CN1290306A

CN1290306A - 大处理量试验系统

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Publication number: CN1290306A
Application number: CN98813273A
Authority: CN
Inventors: 史蒂芬·费尔德; 理查德·克利斯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2001-04-04
Anticipated expiration: 2018-12-21
Also published as: JP2009183286A; PL193762B1; IL136862A0; AU1936699A; DE69839373T2; CN1292076C; WO1999032663A2; ATE392485T1; NZ505319A; DE69839373D1; EP1038033B1; CZ20002259A3; KR20010033324A; JP2012090644A; JP2001526904A; CZ302381B6; AU2003234756A1; NO20003115L; PL342898A1; JP2010046072A

Abstract

本发明涉及使用重复的探针列阵同时进行多项、大处理量生物或化学试验的组合物、设备和方法。本发明的组合包括一个表面,其上有多个测试区,其中至少两个,更好的是至少20个,基本相同,每个测试区上是通用锚分子列阵。这些锚分子与双官能接头分子连接,双官能接头分子的一部分对至少一种锚分子具有特异性,另一部分则是对感兴趣的百分制具有特异性的探针。用所得的探针列阵检测一种或多种与探针特异性反应的靶分子是否存在或测试其活性。本发明实施例之一中,测试区(可以是孔)又分为更小的亚区(低凹或浅凹)。本发明实施例之一测定了EST的图谱。另一实施例检测靶核酸的存在:用聚核苷酸片段保护靶分子不被核酸酶消化,然后用质谱分析被保护的聚核苷酸。

Description

大处理量试验系统

本发明要求以下优先权：1997年12月19日的临时申请60／068，291和1998年7月2日的美国专利申请09／109，076，本发明参考了其中内容。

发明背景

本发明涉及使用重复的探针列阵同时进行多项、大处理量生物或化学试验的组合物、设备和方法。有许多区域，各自具有一个通用锚分子列阵。这些锚分子与双官能接头分子连接，双官能接头分子的一部分对至少一种锚分子具有特异性，另一部分是对感兴趣的靶分子具有特异性的探针。用所得探针列阵检测一种或多种与探针特异性反应的靶分子是否存在。根据分子反应性质，本发明涉及多个不同领域，包括但不限于新药开发、分子生物学、生物化学、药物学和医学诊断技术。

许多分子探针排列于表面或“芯片”已被用于许多生物或化学试验。这些试验被用于确定靶分子是否与某种探针反应。探针与靶分子在选定试验条件下接触后，由检测设备测定靶分子是否与给定探针反应。

这类系统可用于多种筛检过程以获取有关探针或靶分子的信息。例如，它们已被用于筛检结合感兴趣的受体的肽或潜性药物；用于筛检样品中是否有种群基因突变、等位变异，或特定的病原或病原株；用于研究基因表达，以鉴定其表达与特定生理状况、发育阶段或疾病状态等相关的mRNA。

发明概述

本发明提供组合物、设备与方法，用于同时进行多项生物或化学试验，并能够进行多样品大处理量分析，所述多样品例如：诊断试验中需筛检的多分患者样品，用药物开发方法进行测试的多种潜性药物或治疗药剂。本发明提供了一种组合，用于检测样品中一种或多种靶分子的存在。该组合包括一个表面，具有许多空间上相互分开的区域，可称之为测试区，并可以是孔形的，至少两个区域基本相同。每个表面具有至少两个，至少20或以上个，这类基本相同的区域，例如至少25、50、96、864或1536个等。每个测试区即一个含(或可能含)一种或多种靶分子的样品引入区，并具有一个生物或化学列阵。(“含靶分子的样品”或“检测样品中的靶分子”不排除不含或没有检测到靶分子的样品或测定(检测意图)。广义的说，本发明涉及用于检测样品是否含靶分子的列阵，不论是否检测到靶分子)。该列阵包含通用“锚分子”，它们各自与双官能分子连接，双官能分子的一部分对锚分子具有特异性，另一部分包含对至少一种靶分子具有特异性的探针。将本发明的组合与含一种或多种靶分子的样品接触，靶分子选择性地与一种(或多种)侦探分子反应，然后接受检测测试区内靶分子与探针之间反应的检测仪的询问，于是产生试验结果。

本发明提供特别用于大处理量生物试验的方法和组合物。在特别优选的实施例中，本发明可用于大处理量筛检以发现新药。例如，可在许多(例如100块)96-孔板上同时进行大处理量试验。每板每孔中，可用约36对锚分子-接头进行(例如)36项测试。即，100块板，每板96孔，每孔36项测试，总共可进行345，000项测试；例如，可同时对9，600种不同候选药物分别进行36项不同参数或试验的检测。大处理量试验比每次只测试一项参数的试验提供更多有关每种药物的信息。例如，能够在一次初步大处理量的筛检试验中测定候选药物是否具有选择性、特异性和／或毒性。非大处理量方法必需许多后继试验来测试每一种感兴趣候选药物的这些参数。实施例15-17描述了几种类型的大处理量筛检试验。能够同时进行多种不同生物试验和一次进行许多试验的能力(即处理量非常大)是本发明非常重要的两项优点。

例如，实施例之一中，使用聚苯乙烯96孔DNA结合板(Corning Costar)，它具有结合伯胺(例如氨基酸或修饰寡核苷酸)的衍生表面，可将36种不同寡核苷酸排布在每板每孔的表面作为锚分子。可将锚分子与衍生聚苯乙烯共价连接，将这相同的36种锚分子用于所有试验。对于任何一种特定试验，可用给定的一组接头分子规划每孔表面，使之对多达36种感兴趣的不同靶分子或试验类型具有特异性，并将不同测试样品加到各板96孔的每一孔。可多次使用同一组锚分子重新规划孔表面用于其他感兴趣的靶分子或试验，或与同组接头一起多次重复使用。上述灵活性和重复使用性是本发明的又一优点。

本发明实施例之一是用于检测样品中一种或多种靶分子的组合，在加入所述样品前，它包括：

a)一个表面，具有多个空间上相互分开的区域，至少两个区域基本相同，每各区域具有：

b)至少8种不同寡核苷酸锚分子，各自连接

c)一个双官能接头，其第一部分对寡核苷酸锚分子具有特异性，第二部分含有对所述靶分子具有特异性的探针。

本发明的另一实施例是用于检测样品中一种或多种靶分子的组合，在加入所述样品前，它包括：

b)至少8种不同锚分子，各自连接

c)一个双官能接头，其第一部分对锚分子具有特异性，第二部分含有对所述靶分子具有特异性的探针。

本发明的另一实施例是检测至少一种靶分子的方法，包括：在所述靶分子与所述组合结合的有效条件下，将可能含靶分子的样品与上述组合接触。另一实施例是一种测定RNA表达方式的方法，包括：在RNA靶分子与探针特异性杂交的有效条件下，将含作为靶分子的至少两种RNA分子的样品与上述组合一起培养，其中组合的至少一种探针是对至少一种RNA靶分子具有特异性(即选择性)的核酸(例如寡核苷酸)。另一实施例是鉴定改变RNA表达方式的试剂(或条件)的方法，即上述测定RNA表达方式的方法，但还包括将所述试剂(或条件)存在下的RNA表达方式与另一组不同条件下的RNA表达方式相比较。

通过实施例，图1和2是本发明的组合，及其用于检测mRNA靶分子的使用方法。如图2所示，本发明的表面有15个相同的区域；在本发明特别优选的实施例中，上述测试区的每个区即微滴板上的一个孔。各测试区有6种不同锚分子，在图中以1-6表示。图1显示一个锚分子，锚分子1，在本发明最佳实施例中，它是一段寡核苷酸。与锚分子1连接的是接头分子，接头分子1，它包括两部分。第一部分对锚分子具有特异性，在该图中即与锚分子特异性杂交的寡核苷酸。第二部分是对感兴趣的靶分子(在此是靶mRNA)具有特异性的探针，该图中即与靶分子杂交的寡核苷酸。虽然图中没有说明，其余5个锚分子分别与各自的接头通过锚-特异性部分连接；各探针具有对(例如)不同于mRNA1的mRNA具有特异性的探针部分。以上说明的组合可同时分析多达15份不同样品，检测是否存在mRNA1(或同时检测有否列阵中其余5个探针所特异性针对的mRNA靶分子)。为了进行试验，在每区或每孔加入少量各种样品，在本实施例中可以是自例如15种不同细胞系之一提取的一种RNA，在探针与靶分子杂交的有效条件下培养。为了确定样品中是否有mRNA1，使用一种检测仪，它能够识别反应方式，和／或询问各区域内特定位置是否存在信号。如果细胞系的培养条件为：它们的mRNA在体内被某标签所标记，又如果样品中有mRNA1，检测器将检测到标记mRNA在由锚分子／探针复合物1决定的位置发出的信号。或者，mRNA可在加至区(或孔)内之前或之后直接体外标记。或者，如图1所示，可在与探针杂交之前或之后间接标记mRNA，即，通过(例如)将RNA与标记过的“侦探”寡核苷酸(靶分子特异性报道寡核苷酸)一起培养，该侦探寡核苷酸与一段不同于探针所识别序列的序列互补。在所示实施例中，可同时分析15份样品。因为用本发明可同时分析至少20或以上份样品，例如多达1536或更多，所以，这是一种非常高效的分析系统。

本文中，“靶分子”指：需要测定其存在、活性和／或量，并对某给定探针具有亲和性的物质。靶分子可以是人造或天然物质。而且，它们可以其本身的样态使用，或与其他物质结合后使用。靶分子可以直接或通过特殊结合物质与结合元件共价或非共价结合。可用于本发明的靶分子例如但不限于：受体(囊泡上的、脂质上的、细胞膜上的或各种其他受体)；与特定受体结合的配体、活化剂或拮抗剂；与特定抗原决定簇(例如病毒、细胞或其他物质)反应的多克隆抗体、单克隆抗体和抗血清；药物；核酸或聚核苷酸(包括mRNA、tRNA、rRNA、寡核苷酸、DNA、病毒RNA或DNA、EST、cDNA、RNA或DNA的PCR扩增产物，和它们的突变、变异或修饰体)；蛋白质(包括例如负责剪切神经递质的酶，蛋白酶，激酶等)；酶的底物；肽；辅因子；凝集素；糖；聚多糖；细胞；细胞膜；细胞器；等，以及其他可能以复合、共价交联等形式存在的其他此类分子或其他物质。本发明中，所谓核酸、聚核苷酸、聚核酸和寡核苷酸可互换。靶分子又称“抗-探针”。

本发明中，“探针”是能够被特定靶分子特异性识别的物质，例如分子。可能的探针／靶分子或靶分子／探针结合方式类型包括：受体／配体；配体／抗配体；核酸(聚核苷酸)相互反应，包括DNA／DNA，DNA／RNA，PNA(肽核酸)／核酸；酶，其他催化剂或其他物质与底物，小分子或效应分子；等。本发明考虑的探针例子包括但不限于有机物、无机物或聚合物，包括金属，螯合剂或其他与金属特异性相互作用的化合物，塑料，细胞膜受体的活化剂和拮抗剂，毒素和毒液，病毒表位，激素(例如阿片样肽，甾体等)，激素受体，脂类(包括磷脂)，肽，酶(例如蛋白酶或激酶)，酶底物，辅因子，药物，凝集素，糖，核酸(包括寡核苷酸，DNA，RNA，PNA或修饰或取代核酸)，寡糖，蛋白质，酶，多克隆和单克隆抗体，单链抗体或其片段。探针聚合物可以呈线性或环状。探针能够根据不同的活性或不同的结合行为区别磷酸化和非磷酸化的蛋白质。凝集素之类探针能够区分不同的糖基化蛋白。本文中，所谓核酸、聚核苷酸、聚核酸和寡核苷酸可互换。上述作为“探针”的物质也可以作为“靶分子”，反之亦然。

任何相容性表面均可与本发明联用。所述表面(通常是固体)可以是任何有机或无机材料或组合材料的，例如塑料，如聚丙烯或聚苯乙烯；陶瓷；硅；(熔融)二氧化硅，石英或玻璃，厚度为(例如)显微镜载玻片或盖玻片；纸张，例如滤纸；重氮化纤维素；硝酸纤维素滤膜；尼龙膜；或聚丙烯酰胺凝胶垫。如果进行试验的方法涉及光学检测，则可使用透光基质。在优选实施例中，所述表面是多孔塑料表面，例如组织培养盘，例如24、96、256、384、864或1536孔板(例如CorningCostar DNA结合板之类修饰板)。锚分子可与表面直接连接(例如结合)，或与一种类型的表面(例如玻璃)结合，后者再与第二表面接触，例如在一微滴板的塑料孔内。表面的形状并不重要。它可以是例如正方、矩形或圆形的平面；曲面；或珠、颗粒、链、沉淀、管、球等体面。

所述表面包括空间上分开、可定址、可鉴定的区域。各区含有一组锚分子。各区如何隔开，它们的物理特征及彼此之间的相互取向并不重要。实施例之一中，各区之间以不透液的物理屏障隔开。例如，一优选实施例中，区域可以是多孔盘(例如组织培养盘)，例如24、96、256、384、864或1536孔板上的孔。或者，可在诸如玻璃表面上蚀刻形成例如864或1536个分开的浅孔。或者，某表面上的各区可以没有分隔或不是孔，例如塑料、玻璃或纸张平面，然后由勾画出分开的各区的覆盖层(例如塑料或玻璃层)界定单独各区。可选的是，在勾画出各区之前，表面上可以已经具有一个或多个锚分子或锚分子通过结合接头分子所成的列阵。另一实施例中，各区内的锚分子列阵之间可利用表面上没有锚分子的空白区，或蜡或聚硅氧烷等化学屏障相互隔开，以防液滴扩散。另一实施例中，所述区域可以是管或液体控制通道，例如用于流动-通过试验的那种，参见Beattie等(1995)，Clin．Chem．4：700-706。表面内或表面上的区域还可以通过表面本身的修饰来界定。例如，一塑料表面可能包括由修饰或衍生塑料制成的各部分，它们可作为加入特定类型聚合物的位置(例如可将PEG连接于聚苯乙烯表面，然后用羧基或氨基、双键、醛等衍生)。或者，塑料表面可具有模塑而成的结构，例如凹凸，这些结构可作为加入锚分子的平台。测试区的相对取向可取以下形式中任何一种，包括但不限于：在正方形或矩形等平面内平行或垂直排列，在圆形等平面内辐射状排列，或线性排列，等等。

本发明空间上分散的各区具有多份拷贝。即，至少有2个，更好的是至少20个、或至少24、50、96、256、384、864、1536或更多个基本相同、空间上分开的区域。增加重复区域的数量可允许更大处理量的试验。本文中，基本相同的区域指具有相同或基本相同的锚分子和／或锚分子／接头复合物列阵的区域。本文中，基本相同的意思是：某列阵或区域在如本发明所述的靶分子分析中将与另一列阵或区域行使基本相同的功能。对功能，即检测靶分子的能力，基本没有影响的差异与小核苷酸缺陷(缺失／插入／取代)或少量缺陷(表面结合不良)等一样，在试验精确度之内，对靶分子检测结果没有显著影响。

