CN1309294A

CN1309294A - 生物传感器

Info

Publication number: CN1309294A
Application number: CN01103038A
Authority: CN
Inventors: 山本智浩; 渡边基一; 池田信; 南海史朗
Original assignee: 松下电器产业株式会社
Current assignee: PHC Corp
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2001-08-22
Anticipated expiration: 2021-01-19
Also published as: JP2001201479A; DE60123142D1; US6436255B2; ES2270958T3; US20010050227A1; EP1118675A3; EP1118675B1; CN1157599C; DE60123142T2; EP1118675A2

Abstract

本发明提供一种生物传感器,它具有绝缘性基板、设置在上述基板上的至少包括测定电极和对应电极的电极系、与上述基板相组合的、在与基板之间形成向上述电极系供给试样液的试样液供给通路的盖件、至少含有电子介体和氧化还原试剂的反应试剂系、以及加载了反应系中电子介体和氧化还原酶中的至少一种的载体,所述载体的一部分或全部配置在试样液供给通路之外。

Description

生物传感器

本发明涉及可对试样中的测定对象物简便地进行迅速而高精度的定量的生物传感器。

迄今为止，作为无需将试样液稀释、搅拌等即可对试样中的特定成分进行简易定量的方式，已有各种各样生物传感器的方案提出。其中一例是日本特许公开公报1990年第062952号公开的下述传感器。

即，用网板印刷等方法在绝缘性基板上形成由测定电极、对应电极和参比电极组成的电极系，然后在该电极系上紧接着电极系，形成含亲水性高分子、氧化还原酶和电子介体的酶反应层。根据需要，可在该酶反应层中添加缓冲剂。

当在如此制得的生物传感器的酶反应层上滴加含底物的试样液时，酶反应层溶解，酶与底物反应，电子介体随之被还原。酶反应结束后，将该被还原的电子介体电化学氧化，根据此时得到的氧化电流值可求出试样液中的底物浓度。

由于上述生物传感器选用以测定对象为底物的酶，因此在原理上可测定各种物质。例如，若使用葡萄糖氧化酶作为氧化还原酶，则可构成测定血液中的葡萄糖浓度的生物传感器。该传感器作为葡萄糖传感器已被广泛地实用化了。此外，若使用胆固醇氧化酶，则可构成测定血清中的胆固醇的生物传感器。

通常，用作诊断指征的血清胆固醇值是胆固醇和胆固醇酯的浓度的总量。胆固醇酯不能成为胆固醇氧化酶的氧化反应的底物。因此，测定作为诊断指征的血清胆固醇值时，需要有将胆固醇酯转化成胆固醇的过程。作为催化该过程的酶，已知的有胆固醇酯酶。

使用酶反应层中含有该胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的生物传感器，可测定血清中的总胆固醇浓度。

上述结构的生物传感器中的酶反应层通过将至少含有氧化还原酶的试剂的水溶液滴加在上述电极系上、干燥、加载在生物传感器上而成。用这种方法加载试剂时，若试剂量多，则将试样液滴加在反应层上时，反应层不能迅速溶解，从而存在需要测定时间长的问题。

尤其是胆固醇传感器，由于酶反应层中必须含有胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶共二种酶，因此，试剂的加载量变得非常多，试样液滴加后的酶反应层的溶解需要很长的时间，不能迅速地测定。

为此，已有这样的生物传感器的方案提出(日本特许公开公报2000年039416号)。该生物传感器的特征在于，具有绝缘性基板、设置在上述基板上的至少包括测定电极和对应电极的电极系、与上述基板相组合的、在与基板之间形成向上述电极系供给试样液的试样液供给通路的盖件、以及加载了至少含有氧化还原酶的试剂的纤维载体，所述载体配置在试样液供给通路内。

其特征还在于，具有绝缘性基板、设置在上述基板上的至少包括测定电极和对应电极的电极系、以及加载了至少含有氧化还原酶的试剂的纤维载体，所述载体由粘合剂固定在电极系的近旁。

但在该生物传感器中，由于上述载体被配置在试样液供给通路内，因此，试样液供给通路的高度必须至少大于上述载体的厚度。实际上，上述载体与上述电极系是对向配置的，为防止载体表面与电极系接触，需要有一定的空隙，由此，试样液供给通路的高度变得更大。

