CN1312178C - 高密度脂蛋白反应性肽 - Google Patents

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Abstract

如在下面(a)或(b)中表示的高密度脂蛋白反应性肽或泡沫细胞反应性肽：(a)包含由SEQ ID NO：1描述的氨基酸序列的肽；和(b)包含某个氨基酸序列的肽，该氨基酸序列通过对在上面(a)中说明的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的替代、缺失、添加或插入而得到，且该肽能够特异地结合高密度脂蛋白胆固醇或将胆固醇从泡沫细胞中收回。因而，提供了具有新的氨基酸序列的肽，且该肽能够特异地结合HDL胆固醇或将胆固醇从泡沫细胞中收回。这些肽可用作治疗由动脉硬化、脂质代谢错误和外周胆固醇沉着导致的各种疾病的药物。

Description

高密度脂蛋白反应性肽
技术领域
本发明涉及能够特异地结合高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的肽、泡沫细胞反应性肽和含有这种肽的药物。
背景技术
在血液中，脂质总是以脂蛋白存在。目前阐明了脂质通过脂蛋白介导的转运和代谢机制。
三酰甘油(TGs)、胆固醇和胆固醇酯(CEs)是以极低密度脂蛋白(VLDLs)的形式分泌到血液中的。VLDLs以脂肪酸的形式为外周组织提供部分TGs，且也参与HDLs和中密度脂蛋白(IDLs)之间脂质部分的转运和交换。与HDLs进行脂质交换的IDLs失去TGs，从而变为低密度脂蛋白(LDLs)，该低密度脂蛋白反过来被外周组织摄取并提供胆固醇。
其间，在外周组织中变得无用的胆固醇可由HDLs收回并转变为CEs，并随后与包含于上述富含TG的VLDLs、IDLs或LDLs中的TG进行交换，直到反向转运到肝中。从外周组织如血管壁向肝的该胆固醇转移过程已知为反向胆固醇转运(RCT)，且认为该过程有助于防止胆固醇的累积(Medical Practice，Vol.18，No.3，473-480(2001))。
已知在反向胆固醇转运或在HDLs和富含TG的脂蛋白之间的脂质交换中起重要作用的物质包括酶如卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)、肝脂肪酶(HTLC)、脂蛋白脂肪酶(LPL)和胆固醇酯转运蛋白质(CETP)。然而，其作用机制、脂蛋白之间的相互作用和与脂质代谢错误的关系仍然未阐明。
泡沫细胞参与外周组织中胆固醇的累积。即源自血液中单核细胞并存在于血管壁上的巨噬细胞吞食了脂肪并在那里累积了大量的脂肪颗粒(主要为CEs)。化学修饰的LDLs是通过清除受体(scavengerreceptors)的介导而不断摄入巨噬细胞的，借此形成了泡沫细胞。泡沫细胞的出现已知是高胆固醇血症(cholestrolemia)中动脉硬化的发作和发展的关键因素。
本发明的一个目的是提供用于阐明HDL和富含TG的脂蛋白之间的相互作用的新信息。
本发明也提供关于富含TG的脂蛋白的参与上述相互作用的特定成分的信息、这种成分的区域和结构，并进一步提供了具有特定结构的HDL-反应性肽。
本发明也提供关于在外周组织如血管壁和脂蛋白中胆固醇累积之间相互作用的新信息，且特别是关于胆固醇流出机制的信息。
此外，本发明提供了某些手段，该手段用于估计和改善脂质代谢错误，该脂质代谢错误极大地影响心脏疾病如心肌梗死以及不同类型的动脉硬化(包括脑血管病症如脑中风)的发作、发展、预后等。
发明公开内容
本发明者进行了对脂质代谢错误的研究，并提供了(除了别的之外)充当指示该错误的临床指数的残迹样(remnant-like)脂蛋白(RLP)(参见如Arteriosclerosis，20，79-88(1992)；Clin.Chim.Acta.，223，53-71(1993)；或日本专利No.2657225)，以及改进或测量参与上述脂质交换的CETP的技术(日本专利No.3043528)。
在其随后的研究中，本发明者相当出乎意料地获得了HDL直接与LDL反应的新发现。本发明已在确定该反应通过LDL的apo B-100的特定区域介导的基础上实现了。
HDL直接与富含TG的脂蛋白反应并借此交换脂质的新发现满意地解释了RLP的特征和RLP的上述现象的原因，该RLP是异常的脂蛋白，据认为它缓慢代谢并在血液中累积。RLP是一种血清脂蛋白，其特征在于RLP不与apo B-100(VLDL、IDL和LDL的一种结构脱辅基蛋白质)或apo A-I(HDL的一种结构脱辅基蛋白质)的抗体反应。因而，与正常的富含TG的脂蛋白不同，据认为RLP不提供apoB-100的特定区域，其中该特定区域参与与HDL的反应，因此RLP不能与HDL反应，从而导致脂质交换和RLP代谢的停滞。
因此，本发明涉及新信息的提供，即在上述脂质转运机制或在脂蛋白代谢机制中，HDL通过包含于VLDL、IDL和LDL中的apo B-100的介导直接与富含TG的VLDL、IDL和LDL反应。此外，本发明涉及提供参与apo B-100的反应的特定区域。