当然，本领域技术人员将认识到，并不要求表面上所有区域都基本相同。例如，如果平行检测两组列阵，在同一表面上包括两组列阵可能是有益的。例如，这两组列阵可以交替的条带方式排列，从而有利于它们之间的比较。另一实施例中，实验者可能希望在该表面上包括一个或多个区域，这些区域能以可区别于其他区域的方式得到检测，并因此被用作“注册区域”。例如，一注册区可包含显示出可鉴别性荧光分子的寡核苷酸或肽，这些荧光分子可被扫描仪识别，作为表面上诸区域排列位置对比的“原点”。

对于测试区的大小和物理间距没有限制。典型区域的面积约1-700mm²，约1-40mm²更好，相距约0．5-5mm，间距一般根据相关面积选取。优选实施例中，各区相隔约5mm。例如，各区可具有一个矩形格，例如8行6列，由近圆形锚分子点构成，各点直径100微米，彼此间隔500微米；这样的一个区可占约20mm²。本发明包括更大或更小的区域面积。

还可将各区再分隔，使得同区内部分或所有锚分子靠深凹或浅凹与相邻锚分子物理性隔开。例如，一个区内的次区(亚区)数量可为约10-100，或更多，或更少。实施例之一中，可将1536孔板上的一区(即一孔)再分成更小的孔，例如约4-900，更好的是约16-36孔，由此形成孔内的孔列阵。参见图4。这样的凹孔表面减少了人工将单个锚分子(或锚分子组)放到各设定位置的劳动强度，包含锚分子的区域大小更一致，有助于检测与探针结合的靶分子。

本文中的“锚分子”指各种如下实体或物质(或基本相同的此类物质的“组”，见图7)，例如分子，它与表面结合(例如共价或非共价地固定于或连接于表面)，或者就是表面的一部分(例如塑料表面的衍生部分)，它们能够与本文所述接头或其他物质发生特异性相互作用或结合。本文中，“锚分子／接头复合物”产生于当锚分子与接头通过特异性分子结合而形成组合的时候。与接头的相互作用可以是可逆的，例如通过共价键，或是不可逆的，例如通过核酸杂交。优选实施例中，锚分子是任意长度(例如寡核苷酸)或类型(例如DNA、RNA、PNA或RNA或DNA分子的PCR产物)的核酸。该核酸可以是修饰或取代过的(例如，含肌苷等非天然核苷酸；通过诸如氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、磷酸甲酯、氨基甲酸酯等各种已知键相连；或诸如DNA-链霉亲和素偶联物之类半合成分子，等等)。优选单链核酸。锚分子也可以是肽或蛋白质。例如，它可以是多克隆或单克隆抗体分子或其片段，或单链抗体或其片段，它们与接头的抗原或抗-抗体分子部分特异性结合；反之，锚分子可以是肽，而接头与之结合的部分可以是抗体等。另一实施例中，锚分子可以是对特定糖具有特异性的凝集素(例如伴刀豆蛋白A或鲎、花生、绿豆、赤豆、麦芽等的凝集素)。另一实施例中，锚分子可以是一种有机分子，例如用作寡核苷酸特异性固相化学合成平台的修饰或衍生塑料聚合物。此时，所述衍生塑料可以是分开的、衍生的多位点的列阵，它们在制造过程中共同构成一种组合的表面。另一实施例中，锚分子可利用Ni、Zn、Ca、Mg等金属离子之间，特定蛋白质或螯合剂之间的差异或特异性结合。例如，锚分子可以是聚组氨酸，接头的锚分子特异性部分可以是镍，该锚分子通过镍螯合剂与靶特异性探针连接。或者，锚分子可以是螯合剂，而探针相关部分为聚组氨酸。或者，锚分子可以是无机物。例如，它可以是钙和镁等金属，而接头的锚分子特异性部分则可以是优先性螯合剂，例如EDTA或EGTA，然后与靶特异性探针结合。本领域技术人员将认识到，许多其他类型分子也可作为锚分子，例如就探针和靶分子所论述的那些常见类型分子。

测试区内的锚分子数量至少为2，约8至900(比之多或少也包括再内)更好，约8-300更好，约30-100(例如约64)最好。部分优选实施例中，96个测试区(例如孔)的表面上，每区约16、36、45或100个锚分子，384个测试区(例如孔)的表面上，每区约9、16或25个锚分子。最优选实施例中，测试区的每个锚分子具有不同于列阵内其他锚分子的特异性。然而，两个或多个锚分子可以具有相同的特异性，而且可以所有锚分子都相同。实施例之一中，本发明的组合具有大量测试区(例如约864、1536或更多)，这样就可以一次处理大量测试样品，可能只需要就少数(例如2、4、6或9个)参数对这些样品进行测试。换言之，就具有大量区域的组合而言，可能以每区仅约2-9种锚分子为宜。

区内或区上锚分子的物理间隔和相对取向并不重要。通常，锚分子之间的距离约0．003-5mm或更小，较好的是约0．03-1mm。本发明也包括更大或更小的锚分子间距(和面积)。锚分子彼此之间，或相对于区域边界，可以任意取向排列。例如，它们可以呈两维排列，例如正方形、矩形、六边形等，或呈圆形排列，即锚分子排列成由中心发射的射线或成同心圆。锚分子也可以排列成一维线形列阵。例如，寡核苷酸可与DNA或RNA序列上的特定位置杂交，形成超分子列阵。或者，锚分子可排布成条形码形式(参见图6)。例如，锚分子可排列成彼此平行的线。各线之间的间距或各线宽度规则变化，形成类似条形码的简单可识别样式，例如，第一线和第三线可以是其余线的两倍宽，可以缺省部分线，等等。可在末线之后放一空线以划定一测试区，还可在后继测试区内重复该条形码样式。

锚分子的样式不必与分开的试验孔(测试区)或分开的试验液滴的位置严格对应。“试验部位”将用于表示试验表面上加试验样品的位置。(例如在多孔板上，这可以由分开的试验样品液滴位置，或界定单个试验孔的壁或隔断来界定)。锚分子样式本身(例如，寡核苷酸锚分子的“条形码”样式)通过样式识别作用被用来准确确定分开的各锚分子位于何处，例如条形码的各线根据它与其余线的相对位置而得以识别。因此，第一锚分子不必位于各试验位置的一边或一角。第一锚分子将通过样式识别而不是与试验位置的相对位置被发现。只要各试验部位所用的面积足够大，能容纳至少一个完整的锚分子重复样式单元，则不论样式位于试验区何处，各试验点都将检测该试验部位样品是否含由(条形码)样式所确定的靶分子。

锚分子不必在各测试区内排列成严格或甚至固定的格式。例如，各锚分子可与颗粒、珠等结合，它们在测试区内随机分布。各锚分子的位置可用可检测标签来测定。例如，可用不同荧光性或发光性的标签标记各类锚分子的特异性接头分子，然后可根据接头发出的信号，例如激发或发射光谱，来鉴定包含特定接头／锚分子对的颗粒的位置。本领域技术人员可制备出一组带有各种此类固定标签的接头，各自具有不同的光谱。或者，可以直接标记锚分子。例如，以荧光光谱彼此不同的标签分别标记各种不同类型的锚分子。或者，颗粒和珠粒等彼此可具有不同的大小或形状。本文所述的各种标记和检测方法均可使用。例如，可用基于CCD的成象系统，扫描荧光显微镜或荧光活化细胞分选仪(FACS)来测定荧光。

锚分子的一部分可与接头分子的锚特异性部分相互作用或与之结合。“相互作用”或“结合”在此表示，两种物质或化合物(例如锚分子与接头的锚特异性部位，探针与其靶，或靶与其靶特异性报道物)彼此结合(例如附着、结合、杂交、相连、退火、共价交联，或其他结合方式)，足以另所需的试验得以进行。“特异性的”或“特异性地”表示，没有任何保护技术的条件下，两组分选择性地彼此结合，而且一般不与不希望与被测组分结合的其他组分结合。可按照常规，例如用本领域的常规方法，确定获得特异性相互作用所需的条件。

例如，对核酸而言，本领域技术人员可通过试验确定例如长度、碱基组成，和互补程度等特征，使得在选定严谨性条件下，某核酸(例如寡核苷酸锚分子)能与另一核酸(例如接头的锚特异性部位)杂交，同时与其他物质或分子(例如其他寡核苷酸接头)的非特异性杂交最少。通常，锚分子、接头一部分或侦探寡核苷酸的DNA序列或其他核酸序列与其结合对象具有足够的互补性，使之能在选定严谨性杂交条件下杂交，而且，Tm约比室温高10-20℃(例如约37℃)。通常，寡核苷酸锚分子长约8-50个核苷酸，以15、20、25或30个核苷酸为佳。本发明中，“高严谨性杂交条件”指，核酸间的核苷酸互补性(一致性)至少达95％，更好的是约97％-100％时才发生杂交的条件。然而，根据所需目的，可选择互补性要求较低的杂交条件，例如需90％、85％、75％、50％等互补性的条件。杂交反应参数中可变的是盐浓度、缓冲液、pH、温度、培养时间、甲酰胺等变性剂的量与种类，等等。(参见Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Press，New York；Hames等(1985)，Nucleic AcidHybridization，IL Press；Davis等(1986)，Basic Methods in Molecular Biology，ElsevirScience Publishing，Inc．，New York)。例如，可将核酸(例如接头寡核苷酸)加入测试区(例如多孔板-优选实施例中是一96或384孔或更大的板的孔)：核酸的体积是约0．1-100μl(一优选实施例中是约1-50μl，最好是约40μl)，浓度是约0．01-5μM(优选实施例中是约0．1μM)，所在缓冲液是6X SSPE-T(0．9M NaCl，60mMNaH₂PO₄，6mM EDTA和0．05％Triton X-100)，与结合对象杂交约10分钟至至少3小时(优选实施例中是至少15分钟)，温度是约4-37℃(优选实施例中约为室温)。可选择条件以进行大处理量的试验。本发明实施例之一中，反应条件近似于生理条件。

设计其他类型物质或分子(例如多肽、凝集素，等)作为锚分子或接头一部分，并设计它们与其结合对象发生特异性相互作用所需的反应条件是本领域的一般常规技术(参见，Niemeyer等(1994)，Nucleic Acids Res．22，5530-5539；Fodor等(1996)，美国专利5，510，270；Pirrung等(1992)，美国专利5，143，854)。培养参数包括缓冲液、盐浓度、pH、温度、培养时间、有否载体和／或降低非特异性相互作用的试剂或条件等。例如，可向含抗体锚分子的测试区(例如，优选实施例中多孔板，即96或384孔或更大的板上的一个孔)，加入约0．1-100μl或以上(优选实施例中是约1-50μl，最好约40μl)抗-抗体(例如抗原或抗体特异性二级抗体)，浓度约为10pM-10nM(优选实施例中约为1nM)，所在缓冲液可例如6X SSPE-T，PBS或生理盐水，与表面上的锚分子一起在约4-45℃(优选实施例中是约4℃)培养约10分钟至3小时(优选实施例中是至少约15分钟)。肽锚分子以长约5至20个氨基酸的为佳。

在本发明部分实施例中，在选定反应条件下，列阵中的每个锚分子与各自对应接头的锚特异性部位相互作用，程度彼此基本相同。这能确保由锚分子特定一基本均一的接头列阵，由此得到基本均一的探针列阵。

一个测试区内的锚分子可以是一个“通用”组，其中每个锚分子能与一种以上不同接头相互作用，所述的不同接头具有一个对此类锚分子特异性的部位但带着不同的“探针”部分；这样，单一的通用锚分子列阵可用来规划或定义一组不同的探针。有关这类通用锚分子列阵的灵活性可参见图1和图2。图2显示一个有15个测试区的表面，每个测试区有一个6种不同锚分子组成的列阵，在该实施例中，这些锚分子是寡核苷酸。图1显示了上述(寡核苷酸)锚分子中的一个，即锚分子1，它与接头1接触，接头1包含一个锚分子1的特异性部位和对mRNA靶1具有特异性的第二部位。或者，可换以接头2，它和接头1一样有个对锚分子1的特异性部位，但它的第二部位对mRNA靶2而不是mRNA1具有特异性。这样，锚分子1可用来指定(或规划、或定义或确定)针对两种或更多种不同mRNA靶中任一种的探针。产生和固定寡核苷酸或肽的高分辨格式(列阵)的过程昂贵、费时而且／或费力。能用预制锚分子列阵来规划大量探针列阵是本发明的优点之一。

虽然图2中的通用锚分子定义了一个寡核苷酸探针格式，该锚分子列阵也可用来规划其他探针列阵，例如受体蛋白列阵(见图3)。显然，因为锚分子／接头相互作用的类型很多，所以可有许多种排列，例如，甚至可形成更复杂的多层“夹心”或“分层”探针，例如蛋白质／抗体组合。因此，本发明锚分子表面本身提供了一个新的优点。

本发明实施例之一中，锚分子与接头发生可逆相互作用；这样，一组通用探针就可重复使用，以规划不同的探针组。例如，可通过加热分离两寡核苷酸将寡核苷酸锚分子与接头的寡核苷酸部分分离，然后再与第二种接头结合。锚分子列阵的制作昂贵、费时而且／或费力，所以，能够重复使用是本发明又一优点。

锚分子不一定要与接头相互作用。例如，锚分子可与例如荧光素的可测分子偶联(直接或间接)，因而可在一格网中进行定位，以记录测试表面与探测剂之间的对应关系。或者，锚分子可用已知量可测分子标记，作为内部定量标志，用于标定。

“接头”在此指一种双官能物质，具有一个对选定(指定)锚分子或锚分子亚组具有特异性的(“锚特异性”)第一部位，和对感兴趣的靶分子具有特异性的(“靶特异性”)第二部位。接头的这两部分可通过共价或非共价键相连，可以直接相连也可以通过中间体相连。

当然，接头锚特异性部位的化学性质与作为其反应对象的锚分子相关。例如，如果锚分子是寡核苷酸，与之反应的接头的这一部分可以是例如特异性结合该寡核苷酸的肽，或在选定严谨性杂交条件下与之有效且特异性杂交的核酸。所述核酸可以是例如寡核苷酸，DNA，RNA，PNA，PCR产物，或取代或修饰核酸(例如，含肌苷之类非天然核苷酸；通过诸如氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、磷酸甲酯、氨基甲酸酯等各种已知键相连；或诸如DNA-链霉亲和素偶联物之类半合成分子，等等)。优选单链核酸。对寡核苷酸锚分子具有特异性的接头的这一部分长度约为8-50个核苷酸，约15、20、25或30个则更好。如果锚分子是抗体，与之反应的接头的这一部分可以是，例如，能与锚分子特异性相互作用的抗-抗体，抗原，或它们的小片段。与前文所述其他类型锚分子特异性相互作用并可作为接头锚特异性部分的物质或分子是本领域所熟知的，可用常规方法进行设计(参见前文)。

