGT) (SEQ.ID NO:19),rf1 下(CAG GTT TTC GGT CGTTGG GAT ATC GTA ATC)(SEQ.ID NO:20),rf2 上 (GGCCA GAT TACGAT ATC CCA ACG ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGT)(SEQ. IDNO:21),rf2 下 (CAG GTT TTC GGT CGT TGG GAT ATC GTAATC T)(SEQ.ID NO:22),rf3 上(GGCCAA GAT TAC GAT ATC CCA ACGACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGT)(SEQ. ID NO:23),rt3 下(CAG GTT TTC GGT CGT TGG GAT ATC GTA ATC TT)(SEQ.ID NO:24),
羧基上 (ACC GTT TAC GTG GAC)(SEQ. ID NO:25) 和羧基下
(TCGA GTC CAC GTA AAC GGT TCC CAC TTA TTA)(SEQ. IDNO:26).
用T4多核苷酸激酶将rf1、2和3顶链和羧基底链在其5′端磷酸化,然后杂交每对互补链。用NotⅠ和SalⅠ切质粒pEZC3201(图8K),将所切质粒的等分试样与羧基-寡核苷酸双链体(SalⅠ末端)和任一rf1、rf2或rf3双链体(NotⅠ末端)混合(10μg被切质粒(约5pmol)与250pmol羧基寡核苷酸双链体混合,分成3个20μl的等分,往每份反应液中加5μl(250pmol)的rf1、rf2或rf3双链体和2μl=2个单位T4 DNA连接酶)。室温连接90分钟后,将各反应液加到制备琼脂糖凝胶上,洗脱2.1kb载体带并溶于50μl TE中。第三部分:CAT和phoA基因的PCR
引物获自Life Technologies,Inc.,用于从质粒pACYC184中扩增氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因及从大肠杆菌中扩增phoA-碱性磷酸酶基因。引物具有含尿嘧啶碱基的12碱基5′延伸,以致用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)处理PCR产物会削弱DNA各个末端的碱基配对,并允许3′链与上述rf1、2和3载体的突出3′端退火。引物的序列(书写方向5′→3′)是:
CAT左,UAU UUU CAG GGU ATG GAG AAA AAA ATC ACT GGATAT ACC (SEQ. ID NO:27); CAT 右7 ,UCC CAC UUA UUA CGC CCCGCC CTG CCA CTC ATC (SEQ. ID NO:28);phoA左,UAU UUU CAG GGUATG CCT GTT CTG GAA AAC CGG(SEQ.ID NO:29);phoA 右7 ,UCCCAC UUA UUA TTT CAG CCC CAG GGC GGC TTT C (SEQ. ID NO:30).然后将引物用于以已知方法步骤进行的PCR反应中(见,如美国专利号5,334,515,在此全文引入作为参考),用这些引物获得聚合酶链式反应扩增产物含具起始ATG但无任何转录信号的CAT或phoA基因。此外,在氨基末端含尿嘧啶的序列编码TEV蛋白酶切割位点(LifeTechnologies,Inc.),在羧基末端上的那些含尿嘧啶序列编码连续TAA无义密码子。
将未纯化PCR产物(约30ng)与凝胶纯化的线性rf1、rf2或rf3克隆载体(约50ng)混合于含1XREact4缓冲液(LTI)和1个单位UDG(LTI)的10μl反应液中。37℃30分钟后,将各反应1μl等分试样转化入感受态大肠杆菌DH5α细胞(LTI)并铺于含50μg/ml卡那霉素的琼脂板上。挑出菌落并小量制备DNA,DNA的分析显示CAT基因已克隆于阅读框架1(pEZC3601)(图8C)、阅读框架2(pEZC3609)(图8D)和阅读框架3(pEZC3617)(图8E)中,phoA基因已克隆于阅读框架1(pEZC3606)(图8F)、阅读框架2(pEZC3613)(图8G)和阅读框架3(pEZC3621)(图8H)。第4部分:将来自UDG克隆载体的CAT或phoA亚克隆入GST融合载体
用如下重组克隆构建以所有3种阅读框架编码GST和CAT或phoA之间融合体的质粒。用ClaⅠ线性化GST载体供体pEZC3501(图8B)的小量制备DNA(如上所述来自Pharmacia质粒pGEX-2TK)。将约5ng载体供体与含CAT或phoA的适当环状基因供体载体各约10ng混合于含缓冲液和重组蛋白质Int、Xis和IHF(实施例5)的8μl反应液中。温育后,将1μl各反应液转化入大肠杆菌菌株DH5α并铺于含氨苄青霉素平板上,如表7所示。
表7
第5部分:融合蛋白质的表达
DNA | 菌落(各转化物的10%) |
线性载体供体(pEZC3501/Cla) | 0 |
载体供体+CAT rf1 | 110 |
载体供体+CAT rf2 | 71 |
载体供体+CAT rf3 | 148 |
载体供体+phoA rf1 | 121 |
载体供体+phoA rf2 | 128 |
载体供体+phoA rf3 | 31 |
将来自各个转化的2个菌落接种于在17×100mm塑料管(Falcon2059,Becton Dickinson)中含100μg/ml氨苄青霉素的2ml丰富培养基(Circle Grow,Bio101 Inc.)里并37℃剧烈振荡约4小时,此时培养物可见为混浊的。将1ml各培养物转移入含10μl 10%(w/v)IPTG的新管中以诱导GST的表达。追加温育2小时后,所有培养物具有大约相同的混浊度,培养物的A600是1.5。收获来自各培养物约0.35ml的细胞并用样品缓冲液(含SDS和β-巯基乙醇)处理,将相当于约0.15A600单位的细胞加到Novex 4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后用考马斯兰将凝胶染色。
结果:从所有12种培养物中可观察到单蛋白质带表达提高。所观察到的这些蛋白质大小与以三个阅读框架(通过无终止密码子的attB重组位点)和CAT(图8I)或phoA(图8J)融合的GST的预计大小很好地相关:CAT rf1=269个氨基酸;CAT rf2=303个氨基酸;CAT rf3=478个氨基酸;phoA rf1=282个氨基酸;phoA rf2=280个氨基酸;及phoArf3=705个氨基酸。
