CN1314809A - 对新孵化的家禽接种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了家禽疫苗接种的一种方法,即用有效剂量的肠道致病性肠杆菌的无毒活衍生菌喷淋家禽。

Description

对新孵化的家禽接种的方法
发明背景
1．发明领域：
本发明涉及家禽接种疫苗，更具体地说，是一种对家禽接种疫苗的新方法，包括用肠道致病菌的无毒活衍生菌来喷淋。
2．相关领域描述
已知在食用了被人肠道菌致病原(如沙门氏菌spp.)污染的家禽肉和蛋将导致人患病。这种污染主要发生于屠宰后加工畜体过程中接触含有高水平肠杆菌的肠内容物所致。肠杆菌寄居肠道中但通常对家禽不致病。为了减少食物被肠道致病菌污染，理想的是减少上市童子鸡肠道中人致病性肠道细菌的量。降低这种污染的努力着重于改良童子鸡。降低这种污染的努力已着重于改善生产和加工过程中的环境卫生(Bailey,J.s.,Poult.Sci.,72:1169-1173,1993)，但这些方法耗时费用又高，而且对避免零量的(Sporadic)污染并不总是有效。(参见如Food Borne Disease Outlook Annual summary,1982；和SalmonellaSurveillance Annual survey 1992；均可从Center for Disease Control,U.S.Department of Health and Human Services,Atlanta,GA购得)。依赖于加工过程中环境卫生的方法必须经常重复，因为加工的装置和人员会被每只加工的受污染家禽再污染。依赖于生产过程中环境卫生的方法要求坚持防范，因为生产环境污染的可能性很高。因此，一种控制家禽生长过程中肠道致病菌的简单而价廉的方法是降低加工过程中畜体污染的关键性改进。
Promosopone等人，J.Food Protect.,61(2):176-180,1998已报导了可通过给予鼠伤寒沙门氏菌特异性抗体联合应用禽特异性前生物期物质(probiotic)来降低家禽肠道中鼠伤寒沙门氏菌的定居。用噬酸乳杆菌、屎链球菌和鼠伤寒沙门氏菌抗体喷淋给予1日龄的仔鸡，然后通过饮水口服给予1-3天。在第一天口服给予鼠伤寒沙门氏菌攻击仔鸡，第31、38和43天用前生物期物质处理后发现了明显降低了盲肠和结肠鼠伤寒沙门氏菌的量。虽然在早至第1天龄给予前生物期物质和抗体对降低肠中鼠伤寒沙门氏菌的定居可能非常重要，但从该报导中不能弄清楚初期喷淋给予前生物期物质和抗体或更通常在第1-3天在饮水中口服给予是否能引起鼠伤寒沙门氏菌定居的降低。
已报导了预防家禽疾病用的疫苗和一些对沙门氏菌特异的疫苗(参见如美国专利No.5,294,441、5,389,368、5,468,485和5,387,744)。然而对不同家禽给予疫苗的方法不同，这取决于活性制剂作用的靶部位。事实上，通常认为接种途径应按微生物定居和复制的偏爱位点而定。因此，对于在呼吸道中繁殖的新城疫和传染性支气管炎病毒，选择的接种方法是经仔鸡眼、鼻道和呼吸系统的滴眼剂或喷淋途径。(Giambrone,World Poultry-Misset 13:19-23,1997)。由于许多更重要的家禽疾病发生在呼吸道中，对这些疾病接种的研究已采用了喷淋给药，因气雾剂或喷淋剂易为禽类吸入，并接触上呼吸道的粘膜表面。对非呼吸道疾病如组织、循环系统或肠疾病的疫苗，通常通过皮下注射或口服给予、或接种或饮水中给药。
已发表的采用喷淋给予疫苗的参考文献几乎都涉及免疫接种来抵抗通过呼吸道入侵的病毒，例如，预防新城疫、禽脑脊髓炎、鸡马力克病、喉气管炎、感染性支气管炎等。
对家禽已用了细菌疫苗，尤其是从高毒力细菌亲代株衍生的减毒活突变株(Roland,K.等人，表达大肠杆菌078脂多糖的鼠伤寒沙门氏菌株保护鸡抵抗大肠杆菌攻击的效力，Abstract of a presentation at Conf.Of Res.Workersin Animal Diseases,Chicago,IL,Nov.10,1997)。高毒力亲代株的减毒突变株的衍生不仅可能增加了该减毒突变株在肠道的定居也可能增加了其在肠相关淋巴组织(GALT)中的定居，并引起保护性免疫力。(参见如Curtiss Ⅲ等人，对人肠道致病菌在家禽中定居的控制，Blankenship等人编辑，AcademicPress,Inc.,New York,1991 169-198)。相反，在肠中定居而不入侵GALT且不在GALT定居的细菌可能不引发免疫反应。例如，小鼠研究表明鼠伤寒沙门氏菌表面上的脂多糖(LPS)0-抗原重复结构不仅对抵抗非特异性宿主防御机理(微生物毒素，第5卷，Roantree等人编辑，Academic Press,New York,1971)非常重要，而且对有效入侵粘蛋白和多糖覆盖的肠道非常重要。因此，当口服给予LPSO抗原缺乏的粗糙型突变菌时，它们不能入侵和定居于GALT(见如Curtiss等人，1991，同上)。
一些参考文献报导了通过口服或皮下注射给予家禽细菌疫苗。例如，一种预防鸽子患副伤寒的商品疫苗含有皮下注射的死鼠伤寒沙门氏菌(VetafarmParatyphoid Vaccine,Vetafarm Pty.Ltd.Wagga Wagga,Australia)。另外，上述Curtiss等人，1991(同上)报导了用病原性沙门氏菌的无毒衍生株作为鸡的口服疫苗。
也已报导了采用引起呼吸疾病的细菌疫苗作喷淋疫苗菌株。Hertman等人报导了对小鸡和火鸡口服和气雾给予的多杀巴斯德菌疫苗，以预防呼吸道疾病的家禽霍乱症(美国专利No.4,169,886)。Ley等人报导了滴眼和气雾给予含有活鸡枝原体(其导致呼吸道疾病)的疫苗(Ley等人，家禽疾病，41:187-194,1997)。一种商品疫苗推荐给予含大肠杆菌血清型078的无毒菌株的疫苗，以进行抵抗大肠杆菌野生型亲代株引起的呼吸疾病的免疫接种(见GARAVAX-T的产品说明，Schering-Plough animal Health Corp.,Omaha,NE)。对所有这些疫苗可选择采用气雾剂给药，因为接受接种的家禽所患的以下疾病包括呼吸道感染。
另一参考文献报导了将含有非致病性大肠杆菌K-12 O-抗原缺乏性菌株的疫苗作为气雾剂给予(美国专利No.4,404,186)。但K-12菌株只是一种实验室适应性的菌株而不是肠致病性的，由于该微生物不能入侵和定居于肠相关淋巴组织，故任何由此疫苗引发的免疫力很可能是通过呼吸道免疫而产生的。
在一些参考文献中曾建议细菌疫苗用局部喷淋法如鼻喷雾剂或眼喷雾剂(例如，见美国专利No.5,294,441)。但先前的研究没有一个建议用全身喷淋给予肠道致病菌疫苗。
因此，虽然已报导了喷淋给予疫苗可用于控制家禽的呼吸疾病，但至今没有建议用全身喷淋给予家禽疫苗来控制人病原体，这些病原体通常存在于家禽中并由它们传播，但它们不是家禽呼吸疾病的病原体。
另外，希望有一种方法来降低由肠致病性微生物(尤其是沙门氏菌spp.，)导致的家禽污染，此方法在普通的商品家禽生产条件下应易于实施和价廉；可给予新孵化的小鸡而无需单个处理；且可降低或预防肠致病性微生物对家禽内脏、淋巴组织和肠道的感染。