当然，接头靶特异性部位的化学性质与作为其反应对象的靶分子相关。例如，如果靶分子是一种特定mRNA，则接头的靶特异性部位可以是，例如，在选定杂交条件下与该靶分子特异性结合但不结合干扰性RNA或DNA的寡核苷酸。本领域技术人员可用本领域公知的方法实验确定与靶分子结合最佳、与非特异性干扰DNA或RNA反应最弱的寡核苷酸特征(参见前文)。通常，用来在大量非靶RNA背景中分辨靶mRNA的寡核苷酸探针长度约为8-50个核苷酸，约18、20、22或25个更好。背景竞争性靶分子不多的生化试验所用的寡核苷酸探针可以略短。用本领域公知的方法(例如BLAST程序)，可从已知基因库中挑选出如下寡核苷酸探针序列：它们彼此不相关，与可能性干扰序列不相似。可用本领域公知的方法常规选定使得寡核苷酸探针与某种RNA特异性杂交的杂交条件(例如，参见前文)。例如，可将靶RNA(例如，任意容器，例如多孔(如96或384或更多孔)微滴板上孔内的、抽提自培养组织或细胞的总RNA或mRNA(最好用感兴趣的试剂加以处理))加入含寡核苷酸探针列阵的测试区，所述探针在诸如6X SSPE-T或其他缓冲液中，还可以含有降低非特异性结合的试剂(例如约0．5mg／ml降解鲱鱼或鲑鱼卵DNA，或酵母RNA)，在经验温度培养约10分钟至至少18小时(优选实施例中是约3小时)。杂交严谨性可与分离锚分子与接头锚特异性部位所用严谨性相同，或略低。如前所述，设计和使用其他类型探针也是本领域的常规技术。

接头的锚特异性部位与靶特异性部位可通过多种共价或非共价键相连，键的性质对本发明不重要。这两部分可直接相连或通过一中间分子相连。实施例之一中，它们都是寡核苷酸，通过诸如磷酸二酯键的共价键相连，形成一单一、共线核酸。另一实施例中，锚特异性部位是寡核苷酸，靶特异性部位是受体(例如受体蛋白)，这两部分可通过生物素与链霉亲和素的相互作用相连，例如图3所示。所述连接的许多变化形式是已知的(例如，参见Niemeyer等(1994)，NAR22，5530-5539)。或者，两部分可直接相连，例如可将寡核苷酸酰胺化后通过酰胺键与肽或蛋白质直接相连，或通过酰胺键或脂性附着与膜组分相连。形成上述共价或非共价键的方法是常规的，本领域技术人员可方便地加以优化。

两物质结合(例如，通过两核酸，两蛋白质，蛋白质加核酸，等，的培养)成复合物后(例如，锚分子／接头复合物)，可对所得复合物加以处理以去除非结合物质(例如接头)，所用条件凭经验来确定，以保全特异性相互作用，而去除非特异性结合物质。例如，可在与获得该复合物(例如，锚分子／接头复合物)所用相同或更高严谨性条件下，洗涤反应混合物1至10次，或更多次。

本发明的组合可用常规技术来制造。

可用于本发明的某些表面可方便地从供应商处获得。优选实施例中，所述表面是96、384或1536孔微滴板，例如Corning Costar出售的修饰微滴板。或者，可如下制备表面上含孔，孔内又含凹陷的表面：先将铝或钢等材料微切削成模，然后将塑料或类似材料微注入模中，形成图4所示结构。或者，可用图5的三片结构组装成由玻璃、塑料、陶瓷等材料构成的图4结构：第一部分称为分隔片(图5a)，将形成样品孔之间的隔断；第二部分，称为亚分割片(图5b)，将形成每个测试孔内的亚区或浅凹；笫三部分，称为底板(图5c)，将形成测试板的底部和测试孔的下表面。分隔片可以(例如)聚硅氧烷为材料，布满了孔，这样，当三片组合时，每个孔形成测试孔的壁。亚分割片可以是(例如)聚硅氧烷薄片，呈筛网状。底板可以是一玻璃平片，可以是，例如，生化试验常用微滴板底部的形状。底板的上表面可以是平的，如图5c所示，或可形成与亚分割片对齐的凹陷，提供每个样品孔内的完全亚分割。可用标准方法，例如硅片组装所用的方法，将这三片结构结合。

寡核苷酸锚分子、接头部分或探测剂可用常规技术来合成，例如用市售寡核苷酸合成仪和／或将已合成片段连接起来。本发明实施例之一中，功能性核酸锚分子，例如寡核苷酸锚分子，可用各种常规技术定位在测试区表面之上或之内，所述技术包括光刻或丝网化学附着，喷墨沉积，毛细管技术，网状或液体通道芯片，用电极列阵进行的电化学刻画，针或刺触碰，或变性后通过烘烤或UV辐照印到滤膜上(参见，Rava等，(1996)，美国专利5，545，531；Fodor等(1996)，美国专利5，510，270；Zanzucchi等(1997)，美国专利5，643，738；Bernnan(1995)，美国专利5，474，796；PCT WO92／10092；PCT WO90／15070)。可将锚分子置于测试区表面之上，或者，例如在聚丙烯酰胺凝胶垫中，锚分子植入表面，其一部分突出表面外与接头反应。优选实施例中，用一游离氨基衍生功能性寡核苷酸锚分子的5’末端；在诸如50mM磷酸盐，pH8．5缓冲液加1mM EDTA中稀释至经验浓度(例如1μM)；用Pixus纳升喷射分散器(Cartesian Technologies)以约10．4nl液滴的形式分布到一测试孔的特定位置上，该测试孔的上表面是新鲜干燥的DNA结合板(Corning Costar)。根据寡核苷酸固着和蒸发的相对速度，可能需要在制备过程中控制测试孔内的湿度。另一实施例中，可用常规方法直接在测试区表面上合成寡核苷酸锚分子，所述方法例如寡核苷酸链延伸的光激活去保护(例如，联用以定点“屏蔽”)，或用纳升喷射分散器格式化分散去活化化合物的纳升液滴。可将有待获取的核苷酸的全部延伸序列去保护，然后将此核苷酸遍加于表面。

肽、蛋白质、凝集素、螯合剂、塑料及其他类型锚分子或接头部分也可以用常规方法得到，并用合适的技术将锚分子定位在表面之上或之内(参见。Fodor等(1996)，美国专利5，510，270；Pirrung等(1992)，美国专利5，143，854；Zanzucchi等(1997)，美国专利5，643，738；Lowe等(1985)，美国专利4，562，157；Niemeyer等(1994)，NAR22，5530-5539)。

本发明部分实施例中，所述组合被用于多种筛检过程和／或获取有关探针或靶分子的含量、活性或结构的信息。这类试验称为多列阵板式筛检(MAPS)法或试验，此类试验所用、包含锚分子或锚分子加探针列阵的表面称为MAPS列阵或MAPS板。

反应混合物的组分、试验或筛检过程可以任意次序组合。例如，可依次将锚分子、接头和靶分子组装起来；或在有或没有报道物的条件下，在溶液中将靶分子与接头相组装，然后与锚分子接触。

本发明实施例之一涉及检测至少一种靶分子的方法，该方法包括：

a)在获得所述靶分子与所述接头第一杂交产物的有效条件下，将可能含所述靶分子的样品与双官能接头接触，所述接头的第一部位对寡核苷酸锚分子具有特异性，其第二部位包含对所述靶分子具有特异性的探针；

b)在获得所述第一杂交产物与所述组合之间第二杂交产物的有效条件下，将所述第一杂交产物与所述组合接触，在加入所述第一杂交产物之前，所述组合具有：

1)一个表面，包含多个空间上分散的区域，至少两个区域基本相同，每个区域包含

2)至少8种不同的寡核苷酸锚分子，

c)将所述第一杂交产物或所述第二杂交产物与标记过的检测探针接触；

d)检测所述检测探针。

以下试验或方法都可以大处理量地进行，即，在每一测试板或表面上迅速地同时分析大量样品(多达约864、1036、1536、2050或更多，这取决于组合中测试区的数量)。而且，许多板或表面可同时进行试验。例如，在药物开发方法中，可将大量含候选药物(例如大量化学物质组合文库，如小分子、肽、寡核苷酸等物质的变体)的样品加到组合中分开的各区，或先加至生物或生化样品中，然后加到组合中分开的各区，与区内的探针列阵一起培养；得以对每份样品进行分析。随着目前高密度微滴板，DNA点植工具，在更高密度微滴板上产生和收集数据的激光技术等方法，机器人，改进型分散器，完备的检测系统和数据处理软件的开发与问世，用本发明方法，每日可筛检数以万计的化合物。

例如，在以寡核苷酸为探针的实施例中，所述试验可以是用诊断性核酸或聚核苷酸筛检(例如，结合试验或其他)大量样品中有否遗传变异或缺陷(例如，与诸如囊性纤维化等疾病相关的多态性或特殊突变。参见，例如，Iitia等(1992)Molecular and Cellular Probes 6：505-512)；病原体(例如细菌、病毒、原虫，它们的宿主是人等动物或植物)，或指示特定生理状态或疾病的mRNA转录模式。包含部分EST(包括全长拷贝)的核酸探针列阵可用来测评EST源细胞(或其他细胞)产生的转录模式。核酸探针还可检测域特定核酸序列特异性结合的肽、蛋白质或蛋白质的结构域(反之亦然)。

在另一实施例中，本发明的组合可用于监测生化反应，诸如蛋白质、核酸、小分子等之间的相互作用-例如监测抗原与抗体之间，受体(例如纯化受体或结合于细胞膜的受体)与其配体、活化剂或拮抗剂之间，或酶(例如蛋白酶或激酶)与其底物之间相互作用的效率或特异性，或监测底物向产物转化量的升高或降低，等等。上述生化试验可用于描述探针或靶分子的特征，或作为筛检试验的基础。例如，为了筛检样品中有否特定的蛋白酶(例如参与凝血的蛋白酶，例如蛋白酶Xa和VIIa)，可在如下组合上分析样品，即，组合中的探针是对各种感兴趣的蛋白酶具有特异性的荧光性物质。如果靶蛋白酶结合并切割底物，通常，因为两能量转移对之间的切割分离，底物将发出荧光，于是可测得信号。另一实施例中，为了筛检样品中有否特定的激酶(例如，Src，酪氨酸激酶或ZAP70)，可在以下组合上分析含一种或多种感兴趣激酶的样品，即组合中的探针是可被感兴趣激酶之一选择性磷酸化的肽。使用本领域公知、可按常规确定的条件，可在合适的缓冲液中，将样品与底物列阵及辅因子一起培养一段经验时间(在某些试验中，例如在研究调节感兴趣激酶活性的因素的生化试验中，可以调节各种激酶的浓度，使得每种底物的磷酸化速度相近)。可在经验确定的条件下处理(例如洗涤)反应物以去除激酶和不需要的反应组分，然后可如下检测被磷酸化的底物，例如，与荧光标记的抗磷酸酪氨酸或抗磷酸丝氨酸抗体(例如，浓度约10nM左右)等可测试剂一起培养，于是可测到信号。另一实施例是进行结合试验。例如，可在合适的磷酸化肽探针列阵上分析诸如GRB2 SH2或ZAP70 SH2等SH2结构域；或在特定受体探针列阵上筛检血清有否免疫缺陷。此外，还可以以此类列阵方式进行酶联试验。本发明的组合还可用于检测活性高于或低于相应野生型的突变酶；或筛检除草剂或杀虫剂等药剂。

当然，可用MAPS试验测定样品中活性靶分子的含量，条件是探针不被完全占满，即，不超过90％的探针被靶分子结合(或与之反应或杂交)。在此条件下，得以定量靶分子是因为靶分子越多则被结合的探针越多。另一方面，如果90％以上的探针被结合，所含靶分子的增加不显著增加与探针结合的靶分子。前述各种类型的靶分子均可以这种方式定量。例如，实施例6描述了寡核苷酸靶分子的定量。而且，它还显示，即使靶分子大大过量(例如，含量大到令MAPS探针列阵上所有可反应探针被饱和)，通过向结合混合物加入已知量的非标记靶分子，就可以“使反应灵敏度迁移”，从而得以定量如此大量的靶分子。

另一实施例中，可用本发明的组合筛检调节靶分子与给定探针之间相互作用的试剂。一种试剂可能通过与探针、靶分子或靶分子与探针所成复合物直接或间接相互作用而调节靶分子／探针之间的相互作用。所述调节有多种形式，包括但不限于：提高或降低靶分子对探针的亲和力，提高或降低靶分子与探针结合的速度，竞争性或非竞争性地抑制探针与靶分子的结合，或有时，提高或降低探针或靶分子的活性，而这种活性则导致探针／靶分子之间相互作用的增强或减弱。这类试剂可以是人造或天然物质。此外，这类试剂可以其本来状态或与其他物质形成的聚合体被使用；它们能共价或非共价、直接或通过一特定的结合性物质与结合元件连接。例如，为了鉴定“血液稀释剂”或与致凝血蛋白酶级联成员之一反应的药剂，可用许多候选药物测试感兴趣的蛋白酶的混合物，然后如前所述测定活性。本发明还可用于测定许多其他药剂，包括除草剂和杀虫剂。实施例16和17描述了关于选择性抑制特定激酶的药剂，或关于选择性抑制剂SH2结构域与磷酸化肽之间相互作用的药剂的大处理量试验。

另一实施例中，本发明的组合可用于筛检改变基因表达模式的试剂。可用寡核苷酸列阵鉴定某些mRNA，它们从一组基因进行表达的方式与特定的生理状态或发育阶段，或与疾病状态相关(“相关性”基因、RNA或表达模式)。“相关”或“相关性”表示RNA的合成方式与细胞的生理状况相关，而不一定表示给定RNA的表达负责或导致特定的生理状态。例如，可鉴定这样一个小mRNA亚组，它们在细胞内被表达，受到正调和／或负调，因此作为特定疾病状态的模型；这种被改变的表达方式与不表现出病理表型的正常细胞内的表达方式相比，就可作为病态的标志(“指示”基因、RNA或表达模式)。“相关性”与“标志”两词可互换使用。例如，经肉豆蔻酸佛波酯等肿瘤促进剂处理的细胞可能表现出类似肿瘤生长早期所见的基因表达模式。在另一种癌症模型中，小鼠胰腺瘤细胞(细胞系TGP61)被腺病毒感染时，表现出c-Jun和MIP-2表达增加，而诸如GAPDH和L32等管家基因的表达则基本不受影响。

