实施例1
灵长类抗CD23抗体的产生
大体上按照在申请流水号08/379,072(美国专利5,658,570,已被收作本文的参考文献)中公开的方法,从短尾猴中分离出五种对CD23专一的灵长类单克隆抗体。所利用的确切技术如下文所详尽描述的。
分离和鉴定抗人CD23单克隆抗体的方法
从8866细胞中纯化免疫原sCD23
在纯化期间,利用鼠抗CD23抗体(结合位点,目录#MC112)作为捕捉,由三步ELISA量化可溶性CD23(sCD23)。利用补充有10%胎牛血清(JRH生物科学)和4mM谷氨酰胺(JRH生物科学;目录#90114)的RPMI1640(JRH生物科学;目录#56-509),在37℃下从8866细胞(保持在悬浮生物反应器中)培养物中部分纯化抗原。利用二氧化碳来保持7.1的pH值。在利用0.45μm过滤除去细胞之后,加入苯甲基磺酰氟(终浓度0.2mM,Sigma化学公司;目录#p-7626)和乙二胺四乙酸(终浓度3mM,Sigma化学公司;目录#EDS)到上清液中,并将溶液存储在2-8℃下。在环境温度下,利用中空纤维超滤柱(A/T技术;目录#UFP-10-9A;10,000d MWCO)或者切向流超滤柱(Filtron公司;10,000d MWCO)浓缩无细胞上清液大约15至20倍。无菌过滤所浓缩的上清液,并将其存储在-70℃下。通过加入5g/L的SM-2 BioBeads(BioRad工业;目录#152-3920)和在2-8℃下搅拌一夜,使解冻的浓缩液脱脂。由过滤除去树脂并将溶液存储在2-8℃下。对于一些sCD23的制备物,在脱脂之前或之后利用硫酸铵(35-70%(W/V);Fisher;目录#A702-3)分级分离浓缩物。
其后在2-8℃下利用亲和层析纯化去脂溶液。通过利用CNBr活化的琼脂糖凝胶4B(Sigma化学公司;目录#C-99142)来共价连接鼠抗CD23单克隆抗体(BU38)与琼脂糖凝胶,来制备亲和性基质。利用A蛋白层析从腹水(结合位点;目录#CUS830)中纯化BU38抗体至大于90%均一性。将去脂溶液施用于用pH 7.2的1XPBS(Gibco BRL;目录#70013-0.32)平衡的亲和柱(1.5×5cm)中,并用包含0.05%NP40(Sigma化学公司)的、pH值为7.2的1XPBS洗涤柱,以除去不结合的蛋白质。利用3.5M MgCl2 Fisher;目录#M33-500)洗脱可溶性CD23。在2-8℃下结合并用1×PBS(PH7.2)透析(Baxter Spectra/Por;目录#D1615-1)包含sCD23的组分。在透析之后,利用Centriprep 10旋转过滤器(Amicon公司;MWCO 10,000 d)通过离心浓缩蛋白质溶液,并将制备物存储在-70℃下。利用SDS-PAGE分析(4-20%预制凝胶,Novex公司)和Coomasie染色估得sCD23的纯度大于70%。
灵长类的免疫和免疫细胞的分离
用自人RPMI 8866细胞(B细胞淋巴瘤,Hassner和Saxon,免疫学杂志,132:2844(1984))的上清液中纯化的可溶性CD23免疫接种猕猴(White Sands研究中心,Alamogordo,新墨西哥)。用在混合有167μlTemuritide(佐剂肽)(Sigma,St.Louis,MO,目录#A-9519)和333μl3X PROVAX((IDEC药物公司)的500μl PBS中的200μg可溶性CD23,每第三周免疫接种每只猴子一次。免疫可由如下方式实现:皮内、腹膜内、肌肉内和皮下。通过对8866细胞进行的ELISA来测定猴子血清中的抗CD23抗体的滴度,并将该滴度与得自相同猴子的预先流血的滴度进行比较。
处死具有五万血清滴度的猴子PRO 978,并外科除去脾和淋巴结,并在冰上将所得样品输送到IDEC药物上,将其浸没于补加有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠和50μg/ml庆大霉素的无菌RPMI-1640(Gibco BRL,Gaithersburg,MD,目录#21870-050)中。一旦到达,就通过用玻璃研棒挤压其通过金属丝网,以匀化脾。用以氯化铵为基的低渗缓冲液溶解红血细胞,收集余下的淋巴细胞并用RPMI-1640至少洗涤三次。同样地将淋巴结匀化为单一细胞悬液,收集之并用RPMI-1640洗涤至少三次。
杂交瘤的产生
在最后洗涤之后,计算细胞量,然后利用标准技术(Boerner等,免疫学杂志,147:86(1991)),将以上获得的灵长类细胞体融合到小鼠-人异种杂交瘤细胞系H6K6/B5(Carroll等,免疫学方法杂志,89:61(1986))中,并且以每孔300,000个细胞将其平板接种到96孔平皿(对于脾为175个平皿或14,700个孔,对于淋巴结为17个平皿或者1386个孔)中。
该方法包括以2∶1的比例混合淋巴细胞和以上确定的融合配偶体,其中用1分钟使细胞缓慢地再悬浮进入50%的PEG 1500(Sigma,目录#P5402)中,然后静置细胞1分钟,并使其缓慢地再悬浮于过量的RPMI-1640中。其后,再一次静置细胞15分钟,然后以250×g的低速旋转。然后使细胞再悬浮于RMPI-1640生长培养基中,该培养基补加有20%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸和50μg/ml庆大霉素,该庆大霉素包含100μM次黄嘌呤、16μM胸苷(BoehringerMannheim,德国,#623091)和5.8μM重氮丝氨酸(Sigma,目录#A1164)(HTA)。HTA是选择剂,其使成功融合的细胞(与异种杂交瘤融合配偶体融合的灵长类淋巴细胞)得以存活。
大约65%的孔显示出生长(10,500个孔)。然后利用三步细胞ELISA来筛选这些孔,以确定抗人CD23抗体的存在。
ELISA方法
ELISA的第一步包括将50μl上清液从每孔转移至96孔平板中,该平板每孔预先涂布有105个8866细胞(CD23阳性细胞系)。在室温下首先用50μl包含20μg/ml聚L-赖氨酸(Sigma,目录#P1399,MW150,000-300,000)的水溶液涂布平板三十分钟,来制备这些平板。除去(“摇出”)余下的溶液,并将平板静置干燥。一旦干燥,就转移50μl在PBS中的8866细胞,并且在600g下旋转五分钟。通过用15分钟加入在磷酸盐缓冲液(PBS)中的50μl0.5%戊二醛(Sigma,目录#06257),使8866细胞与平板共价结合。除去(摇出)戊二醛,并用在0.1%BSA-PBS中的150μl 100mM甘氨酸(Sigma,目录#2879)封闭平板。在上清液加入之后,在37℃下温育平板1-2小时并用自来水洗涤7-9次,并且加入偶联至辣根过氧化物酶(HRPO)(Southern Biotech,伯明翰,Alabama,目录#2040-50)上的山羊抗人IgG抗体,该HRPO已以1∶2000稀释至在PBS-0.05%吐温20(Sigma,目录#P1379)中的1%干燥脱脂乳(Vons)中。在37℃下温育平板45分钟,并用自来水再洗涤7-9次。在每孔加入100μl TMB试剂(Kirkegaard和Perry,Gaithersburg,MD,目录#50-76-02和50-65-02)之后,通过颜色发展来检测HRPO的存在。通过加入25μl 4N H2SO4来停止反应。在分光光度计(Titertek Multiscan)上在470nM波长下测量光密度(OD)。比背景值大2倍的光密度值打分为阳性。
进行ELISA的第二步以确定:在第一步ELISA中打分为阳性的上清液与CD23反应而不与一些无关的抗原反应。通过利用相同的ELISA方法,在SupT1细胞(ERC BioServices公司,Rockville,MD,目录#100)(一种CD23阴性人细胞系)上检验上清液,可以实现这一步。弃去在两个检验中同样打分的上清液。这些结果表明:10,500个有生长的孔中的56个显示出灵长类单克隆抗体的存在,其中该单克隆抗体在两步独立筛查步骤中在不同时间结合至8866细胞上,并且没有结合到SupT1细胞上。
实施ELISA的第三步以确定:按照前两步ELISA鉴定的上清液是否与可溶性CD23反应。在该第三步ELISA中,在4℃下用包含在50mMpH 9.3碳酸氢盐缓冲液中的2μg/ml BG-6(BiosourceInternational,Camarillo,CA,目录#CT-CD23-CF)涂布96孔平板一夜,其中BG-6是一种结合到可溶性CD23上但不抑制CD23-1gE结合的小鼠单克隆抗体。在除去涂布的缓冲液之后,在平板上加入50μl半纯化的可溶性CD23(以预定比例稀释于PBS中),并在室温下温育两小时。在用自来水洗涤平板7-9次之后,加入50μl得自所选孔的上清液。在用自来水洗涤平板7-9次之后,加入50μl用0.05%吐温20以1∶4000稀释在1%干燥脱脂乳(在PBS中)中的兔抗人IgG(小鼠吸附的)-HRPO(Southern Biotech,目录#6145-05),并在37℃下温育两小时,用自来水洗涤7-9次并用如上所述的TMB发展之。再一次给具有比背景值大2倍的光密度的孔打分为阳性。
在ELISA中,显示出与8866细胞结合的56孔之21孔也与sCD23结合。通过以每三孔一个细胞的密度平板接种细胞,来扩展这些孔并亚克隆至少两次。在大约三个月之后,获得产生对CD23的灵长类单克隆抗体的五种稳定的杂交瘤。
用A蛋白方法纯化抗体
本质上,通过离心培养物上清液以除去细胞和碎屑来纯化抗体。然后通过0.2μm滤器过滤所产生的离心样品。然后制备A蛋白琼脂糖凝胶快速流柱,并利用PBS(pH 7.4)平衡之。然后以一适当流速(2ml/min)将上清液加样到柱上。加样之后,以10柱量PBS(pH 7.4)洗涤洗柱。然后用洗脱缓冲液(0.2M乙酸、0.1M甘氨酸、pH 3.5)以1ml/min流速自柱上洗脱抗体。然后收集包含100μlTris的1ml组分/管(2.0M Tris-HCl pH 10.0)。其后,在280nm获取分光光度计读数。然后收集所产生的、在280nm波长下具有高吸收率的、包含抗体的组分,并用PBS透析一夜。然后由通过0.22μm膜的过滤来给产物灭菌,并存储在20℃下。
这五种灵长类抗人CD23单克隆抗体的四种(B3B11、2C8、5E8和6G5)在体外分析中显示出抑制IgE产生,其中这种分析测定由IL4-氢化可的松诱导外周血单核细胞(PBMC)培养物造成的IgE产生。这些结果显示在图1中。测定条件如下所述。第五种灵长类单克隆抗人CD23抗体3G12在这一测定中是失活的。
由IL-4刺激的外周血单核细胞的IgE产生
正如以上所讨论的,评估主题灵长类抗体及其PRIMATIZED形式在体外分析中抑制IgE产生的能力,该分析测定这样的抗体对由IL-4刺激的外周血单核细胞诱导的IgE产生的效应。
用于体外IL-4 IgE分析的材料
48孔平底群集平板(Costar,目录#3548)(每孔(48孔平板)每升一百五十万PBMCs))
人重组IL-4(Genzyme目录#2181-01;10μg(2.5×107单位))
抗CD23Mabs:鼠Mab(MHM6;DAKO.目录#M763);灵长类Mabs(无防腐剂);PRIMATIZED(无防腐剂)
HB101基础培养基:(Irvine科学目录#T000)
HB101补料:(Irvine科学目录#T151)
胎牛血清:(FBS;Bio-Whittaker目录#14-501F)
二甲基亚砜:(DMSO;Fisher科学目录#D128-500)
氢化可的松:(Sigma目录#H-0888)
嘌呤霉素:(Sigma目录#P-7255)
环己酰胺:(Sigma目录#C-7698)
Histopaque(:(Sigma目录#H-8889)