因此，在试样液供给通路内配置载体时，为在试样液供给通路内充满试样液，所需试样液量必须至少是由载体外形算出的体积乘以载体空隙率的值与载体表面和电极系的空隙之和的量。

另一方面，为提高试剂的溶解性，上述载体的空隙率越高越好。

由于以上特征，在上述生物传感器中，与无需载体的生物传感器相比，存在着测定所需的试样液量多的倾向。

此外，由于载体配置在试样液供给通路内，因此，在试样液为血液时，若使用滤纸等多孔体对血液样品作预处理而使生物传感器滤去血球成分时，有时会给经血球过滤用的多孔体过滤的试样液进入试样液供给通路内带来若干困难。

鉴于上述问题，本发明的目的是，提供一种可提高试剂的溶解性、迅速进行测定、且可减少试样液的生物传感器，本发明的目的还在于，提供一种可容易导入试样液的生物传感器。

本发明的生物传感器特征在于，具有绝缘性基板、设置在上述基板上的至少包括测定电极和对应电极的电极系、与上述基板相组合的、在与基板之间形成向上述电极系供给试样液的试样液供给通路的盖件、至少含有电子介体和氧化还原酶的反应试剂系、以及加载了反应系中电子介体和氧化还原酶中的至少一种的载体，所述载体的一部分或全部配置在试样液供给通路之外。

在本发明的上述生物传感器中，载体具有未加载上述反应试剂系中的任一个的区域，加载了电子介体和氧化还原酶中的至少一种的区域配置在更靠近上述电极系的位置。

上述氧化还原酶可以是胆固醇氧化酶。

上述反应试剂系最好含有能水解胆固醇酯的酶。

上述能水解胆固醇酯的酶可以是胆固醇酯酶。

上述反应试剂系最好含有表面活性剂。

上述载体可以是多孔体，上述载体可以是纤维质的(由纤维构成)。

图1是本发明一实施例的生物传感器的分解立体图。

图2是将图1所示生物传感器的盖板与隔板重合的盖件的立体图，与图1成上下倒置关系。

图3是图1的生物传感器的主要部分的垂直剖视图。

图4是本发明的另一实施例的生物传感器的主要部分的垂直剖视图。

图5是本发明的又一实施例的生物传感器的主要部分的垂直剖视图。

图6是本发明的再一个实施例的生物传感器的主要部分的垂直剖视图。

图7是本发明的还有一个实施例的生物传感器的主要部分的垂直剖视图。

如上所述，本发明的生物传感器在由多孔体构成的载体上加载了含有电子介体和氧化还原酶中的至少一种的试剂。

由于加载在载体上的试剂是以附着在构成载体的多孔体的表面的形式加载的，因此，与试样液接触的试剂的表面积增大，试剂在试样液中的溶解性提高。

载体只要具有加载试剂的功能、其自身对生物传感器内发生的酶反应和电化学反应呈惰性，可以是各种物质。例如，较好的有层压成绒头织物状或毡状的纤维素纤维、玻璃纤维或由高分子化合物构成的纤维等。

对于生物传感器内的载体的配置，可进行各种变化。一种形式是，在将全部载体配置在上述盖件的试样液供给通路之外的同时，使载体的端部与上述试样液供给通路的前端接触。

另一种形式是，将载体的一部分插入上述盖件的试样液供给通路中。这样，将载体的至少一部分露出于上述试样液供给通路之外，可使试样液容易浸润载体，从而使加载在载体上的试剂迅速溶解。

但使用的试样液是可能会对电极反应或酶反应产生不良影响的含有固态成分的血液等液体时，在上述载体的至少一部分区域不加载上述试剂，使血液等含有固态成分的试样液从该区域浸润，可滤去固态成分。

在使载体与上述盖件的试样液供给通路接触时，最好将载体与盖件的一部分和设有电极系的绝缘性基板的一部分中的任一个或两者粘合固定。

所用的粘合剂最好具有在制作传感器时的环境中不会渗入载体的高粘性，粘合后对水的溶解性低，或者溶解在水中后在水溶液中呈电化学惰性。例如，使用木工用的粘合剂(如SEMEDAIN株式会社生产的SEMEDAINc)，效果较佳。