接触疾病模型细胞后直接或间接，体内或体外(或在组织培养物中)改变标志表达模式的实际可作为患该病的生物体(例如，人或其他动物，或植物)的治疗剂或药物。试剂还可能通过直接接触核酸而改变表达模式，例如在体外(试管)表达系统中。本文中，“改变”表示引起参与可测知反应的分子等物质的量和／或活性的增加或减少。本发明的组合可用于筛检此类试剂。例如，可将一系列细胞(例如来自疾病模型)与一系列试剂接触(例如，接触约10分钟至约48小时，或更久)，并用常规公知方法(例如市售试剂盒)抽提总RNA或mRNA。如果需要扩增RNA，可用诸如RT-PCR扩增等标准方法(参见，Innis等(1996)，PCR Protocols：A Guideto Methods in Amplification，Academic Press，New York)。可让抽提物(或其扩增产物)与大量基本相同的列阵接触(例如一起培养)，所述列阵包含针对相应标志RNA的探针，于是可鉴定出与标志表达模式改变相关的试剂。实施例15描述了一个大处理量的试验，用于筛检可能改变病态相关基因表达模式的化合物。

同样，也可鉴定改变与特定生理状态或发育阶段相关的表达模式的试剂。此类试剂可以是人造或天然物质，包括环境因素，例如参与胚胎发育或调节生理反应的物质，或重要的农用物质例如除草剂或杀虫剂。此外，这类试剂可以其本来状态或与其他物质形成的聚合体被使用；它们能共价或非共价、直接或通过一特定的结合性物质与结合元件连接。

本发明的另一实施例是一种试剂盒，用于在样品中检测至少一种靶分子，它包括：

a)一个表面，具有许多分散的区域，至少两个区域基本相同，每区至少有8种不同的锚分子(寡核苷酸，或本文所述的任意一种)，

b)一个容器，含至少一种双官能分子，它的第一部位对至少一种锚分子具有特异性，第二部位包含对至少一种所述靶分子具有特异性的探针。

实施例之一中，提供以上a)中所述的表面和一组说明书，说明如何将至少一种所述锚分子与双官能接头分钟相连，所述接头分子具有对至少一种锚分子具有特异性的第一部位和含对至少一种所述靶分子具有特异性的探针的第二部位。说明书还包括，例如，表面上每种锚分子的描述，锚分子数量及其所在位置的说明，以及将接头与锚分子特异性相连(缔合或结合)的方案。例如，如果锚分子是寡核苷酸，说明书包括每种锚分子的序列，供操作者籍此设计出接头上与之互补的锚特异性部位，以便与该锚分子特异性相互作用(例如与之杂交)；如果锚分子是肽，说明书将提供有关，例如，与该肽特异性相互作用的抗体的信息。说明书可能还包括将锚分子与接头结合的方案，例如杂交(或其他结合类型)的条件和试剂，例如温度和培养时间，去除不结合分子(例如洗涤)的条件和试剂，等等。此外，说明书可能包括有关构造和使用本文所述各种对照接头的信息，和用本发明组合进行的定量、校准、“微调”或标定试验等方法的信息。说明书可包括任何本申请所揭示的参数、条件或实施方式，这些都可以由本领域技术人员用常规方法进行。

如本发明其他部分所述，操作者可在本发明表面上固定一个或多个给定的锚分子列阵，多种接头，由此形成多种探针列阵。而且，操作者可以从本发明表面去除任意一组给定接头而加上另一组(与第一组相同或不同)，使得给定表面可重复使用多次。这种灵活性和可重复使用性也是本发明的优点。

另一实施例中，本发明的组合可用于绘制EST图谱(被表达序列标签)。即，可用MAPS试验确定一组EST中哪些(如果有)来自同基因的不同(或部分重叠)部分，哪写(如果有)是独特的。图18，19，20和21显示这样一个试验，该实施例中的试验是测定16种EST中哪些(如果有)与一共同基因“连锁”。该试验(图18)的第一步，组装以下列阵：其中，有待定位的每种EST由至少一个与之对应的寡核苷酸探针代表。数量等于(或大于)有待定位的EST的列阵分布于表面上分散的各区(例如孔)；在所示实施例中，组合的表面有16个孔，各含一个由16种不同EST-特异性寡核苷酸(编号1-16)组成的列阵。“对应于”一种EST(即“EST-特异性”)的寡核苷酸对该EST的互补性足以使该寡核苷酸在选定严谨性条件下特异性地与该EST杂交，而不与其他不相关的EST杂交。这种对应于一种EST的寡核苷酸能与编码或非编码cDNA链，或与mRNA(在最适条件下)特异性结合，所述cDNA和所述mRNA是由EST源基因合成的。本发明的其他部分讨论了为获得特异性杂交，设计寡核苷酸时所要考虑的因素和需要优化的杂交参数。为了组装列阵，制备接头分子，各自具有对通用列阵锚分子具有特异性的部分和包含对应于有待定位的EST之一的寡核苷酸探针的部分；接头，如本发明其他部分所述，与锚分子相连。下一步，取一等份含核酸(例如，mRNA或单链或变性cDNA)混合物的样品，其中可能含与一种或多种寡核苷酸探针互补的序列，将其加至含探针列阵的各区(孔)；然后，在常规确定的最适条件下培养混合物，从而允许核酸与互补探针结合。如果数种EST特异性探针与一种核酸的不同部分互补，该核酸将与列阵中这些探针各自所在位置结合。

下一步，将不同的侦探寡核苷酸(所示实施例中即1-16号标志)加至各区(孔)(见图19)。侦探寡核苷酸被设计成针对有待定位的各EST。各EST特异性侦探而不是探针寡核苷酸对应于EST的不同(至少部分不重合)部分，这样，探针与侦探寡核苷酸就不会相互干扰。例如，以图21所示的EST为例，它们对应于图18-20中的EST1、2和6。图21显示，EST1和2都来自X基因(它们是“连锁的”)，EST6则来自另一不相关的基因。如果含mRNA混合物(其中包括来自X基因的)的样品等份与图18-20所示探针列阵一起培养，在最适条件下，X基因的mRNA将在探针1和2位杂交，而不会在探针6位杂交。(当然，加入的每种mRNA的摩尔量都必需过量于它可杂交探针的总数)。如果将侦探寡核苷酸1加至测试区(孔)1，它将与结合于探针列阵1和2位的X基因的mRNA杂交，而不会在6位杂交。同样，如果在另一孔-例如2号孔-加入侦探寡核苷酸2，它也将在1和2位结合，而不会在6位。以此方式，能够大处理量地确定哪些EST是连锁的，即，编码同基因的不同部分，哪些EST是独特的。对于图20所示的假设实施例，头3个EST编码同一基因的不同部分，末5个EST编码另一基因的不同部分，其余EST则似乎不连锁。本发明其他部分结合其他MAPS试验讨论了杂交条件，最适洗涤步骤，检测方法，等等。为了证实MAPS试验得到的连锁信息，可以用EST-特异性寡核苷酸探针对作为有义和反义引物进行PCR反应。每组连锁EST将产生一种PCR产物。注意，该配对PCR测试可直接用来确定连锁性，而不需要使用连锁MAPS试验；然而，这需要许多反应，必需合成每个EST引物作为有义和反义链。对所示实施例来说，这需要180个此类反应。

本发明一方面内容涉及测定大量EST中哪些与一给定核酸互补的方法，它包括：

a)固定化的寡核苷酸探针列阵与含给定核酸测试样品一起培养，至少列阵中探针之一对应于各所述EST，从而获得所述寡核苷酸探针与所述核酸之间的杂交产物，

b)所述杂交产物与侦探寡核苷酸一起培养，该侦探寡核苷酸对应于所述寡核苷酸探针之一所对应的EST，但它与所述寡核苷酸探针分别对该EST的不同部分具有特异性，

c)检测所述列阵中哪些寡核苷酸探针被所述侦探探针标记，

其中，所述寡核苷酸探针列阵被固定在组合的一个区域，所述组合包括：

1)一个表面，具有与所研究EST等量、空间上分散的、基本相同的区域，各区包含：

2)与所研究EST等量的不同锚分子，各锚分子与以下物质结合：

3)双官能接头，所含第一部分对锚分子具有特异性，所含第二部分包含对应于至少一种所述EST的寡核苷酸探针。

本发明还涉及以上所述方法，其中，一种或多种所述EST可能与所述核酸互补，各所述EST含两段不同的寡核苷酸序列，第一段定义一个对应于所述EST的探针，第二段定义一个对应于所述EST的侦探寡核苷酸，该方法包括：

a)含所述核酸分子的样品与组合中至少一个区接触，所述区具有寡核苷酸探针列阵，至少其中之一对应于各所述EST，

b)所述样品与所述区域一起培养，从而令所述核酸分子与EST对应性寡核苷酸探针结合，所述探针与所述核酸的一部分互补，

c)所述区域与侦探寡核苷酸一起培养，所述区含有与一种或多种所述EST对应性寡核苷酸探针结合的核酸分子，所述侦探寡核苷酸对应于所述列阵中所述给定寡核苷酸探针之一所对应的EST，由此令侦探寡核苷酸与核酸分子结合，该核酸分子已经与所述给定寡核苷酸探针或与所述核酸互补的其他寡核苷酸探针相结合，

d)检测所述侦探寡核苷酸，从而鉴定所述列阵中哪些EST对应性寡核苷酸探针与核酸上结合所述给定EST对应性寡核苷酸探针的部分互补，进而鉴定哪些EST与所述核酸互补，其中，所述寡核苷酸探针列阵固定在组合的一个区域内，所述组合包括：

EST定位试验的各部分可以任意顺序组合。例如，可顺次组装锚分子、接头和EST；或者在有或没有报道物的条件下，在溶液中连接接头与EST，然后加入锚分子中。

本发明另一方面内容涉及测定大量EST中哪些与给定核酸互补的方法，它包括：

a)将一组双官能寡核苷酸接头分子与可能含给定核酸的测试样品一起培养，以获得所述寡核苷酸探针与所述核酸之间的第一杂交产物，所述接头分子各自的第一部分对应于至少一种所述EST的探针，第二部分对锚分子寡核苷酸具有特异性，

b)将所述第一杂交产物与一固定寡核苷酸锚列阵一起培养，以形成包含所述锚分子、所述寡核苷酸探针和所述核酸的第二杂交产物，其中，各寡核苷酸锚对应于至少所述接头分子之一的锚特异性部分，

c)将所述第一杂交产物或第二杂交产物与侦探寡核苷酸一起培养，所述侦探寡核苷酸对应于所述寡核苷酸探针之一所对应的EST，但它与寡核苷酸探针对EST上不同部位具有特异性，

d)检测哪些寡核苷酸探针被所述侦探寡核苷酸所标记，

其中，所述寡核苷酸锚固定在组合的一个区域上，所述组合包括：

2)与所研究EST等量的不同锚分子。

当然，上述定位EST的方法可用于确定测试序列(例如聚核苷酸)在任意感兴趣核酸上的位置。例如，可以确定两种或更多克隆DNA片段或cDNA是否属于同一基因组DNA。该方法有助于阐明复杂长基因的结构。以类似的方式，可确定一段或多段切出序列或编码序列是否属于同一基因组DNA。这样的测定可用于，例如，诊断试验，区分以差异剪接为特征的正常与病态。定位方法的其他应用是本领域技术人员所熟悉的。

本发明另一方面内容涉及一种测定大量聚核苷酸中哪些与给定核酸互补的方法，

其中，可能一种或多种所述聚核苷酸与所述核酸互补，各所述聚核苷酸包含两段不同的寡核苷酸序列，第一段定义一个对应于所述聚核苷酸的寡核苷酸探针，第二段定义一个对应于所述聚核苷酸的侦探寡核苷酸，该方法包括：

a)将含有所述核酸分子的样品与组合中至少一个区接触，所述区具有一个寡核苷酸探针列阵，至少探针之一对应于各所述聚核苷酸，

b)将所述样品与所述区域一起培养，令所述核酸分子与所述聚核苷酸对应性寡核苷酸探针结合，所述探针与所述核酸的一部分互补，

c)将所述区域与侦探寡核苷酸一起培养，以令侦探寡核苷酸与核酸分子结合，所述区域具有与一种或多种所述聚核苷酸对应性寡核苷酸探针结合的所述核酸，所述侦探寡核苷酸对应于给定寡核苷酸探针所对应的聚核苷酸，所述核酸分子已经与所述给定寡核苷酸探针或与所述核酸互补的其他寡核苷酸探针相结合，

d)检测所述侦探寡核苷酸，从而鉴定所述列阵中哪些聚核苷酸对应性寡核苷酸探针与核酸的一部分互补，所述核酸分子能与聚核苷酸对应性给定寡核苷酸探针结合，从而鉴定哪些聚核苷酸与所述给定核酸互补，

其中，所述寡核苷酸探针列阵固定在组合的一区域上，所述组合包括：

1)一个表面，具有与所研究聚核苷酸等量、空间上分散的、基本相同的区域，各区包含：

2)与所研究聚核苷酸等量的不同锚分子，各锚分子与以下物质结合：

3)双官能接头，所含第一部分对锚分子具有特异性，所含第二部分包含对应于至少一种所述聚核苷酸的寡核苷酸探针。

在本发明另一方面内容中，上述定位EST或其他聚核苷酸的方法还包括在步骤之间去除样品中不结合的部分。

在本发明另一实施例中，一种或多种感兴趣的RNA靶(例如mRNA或其他类型RNA)通过逆转录被转化成cDNA，然后将这些cDNA与探针列阵杂交。图8显示这类试验。如本文所述，由细胞或组织制备RNA抽提物(或纯化mRNA)。然后向RNA样品中加入对感兴趣的RNA具有特异性的逆转录酶和寡核苷酸引物，用可常规确定并优化的公知方法或过程生产cDNA第一链。“特异性”引物指，与感兴趣的mRNA的互补性足以在选定严谨性杂交条件下与之结合，并为逆转录酶所识别，但不与杂核酸结合(参见有关获得特异性杂交的适宜反应条件的论述)。残留RNA-不被特异性引物所识别的mRNA和／或RNA抽提物中其他污染性RNA(例如tRNA或rRAN)-可用多种核糖核酸酶或化学方法去除，例如碱处理，只留下将与MAPS列阵接触的单链cDNA。该方法因使用逆转录酶而不必大量处理RNA，RNA对核酸酶很敏感，因而很难处理。而且，特异性逆转录引物所增加的特异性为本发明又增加了一个特异性层次。

或者，可在与探针列阵杂交前先扩增上述cDNA，以增加信号强度。上述寡核苷酸逆转录酶引物其5’端可含成为RNA聚合酶(例如T7、T3或SP2聚合酶，等)特定起始位点的序列(可长约22-27个核苷酸)。图8所示实施例中，逆转录酶引物中加入的是T7启动子序列。向cDNA中增加聚合酶识别位点，可作为多轮转录中相应RNA聚合酶的识别位点(例如体外转录，即IVT)。可选的是，可用PCR及合适的引物进一步扩增由此产生的mRNA或cDNA本身。转录和PCR的过程是本领域所熟悉的。

上述方法先用逆转录酶将mRNA靶转化为cDNA，然后在MAPS板上分析，该方法可取代标准MAPS试验用于前文所述各种以RNA为基础的试验。

本发明另一实施例中，一种或多种感兴趣的核酸靶与特定的聚核苷酸保护片段杂交，然后进行核酸酶保护过程，并在MAPS板上分析与感兴趣的靶杂交的保护片段。如果感兴趣的靶是RNA而保护片段是DNA，核酸酶保护／MAPS试验(NPA-MAPS)可减少处理RNA的需要，RNA因极易被污染性核酸酶降解而很难处理。在这样的NPA-MAPS试验中，探针列阵中的探针与感兴趣的靶核酸具有相同的链型，而不是象在标准MAPS试验中那样与它们互补。图9显示了一个NPA-MAPS试验的实施例。