Hanks缓冲盐溶液:(HBSS;Irvine科学目录#9232)
在HBSS中的1%FBS
浓缩的Dulbecco磷酸缓冲盐水(10x DPBS;Bio-Whittaker,目录#17-517Q)
在DPBS中的浴池清洁杀微生物剂(Fisher,目录#13-641-334)
溶液
嘌呤霉素溶液:40μg/ml,在HB101生长培养基中
环己酰胺溶液:200μg/ml,在μg101生长培养基中
氢化可的松溶液:在DMSO中的0.1M溶液
充分透析抗CD23鼠Mabs,以除去防腐剂
HB101生长培养基:HB101基础培养基,500ml;在10ml中的HB101补料;无菌过滤的蒸馏水,5ml;FBS,10ml;氢化可的松溶液(终浓度为0.5μM),0.25ml
体外分析方法
在室温下利用HBSS以1∶4稀释buffy涂层细胞。在室温下温育一夜以溶解和分离原生质组分之后,从全血中得到这些细胞,凝结血小板和血纤蛋白以及buffy涂层细胞。
然后在50ml圆锥形试管中将30微升稀释的buffy涂层覆盖在15微升Histopaque上。然后在没有制动闸(IEC 216摇摆桶转子)下,在室温下以1700rpm离心这些试管20分钟。然后利用无菌移液管收集白色PBMC层,注意不要扰动其它层次。PBMCs(外周血单核细胞)是buffy涂层细胞,其中该细胞沉淀由在形成清晰可见的白色细胞层的HISTOPAQUE密度梯度下的部分离心得到。用移液管收集这些细胞,并用HBSS漂洗之,然后用血细胞计计算其个数。典型地,可以从单一的450ml buffy涂层包中回收300至600百万个PBMCs。
然后用1%FBS/HBSS洗涤所收集的PBMCs三次。在7℃下由离心(1300rpm,7分钟)收集洗得的细胞。
然后利用血细胞计测定收集得到的细胞的数量。将细胞浓度调整至每毫升HB101生长培养基大约三百万个细胞。
然后将大约1.5百万个细胞(0.5ml)加入至48孔平板的每孔中。一般,为每一实验制备五个重复样品。每个平板的周边孔不用于细胞样品。因此,这些孔利用例如0.5ml 0.05%浴池清洁液/DPBS填充。
然后将包含所需量IL-4和Mab的0.5ml HB101生长培养基加至孔中。所使用IL-4是重组DNA产生的人白细胞介素4。用于分析的Mab是鼠、灵长类或者PRIMATIZED抗体。典型地,以终浓度100U/ml加入IL-4,以终浓度0.01至3μg/ml加入Mab。
然后在潮湿温箱设备中在37℃下以5%CO2温育细胞9-11天。温育之后,收集上清液并测定IgE含量。
IgE ELISA
下列表确定用于IgE ELISAs的材料和溶液。
IgE ELISAs所需的材料和溶液
硫酸,4M
涂布缓冲液:10mM碳酸氢钠缓冲液,pH 9.6的浓缩磷酸盐缓冲盐溶液(10x PBS)母液:
NaH2PO 426.6gm
Na2HPO4 289gm
NaCl 1064gm
蒸馏水 10L
抑制缓冲液:10%FBS/PBS
稀释缓冲液:1%BSA/0.05%吐温20/PBS
洗涤缓冲液:0.05%吐温20/PBS
山羊抗人IgE(ε链特异性),未标记的:(Tago目录#4104)
人IgE标准物:(结合位点目录#BP094)
山羊抗人IgE,HRP标记的:(Tago目录#AHI 0504)
TMB过氧化物酶底物:(KPL目录#50-76-02)
过氧化物酶溶液B:(KPL目录#50-65-02)
工作底物溶液:以1∶1混合底物和溶液B
Immulon II微量滴定板(Dynatech Labs目录#011-010-3455)
IgE ELISA方法
利用包含2μg/ml山羊抗人IgE的100μl缓冲液涂布微量滴定板的每孔。
然后在4℃下温育涂布的平板一夜。
温育之后,然后以200μl吐温20/PBS洗涤平板上的每孔三次。洗涤之后,在37℃下以200μl抑制缓冲液/孔抑制非特异性结合位点1小时。
然后在每孔中加入100ml样品或者标准物;然后在4℃下温育这些孔一夜。温育之后,在稀释或者不稀释的条件下检验样品。利用几个从0.1至50ng/ml的IgE稀释液制备每个平板的标准浓度曲线。
温育一夜之后,以吐温20/PBS洗涤每个平板五次。
然后将以1∶14,000稀释在稀释缓冲液中的100μl辣根辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgE加入至每个导流孔中。然后在37℃下温育平板4小时。
然后以吐温20/PBS洗涤平板5次,并以水洗涤3次。
然后将100μl 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺工作底物溶液加入至每孔中。然后在室温下在暗处温育平板25分钟。温育之后,通过加入50μl4M硫酸来停止正发展的反应。
然后在450nm和540nm同时读取吸收值。减去作为背景的540nm吸收值。
灵长类单克隆抗人CD23抗体的Kd测定值的分析
Scatchard分析方法
1.放射性标记方法
用100mN磷酸缓冲液(pH 7.4)以每2粒小珠1mL缓冲液洗涤碘代珠两次。然后在滤纸上干燥小珠。
然后将以上两粒小珠加入至包含大约1mCi碘的100μl 125I溶液中,用200μl磷酸缓冲液稀释之,并在室温下存放5分钟。
将抗体(50μgs)加入至预装填的小珠中。得到最大掺入的放射性活度的反应时间是6分钟。
通过从反应容器中除去放射性标记的抗体来停止反应。
然后进行凝胶过滤以从放射性标记抗体溶液中除去过量的125I或者未结合的125I。由使放射性标记抗体通过由1.5mL葡聚糖凝胶-G25、1.5mL DEAE葡聚糖凝胶-A25和0.5mL安伯来特组成的柱来实现这一步骤。洗脱下放射性标记抗体,其总量为5mL,浓度为大约10μg/ml(洗脱缓冲液:包含10%明胶、2%叠氮化钠和1%BSA的1XPBS)
2.优化分析(直接结合研究)
取1μl样品并使样品运行在γ计数器上,测定10μg/ml放射性标记溶液的比活性。
例子:
·1×105cpm/μl×1000μl/10μg抗体
1×105cpm/μg抗体
1×104cpm/ng抗体
·抗体分子量=75,000ng/nmole
·比活性:
1×104cpm/ng×75,000ng/nmole=7.5×108cpm/nmole
在室温下用200μl/孔的抑制缓冲液(抑制缓冲液,包含10%明胶、2%叠氮化钠、1%BSA和10%FBS的1xPBS)抑制涂布抗原的平板1小时,(以消除非特异性结合,例如,用mB7.1-CHO)和背景平板(即未转染的CHO)。
然后洗涤平板,典型地用手以自来水洗涤10次。
然后利用多通道移液管,使两倍系列稀释液通过平板,来滴定10μg/ml放射性标记的抗体(50μls)。在室温下温育1小时。
以200μl/孔洗涤缓冲液再一次洗涤平板大约6-7次(洗涤缓冲液:包含10%明胶和2%叠氮化钠的1xPBS)。
然后通过在γ计数器上运行孔来测定每孔的放射性计数。
最适的放射性标记抗体浓度是其中特异性计数和本底计数之间的差别达到最大时的浓度。
3.竞争性测定的Scatchard分析
将10μg/mL放射性标记的溶液稀释为在直接结合实验中确定的最适浓度。
在室温下用200μl/孔的抑制缓冲液抑制涂布抗原的平板和背景平板1小时。
然后以自来水用手洗涤平板,例如,大约10次。
然后用两倍稀释液在单独的U型底微型滴定板中滴定“冷”(没有放射性标记的)抗体。“冷”抗体的起始浓度应该比放射性标记抗体的最适浓度大至少100倍。
例子:
·最佳放射性标记浓度:0.5μg/mL
·“冷”抗体浓度:100μg/mL(注意:在第一孔中的1∶2滴定将使″冷″抗体浓度调整到50μg/mL)
然后加入50μl/孔的最适放射性标记抗体至包含″冷″抗体的孔中。
然后转移100μl/孔的混合溶液到涂布抗原的平板的对应孔中,并在室温下温育1小时。
此外,进行下列控制实验也是所需的:
a)放射性标记抗体与涂布抗原的平板(5孔)的直接结合;
b)放射性标记抗体与背景平板(5孔)的直接结合。
温育之后,用200μl/孔的洗涤缓冲液洗涤平板,例如,大约6-7次。
然后通过在γ计数器上运行孔来测定每孔中的放射性计数。
通过计算每孔中的比计数率来测定这些计算值,其中比计数率通过由结合涂布抗原的平板计数减去本底计数来试验得到。
4.Scatchard分析的计算
然后可以按以下方法确定结合抗体[B]的摩尔浓度:
例子:50μg/ml“冷抗体”
结合的计数比:4382cpm
存在50μg/ml″冷″抗体时结合的计数:215cpm
差:4382cpm-215cpm=4167cpm
比活性(放射性标记的抗体):5.54×109cpm/nmole
4167cpm÷5.54×109cpm/nmole=7.52×10-7nmole
7.53×10-7nmole÷0.05mL(样品体积)
=1.50×10-5nmole/ml
=1.50×10-8μmole/mL
[B]=1.50×10-11摩尔/mL(M)
按以下方式确定总摩尔浓度[T]:
50μg/mL×1μmole/75,000μg=6.67×10-4μmole/mL
=6.67×10-7mmole/mL(M)
[T]=66667×10-11mmole/mL(M)
按以下方法确定自由抗体[F]:
自由摩尔浓度=总摩尔浓度-结合的摩尔浓度
[F]=(66667×10-11)-(1.50×10-11)
=66665.5×10-11mmole/mL(M)
计算B/F
在Cricket绘图软件上绘制B-B/F图。
本发明的抗人CD23抗体的活性和亲和性
在上文确定的体外分析中,发现在五种分离的灵长类抗人CD23单克隆抗体中有四种(B3B11、2C8、5E8和6G5)能抑制IgE产生,其中体外分析用来测定为IL4-氢化可的松诱导外周血单核细胞(PBMC)培养物中的IgE产生。这些结果显示在图1中。第五个灵长类单克隆抗人CD23抗体3G12在这一测定中是失活的。
结果发现:在这一体外分析中发现有活性的四种灵长类单克隆抗人CD23抗体中的两种(B3B11和2C8)与市售的鼠抗人CD23抗体MHM6(CAKOA/S,Glostrup,丹麦目录#M763)不相上下。(图2,上图)。然而,在重复的分析中,这些抗体不如MHM6那样是有效的IgE抑制剂(数据没有显示)。相反,发现其它灵长类抗CD23单克隆抗体(5E8和6G5)彼此之间是相当的,并且不能与MHM6相匹敌。(图2,中图和下图)。此外,在体外分析中发现灵长类抗人CD23单克隆抗体5E8是IL-4诱导的IgE的有效的抑制剂。(参见图1和3)。
用于人IgE合成的改进的Hu-SCID-小鼠模型和测定体内抗CD23抗体对IL-4诱导的IgE产生的抑制作用
也发展了一个改进的hu-PBMC-SCID小鼠模型以检测主题抗体对诱导人体内IgE产生的效应。用IL-4将得自两个供体的PBMCs体外培养两天。集中PBMCs,并用它来构建有和没有抗体的C.B.-17 SCID小鼠组。在14、21、28和35天使小鼠出血,并由ELISA来测定血清IgG和IgE水平。利用体内模型来分析灵长类和两种不同形式PRIMATIZED的抗CD23抗体的抑制IgE产生的能力。
之所以使用改进的SCID小鼠模型,是因为人们熟知:由人外周血单核细胞(hu-PBMC-SCID)重建的、严重的合并免疫缺陷型scid/scid(SCID)小鼠C.B.-17(Bosma等,自然,301:527(1983))可以产生大量的人免疫球蛋白(Ig)(Mosier等,自然,335:256(1988);Mosier等,临床免疫学杂志,10:185(1990);Abedi等,免疫学杂志,22:823(1992);和Mazingue等,欧洲免疫学杂志,21:1763(1991))。在hu-PBMC-SCID小鼠中产生的占优的同型人免疫球蛋白(Ig)是IgG。一般,发现IgM、IgA和IgE同型处于非常低的或不可检测的水平,除非PBMC是得自具有某些自身免疫病或者变应性疾病的供体。也有人报导:可以用某种细胞因子操作hu-PBMC SCID小鼠模型来产生大量的非IgG同型,包括IgE(Kilchherr等,细胞免疫学,151:241(1993);Spiegelberg等,临床研究杂志,93:711(1994);和Carballido等,免疫学杂志,155:4162(1995))。只要引导供体的体内抗原,hu-PBMC-SCIDs也可用来产生抗原特异性的Ig。