分析:将CAT和phoA基因均以所有三个阅读框架亚克隆入GST融合载体,6个融合蛋白质的表达得到证实。
实施例7:反向重组和通过重组进行亚克隆
构建两个质粒以证实按本发明进行的反向重组。如上所述,含attB重组位点并被称为attB亲代质粒(此载体可相应于产物DNA)的载体pEZC5601(图10A)进一步含氨苄青霉素抗性基因、复制起点、attB2位点、四环素抗性基因和attB0位点。含attP重组位点并称为attP亲代质粒(该载体可相应于副产物DNA或可相应于不同的载体供体DNA)的质粒pEZC6701(图10B)还包括卡那霉素抗性基因、复制起点、attP2位点、编码毒性蛋白ccdB的基因及attP0位点。10X浓度的整合酶缓冲液含0.25M Tris HCl pH7.5、0.25M Tris HCl pH8.0、0.7M氯化钾、50mM亚精胺HCl、5mM EDTA及2.5mg/ml BSA。注意attP0和attP2含P1和H1结构域。将整合酶(1.5μl,435ng/μl)和IHF(在1X整合酶缓冲液中16ng/μl,1.5μl)与13.5μl 1X Int缓冲液混合制成重组酶混合物。
配制两份8μl反应液。反应A在1×整合酶缓冲液中含300ngpEZC6701质粒及2μl重组酶混合物。反应B在1X整合酶缓冲液中含300ng pEZC5601、300ng pEZC6701和2μl重组酶混合物。两个反应均于25℃温育45分钟,然后70℃5分钟,然后冷却。将TE缓冲液(792μl 10mM Tris HCl pH7.5,1mM EDTA)加入各反应中,用1μl该稀释反应液转化入DH5α UltraMax感受态大肠杆菌细胞(LifeTechnologies,Inc.,Rockyille,MD)。在非选择性培养基中表达1小时后,将各个转化的十分之一(100μl)铺于含100μg/ml卡那霉素的琼脂板上。
37℃温育过夜后,来自反应A的平板有1个菌落,而来自反应B的平板含392个菌落。从反应B平板中挑出12个菌落接种于丰富液体培养基中并培养过夜。将这些培养物的小量制备DNA未经切割而在琼脂糖凝胶上电泳,所有的12个均含约3.8kb的质粒。用限制酶ClaⅠ切割6个小量制备DNA,并与也用ClaⅠ切割的pEZC6701(卡那霉素抗性亲代质粒)一起电泳。ClaⅠ切割质粒pEZC6701一次,产生约3.8kb的片段。ClaⅠ切割6个小量制备DNA两次,产生约900bp和约2900bp的片段。
分析:pEZC6701上attP位点与pEZC5601上attB位点之间的重组导致产生了两子代质粒,即含氨苄青霉素抗性和ccdB基因的attL产物质粒(图10C)(可相当于载体供体DNA或新的副产物DNA)及含卡那霉素和四环素抗性基因的attR产物质粒(图10D)(也可相当于插入物供体DNA或新的产物DNA)。接受attL产物质粒、attP亲本质粒pEZC6701或重组中间物的感受态大肠杆菌细胞被毒性ccdB基因产物杀死。接受attB亲本质粒pEZC5601的感受态大肠杆菌细胞被卡那霉素选择杀死。只有接受含卡那霉素和四环素抗性基因之所需attR产物质粒的感受态大肠杆菌细胞存活,形成菌落。与只含1种亲代质粒的反应相比,含两亲代质粒的反应得到大量克隆,表明了选择策略的成功。反应机制预计所需产物质粒将包含两ClaⅠ限制位点,一个在来自pEZC6701 attP亲本质粒的卡那霉素抗性基因中,另一个在来自pEZC5601 attB亲本质粒的四环素抗性基因中。两位点的存在及ClaⅠ消化产生的片段大小可证实反应机制。
因而,本发明涉及图1所示的反向重组反应,其中产物DNA和副产物DNA可结合产生插入物供体DNA和载体供体DNA。此外,本发明为亚克隆重组作了准备,其中产物DNA(按图1产生)可与新载体供体DNA结合以产生新的产物DNA(在不同的载体背景下)和新的副产物。实施例8:线性化片段的亚克隆
质粒pEZC7102(图11A),即attP亲本质粒(可相当于载体供体DNA),含区段attP1、复制起点、卡那霉素抗性基因、attP3、氯霉素抗性基因及毒性基因ccdB,在本文所述实验中是超螺旋的。质粒pEZC7501(图11B),即attB亲本质粒(可相当于插入物供体DNA或产物DNA),包括克隆于含pCMVSPORT2.0(Life Technologies,Inc.)功能结构域之载体的attB1和attB3位点之间的GFP基因。attP位点含P1和H1结构域。质粒pEZC7501使用未切割形式的,或用ScaⅠ在氨苄青霉素抗性基因内线性化,或用XbaⅠ和SalⅠ切割得到含SalⅠ末端、22bp、attB1位点、GFP基因、attB3位点及14bp至XbaⅠ末端的片段:SalⅠ末端--22bp--attB1--GFP--attB3--14bp--XbaⅠ末端
反应(8μl终体积)含DNA各约40ng、1X Int缓冲液(25mM Tris HClpH7.5,25mM Tris HCl pH8.0,70mM KCl、5mM亚精胺HCl、0.5mM EDTA、和0.25mg/ml BSA)、12.5%甘油、8ng IHF和43ngλ整合酶。反应在25℃温育45分钟,然后在70℃ 5分钟,然后冷却。将各反应液1μl等分试样两份转化入DH5α UltraMax细胞,并双份铺于卡那霉素琼脂板上。
只含(超螺旋)pEZC7102的反应平均得到2个菌落(约为1-4个)。含pEZC7102和超螺旋pEZC7501的反应平均为612个菌落(约为482-762个)。含pEZC7102和线性(ScaⅠ切割)pEZC7501的反应平均为360个菌落(在约127-605个之间)。含有在具attB位点并在attB位点之外22bp和14bp的片段上的GFP基因(用SalⅠ和XbaⅠ切割pEZC7501)和pEZC7102的反应平均得到274个菌落(约为243-308个)。
从来自pEZC7102 X超螺旋pEZC7501反应的4个菌落和来自pEZC7102×pEZC7501/SalⅠ+XbaⅠ反应的10个菌落小量制备DNA。将所有14个未切DNA电泳于琼脂糖凝胶上,用NcoⅠ和PstⅠ混合物酶切割来自pEZC7102×pEZC7501/SalⅠ+XbaⅠ反应的10个DNA后电泳于琼脂糖凝胶上。所有的未切质粒大小约为2.8kb。所有10个用NcoⅠ和PstⅠ混合物酶切的质粒得到约为700和2100bp的片段。
结果如表8所示:
表8