因而，本发明提供了下面(a)或(b)中的HDL-反应性肽：
(a)具有由SEQ ID NO：1描述的氨基酸序列的肽；或
(b)具有由(a)描述的氨基酸序列的肽，该肽中的一个或多个氨基酸残基已通过替代、缺失、添加或插入而进行修饰，且该肽具有对HDL胆固醇的特异结合能力。
本发明者进一步进行了对肽和修饰的肽作用的各种研究，且发现这些肽具有使胆固醇从在动脉硬化早期产生的泡沫细胞中流出的作用。一种具有使胆固醇从泡沫细胞流出作用的物质防止了蚀斑的形成、血栓的形成、泡沫细胞发展成动脉硬化或相似的反应。因此，肽和修饰的肽可用作改进脂质代谢错误的药物或防止或治疗动脉硬化的药物。
本发明提供了下面(a)或(b)中的泡沫细胞反应性肽：
(a)具有由SEQ ID NO：1描述的氨基酸序列的肽；或
(b)具有由(a)描述的氨基酸序列的肽，该肽中的一个或多个氨基酸残基已通过替代、缺失、添加或插入而进行修饰，且该肽诱导胆固醇从泡沫细胞中流出。
本发明也提供了一种药物如外周组织胆固醇流出药物、用于改善脂质代谢错误的药物或用于防止或治疗动脉硬化的药物，该药物含有HDL-反应性肽或泡沫细胞反应性肽作为活性成分。
本发明也提供了一种药物组合物如外周组织胆固醇流出药物、一种用于改善脂质代谢错误的药物或一种用于防止或治疗动脉硬化的药物，该药物包含HDL-反应性肽或泡沫细胞反应性肽和一种药物学可接受的载体。
本发明也提供了HDL-反应性肽或泡沫细胞反应性肽在生产药物时的用途，该药物如外周组织胆固醇流出药物、用于改善脂质代谢错误的药物或一种用于防止或治疗动脉硬化的药物。
本发明也提供了治疗外周组织中胆固醇累积、脂质代谢错误或动脉硬化的方法，该方法包含以有效量给予需要其治疗的被试者HDL-反应性肽或泡沫细胞反应性肽。
在本说明书中，用于指明氨基酸、肽、核苷酸序列、核酸等的缩写与IUPAC或IUB“Guideline for Preparing a SpecificationContaining a Nucleotide Sequence or an Amino Acid Sequence”(日本专利局编)的规则一致，或者与现有技术中惯例的编码一致。
apo B-100的氨基酸序列和位置编号与“apolipoprotein B-100precursor-human，ACCESSION：LPHUB，PID：g71789，NCBISequence Viewer”一致。
附图简述
图1表示B100FL与抗-apo B-100单克隆抗体(JI-H)的反应性；
图2表示在不结合B100FL凝胶(A)的组分中或不结合对照凝胶(B)的组分中含有的脂蛋白的分析(HPLC)结果；
图3表示在不结合B100FL凝胶的组分中和结合B100FL凝胶的组分中含有的蛋白质的分析(SDS凝胶电泳)结果；
图4表示本发明肽在胆固醇从RAW264细胞中流出时的作用；和
图5表示本发明肽在鹌鹑动脉硬化模型中的血管组织中的作用(A(×16)和B(×40)：对照组；和C(×16)和D(×40)：已向其中给予了本发明肽的组)。
实施本发明的最佳模式
本发明的HDL-反应性多肽将详细进行描述。
本发明的HDL-反应性多肽的特征在于其对HDL胆固醇的特异结合能力。
如在此处所用的，措辞“具有对HDL胆固醇的特异结合能力”指一种如下情形，其中HDL-反应性肽展示了与游离胆固醇和/或在HDL中含有的CE的特异的亲和力，并从而特异地与其进行结合。该措辞也指一种如下情形，其中游离胆固醇和/或在HDL中含有的CE展示了与HDL-反应性肽的特异亲和力，并从而特异地与其进行结合。
SEQ ID NO：1是显示与HDL胆固醇有结合能力的特征肽的氨基酸序列。即具有这种氨基酸序列的肽具有与HDL胆固醇的特异结合能力。因此，这种肽是本发明的HDL-反应性肽的优选的实施方案。
SEQ ID NO：1代表在apo B-100(VLDL、IDL和LDL的一种结构蛋白质)中含有的区域，该区域具有51个氨基酸残基；即apoB-100的第2,297～2,347个氨基酸残基。
有趣的是，由SEQ ID NO：1代表的区域含有一个区域，该区域被认为是单克隆抗体JI-H”(一种用于RLP测量中的apo B-100抗体)的抗原决定部位(J.Clin.Ligand Assay，19(3)，177(1996))。因此，本发明中的发现非常好地与下面的事实吻合，即异常的富含TG的脂蛋白RLP与单克隆抗体不具有结合能力，该RLP缓慢代谢且在血液中累积。
关于HDL-反应性肽，SEQ ID NO：1的氨基酸序列可采取修饰的形式，其中部分氨基酸或者一个或多个氨基酸残基被修饰了，只要该肽展示与HDL胆固醇结合的能力。