因此,本发明者的目标聚焦在建立合适的产生人IgE的hu-PBMC-SCID小鼠模型,其中该模型能检验用来治疗与IgE有关的疾病(如变应性疾病)包括主题抗CD23抗体在内的治疗剂)的疗效。
材料和方法:
下列材料和方法用于如下所述的hu-PBMC-SCID小鼠模型中。
SCID小鼠:C.B.-17scid/scid免疫缺陷小鼠得自Taconic(C.B.-17/IcrTac-scidfDF),并将其保持在IDEC药物的动物设备中。将小鼠关在有灭菌床的灭菌的微型围栏装置中。按照负责生命科学国家研究会的实验动物资源委员会的全体委员规定的“实验动物照料与利用指导”(实验动物照料与利用指导,DHHS出版号(NIH)86-23,Bethesda,MD,NIH,1985)进行动物研究。
人PBMC:由通过制造厂商(Sigma诊断学目录#1077-1)推荐的Ficoll-Hypaque(Histopaque-1077)的离心,自得自血库的buffy涂层中分离得到PBMCs。收获梯度界面的淋巴细胞制剂,并用Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Bio-Whittaker目录#10-527F)洗涤三次。对于每一实验,从两个单独的供体中获得PBMCs,并分别体外培养之。使PBMCs以1-3×106个细胞/ml浓度再悬浮在包含5%FCS和1000IU/ml IL-4(Genzyme公司目录#2181-01)的1%HB101冻干补料(Irvine科学目录#T000 & T151)的HB基础培养基中,并在37℃下用5%CO2温育48小时。温育之后,收获、集中不同buffy涂层的细胞,并用它来重建SCID小鼠。
体内分析条件
在第0天给小鼠组(每组四至五只)腹膜内(i.p.)注射在200-300μlHBSS中的50-60×106个淋巴细胞。对于接受抗CD23抗体的组,在第0天,在i.p.注射之前混合PBMCs和抗CD23抗体(200-400μg/小鼠),在第7天进行第二次注射。在第0至第5天之间,所有小鼠都接受5000IU/小鼠的IL-4i.p.注射。没有注射抗体的组作为对照组。在第14天、第21天、第28天和第35天,使小鼠从眶后静脉出血,并由ELISA分析血清的IgG和IgE。
图8显示:在SCID小鼠模型中,灵长类抗人CD23单克隆抗体5E8在抑制IL-4诱导的体内IgE产生方面是有效的。
PRIMATIZED抗人CD23单克隆抗体的克隆和表达
为了克隆灵长类免疫球蛋白可变区,利用微型FastTrackmRNA试剂盒(Invitrogen目录#K1520-02),按照制造厂商提出的方法,从大约2×106个得自灵长类异种杂交瘤(分泌抗人CD23单克隆抗体6G5和5E8)的细胞中单独分离出聚腺苷酸化RNA。
按照常规方法,利用cDNA循环试剂盒(Invitrogen目录#L1310-01)由聚腺苷酸化RNA合成第一支cDNA链。
然后利用基于不同共有家族的人免疫球蛋白选择的PCR引物,通过PCR从cDNA分离出6G5和5E8的轻链和重链可变区。选择5’引物,该引物对应于轻链和重链可变区的前导序列的开端,同时选择3’引物,该引物对应于J区(用于PCR扩增6G5的λ轻链可变区、5E8的κ轻链可变区和5E8的重链可变区的具体引物列于表1-3中)。按照标准方法进行PCR(在94℃下1分钟、在54℃下1.5分钟和在72℃下2分钟,一共在热启动100管(Gibco BRL目录#10332-013)中循环30次)。在50μl反应物中建立PCR,该反应物包含取自80μl cDNA(得自2×106细胞)的5μl作为模板、2μl 5nM dNTP、1μl Taq聚合酶、5μl Taq聚合酶缓冲液、2μl5’引物(25pmoles/μl)、2μl 3’引物(25pmoles/μl)和36μl水。(Taq聚合酶和缓冲液得自Stratagene目录#600131、dNTP得自Boehringer MaNheim目录#1581295)。
A)质粒N5LG1+6G5和N5LG4P+6G5的构建
1)由PCR克隆灵长类单克隆抗人CD23抗体6G5的轻链可变区
得自灵长类单克隆抗体6G5cDNA的轻链可变区的第一次PCR扩增产物显示出与λ轻链可变区原位一致的条带。这些带出现在所有利用三种不同的早期前导序列引物的反应中。(参见表1-3)。然而,由于PCR产物带的强度比较大,认为利用引物745(第2家族)得到的PCR产物更具特异性。
利用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen目录#28704)分离这一PCR产物。用Bgl II和Avr II限制性内切酶消化纯化的PCR片段,并且使其与用同样的限制性内切酶消化的哺乳动物表达载体N5LG1连接。然后在14℃下温育包含得自50微升PCR反应物的纯化PCR产物、100mgN5LG1载体、2微升10x连接缓冲液(NEB目录#202S)和2微升T4连接酶(NEB目录#202S)的20微升连接混合物一夜。
哺乳动物表达载体N5LG1包含在哺乳动物细胞中提供四种单独蛋白质的表达的遗传序列(例如调节序列、编码序列)。它们是:
(i)具有人λ轻链恒定区和插入轻链可变区的唯一限制性内切酶位点的部分免疫球蛋白轻链;
(ii)具有人γ1链恒定区编码序列和插入重链可变区的唯一限制性内切酶位点的部分免疫球蛋白重链;
(iii)用于选择掺入质粒和具有抗抗生遗传霉素(Gibco BRL目录#10131-1209)抗性的细胞的新霉素磷酸转移酶基因;和
(iv)鼠二氢叶酸还原酶基因(DHFR),在存在氨甲蝶呤(MTX,Sigma目录#A-6770)(Reff等,血液,83:433-445(1994))的情况下培养细胞时,进行选择与基因组扩增。
连接之后,利用Pme I限制性内切酶消化混合物,该限制性内切酶消化亲本N5LG1质粒,但不消化连接到6G5的轻链可变区上的N5LG1质粒。消化之后,按如下方法将混合物转化为Epicurian coliXL1-Blue感受态细胞(Stratagene目录#200249)。
混合100微升感受态细胞与10μl上述连接混合物,在冰上放置30分钟,然后在45℃下加热30秒。将这一混合物在冰上放置2分钟,然后加入预热至室温的900μl SOC。(SOC是LB肉汤Gibco BRL目录#10855-013,其中加入0.02M MgCl2、0.02M MgSO4和0.02M D-葡萄糖)。在37℃下温育1小时之后,以4000g离心混合物1分钟,并弃去800μl上清液。将混合物的余下部分平板接种在包含50μg/ml氨苄青霉素(Amp,Gibco BRL目录#13075-015)的LB琼脂(Gibco BRL目录#12945-044)平皿上。利用WizardMiniprep DNA纯化系统(Promega目录#A7510)从生长在Amp平板上的大肠杆菌单个菌落中分离质粒DNA。
然后利用Bgl II和Avr II的消化,其后进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定分离得到的质粒DNA。400bp的乙锭染色的DNA带表明可能成功克隆了轻链可变区。
为了确定这是免疫球蛋白轻链可变区,利用具有测序引物607和GE108的测序酶7-Deaza-dGTP DNA测序试剂盒(USB目录#70990)进行测序。(参见表4中的测序引物)。
利用λ轻链家族2的早期前导序列的5’引物(引物745)和3’丁区引物926,对得自灵长类单克隆抗体6G5的cDNA的轻链进行第二次独立的PCR扩增。(参见表1-3中的用于6G5的λ轻链可变区的PCR的引物)。利用源TA克隆试剂盒(Invitrogen目录#K2000-01),将分离的PCR产物(参见以上技术)克隆到TA载体上。在用EcoR I限制性内切酶消化之后,在琼脂糖凝胶电泳下检查分离得到的微量制备DNA(参见以上技术)。然后利用Sp6和M13(-40)正向引物(参见表4中的测序引物)测序(如前所述)所产生的包含在TA载体中的PCR产物。所产生的轻链序列与得自第一次PCR的轻链序列相同。灵长类单克隆抗人CD23抗体6G5的轻链可变区的完整序列如下所述。
灵长类单克隆抗人CD23抗体6G5前导序列的轻链可变区
Met Ala Trp Thr Leu Leu Leu Val Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr
ATG GCC TGG ACT CTG CTC CTC GTC ACC CTC CTC ACT CAG GGC ACA
-1
Gly Ser Trp Ala
GGA TCC TGG GCT
成熟蛋白质(计数是Kabat)
构架1
1 9 11
Gln Ser Ala Pro Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly
CAG TCT GCC CCG ACT CAG CCT CCC TCT GTG TCT GGG TCT CCT GGA
20 23
Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys
CAG TCG GTC ACC ATC TCC TGC
CDR 1
24 27 27A 27B 27C 28 34
Thr Gly Thr Ser Asp Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
ACT GGA ACC AGC GAT GAC GTT GGT GGT TAT AAC TAT GTC TCC
构架2
35 40 49
Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr
TGG TAC CAA CAC CAC CCA GGC AAA GCC CCC AAA CTC ATG ATT TAT
CDR2
50 56
Asp Val Ala Lys Arg Ala Ser
GAT GTC GCT AAG CGG GCC TCA
构架3
57 60 70
Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala
GGG GTC TCT GAT CGC TTC TCT GGC TCC AAG TCT GGC AAC ACG GCC
80
Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
TCC CTG ACC ATC TCT GGG CTC CAG GCT GAG GAC GAG GCT GAT TAT
88
Tyr Cys
TAC TGT
CDR3
89 90 95 95A 96 97
Cys Ser Tyr Thr Thr Ser Ser Thr Leu Leu
TGT TCA TAT ACA ACC AGT AGC ACT TTG TTA
构架4
98 100 106 106A 107
Phe Gly Arg Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly
TTC GGA AGA GGG ACC CGG TTG ACC GTC CTA GGT
2)由PCR克隆灵长类单克隆抗人CD23抗体6G5的重链可变区
利用前述的成套的早期前导序列引物和3’J区引物GE244进行得自灵长类单克隆抗体6G5的cDNA的重链可变区的第一次PCR扩增。这些引物显示在如下的表1-3中。这一反应产生350个碱基的PCR产物。用Nhe I和Sal I消化这一350个碱基的产物(如上所述纯化),使其与N5LG1连接,并用与在第一次PCR扩增中相同的核酸内切酶消化之。利用与克隆轻链相同的技术,将所产生的连接混合物转入宿主细胞。然后分离包含350个碱基的PCR产物的质粒N5LG1并测序(利用测序引物266和268)。(这些测序引物在表4中给出)。
测序揭示:PCR产物仅仅包含部分重链可变区,并且在氨基末端含有缺失(序列始于构架2的,第36个密码子)。
实施第二次独立的PCR反应,以利用家族1的5’早期前导序列(MB1503)和3’J’区引物GE244来扩增和分离灵长类单克隆抗体6G5的重链可变区。(这些引物也包含在表1-3中)。然后利用与前述相同的技术,将所产生的PCR产物克隆进入N5LG1。发现它的序列与第一次PCR产物一致。
因此,为了克隆包括缺失的5’末端的6G5的整个重链可变区,将新的更长3’引物(MB1533)用于与家族15’引物(MB1503)的第三次独立的PCR反应,其中该新引物包含CDR3和6G5重可变链的构架4区。(这些引物也包含在表1-3中)。
PCR之后,在琼脂糖凝胶上观察到420个碱基的更大的PCR产物。按照如前所述方法分离这一PCR产物,并将其克隆进入TA载体。然后对所产生的包含在TA载体中的PCR产物进行测序。测序揭示:这一DNA包含整个重链可变区,并且3’部分与前两次PCR反应得到的部分克隆的重链可变区的3’部分一样。
利用与第三次PCR扩增相同的引物进行第四次独立的PCR。其结果产生得到PCR产物,如前所述一样,该产物得到分离并被克隆进入TA载体。发现第四次独立的PCR产物的序列与第三次PCR扩增得到的一致。这一包含灵长类单克隆抗人CD23抗体6G5的重链可变区的序列描述如下。
灵长类单克隆抗体抗人CD23 6G5的重链可变区
前导序列
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg
ATG AAA CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCT CCC AGA
-1
Trp Val Leu Ser
TGG GTC CTG TCC
成熟蛋白质(计数是Kabat)
构架1
1 10
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Lys Pro Ser
CAG CTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA GTG GTG AAG CCT TCG
20 30
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Val Ser
GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC GCT GTC TCT GGT GGC TCT GTC AGC
CDR 1
31 35 35a
Ser Ser Asn Trp Trp Thr
AGT AGT AAC TGG TGG ACC
构架2
36 40 49
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
TGG ATC CGC CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG ATT GGA
CDR 2
50 52 52A 53 60
Arg Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
CGT ATC TCT GGT AGT GGT GGG GCC ACC AAC TAC AAC CCG TCC CTC
65
Lys Ser
AAG AGT
构架3
66 70 80
Arg Val Ile Ile Ser Gln Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
CGA GTC ATC ATT TCA CAA GAC ACG TCC AAG AAC CAG TTC TCC CTG
82 82a 82b 82c 83 90
Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
AAC CTG AAC TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT
94
Ala Arg
GCC AGA
CDR 3
95 100 100a 100b 100c 100d 101 102
Asp Trp Ala Gln Ile Ala Gly Thr Thr Leu Gly Phe
GAT TGG GCC CAA ATA GCT GGA ACA ACG CTA GGC TTC
构架4
103 110 113
Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA
3)哺乳动物表达载体的构建
为了将克隆的6G5的重链可变区插入哺乳动物表达载体中,用NheI和Sal I消化TA载体中的重链可变区(在第三次独立的PCR中得到),并将其克隆进入N5LG1载体,该载体用相同的限制酶消化,并且该载体已经含有轻链可变区。所产生的哺乳动物表达载体命名为N5LG1+6G5。
为了构建N5LG4P+6G5载体,分别利用Bgl II和Avr II以及Nhe I和Sal I消化来将轻链和重链可变区与N5LG1+6G5分离。除人γ1恒定区为人γ4恒定区(其在绞链区中包含丝氨酸至脯氨酸的突变)所置换以便增加免疫球蛋白的稳定性和改善体内(“p”突变)药物动力学外,哺乳动物表达载体N5LG4P载体与以上所描述的N5LG1载体一样。首先将轻链可变区克隆进入质粒,同时利用前述技术将重链可变区克隆进入包含轻链可变区的载体中。这一哺乳动物的表达载体命名为N5LG4P+6G5。
B.质粒N5KG4P+5E8、N5KG1+5E8、N5KG4P+5E8N-和N5KG1+5E8N-的构建。
1.由PCR克隆灵长类单克隆抗人CD23抗体5E8的轻链可变区
利用一套κ早期前导序列引物和3’J区引物GE204,进行得自5E8cDNA的轻链可变区的第一次PCR反应。(参见在表1-3中的用于5E8的κ轻链可变区的PCR的引物)。获得420个碱基的PCR产物。用Bgl II和BsiW I限制性内切酶消化分离得到的420个碱基的PCR产物,将其克隆进入哺乳动物表达载体N5KG4P中,并利用GE108和377引物(其包含在表4中)测序。哺乳动物表达载体N5KG4P与载体N5LG4P一样,所不同的是N5KG4P包含替代人λ轻链恒定区的人κ轻链恒定区。这一具有420个多核苷酸的DNA的测序揭示:它含有整个κ轻链可变区。
利用5’家族1引物GE201和3’引物GE204,进行轻链可变区的第二次独立的PCR。(参见表1-3中的用于5E8的κ轻链可变区的PCR的引物)。(利用前述方法)将分离得到的PCR产物克隆进入TA载体,并利用Sp6和T7启动子引物测序。测序揭示:这一PCR产物与得自第一次PCR的PCR产物一样。灵长类单克隆抗人CD23抗体5E8的轻链可变区的整个序列如下所述。
灵长类单克隆抗体抗人CD23 5E8的轻链可变区
前导序列
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu
ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTT CTG CTC
-1
Trp Leu Pro Gly Ala Arg Cys
TGG CTC CCA GGT GCC AGA TGT
成熟蛋白质(计数是Kabat)
构架1
1 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCT TCC CTG TCT GCA TCT GTA
20 23
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC
CDR 1
24 30 34
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Tyr Tyr Leu Asn
AGG GCA AGT CAG GAC ATT AGG TAT TAT TTA AAT
构架2
35 40 49
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGA AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT
CDR2
50 56
Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser
GTT GCA TCC AGT TTG CAA AGT
构架3
57 60 70
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAG TTC
80
Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
ACT CTC ACC GTC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT
88
Tyr Cys
TAC TGT
CDR 3
89 90 97
Leu Gln Val Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
CTA CAG GTT TAT AGT ACC CCT CGG ACG
构架4
98 100 107
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA
2)由PCR克隆灵长类单克隆抗人CD23抗体5E8的重链可变区
利用一套5’早期前导重链序列引物和3’引物GE210,进行5E8的重链可变区的第一次PCR。(参见表1中的用于6G5和5E8的重链可变区的PCR的引物)。在家族3引物反应中出现420个碱基的PCR产物。纯化PCR产物,然后用Nhe I和Sal I消化之,并将其克隆进入哺乳动物表达载体N5KG4P载体中(如前所述)。利用268和928引物(参见表4中的测序引物)对PCR产物进行测序。
利用家族35’引物GE207和3’引物GE210,进行5E8的重链可变区的第二次独立的PCR。(参见表1-3中的用于6G5和5E8的重链可变区的PCR的引物)。利用与前述相同的技术将分离得到的PCR产物克隆进入TA载体,并利用Sp6和T7引物测序。测序揭示:在密码子91的TAC变成为TGC。
为了在91位确定适当的密码子,利用与第二次PCR相同的引物(参见以上描述)进行第三次独立的PCR。将PCR产物再一次克隆进入TA载体,并利用Sp6和T7引物测序。发现该序列与在第一次PCR中得到的重链可变序列一样。因此,在第二次独立的PCR产物中的91位的TGC明显是在PCR期间误引入的结果。灵长类单克隆抗人CD23抗体5E8的重链可变区的这一整个序列描述如下。
灵长类单克隆抗体抗人CD23 5E8的重链可变区
前导序列
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Pro Leu Leu Lys
ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT CCT CTT TTG AAA
-1
Gly Val Gln Cys
GGT GTC CAG TGT
成熟蛋白质(计数是Kabat)
构架1
1 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Lys Pro Gly
GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGC GGC TTG GCA AAG CCT GGG
20 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Thr
GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGC GCA GCC TCC GGG TTC AGG TTC ACC
CDR 1
31 35 35a 35b
Phe Asn Asn Tyr Tyr Met Asp
TTC AAT AAC TAC TAC ATG GAC
构架2
36 40 49
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser
TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG CAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA
CDR2
50 52 52A 53 60
Arg Ile Ser Ser Ser Gly Asp Pro Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
CGT ATT AGT AGT AGT GGT GAT CCC ACA TGG TAC GCA GAC TCC GTG
65
Lys Gly
AAG GGC
构架3
66 70 80
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Asn Asn Thr Leu Phe Leu
AGA TTC ACC ATC TCC AGA GAG AAC GCC AAC AAC ACA CTG TTT CTT
82 82a 82b 82c 83 90
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTC TAT TAC TGT
94
Ala Ser
GCG AGC
CDR 3
95 100 101
Leu Thr Thr Gly Ser Asp Ser
TTG ACT ACA GGG TCT GAC TCC
构架4
103 110 113
Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
TGG GGC CAG GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA
3)哺乳动物表达载体的构建
用Nhe I和Sal I消化N5KG4P中的重链可变区,纯化之,并将其克隆进入N5KG4P,该N5KG4P包含5E8的轻链可变区。然后用如前所述的限制性内切酶消化这一质粒。这一过程产生包含5E8的轻链和重链可变区的载体。这一载体命名为N5KG4P+5E8。然后将5E8+N5KG4P的重链和轻链可变区插入到哺乳动物表达载体N5KG1中,以产生N5KG1+5E8载体。
4)由位点特异性诱变改变灵长类单克隆抗体5E8的重链可变区中的一个氨基酸和哺乳动物表达载体的构建
基于5E8重链可变区的序列,在天冬酰胺密码子75处存在免疫球蛋白的潜在的糖基化位点。这一潜在的糖基化位点对应于保守天冬酰胺连接的具有下列三肽序列的糖基化基元:(Asn)-(除脯氨酸外的任何氨基酸)-(丝氨酸或苏氨酸)。因此,通过以赖氨酸(发现其存在于许多人免疫球蛋白的这一位置上)置换天冬酰胺密码子75来产生5E8的糖基化突变体,其中由于这一糖基化基元的修饰使得该突变体不能在这一位置被糖基化。用下列方法实现位点特异性诱变。
利用N5KG4P+5E8作为模板和3’引物(对应于密码子71至79),进行第一次PCR,其中的3’引物在密码子75处含有突变(AAC变成为AAG)、引物MB1654和前导序列(引物MB1650)之起始处的5’引物。(参见如表5所述的用于产生重链可变区5E8的糖基化突变体的PCR引物)。
利用5’引物(对应于密码子71至79)在相同模板上进行第二次PCR,其中该5’引物包含相同突变(引物MB1653)和得自构架4末端的3’引物(引物MB1651)。(参见表5中的用于产生5E8的重链可变区的糖基化突变体的PCR引物)。
分离这两种PCR产物,并以相等的摩尔比率混合。然后通过利用第一次和第二次PCR产物的混合物作为模板,用第一次PCR的5’引物(MB1650)和第二次PCR的3’引物(MB1651)的,进行第三次独立的PCR。(参见表5中的用于产生重链可变区的糖基化突变体的PCR引物)。发现在第三次PCR中得到的PCR产物含有5E8的重链可变区编码区,其中的天冬酰胺75已经改变成为赖氨酸。
纯化第三次PCR产物,用限制性内切酶Sal I和Nhe I消化之,并将其克隆进入仅仅包含轻链可变区的N5KG4P中。测序PCR产物以确认它包含突变的重链可变区。这一哺乳动物的表达质粒命名为N5KG4P+5E8N-。
为了构建N5KG1+5E8N-,分别用Bgl II和BsiW I以及Nhe I和SalI消化得自N5KG4P-5E8N-的轻链和重链可变区。首先将轻链可变区克隆,然后将重链可变区插入到哺乳动物表达质粒N5KG1中,以产生质粒N5KG1+5E8N-。
表1
用于5E8的κ轻链可变区的PCR的引物
名称 轻链VK-早期前导序列5’(Bgl II) 家族
-22-21-20-19-18 -17-16 -15-14
GE201 5′AT CAC
AGA TCT CTC ACC ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG 3′ 1
GE200 5′AT CAC
AGA TCT CTC ACC ATG AGG CTC CCT GCT CAG 3′ 2
GE202 5′AT CAC
AGA TCT CTC ACC ATG GAA(A/G)CC CCA GC(T/G) CAG 3′
3
GE203 5′AT CAC
AGA TCT CTC ACC ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC
3′4
113 112 111 110 109 108 107 106 105 104 103
GE204 5′GG TGC AGC CAC
CGT AGC TTT GAT (C/T)TC CA(G/C)
CTT 3′
轻链VK-3’引物(BsiW I)
表2
用于6G5的λ轻链可变区的PCR的引物
名称 轻链Vl-早期前导序列5’(Bgl II) 家族
-20 -19 -18 -17 -16 -15
744 5′AT CAC
ACA TCT CTC ACC ATG (G/A)CC TG(G/C) TCC CCT CT 3′
1
745 5′AT CAC
AGA TCT CTC ACC ATG GCC TGG (A/G)CT C(T/C)G CT 3′
2
910 5′AT CAC
AGA TCT CTC ACC ATG GC(A/C) TGG A(T/C)C CCT CTC 3′
3
轻链V1-3’引物(Avr II)
110 109 108 107 106 105 104
926 5′(AC)10 CTT GGG CTG A
CC TAG GAC GGT 3′
表3
用于6G5和5E8的重链可变区的PCR的引物
名称 重链早期前导序列5’(Sal I) 家族
-20 -19 -18 -17 -16 -15
MB1503 5′GCG ACT AA
G TCG ACC ATG GAC TGG ACC TGG 3′ 1
MB1502 5′GCG ACT AA
G TCG ACC ATG AAA CAC CTG TGG 3′
2,4
GE207 5′GCG ACT AA
G TCG ACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC 3′ 3
GE208 5′GCG ACT AA
G TCG ACC ATG GGG TCA ACC GCC ATC 3′ 5
GE209 5′GCG ACT AA
G TCG ACC ATG TCT GTC TCC TTC CTC 3′ 6
重链3’引物(Nhe I)
120 119 118 117 116 115 114 113 112 111
110
GE244 5′GC CAG GGG GAA GAC CGA TGG GCC CTT GGT
GCT AGC TGA GGA GAC GG
3′
GE210 5′ GA TGG GCC CTT GGT
GCT AGC TGA GGA GAC GG
3′
MB1533 5′ GGT
GCT AGC TGA GGA GAC
GGT
109 108 107 106 105 104 103 101 100 99
GAC CAG GAC TCC CTG GCC CCA GAA GCC TAG 3′
表4测序引物
Sp6 primer 5′AT TTA GGT GAC ACT ATA 3′
M13(-40)Forward
Primer 5′GTT TTC CCA GTC ACG A 3′
T7 Promoter Primer 5′AT ATA CGA CTC ACT ATA GGG 3′
GE 108 Primer 5′CCG TCA GAT CGC CTG GAG ACG CCA 3′
377 Primer 5′GCA GTT CCA GAT TTC AAC TG 3′
607 PRIMER 5′CCA GGC CAC TGT CAC GGC TTC 3′
266 PRIMER 5′CAG AGC TGG GTA CGT CCT CA 3′
268 PRIMER 5′GCC CCC AGA GGT GCT CTT GG 3′
876 PRIMER 5′ACA CAG ACC CGT CGA CAT GG 3′
928 PRIMER 5′GCT CTC GGA GGT GCT CCT GG 3′
表5用于产生5E8的重链可变区的糖基化突变体的PCR引物
Sal I -20 -19 -18 -17 -16
MB 1650 5′ACA GAC CC
G TCG ACC ATG GAG TTT GGG CTG 3′
Nhe I
181 171 161 151 141 131 121 111 110
MB 1651 5′CCC CTT
GGT GCT AGC TGA GGA GAC GGT 3′
71 72 73 74 75 76 77 78 79
MB 1653 5′AGA GAG AAC GCC AAG AAC ACA CTG TTT 3′
79 78 77 76 75 74 73 72 71
MB 1654 5′AAA CAG TGT GTT CTT GGC GTT CTC TCT 3′
C)构建γ-3载体