发明概述
本发明发现可通过用疫苗全身喷淋家禽，从而将疫苗给予家禽。通过这种全身喷淋途径给予的疫苗量能有效引发免疫应答，即抗体和/或细胞免疫力。虽然事实上任何疫苗都可用这种方法送递，但全身喷淋给药对包含肠道致病菌的无毒活衍生菌疫苗特别有效。这些肠道致病菌宜为沙门氏菌属。这种喷淋给予肠道致病菌的方法避免了其它给药途径的缺点，这种方法无需单个处理小鸡，可在孵化日给予，且其在商品家禽生产的普通条件下易于操作。
其引发免疫应答的有效剂量意想不到的低，约相当于通过口服途径给药(如在饮用水中给药)的有效剂量。通常用本发明活疫苗给药的剂量约为105到108菌落形成单位。
疫苗的这种喷淋给药适用于家禽(如鸡)的疫苗接种，可在它们易接受疫苗有益效果的任何年龄(给予)，但尤其适用于3周龄或更小年龄的家禽，更佳的是不到1日龄的家禽。
在一些实施例中，可在喷淋给药后再至少给予一次加强剂量疫苗。较佳地，该加强剂量可在喷淋给药后的14天，通过饮水口服给予或喷淋给予。
较佳地，喷淋的近似雾滴直径范围约为50微米到150微米。
在本发明的其它实施例中涉及降低家禽微生物污染的方法。该方法包括通过全身喷淋给予免疫原性组合物，来免疫接种家禽使其抗微生物污染。这种微生物污染对家禽本身可能是或不是致病性的，但其存在于家禽中，当人食用了这些家禽的肉或由其生产的其它食品后，这种微生物污染可能在人中产生疾病病症。这种微生物污染物可以是任何污染物，尤其是定居在家禽肠胃道的微生物。
给予的免疫原性组合物的量应有效地引发免疫应答，即抵抗污染微生物的抗体和/或细胞免疫力。较佳地，该免疫原性组合物含有肠道致病菌的无毒活衍生菌。较佳地，这些肠道致病菌是沙门氏菌属。
该免疫原性组合物以有效引发免疫应答的量给予。该剂量约相当于口服途径给药的剂量。通常用本发明活疫苗给药的剂量约为105到108菌落形成单位。
本发明免疫原性组合物的喷淋给药适用于家禽接种，可在它们易接受疫苗有益效果的任何年龄(给予)，但尤其适用于3周龄或更小年龄的家禽(如鸡)，更佳的是小于1日龄的家禽。
在一些实施例中，可在喷淋给药后再至少给予一次加强剂量疫苗，该加强剂量可通过饮水口服给予，较佳地在喷淋给药后的14天。
较佳地，喷淋的近似雾滴直径范围约为50微米到150微米。
用本发明所达到几个优点中要关注的是：提供了用肠道致病菌疫苗接种家禽的一种新方法；提供了一种降低肠道致病性微生物在肠道、淋巴组织和内脏组织中定居的方法；提供了一种降低家禽(用于人食用的)微生物污染的方法；提供了一种在普通商品家禽生产条件下易于操作且价廉的疫苗接种方法；和提供了一种接种幼禽而无需单个处理小鸡(尤其是孵化日的小鸡)的方法。
附图简述
图1显示了对孵化日的白来亨鸡粗喷淋或直接口服送递(a)105CFU、(b)107CFU或(c)109CFU鼠伤寒沙门氏菌χ3985疫苗株后7天，从脾、法氏囊组织、粪便和盲肠回收的χ3985的量；
图2显示了在第1和14天对白来亨鸡粗喷淋或直接口服送递(a)105CFU、(b)107CFU或(c)109CFU鼠伤寒沙门氏菌χ3985疫苗株后20天，从脾、法氏囊组织、粪便和盲肠回收的χ3985的量；和
图3显示了在第1和14天对白来亨鸡粗喷淋或直接口服送递免疫接种和加强接种(a)105CFU、(b)107CFU或(c)109CFU鼠伤寒沙门氏菌χ3985后20天，用纯化的鼠伤寒沙门氏菌LPS检测，血清IgM、IgA和IgG的应答。
实施例详述
本发明的基础是发现了可用全身喷淋给药来对家禽送递肠道致病菌无毒衍生菌的疫苗或免疫原性组合物，并有效引发免疫应答。
本发明的全身喷淋给药能将疫苗或免疫原性组合物送递到家禽的肠胃道。本文所用的喷淋给药或喷淋疫苗接种是指送递含有疫苗或免疫原性组合物液体的雾滴。全身喷淋给药是指将这种疫苗或免疫原性组合物雾滴送递到家禽全身的大部分。这是与局部喷淋给药(如人的鼻内喷雾，其仅给药于特定的、小的、局部靶位点)截然不同。本发明给予肠道致病菌的全身喷淋方法均衡地(indiscriminately)将疫苗微生物送递到家禽身体的大部分表面，其就是可接触到喷淋装置的全身表面的部分(参见例为美国专利4,316,464和4,449,968，全部纳入本文作为参考)。本发明的疫苗或免疫原性组合物的全身喷淋给药特别适用于同时对大量家禽给药。
本发明的喷淋给药宜包括将含有疫苗或免疫原性组合物的粗喷淋剂送递该家禽。虽然不希望受特定理论的束缚，相信作为粗喷淋剂给予疫苗或免疫原性组合物使得喷淋的雾滴能接触体表，而使吸入下呼吸系统的疫苗量最少。这不同于非常精细的雾滴或细雾(如雾滴直径约小于40微米的通常称为气溶胶)。与气溶胶喷雾不同，据信本发明的粗喷淋不能深深吸入，从而有助于避免呼吸系统感染的发生，而这见于一些喷雾疫苗接种时(参见例如美国专利No.4,449,968；Clarket等人，Austr.Vet.J.56:424-428,1980)。本文所用的粗喷淋是指由直径足以基本防止雾滴被吸入家禽下呼吸系统，但仍然能使液态雾滴接触家禽体表的液滴组成的喷淋。这种粗喷淋的稠密度可称为“雾雨”，优选的是大小12微米以下的雾滴不到1％的喷淋。优选的粗喷淋是由平均直径约为40-400微米的雾滴构成的；较佳的为40-200微米；更佳的是约50-150微米；最佳的是约50-100微米。另外，粗喷淋中约80％雾滴的大小范围约为90-190微米。
用于疫苗给药的喷淋疫苗接种装置的类型不是关键性的，可采用几乎任何类型的能分送粗喷淋的喷淋疫苗接种装置(参见例为美国专利No.4,316,464、4,449,968、4,674和5,312,353)。
本发明的喷淋给药送递含有肠道致病菌无毒活衍生菌的疫苗。这种疫苗微生物是能在家禽的肠道和肠相关淋巴组织(GALT)定居的肠杆菌。这些微生物作为疫苗或免疫原性组合物中的免疫原性组分，包括肠杆菌家族的成员如埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、变形菌属、耶尔森氏菌属和欧文氏菌属。沙门氏菌属、埃希氏菌属和沙门氏菌-埃希氏菌属的杂交菌对本发明特别有用，较佳地包括大肠杆菌和沙门氏菌属，如鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种和猪霍乱沙门氏菌。
肠道致病菌的无毒衍生菌也可作为载体杆菌将选定的抗原送递到GALT。这些载体菌含有并表达病原微生物的重组基因，从而引发针对病原微生物通常产生的抗原基因产生的抗体和/或细胞免疫力。因此可以通过喷淋给予肠道致病菌的无毒衍生菌，将可以送递各种各样的微生物并引发家禽对微生物(无需是能在肠胃道(GI)定居的)的免疫应答。
该无毒微生物还可作为载体来合成家禽的各种蛋白。因为在喷淋给药和进入到家禽的肠胃道后，本发明的无毒微生物能穿过GALT，这些微生物可用于制造和送递基因产物，如生长因子或能刺激或抑制各种生理机能的免疫调节产物或物质。这些微生物含有和表达编码所需蛋白的重组基因。