在修饰(即替代、缺失、添加或插入)的程度和位点上没有限制，只要具有修饰的氨基酸序列的肽展示与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽相同的作用；即该肽具有对HDL胆固醇的结合能力。突变体的例子包括具有约100个氨基酸残基的肽，且突变体优选地具有约6～约60个氨基酸残基，更优选地为约20～约50个氨基酸残基。基本的要求是突变体具有由SEQ ID NO：4所描述的6个氨基酸残基，且优选地突变体具有由SEQ ID NO：5所描述的20个氨基酸残基。突变体的例子包括具有由SEQ ID NO：2所描述的30个氨基酸残基的肽和具有由SEQ ID NO：3所描述的30个氨基酸残基的肽。本发明的HDL-反应性肽特别优选地是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽。
HDL-反应性肽是否具有与HDL胆固醇的结合能力可依照惯例方法来证实。一个特定的例子将在下面的实施例中进行描述。
本发明的泡沫细胞反应性肽将详细进行描述。泡沫细胞反应性肽的特征在于其使胆固醇从泡沫细胞中流出的作用。
关于泡沫细胞反应性肽，SEQ ID NO：1的氨基酸序列可采取修饰的形式，其中部分氨基酸或者一个或多个氨基酸残基被修饰了，只要该肽展示使胆固醇从泡沫细胞中流出的能力。
在修饰(即替代、缺失、添加或插入)的程度和位点上没有限制，只要具有修饰的氨基酸序列的肽展示与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽相同的作用；即该肽展示使胆固醇从泡沫细胞中流出。突变体的例子包括具有约100个氨基酸残基的肽，且突变体优选地具有约6～约60个氨基酸残基，更优选地为约20～约50个氨基酸残基。基本的要求是突变体具有由SEQ ID NO：4所描述的6个氨基酸残基，且优选地突变体具有由SEQ ID NO：5所描述的20个氨基酸残基。突变体的例子包括具有由SEQ ID NO：2所描述的30个氨基酸残基的肽和具有由SEQ ID NO：3所描述的30个氨基酸残基的肽。本发明的HDL-反应性肽特别优选地是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽。
泡沫细胞反应性肽是否具有使胆固醇从泡沫细胞流出的能力可依照下面在实施例中描述的方法来证实。
在下文中，HDL-反应性肽和泡沫细胞反应性肽可共同称为“本发明肽”。
本发明肽可通过常规的化学合成方法进行生产从而使得该肽具有所提及的氨基酸序列。该方法包含各种以惯例的固相技术和惯例的液相技术为基础的肽合成技术。
特定地，肽合成方法包括逐步延伸和片段缩合。在逐步延伸中，肽是通过依照目标氨基酸序列信息而相继结合氨基酸残基而生成的，借此链得以延伸。在片段缩合中，肽片段是通过依照目标氨基酸序列信息合成的，合成的片段具有多数氨基酸残基并随后使得片段相互进行偶联反应。本发明肽可通过这些方法中的任何一个来合成。
在上述肽合成中采用的缩合可通过常规方法进行。该方法的特定例子包括氮化物方法、混合酸酐方法、DCC方法、活性酯方法、氧化-还原方法、DPPA(二苯磷酸氮化物(diphenylphosphorylazide))方法、作为DCC方法和添加物(如1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰胺、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亚胺)的组合的修饰的DCC方法和Woodward方法。在这些方法中所用的溶剂可适当地选自那些众所周知在这种肽缩合反应中应用的溶剂。溶剂的例子包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、六磷酸酰胺(hexaphosphoramide)、二烷、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯及其混合物。
在肽合成反应中，在氨基酸或肽中含有的且不参与反应的羧基基团一般可通过形成酯来进行保护；如低级烷基酯如甲酯、乙酯或叔丁酯；苄酯；对甲氧基苄酯；对硝基苄酯或芳烷基酯。当氨基酸残基在其侧链具有功能基团时，可将该功能基团进行保护。例如，Tyr的羟基基团可用乙酰基基团、苄基基团、苄氧基羰基基团或叔丁基基团进行保护。但是，这种功能基团并非必须进行保护。此外，Arg的胍基基团可用适当的保护基团进行保护，如硝基基团、甲苯磺酰基基团、2-甲氧基苯磺酰基(2-methoxybenzenesulfonyl)基团、亚甲基-2-磺酰基基团、苄氧基羰基基团、异冰片基氧基羰基基团或金刚烷氧基羰基基团。
上述保护的氨基酸或肽或以保护的形式最终获得的本发明肽的去保护可通过常规方法进行；如催化还原或采用液态氨/钠、氟化氢、溴化氢、氯化氢、三氟乙酸、乙酸、蚁酸或甲磺酸的方法。
依照所需，这样获得的本发明肽可通过常规方法进行纯化。该方法的例子包括离子交换、分配层析、凝胶层析、亲和层析、高效液相层析(HPLC)和逆流分配。这些方法已惯例地应用于肽化学领域中。
可选择地，本发明肽可通过基因工程技术来生产，该技术利用编码本发明肽的DNA序列。