attP亲本 | attB亲本 | 菌落(4个平板的平均值) | 进行的小量制备 | 未切产物质粒大小 | 片段大小,Nco+Pst消化 |
sc 7102 | -- | 2 | -- | -- | -- |
sc 7102 | sc 7501 | 612 | 4 | 2.8kb | -- |
sc 7102 | 7501/ScaⅠ | 360 | -- | -- | -- |
sc 7102 | 7501/SalⅠ+XbaⅠ | 274 | 10 | 2.8kb | 约2100bp,700bp |
分析:预计在质粒pEZC7501上的attB位点和质粒pEZC7102上的attP位点之间的整合反应将产生含有来自pEZC7501之GFP区段和来自pEZC7102之卡那霉素起点区段的attL产物质粒(图11C)(相应于插入物供体DNA)。预计在attP亲本质粒pEZC7102(相应于副产物DNA)上毒性基因ccdB的存在会杀死接受该质粒的细胞。当pEZC7501存在时菌落数目的大大增加表明发生了预期反应,且即使attB亲本质粒(相应于产物DNA)是线性的(ScaⅠ切)或attB位点和GFP基因存在于除attB位点外仅含很小附加序列的片段上,反应的效率也是足够的。
这些结果表明用本发明的方法可将线性片段恰当地亚克隆入不同载体中。
实施例9:长PCR片段的克隆
设计一种PCR产物,使其在一端具有attB0(野生型)位点而在另一端有loxP位点。基本原理是用线性attB0分子(PCR产物)可很好地进行attP0×attB0反应,(因为涉及一正常的λ整合反应),且共合体的loxP×loxP切除也是有效的(单分子切除反应效率高,用Cre进行的双分子整合反应效率低)。
含attB之PCR引物的序列是5′-TCC GTT GAA GCC TGC TTT TTT ATACTA ACT TGA GCG AAG CCT CGG GGT CAG CAT AAG G-3′(SEQ ID NO:31)。loxP引物的序列是5′-CCA ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACGAAG TTA TTG CCC CTT GGT GAC ATA CTC G-3′(SEQ ID NO:32)。这些引物扩增人肌球蛋白重链的一部分。利用ELONGASETM并以K562人DNA为模板进行聚合酶链式反应。聚合酶链式反应进行如下。反应液(50μl)在ELONGASETM SuperMix(Life Technologies,Inc.)中含100ng K562人DNA(Life Technologies,Inc.)、0.2μM各引物及0.2mM各dNTP。薄壁管中矿物油下的反应液在94℃1分钟,然后按94℃30秒、65℃30秒、68℃8分30秒循环35次。热循环后,反应液4℃保存。凝胶纯化5.2kb的PCR产物(图9A)。
质粒pEZC1202(图9B)含野生型attP位点、氯霉素抗性基因、编码tet阻遏物的基因、野生型loxP位点、复制起点、转录和调控转录卡那霉素抗性基因的tet操纵基因/启动子。该质粒有氯霉素抗性但无卡那霉素抗性,因为由质粒某元件产生的tet阻遏物使卡那霉素抗性基因保持关闭。该实验中所用pEZC1202 DNA是小量制备物,其浓度估计约为50ng/μl。
将约40ng凝胶纯化的5.2kb PCR产物加入10μl反应液中,该反应液于50mM Tris HCl pH约7.8、16mM NaCl、35mM KCl、0.25mM EDTA、0.375mg/ml牛血清白蛋白中包含约50ng超螺旋pEZC1202、0.2个单位的Cre重组酶、3.6ng IHF、及11ng Int。不含PCR产物的第二反应作为对照。27℃温育45分钟随后70℃5分钟后,将1μl等分试样转化入DH5α UltraMax感受态大肠杆菌细胞(Life Technologies,Inc.)。将各反应混合物的五分之一铺于含100μg/ml卡那霉素的琼脂上并37℃温育平板过夜。含PCR产物的反应液得到34个菌落,而缺少PCR产物的反应液得到31个菌落。平板室温放置4天后,在阳性(+PCR产物)反应液平板上可见26个额外的小菌落,而在阴性(无PCR产物)反应液平板上只见1个额外的小菌落。
将26个小菌落中的12个在含25μg/ml卡那霉素的丰富肉汤培养基(Circle Grow)中培养过夜,并从这些培养物中小量制备DNA。所有的12个小量制备质粒大小约为8kb,符合用5.2kb PCR产物置换氯霉素抗性及tet阻遏物基因后的预期大小。预计的重组产物如图9C中所示。用AvaⅠ(预计8个位点)和BamHⅠ(预计4个位点)切割这些质粒中的两个。所有的预计AvaⅠ片段均显出存在。在两小量制备DNA中均缺乏PCR产物中预计的BamHⅠ位点之一(离attB端最近的一个),但其它BamHⅠ片段与克隆5.2kb PCR产物的预期结构一致。
分析:用5.2kb PCR产物(人肌球蛋白重链的一部分)置换pEZC1202中的氯霉素抗性和tet阻遏物基因赋与宿主大肠杆菌细胞适度的抗卡那霉素抗性,但该抗性不足以使菌落在过夜温育后长出。因而,含所需重组产物的菌落生长于卡那霉素平板上,但过夜温育后观察不到,只有在另外室温温育后才可见。在从核苷酸序列预计的12个AvaⅠ和BamHⅠ限制位点中,11个已通过实验证实。因而以下3个观察结果证实了通过重组克隆5.2kb PCR产物的结论:(a)只在含PCR产物之反应液的平板上显现缓慢生长的小菌落;(b)来自这些菌落的小量制备质粒是预计大小的;和(c)诊断性限制酶切得到了预计片段(有一个上文所提及的例外)。实施例10:PCR片段的克隆
设计三套PCR引物对(表9)以扩增质粒pEZC7501(图11B)内的830bp序列,该序列包含:attB1--GFP--attB3,在25bp attB1和attB3重组位点外端有或无附加的核苷酸。(此处“外”指不与GFP基因序列相邻的attB序列末端。)A套引物在attB1上游加17个核苷酸,而在attB3下游加15个核苷酸;B套引物分别加5和8个核苷酸至attB1和attB3;而C套引物不添加核苷酸至任一attB重组序列。
引物序列如表9中所示:
PCR反应
表9 | |
上GFP A | 5′-TCA CTA GTC GGC GGC CCA CA(SEQID NO:33) |
下GFP A | 5′-GAG CGG CCC CCG CGG ACC AC(SEQID NO:34) |
上GFP B | 5′-GGC CCA CAA GTT TGT ACA AAA(SEQIDNO:35) |