术语“肠道致病菌”是指能定居在家禽的肠道和肠相关淋巴系统的微生物。本文所用的“病原”是指能导致疾病病症或损伤正常生理机能的微生物。本发明的疫苗含有肠道致病菌株的无毒衍生菌。“衍生菌”或“衍生的菌株”是指从亲代菌株经基因修饰产生的菌株。“病原性”微生物是指能导致基本或损伤正常生理机能的微生物。“无毒性”是指不能诱导全套疾病病症(这通常与其毒性病原性对应菌相关)的特殊微生物菌株。因此无毒性包括毒力或产生疾病病症能力的降低，无毒微生物不一定完全丧失损伤正常宿主生理机能的能力。另外，无毒微生物不一定不能起致病原的作用，而是所用的特定微生物对于待处理的特定个体而言是无毒的。较佳地，从无毒微生物衍生的肠道致病菌至少对孵化日的家禽是致病性的。
在本发明的一实施例中，肠道致病菌的无毒活衍生菌是鼠伤寒沙门氏菌如χ3985，其带有△cya-12/△crp-11突变。美国专利No.5,294,441中详细描述了这种菌株和其它的菌株的构建。
在对感兴趣组合物或疫苗的宿主的细胞和/或抗体介导的免疫应答中发生了对该组合物或疫苗的免疫应答。通常，这种应答包括受验者产生针对感兴趣组合物或疫苗中所含抗原的抗体、B细胞、辅助性C细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞。
“疫苗”是指一种用于刺激个体免疫系统的制剂，从而向机体提供保护力抵御免疫系统识别作为非自身抗原的抗原。“免疫接种”是指诱导持续高水平抗体和/或细胞免疫应答的过程，在此过程中T淋巴细胞和/或个体中的其它活性细胞(如吞噬细胞)杀死侵入的微生物，是针对先前生物体曾接触过的微生物或抗原。术语“免疫系统”是指解剖学特征和个体产生针对抗原性物质的抗体(其中所述的抗原性物质侵入个体的细胞或个体的细胞外液)的机制，还包括细胞免疫应答。在抗体的产生中，产生的抗体可属于任何免疫类型，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。特别感兴趣的是能刺激产生免疫球蛋白A(IgA)的疫苗，因为其是温血动物分泌系统产生的主要免疫球蛋白，虽然本发明的疫苗不限于刺激IgA产生的那些疫苗。例如，本文所述的天然疫苗除形成IgA外可能产生范围广泛的其它免疫应答，例如细胞和体液免疫力。已很好的研究了对抗原的免疫应答并有许多报导。在Elgert,Klaus D.,Immunology,wiley Liss,Inc.,(1996)；Stites等人，Basic&Clinical Immunology；第7版.,Appleton&Lange,(1991)中提供了免疫学的概述，本文全部纳入作为参考。
用本发明疫苗处理的个体是指禽类，包括家禽，尤其是指那些有农业价值的。本文所用的“家禽”包括各种驯化的家禽品种或这些品种的个体，如鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽子、珍珠鸡(guineas)、鸵鸟、鸸鹋等，尤其是指那些用于产肉或蛋的驯化家禽或个体。
疫苗的制备可通过将疫苗菌株在合适的生长培养基中生长，然后(直接)使用或将生长培养物或其中的细胞与适当的稀释剂混合制成疫苗组合物。适当的稀释剂宜为液体，更佳的是对疫苗培养物的稳定性和活力没有副作用的液体，其粘度与水相似以便于形成粗喷淋的雾滴。较佳地，稀释剂不含氯、抗生素、抗微生物剂或其它可能对活疫苗生物体有害的试剂。疫苗在稀释剂中应是可分散的，从而没有疫苗残留的固体团粒或大块，且稀释剂的温度也应对活疫苗微生物无害。适当的稀释剂例子包括水、蒸馏水、去离子水、脱脂乳、含Marek疫苗稳定剂的水、带明胶的缓冲盐水、及本领域技术人员熟知的类似组合物。较佳地，在稀释剂的温度约为室温或更低时(更佳的是约34℃到约15℃)，将疫苗引入稀释剂中。
在一实施例中，从鼠伤寒沙门氏菌UK-1△cya△crpχ3985制备疫苗。如本文所用，这种疫苗可称为χ3985或Chi3985或χ3985，产品编码19C1.01。可如上新鲜制备疫苗菌株，或从保存的培养物中，例如从冷冻干燥的培养物或冰冻的培养物(例如，-70℃的种子原液)等回收。然后37℃将这种培养物的接种物在Luria肉汤中生长至对数生长晚期。例如，在250ml的无菌烧瓶中，将-70℃的种子原种接种到50ml Luria肉汤中并用箔密封。37℃静置培养该烧瓶过夜。约12-24小时后，37℃将此50ml静置过夜的培养物移液至450ml预热过的Luria肉汤中(在1L无挡板的烧瓶中)，置于New Brunswick培养摇床上(150rpm)。当培养物达到OD600≥1.0后，室温离心(在Centra MP4离心机上，IEC离心筒、3224转子，4400rpm,15分钟)沉淀细胞。将细胞重悬浮于40ml为室温的带明胶的缓冲盐水(BSG)中。可将该细胞悬液用BSG进行10倍的连续稀释测定疫苗组合物的滴定度，并将100μl的10-6和10-7稀释液涂布在MacConkey琼脂+1％麦芽糖板上。计数在这些平板上长出的菌落数确定该疫苗菌株的滴度。以每单位体积疫苗组合物的疫苗微生物菌落形成单位表示滴度。
如上述制备用于家禽的疫苗，用适当的稀释剂将培养物稀释到所需的剂量密度或滴度。调节稀释剂的缓冲性能(如果使用的话)以达到维持该疫苗株稳定性和活性所需的pH和离子强度。然后将疫苗进料到喷淋器中，准备对家禽给药。
也可以每只禽类特定的剂量方式进行喷淋给药。可用于送递精确疫苗剂量的一种方法是在密闭的空间内一段时间以已知的体积送递速率喷淋禽类。通过了解要接种疫苗的禽类数量、每只禽类所需的剂量、疫苗的滴度和喷淋装置的送递速率，本领域技术人员易计算出对每只禽类送递所需剂量需要的喷淋时间。另外，一些可购得的喷淋装置能预先选择好送递给已知数量禽类的液体的体积。
本发明的疫苗或免疫原性组合物可以有效剂量或有效量给予。本文所用的“有效量”是疫苗或免疫原性组合物的足以引发接种家禽产生针对靶微生物或抗原(家禽免疫接种所针对的)免疫应答的量。这些免疫应答包括产生抗体和/或细胞免疫力。本发明的一重要方面是疫苗或免疫原性组合物给药的剂量与口服给药(如在饮用水中给药)的有效剂量大致相当。
较佳地，在禽类小于1日龄时(即在孵化日)进行喷淋给药。通常也需要在初次喷淋给药的一段时间后给予一次或多次加强剂量的疫苗。可在禽类易接受疫苗有益作用的任何时候进行这种加强给药。优选地，可在5至21日龄之间给予这种加强给药，较佳地可在6和15日龄之间，更佳的是在7和14日龄之间，最佳的是在7日或14日龄或在7日龄和14日龄两天。
通常在饮水中口服给予加强剂量，虽然也可通过其它途径(包括喷淋给药)给予加强剂量。可用本领域已知的若干方法之一进行饮水中的疫苗给药。仅作为举例，饮水中给药可用以下方法进行。在疫苗给药前24小时，从要给予禽类的饮用水中除去所有的消毒剂、卫生洗涤剂和抗微生物药。在疫苗接种24小时后再次给予这种无消毒剂、卫生洗涤剂和抗微生物药的水。可将疫苗与不含卫生洗涤剂或抗微生物药的清水混合。将50升含疫苗的水用于500只禽类(如鸡)，应提供充足的空间使所有禽类都能轻易喝到水。含疫苗的水应在2小时或2小时以内用掉。为了确保所有禽类都喝到，应在给予饮用水中疫苗前1-2小时停止给水。
由于喷淋给予疫苗或免疫原性组合物的剂量与在饮水中给予的口服剂量差不多相同，较佳地是这两个剂量相同。因此，例如喷淋给药每只禽类如果107菌落形成单位，则饮水给予每只禽类也约为107菌落形成单位。较佳地，初次喷淋给药的剂量与后续在饮水中给予的加强剂量的区别应小于100倍，较佳地应小于10倍，更佳的是小于3倍，最佳的是小于10％。