存在大量将鼠抗体转化为嵌合体的方法,在该嵌合体中重链和轻链恒定区为人形式所取代或者其中除CDRs(互补决定区)外的所有重链和轻链恒定区为它们的人等同物所取代。(参见King等,生物化学杂志,281:317-23,1992;Queen等,美国科学院院报,86(24):10029-33,1989;Love等,酶学方法,178:515-27,1989;Hutzell等,癌症研究,51:181,1991;Chiang等,生物技术,7(4):360-6,1989;Heinrich等,免疫学杂志,143:3589,1989;Hardman等,Int.J.Cancer,44:424,1989;Orlandi等,美国科学院院报,86(10):3833-6,1989)。
此外,前几段特别地显示:通过利用PCR扩增编码轻链和重链可变区的DNA,以及克隆这些区进入表达载体或者编码适当的人恒定区结构域的载体,可以实现表达PRIMATIZEDγ-1和γ-4抗体的载体的构建。因此,很显然,只要能得到适当的哺乳动物表达载体,可以制备编码其它人恒定区的类似结构,该结构还包括能插入源于灵长类抗体的扩增的可变区DNA的克隆位点。
以下也应该是明显的:可以设计用于扩增可变区DNA的PCR引物,以顺应取决于所用载体的各种限制性克隆位点。
编码人免疫球蛋白IgG3恒定区结构域的载体在本领域中是可获得的,并且可以用于构建本发明的PRIMATIZED抗体。例如,Co等利用表达人轻链和重链恒定区的不同载体,构建嵌合抗体和人源化抗体并提供人γ-1和γ-3重链载体。为了克隆感兴趣抗体的可变区片段进入这些载体,XbaI限制酶切位点一般恰好分别定位在轻链和重链的JK4和JH3内含子片段的恒定区之前(Co等,1996,癌症研究,56:1118-1125;Co等,1992,免疫学杂志,148:1149-1154)。
因此,通过设计结合了XbaI限制酶切位点或者创建作为XbaI限制酶相同的单链突出端(即NheI、SpeI)的位点的PCR引物,可以利用在Co等的文献中所描述的载体使灵长类抗体的可变区与人γ-3个恒定区结构域连接起来。此外,接头或者适配器可以用来促进克隆。
也有可能利用DNA合成技术构建cDNA形式的人γ-3恒定区,并将其插入本文所述的N5KG1载体以替代NheI和BamHI位点之间的人γ-1恒定区。也有本领域中描述的其它γ-3载体,这取决于哪些限制酶切位点最便于克隆感兴趣的特定可变区,并且这些载体之任一都可以用于构建和表达本发明的γ-3抗体。(参见,例如,Parren等,1992,免疫学杂志,148(3):695-701;Steplewski等,1988,美国科学院院报,85:4852-4856和美国专利4,975,369),以上文献被收作本文参考文献)
D)PRIMATIZED抗体的变异
本发明也包括含有恒定区突变、取代或者缺失的PRIMATIZED抗体。可以利用如上所述用于糖基化突变体的定点诱变技术构建这样的突变,该技术是本领域技术人员所熟知的。
设计本发明的突变抗体,其目的是在治疗效率水平上(即在FcR结合方面)建立所需的改变。然而,应该将其理解为:在抗体恒定区中的任何突变都不应改变为γ-1或者γ-3恒定区结构域所介导的基本效应子功能。也可能通过诱变改变其它亚型的γ抗体,以便它们具有与包含γ-1或γ-3结构域的抗体类似的效应子功能。本发明也包含这样的抗体。
例如,与FcR结合和与Clq补体组分的相互作用有关的IgG恒定区的片段得到鉴定,并且已确定出能增加或者减少结合亲和性的突变。正如美国专利5,648,260(收作本文参考文献)中所公开的,在将人IgG3恒定区的Leu 235改变为Glu可破坏人FcγR1受体的突变体的相互作用。在绞连结区中的邻近或者相邻位点上的突变(即由Ala置换234、235、236或者237号残基)表明:残基234、235、236和237的改变至少影响对FcγR1受体的亲和性。
同样地,在美国专利5,348,876(也收作本文参考文献)中显示:通过减少人IgG3恒定区的绞链区长度和改变这一区的氨基酸顺序,可以进一步改善Clq结合和补体介导的细胞溶解。事实上,所述变体比野生型IqG3结合更多的Clq并且比IgG1结合多得多的Clq。
因此,在本领域中清楚的是:突变可以用来产生具有减弱的对人Fc受体亲和性的治疗抗体,或许用于治疗更为轻度的内科病。此外,可以确定能增加效应子功能活性的突变,由此而产生用于治疗用途的更强形式。应该理解的是,可以设想在药效方面建立改变的基因序列的操作,并且该设想处于本发明的精神和范围之内。
E)在中国仓鼠卵巢细胞中表达PRIMATIZED抗体
为了分离PRIMATIZED抗体,利用下列方案在中国仓鼠卵巢细胞中表达编码抗体的载体。
利用WIZARDMaxipreps DNA纯化系统(Promega目录#A7421)纯化大规模质粒DNA。用Ssp I和BspLU11 I消化纯化的DNA,以乙醇沉淀一次,并将其再悬浮于无菌TE中。
然后利用电穿孔法将纯化的、内切核酸酶限制的质粒DNA引入中国仓鼠卵巢(CHO)二氢叶酸还原酶负DG44细胞中。所利用的电穿孔法技术描述如下。
在一支适当大小的无菌Corning管中,以1000rpm旋转大约1.6×108个CHO细胞1分钟。除去培养基,并用15毫升无菌的冰镇的SBS(无菌蔗糖缓冲液是272mM蔗糖、7mM pH 7.4磷酸钠、1mM MgCl2)洗涤细胞,并以1000rpm旋转5分钟。除去SBS,并利用新鲜的冰镇的无菌SBS悬浮细胞,其细胞浓度为每ml 1×107个细胞,并将其在冰上放置15分钟。打开BTX 600电穿孔仪,并用将其预置为230伏特,将最大电压旋钮设定在500伏特/电容和电阻。电容设置在400微法拉第,而电阻则设置在13欧姆(设置R1)。
然后将质粒DNA(4μg DNA或者2μg DNA)和0.4ml细胞(4×106个细胞)放置在BTX 0.4ml样品池(BTX目录#620)中。通过把样品池放入BTX 600支架上并按下自动充电和脉冲钮来冲击细胞。用每一哺乳动物表达质粒进行大约20次单独的电穿孔。
冲击之后,将样品池在环境温度下放置十五分钟。使得自每个样品池的细胞和DNA再悬浮于20ml不包含任何次黄嘌呤或者胸苷(GibcoBRL目录#31033-012)的、HT补料(100X补料是10mM次黄嘌呤钠、1.6mM胸苷Gibco BRL目录#11067-014)已加入其中的CHO-SSFMII中。然后将单一的电穿孔样品池中的细胞平板接种到96孔平板(200μl/孔)上,并放置在37℃CO2温箱中。2或3天后,通过加入400mg/mlGeneticin(G418,Gibco BRL目录#10131-019)将培养基改变成为上述培养基来开始选择。在37℃下培育细胞,同时每3-5天改变细胞培养基一次。在16天后G418抗性克隆出现于孔中,由ELISA分析上清液的抗体表达。然后个别地扩增最高表达的克隆。按照如下描述的方法纯化单克隆抗体。
免疫球蛋白ELISA
在4℃下,用200ng未标记的山羊抗人IgG抗体以100μl/孔涂布平板(Immulon 2,Dynatech实验室,公司目录#011-010-3455)一夜。利用20ml未标记的山羊抗人IgG/10mls涂布缓冲液/平板(BoehringerMannheim Ab目录#605 400)实现这一过程。(1∶500稀释大约1mg/ml母液)。然后从平板上除去涂布缓冲液,并用纸巾干燥之。然后每孔加入100微升稀释缓冲液。
然后以100μl/孔双份地将抗体溶液和标准(100ng/ml-2.5ng/ml)直接加入100ml稀释缓冲液中。抗体溶液和标准包含在稀释缓冲液中。然后在37℃下温育所产生的溶液至少1小时。
温育之后,除去每个平板的内含物,并用自来水洗涤平板5次。然后在纸巾上干燥平板。
平板干燥之后,然后以100μl/孔加入第二种抗体。该第二种抗体是山羊抗人κ-HRPO(以1/10,000稀释液或1μl Ab/10mls稀释缓冲液/平板加入,可获自Southern Biotechnology Associates,Inc.目录#2060-05)或者山羊抗人λ-HRPO(以1/20,000稀释液或1μl Ab/20mls稀释缓冲液/2平板加入,可获自Southern BiotechnologyAssociates,Inc.目录#2070-05)。
使抗体和平板内含物在37℃下温育1小时。温育之后除去每个平板的内含物。用自来水再一次洗涤平板五次,并干燥所洗涤的平板。然后以100μl/孔的量将HRPO底物(TMB Microwell-两个组分)加入到干燥的平板中。(5ml TMB过氧化物酶底物+5ml过氧化物酶溶液B/平板(Kirdgaard和Perry Labs,TMB Microwell两种组分试剂目录#50-76-00))。
当最弱的标准(2.5ng/ml)在背景之上可见时,通过每孔加入100微升2M H2SO4来停止反应。然后利用平板读数仪(例如MolecularDevices Emax精密微型平板读数仪,设定波长为OD 450和OPT2(OD 540))读取平板中的孔的光密度。
ELISA缓冲液
涂布缓冲液
碳酸钠 0.8克/升
碳酸氢钠 1.55克/升
用大约1ml 1N HCl调整pH值至9.5
稀释缓冲液
溶在PBS中的5gm/L 0.5%脱脂干牛奶加上100mg/L 0.01%硫抑汞
利用上述测定得到的ELISA值的例子说明如下。
标准 OD 450 OD 450 平均
100ng/ml 0.805 0.876 0.841
50ng/ml 0.395 0.472 0.434
25ng/ml 0.213 0.252 0.233
10ng/ml 0.089 0.105 0.097
5ng/ml 0.054 0.055 0.055
2.5ng/ml 0.031 0.035 0.033
0ng/ml 0.004 0.006 0.005
稀释缓冲液中的标准
适当地稀释母液AB(在生理盐水中无菌过滤,由OD测定蛋白质),从而得到1mg/nl。
实例:
嵌合的猴/人抗CD4(CE9.1)是4.18mg/ml
24μl上述溶液倒入76μl稀释缓冲液是1mg/ml
50μl储液Ab(1mg/ml)注入450μl稀释缓冲液(D.B.)是100 1μg/ml
50μl上述混合物注入450μl D.B是1μg/ml
200μl上述混合物注入1.8mls D.B是1μg/ml
1ml上述混合物注入9mls D.B是100ng/ml*
5ml上述混合物注入5ml D.B是50ng/ml*
5ml上述混合物注入5ml D.B是25ng/ml*
4ml上述混合物注入6ml D.B是10ng/ml*
5ml上述混合物注入5ml D.B是5ng/ml*
5ml上述混合物注入5ml D.B是2.5ng/ml*
*用于ELISA中的标准
由A蛋白纯化抗体
方法
离心培养物上清液以除去细胞和碎片。然后通过0.2μm滤器过滤离心获得物。然后制备A蛋白琼脂糖凝胶快速流柱(重组A蛋白琼脂糖凝胶快速流(floe))(Pharmacia Biotech目录#71-5000-09),并利用PBS(pH 7.4)平衡之。
然后以适当流速(例如2ml/min)将上清液加样到柱上。加样之后,以10柱量PBS(pH 7.4)洗涤柱。利用洗脱缓冲液(0.2M乙酸,0.1M pH3.5甘氨酸)以1m/min流速从柱上洗脱抗体。然后收集包含100μl Tris的1ml组分/管。然后在280nm读取分光光度计吸收率。然后收集抗体组分,并由PBS(pH 7.9)透析一夜。然后由通过0.22μm膜的过滤来灭菌透析物,并将其存储在-20℃下。
测定结果
纯化如上所述的PRIMATIZED人γ-4抗人CD23抗体,并测定它们的诱导IgE体外抑制活性。这些结果包含在图3和5中。利用如上所述的体外IL-4 TgE测定实现这一步骤。
这些测定结果令人诧异地表明:两种人γ-4抗人CD23抗体都不具有与对应的灵长类抗人CD23抗体那样的活性,即它们并不明显地抑制诱导体外IgE产生。