下GFP B | 5′-CCC CGC GGA CCA CTT TGT AC(SEQID NO:36) |
上GFP C | 5′-ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA(SEQIDNO:37) |
下GEP C | 5′-ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT(SEQIDNO:38) |
A套和C套引物首先用于以下PCR反应,50μl,双份。终浓度是:
20mM TrisHCl,pH8.4
50mM KCl
0.2mM所有4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)
400ng/ml pEZC7501超螺旋DNA模板
0.5μM各引物
重组Taq DNA聚合酶(BRL-GIBCO)100U/ml
双份以上反应液含1M甜菜碱。
反应液首先94℃加热1分钟,然后在94℃45″、55℃30″及72℃1′循环25次。
在TAE缓冲液中、含0.5μg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上分析PCR反应产物的大小。所有反应均产生预期大小的产物,这样合并双份反应液。因为带或不带甜菜碱的相应反应液无显著差异,也将它们合并,得到终合并体积各为200μl的A套和C套引物反应液。
然后将B套引物用于与上述相同的反应液中,只是将反应液体积增加至100μl。合并双份反应液及加和不加甜菜碱的反应液,带B套引物的反应终体积为400μl。
三种合并的引物反应产物在-20℃贮存4周。PCR产物纯化
用等体积Tris平衡酚、异戊醇和氯仿混合物抽提三种合并PCR产物的每一种一次。然后用等体积异丁醇提取水相上清液两次,用两倍体积乙醇、0.1M乙酸钠pH6.2沉淀水相。13,000rpm室温离心10分钟回收乙醇沉淀,丢弃上清液。将抽干的沉淀溶于TE:用A和C套引物制备的反应液是溶于100μl;用B套引物的反应液是溶于200μl。
为了去除PCR引物及无关的小PCR产物,用聚乙二醇(PEG)沉淀PCR产物,这是通过添加1/2体积的30%PEG8000(Sigma)、30M MgCl2溶液,混匀,并在13,000rpm离心10′(均于室温)进行的。丢弃上清液,沉淀溶于原体积的TE缓冲液中。在1%琼脂凝胶上检测三种PCR产物各1μl等分试样以确定回收率,估计为超过90%。用TE将各PCR产物浓度调节至40ng/μl。用A、B和C套引物的PCR产物进行重组反应
在1X整合酶缓冲液(25mM Tris HCl pH7.5、25mM Tris HCl pH8.0、80mM KCl、5mM亚精胺、0.5mM EDTA、O.25mg/ml BSA)中配制5个8μl反应,该缓冲液包括:40ng pEZC7102 DNA、2μl重组酶混合物(8ng/μl IHF、22ng/μl Int于1X Int缓冲液中、50%甘油),各反应因添加A套引物的PCR产物(反应A)、B套引物的PCR产物(反应B)、或C套引物的PCR产物(反应C);不添加PCR产物(反应D),或添加40ngpEZC7501 SC(超螺旋)DNA(反应E)作为阳性对照而不同。所有的反应均双份反应。
反应液于25℃温育45′,70℃10′,然后保存于0-5℃。将反应液各2μl等分试样转化入Max Efficiency DH5α,转化反应液50μl,在50C培养基中表达后,将1/5(100μl)和4/5(400μl)反应液铺于含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养皿上。双份反应的结果如表10所示。
表10 | |
转染 | 菌落数 |
A 100 μlA 400 μl | 464,668>1000,>1300 |
B 100 μlB 400 μl | 980,1292>3000,>3000 |
C 100μlC 400μl | 2,813,20 |
D 100 μlD 400 μl | 0,00,0 |
E 100 μl | 56.70 |
从A、B或C套引物的各重组反应液的8个菌落小量制备DNA。在1%琼脂糖凝胶上分析所获的超螺旋DNA:来自A套和B套引物之重组产物的所有8个菌落均为PCR产物(约824bp)和pEZC7102(1967bp)所提供attB1--ori--kanr--attB3序列之间正确重组的预计大小(2791bp)。C套引物之8个反应产物中的3个为预计大小的;另5个均稍大于4kb。
用两种不同的限制酶AvaⅠ和PvuⅡ进行反应产物的进一步分析,在预计重组产物内每种酶切割两次(但在不同的位置),一次在PCR产物序列内,而另一次在pEZC7102提供的序列内。这些酶均应在两位点切割完整pEZC7102重组配偶体质粒,从而产生容易区别于预期重组产物的片段。
从产生自具A套和B套引物之重组反应液的菌落,两个限制酶消化产生了预计大小的片段(对于AvaⅠ为2373和430bp;对于PvuⅡ为2473和330bp),对于来自C套引物展示预计大小的超螺旋DNA的3个菌落,有相同结果。但来自C套引物、产生更大SC DNA的另5个菌落,PvuⅡ消化显出与从pEZC7102消化所预计相似大小的片段,而AvaⅠ消化显示只有单个片段,约为线性pEZC7102(4161bp)的大小。分析
这些结果表明产生自含侧翼有attB位点之基因的模板的PCR产物可作为逆重组反应的有效底物。添加更短的DNA序列至attB1和attB3位点或核心区(如在B套引物内分别为5bp和8bp)末端可刺激此反应100倍或更多。令人惊奇的是,用在attB位点外含附加序列之PCR产物进行的逆重组反应,显示在这些反应中是比超螺旋阳性对照质粒pEZC7501更有效的重组配偶体。
所有的重组产物均如实产生。C套引物的相对低效重组反应呈现低水平的背景菌落,该重组反应缺乏25bp attB位点外的附加序列。该背景显示是由于大量完整pEZC7102(编码卡那霉素抗性)缺乏活性ccdB致死基因,从而使其可存活。与此解释相一致的是,在此质粒内的两AvaⅠ限制位点之一也改变了。AvaⅠ位点之一存在于pEZC7102的ccdB区内。因此该位点的改变很可能是ccdB基因突变失活的附属性质。实施例11:PCR片段的进一步克隆