基因工程技术可通过常规程序进行。例如，DNA片段的合成、使得DNA片段能够表达的载体的生产和载体在宿主细胞中的表达可通过与用于惯例的基因工程技术中的那些相似的技术来进行(参见如Molecular Cloning 2d.Ed.，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；或由Japan Biochemical Sociaty编辑的Zoku-seikagaku Jikken Kouza“Idenshi Kenkyu-ho I，II，III，”(1986))。例如，编码本发明肽的DNA片段是通过依照由本发明提供的HDL-结合肽的氨基酸序列信息而通过常规方法生产的(参见如Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1985)或Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990(1983))。
更特定地，DNA片段可通过亚磷酰胺法或三酯法进行化学合成。这种方法的例子包括使用商业上可购得的自动寡核苷酸合成设备的方法。双链DNA片段是通过合成与单链DNA片段互补的DNA片段并使两个片段在适当的条件下进行退火程序而从化学合成的单链DNA片段生产的，或者是通过使用适当的引物和DNA聚合酶并向单链DNA片段添加互补的DNA片段而生产的。
依照所需，由DNA片段编码的氨基酸序列可以进行修饰。这可通过已知的方法来实施。该方法的例子包括寡核苷酸定点特异性诱变(Zoller， M.等人，Nucl.Acids Res.，10，6487-6500(1982))和盒式诱变(Well，J.等人，Gene，34，315-323(1985))。
通过利用DNA片段进行想要的肽的生产或表达可通过本领域中已知的惯例方法来进行(参见如Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1985)或Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990(1983))。
编码本发明肽的DNA片段可通过用能够编码apo B-100的现有DNA片段来制备。
这样获得的目标肽可利用其物理或化学特征通过分离技术进行分离和纯化(参见如“Biochemistry Data Book II”，pp.1175-1259，第一版，第一次印刷，1980年6月23日，Tokyo Kagaku Dozin Co.Ltd.出版；Biochemistry，25(25)，8274-8277(1986)或Eur.J.Biochem.，163，313-321(1987))。
如上所述，本发明肽包括具有对HDL胆固醇特异性结合能力的肽和诱导胆固醇从外周组织特别是从泡沫细胞中流出的肽。因此，利用这些作用，本发明肽可用作试剂以研究解释脂质转录和代谢的机制、外周组织中动脉硬化的发生机制或血栓的形成机制。例如，此外本发明肽可用于生产含有肽作为活性成分的药物组合物。由于药物组合物含有展示对HDL胆固醇特异性结合能力的本发明肽作为活性成分，所以该药物组合物可用于如提供与HDL到富含TG的脂蛋白或异常脂蛋白(如RLP)的反应性，该异常脂蛋白代谢缓慢并在血液中累积，或者用于促进反应。此外，由于本发明肽导致胆固醇从外周组织细胞中流出，所以药物组合物可用于改善冠状动脉、主动脉、外周动脉等中的脂质代谢及防止或治疗动脉硬化。
因而，这种脂蛋白的代谢可得到正常化或促进，且可防止动脉硬化的发展。因此，药物组合物可用作改善脂质代谢的药物或用作防止或治疗动脉硬化的药物。
药物组合物是这样给予的，从而其活性成分可有效地递送到目标位点，如RLP、富含TG的脂蛋白或动脉(特别是血管)中。例如，药物组合物是通过食物给予的，或者将药物组合物进行加工从而其活性成分在肠吸收，进而制得药物制剂，且该制剂是经口服给予的。这种药物制剂可通过常规方法生产并以惯例的方式给予。可选择地，本发明肽，即药物组合物的活性成分可用脂质或其它物质进行处理。
药物组合物可用药物递送物质来与药物递送系统(DDS)组合，该药物递送物质结合目标RLP或富含TG的脂蛋白。
药物递送物质的例子包括在目标脂蛋白中含有的脱辅基蛋白质如apo B-100的抗体(优选地为单克隆抗体)。用这种抗体修饰的本发明肽可由目标脂蛋白实现有效的导向。
药物组合物含有药物学有效量的本发明肽作为活性成分，且该组合物是通过常规方法与一种或多种药物学可接受的载体一起制备的，并借此制备药物组合物。
本发明提供了具有编码本发明肽的核苷酸序列的DNA片段。该DNA片段在通过如上所述的基因工程技术生产本发明肽中是有用的。此外，该DNA片段可用于生产含有DNA片段作为活性成分的药物组合物。结果所得的药物组合物可用作目标为RLP、富含TG的脂蛋白或动脉的药物，且该药物组合物可用于与如上所述含有本发明肽作为活性成分的药物组合物相同的用途。
本发明肽导致胆固醇和/或脂质如TG从HDL中流出。因此，通过与HDL的反应，本发明肽可用于如上所述激活反向胆固醇转运或促进有利的HDL代谢。例如为了使用本发明肽，可生产含有本发明肽或其DNA片段作为活性成分的药物组合物，或者通过使胆固醇从HDL中流出而将本发明肽用于生产不含胆固醇的HDL(在下文中称为“无脂质的apo A-1”)(参见如Curr.Opin.Lipidol.，7，82-87，(1986))。