NPA-MAPS试验中，感兴趣的靶可以是各种核酸，例如基因组DNA、cDNA、病毒RNA或DNA，rRNA、tRNA、mRNA、寡核苷酸、核酸片段、修饰核酸、合成核酸等。本发明优选实施例中，该方法被用于分析存在于组织或细胞RNA抽提物的一种或多种mRNA。先在选定严谨性杂交条件(参见前文有关获得特异性杂交的适宜反应条件的论述)下将含感兴趣靶的样品与一种或多种保护片段杂交。保护片段即一段聚核苷酸，它可以是例如RNA、DNA(包括PCR产物)、PNA或修饰或取代过的核酸，它对感兴趣的核酸靶的一部分具有特异性。“特异性”保护片段表示这样的聚核苷酸，它与其结合对象的互补性足以在选定严谨性条件下与之杂交而不与其他不相关的核酸杂交。保护片段的长度可至少10个核苷酸，以50-100个为佳，或者是全长cDNA。在优选实施例中，保护片段是单链DNA寡核苷酸。单独一次杂交反应可包含对多达100或更多靶分子具有特异性的保护片段。杂交后，用一种或多种核酸酶的混合物处理样品，基本上破坏掉除被保护片段外的所有核酸，所述保护片段已经与感兴趣的核酸和(可选)靶核酸的一部分杂交，它们经杂交而在核酸酶保护过程中不被降解(呈双链杂交体)。例如，如果样品含细胞提取物，该步骤可基本破坏不需要的核酸(例如所感兴趣之外的基因组DNA、tRNA、rRNA和mRNA)。各种核酸酶均可使用，包括，例如，胰RNA酶，绿豆核酸酶，S1核酸酶，RNAse A，核糖核酸酶T1，外切核酸酶III等，这取决于杂交复合物和样品中不需要的核酸的性质。RNAse H对于消化与DNA保护片段结合的残留RNA特别有用。这些酶的反应条件是本领域所熟悉的，并可按经验进行优化。此外，可使用化学方法，例如碱水解RNA。根据需要，可再用本领域熟悉的方法处理样品以去除不杂交的物质，和／或灭活或去除残留的酶(例如苯酚萃取、沉淀、柱过滤等)。杂交，然后核酸酶消化和(可选)化学降解，这一过程就是核酸酶保护法；许多核酸酶保护法已经被描述过(参见，例如，Lee等(1987)，Meth．Enzymol．152，633-648．Zinn等，(1983)，Cell 34，865-879)。经核酸保护处理，然后(可选)将核酸酶灭活的样品与MAPS探针列阵接触，进行普通MAPS试验步骤。如本文就标准MAPS试验所述，结合的保护片段可通过与标记的靶特异性报道物杂交而被检测到，或者，可用可测分子共价或非共价地标记保护片段本身。

优选实施例中，保护片段直接被标记，而不是通过与靶特异性报道物杂交而被标记。例如，报道物通过配体-抗配体相互作用与保护片段结合，例如，将链霉亲和素酶复合物加入生物素化的保护寡核苷酸。另一实施例中，保护片段被化学修饰(例如直接与辣根过氧化物酶(HRP)或荧光染料偶联)，然后(例如，在经酶或化学处理剪切下该修饰之后)检测带有或不带保护片段的核酸部分的该化学修饰。在任一上述方法中，保护片段可在与对应接头分子杂交之后或之前标记。

为了控制核酸酶保护过程正常进行，即，不杂交的核酸按要求被降解，可以设计一种或多种含悬垂(非杂交性)节段的保护片段，如果过程进行正常，则这些节段将被核酸酶剪切掉。可通过与一段互补标记检测探针杂交来测定悬垂片段的有无，或者，可用可测分子共价或非共价地标记保护片段的悬垂部分本身。这一控制可在样品与探针列阵接触之前进行，或作为MAPS试验的一部分。实施例15描述了一个此类控制试验的实例。当然，因为不同的标记很容易区别(例如不同吸收光谱的荧光团)，所以同一试验可包括数种差异标记的寡核苷酸。而且，在试验进行过程中，可用凝胶电泳分析的标准核酸保护试验来验证保护片段是否如期望地被加工。

NPA-MAPS试验可用于样品中靶分子的定量。如果加入的保护片段的摩尔量大大过量于靶分子，足以使杂交反应驱向完全，则核酸保护步骤之后残留的保护片段量将反映样品中的靶分子量。实施例12和13描述了一个如此定量反应的实例。

NPA-MAPS试验可作为任一上述用到MAPS试验的方法的补充。

在优选实施例中，聚核苷酸保护片段是用质谱而不是在MAPS板上测定的。在最佳实施例中，在杂交或核酸酶消化过程中，聚核苷酸都不与固体表面结合。杂交后，可用核酸酶或化学处理降解杂交的靶分子，留下保护片段与曾与靶分子杂交的片段量呈正比。或者，可处理样品以留下靶分子的杂交部分(单链)或靶分子与保护片段杂交形成的双链，然后对其进行分析。可将有待分析的样品与其他杂交或核酸酶混合物分离(例如用乙醇沉淀或亲和性层析吸附)，稀释或溶解，用适合大处理量的环注法注入质谱仪。优选实施例中，用本领域熟悉的方法，将有待分析的样品吸附于一表面，并通过激光解吸进行分析。因为可以用灵敏度最高的Fourier转化质谱(FTMS)(或其他类似先进技术)，所以可测知毫微微或以下的保护片段。

可将一份或多份样品中有待测定的保护片段设计成对所用质谱仪只发出一种信号。实施例之一中，各保护片段可经杂交和核酸酶处理后具有独特的分子量，根据它们的分子量、离子化特征及片段化模式，足以测出它们的浓度。为了提高灵敏度或协助分析复杂的混合物，可用提供独特信号的化学部分修饰保护片段(例如衍生)。例如，可用不同天然或非天然氨基酸衍生各保护片段：通过酰胺键将氨基酸结合于寡核苷酸链上杂交部分的一处或多处。用能量适宜的质谱仪，断链发生在酰胺键处，释放出特征氨基酸部分。这种以中等大小(分子量约80-200)化学组分作为质谱标签的方法是较好的，因为如此大小的分子一般易被测知。另一实施例中，化学修饰是具有明确质谱信号的有机分子，例如四烷基铵基团，它能够衍生另一分子，例如一氨基酸。另一实施例中，正离子或负离子信号通过与某种试剂反应而被增强。例如，要增强正离子的检测，可将吡喃鎓盐(例如四氟硼酸2-4-二噻吩基，6-乙基吡喃鎓，或其他)与胺反应形成吡啶鎓盐；可用任意其他增强剂形成其他正电官能团(参见，例如，Quirke等(1994)Analytical Chemistry 66，1302-15)。同样，可用许多本领域公知的试剂反应形成负离子增强剂。当然，化学修饰的检测可在从核酸上剪切下来之后，或仍与核酸结合时进行。通过以可区别的方式鉴定每一保护片段，可在一次试验中分析(例如筛检)大量不同的靶分子(例如2、6、10、16或更多的不同靶分子)。许多此类试验快速而方便。所以，可以如前所述，大处理量地进行一种或一组此类试验。

不论寡核苷酸是根据其质量还是用独特的分子标签进行检测，各种测信分子在已知浓度的纯制剂中的代号可被详尽地加以特征描述。因而可以将信号准确定量。对欲用质谱法检测的分子来说，无法准确预计强度和概况。分子被离子化的趋势，分子内部所有化学键对断链的敏感性，各片段带多电荷或单电荷的程度，都太复杂，因而无法预计。然而，对于一个具有固定能量和样品处理方式的仪器来说，信号的强度和概况具有很好的重复性。因此，对于每个探针来说，可用纯标准物描述信号的特征，从而可准确地将实验信号翻译成含量。

本发明内容之一涉及检测一种或多种感兴趣的核酸分子的方法，包括：用一种或多种保护片段对含感兴趣核酸的样品进行核酸酶保护，质谱法检测杂交的双链、或被保护核酸、或保护片段。

核酸的质谱分析是本领域所熟悉的。参见，例如，Alper等(1998)Science279：2044-2045和Koster的美国专利5，605，798。

除上述之外，本领域熟练技术人员还知道许多其他大处理量的试验。

多探针试验的优点之一是能够在各探针列阵中包含大量“对照”探针，它们与实际实验探针经历相同的反应条件。例如，列阵内各区可含有阳性和／或阴性对照。“阳性对照”在此表示已知能与靶分子充分反应，或以可定量或可定性方式与之反应的探针，它们因而成为探针／靶分子相互作用的(内部)标准物。这样的探针可作为，例如，杂交效率的对照。“阴性对照”在此表示已知基本上不与靶分子相互作用的对照探针。这样的探针可作为，例如，反应特异性的对照。作为可用对照的实例，有以下实验，其中用一个寡核苷酸探针列阵筛检调节一组某疾病相关基因表达的试剂。作为内部对照以校准某些变量，例如各样品内裂解细胞数量、mRNA回收率、或杂交效率，某探针列阵可包含对表达水平据估计不受被测试剂改变的一种或多种基础或组成型管家基因(例如肌动蛋白、微管蛋白等结构基因)或DNA结合性蛋白质(例如转录调节因子等)具有特异性的探针。此外，要确定被测试剂是否具有副作用，例如细胞致死性或毒性，探针列阵可包含如下探针：它们对在细胞程序死亡中诱导的基因或受细胞创伤(例如热休克蛋白)或细胞毒性(例如p450基因)条件诱导的基因具有特异性。

列阵中还可包含用于实验灵敏度“微调”的其他对照探针。例如分析调节与特定病态相关mRNA产生的试剂的试验。如果先前的试验提示：该组内一相关mRNA(如mRNA-A)的产量如此之高以至于其信号淹没了其余mRNA的信号，则可调节接头，对试验进行“微调”，使得信号强度相等。“封闭接头”含有针对mRNA-A的锚特异性寡核苷酸序列，但没有探针特异性序列，可添加它们以稀释靶特异性接头，从而降低试验对该mRNA的灵敏度。本领域技术人员可按照传统方法常规确定封闭接头与非封闭接头的适当比例。

本发明试验中的待测样品可包含任意上述或其他靶分子。液体待测样品可以是适合测试区大小的任意体积，约为100nl至100μl。优选实施例中，在一块1536孔微滴盘的各孔中加约1μl的液滴。可用任何适合大处理量分析的方法将样品与探针列阵接触，例如移液、喷墨分散或用多针头器具。在探针与靶分子发生结合或其他有效相互作用的有效条件(例如盐浓度、pH、温度、培养时间，等，参见前文)下培养样品。这些条件可常规确定。培养后，可处理(例如洗涤)样品以去除不结合的靶分子，所用条件可经验确定，目的是完好保留特异性相互作用而去除非特异性结合的物质。例如，可在与获得探针／靶分子结合所用严谨性条件相同或更严谨的条件下洗涤样品1至10次或更多次。

可用各种方法制备含靶RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA或总RNA)的样品。例如，可将作为抽提mRNA来源的体外细胞培养物平板接种于表面的区域上，例如铺在微滴板的单个孔内。可选的是，在这些细胞达到要求的细胞密度后，可用感兴趣的试剂进行处理，所述试剂例如激发剂或潜性治疗剂，可用各种方法将其加入细胞，例如用多针头器具(例如Beckman的96或384针工具)，或通过移液或喷墨分散，然后根据具体试验，与细胞一起培养约15分钟至48小时。可用公知方法(例如市售试剂盒)常规制备自体外或体内来源的组织或细胞抽提的总RNA、mRNA等。

可选的是，可通过杂交前预先用核酸酶保护法(NP)处理样品从RNA样品中至少部分去除可能与感兴趣的RNA竞争结合特异性探针的核酸(例如与感兴趣的RNA至少具有部分序列同源性的基因组DNA、rRNA、tRNA或mRNA)。将过量的某种核酸加入样品，并在选定严谨性条件下一起培养，该核酸(即“保护片段”，可以是RNA、DNA或PNA)至少与感兴趣RAN的一部分互补，而且其序列与感兴趣RNA的特异性探针序列部分或完全重合，所述条件下，保护片段将与感兴趣的RNA特异性杂交(参见前文有关适宜反应条件的论述)。在这一步，可添加对样品内任一或所有RNA具有特异性的保护片段(例如100种，或更多)。杂交反应后，用一种或多种核酸酶的混合物处理样品，基本上破坏除各感兴趣RNA上与保护片段互补部分之外，或除保护片段与被保护RNA所成双链之外的所有核酸。下一步中，可通过双链变性并用合适的酶消化来去除双链中的保护片段，所述的酶只降解保护片段而保持被保护RNA基本完好。许多核酸酶可用于上述消化步骤，例如胰腺RNAse，绿豆核酸酶，RNAse H，S1核酸酶(在高盐或低盐消化条件下)，RNAse A，核糖核酸酶T1，内切核酸酶III，内切核酸酶VII，RNAse CL3，RNAse PhyM，RNAse U2等，根据杂交复合物和样品中不需要的核酸的性质来选择。这些酶的反应条件是本领域所熟悉的，并可常规确定和优化。根据需要，可用本领域所熟悉的方法处理样品以去除不杂交的物质和／或灭活或去除残留的酶(例如苯酚萃取、沉淀、柱层析，等)。然后，将处理后的样品与探针列阵接触。为了控制特异性杂交和后继核酸酶保护过程正常进行，反应混合物可包括被标记的保护片段。为了控制核酸酶保护过程正常进行，即，非杂交核酸按要求被消化，可设计一种或多种包含悬垂节段(不杂交)的保护片段，如果试验进行正常，则这些悬垂将被切除。通过用互补性标记探针进行杂交，或用可测分子标记保护片段悬垂部分本身，可检测悬垂片段的有无。

对任一本发明方法来说，可用多种方法标记靶分子，这些方法是本领域所熟悉的，而且在本文的其他部分有所描述(例如，检测核酸酶保护片段部分)。例如，靶分子可直接或间接与提供检测信号的化学基团偶联，所述基团例如化学发光分子，或催化产生化学发光分子的酶，或荧光素或cy5之类荧光分子，或例如镧系金属之一的时间分辨荧光分子，或放射性化合物。或者，靶分子可在与探针反应之后以一种或多种靶特异性报道物(例如抗体、图1所示的寡核苷酸，或前文就与探针及靶分子结合所述的多种分子中的任一种)进行标记。也可以使用各种更复杂的夹心检测方法。例如，可将靶分子与一双官能分子杂交，该分子的第一部分具有对靶分子的特异性，第二部分可被通用(共同)报道物(例如标记过的聚核苷酸、抗体等)识别。可设计双官能分子，从而在各试验中按使用所需数量的共同报道物。