较佳地，待免疫接种禽类的年龄是易于接受疫苗有益免疫原性作用的年龄。这随禽类品种的不同而有所改变，已发现获得这种有益作用的年龄从孵化日到104周龄的禽类都行。优选的是孵化日到52周龄的禽类，较佳的是孵化日到3周龄的禽类，更佳的是孵化日到2周龄的禽类，还要佳的是孵化日到1周龄的禽类，最佳的是孵化日的禽类。本文所用的“孵化日”与术语“小于一日龄可互换。
本发明方法的一个优点是可在商品禽类饲养的普通条件下进行。通常，大规模商品鸡或火鸡饲养的特征为拥有或多或少自动化喂食和供水系统的家禽大饲养场，每舍可关养1,000只以上禽类；通常每舍为5,000只以上的禽类；甚至每舍为20,000只以上禽类。
本方法可用于孵化场或家禽饲养场，在放养到孵鸡场或家禽饲养场之前，喷淋小鸡盘或其它小鸡槽或盒中的刚孵化的小鸡。另外，无论是小家禽或是老家禽都可在放养到饲养场前接受喷淋。(参见如Grieve,Poultry Times，第18页，1997,9,22；和Giambrone,1997，同上)。
由于本发明方法易于实施，所以家禽疫苗接种的费用很低。由于可同时疫苗接种许多小鸡并可如此处理第二次，从而避免了单个小鸡处理的高费用。另外，对每只小鸡可给予精确的疫苗剂量，使得疫苗剂量过量和无效施用减至最小。
以下实施例描述了本发明的优选实例。本领域技术人员在参考了本文所公开的本发明的说明书或实例后，将会明白本发明权利要求范围以内的其它实施例。本说明书以及实施例仅作示范说明，权利要求书才表明本发明的范围和精神。
实施例1
本实施例说明了用鼠伤寒沙门氏菌活疫苗喷淋免疫接种小鸡，与直接口服给予这种疫苗，在由疫苗微生物诱导的血清免疫力和产生的在肠道和内脏组织中的定居以及诱导血清免疫力方面同样有效。
为了确定无毒△cya△crp突变型鼠伤寒沙门氏菌活疫苗定居和诱导免疫力的效果，本例研究了以粗喷淋为手段对一日龄小鸡送递初次疫苗和加强疫苗接种。重复组的禽类口服接受疫苗。另外，两个较小组的禽类通过喷淋和口服法接种野生型鼠伤寒沙门氏菌UK-1 MGN-054s，并测定LD50。在第7和20日龄，测定通过粗喷淋接受疫苗接种和通过直接口服方法送递疫苗菌株组禽类的脾、囊、肠道和盲肠中疫苗菌株的定居。用ELISA测定从20日龄接种禽回收的血清确定血清抗体应答。
实验目的：
本研究的目的是：1)测定用粗喷淋方法免疫接种的小鸡与直接口服免疫接种小鸡相比，疫苗菌株的定居是否同样有效，和2)评价由粗喷淋或口服给予递增剂量的疫苗所引发的血清免疫力。由于在一日龄小鸡(但在3日龄或更老的小鸡中不能)能测得致死终点，包括用野生型鼠伤寒沙门氏菌亲代株来测定这两种送递方法是否有效以及比较导致的疾病。
材料和方法：
鼠伤寒沙门氏菌UK-1△cya-12△crp-11χ3985是一减毒疫苗菌株(见CurtissⅢ等人，对人肠道致病菌在家禽中定居的控制，Blankenship等人编辑，Academic Press,New York,1991，第169-198页)。该菌株生长成新鲜的、对数生长期的Luria肉汤培养物，用含明胶的缓冲盐水稀释到所需的剂量密度。制备送递递增剂量105、107和108 CFU(菌落形成单位)的疫苗用于4组1日龄的白来亨鸡。用喷淋疫苗接种装置(Preval Power Unit,Precision ValveCorporation,Yonkers,NY,10703)作粗喷淋(雾滴的直径约为140微米)或用顶端带3mm球的18号×7.5mm进料针直接口服疫苗接种小鸡。在球虫抑制剂或抗生素的Purina Start and Grow上喂养禽类。
同时，用含明胶的缓冲盐水从新鲜的对数生长后期的Luria肉汤培养物制备递增剂量的野生型鼠伤寒沙门氏菌亲代株MGN-054，并以粗喷淋或直接口服送递给予3日龄的白来亨鸡。
所有在孵化日接受疫苗菌株的禽类组在第14天以相同的方法给予加强接种，每组的剂量如同初次接种的剂量。至7和20日龄，用CO2窒息处死禽类，无菌解剖尸体回收脾、囊、粪便和盲肠内含物的样品，用于疫苗菌株的计数。
从20日龄的尸体收集的血样中分离出血清，并以1∶200稀释用于ELISA。简单地说，用鼠伤寒沙门氏菌的纯化LPS作为测试抗原。分别用1/5000稀释的山羊抗鸡IgA、IgM和IgG亲和纯化的多克隆抗体EC2-001、EC2-005和EC2-0011(从Immunovision,Springdale,AR得到)，来检测结合于ELISA板上的纯LPS抗原的鸡IgM、IgA或IgG(Dynatech Laboratories Inc.,Alexandra,VA)。以P-硝基苯磷酸脂(Sigma,St.Louis,MO)(1mg/ml)的二乙醇胺缓冲液(pH9.8)作为底物，采用1/3000稀释的兔抗山羊IgG(整个分子)碱性磷酸酶偶联物(Sigma,St.Louis,MO)。培养30分钟后，用50μl 3M氢氧化钠终止反应。用自动微孔板读数仪(Bio-Tek,Winooski,VT)在405nm读取吸光值。以每处理组的4只小鸡的平均吸光值(405nm)表示ELISA结果。截断点是非感染小鸡血清平均吸光值的2倍，作为用ELISA检测小鸡免疫球蛋白同种型的基线。
结果与结论
在第1和14天接受109CFU剂量疫苗的家禽组中未观察到死亡。经粗喷淋或口服方法对接受递增剂量的野生型方毒力亲代株(约103CFU)的一日龄小鸡组测得的LD50，与先前通过口服接种的一日龄小鸡测得的值相同。
图1(a、b和c)显示了在孵化日接受疫苗菌株的禽类7天后，从脾、囊组织、粪便和盲肠回收的疫苗菌株的量。图2(a、b和c)显示了在第1和14天接受疫苗菌株的禽类7天后，从脾、囊组织、粪便和盲肠回收的疫苗菌株的量。该疫苗菌株有效地定居于内脏和淋巴组织以及肠道的100％禽类标本中。比较这两种疫苗送递方法的其它研究中得到与添加有推荐水平杆菌肽(BMD-50)和球虫抑制剂(Coban-100)的Purina Start and Gro上喂养的小鸡相似的结果。对于所比较的所有剂量水平，数据均显示用粗喷淋或直接口服对来亨鸡或童子鸡接种鼠伤寒沙门氏菌χ3985没有明显差异。
图3显示了用ELISA检测用疫苗χ3985接种的小鸡中，抗鼠沙门氏菌LPS的特异性IgM、IgA和IgG水平。用测试的两种送递方法，剂量范围105-109CFU的疫苗都诱导了显著的体液抗体。最高剂量(109CFU)与低剂量相比诱导了最大抗体应答。20天龄时，在所有剂量组的所有测试动物中，IgM是占优势的免疫球蛋白。已报导过口服途径免疫接种3周后，IgM是占优势的同种型。(Hassan和Curtiss,Res.Microbil.,141:839-850,1990)。本研究中发现，较高的OD405测定值反映了与直接口服方法送递107或109CFU家禽相比，喷淋给予禽类107或109CFU增加了抗体应答。
实施例2
本实施例显示了喷淋疫苗接种无毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗对预防野生型鼠伤寒沙门氏菌在肠胃道和肠器官中定居的效力。