当以上述方式使用本发明肽时，本发明肽与HDL进行反应，从而在血液中获得无脂质的apo A-1的阳性产物。因而，除此之外，本发明肽通过强制胆固醇的流出可相当有效地用于(经由HDL)防止胆固醇在组织中的沉积，或者防止血管的动脉硬化或再狭窄。
如上所述，本发明肽具有直接的使胆固醇从动脉泡沫细胞中流出的作用。因此，即使将本发明肽用于已经发展了动脉硬化的血管中，本发明肽在例如防止动脉硬化的发展或治疗动脉硬化中、或者经由胆固醇的流出来防止血管的再狭窄中也是相当有用的。
本发明肽作为药物组合物的用途包含其体外的用途。
如上所述，当本发明肽与HDL进行反应时，则产生了无脂质的apo A-1，且无脂质的apo A-1在预防或治疗上述疾病或病理状况中是有用的。本发明肽的体外用途的例子包括使用含有本发明肽作为有效成分的柱子的体外循环。在体外循环的方式上没有限制，只要该方法使得本发明肽能够有效地与试验血液样品(HDL)相接触。例如，在其上固定有本发明肽的载体是优选采用的。除使用在其上固定本发明肽的载体的方法之外，体外循环可通过在日本专利No.2835923中描述的方法实施。
实施例
本发明下一步将通过实施例来更加详细地加以描述，该实施例不应该理解为限制本发明的。
实施例1
(1)肽合成
具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的肽(B100FL)是依照常规方法化学合成的。
特定地，该肽是通过Fmoc方法合成的，从而使得可以用Fmoc-NH-SAL树脂(Watanabe Kagaku的产品)获得上述序列。保护的含肽树脂用溶剂混合物(TFA∶苯酚∶苯硫基甲烷∶1，4-二巯基丁烷(1，4-butanedithiol)∶水＝82.5∶5∶5∶2.5∶5)处理3小时，从而除去保护基团。
粗产物是通过如下所述的反相HPLC进行纯化的，从而得到目标肽。
<反相HPLC>
柱：Cosmosil 5C18MS(10×250mm；Nacalai Tesque)
洗脱液：含有0.1％TFA的水/乙腈(乙腈的线性梯度；2.5mL/分)
这样获得的目标肽可通过质谱分析法(Perseptive Biosystems；Voyager DE/矩阵辅助的激光解吸电离-飞行时间：MALDI-TOF/矩阵：α-氰基-4-羟基肉桂酸)和氨基酸分析(在密封的的试管中于110℃在恒定沸腾的盐酸中水解24小时(Hitachi L-8500 Amino AcidAnalyzer))进行分析。
(2)与抗-apo B-100的单克隆抗体(JI-H：J.Clin.LigandAssay，19(3)，177(1999))的反应性
反应性是依照常规方法用由上面获得的肽(B100FL)覆盖的平板通过ELISA来证实的(参见如公开的日本专利申请(Kokai)No.4-104798)。
结果发现B100FL具有与JI-H的特定反应性(图1：Y-轴和X-轴分别代表吸收值(OD450)和固定的肽的浓度(ng/mL))。
(3)与HDL的反应性
将上述(1)中获得的肽(B100FL，0.1mg)加入到亲和凝胶(25μL)中，在该凝胶中已固定了抗-apo B-100的单克隆抗体(JI-H)，由此制备了B100FL-结合的亲和凝胶。对照凝胶是通过以上述相似的方式用PBS(不含B100FL)处理凝胶来制备的。
将人血浆(1mL)加入到亲和凝胶(2mL)中，在该凝胶中已固定了抗-apo A-1的单克隆抗体，由此导致HDL特异性地与凝胶结合。结合的HDL是用3M的硫氰酸钠洗脱的，且将这样获得的洗脱液的缓冲液通过用脱盐柱而改变为PBS，由此制备了HDL样品。
前述固定了抗-apo A-I单克隆抗体的亲和凝胶和固定了抗-apoB-100单克隆抗体(JI-H)的亲和凝胶是依照常规方法制备的(日本专利出版物(kokoku)No.7-104351)。
使HDL样品(含有20μg apo A-I)与B100FL-结合的亲和凝胶在室温反应30分钟。随后，使反应混合物放置15分钟，借此导致凝胶沉淀，从而从反应混合物中去除凝胶。
不结合凝胶的组分(在下文中称为“B100FL-不结合的组分”)和结合凝胶的组分(在下文中称为“B100FL-结合的组分”)是依照常规方法分别进行下面描述的分析的。
总胆固醇水平：总胆固醇水平是依靠自动分析仪(TBA20R；Toshiba)用测量胆固醇水平的试剂(L-TCII，Kyowa Medex Co.，Ltd.)确定的。
脂蛋白分析：脂蛋白是通过监控由胆固醇产生的颜色而由脂蛋白分析系统的HPLC来分析的(Lipopropax XL，洗脱液：TSK洗脱液LP-1，1mL/分，样品体积：100μL；Tosoh)。
蛋白质浓度：每一蛋白质浓度是通过测量吸收值(OD280)确定的；或者通过劳里(Lowry)方法确定，在该方法中使每一个样品(该样品已用乙醇-乙醚脱脂)进行颜色反应。