如何在获得结合或其他稳定相互作用的有效条件下将靶分子与靶特异性报道物一起培养的方法可按常规确定(参见前文)。例如，可将荧光寡核苷酸报道物(浓度约10nM至1μM或更高，以约30nM为佳，在诸如6X SSPE-T缓冲液中)与结合靶分子在约15-45℃(以室温为佳)一起培养约15分钟至2小时(以约30-60分钟为佳)。培养后，可处理(例如洗涤)样品以去除未结合的靶特异性报道物，经验确定处理条件：保留特异性相互作用，而去除非特异性结合的物质。例如，可在与获得靶分子／报道物结合所用严谨性条件相同或更严谨的条件下洗涤样品1至10次，或更多次。

用靶特异性报道物进行标记为原来的杂交反应增加了一层特异性，例如，一种靶特异性寡核苷酸针报道物对一靶核酸序列中不同于探针核苷酸的部分，或探针和报道物抗体识别靶抗原不同表位。此外，用靶特异性报道物进行标记可使反应的灵敏度“迁移”。例如，如果作为相关表达模式一部分的靶mRNA表达水平很低，通过将结合的靶与数种(约2种至5种以上)各自与靶mRNA不同部位结合的靶特异性报道物杂交可增强信号水平。

独立检测两种标记的能力允许MAPS试验中再多一种对照。部分(约10-100％)针对特定锚位(图7显示了3个锚位，各含许多基本相同的锚分子(A、B或C))的接头可在一个末端连接一个标记(例如荧光团)。例如，罗丹明或Cy5荧光团可连接在接头的5’端。这种修饰接头称为“对照接头”。在接头与对照接头混合物与锚分子结合，含靶分子的样品与所得探针列阵一起培养后，可使用带有不同荧光团(例如荧光素或诸如化学发光剂等其他检测标记)的靶特异性报道物(或，可用荧光团或其他检测标记直接标记靶分子)；然后可测定两种信号的比例。有对照接头就能够标定测试区内和测试区之间的有效(例如能够与接头相互作用)锚分子的数量(即，测试列阵各位置结合靶分子的容量，用于将信号归一化)，作为定量结合探针的基础，帮助锚位的定址和／或提供阳性对照，例如因为样品内没有靶分子而没有信号的情况。本发明另一实施例中，还可用两种不同的标记(例如荧光团)检测两群不同的靶分子；然而，能够通过空间区分信号来识别靶分子的存在的能力允许将一种标记用于不同的靶分子。

本发明另一实施例中，对靶分子具有特异性的“锚分子”不与接头结合，而直接与靶分子结合，然后靶分子可与靶特异性报道物相互作用。

靶分子，不论标记与否，都可用本领域常规技术进行检测(参见，例如，Fodor等(1996)，美国专利5，510，270；Pirrung等(1992)，美国专利5，143，854；Koster(1997)，美国专利5，605，798；Hollis等(1997)，美国专利5，653，939；Heller(1996)，美国专利5，565，322；Eggers等(1997)美国专利5，670，322；Lipshutz等(1995)BioTechniques 19，442-447；Southern(1996)Trends in Genetics 12，110-115)。检测方法包括以酶为基础的检测，比色法，SPA，放射性自显影，质谱法，电学方法，吸光度或发光度检测(包括化学发光或电发光)，和检测(例如)微小粒子标签造成的光散射。也可以检测荧光标记，例如通过电荷偶合装置造影(CCD)或荧光显微(例如扫描或共焦荧光显微)，或通过扫描系统与CCD列阵或光电倍增管联合，或使用以列阵为基础的技术进行检测(例如，可测定一测试区每10微米的表面势能，或在分辨率足够高的条件下利用表面等离子体共振)。或者，列阵可含这样的标记：它能因向接头、靶分子或报道物上的标记转移能量(或能量被其改变)而被测定。在大量基于荧光的检测系统中包括荧光强度、荧光极化(FP)、时间分辨的荧光、荧光共振能量转移和均匀时间释放的荧光(HTRF)。对重复条形码样格式的分析可通过格式识别(根据与其他点或线的相对位置寻找各特定经标记靶分子相应的点或线)和其后的标记强度定量来完成。条形码识别装置和用于分析单维或两维列阵的计算机软件可用常规方法制造和设计，而且／或者可以购买(例如，参见Rava等(1996)，美国专利5，545，531)。

制造和使用本发明的方法包括如前所述制备表面或测试区，合成或纯化并连接或组装本文所述的锚分子、接头、探针和侦探探针等物质，以及如前所述检测和分析经标记或带标签的物质，这些都是熟悉的常规技术。除前文参考文献中的方法之外，参见，例如，转让给Affymax、Affymetrix、Nanogen、Protogene、Spectragen、Miilipore和Beckman(本发明所用即它们的产品)的专利；分子生物学和蛋白质科学的标准教科书，包括前文所引用的那些；和Cozette等(1991)的美国专利5，063，081；Southern(1996)，Current Opinion in Biotechnology 7，85-88；Chee等(1996)Science 274，610-614；和Fodor等(1993)Nature 364，555-556。

附图简述

图1显示寡核苷酸的设计，其中，接头1包含一个对锚分子1具有特异性的部分和另一个对靶mRNA1具有特异性的部分(探针)，其中，标记的检测探针1对靶mRNA1上的一段序列具有特异性，它不同于接头的靶特异性部分序列。

图2显示包含15个测试区的表面，各区包含一个6种寡核苷酸锚分子组成的列阵。

图3显示用于受体结合试验的接头设计，其中，接头的锚特异性部分通过生物素与链霉亲和素分子与探针部分(受体蛋白)连接，其中对受体具有特异性的配体以荧光标记分子进行标记。B：生物素。SA：链霉亲和素。Rec：受体蛋白。配体：受体的天然或合成配体。*：与配体连接的荧光标记分子。

图4显示含21个测试区的表面，各区又被再分割成16个亚区(凹陷)。

图5a，5b和5c显示可组装成图4所示表面的3片结构。图5a代表孔分隔片；图5b代表亚分割片；图5c代表底板。

图6代表2个测试区，各含“条形码”样格式的探针(或锚分子)线性排列。

图7表示含3种锚分子(A、B和C)的测试区，各种锚分子以多拷贝(组)形式存在。各组锚分子所在位置称为一个“位”。

图8显示一试验，其中，特异性逆转录酶产生的cDNA在MAPS板上进行试验。

图9显示使用核酸酶保护过程的试验(NPA-MAPS试验)。由细胞或组织制备样品RNA，以波形线表示。向RNA样品中加入一组聚核苷酸保护片段，以粗的黑白线表示。保护片段的黑线部分表示与特异性RNA靶分子互补并与之杂交的节段。白线部分表示悬垂部分：与互补序列相邻但不与靶分子互补的序列。加入过量的保护片段。在所有存在的靶分子与保护片段杂交后，用合适的核酸酶混合物处理样品并进行化学处理，破坏掉不需要的未杂交RNA和未杂交聚核苷酸。例如，S1核酸酶可破坏所有单链DNA。因此，过量的保护片段和结合保护片段的未杂交悬垂部分被水解。可加入包括核糖核酸酶H在内的核糖核酸酶，或碱加热样品来水解RNA。留下的是许多经剪切的保护片段，它们反映了样品中曾含有的各种靶RNA的量。用MAPS杂交试验测定留下的保护片段。

图10显示MAPS试验的杂交特异性。

图11显示锚分子与接头结合的动力学。

图12显示对两种寡核苷酸靶的MAPS试验。

图13显示灵敏度迁移的定量。

图14显示4种寡核苷酸接头／锚分子组合的熔点测定。

图15显示以NPA-MAPS进行的mRNA试验。

图16显示用NPA-MAPS的稀释曲线。

图17显示检测含磷酸酪氨酸残基的肽的试验。

图18显示制作EST图谱的第一步：在MAPS板上的通用锚分子列阵上组装对应于各待定位EST的接头。将包含16种不同寡核苷酸探针的接头固定到微滴板上16孔各自的表面上，排列成4×4的矩阵。第一位是寡核苷酸1，它与第一EST序列的一部分互补，16种待测EST以此类推。

将由EST源基因生成的cDNA或mRNA加入16个孔，在适宜条件下令其杂交。因此，任何含有16种EST序列之一的cDNA或mRNA都将固定到其互补探针所在的位置。

图19显示制作EST图谱的下一步：将侦探寡核苷酸加入MAPS板。板上各孔得到一种对应于待定位EST之一的侦探寡核苷酸。各侦探寡核苷酸是一段与用于检测的分子偶联的寡核苷酸，例如，如果检测方法是荧光造影，则该分子是荧光素。各侦探核苷酸与EST之一互补，但不同于EST特异性探针，所以，与同一EST互补的探针和侦探寡核苷酸可同时与之结合。

洗涤后，各孔中加入一种侦探寡核苷酸，如图中数字所示。即，具有与第一EST互补序列的侦探寡核苷酸加入第一孔，以此类推。

图20a和b显示图18和图19所示制作EST图谱的结果。侦探寡核苷酸杂交和用适当严谨性条件洗涤后，微滴板上的16孔用(例如)基于CCD的荧光造影仪造影。图20a显示特定格式的结果。预计，各EST特异性侦探寡核苷酸将标记被对应EST特异性探针所固定的mRNA或cDNA。例如，探针5在该处结合含第5EST序列的cDNA或mRNA，所以，第5侦探寡核苷酸也应与该同一位置的cDNA或mRNA杂交。这是所示特定格式信息的情况，即各检测寡核苷酸标记相匹配的探针。此外，头3个侦探寡核苷酸各自标记头3个探针所固定的cDNA或mRNA，说明这些序列位于同一基因上。同理，最后5个EST也似乎是连锁的。图20b显示了以上信息确定的连锁关系。

图21显示图18-20中探针、侦探寡核苷酸和EST1、2和6的关系。

图22显示大处理量的试验。

实施例实施例1：杂交特异性(参见图10)

用喷墨分散器，Pixus系统(Cartesian Technologies，Inc．，Irvine，CA)制作一块通用MAPS板，在微滴板的各孔内形成相同的DNA格网。所有寡核苷酸均购自Biosource International(Camarillo，CA)。对于该板，各孔内如键盘(图左侧)所示分布7种不同寡核苷酸。各种寡核苷酸均以10nl液滴形式分布于DNA结合板孔(Corning Costar)上的2个位置，它们含于含500mM磷酸钠，pH8．5和1mM EDTA的2μM溶液中，任其干燥。固定后，用50mM Tris pH8封闭各孔，然后用0．1％SDS在5×SSP缓冲液中所成溶液洗去没有与表面共价结合的寡核苷酸。

将荧光标记的接头寡核苷酸加到洗涤后的板上，在6×SSPE加0．1％TritonX-100中室温杂交30分钟。这是一种优选的接头固定方案。接头寡核苷酸在合成过程中以Cy5进行衍生，与特异性锚着寡核苷酸的25碱基节段互补。7种锚分子和接头的序列如下(都是从3’到5’)：

#1锚分子*：SEQ ID：1

TCCACGTGAGGACCGGACGGCGTCC

接头**：SEQ ID：2

GTCGTTTCCATCTTTGCAGTCATAGGATACTGAGTGGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGA

RNA模拟物(小鼠C-jun)：SEQ ID：3

CTATGACTGCAAAGATGGAAACGACGATACTGAGTTGGACCTAACATTCGATCTCATTCA

侦探寡核苷酸***：SEQ ID：4

TGAATGAGATCGAATGTTAGGTCCA

#2锚分子*：SEQ ID：5

CACTACGGCTGAGCACGTGCGCTGC

接头**：SEQ ID：6

CTAGGCTGAAGTGTGGCTGGAGTCTGCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTG

RNA模拟物(小鼠MIP-2)：SEQ ID：7

AGACTCCAGCCACACTTCAGCCTAGGATACTGAGTCTGAACAAAGGCAAGGCTAACTGAC

侦探寡核苷酸***：SEQ ID：8

GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG

#3锚分子*：SEQ ID：9

GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG

接头**：SEQ ID：10

ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG

RNA模拟物(小鼠GAPDH)：SEQ ID：11

CCTTCATTGACCTCAACTACATGGTGATACTGAGTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC

侦探寡核苷酸***：SEQ ID：12

GTCATCATACTTGGCAGGTTTCTCC

#4锚分子*：SEQ ID：13

GAACCGCTCGCGTGTTCTACAGCCA

接头**：SEQ ID：14

CTACCGAGCAAACTGGAAATGAAATTGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTC

RNA模拟物(小鼠L32蛋白)：SEQ ID：15

ATTTCATTTCCAGTTTGCTCGGTAGGATGCTGAGTGAGTCACCAATCCCAACGCCAGGCT

侦探寡核苷酸***：SEQ ID：16

AGCCTGGCGTTGGGATTGGTGACTC

#5锚分子：SEQ ID：17

CTCGTTCCGCGTCCGTGGCTGCCAG

接头**：SEQ ID：18

CTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAG

6#锚分子*：SEQ ID：19

CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC

接头**：SEQ ID：20

GCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG

#7锚分子*：SEQ ID：21

GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG

接头**：SEQ ID：22

CGAAGAGATGCATAACGCGGCGCCG

*5’端为酰胺，有C12间隔基的合成锚分子

**5’端连有Cy5的合成接头

***5’端连有生物素的合成侦探寡核苷酸

向各孔加入一种接头或接头混合物(如图所示)。(在标有“全部”的孔中加入7种接头的混合物)。培养，并以5×SSP洗涤3次后，用Tundra造影仪(IRI，St．Catherines，Ontario)得到该图右侧的荧光照片。如图所示，接头通过与互补锚分子的特异性结合自安装于表面。

在各孔中重复该过程，分散有8种不同锚分子的孔除外，然后，接头与锚分子优先结合。在24、96、384、864或1536孔板的各孔中用36、64等不同锚分子重复全过程。实施例2：结合动力学(参见图11)

图中显示不同浓度的Cy5衍生1号接头与其互补固定锚分子的杂交速度。如图1所示制备通用MAPS板，但锚分子1固定于各孔的4个位置。培养在室温下，5×SSP加0．1％Tween-20中进行，各孔用5×SSP洗涤3次，测定结合荧光。用Tundra得到测试板的荧光照片，用Tundra软件，扣除背景，算出各孔内各位置的累积荧光强度。图中绘制的是2个重复孔之一中4个位置累积荧光强度的平均值与标准偏差。

实施例3：荧光接头

按照前述方法，用一种锚着寡核苷酸固定于各孔内1个位置(最上方2行)、4个位置(后4行)或16个位置(下面2行)。用实施例1所述优选方案，将互补的、荧光标记的接头固定于各孔。洗涤后，用Tundra获取测试板的荧光照片。各位置上的荧光量反映可有多少接头与靶分子杂交。重复位置测得的信号量具有高度的重现性。