将55只用于本实验的1日龄SPF白来亨鸡编上翅号。在一日龄，用PrevalPower Unit喷淋装置(Precision Valve Corp.,Yonkers,NY10703购得)，以1×107CFU/剂量粗喷淋接种30只鸡，每只鸡约0.3ml。该疫苗为χ3985,产品编号19C1.01(Maine Biological Laboratories,Inc.,Waterville,ME)。二十只鸡粗喷淋蒸馏水，每只约0.3ml，作为对照。另外5只鸡作为同期对照。将接过种的和对照鸡分别关养在Horsfal隔离单元中。在二周龄，通过饮用水以1×107CFU/剂量的同一疫苗加强接种动物。在6周龄，分别以口服剂量1×106CFU的0.1ml野生型鼠伤寒沙门氏菌攻击两个处理组的所有鸡。
在攻击前和处死时收集两个处理组每只鸡的泄殖腔棉拭子，用于检测沙门氏菌(Salmonella sp.)。将棉拭子置于5ml TBGH肉汤中，42℃培养24-36小时。约36小时后，将肉汤划线培养在亮绿琼脂+35μg/ml新生霉素(BGAN)上，42℃培养。
在7周龄时，处死所有鸡，收集组织，如下培养野生型鼠伤寒沙门氏菌：无菌收集每只鸡的脾、肝、肾和其它任何显出可见病变的器官各5gm。将从同一只鸡得到的脾、肝、肾组织合并。收集任何显出可见病变的器官，并分别加工。另外，无菌收集每只鸡10mm十二指肠、回肠和大肠组织(带内含物)样品，并分别加工。另外，收集每只鸡1克带内含物的盲肠，并基进行类似的加工。
为了培养沙门氏菌，将组织置于浸在Stomacher搅拌器中的无菌Whirlpak袋中，将5ml连四硫酸盐亮绿Hajna(TBGH)肉汤加到每个袋中。42℃培养这些组织袋24-36小时，随后将各培养物一接种环划线到BGAN上。42℃培养平板36小时后，鉴定BGAN琼脂上的特征性CFU。培养上述袋约48小时后，将1ml袋培养物的TBGH转移到含4ml新鲜TBGH肉汤的试管中，将该试管培养5天，然后划线(培养)到BGAN琼脂上。42℃培养36小时后，检验平板。用B组沙门氏菌抗血清对所有平板进行凝集测试，每个平板至少测试一个菌落，以证明野生型攻击菌株鼠伤寒沙门氏菌F98的存在。
表1．用无毒鼠伤寒沙门氏菌免疫接种和用野生型鼠伤寒沙门氏菌攻击小鸡的实验设计。
实验组 处理* 攻击时的年龄     攻击菌种 鸡的数量
    1 疫苗     6周 野生型鼠伤寒沙门氏菌     30
    2 蒸馏水     6周 野生型鼠伤寒沙门氏菌     20
    3 无     N/A 无     5
*疫苗或蒸馏水的给予在第1天通过粗喷淋，第14天在饮用水中给予。
结果：
免疫接种后，未观察到对疫苗的临床反应。免疫接种后的第8天，从30只鸡的1只中分离出疫苗菌株，但自攻击日后不能从任何鸡中回收到疫苗菌株。在实验过程中没有发生死亡。
下表2显示了攻击之前和之后泄殖腔棉拭子的培养结果。在免疫接种后的第8天，从30只鸡的1只中分离出疫苗微生物，当初次免疫接种后的第42天再次取样时，所有免疫接种过的鸡都培养阴性。攻击后7天，从13％接受过免疫接种的鸡的泄殖腔棉拭子培养出野生型鼠伤寒沙门氏菌，与此相比仅接受蒸馏水未免疫接种的鸡40％培养出野生型鼠伤寒沙门氏菌。
表2．疫苗处理过的和未处理过的鸡用野生型鼠伤寒沙门氏菌攻击之前和之
                     后泄殖腔棉拭子标本阳性培养数
    攻击之前1 攻击之后2
实验组 处理 第8天 第42天     第49天
    1 鼠伤寒沙门氏菌 1/30(3％) 0/30(0％)     4/30(13％)3
    2 未处理的、攻击对照 0/20(0％) 0/20(0％)     8/20(40％)
    3 未处理的、非攻击对照 0/5(0％) 0/5(0％)     0/5(0％)
小鸡数1表示鼠伤寒沙门氏菌疫苗菌株培养阳性小鸡数/小鸡总数。
小鸡数2表示野生型鼠伤寒沙门氏菌攻击培养阳性小鸡数/小鸡总数。
3用卡方检验显示出未处理与攻击对照相比有显著性差异(P≤0.05)。
免疫接种过的和未免疫接种过的鸡在肠胃道和脾、肝和肾中的定居程度也有差异(见表3)。从85％未免疫接种对照鸡的合并器官组织培养出野生型鼠伤寒沙门氏菌与13％免疫接种鸡的作比较(P≤0.05)。接种疫苗和未接种疫苗的鸡发现回肠和大肠样品的阳性培养数明显降低(P≤0.05)。同样也在免疫接种过的和未免疫接种的鸡中发现阳性培养的回肠样品数明显降低(P≤0.05)。免疫接种过的和未免疫接种的鸡十二指肠样品阳性培养数未测见差异。
表3．用无毒活鼠伤寒沙门氏菌疫苗接种并用野生型鼠伤寒沙门氏菌攻击的
童子鸡的鼠伤寒沙门氏菌的培养。
实验组 疫苗接种(天：CFU) 在第6周攻击(CFU)     培养结果(阳性数/测试数(％))
器官合并 十二指肠 回肠 大肠 盲肠
1 第1天：3.6×106第14天：6.8×106 1×106 6/30(20％)1 1/30(3％) 8/30(27％)1 5/30(17％)1 7/30(23％)1
    2     无 1×106 17/20(85％) 2/20(10％) 12/20(60％) 13/20(65％) 10/20(50％)
    3     无   无     0/5     0/5     0/5     0/5     0/5
1卡方检验表明与未接受疫苗接种而用野生型微生物攻击的组相比有显著差异(P≤0.05)。
修饰过的鼠伤寒沙门氏菌活疫苗对免疫接种过的鸡提供了抵抗侵袭性野生型鼠伤寒沙门氏菌的人为攻击的保护力。本攻击实验显示在1和14日龄用鼠伤寒沙门氏菌活疫苗接种的鸡比对照鸡有统计学意义的优势。在两处理组中内脏中有野生型鼠伤寒沙门氏菌定居的童子鸡数目明显下降(P≤0.05)。对肠胃的保护作用是明显的，与未接受免疫接种的鸡相比，较少数目的接受免疫接种的鸡的回肠、大肠和盲肠组织的测试样品为培养阳性(P≤O.05)。十二指肠似乎不是鼠伤寒沙门氏菌的靶组织，因为仅有10％未接受疫苗接种的对照鸡的十二指肠中有野生型菌定居。另外，经未处理的鸡相比，用疫苗处理的鸡中观察到显示泄殖腔棉拭子野生型攻击微生物培养阳性的鸡数目明显降低。
本研究的数据证明在第一天通过粗喷淋给予和在第14天通过饮水给予鼠伤寒沙门氏菌疫苗，明显降低了野生型鼠伤寒沙门氏菌在童子鸡肠胃道的定居和对内脏器官的侵入和定居。
实施例3
本实施例说明了喷淋给予无毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗，来预防用野生型肠炎沙门氏菌或海德尔堡沙门氏菌口服攻击后细菌在内脏器官中的定居。
表4显示了对用海德尔堡沙门氏菌或肠炎沙门氏菌攻击喷淋免疫接种的小鸡的实验设计。
表4．用鼠伤寒沙门氏菌疫苗免疫接种并用海德尔堡沙门氏菌或肠炎沙
               门氏菌攻击小鸡的实验研究。
实验组 疫苗 疫苗接种时的年龄 攻击物 攻击时的年龄 鸡的数目
1 χ3985产品编码19C1.01 第1和14天 海德尔堡沙门氏菌 6周 33
2 无 无 海德尔堡沙门氏菌 6周 20