蛋白质分析：蛋白质是用SDS-凝胶电泳进行分析的。特定地，使每一个样品进行脱脂处理并用1％的SDS进行溶解，随后用缓冲液(2％SDS/10％甘油/0.005％BPB/20％2-巯基乙醇)进行处理，借此制备用于电泳的样品。结果所得的样品是依照常规方法在4-20％的梯度凝胶上进行电泳的。
<结果>
图2表示通过脂蛋白分析获得的结果，该脂蛋白包含于不结合B100FL凝胶的组分(图2A)和不结合对照凝胶的组分(图2B)中。在图2中，实线表示通过将每一个组分都用作样品的分析获得的结果；且虚线表示通过将HDL用作样品的分析获得的结果(基线)。
下面的表1表示通过对不结合B100FL凝胶的组分(表1中为“B100FL”)和不结合对照凝胶(表1中为“PBS”)的组分的每一分析所获得的结果。每一分析都是关于总胆固醇水平(表1中为“胆固醇”)、由脂蛋白分析(图2)获得的HDL-胆固醇水平(表1中为“HDL-C”)、由测量吸收值确定的蛋白质浓度(表1中为“O.D.280”)和通过颜色反应测量的蛋白质浓度(表1中为“脱脂蛋白质”)而进行的。
表1
胆固醇(mg/dl) HDL-C(区域) O.D.280 脱脂蛋白质(μg/mL)
B100FLPBS 0.253.60 243.25,811.3 0.1160.143 231.0215.8
从表1显而易见的是，用B100FL-结合的凝胶处理的HDL样品的总胆固醇水平是0.25mg/dl，该值是用对照凝胶处理的HDL样品的值的约1/15。此外，图2(脂蛋白分析)包括在用对照凝胶处理的HDL样品中属于胆固醇(HDL-C)的峰，但不包括在用B100FL-结合的凝胶处理的HDL样品中的峰。
蛋白质浓度是通过测量吸收值和通过颜色反应来确定的。发现用B100FL-结合的凝胶处理的HDL样品的蛋白质浓度几乎与用对照凝胶处理的HDL样品中的一样(表1)。
蛋白质分析是通过SDS-凝胶电泳进行的。结果显示于图3中。
在图3中，每一个泳道代表下面的样品。
标准(低)：低分子量标准
B100FL(+)未结合的：B100FL-未结合的组分
B100FL(+)结合的：B100FL-结合的组分
B100FL(-)未结合的：对照凝胶-未结合的组分
B100FL(-)结合的：对照凝胶-结合的组分
B100FL(-)/凝胶(-)：HDL：未用凝胶处理的HDL
HDL-4：未用凝胶处理的HDL-组分4
LDL-3：未用凝胶处理的LDL-组分3
标准(高)：高分子量标准
在图3中，不仅在未处理的HDL样品中，而且在已用B100FL-结合的凝胶处理的样品中，在分子量28,000位置附近存在一条代表A-1(HDL的主要脱辅基蛋白质)的条带作为主要条带。此外，也存在代表除A-I之外的HDL-结构化蛋白质(apo C，apo A-II，apo E，apo A-IV等)的条带，且在这些蛋白质的结构比例中未发现差异。
因此，在通过用HDL与B100FL反应而获得的反应溶液中，只存在蛋白质(例如HDL的apo A-I)，且胆固醇和胆固醇酯基本不存在。上述结果显示B100FL与HDL的胆固醇或胆固醇酯具有相互作用，且具有使胆固醇和胆固醇酯从HDL的脱辅基蛋白质颗粒中流出的作用。
实施例2肽合成
具有在表2中显示的氨基酸序列的每一个肽都是以与在实施例1中描述的相似的方式合成的。
表2
名称 M.W. 氨基酸序列 Apo B-100位置
P51(B-100FL) 5,931 LLDQLGTTIS FERINDVLEH VKHFVINLIG DFEVAEKINA FRAKVHEL IE R (2,297-2,347)
P21 2,514 DFEVAEKINA FRAKVHEL IE R (2,327-2,347)
PS505(SEQ ID NO：2) 3,434 LLDQLGTTIS FERINDVLEH VKHFVINLIG (2,297-2,326)
PS506 2,824 LLDQLGTTIS FERINDVLEH VKHF (2,297-2,320)
PS507 1,834 LLDQLGTTIS FERIND (2,297-2,312)
PS508 1,952 EKINA FRAKVHEL IE R (2,332-2,347)
PS509(SEQ ID NO：3) 3,509 FERINDVLEH VKHFVINLIG DFEVAEKINA (2,307-2,336)
实施例3胆固醇流出试验
对前述的肽关于胆固醇从RAW264细胞(动脉粥样硬化的模型)中流出的作用进行了检查。
特定地，将RAW264细胞(小鼠单核细胞白血病品系)加入到补充了10％FBS的DMEM培养基中，从而制备了具有4×105细胞/mL的浓度的样品。将样品(1mL)的等份试样加入到12-孔平板的每一个孔中，随后在CO2培养箱中培养2天(37℃)。将每一个孔中的培养基去除，并用1mL含有0.2％BSA和20mM谷氨酰胺的DMEM(在下文中称为“DMEM”)洗涤孔中的细胞1次。随后，将DMEM中乙酰化的LDL溶液(40μg/mL，1mL)加入到每一个孔中，接着在CO2培养箱中培养24小时(37℃)，借此乙酰化的LDL进入到细胞中。将细胞用补充了0.2％BSA的PBS洗涤2次。其后，将DMEM中的二丁基cAMP溶液(0.3mM，1mL)加入到每一个孔中，随后在CO2培养箱中培养2小时(37℃)。