以质粒pBR322为模板用两套6个引物制备PCR产物。一套(表11)与TetR基因侧翼的序列,包括TetR启动子退火。另一套(表12)与AmpR基因侧翼的序列,包括其启动子退火。所用引物“tet”和“amp”不含attB序列,只含PBR322质粒固有序列;除pBR322序列之外,“attB”引物还含25bp的attB1或attB3序列;“attB+4”引物含pBR322特异序列,加上25bp attB1或attB3序列,每个均在外端带4个G。(在此“外端”指不与模板特异引物序列相邻的attB序列末端。)pBR322模板的制备
为了提高PCR反应的效率,通过在含15个单位限制酶NdeⅠ及终浓度50mM Tris-HCl pH8.0、10mM MgCl2和50mM NaCl的200μl反应液中于37℃温育3.5μg超螺旋(SC)pBR322 DNA 1小时而将超螺旋pBR322DNA线性化。
用酚、异戊醇和氯仿抽提被消化的pBR322 DNA 1次,用异丁醇抽提2次,并通过加入2倍体积乙醇及0.15M乙酸钠沉淀。用100%乙醇洗沉淀1次,晾干,然后溶于TE缓冲液中。在于TAE缓冲液中、含0.5μg/ml溴化乙锭中的1%琼脂糖凝胶上确定DNA回收率,估计大于80%。
表11
tet引物 | 引物序列 | SEQ IDN0: |
tet-Ltet-R | AAT TCT CAT GTT TGA CAG CTT ATCCGA TGG ATA TGT TCT GCC AAG | 4849 |
attB1-tetLattB3-tetR | ACAAG TTTGTA CAAAAA AGCA GGCT-AAT TCT CAT GTT TGA CAG CTT ATCACCAC TTTGTA CAAGAA AGCT GGGT-CGA TGG ATA TGT TCT GCC AAG | 5051 |
attB1+4-tetLattB3+4-tetR | GGGG ACAAG TTTGTA CAAAAA AGCA-GGCT AAT TCT CAT GTT TGA CAG CTT-ATCGGGG ACCAC TTTGTA CAAGAA AGCT-GGGT CGA TGG ATA TGT TCT GCC AAG | 5253 |
表12
tet和amp基因序列的PCR扩增
amp引物 | 引物序列 | SEQ IDN0: |
amp-Lamp-R | AAT ACA TTC AAA TAT GTA TCC GCTTA CCA ATG CTT AAT-CAG TGA G | 5455 |
attB1-ampLattB3-ampR | ACAAG TTTGTA CAAAAA AGCA GGCT-AAT ACATTC AAATAT GTATCC GCACCAC TTTGTA CAAGAA AGCT GGGT-TTA CCA ATG CTT AAT CAG TGA G | 5657 |
attB1+4-ampLattB3+4-ampR | GGGG ACAAG TTTGTA CAAAAA AGCA-GGCT AAT ACA TTC AAA TAT GTA TCC-GCGGGG ACCAC TTTGTA CAAGAA AGCT-GGGTT TAC CAA TGC TTA ATC AGT GAG | 5859 |
在由20mM Tris-HCl pH8.4、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、2ng线性化pBR322、2.5个单位Taq DNA聚合酶(GIBCO-BRL)及表3和4所列PCR引物对各0.5μM组成的100μl体系中进行6个PCR反应。反应液首先在94℃加热3分钟,然后94℃ 45秒、55℃30秒、72℃1分钟进行25个循环。基于1%琼脂糖凝胶分析,所有的反应均产生合适产量的预计大小产物。PCR产物的纯化
合并双份反应产物;用等体积酚、异戊醇和氯仿抽提;用等体积异丁醇抽提2次;并如上所述用2倍体积乙醇沉淀。用100%乙醇洗6份沉淀1次,干燥并溶于100μl TE中。在PEG沉淀前取1μl等分试样用于产物的凝胶分析。
每管中加入50 μl 30%PEG 8000、30mM MgCl2。溶液混匀并于13,000rpm室温离心10分钟。小心去除上清液,沉淀溶于100μl TE中。在1%琼脂糖凝胶上确定回收率,估计超过90%。凝胶分析还显示小于约300个核苷酸的核酸产物已通过PEG沉淀步骤有效去除了。重组反应
进行7个重组反应,每个总体积8μl,含lX整合酶缓冲液、40ngpEZC7102(图11A)和2μl重组酶混合物(见上文,实施例10)。各反应液还包含约40ng 6种上述PCR产物之一或作为阳性对照的40ngpEZC7501(图11B)。在其末端带attB位点的amp和tet PCR产物如图12A和12B中所示。反应液于25℃温育45分钟,70℃10分钟,然后于0-5℃保持1-2小时直至用于转化大肠杆菌。用重组反应产物转化大肠杆菌
将1μl各重组反应液在50μl转化反应液中转化入MaxEfficiency DH5α中,在SOC培养基中表达后,将1/5(100μl)和4/5(400μl)各反应液铺于含50μg/ml卡那霉素的培养板上。平板温育过夜并将菌落计数。获自每套双份反应液的菌落数列于表13中:
表13重组反应 菌落数
所获菌落的分析
tet 100(100μl)tet 400(400μl) | 6,1027,32 |
attB-tet100attB-tet400 | 9,627,36 |
attB+4-tet100attB+4-tet400 | 824,1064>2000,>4000 |
amp 100amp 400 | 7,1359,65 |
attB-amp 100attB-amp 400 | 18,2266,66 |
attB+4-amp 100attB+4-amp400 | 3020,3540>5000,>5000 |
pEZC7501 100pEZC7501 400 | 320,3941188,1400 |
为进行快速表型筛选,将来自tet EZC反应液的10个菌落和来自attB+4-tet EZC反应液的33个菌落划线接种于含四环素(15μg/ml)的LB培养板上。作为四环素效力的对照,将缺乏TetR基因的pUC19转化,细胞的3个菌落也划线于平皿上。所有来自attB+4-tet EZC反应的菌落生长良好;来自tet EZC反应的菌落只很少量地生长,而pUCl9菌落根本不生长。
通过将来自amp PCR反应的菌落划线于含氨苄青霉素(100μg/ml)的培养皿上得到类似的结果。产生自attB+4-amp重组反应液的所有21个菌落均生长良好,而存在氨苄青霉素时来自attB-amp反应液的13个菌落中只有1个生长。来自含amp PCR产物之重组反应液的15个菌落中任何一个都未见生长。