    3     无     无 无     无     10
4 χ3985产品编码19C1.01 第1和14天 肠炎沙门氏菌 6周 33
5 无 无 肠炎沙门氏菌 6周 20
    6     无     无 无     无     10
海德尔堡沙门氏菌的研究
将63只用于本实验的1日龄SPF白来亨鸡(SPAFAS Inc.,Storrs,CT)编上翅号。在1日龄，用Preval Power Unit喷淋装置(Precision Valve Corp.,Yonkers,NY10703购得)，以1×107CFU/剂量疫苗χ3985(产品编码19C1.01)粗喷淋接种33只鸡(组1)，每只鸡约0.35ml。二十只鸡(组2)粗喷淋蒸馏水，每只鸡约0.3ml，作为对照。另外10只鸡(组3)作为未接受疫苗接种、未攻击的对照。将接过种的以及对照鸡分别关养在Horsfal隔离单元中。
在二周龄，通过饮水以9.6×106CFU/剂量的同一疫苗加强接种动物；每只鸡消耗5.1ml水。在攻击前先从六周龄的鸡(组1和组2)中收集血清样品，用ELISA评估沙门氏菌抗体。此时也从每只鸡采集泄殖腔棉拭子作沙门氏菌培养。在6周龄时，组1和组2中的所有鸡都以口服1.6×108CFU(1.0ml)野生型萘啶酮酸-抗性海德尔堡沙门氏菌进行单个攻击。四天后，取棉拭子、处死所有鸡，回收组织，并如下培养野生型海德尔堡沙门氏菌。从每只鸡上无菌采集脾、肝、肾和其它任何显示可见病变的器官各约10gm。将从同一只鸡得到的脾、肝、肾组织合并。采集任何显示可见病变的器官，并分别加工。另外，从每只鸡无菌收集10mm十二指肠、回肠和大肠组织样品，并进行类似的加工。另外，从每只鸡收集10mm带内含物的盲肠，并进行类似的加工。
为了培养沙门氏菌，将组织置于无菌的Whirl pak袋中，将25ml连四硫酸盐亮绿Hajna(TBGH)肉汤加到每个袋中，并将样品在Stomacher搅拌器中浸泡。42℃培养这些组织袋40小时，随后将一接种环10μl各培养物划线到亮绿琼脂+35μg/ml新生霉素(BGAN)和木糖-赖氨酸-表面活性剂4琼脂+100μl/ml萘啶酮酸(XLT4-Nal)上。42℃培养24小时后，检验平板XLT4-Nal和BGAN琼脂上的特征性菌落。浓缩的肉汤培养物再培养24小时。将对应于阴性平板的培养物再划线到XLT4-Nal和GBAN上，42℃培养24小时，观察特征性菌落。用O群特异性(B群)沙门氏菌抗血清对所有平板作凝集测试，每个平板至少测试一个菌落，以证明野生型攻击菌株海德尔堡沙门氏菌的存在。
在攻击前和处死动物时，从所有处理组的每只鸡采集泄殖腔棉拭子以监测沙门氏菌。将棉拭子置于5ml TBGH肉汤中，42℃培养24-40小时。40小时后，将肉汤划样到BGAN上，42℃培养。用O群特异性(B群)沙门氏菌抗血清对所有平板作凝集测试，每个平板至少测试一个菌落，以证明野生型攻击菌株海德尔堡沙门氏菌的存在。
结果：
免疫接种后，未观察到对疫苗的临床反应。在实验过程中没有发生因接种的死亡。在实验的第49天，免疫接种组中的一只鸡由于受外伤死亡。当在免疫接种后的第42天采样时，组1的任何一只鸡都未发现阳性泄殖腔培养物。
下表5显示了攻击之前和之后泄殖腔棉拭子的培养结果。在攻击前组1中的任何一只鸡中都未采集到疫苗微生物。接受野生型微生物攻击后4天，50％接受过免疫接种的鸡显示出野生型微生物的阳性泄殖腔培养物，而70％未接受疫苗菌株的对照鸡为阳性培养物。这些数据显示两组之间野生型微生物阳性泄殖腔培养物无统计学差异。
表5．用野生型海德尔堡沙门氏菌攻击之前和之后，从处理过的和未处理过
                  的鸡中采集的泄殖腔棉拭子的培养阳性数。
    处理组 攻击之前1(第42天) 攻击之后2(第46天)
组1：鼠伤寒沙门氏菌疫苗     0/33(0％)     16/32(50％)3
组2：未处理、受攻击的对照     0/20(0％)     14/20(70％)3
组3：未处理、未受攻击的对照     0/10(0％)     0/10(0％)
1表示鼠伤寒沙门氏菌疫苗菌株培养阳性的小鸡数/小鸡总数。
2表示攻击的野生型海德尔堡沙门氏菌培养阳性的小鸡数/小鸡总数。
3用卡方检验表明与未接种疫苗未受攻击组相比有显著性差异(P≤0.05)。
在6周龄时，用口服活野生型海德尔堡沙门氏菌攻击免疫接种过的和未免疫接种过的鸡，以评估其抵抗病菌侵入内脏器官和肠道定居的保护作用(见表6)。用野生型海德尔堡沙门氏菌攻击后，免疫接种过的和未免疫接种过两组之间存在明显差异；25％用野生型攻击的免疫接种鸡的合并器官组织为培养阳性，而未接受免疫接种的对照鸡为70％(P≤0.05)。与未接受免疫接种的鸡相比，免疫接种鸡中发现消化道混合样品培养阳性的数目明显降低(P≤0.05)。在免疫接种过的和未免疫接种的鸡之间发现盲肠样品培养阳性数目无差异。未处理的、未受攻击的对照鸡无沙门氏菌。
表6．用无毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗接种并用野生型海德尔堡沙门氏菌攻击
                                童子鸡受保护情况。
实验组     处理 合并器官 合并的消化道     盲肠
    1 接种疫苗+攻击 8/32(25％)1     10/32(31％)1 21/32(66％)
    2 未接种疫苗菌但受攻击的对照 14/20(70％)     17/20(85％) 17/20(85％)
    3 未免疫接种未受攻击的对照 0/10(0％)     0/10(0％) 0/10(0％)
1卡方检验表明与未接受疫苗接种而受攻击组相比有显著性差异(P≤0.05)。
肠炎沙门氏菌的研究：
表4显示了肠炎沙门氏菌效力研究的实验设计。将63只用于本实验的1日龄SPF白来亨鸡(SPAFAS Inc.,Storrs,CT)编上翅号。在1日龄，用PrevalPower Unit喷淋装置(Precision Valve Corp.,Yonkers,NY10703购得)，以1×107CFU/剂量疫苗χ3985(产品编码19C1.01)粗喷淋接种33只鸡(组4)，每只鸡约0.35ml。二十只鸡(组5)粗喷淋蒸馏水，每只鸡约0.3ml，作为对照。另外10只鸡(组6)作为未接受疫苗接种、未受攻击的对照。将接过种的以及对照鸡分别关养在Horsfal隔离单元中。
在二周龄，通过饮水以9.6×106CFU/剂量的同一疫苗加强接种动物；每只鸡消耗5.1ml水。在攻击前先从六周龄的鸡(组4、组5和组6)中收集血清样品，用ELISA评估沙门氏菌抗体。此时也从每只鸡采集泄殖腔棉拭子作沙门氏菌培养。在6周龄时，组4和组5中的所有鸡都以口服4.5×107CFU(1.0ml)野生型萘啶酮酸-抗性肠炎沙门氏菌进行单个攻击。七天后，取棉拭子、处死所有鸡，并用以上海德尔堡沙门氏菌效力研究中所述的方法培养野生型肠炎沙门氏菌，但用0群特异性(D群)沙门氏菌抗血清取代B群抗血清，进行凝集试验。
结果：
免疫接种后，未观察到对疫苗的临床反应。在实验过程中没有发生死亡。免疫接种组中一只鸡死亡，可能由于心脏穿刺(收集用于血清抗体评估的血样)后受伤而亡。