然而,由于灵长类5E8和p5E8G4P在重链可变区有一个潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点,因此调查在这一位点上的糖基化效应。(发现:这两种抗体在这一位点上都含有N-连接的低聚糖。(数据没有显示))。因此,为了阻止糖基化,将糖基化位点中的天冬酰胺改变为赖氨酸以便消除糖增加。这一变异的抗体命名为p5E8G4PN-。测定结果显示:在IL-4 IgE测定中,这一抗体表现出与p5E8G4P相同的行为(参见图3),并且也显示出相同的对人CD23的表观亲和性Kd。(参见图4)。因此,这些结果表明:与灵长类5E8抗体相比较,自5E8γ4PRIMATIZED抗体中观察到的IgE抑制作用的区别并不能归因于糖基化区别。
然后利用本质上相同的方法表达三种灵长类抗体(p5E8G4P、p5E8G4PN-和p6G5G4P)作为人γ-1形式。发现分别被命名为p5E8G1、p5E8G1N-和p6G5G1的所有三种人γ-1抗人CD23抗体在体外IL-4/IgE测定中都具有活性(图3和5)。
发现在0.3μg/ml(P[T,t)一条尾部+0.0055)和3μg/ml(P[T<t)一条尾部+0.0019)浓度下从统计学上讲,p5E8G1比p5E8G4P具有更大的抑制性。此外,在0.3μg/ml(P[T<t)一条尾部+0.0392)和3μg/ml(P[T<t)一条尾部+0.0310)浓度下,从统计学上讲,p5E8G1N-比p5E8G4PN-具有更大的抑制性(图3)。
同样地,p6G5G1在3mg/ml下能完全抑制诱导IgE产生,而p6G5G4P不能。(这些结果显示在图5中)。
因此,这些结果表明:活性Fc区,尤其是人γ-1的,对于诱导抗人CD23抗体的IgE抑制作用是十分重要的。这些结果也表明:包含人γ-3恒定区的人抗CD23抗体对于诱导IgE抑制作用来说也是重要的,因为γ-3恒定区结合到同样与γ-1结合的相同的Fc γR受体上,并且很有可能介导相同的结果。
实施例2
为了证实我们的关于Fc效应子部分涉及抗人CD23抗体的IgE抑制作用的假说,将也显示出体外抑制IgE的第三种灵长类抗体(命名为2C8)转化成为F(ab’)2。利用与前述相同的IL-4/IgE测定来确定IgE抑制活性。
材料
下列材料用于这一实施例。
ImmunoPure F(ab’)2制备试剂盒(Pierce目录#44888)
消化缓冲液:20mM乙酸钠缓冲液,pH 4.5
0.1M柠檬酸,pH 3.0(以NaOH调整pH值)
在水中的0.1%叠氮化钠
透析袋;截断分子量50,000(Spectra Por目录#132 128)
能保持37℃的振荡水浴
聚苯乙烯培养管,17×100mm(Fisher目录#14-956-6B)
BCA蛋白质测定(Pierce目录#23224)
Centricon-50浓缩器(Amicon目录#4225)
固定化胃蛋白酶的平衡
将0.25ml 50%匀浆固定化胃蛋白酶加入至17×100mm试管(0.125ml凝胶)中。然后加入4ml消化缓冲液。利用血清分离器分离胃蛋白酶和缓冲液。然后弃去缓冲液,并再用另一4ml缓冲液重复洗涤过程。然后使固定化胃蛋白酶再悬浮于在0.5ml消化缓冲液中。
固定化A蛋白柱的制备
将A蛋白AffinityPak(柱和ImmunoPure结合以及洗脱缓冲液回至室温。
2C8的F(ab’)2片段的制备
利用抗体领域所熟知的方法制备2C8的F(ab’)2片段。本发明者选择利用市售试剂盒,即ImmunoPure F(ab’)2制备试剂盒(Pierce目录#44888),并利用制造厂商的方案。
将10mg冻干2C8抗体溶于1ml消化缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液,pH 4.5)中。然后将1ml包含抗体的样品加入装有固定化胃蛋白酶的试管中。
然后在37℃下在高速度振荡水浴中(以高速度)温育抗体和固定化胃蛋白酶4小时,注意温育期间保持混合恒定。
然后利用血清分离器从固定化胃蛋白酶凝胶上回收所产生的溶解的F(ab’)2和Fc片段以及未消化的IgGs。然后将粗消化物倾入一支干净的试管中。
为了提高F(ab’)2片段回收率,优选用1.5ml ImmunoPure IgG结合缓冲液洗涤固定化胃蛋白酶。然后将洗液加入粗消化物中。
然后利用A蛋白柱回收抗体片段。通过打开固定化A蛋白柱实现这一步骤。注意避免气泡进入凝胶。弃去储液(含有0.02%叠氮化钠)。
然后利用12ml结合缓冲液(包含在ImmunoPure制备试剂盒中)平衡固定化A蛋白柱。然后将柱转移到包含在试剂盒(标记的”F(ab’)2”)中的17×100mn试管中,以收集洗脱物。
然后将3ml粗消化物施用于柱中,并使之完全流入凝胶中。AffinityPakTM柱的利用是当水平达到顶层半熔玻璃质时使这些柱自动停止流动所需的。
然后利用6ml结合缓冲液洗涤柱。然后收集含有F(ab’)2片段的洗脱物。这一洗脱物也含有不再结合A蛋白(不结合A蛋白柱)的小Fc片段。然而,其大部分为透析所除去。
利用具有50,000截断分子量的透析袋,通过采用包含F(ab’)2的洗脱物和用pH 7.4磷酸缓冲盐水透析洗脱物来实现透析,以除去小Fc片段污染物(Spestra Pur.目录#132128)。
由此产生具有0.707的280nm光密度(6ml)的F(ab’)2组分。在透析和用Centricon-50浓缩器(Amicon目录#4225)浓缩之后,利用BCA蛋白质测定(Pierce目录#23224)分析2C8F(ab’)2产物的蛋白质含量。发现蛋白质含量为每毫升3.76mg。
分析2C8F(ab’)2的IgE抑制活性,发现它在与前述相同的体外分析中本质上不能抑制IgE产生。这些结果包含在图6中。事实上,发现F(ab’)2拮抗诱导IgE对单克隆抗体2C8的抑制效应。这些结果显示在图7中。
实施例3
在前述的SCID小鼠模型中,评价灵长类单克隆6G5的PRIMATIZEDγ1和γ4P形式对诱导体内IgE产生的抑制作用的效应。发现p5E8G1N-在抑制诱导IgE方面与灵长类5E8同样有效。(参见图8和9)。尽管灵长类6G5和PRIMATIZED p6G5G4P在体内抑制诱导IgE方面都不是有效的,但PRIMATIZED p6G5G1能抑制诱导IgE产生。(参见图9和10)。这些结果进一步证实我们的结论:活化Fc区对抗人CD23抗体有效地抑制诱导IgE产生的能力来说是重要的。
建议的机理
虽然本发明的结果结论性地显示:活化Fc区对抗人CD23抗体有效地抑制诱导IgE产生的能力来说是重要的,但是其分子机理还没有得到阐明。然而,可以提出以下几个假设。
首先,它可以是:本发明的抗CD23抗体可以起到触发与由交联B细胞受体和抗BCRγ-1抗体触发的途径类似的信号转导途径。假设:在这一情况下由FcγRII和相同B细胞上的表面Ig(B细胞受体)的共连接产生的抗原受体信号传递的负调节可导致Ig表达的负调节。(D’Ambrosia等,1995,科学,268:293-297;Ono等,1997,细胞,90:293-301)。事实上,CD23在表达B细胞的IgE的表面上得到正调节,因此这是可能的:CD23和FcγRNII-B受体经由γ-1恒定区的共连接产生类似的信号转导途径。
此外,当Fc区与另一细胞类型(即杀伤T细胞)上的合适FcγR受体相互作用时,通过交联B细胞上的表面IgE,可以发生对诱导IgE表达的抑制,其中所说的另一类型细胞可以“指令”B细胞经历编程性细胞死亡或者以其它一些方式(即吞噬)导致细胞死亡。例如,美国专利5,543,144(收作本文参考文献)提出类似用抗IgE抗体抑制表达IgE的B细胞的机理。正如其中所讨论的,某些IgG亚型的抗体,如小鼠IgG2a以及人IgG1和IgG3,可以介导由某些携带Fc受体的吞噬白细胞实现的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)。例如,将OKT3(即对人T细胞表面抗原专一的小鼠IgG2a单克隆抗体)(它是FDA批准销售的第一种作为治疗剂的单克隆抗体产物)施用于患者身上,以提供血液中的T细胞的迅速耗竭和诱导免疫抑制状态(用于肾移植)。(Russell,P.S.等,Transpl.Proc.17:39-41(1985))。以5mg/天/受治疗者的剂量使用OKT3可以完全耗尽循环的T细胞。美国专利号5,543,144中描述的单克隆抗体,尤其是小鼠γ2a抗体形式或者携带人γ-1或γ-3链的人或人源化抗体,被建议用来以类似方式由ADCC机理耗尽表达IgE的B细胞。
无论利用抗CD23抗体抑制IgE表达的实际分子机理是什么,很明显,抗CD23抗体的Fc区以及因此而形成的效应子功能都是重要的因素。正如前述的,由于补体在本发明的体外分析中并不出现,该现象很有可能涉及一或多个FcγR受体。一旦相关的分子成分得到鉴定和牵涉到细胞内部的分子(在信号转导路径中牵涉到该分子),那么就有可能设计出也可用来抑制诱导IgE表达的其它治疗方法。
应用
由于它们的有效地抑制IgE产生的能力,包含人γ-1恒定区的主题抗人CD23抗体和那些也可以构建的包含γ-3的抗体在治疗任何有关疾病(其中对IgE产生的抑制作用是治疗上所需的)方面都是有效的。例如,这样的疾病包括变应性疾病、自身免疫疾病和炎性疾病。
通过施用包含人γ-1/γ-3恒定区的主题抗CD23抗体有可能达到治疗目的的具体疾病包括下列:变应性支气管肺曲霉病,变应性鼻炎和结膜炎自身免疫溶血性贫血,黑棘皮症,变应性接触性皮炎,Addison疾病,特应性皮炎,斑形脱发,全身脱毛,淀粉样变性,过敏性紫癜,过敏性反应,再生障碍性贫血,血管性水肿(遗传性),血管性水肿(原发性),关节强硬脊椎炎,动脉炎(颅),动脉炎(巨细胞),动脉炎(Takayasu),动脉炎(暂时的),哮喘,毛细血管扩张紊乱,自身免疫卵巢炎,自身免疫睾丸炎,自身免疫内分泌失调,Behcet疾病,Berger疾病,Buerger疾病,支气管炎,大疱天疱疮,念珠菌病(慢性粘膜和皮肤的),Caplan综合症,后心肌梗塞综合症,后心包造口术综合症,心炎,Celiac口炎性腹泻,Chagas疾病,Chediak-Higashi综合症,Churg-Strauss疾病,Cogan综合症,冷凝集素疾病,CREST综合症,Crohn疾病,冷球蛋白血,隐原性纤维化肺泡炎,皮炎性疱疹(Dermatitisherpetifomis),皮肌炎,糖尿病,Diamond-Blackfan综合症,DiGeorge综合症,盘状红斑狼疮(Discoid lupus erythematosus),嗜酸细胞性筋膜炎,巩膜外层炎,Drythema elevatum diutinum,边缘性红斑,多形性红斑,结节性红斑,家族性地中海发热,Felty综合症,肺纤维变性,肾小球性肾炎(过敏性),肾小球性肾炎(自身免疫),肾小球性肾炎(后链球菌),肾小球性肾炎(移植后),肾小球病(膜性的),Goodpasture综合症,移植物-与-宿主疾病,粒细胞减少(免疫介导),环韧带肉芽肿,肉芽肿病(变应性),肉芽肿肌炎,Grave疾病,Hashimoto甲状腺炎,新生儿溶血病,血色病(原发性),Henoch-Schoenlein紫癜,肝炎(慢性活性和慢性进行性),组织细胞增多症X,嗜酸细胞增多综合症,原发性血小板减少紫癜,约伯综合症,青少年皮肌炎,青少年类风湿关节炎(青少年慢性关节炎),Kawasaki疾病,角膜炎,干燥性角结膜炎,Landry-Guillain-Barre-Strohl综合症,麻风病(麻风瘤),Loeffler综合症,狼疮,Lyell综合症,Lyme疾病,淋巴瘤样肉牙肿病,肥大细胞增生病(系统性),混合结缔组织疾病,多发性单神经炎,Muckle-Wells综合症,粘膜与皮肤的淋巴结综合症,粘膜与皮肤的淋巴结综合症,多中心性网状组织细胞瘤病,多发性硬化,重症肌无力,蕈样肉芽肿,坏死性脉管炎(系统性),肾病综合症,重叠综合症,脂膜炎,阵发性冷血红蛋白尿,阵发性夜间血红蛋白尿,类天疱疮,天疱疮,红斑天疱疮,叶状天疱疮,普通天疱疮,饲鸽者疾病,肺炎(超敏反应),结节性多动脉炎,风湿性多肌痛,多肌炎,多神经炎(原发性),葡萄牙家族多神经病,预惊厥/惊厥,原发性胆汁性肝硬化,进行性系统性硬化(硬皮病),牛皮癣,牛皮癣关节炎,肺部肺泡蛋白沉积,肺部纤维变性(Raynaud现象/综合症),Reidel甲状腺炎,Reiter综合症,复发性polychrondritis,风湿热,类风湿性关节炎,肉样瘤病,巩膜炎,硬化性胆管炎,血清病,Sezary综合症,Sjogren综合症,Stevens-Johnson综合症,Still疾病,亚急性硬化性全脑炎,交感性眼炎,系统性红斑狼疮,移植排斥,溃烂结肠炎,未分化结缔组织疾病,荨麻疹(慢性),荨麻疹(冷性),葡萄膜炎,白斑,Weber-Christian疾病,Wegener肉牙肿病,Wiskott-Aldrich综合症。