加载在载体上的氧化还原酶可以是各种各样的。例如，可以是葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、胆固醇氧化酶。

测定血清胆固醇值时，使用胆固醇氧化酶和能水解胆固醇酯的酶。能水解胆固醇酯的酶的例子有胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等。尤其是胆固醇酯酶，通过使用适当的表面活性剂，可迅速地将胆固醇酯转化成胆固醇，因此效果较佳。

使用能水解胆固醇酯的酶时，将能提高该酶活性的表面活性剂加入到加载在载体的全部或其一部分的试剂中，可缩短酶反应所需的时间。

例如，可任意地使用正辛基-β-D-硫葡糖苷、聚乙二醇单月桂基醚、胆酸钠、月桂基-β-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、N,N-二(3-D-葡糖酰胺基丙基)胆酰胺、N,N-二(3-D-葡糖酰胺基丙基)脱氧胆酰胺、聚氧乙烯-对-叔辛基苯基醚(例如，Sigma公司生产的Triton X-100)等作为提高胆固醇酯酶活性的表面活性剂。

用铂等电化学稳定的金属制成生物传感器的电极系，则所得氧化电流值不会有误差。但由于这样的金属价格昂贵，因此，在一次性传感器中，用银膏等形成银电极后再用碳糊包覆，形成电极系。

但若试样液中含有表面活性剂，则由于表面活性剂的作用，试样液会浸润到碳粒子之间。其结果是，碳电极的活性可能会下降。此外，试样液变成与银电极接触的状态。由此，在该状态下在测定电极上施加电压，有时会发生银电极引起氧化反应、产生电流、从而使测定电流值产生正的误差的情况。

为抑制此现象，已有用亲水性高分子包覆电极系表面的方法。该亲水性高分子即使在导入试样液时仍然呈粘稠层的状态，从而可抑制试样液与电极接触。这样的亲水性高分子的例子有羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙基纤维素、羟丙基纤维素、明胶、聚丙烯酸及其盐、淀粉及其衍生物、马来酸酐及其盐、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯树脂、聚甲基丙烯酸2-羟乙酯等也可加载氧化还原酶、胆固醇酯酶等酶，使其包覆该亲水性高分子层。此时，在上述载体上加载电子介体。

最好将卵磷脂等亲水亲油性物质溶解在有机溶剂中，将所得溶液滴加在覆盖电极系的层(即，亲水性高分子层或覆盖亲水性高分子的酶层)上，干燥，形成亲水亲油性物质层，将覆盖电极系的层进一步包覆。

这样的亲水亲油性物质层对于酶反应和电极反应是不必要的，但通过设置该层，可使试样液顺利导入。可用于此目的的亲水亲油性物质以卵磷脂等磷脂质等亲水亲油性脂质为佳。

此外，为使在载体中与被加载的反应试剂系混合、完成了一系列反应的试样液或反应进行中的试样液顺利地充满试样液供给通路内并到达电极系，可在盖件的与试样液供给通路面对的部分或在电极系表面设置表面活性剂层。

用于该用途的表面活性剂最好选自上述能提高胆固醇酯酶活性的物质，但如果不影响反应系，也可以是其他物质。

设置该表面活性剂层时，必须设置上述覆盖电极系表面的亲水性高分子层。此时，将表面活性剂溶解在不会使上述覆盖电极系表面的亲水性高分子层溶解的溶剂中，将所得溶液滴下，使其覆盖上述亲水性高分子层，然后干燥，由此设置表面活性剂层。

在载体中加载电子介体，但对于此用途，可任意地使用铁氰化钾、对苯醌、N-甲基吩嗪鎓硫酸单甲酯盐、二茂铁衍生物(氧化体)等水溶性的、可成为酶-电极间电子移动的媒介的化合物。