下表7显示了攻击之前和之后泄殖腔棉拭子的培养结果。在攻击前4天，从组4中的任何一只鸡中都未回收到疫苗微生物。接受野生型微生物攻击后7天，41％接受过免疫接种的鸡显示出泄殖腔野生型微生物培养阳性，而63％未接受疫苗菌株的对照鸡培养阳性。这些数据显示出这两组之间泄殖腔野生型微生物培养阳性无统计学差异。
表7．用野生型肠炎沙门氏菌攻击之前和之后，处理过的和未处理过的鸡采
                   集的泄殖腔棉拭子培养阳性数目。
实验组     处理 攻击之前1(第42天) 攻击之后2(第49天)
    4 疫苗接种+攻击     0/33(0％)     13/32(41％)3
5 未疫苗接种、受攻击的对照 0/20(0％) 12/19(63％)3
6 未疫苗接种、未受攻击的对照 0/10(0％) 0/10(0％)
1表示鼠伤寒沙门氏菌疫苗菌株培养阳性的小鸡数/小鸡总数。
2表示攻击的野生型海德尔堡沙门氏菌培养阳性的小鸡数/小鸡总数。
3用卡方检验表明与未接种疫苗未受攻击组相比有显著性差异(P≤0.05)。
表8中显示了免疫接种过和未免疫接种过的鸡沙门氏菌在肠胃道、脾、肝和肾中定居程度的差异。用野生型海德尔堡沙门氏菌攻击后，免疫接种过的和未免疫接种过两组鸡之间发现有显著性差异；9％用野生型攻击的免疫接种鸡的合并内脏组织为培养阳性，而未接受免疫接种的对照鸡为58％(P≤0.05)。与未接受免疫接种的鸡相比，免疫接种鸡中发现消化道合并样品培养阳性的数目明显降低(P≤0.05)。在免疫接种过的和未免疫接种的鸡之间未发现盲肠培养阳性数目的差异。未处理的、未受攻击的对照鸡无沙门氏菌。
表8．用修饰的鼠伤寒沙门氏菌活疫苗接种并用野生型肠炎沙门氏菌口
                      服攻击后童子鸡受保护情况。
实验组     处理 器官合并 消化道合并     盲肠
    4 疫苗接种+攻击 3/32(9％)1 4/32(13％)1 16/32(50％)
    5 未免疫接种、受攻击的对照 11/19(58％) 7/19(37％) 11/19(58％)
    6 未免疫接种、未受攻击的对照 0/10(0％) 0/10(0％) 0/10(0％)
1卡方检验表明与未接受疫苗接种而受攻击组相比有显著差异(P≤0.05)。
用ELISA筛选血清样品中有无抗鼠伤寒沙门氏菌脂多糖(LPS)的IgG抗体。以1∶100稀释样品，并加入到包被有商品化的鼠伤寒沙门氏菌LPS的重复孔中。用1∶30,000偶联了HRP的兔抗鸡IgG检测。用鼠伤寒沙门氏菌免疫接种的小鸡中，52％对疫苗有强烈应答(OD490值大于0.3)；9％有肯定应答(OD490值在中等范围0.2-0.3内)，39％的OD490值在低范围0.05-0.1内。对照鸡的血清OD490平均值范围为0.005±0.009，明显低于所有免疫接种鸡测得的值。
结论：
在孵化日用无毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗(χ3985，产品编码19C1.01)喷淋接种，随后在第14天通过饮用水口服给予疫苗，对小鸡无任何不良作用。在6周龄或在用野生型肠炎沙门氏菌或海德尔堡沙门氏菌攻击前采样，喷淋免疫接种鸡的泄殖腔棉拭子中没有回收到疫苗菌株。与未免疫接种的鸡相比，所有测试的免疫接种鸡接触鼠伤寒沙门氏菌疫苗后都有血清应答升高。
本研究得到的数据表明鼠伤寒沙门氏菌疫苗提供了降低海德尔堡沙门氏菌或肠炎沙门氏菌在内脏器官中定居水平的显著保护作用。虽然，与未免疫接种的鸡相比，在免疫接种鸡的盲肠中未观察到野生型攻击菌株定居水平的明显差异，但免疫接种赋予了抵抗海德尔堡沙门氏菌或肠炎沙门氏菌在消化道定居的明显保护作用。
实施例4
本研究表明用无毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗喷淋免疫接种保护童子鸡抵抗野生型肠炎沙门氏菌攻击后的内脏器官定居。
将55只用于本实验的1日龄SPF白来亨鸡(HyVac,Adel,IA)编上翅号。在1日龄，用Preval Power Unit喷淋装置(Precision Valve Corp.,Yonkers,NY购得)，以1×107CFU/剂量疫苗χ3985(产品编码19C1.01)(由MaineBiological Laboratories,Inc.,Waterville,ME制造)粗喷淋接种30只鸡(组1)，每只鸡约0.3ml。二十只鸡(组2)接受粗喷淋蒸馏水，每只鸡约0.3ml，作为对照。另外5只鸡(组3)作为同步对照。将接过种的以及对照鸡分别关养在Horsfal隔离单元中。
表9．用鼠伤寒沙门氏菌疫苗接种，并用肠炎沙门氏菌攻击的实验设计。
实验组 疫苗 疫苗接种时的年龄 攻击 攻击时的年龄 鸡的数量
1 Chi3985产品编码19C1.01 第1和14天 肠炎沙门氏菌 第6周 30
    2 无 无 肠炎沙门氏菌 第6周     20
    3 无 无 无 N/A     5
在二周龄，通过饮水以1×107CFU/剂量的同一疫苗加强接种动物；每只鸡剂量含在15ml水中。在六周龄时，所有接受疫苗接种处理和对照组中的鸡都口服一剂4×107CFU(0.5ml)野生型肠炎沙门氏菌进行单个攻击。在攻击前5天，从每只鸡收集泄殖处棉签，评估泄殖腔棉拭子的野生型菌数。攻击后5天，处死所有鸡，解剖并进行组织样品野生型肠炎沙门氏菌的培养(如实施例2所述)。
结果：
免疫接种观察中，未观察到对疫苗的临床反应。在实验过程中没有发生死亡。
在6周龄时，对口服活野生型肠炎沙门氏菌而受攻击的免疫接种和未免疫接种组的鸡，评估其抵抗细菌对内脏器官组织侵入和肠胃道定居的保护作用(见表10)。受野生型肠炎沙门氏菌攻击的，免疫接种过的和未免疫接种过的两组之间发现有显著性差异；95％用野生型肠炎沙门氏菌攻击的未免疫接种对照鸡，在攻击后合并器官组织为培养阳性，而接受免疫接种的鸡为20％(P≤0.01)。免疫接种处理组和对照组中发现十二指肠样品培养阳性的数目明显降低(P≤0.01)。在免疫接种过的和未免疫接种的鸡中，未发现回肠、大肠或盲肠样品肠炎沙门氏菌培养阳性数目有差异。
表10．口服野生型肠炎沙门氏菌攻击后，经修饰过的鼠伤寒沙门氏菌活疫
                            苗接种的童子鸡受保护情况。
处理组 处理 器官合并 十二指肠 回肠 大肠 消化道(合并数据) 盲肠
    1 疫苗 6/30(20％)1 2/30(7％)1 20/30(67％) 26/30(87％) 27/30(90％) 29/30(97％)
    2 对照 21/22(95％) 12/22(55％) 15/22(68％) 22/22(100％) 22/22(100％) 22/22(100％)
3 分离的对照 0/5(0％) 0/5(0％) 0/5(0％) 0/5(0％) 0/5(0％) 0/5(0％)
1用卡方检验显示与未免疫接种、受攻击对照相比有明显差异(α=0.01)。
86％疫苗接种鸡表现为泄殖腔野生型攻击微生物培养阳性，而未疫苗接种对照组为100％。
结论：