为了鉴定质粒DNA,挑出产生自PCR产物之6个EZC反应液的8个菌落并接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养过夜。从0.9ml各培养物中小量制备DNA,并在含0.5μg/ml溴化乙锭之TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上分析超螺旋DNA的大小。结果列于表14。重组产物的预计结构如图12C和12D中所示。
表14
分析
重组反应 | DNA | 预计大小(bp) | 具有预计大小的数目 |
tet | SC(超螺旋) | 3386 | 0/8 |
attB-tet | SC | 3386 | 1/8 |
attB+4-tet | SCAvaⅠ+Bam | 3386485,2901 | 7/73/3 |
amp | SC | 2931 | 0/8 |
attB-amp | SC | 2931 | 3/8 |
attB+4-amp | SCPst | 2931429,2502 | 8/83/3 |
基于质粒pBR322中两不同基因序列tet和amp的扩增,这些结果清楚地表明用含25bp attB1和attB3重组序列之引物产生的PCR产物可作为高效底物用于重组反应。添加短序列至各25bp attB位点之外端可刺激重组反应超过100倍,如同在实施例10的实验中也观察到的一样。与实施例10也类似的是,用带attB位点之线性PCR产物进行的重组反应的效率超过用阳性对照SC DNA质粒pEZC7501获得的效率。
此外,如所预计有高比率的反应产物,因为检测的来自attB+4-tet反应的所有33个菌落显示有功能的四环素抗性,而来自attB+4-amp反应的所有21个菌落均显示氨苄青霉素抗性。由pEZC7102与attB+4-tet或attB+4-amp PCR产物进行的重组反应的所有16种小量制备DNA,均产生正确大小的超螺旋DNA和限制性消化片段。实施例12:用拓扑异构酶刺激重组
通过将一个或两个亲代质粒线性化而对重组反应的刺激作用在意料之外。如果刺激是因两重组反应(共合体形成及分解成两子代分子)期间引起的一些构象限制解除而导致的,那么当一个或两个亲代质粒为环状时用拓扑异构酶解开质粒可能也是有刺激作用的。
插入物供体是pEZC2901(图7A),而载体供体是pECZ3101(图7B)。用MluⅠ线性化一部分pEZC3101。 20ng pEZC2901和/或pECZ3101用于各10μl反应中(29ng Int、2.9ng Xis、5.4ng IHF,在50mM Tris HClpH约7.8、16.5mM NaCl、35mM KCl、5mM亚精胺、0.375mg/ml BSA、0.25mM EDTA、2%甘油)。用1X EZC缓冲液将拓扑异构酶Ⅰ(来自小牛胸腺;Life Technologes,Inc.)从15个单位/μl稀释至表15中所示浓度。
表15
这些反应液以以下次序配制:缓冲液;TE;DNA;Clonase;拓扑异构酶。该反应在22°-28°温育45分钟,然后70℃5分钟。用1μl等分试样转化入UltraMax DH5α感受态大肠杆茵(Life Technologies,Inc.)。表达后,等分试样铺于含100μg/ml卡那霉素的平板上并于30℃温育48小时。结果:见表16。
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
环状3101 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | |||||
线性3101 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | |||||
环状2901 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | ||
重组酶 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
TE | 2 | 2 | ||||||||
拓扑异构酶,1∶60 | 2 | 2 | ||||||||
拓扑异构酶,1∶20 | 2 | 2 | ||||||||
拓扑异构酶,1∶6 | 2 | 2 | ||||||||
3X缓冲液 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
1X缓冲液 | 2 | 2 | 2 | 2 |
表16
分析
反应号 | 菌落 | 载体供体 | 插入物供体 | 重组酶 | 拓扑异构酶 |
1 | 0 | 线性3101 | -- | + | -- |
2 | 245 | 线性3101 | 环状2901 | + | -- |
3 | 221 | 线性3101 | 环状2901 | + | 0.5单位 |
4 | 290 | 线性310l | 环状2901 | + | 1.6单位 |
5 | 355 | 线性3101 | 环状2901 | + | 5单位 |
6 | 0 | 环状3101 | + | -- | |
7 | 23 | 环状3101 | 环状2901 | + | -- |
8 | 209 | 环状3101 | 环状2901 | + | 0.5单位 |
9 | 119 | 环状3101 | 环状2901 | + | 1.6单位 |
10 | 195 | 环状3101 | 环状2901 | + | 5单位 |
载体供体线性化使菌落数增加了约10倍(反应2相比于反应7)。添加0.5-5个单位拓扑异构酶Ⅰ至含环状插入物供体和线性载体供体的反应中,对菌落数仅有微小影响或无影响(反应2与反应3、4和5相比;最大为1.4倍)。相比之下,如果两亲代质粒均为环状(反应7-10),拓扑异构酶的添加可刺激菌落数增加至5-9倍。因此,添加拓扑异构酶Ⅰ至两亲代质粒均为环状的反应中对重组反应的刺激作用几乎与线性化载体供体亲本的一样高。当在重组缓冲液中与三种重组蛋白质结合使用时,拓扑异构酶Ⅰ是有活性的。将拓扑异构酶Ⅰ添加至重组反应解除了为达到重组反应的刺激作用而需线性化载体供体的必需性。
为了理解清楚的目的,现已用举例和实施例的方式完整详述了本发明,对本领域普通技术人员很明显的是,可以在不影响本发明范围或其任何特异实施方案的前提下,在广泛及相等范围的条件、配方及其他参数内修饰或改变本发明而达到相同目的,这样的修饰或改变也包括于附加的权利要求范围内。