实施例4：结合曲线

将不同浓度的靶核苷酸加至实施例3制备的测试板。已结合的接头含有一段25元的序列与靶分子的一部分互补。加入30或100微升靶分子在5×SSC加0．05％SDS中所成的溶液，覆盖测试板，50℃培养过夜。靶分子与固定接头杂交后，用优选的化学发光法显现靶分子。加入30nM生物素化的侦探寡核苷酸，它含一段25元序列与靶分子上另一部分(不是与接头互补的部分)互补。可在洗去未结合的靶分子后，加入生物素化的侦探分子反应30分钟，或者，可以与靶分子一起加入，进行一昼夜的杂交。侦探分子结合后，表面以5×SSC洗涤2次，以含0．1％Tween-20和1％PEG的1×SSP(SSPTP)洗涤1次，室温下加入250μg／ml与链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(HRP∶SA，购自Pierce，Rockford，Ill．)在SSPTP中的1∶50，000稀释液反应5小时，用SSPTP洗孔4次，用超信号紫外试剂(Pierce)洗涤1次，并用它培养。数分钟后，用Tundra造影仪采集发光照片，例如，可在CCD列阵内累积造影5分钟。在靶分子浓度仅为约5×10^-13M的孔中即可看到低水平信号；当浓度达到约10^-10M时，信号量达到饱和。重复位置测得的信号具有高度重现性。实施例5：2种寡核苷酸的试验(参见图12)

所示的结合曲线显示用2种不同靶寡核苷酸，以前述优选方案进行的MAPS杂交试验。用4种不同的锚着寡核苷酸制备通用MAPS板，各锚分子分别于各孔内重复点4次。第2和第4锚分子的互补接头寡核苷酸自安装于表面。各孔内加入40μl所示浓度的两种靶分子，50℃培养过夜。如前所述，以各靶分子的生物素化的特异性检测寡核苷酸与之结合，然后加入HRP∶SA，进行化学发光造影，如此显现各结合的靶分子的量。图的下部，对图象强度进行了定量。用Tundra造影仪套装中的软件沿图上部所示箭头之间的线扫描图象强度，在1．1pM的靶分子最低浓度，扫描图象在各位置都显示清晰的高斯峰，最左端即0浓度靶分子样品中，没有可识别的背景峰。

实施例6：灵敏度迁移(图13)

可用MAPS杂交试验测定一组寡核苷酸的浓度：将它们固定于表面，并进行标记。这对于中低浓度的寡核苷酸很有效。此时可将两种样品区分开来，因为，一种样品含寡核苷酸较多，则结合的也较多。另一方面，如果靶定寡核苷酸的浓度对表面来说已饱和(即，如果高得足以占据所有位点)，则浓度进一步升高也不会结合更多，则不能定量。然而，可通过添加非标记竞争性配体来改变靶分子的结合曲线。

获取4种不同寡核苷酸靶的结合数据，它们在约为3nM时都对表面饱和(即达到最大结合)。向各孔都加入非标记的竞争性靶分子，标记核苷酸的结合发生漂移，浓度较低则结合较少，饱和浓度被提高。例如，可以加入靶分子1和3的竞争性寡核苷酸，但不加靶分子2和4的竞争性寡核苷酸。这样，只使靶分子1和3的试验灵敏度发生迁移。这样，如果预计寡核苷酸的相对量已知，就可以在一个试验孔中测定许多不同浓度的寡核苷酸靶分子。

可以如上所述，根据数据定量寡核苷酸靶分子之一的结合。图13定量显示，试验中包含竞争性寡核苷酸使得用于分析该靶分子的曲线向高浓度迁移。实施例7：4种探针的熔点(图14)

将MAPS测得的与锚寡核苷酸特异性杂交的4种不同荧光标记接头寡核苷酸的量绘制成温度的函数。4种寡核苷酸先在50℃，300nM杂交1小时。然后，用不含探针的SSC洗孔，如前所述用荧光测定结合量(50℃点)。然后，在55℃培养30分钟并测定结合荧光，以此类推至所有图中温度。实施例8：检测方法

两种检测方法可直接比较。MAPS板上固定有4种寡核苷酸锚分子，各自在每孔的4个位置，每孔中加入两种寡核苷酸，两者都含共价连接的cy5或含生物素基团。如观察和测定荧光接头所述，测定表面荧光。按照就随后加入HRP∶SA和化学发光底物的MAPS所述，测定化学发光。产生的信号大致为相同的数量级。然而，由于孔与孔彼此分开的微滴板几何形状，以及偶尔出现的液泡或液体的minisucus，表面荧光图象中的反射可能干扰数据解读。实施例9：化学发光产物

可以象比较MAPS试验的检测方法一样比较作为辣根过氧化物酶化学发光底物的两种产物。如实施例8所述制备MAPS板，与生物素化的接头寡核苷酸一起培养。然后，加入与链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶(AlkPhos∶SA)或HRP∶SA，然后洗涤，向孔中加入CDP-Star(Tropix)和AlkPhos∶SA，或加入ECL-Plus和HRP∶SA。按照生产商就Western印迹中标记所做的建议，用SA衍生的酶和底物进行标记。这两种底物(以及其他底物)都可用来评价寡核苷酸与MAPS板的杂交。实施例10：0．6mm的分辨率

测定本系统的MAPS试验分辨率：制备每孔4种不同寡核苷酸锚分子的MAPS板，各种锚分子在每孔中重复4个位置，栅距(中心距)0．6mm。然后，如前所述，与cy5衍生的接头或生物素化的接头杂交，检测并扫描。表面荧光测定的分辨率较高(可减小栅距)。化学发光检测中，相邻位置没有完全分开，在这样的间距，计算机解卷积能明确分辨单个峰。实施例11：测试核酸酶保护方案

在测定核酸酶保护方案中杂交和核酸酶处理的最佳条件的实验中，用Ambion(Austin，Texas)的核酸酶保护试验试剂盒来提供条件、缓冲液和酶。以三种缓冲液之一配制8种样品。Hyb Buff1是100％杂交缓冲液(Ambion)；Hyb Buff2是75％杂交缓冲液加25％杂交稀释缓冲液(Ambion)；Hyb Buff3是两种缓冲液各50％。合成一段70元寡核苷酸，其中60个残基与被测mRNA互补(BiosourceInternational，Camarillo，CA)，按照Ambion建议的补骨脂素-荧光素标记方案，用补骨脂素-荧光素(Schleicher and Schuell，Keene，NH)标记。简而言之，保护片段以20μl TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8)稀释至50μg／ml，煮沸10分钟，在冰水中迅速冷却。加入130μg／ml补骨脂素-生物素的DMF溶液4μl，用手持式长波UV光源在40℃照射45分钟。通过饱和丁醇萃取去除游离的补骨脂素-荧光素。所用的mRNA是GAPDH反义mRNA，是用T7启动子和MaxiScript试剂盒(Ambion)从反义质粒(Ambion的pTRI-GAPDH-小鼠反义对照模板)制备的。另外合成60元的短保护片段，进行相同的标记。保护片段的序列为：

全长保护片段：SEQ ID：23

CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTAA

短保护片段：SEQ ID：24

CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTT

如下杂交：在20℃或37℃，将20nM保护片段与60nM GAPDH mRNA混合，最终体积为10μl。杂交后，按照生产商的说明加入200μl核酸酶混合物(Ambion核酸酶保护试剂盒：1∶200稀释的核酸酶混合物)，在同样温度培养30分钟。用杂交抑制缓冲液(Ambion)终止水解，沉淀出寡核苷酸，用乙醇洗涤。加入10μl 1×凝胶上样缓冲液(Ambion)，在15％TBE-尿素凝胶上分离寡核苷酸。凝胶在运行缓冲液中转动30分钟，放在一塑料板上，用Tundra造影，用荧光滤光片选择激发和发射波长。图象在CCD列阵上累积造影2分钟。最佳条件是在Hyb Buff2中37℃培养或在Hyb Buff3中22℃培养样品。在这些样品中，没有可测的全长保护片段残留，发现有大量部分全长保护片段，其大小明显与短保护片段相同的。实施例12：NPA-MAPS进行的mRNA试验(见图15)

采用完整的NPA-MAPS方案，杂交和核酸酶处理条件与实施例11所述相似。该试验共运行了10份样品。它们都包含等量的70元寡核苷酸保护片段和不同量的GAPDH mRNA。10μl含0．08mg／ml酵母RNA的50％杂交缓冲液加50％稀释缓冲液的杂交样品90℃加热6分钟，简单离心，37℃加热5分钟，令其冷却至19℃，培养19小时。然后在每份样品中加入200μl核酸酶混合物，19℃放置30分钟。每份样品取60μl进行MAPS试验。加入2μl 10N NaOH和2μl 0．5MEDTA，样品90℃加热15分钟，70℃加热15分钟，冷却至室温20分钟。然后，用2μl 10M HCl中和样品，加入12μl含2M HEPES pH7．5和200nM对保护片段具有特异性的生物素化侦探寡核苷酸的20×SSC和1μl 10％SDS。混合样品，80℃加热5分钟，各样品吸出两份35μl，加至MAPS板的两孔(各样品一分为二，在MAPS板上平行试验)。该板是按照标准MAPS方案制备的，已经固定有对保护片段具有特异性的自安装的CY-5衍生接头。覆盖MAPS板，50℃培养过夜，如前所述进行检测和发光，在对照试验中不加核酸酶，以观察MAPS仅检测保护片段的情况。在图的下半部分，显示了对上排孔的强度扫描(如用造影仪进行分析那样)。图中列出了样品内GAPDHmRNA的含量(即，加至MAPS板后各重复孔内的量)。

用于MAPS板的寡核苷酸为：

锚分子*：SEQ ID：25

CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC

接头**：SEQ ID：26

CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATGCTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG

保护片段(与小鼠GAPDH的反义mRNA互补)：SEQ ID：27

CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTAA

侦探寡核苷酸***-5’端以生物素标记：SEQ ID：28

AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT

*5’端为酰胺，有C12间隔基的合成锚分子

**5’端连有Cy5的合成接头

***5’端连有生物素的合成侦探寡核苷酸

实施例13：稀释曲线，NPA-MAPS(图16)

对实施例12讨论并显示于图15的数据进行定量，并绘制成稀释曲线。所绘8点是两重复孔在各种mRNA浓度的平均值和标准偏差。上面还重合以结合曲线，其形式为：

结合分数=最大结合*1／(1+IC₅₀／L)

其中的最大结合是饱和浓度时的最大结合，结合分数是在配体浓度L时的结合量，IC₅₀是结合分数为最大结合一半时的配体浓度。该曲线在图中以红点表示，以图中所示的最佳拟和值(fit value)IC₅₀=4．2毫微微摩尔绘制。实施例14：小鼠肝总RNA抽提物中GAPDH mRNA的NPA-MAPS试验

用NPA-MAPS试验分析小鼠总RNA提取物中的GAPDH mRNA，并绘制稀释曲线。用Qiagen试剂盒制备来自小鼠肝脏的总RNA。在含0．5M乙酸镁的70％乙醇中沉淀RNA，重悬在含0．05％SDS和1．8nM保护片段的10μl 5×SSC中。所加保护片段长70个碱基，其中60个与小鼠GAPDH互补。使用与小鼠GAPDHmRNA互补的片段(“保护片段”)，或使用该序列的互补序列作为阴性对照(“反义片段”)。

含保护片段的RNA样品在90℃加热5分钟，将样品冷却至70℃进行杂交，经一昼夜任其缓慢冷却至室温。加入30μl S1核酸酶(Promega)以1×S1核酸酶缓冲液(Promega)所配1∶10稀释液，19℃培养30分钟，用1．6μl 10N NaOH和2．7μl0．5M EDTA终止。样品在90℃加热15分钟，然后在37℃变性15分钟以破坏RNA，用1．6μl 10M HCl中和，在MAPS板上，5×SSC中含0．05％SDS，补充了200mM HEPES，pH7．5，并在其中加入30nM生物素化的检测寡核苷酸的，在其中培养过夜。洗涤，并用SA-HRP显色。信号量随小鼠RNA减少(样品分别含500、170、50、5或0．5μg小鼠总RNA)而减少。两份对照样品中不加S1核酸酶。只看到互补保护片段的信号。

所用寡核苷酸：

用于反义对照(与实施例12相同的寡核苷酸)：

锚分子*：SEQ ID：25

CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC

接头**：SEQ ID：26

CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATGCTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG

保护片段(与GAPDH的小鼠反义mRNA互补)：SEQ ID：27

CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTAA

侦探寡核苷酸***-5’端以生物素标记：SEQ ID：28

AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT

用于有义GAPDH mRNA样品：

锚分子*：SEQ ID：25

CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC

接头**：SEQ ID：29

ATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG

保护片段(与GAPDH的小鼠mRNA互补)：SEQ ID：30

AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGACAATCTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGCTTGTCTAA

侦探寡核苷酸***：SEQ ID：31

CGAGAAATATGACAACTCACTCAAG

*5’端为酰胺，有C12间隔基的合成锚分子

**5’端连有Cy5的合成接头

***5’端连有生物素的合成侦探寡核苷酸实施例15：有对照的核酸酶保护MAPS试验

由小鼠肝脏抽提mRNA，如实施例14进行核酸酶保护，但GADPH特异性保护片段含60个与小鼠GADPH互补的核苷酸，后面是3’端的15个与靶分子不互补的“悬垂”核苷酸。杂交和核酸酶消化后，如实施例14所述，留下的保护片段与MAPS板杂交，但用2种不同的寡核苷酸检测片段来检测被固定的保护片段。检测片段之一与保护片段的GAPDH特异性部分互补，另一检测片段作为对照与保护片段的15碱基悬垂互补。将各检测片段用于不同的重复样品(即，位于不同的孔)，这样，两检测片段可被相同的检测分子所标记。本实施例中，两检测片段都被HRP标记。不加核酸酶，可看到来自两检测片段的信号；但是，进行了核酸酶消化后，只能检测到对应于GAPDH序列的信号。GAPDH特异性信号的量比没有进行核酸酶消化时的少，因为，加入的保护片段相对存在的GAPDHmRNA过量。这使得GAPDH mRNA量成为保护性杂交的限制因素，这样，所形成双链杂交体的量(亦即免受核酸酶消化的保护片段的量)反映mRNA的量。当反应混合物中没有mRNA时，加入核酸酶后检测不到任何信号。以上证明杂交和消化步骤的进行合乎要求。

当给定试验包括对应于多种靶分子的保护片段时，每一种都含同样的15碱基悬垂部分。这使得同一检测片段可用于测试全部样品的其余悬垂。实施例16：筛检改变某病态相关基因表达的化合物的转录试验

使用的是人肿瘤细胞系。已知它30个基因的表达水平高于正常细胞。(即，有30个基因比在正常细胞中更多地被用来在这些基因指导下合成mRNA，然后合成蛋白质。转录试验通过测定有多少各基因的mRNA来测定基因的使用频率)。用MAPS板上的核酸酶保护试验测试8800种化合物，看在化合物存在下培养细胞是否减少30种相关基因中部分的表达而不影响6个正常基因(组成型，“管家”基因)的表达。任何具有上述效果的化合物都可在将来用于开发治疗这种肿瘤的药物。