氧化电流的测定方式有仅测定电极和对应电极的二极电极方式以及加入了参比电极的三极方式，三极方式可更正确地进行测定。

下面通过具体实施例对本发明作详细说明，但本发明不限于这些实施例。图1是本发明一实施例的生物传感器的分解立体图。

如图1所示，在由聚对苯二甲酸乙二醇酯制成的绝缘性基板1上，用网板印刷法印刷银膏，形成导线2、3和电极系的基底。然后，将含有树脂粘合剂的导电性碳糊印刷在基板1上，形成包含测定电极4和对应电极5的电极系，另外，再印刷绝缘性膏，分别形成绝缘层6。测定电极4和对应电极5分别与导线2和3连接。绝缘层6使测定电极4和对应电极5露出部分的面积保持恒定，并部分覆盖导线。

将用上述方法形成电极系的绝缘性基板1和具有空气孔11的盖板9、隔板8和加载了试剂的载体13按图1中点划线所示位置关系接合，制成生物传感器。

在这种结构的生物传感器中，在基板1和盖板9之间，构成试样液供给通路的空间部分形成于隔板8的隙缝12的部分。

试样液从成为试样液供给通路口的开口部10导入传感器内部。在本实施例中，开口部10至空气孔11的长度为4.5mm，隙缝的宽度为2.0mm，隙缝的深度为0.1-0.3mm。

由于前述各尺寸的标示是规定下面所示载体的尺寸所必不可少的，因此，作了描述，但各尺寸并不限于所述的那些。

图2是将隔板8与盖板9重合的盖件的立体图，与图1成上下倒置的关系。将该盖件与基板组合，形成构成试样液供给通路的空间部分。

图3是本发明一实施例的生物传感器的垂直剖视图。与图1同样，在绝缘性基板1上形成电极系，在该电极系上形成亲水性高分子层7，再形成覆盖亲水性高分子层的由胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶构成的酶层18，加载TritonX-100，作为表面活性剂层19。

在构成试样液供给通路的盖板背面部分配置卵磷脂层17，用粘合剂14将加载了试剂的载体13粘合在上述盖板9上并使其与试样供给口10接合。

图4是本发明的另一实施例的生物传感器的垂直剖面图。与图3同样，在绝缘性基板1上形成电极系，在该电极系上形成亲水性高分子层7、卵磷脂层17。加载了试剂的载体13由粘合剂14固定在盖板9上，其位置在试样供给口10附近至试样供给通路的外侧。

图5-图7是本发明的又一实施例的生物传感器的部分剖面图。图中省略了电极系、亲水性高分子层、表面活性剂层等。

在图5所示生物传感器中，载体13的一部分由粘合剂14固定在构成试样供给通路的盖板背面部分。载体13的向外露出一侧的端部由绝缘性基板的试样供给口侧的端部而延长。

在该实施方式中，从上部(即，盖板侧)或从下部(即，绝缘性基板侧)均可将试样供给至载体。

在图6所示生物传感器中，与图5所示生物传感器相反，绝缘性基板的试样供给口侧的端部由载体13的向外露出一侧的端部而延长。

在该实施方式中，可将试样添加在绝缘性基板上，尤其当试样湿润载体需要较长时间的时候(如试样为血液时)较有利。

在图7所示生物传感器中，通过在绝缘性基板1的构成试样供给通路的部分设置1处以上的突起15将载体13固定。

根据该结构，不用粘合剂就可将载体13固定。此外，将突起15中的至少一个做成枕木状，可抑制由于试样液在载体外部通过、直接到达电极系从而导致加载在载体上的试剂不能充分溶解的现象。

实施例1

在本实施例中，用以下方法制成图3所示结构的生物传感器。

首先，在图1的基板1上的电极系上，滴加亲水性高分子羧甲基纤维素的钠盐(以下称“CMC”)的0.5重量％水溶液，在50℃的温风干燥器中干燥10分钟，形成CMC层7。

接着，滴加400单位/mL的胆固醇氧化酶(以下称“ChOx”)、2000单位的胆固醇酯酶(以下称“ChE”)的混合溶液2μL，覆盖CMC层，形成酶层18。

再滴加TritonⅩ-100的5.0％乙醇溶液1μL，使其覆盖酶层18，干燥，形成表面活性剂层19。该表面活性剂层19是为了使试样液能顺利地覆盖电极系而设置的，但为了提高ChE的活性，使用了TritonⅩ-100。此外，在形成试样液供给通路的盖板背面，设置卵磷脂层17。