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请是本发明所属领域内技术熟练人员技术水平的指示,各出版物、专利或专利申请均相同程度地具体并独立引入本文作为参考。
序列表>Life Technologies,Inc.>利用具重组位点的核酸进行重组克隆򗦎.285PC04>>>US 60/065,930򗶭-10-24>US(待转让)򗶮-10-23ᡴ>PatentIn Ver.2.0ɭᡑ>DNA>未知>>未知生物描述:重组产物ɭ
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Claims (51)
1.克隆或亚克隆一种或多种所需核酸分子的方法,包括:
(a)体外或体内组合
(ⅰ)含侧翼有至少两个重组位点的一个或多个所需核酸区段的一种或多种插入物供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;
(ⅱ)含至少两个重组位点的一种或多种载体供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;及
(ⅲ)一种或多种位点特异性重组蛋白质;
(b)在足以转移一个或多个所说所需区段至一种或多种所说载体供体分子内的条件下温育所说的组合,从而产生一种或多种所需产物核酸分子;
(c)体外或体内组合
(ⅰ)含侧翼有两个或多个重组位点之所说所需区段的一种或多种所说产物分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;
(ⅱ)含两个或多个重组位点的一种或多种不同载体供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;及
(ⅲ)一种或多种位点特异性重组蛋白质;及
(d)在足以转移一个或多个所说所需区段至一种或多种不同载体供体分子内的条件下温育所说的组合,从而产生一种或多种不同的产物分子。
2.权利要求1的方法,其中进一步包括在足以转移一个或多个所说所需区段至所说不同载体供体分子内的条件下将该不同产物分子与一种或多种不同的载体供体分子温育。
3.一种克隆或亚克隆所需核酸分子的方法,包括:
a)体外或体内组合
ⅰ)含侧翼有两个或多个重组位点的一个或多个核酸区段的一种或多种插入物供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;
ⅱ)含两个或多个重组位点的两个或多个不同载体供体分子,其中所说的重组位点基本上不相互重组;及
ⅲ)一种或多种位点特异性重组蛋白质;及
b)在足以转移一个或多个所说所需区段至所说不同载体供体分子内的条件下温育所说的组合,从而产生两种或多种不同产物分子。
4.权利要求1或3的方法,其中所说的插入物供体分子来自基因组DNA。
5.权利要求1或3的方法,其中所说的插入物供体分子来自cDNA。
6.权利要求1或3的方法,其中所说的插入物供体分子是通过化学合成产生的。
7.权利要求1或3的方法,其中所说的载体供体分子包含至少一个选择标记。
8.权利要求7的方法,其中的选择标记包含至少一个选自下组的DNA区段:
(a)编码在受体细胞内提供抗原本有毒的毒性化合物之抗性的产物的DNA区段;
(b)编码受体细胞中原本缺乏的产物的DNA区段;
(c)所编码产物可抑制受体细胞内一种基因产物活性的DNA区段;
(d)所编码产物可鉴定的DNA区段;
(e)所编码产物可抑制受体细胞内细胞功能的DNA区段;
(f)可抑制以上(a)-(e)中任何DNA区段的活性的DNA区段;
(g)可结合能修饰底物的产物的DNA区段;
(h)编码可被蛋白质、RNA、DNA或化学物质识别之特异核苷酸识别序列的DNA区段;
(ⅰ)缺失时直接或间接在受体细胞内赋予被特殊化合物杀死之细胞敏感性的DNA区段;
(j)所编码产物在受体细胞内有毒的DNA区段;及
(k)可用于分离或鉴定所需分子的DNA区段。
9.权利要求8的方法,其中所说选择标记包括选自下组的至少一个标记:抗生素抗性基因、tRNA基因、营养缺陷型标记、毒性基因、表型标记、反义寡核苷酸、限制性内切核酸酶、限制性内切核酸酶切割位点、酶切割位点、蛋白质结合位点及互补于PCR引物序列的序列。
10.权利要求1或3的方法,其中所说的载体供体分子包含原核和/或真核载体。
11.权利要求10的方法,其中所说的真核载体包含可在酵母细胞、植物细胞、鱼类细胞、真核细胞、哺乳动物细胞和/或昆虫细胞内增殖和/或复制的载体。
12.权利要求10的方法,其中所说的原核载体包含可在革兰氏阴性或阳性细菌内增殖和/或复制的载体。
13.权利要求12的方法,其中所说的原核载体包括可在埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和/或假单胞菌属细菌内增殖和/或复制的载体。
14.权利要求13的方法,其中所说的原核载体包括可在大肠杆菌中增殖和/或复制的载体。
15.权利要求10的方法,其中所说的载体供体分子选自下组:克隆载体、测序载体、表达载体、融合载体、双杂交载体、反向双杂交载体或它们的衍生物或变体。
16.权利要求10的方法,其中所说的真核载体选自下组:pFastBac,pFastBac HT,pFastBac DUAL,pSFV,pTet-Splice,pEUK-C1,pPUR,pMAM,pMAMneo,pBI101,pBI121,pDR2,pCMVEBNA,YACneo,pSVK3,pSVL,pMSG,pCH110,pKK232-8,p3’SS,pXT1,pSG5,pPbac,pMbac,pMClneo,pOG44,pYES2,pAC360,pBlueBacHis,pVL1392,pBlueBacⅢ,pCDM8,pcDNA1,pZeoSV,pcDNA3pREP4, pCEP4, 及 pEBVHis 或它们的衍生物或变体。
17.权利要求10的方法,其中所说的原核载体选自下组:pcDNAⅡ,pSL301,pSE280,pSE380,pSE420,pTrcHis,pRSET,pGEMEX-1,pGEMEX-2,pET,pTrc99A,pKK223-3,pGEX,pEZZ18,pRIT2T,pMC1871,pKK233-2,pKK388-1,及 pProEx-HT或它们的衍生物或变体。