在100块96孔聚苯乙烯板上各孔内加约10，000至100，000个细胞，培养2天，直至它们覆盖各孔表面。各板上8个孔内的细胞任其生长，不加任何物质。向各板上其余88孔内加入不同的一种化合物，从而可检测化合物的单独作用。一次使用100块板，则可测试或筛检8800种化合物。细胞在化合物存在下培养24小时，然后收获细胞进行试验。按照有关从96孔板上样品制备RNA的说明处理各板上的细胞(例如，根据Qiagen RNeasy96试剂盒)。制得RNA后，以NPA-MAPS法测定36种不同mRNA各自的量，这其中包括30个相关基因和6个正常“管家”基因。向各孔加入各自对应于感兴趣基因之一的36种DNA寡核苷酸保护片段，让它们在选定严谨性杂交条件下与各自靶mRNA序列杂交。然后，加入S1核酸酶破坏过量的未杂交DNA，并对样品进行化学处理以破坏RNA。留下的是36个基因各自的寡核苷酸保护片段，其含量与各样品中被处理细胞内的mRNA量成正比。

100块96孔板上各孔内具有一个36种不同锚寡核苷酸组成的列阵，向各孔内加入36种不同的接头寡核苷酸进行制备。接头自安装于各孔表面，将通用板转化为具有各自针对36种寡核苷酸保护片段的特异性探针的MAPS板。各接头的一部分对36种锚分子之一具有特异性，另一部分对36种保护寡核苷酸之一的一节段具有特异性。将100块样品板上各孔内的寡核苷酸样品加至100块MAPS板上对应孔内。在选定严谨性杂交条件下杂交后，加入针对各靶分子的带有化学发光酶的检测寡核苷酸，这样，各孔内各特定位置的发光将与样品内mRNA含量成正比。显示相关基因量减少而对6个管家基因没有影响的孔都是有意义的。加入这些样品的化合物可能是开发抗肿瘤引物的起点。实施例17：诱导型和组成型的基因表达

按照实施例14所述，由非感染(对照)小鼠和被腺病毒感染后1小时的(感染)小鼠的肝脏制备RNA。各份样品用60μg肝RNA，制备重复样品。各试验孔包含3组重复位置，对应于上述3个基因。各位置含有一种锚分子，它与含有探针的接头结合，探针与保护片段互补，保护片段对应于3个基因之一。按照实施例12进行核酸酶保护MAPS，采集和扫描图象。显示的是3种mRNA靶各自重复孔的粗略图象数据和强度扫描。扫描线上的数字是各种情况的累积强度和标准偏差(n=4)。预计不发生改变的管家基因GAPDH在感染样品中显示1．3倍的中度增加，在统计学上无显著意义。MIP-2和c-jun转录分别增加4倍和6倍。以上发现显示，与作为对照的组成型表达基因GAPDH相比，MIP-2和c-jun两基因的表达因腺病毒感染而增强。实施例18：筛检选择性抑制酪氨酸或丝氨酸激酶的化合物的酶试验(图17)

激酶是使磷酸酯与蛋白质结合的酶。已知许多激酶刺激正常和肿瘤细胞的生长。因此，抑制特定激酶(并非所有激酶)的化合物可用来检测激酶是否参与致病，如果是，则可以此作为药物开发的起点。例如，参与刺激细胞生长或参与调节炎症反应的5种酪氨酸激酶是src，lck，fyn，Zap70和yes。各激酶的底物已部分确定，是含有一个酪氨酸的短肽。激酶的某些特异性彼此重迭，因而，不同的激酶可同等地磷酸化某些肽，而优先磷酸化另一些。对这5种激酶来说，挑选了36种表现出谱特异性和重迭特异性的肽底物。

使用100块96孔测试板；各孔包含36种通用寡核苷酸锚分子。制备36种接头将通用寡核苷酸列阵(只有锚分子)转变成包含肽底物的列阵。合成这36种肽底物，各自通过酰胺键与具有5’氨基的寡核苷酸共价连接。所述寡核苷酸具有与锚分子特异性杂交的序列。将肽／寡核苷酸接头加至MAPS板上所有孔内，它们自安装于表面。

为了进行筛检，向各孔加入适当浓度的5种激酶(以尽可能平衡底物的磷酸化速度)和8800种不同待测化合物之一。检测化合物直接抑制分离的酶的能力。加入只结合酪氨酸被磷酸化的肽的标记抗体，检测列阵内各肽磷酸化的量。有意义的是在部分而非全部磷酸酪氨酸位置表现出减少的那些孔。加入这些孔的化合物可进一步测试，作为部分被测激酶的选择性抑制剂。

该试验显示在图17上部。制备嵌合接头，其中与锚分子之一互补的25个碱基对与一种酪氨酸磷酸激酶的肽底物交联。该嵌合寡核苷酸-肽底物自安装于寡核苷酸锚分子列阵上，用激酶来磷酸化嵌合物的肽部分，酶反应后，用连有检测荧光团或酶的抗磷酸酪氨酸或抗磷酸丝氨酸抗体测定肽的磷酸化量。

试验结果显示于图下部。用均双官能交联剂DSS(Pierce)将寡核苷酸接头的5’氨基与带有磷酸化酪氨酸的合成肽的N末端连接。单字母的该肽序列：TSEPQpYQPGENL(SEQ ID：32)，其中pY代表磷酸酪氨酸。嵌合分子直接使用，或先调至pH14放置60分钟以部分水解酪氨酸上的磷酸基团。在MAPS板内，在所示浓度，经1小时，磷酸化的或部分去磷酸化的嵌合分子自安装于互补锚分子上。洗涤，并用0．3％BSA的SSPTP溶液封闭各孔后，加入与HRP交联的抗磷酸酪氨酸抗体(一SSPTP所配1∶3000稀释液)(抗体4G10购自Upstate Biotechnology，LakePlacid NY)，反应1小时，用化学发光底物Super Signal Blaze测定结合抗体的量。所示的图象的CCD列阵上的1分钟累积。如所预计的，发现与寡核苷酸-肽结合的磷酸酯的量有差异。该差异是测定以不同可能性抑制剂处理时一系列激酶活性的试验基础。实施例19：检测SH2结构域与磷酸化肽之间相互作用的选择性抑制剂的结合试验

SH2结构域是部分生长调节蛋白的停靠亚基。该结构域以不完善的特异性与含有磷酸酪氨酸的蛋白质或肽结合。即，有些磷酸酪氨酸肽与一种或数种SH2蛋白结合，另一些则与许多SH2蛋白广泛结合。

该试验的接头是与寡核苷酸共价连接的磷酸化的肽。选择能够与一组选定SH2蛋白结合的肽。接头将通用MAPS板转变成具有SH2蛋白基团特异性配体的测试板。制备100块带有这种配体的96孔MAPS板。分离蛋白质，用例如cy5荧光分子标记。

为了筛检SH2结构域／磷酸肽相互作用的抑制剂，向100块96孔MAPS板的各孔内加入标记的SH2蛋白组，并每孔加一种不同的测试化合物。因此可检测各化合物单独对SH2蛋白与其磷酸肽配体相互作用的效果。该试验测定与结合于表面的各肽接头结合的SH2蛋白的荧光。对于表现为部分而非全部位置荧光减弱的孔，加入其中的化合物可接受进一步试验，作为可能的SH2停靠作用的选择性抑制剂。

实施例20：大处理量的筛检(图22)

所示的是一块大处理量的MAPS板，显示在一次实验种检测来自96孔的信号。在80孔内，以16份重复测定与相同寡核苷酸的杂交。如图所示，1280次杂交实验的重现性非常高。最左栏和最右栏是对照，用于不同浓度寡核苷酸信号的标准化。

以类似方式，可在各孔内测试16种不同的寡核苷酸，该测试在板上80个孔内重复。当然，还可在各孔内实验更多的不同寡核苷酸或其他探针(例如100种寡核苷酸探针)，并同时实验许多测试板(例如，100块96孔微滴板)。可对各样品进行大量实验(后一种情况中约为100种不同实验)，并可同时对大量样品进行实验(例如，后一种情况中，约96×100即9600种不同样品)，因而具有处理量大的特点。

根据以上所述，本领域熟练技术人员可轻易发现本发明的本质特征，并可在本发明构思和范围内修改本发明以适应不同用途和情况。

无需更多赘述，本领域熟练技术人员能够利用以上描述对本发明进行最充分的运用。所以，以上优选实施例只应理解成对所公开的其他内容的说明而不是限定。

本发明参考了所有在此引用的专利申请、专利和出版物。

Claims

1．一种用于检测样品中一种或多种靶分子的组合，在加入所述样品之前它包括：

a)一个表面，具有许多空间上分开的区域，其中至少2个基本相同，各区包含：

b)至少8种不同寡核苷酸锚分子，各自连接

c)双官能接头，该接头具有对寡核苷酸锚分子特异性的第一部分，和包含所述靶分子的特异性探针的第二部分。

2．根据权利要求1所述组合，其中各区包含至少64种不同寡核苷酸锚分子。

3．根据权利要求1所述组合，具有至少96至1536个基本相同的区域。

4．根据权利要求1所述组合，其中各区包含30至100个探针，各自对不同的靶分子具有特异性。

5．根据权利要求1所述组合，具有96个基本相同的区域，各区包含16、36、46或100种不同的寡核苷酸锚分子。

6．根据权利要求1所述组合，具有384个基本相同的区域，各区包含9、16或25种不同寡核苷酸锚分子。

7．根据权利要求1所述组合，具有1536个基本相同的区域，各区包含4或9种不同寡核苷酸锚分子。

8．根据权利要求1所述组合，其中各区再分割成更小的亚区。

9．根据权利要求1所述组合，其中各区还包含杂交效率和特异性的对照。

10．根据权利要求1所述组合，其中各区还包含位点靶分子结合容量的对照。

11．根据权利要求1所述组合，其中所述探针是核酸。

12．根据权利要求1所述组合，其中所述探针是肽或蛋白质分子。

13．根据权利要求12所述组合，其中所述肽或蛋白质分子与带有偶联分子的所述接头分子的第一部分偶联。

14．根据权利要求13所述组合，其中的偶联分子是生物素或链霉亲和素。

15．根据权利要求1所述组合，其中所述探针是酶的底物或受体的配体。

16．一种用于检测样品中一种或多种靶分子的组合，在加入所述样品之前它包括：

a)一个表面，具有许多空间上分开的区域，其中至少2个基本相同，各区包含

b)至少8种不同锚分子，各自连接

c)双官能接头，该接头具有对锚分子特异性的第一部分，和包含所述靶分子特异性探针的第二部分。

17．一种检测样品中至少一种靶分子的方法，它包括在所述靶分子与权利要求1所述组合结合的有效条件下，将可能含所述靶分子的样品与权利要求1所述组合接触。

18．一种检测一种或多种靶分子的方法，它包括：

a)在所述靶分子与权利要求1所述组合结合的有效条件下，将可能包含所述靶分子的样品与权利要求1所述组合接触，

b)将所述组合和所有结合的靶分子与经标记的检测探针接触，

c)检测所述检测探针。

19．根据权利要求17所述方法，其中所述经标记的检测探针产生化学发光信号。

20．根据权利要求17所述方法，其中测定的是靶分子。

21．根据权利要求17所述方法，还包括对所述样品进行核酸酶保护。

22．根据权利要求17所述方法，它鉴定RNA表达模式，其中所述靶分子是至少2种RNA分子，所述组合的所述探针是至少对所述靶mRNA之一具有特异性的寡核苷酸，所述样品与所述组合的培养是在所述RNA靶与所述探针特异性杂交的有效条件下进行的。

23．根据权利要求22所述方法，它鉴定改变RNA表达模式的试剂，它还包括比较所述试剂存在下所产生的RNA表达模式和另一组不同条件下所产生的RNA表达模式。

24．根据权利要求17所述方法，其中所述靶分子是保护片段。

25．根据权利要求17所述方法，它还包括：

a)将RNA抽提物与一种或多种保护片段在所述保护片段与抽提物内感兴趣RNA杂交的有效条件下一起培养，

b)用一种或多种核酸酶处理所述抽提物，有效消化除与感兴趣RNA杂交的保护片段和所述RNA杂交部分之外几乎全部核酸，

c)去除除与感兴趣RNA杂交的保护片段之外几乎全部核酸，提供含有作为靶分子的保护片段的样品。

26．根据权利要求17所述方法，其中所述组合包含大量所述区域，所述方法是一种大处理量方法。

27．一种快速分析大量样品的方法，它包括将各样品置于权利要求1所述组合的分开区域，检测有无所述靶分子。

28．一种检测至少一种靶分子的方法，包括：

a)在获得所述靶分子与所述接头之间第一杂交产物的有效条件下，将可能包含靶分子的样品与双官能接头接触，所述接头具有对寡核苷酸锚分子特异性的第一部分，和包含所述靶分子的特异性探针的第二部分，

b)在获得所述第一杂交产物与所述组合之间第二杂交产物的有效条件下，将所述第一杂交产物与组合接触，所述组合在加入所述第一杂交产物之前包含：

1)一个表面，具有许多空间上分开的区域，其中至少2个基本相同，各区包含，

2)至少8种不同寡核苷酸锚分子，

c)将所述第一杂交产物或所述第二杂交产物与标记过的侦探探针接触，

d)检测所述侦探探针。

29．一种用于检测样品中至少一种靶分子的试剂盒，它包括：

a)一个表面，具有许多空间上分开的区域，其中至少2个基本相同，各区包含至少8种不同寡核苷酸锚分子，

b)一套有关将至少一种所述寡核苷酸锚分子与双官能接头连接的说明，所述接头具有对至少一种寡核苷酸锚分子具有特异性的第一部分，和包含对至少一种所述靶分子具有特异性的探针的第二部分。

30．根据权利要求29所述试剂盒，它包含：

c)一种含有至少一种双官能接头的容器，所述接头具有对至少一种寡核苷酸锚分子具有特异性的第一部分，和包含对至少一种所述靶分子具有特异性的探针的第二部分。

31．一种检测一种或多种感兴趣的核酸的方法，它包括：用一种或多种保护片段对含所述核酸的样品进行核酸酶保护，用质谱法检测杂交双链分子、或单链的被保护核酸分子、或保护片段。

32．根据权利要求31所述方法，其中的方法是一种大处理量的方法。

33．根据权利要求32所述方法，其中所检测的核酸是保护片段。

34．根据权利要求33所述方法，其中检测至少2种不同保护片段。

35．根据权利要求33所述方法，其中检测至少16种不同保护片段。

36．根据权利要求32所述方法，其中所检测的核酸是杂交双链分子。

37．根据权利要求32所述方法，其中所检测的核酸是被保护的核酸。

38．根据权利要求32所述方法，其中所测定的是所述感兴趣的核酸。

39．根据权利要求38所述方法，其中所测定的核酸是保护片段。

40．根据权利要求32所述方法，其中所述保护片段被化学修饰，并检测带有或不带保护片段核酸部分的所述化学修饰。