另外，制备了厚0.2mm、宽2mm、长10mm的毡状玻璃滤器，用液氮将该玻璃滤器冷却，在该玻璃滤器的一侧的前端附近滴加作为电子介体的铁氰化钾。该玻璃滤器由于被液氮冷却，因此，滴加的铁氰化钾水溶液在滴加后立即冻结，不会扩散到整个玻璃滤器上。

滴加铁氰化钾水溶液，使其渗透至离该玻璃滤器的一侧的前端约2mm的部分并冻结，然后在冷冻干燥器中减压、干燥约4小时左右。在该玻璃滤器的一侧的前端约2mm以内的范围内，加载了0.33μmol/mm²的铁氰化钾。

按图1所示，将上述部分加载了铗氰化钾的玻璃滤器作为载体粘合固定。此时，配置载体，使载体的附着了铁氰化钾的部分的边缘与试样供给通路的前端接触。并且，按图1中点划线所示位置关系，将该盖件与基板1接合，制成生物传感器。

试样液供给通路的隙缝深度为0.1mm。

在这样制成的生物传感器中，作为试样液，供给血液或者在使渗透压保持恒定的同时将标准血清稀释而成的溶液与血球的混合溶液10μL，使其从载体13的未加载铗氰化钾的部分的宽2mm的边缘被吸引。

其结果，在血球成分到达载体中未加载铁氰化钾的部分之前，试样液的滤液部分将载体中的铁氰化钾溶解，从试样液供给口渗入试样液供给通路，电极系表面被试样液充满。并且，3分钟后，以对应电极为基准，在测定电极上向正极方向施加+0.5V的脉冲电压，5秒钟后测定测定电极和对应电极之间流过的电流值。

其结果，显示出依存于试样液中总胆固醇浓度的应答值。实施例2

在本实施例中，用以下方法制成图4所示结构的生物传感器。

与实施例1同样，在图1的基板1上的电极系上形成CMC层7和卵磷脂层17。在构成试样液供给通路的盖板背面部分也形成卵磷脂层17。

然后，在厚0.2mm、宽2mm、长4.5mm的毡状玻璃滤器上加载铁氰化钾、ChOx、ChE、用于提高ChE活性的表面活性剂TritonⅩ-100。

铁氰化钾的加载量为0.33μmol/mm²玻璃滤器。ChOx的加载量为0.1单位/mm²玻璃滤器。ChE和TritonⅩ-100的加载量分别为1单位和0.15mg。

在盖板内侧涂布作为粘合剂14的木工用粘合剂(SEMEDAIN株式会社生产的SEMEDAINc)，将载体粘合固定，使其前端位于离试样液供给口1mm的位置。由此得到载体的大部分露出于试样供给通路之外的生物传感器。

在这样制成的生物传感器中，以标准血清或用生理盐水将标准血清稀释而成的溶液作为试样液，添加在载体的露出于试样液供给通路之外的部分，按与实施例1相同的方法测定应答值，得到依存于胆固醇浓度的良好的应答性。在此时的载体中，试剂的溶解性非常好，而且，试样液向试样供给通路的渗入也非常顺利。如上所述，根据本发明，即使用少量的试样，也能非常顺利地导入试样液且可提高试剂的溶解性、迅速进行测定。

Claims

1．生物传感器，具有绝缘性基板、设置在上述基板上的至少包括测定电极和对应电极的电极系、与上述基板相组合的、在与基板之间形成向上述电极系供给试样液的试样液供给通路的盖件、至少含有电子介体和氧化还原试剂的反应试剂系、以及加载了反应系中电子介体和氧化还原酶中的至少一种的载体，所述载体的一部分或全部配置在试样液供给通路之外。

2．如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述载体具有未加载反应试剂系中任一个试剂的区域，加载了电子介体和氧化还原酶中的至少一种的区域配置在更靠近电极系的位置。

3．如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述氧化还原酶是胆固醇氧化酶。

4．如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述反应试剂系含有能水解胆固醇酯的酶。

5．如权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，所述能水解胆固醇酯的酶是胆固醇酯酶。

6．如权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，所述反应试剂系含有表面活性剂。

7．如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述载体是多孔体。

8．如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述载体由纤维构成。