在这些疾病中,可通过施用抗CD23抗体治疗的或呈现的优选症状包括变应性鼻炎和结膜炎、特应性皮炎、湿疹、约伯综合症、哮喘、变应性疾病和慢性炎性疾病和病症,包括CLL慢性淋巴细胞白血病,其典型地具有高水平的膜CD23和高循环水平的sCD23的特点(Sarfati等,血液,71:94-98(1988))。
用于产生疗效的抗体的量可以由本领域一般技术人员所熟知的技术确定。抗体一般由标准技术用在药学上可接受的缓冲液中提供,并可以经由任何所需的途径施用。由于本发明抗体的功效和人对它们的耐受性,可能以重复施用这些抗体以对抗人体内的各种疾病或者疾病状态。
本领域技术人员能够通过常规实验确定:多少有效的、无毒性的抗体量能够治疗变应性疾病和炎性疾病。然而,一般地,一个有效剂量是每天每千克体重大约0.05至100mg抗体。
可以按照前述的治疗方法,以足以在治疗或预防水平上产生效应的剂量,向人或者其它动物施用本发明的抗体。可以以通过按照已知技术使本发明抗体与常规药学上可接受的载体或者稀释剂混合来制备的常规剂量形式,向这样的人或者其它动物施用本发明的抗体。本领域技术人员应该认识到:药学上可接受的载体或者稀释剂的形式和特性是按要与之混合的有效成分的量、施用途径和其它众所周知的变化来规定的。
本发明抗体的施用途径可以是口服、肠胃外、吸入或者局部。这儿所用的术语肠胃外包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或者腹膜内施用。静脉内形式的肠胃外施用一般是优选的。
肠胃外施用和口服施用本发明化合物,以便预防性或者治疗性诱导免疫抑制的每日剂量方案为每天每千克体重大约0.05-100mg,优选大约为0.5-10mg。
也可以通过吸入来施用本发明抗体。″吸入″意指鼻内和口部吸入施用。可以用常规技术制备用于这样的施用的剂量形式,如气雾剂形式或者计量供给的剂量吸入器。所使用的本发明化合物的优选剂量一般为大约10-100mg。
也可以局部施用本发明抗体。局部施用意指非全身性施用,包括外部施用本发明的抗体(或片段)化合物于表皮、口腔前庭上和滴注这样的抗体于耳、眼和鼻中,其中它并不大量地进入血流中。全身施用意指口服、静脉内、腹膜内和肌内施用。当然,达到治疗或者预防效果所需的抗体的量将随以下几个因素而变化:所选择的抗体、所治疗的疾病的性质和严重程度以及接受治疗的动物,并且最终地取决于医生的判断力。本发明抗体的合适的局部剂量一般为每日每千克体重大约1至100mg。
配方
尽管可以单独施用抗体或其片段,但优选将它作为药物配方。对于局部施用来说,活性成分可以占0.001%至10%w/w,例如占制剂重量的1%-2%,虽然它可以包含高达10%w/w的活性成分,但是优选不超过5%w/w,更优选为制剂重量的0.1%-1%w/w。
本发明的局部配方包含与其一或多个可接受的载体结合在一起的有效成分和可选择的任何其它治疗成分。载体必须是在与配方中的其它成分可兼容性方面“可接受的”,并且不会有害于其受体。
适合于局部施用的配方包括适合于穿过皮肤到达需要治疗的部位的液体或者半液态制剂(如涂抹剂、洗剂、乳膏、软膏或者糊剂)和适合于施用到眼、耳或鼻中的滴液。
本发明的滴液可以包括无菌的水性或油性溶液或者悬浮液,并可以通过将活性成分溶解在杀菌和/或杀真菌剂和/或任何其它合适的防腐剂的合适水溶液(优选包含表面活性剂)中来制得。然后可以由过滤澄清所产生的溶液,将其转移到合适的容器中,然后密封并由加压灭菌器灭菌或者在90-100℃下保持半小时。此外,可以通过过滤灭菌溶液,并用无菌技术将其转移到容器中。适合于包含在滴液中的杀菌和杀真菌剂的例子是硝酸苯汞或者乙酸苯汞(0.002%)、氯化苯甲烃铵(0.01%)和乙酸洗必太(0.01%)。适合于油性溶液的制剂的溶剂包括甘油、稀释的乙醇和丙二醇。
本发明的洗剂包括那些适合于施用在皮肤或者眼睛中的洗液。眼睛洗剂可以包含可选择地含有杀菌剂的无菌水溶液,并可以用那些类似于制备滴液的方法制得。施用于皮肤上的洗剂或者涂抹剂也可以包括加速干燥和使皮肤降温的试剂(如乙醇或丙酮)和/或增湿剂(如甘油)或者油(如蓖麻油或者花生油)。
本发明的乳膏、软膏或者糊剂是外敷的活性成分的半固态形式的制剂。可以借助于合适的机械,通过将细分或磨碎形式的活性成分单独或在溶液或水悬浮液或无水液体中与油脂或非油脂基底混合制备。基底可以包括烃(如硬、软或液状石蜡,甘油,蜂蜡,金属肥皂),胶浆,天然来源的油(如杏仁、玉米、花生(arachis)、蓖麻或橄榄油),羊毛脂肪或其衍生物,或者混有醇(如丙二醇或者大粒凝胶)的脂肪酸(如硬脂酸或油酸)。制剂可以结合任何合适的表面活性剂,如阴离子、阳离子或者非离子表面活性剂,如山梨聚糖氨酰基酯或其聚氧化乙烯衍生物。也可以包括悬浮剂,如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料(如二氧化硅(silicaceous silicas))和其它成分(如羊毛脂)。
本领域技术人员将认识到本发明的抗体或其片段的最适剂量或单个剂量的范围将由以下因素确定:所治疗的疾病的性质和严重程度,施药的形式、途径和部位以及所治疗的具体动物;并且将认识到可以用常规技术确定这样的最佳治疗方法。本领域技术人员还可以理解,可以由本领域技术人员利用治疗测定检验的常规方法确定最适治疗方法(即对于给定天数,每天施用的本发明的抗体或其片段的剂量数量)。
无需进一步的详细说明,可以认为:本领域技术人员可以利用前述说明最大限度地利用本发明。因此,下列实施例应当被视为仅仅是说明性例子,而不在任何方面限制本发明的范围。
胶囊组合物
通过用50mg本发明的粉状的抗体或其片段、100mg乳糖、32mg滑石粉和8mg硬脂酸镁填充标准拼合式硬明胶胶囊,来制备本发明的荚膜形式的药物组合物。
肠胃外注射的组合物
通过在10k体积的丙二醇和水中搅拌1.5k重量的本发明抗体或其片段,来制备本发明的适合于注射施用的形式的药物组合物。由过滤灭菌溶液。
软膏组合物
本发明的抗体或其片段10g。
白色软石蜡100.0g。
将本发明抗体或其片段分散在小量载体中,以产生平滑的均相产物。然后用该分散体填充可挤压的金属管。
局部乳膏组合物
本发明的抗体或其片段1.0g。
Polawax GP200 20.0g。
无水羊毛脂2.0g。
白蜂蜡2.5g。
羟基苯甲酸甲酯0.1g。
蒸馏水100.0g。
在60℃下共同加热polawax、蜂蜡和羊毛脂。加入羟基苯甲酸甲酯溶液,同时利用高速搅拌完成匀浆。然后使温度降至SOOC。然后加入本发明的抗体或其片段并完全分散之,以慢速搅拌使组合物冷却。
局部洗液组合物
本发明的抗体或其片段1.0g。
山梨聚糖一月桂酸酯0.6g。Polysorbate 20 0.6g。
Cetostearyl alcohol 1.2g。甘油6.0g。羟基苯甲酸甲酯0.2g。
B.P.纯化水100.00ml。(B.P.=英国药典)
将羟基苯甲酸甲酯和甘油溶解于70ml 75℃的水中。在75℃下共同熔化山梨聚糖一月桂酸酯、polysorbate 20和cetostearylalcohol,并将其加入至水溶液中。匀化所产生的乳剂,用连续搅拌使之冷却,加入本发明的抗体或其片段作为在余下的水中的悬浮物。搅拌整个悬浮液直到匀化。
滴眼剂组合物
本发明的抗体或其片段0.5g。
羟基苯甲酸甲酯0.01g。
羟基苯甲酸丙酯0.04g。
100.00ml B.P.纯化水。
将羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯溶解70ml 75℃的纯化水中,并使所产生的溶液冷却。然后加入本发明的抗体或其片段,同时由通过膜滤器(0.022Am孔径)的过滤来给溶液灭菌,并且无菌地包装到合适的无菌容器中。
吸入施用的组合物
对于具有15-20ml容量的气雾剂容器:混合10mg本发明的抗体或其片段与0.2-0.5k润滑剂(如polysorbate85或油酸),并分散这样的混合物于推进剂(如氟利昂,优选为混合有(1,2-二氯四氟乙烷)和二氯氟甲烷)中,并放入适应于鼻内或口部吸入施用的适当的气雾剂容器中。具有15-20ml容量的气雾剂容器中的吸入施用的组合物:在乙醇(6-8ml)中溶解10mg本发明的抗体或其片段,加入0.1-0.2k润滑剂,如polysorbate 85或油酸;同时分散这样的混合物于推进剂(如氟利昂,优选为混合有(1,2-二氯四氟乙烷)和二氯氟甲烷)中,并放入适应于鼻内或口部吸入施用的适当的气雾剂容器中。
可肠胃外施用的抗体组合物
本发明的抗体和药物组合物特别有用于肠胃外施用,即皮下注射、肌肉注射或静脉注射。肠胃外施用的组合物一般包含本发明的溶于可接受载体(优选为含水载体)中的抗体溶液或其鸡尾酒。可以使用各种含水载体,例如水、缓冲水、0.4k盐水(生理盐水)、0.3%甘氨酸和类似之物。利用生理盐水是优选的。这些溶液是无菌的并且常常是无颗粒状物质的。可以由常规的、众所周知的灭菌技术给这些溶液灭菌。如果需要接近生理学条件,组合物可以含有药学上可接受的辅助物质,如pH值调节剂和缓冲剂等等。在这样的药物配方中,本发明的抗体或其片段的浓度可以广泛地变化。这样的浓度的选择将主要基于流体体积、粘性等等,并按照所选择的具体施用方式进行选择。一般地,合适的静脉内注射液浓度为大约每毫升1至100mg。
因此,本发明的静脉内注射的药物组合物可以包含10mL含有40-50mg本发明的抗人CD23抗体的生理盐水。用于制备可肠胃外施用的组合物的方法是本领域所熟知的,或对本领域技术人员来说是显而易见的,并且这些方法在有关文献中已有更详细的描述,例如,Remington药物科学,第15版,Mack出版公司,Easton,宾夕法尼亚,该文献被收作本文的参考文献。
本发明的抗体可以冻干存储,并可在利用之前重建于合适的载体中。业已证实该技术对于常规免疫球蛋白是有效的,并可以使用本领域熟知的冻干和重建技术。
取决于所需结果,可以施用本发明的药物组合物以预防和/或治疗疾病。在治疗应用中,以足以医治或至少部分地阻止疾病及其并发症的量,施用组合物于已患有疾病的患者。在预防应用中,施用包含本发明抗体或其鸡尾酒的组合物于不处于发病状态的患者,以提高患者的抗性。
可以用主治医生所选择的剂量水平和形式一次或多次施用药物组合物。在任何情况下,本发明的药物组合物都应该提供足以有效地治疗患者的量的主题抗CD23抗体。
也应该注意到:本发明的抗体可以用于设计和合成与抗体具有相同治疗作用的肽或非肽化合物(模拟物)。参见,例如,Saragovi等,科学,253:792-795(1991)。
通过以上说明可以了解:虽然在文中出于说明目的对本发明的具体实施方案进行了说明,但是可以在不偏离本发明的范围的前提下进行各种修饰。因此,本发明不为后附的权利要求所限制。
<110>REFF,MITCHELL E.
KLOETZER,WILLIAM S.