18.权利要求15的方法,其中所说的双杂交和反向双杂交载体选自下组:pPC86, pDBLeu,pDBTrp,pPC97,p2.5,pGAD1-3,pGAD10,pACt,pACT2,pGADGL,pGADGH,pAS2-1,pGAD424,pGBT8,pGBT9,pGAD-GAL4,pLexA,pBD-GAL4,pHISi,pHISi-1,placZi,pB42AD,pDG202,pJK202,pJG4-5,pNLexA,及 pYESTrp 或它们的衍生物或变体。
19.权利要求1或3的方法,其中所说的插入物供体分子包括载体。
20.权利要求1或3的方法,其中所说的插入物供体分子含扩增产生的DNA区段。
21.权利要求20的方法,其中所说的扩增是PCR。
22.权利要求21的方法,其中所说的插入物供体是线性的。
23.权利要求22的方法,其中所说的插入物供体含有至少一个位于所说线性分子一末端或两末端处或附近的重组位点。
24.权利要求1或3的方法,其中所说的重组位点选自loxP、attB、attP、attL和attR。
25.权利要求1或3的方法,其中所说的重组蛋白质选自Int、Cre、Flp、Res。
26.制备含两个或多个重组位点或其部分的核酸分子的方法,包括
(a)将核酸模板与具聚合酶活性的多肽及含一个或多个重组位点或者其部分的一个或多个引物混合;并
(b)在足以合成互补于所说模板全部或部分并含一个或多个重组位点或其部分的核酸分子的条件下温育该混合物。
27.权利要求26的方法,其中进一步包括在足以合成互补于所说第一核酸分子全部或部分的第二核酸分子的条件下,存在含一个或多个重组位点或其部分的一个或多个引物时温育所说的合成分子,从而产生含两个或多个重组位点或其部分的双链核酸分子。
28.权利要求27的方法,其中所说的重组位点或其部分位于所说合成双链核酸分子的一个或多个末端处或附近。
29.权利要求27的方法,其中所说的模板是RNA或DNA。
30.权利要求29的方法,其中所说的RNA是mRNA或polyA RNA分子。
31.权利要求27的方法,其中所说的多肽选自逆转录酶或DNA聚合酶。
32.权利要求31的方法,其中所说DNA聚合酶是耐热DNA聚合酶。
33.权利要求32的方法,其中所说耐热DNA聚合酶选自下组:嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Tne)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis(Tli或VENT_)DNA聚合酶、激烈热球菌(Pfu或DEEPVENT_)DNA聚合酶、沃氏热球菌(Pwo)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sac)DNA聚合酶、嗜酸热原菌(Tac)DNA聚合酶、黄栖热菌(Tfl/Tub)DNA聚合酶、红栖热菌(Tru)DNA聚合酶、Thermus brockianus(DYNAZYME_)DNA聚合酶、热自养甲烷杆菌(Mth)DNA聚合酶,及其突变体、变体和衍生物。
34.权利要求27的方法,其中进一步包括扩增所说第一和第二核酸分子。
35.权利要求34的方法,其中完成所说扩增的方法包括:
(a)用具聚合酶活性的多肽将所说第一核酸分子与互补于该第一核酸分子一部分的第一引物接触,将第二核酸分子与互补于该第二核酸分子一部分的第二引物接触;
(b)在足以形成互补于该第一核酸分子全部或部分的第三核酸分子及互补于该第二核酸分子全部或部分的第四核酸分子的条件下温育所述混合物;
(c)变性所说的第一和第三及所说的第二和第四核酸分子;及
(d)重复步骤(a)-(c)一次或多次,其中所说的第一引物和/或第二引物含一个或多个重组位点或其部分。
36.一种扩增核酸分子的方法,包括
(a)用具聚合酶活性的多肽将第一核酸分子与互补于该第一核酸分子一部分的第一引物接触,将第二核酸分子与互补于该第二核酸分子一部分的第二引物接触;
(b)在足以形成互补于该第一核酸分子全部或部分的第三核酸分子及互补于该第二核酸分子全部或部分的第四核酸分子的条件下温育所说的混合物;
(c)变性所说的第一和第三及所说的第二和第四核酸分子;及
(d)重复步骤(a)-(c)一次或多次,其中所说第一引物和/或第二引物含一个或多个重组位点或其部分。
37.生产一种或多种cDNA分子或cDNA分子群的方法,包括
(a)将RNA模板或RNA模板群与逆转录酶和一个或多个引物混合,其中所说引物包含一个或多个重组位点或其部分;及
(b)在足以产生互补于所说模板全部或部分的第一DNA分子的条件下温育该混合物,从而形成含一个或多个重组位点或其部分的第一DNA分子。
38.权利要求37的方法,其中进一步包括在足以产生互补于所说第一DNA分子全部或部分的第二DNA分子的条件下将所说的第一DNA分子与含一个或多个重组位点或其部分的一个或多个引物温育,从而产生含一个或多个重组位点或其部分的双链DNA分子。
39.权利要求38的方法,其中所说的双链DNA分子是线性的。
40.权利要求39的方法,其中所说双链DNA分子包含位于该双链DNA分子一末端或两末端处或附近的一个或多个重组位点或其部分。
41.合成含一个或多个重组位点的一种或多种核酸分子的方法,该方法包括:
(a)获得一种或多种线性核酸分子;及
(b)将所说分子与含一个或多个重组位点或其部分的一个或多个衔
接子在足以将一个或多个所说衔接子添加至该线性核酸分子
一个或多个末端的条件下接触。
42.权利要求41的方法,其中所说的线性核酸分子来自基因组DNA。
43.权利要求4l的方法,其中所说的线性核酸分子来自cDNA。
44.权利要求41的方法,其中所说的线性核酸分子是用机械或酶促技术产生的。
45.权利要求41的方法,其中所说的线性核酸分子是通过用一种或多种限制性内切核酸酶消化一种或多种核酸分子而产生的。
46.将一个或多个重组位点或其部分添加至一种或多种核酸分子上的方法,该方法包括:
(a)将一种或多种核酸分子与含一个或多个重组位点或其部分的一种或多种整合序列接触;和
(b)在足以将该整合序列掺入所说核酸分子的条件下温育该混合物。
47.权利要求46的方法,其中所说的整合序列选自转座子、整合病毒、整合元件、整合子和重组序列。
48.权利要求47的方法,其中所说的整合序列被添加至基因组DNA上。
49.由权利要求1、3、27、37、41和46中任一项的方法生产的产物。
50.权利要求1或3的方法,其中所说的区段是通过化学合成法产生的。
51.权利要求47的方法,其中所说的整合序列被添加至载体上。
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