将试验肽(20μL)加入到每一个孔中从而获得20、2.0或0.2μg/mL的终浓度，随后在CO2培养箱中培养24小时(37℃)。
24小时之后，将每一个孔中的上清液收集到微量试管中，并将该微量试管于10,000rpm离心5分钟。上清液的胆固醇水平是依靠上述的自动分析仪进行测量的。
使每一个试验的肽溶于DMSO(5mg/mL)中，并将这样形成的溶液用DMEM稀释，从而获得1mg/mL的浓度。随后，将结果所得的溶液用DMEM稀释10倍或100倍，从而制得试验样品。此外，为了制备对照样品，仅将DMSO用DMEM稀释以得到0.4、0.04或0.004％的终浓度；同时为了制备正对照样品，将脱脂的HDL用DMEM稀释，从而获得2.5、5.0或10μg/mL的浓度。
结果显示于图4中。
可发现3个肽(P51(B-100FL，SEQ ID NO：1)、PS505(SEQ IDNO：2)和PS509(SEQ ID NO：3))依赖于所应用的肽浓度展示强的使胆固醇从RAW264细胞(被乙酰化LDL泡沫化)中流出的作用。然而，发现4个不含有由6个氨基酸(相应于B-100的第2,321-2,326个氨基酸)组成的序列的肽(P21、PS506、PS507和PS508)不展示该作用。
令人信服地，含有6个氨基酸(B-100的第2,321-2,326个氨基酸)(SEQ ID NO：4)序列的肽和含有20个氨基酸(B-100的第2,307-2,326个氨基酸)(SEQ ID NO：5)序列的肽展示胆固醇流出作用，并且具有抗动脉硬化作用。
实施例4用动脉硬化模型所做的作用试验
将胆固醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和玉米油(CornGerm Oil 100；Ajinomoto Co.，Inc.)混合入商业上可购得的饲料(Natural Pet Foods产品，“Chicks and nestlings(Quail)”)中以分别获得2％和15％的终浓度，从而制备高胆固醇的饲料。
使健康的鹌鹑在能够自由地摄入高胆固醇饲料的情况下饲养8周。在开始饲喂的第5周，将试验肽(B-100FL)在盐中的溶液(1.0mg/mL)以2～3天的间隔每周2次给予肱(翅)静脉中(200μL；200μg/个体)。以与上述相似的方式，仅将盐给予对照组的鹌鹑。
在对鹌鹑进行饲喂8个星期之后，将每一个鹌鹑的头切下进行放血，从而获得主动脉样品。迅速将主动脉样品在固定溶液(10％福尔马林)中固定3天。随后制备了弓动脉(在那里最容易发生动脉硬化病灶)的组织样品(厚度为4μm的冷冻切片)。将组织样品进行苏木精和伊红染色(常规染色)，并进行油红染色(脂肪染色)，随后在显微镜下进行检查。
在对照组的组织样品中，观察到了下面的情况：血管内膜相当程度的加厚、大量脂质在内膜加厚部分的累积、脂质向许多部分(不仅是内膜而且是中膜)的渗入，以及组织包括脂质，且平滑肌细胞在弹性纤维中存在。
在向其中给予了试验肽的组的组织样品中，在内膜中观察到了小量脂质的累积。然而，累积的脂质的大小和量都小，且未观察到血管内膜的形态病症。此外，发现不存在内膜的加厚和脂质向中膜的渗入。
图5表示组织样品的典型图象。在图5中，A(×16)和B(×40)代表对照组的组织样品的图象，C(×16)和D(×40)代表试验组的组织样品的图象。
在上述中显而易见的是，本发明的肽通过防止脂质向血管的渗入而在早期抑制了动脉硬化病灶的出现；并且通过使渗入的脂质从血管中流出而阻止了该病灶的发展。
实施例5
以与在实施例1(3)中描述的相似的方式，检查了HDL与PS509(在实施例2中合成)的反应性(作为试验肽，应用了B-100FL或PS509，且应用的HDL样品的总胆固醇浓度为12.7mg/dl)。
当用B-100FL处理HDL时，总胆固醇浓度水平减少了约72个百分点，而当用PS509处理HDL时，总胆固醇浓度水平减少了约48个百分点。
工业应用
本发明提供了一种具有新氨基酸序列的肽，该氨基酸序列具有HDL-胆固醇-特异性结合能力。同样地，本发明提供了一种导致胆固醇从外周组织中流出的肽。这些肽可用作多种疾病的药物，该疾病由如动脉硬化、脂质代谢错误和外周组织胆固醇累积所导致。
序列表
<110>Japan Immuno Research Laboratories Co.，Ltd.
<120>高密度脂蛋白反应性肽
<130>OP0041
<140>
<141>
<150>JP P2001-144304
<151>2001-05-15
<160>5
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>51
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：基于apoB-100设计的肽
<400>1
Leu Leu Asp Gln Leu Gly Thr Thr Ile Ser Phe Glu Arg Ile Asn Asp
  1               5                  10                  15
Val Leu Glu His Val Lys His Phe Val Ile Asn Leu Ile Gly Asp Phe
             20                  25                  30
Glu Val Ala Glu Lys Ile Asn Ala Phe Arg Ala Lys Val His Glu Leu
         35                  40                  45
Ile Glu Arg
     50
<210>2
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：基于apoB-100设计的肽
<400>2
Leu Leu Asp Gln Leu Gly Thr Thr Ile Ser Phe Glu Arg Ile Asn Asp
  1               5                  10                  15
Val Leu Glu His Val Lys His Phe Val Ile Asn Leu Ile Gly
             20                  25                  30
<210>3
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：基于apoB-100设计的肽
<400>3
Phe Glu Arg Ile Asn Asp Val Leu Glu His Val Lys His Phe Val Ile
1               5                   10                  15
 Asn Leu Ile Gly Asp Phe Glu Val Ala Glu Lys Ile Asn Ala
             20                  25                  30
<210>4
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：基于apoB-100设计的肽
<400>4
Val Ile Asn Leu Ile Gly
1               5
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：基于apoB-100设计的肽
<400>5
Phe Glu Arg Ile Asn Asp Val Leu Glu His Val Lys His Phe Val Ile
1               5                   10                  15
Asn Leu Ile Gly
            20

Claims (11)

1.一种下面(a)或(b)的高密度脂蛋白反应性肽：
(a)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的肽；或
(b)由(a)描述的氨基酸序列组成的肽，该肽中的一个或多个氨基酸残基已通过替代、缺失、添加或插入而进行修饰，且该肽具有对高密度脂蛋白胆固醇的特异结合能力。
2.根据权利要求1的高密度脂蛋白反应性肽，该肽由SEQ IDNO：4的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1的高密度脂蛋白反应性肽，该肽由SEQ IDNO：5的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1的高密度脂蛋白反应性肽，该肽由SEQ IDNO：2或3的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1的高密度脂蛋白反应性肽，该肽具有对高密度脂蛋白胆固醇的特异结合能力。
6.一种药物，该药物含有在权利要求1～4的任何一项中所述的高密度脂蛋白反应性肽作为活性成分。
7.根据权利要求6的药物，该药物是防止或治疗动脉硬化的药物、改善脂质代谢错误的药物或导致胆固醇从外周组织中流出的药物。
8.一种含有在权利要求1～4的任何一项中所述的高密度脂蛋白反应性肽和药物学可接受的载体的药物组合物。
9.根据权利要求8的药物组合物，该药物组合物是防止或治疗动脉硬化的药物、改善脂质代谢错误的药物或导致胆固醇从外周组织中流出的药物。
10.在权利要求1～4的任何一项中所述的高密度脂蛋白反应性肽在生产药物中的应用。
11.根据权利要求10的应用，其中该药物是防止或治疗动脉硬化的药物、改善脂质代谢错误的药物或导致胆固醇从外周组织中流出的药物。
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