用活χ3985产品编码19C1.01疫苗在孵化日进行喷淋疫苗接种，然后在第14天饮水口服给予疫苗，对小鸡无不良反应。
虽然在疫苗接种鸡的消化道和盲肠样品中抗野生型菌定居的保护作用不明显，但证明了免疫接种受攻击的鸡与未免疫接种受攻击的鸡相比，抵抗抗野生型肠炎沙门氏菌在内脏器官定居有显著的保护作用。
实施例5
本实施例说明用修饰过的活鼠伤寒沙门氏菌活疫苗喷淋接种小鸡，对在普通大规模商品化家禽生产场地条件下降低沙门氏菌的污染是安全和有效的。
实验目的：
本实验的目的是为了评估χ3985产品编码19C1.01疫苗，对在普通大规模商品化家禽生产条件下降低沙门氏菌污染的安全性和效率。通过测定鸡生长过程中小鸡的存活率和产品的分散能力来监测疫苗的安全性。通过测定加工后冷藏禽体淋洗液的细菌分析、加工中的平均体重和损失百分比来监测生产的效率。
材料和方法：
选择了三个地理位置不同的农场(具有配对的饲养场)，每个家禽饲养场最少有16,000个家禽。这就可以用115,000多只家禽作三次重复实验，其中有对照家禽和用修饰的鼠伤寒沙门氏菌活疫苗处理的家禽。需鉴定实验家禽农场是否曾有持续性沙门氏菌污染的历史背景。表11表明了三个实验的位置和试验参数。
表11．疫苗现场安全性实验的说明
农场实验位置 所用疫苗的序号 小鸡的数量 免疫接种的时间(孵化后的天数) 实验持续时间
疫苗接种的 对照 第一次 加强接种 (天)
    1     7002     21,000     21,000     1     14     48
    2     7003     20,500     20,500     1     17     42
    3     7004     16,000     16,000     1     15     64
产品许可前的序号(prelicensing serial)：
修饰的活χ3985(产品编码19C1.01)疫苗许可前序号按生产现场的概况制定，并在1995年3月20日批准。
实验步骤：
在所有农场，如下制定对具体家禽的普通商品疫苗、饲料和水的供给方案。处于孵化的(家禽)接受Marek疫苗(卵上或在孵化日)，新城疫/支气管炎疫苗在孵化日进行喷淋疫苗接种。在本研究的16-18日，在各饲养场进行支气管炎疫苗的加强给药。
鼠伤寒沙门氏菌疫苗给药的步骤：
1．在孵化日进行喷淋给药
在孵化场设置可移动的喷淋箱(由Merial Select,atlanta,GA提供并操作)，在将小鸡置于饲养室地面前就给进入箱中的小鸡疫苗接种。疫苗以玻璃小瓶冻干制剂提供。按包装说明将疫苗与清洁的、无氯气的水混合。手动将喷淋装置事先校准到，在1bar(15帕斯卡)压力下对10,000只小鸡送递约700ml-1L，用4个粗鸟嘴砧(anvil)扇形喷淋嘴送递50-100微米大小的微滴。从而对每只小鸡送递约0.07-0.1ml。
2．两周龄时饮水给药
到每个农场疫苗处理饲养房的鸡接近疫苗水之前不给两周龄的小鸡喝水2-4小时。调节Merial Select Bag Boost系统以校准疫苗的送递。按包装说明混合所需量的鼠伤寒沙门氏菌疫苗至稀释液最终体积，使足以在两个小时中通过所有饲养房的饮水线给予每只小鸡一个剂量。在这两小时中，这种疫苗水是小鸡唯一的饮水来源，从而确保所有小鸡都有机会喝到足够的疫苗。在饮用水疫苗接种前测试所有农场饲养房所用的水，发现不含氯残气，pH范围为6.0-7.0。
实验中采样和富集培养的步骤：
为了监测环境和小鸡中土著野生型沙门氏菌的存在，在孵化场收集仔鸡纸盘上的胎粪基线样品，同时如下所述收集饲养房内垫草的拭子、饲料和水的样品作细菌分析。在每个实验点整个实验过程中定期收集垫草拭子、饲料和水的样品。
1．小鸡纸盘和拭子：
在疫苗接种前，从各细菌运送盒中随机收集代表每个种鸡群的小鸡纸盘(12-18只)和拭子样品。将选出的含胎粪的各小鸡纸盘置于一单独的塑料袋中，密封并作标记。用无菌脱脂乳润湿无菌纱布垫来取得小鸡纸盘的其它拭子，然后置于塑料WhirlPak袋中，密封并作标记。迅速将所有样品转移到冰块上，送到实验室分析沙门氏菌，以确定进入饲养房小鸡污染水平的基线。
2．饲料和水的样品：
在研究开始之前，从每个农场内部推进加料器的进料流收集40g样品。将这些样品置于WhirlPak袋中并作标记。另外，从每个饲养场过滤过的水源收集100ml水，并从各饲养房饮水器收集100ml水。立即分析收集到的水中氯气的残留和pH范围。每个农场在整个试验期间，每两周收集一次饲料和水的样品，作好标记，置于冰块上送到实验室作细菌分析。
3．饲养房垫草的拭子样品
在每次实验开始之前，收集每个农场的每个饲养房垫草拭子的样品，以确定沙门氏菌污染的基线水平。每个农场的每个饲养房，在整个实验过程中每两周收集一次拭子样品。按国家家禽改良方案及补充规定(National PoultryImprovement Plan and Auxiliary Provisions manual.United Statesdepartment of Agriculture,Animal and Plant Health Inspection Service(APHIS 92-55-017),April 1993)安装好取样拭子。将袋密封，作标记并置于冰块上，送至实验室作细菌分析。
4．培养步骤：
用蛋白胨缓冲水溶液(International Bioproducts Inc.,Redman,WA；Difco Inc.,Detroit,MI)预先富集饲料、水、小鸡棉拭子、小鸡纸盘和拭子(上的细菌)，并作为评估禽体上细菌负载的漂洗液。将连四硫酸盐亮绿Hajna肉汤(Northeast Laboratories Inc.,Waterville,ME)作为富集沙门氏菌或疫苗菌的选择性培养基。用添加有35μg新生霉素/ml(Sigma,St.Louis,MO)的连四硫酸盐亮绿琼脂鉴定沙门氏菌或疫苗菌的生长。按FSIS样品收集指南(FSIS Sample Collection Guidelines)和从生肉和家禽制品沙门氏菌的分离及其鉴定方法(Procedure for Isolation and Identification of Salmonellafrom Raw Meat and Poultry Products)进行沙门氏菌的验证。将所有阳性培养物送至国家兽医服务实验室(National Veterinary Services Laboratory)(Ames,IA)分析血清型。
5．整个禽体的细菌分析
加工后，从每个饲养场随机选择50个冷藏的禽体。按FSIS样品收集指南和从生肉和家禽制品分离鉴定沙门氏菌的方法(Food Safety InspectionService Sample Collection Guidelines和Procedure for Isolation andIdentification of Salmonella from Raw Meat and Poultry Products,FederalRegister Vol.61,No.144,7/25/96，第38923页)收集整个禽体的漂洗液，并评估沙门氏菌和/或疫苗残留菌存在与否。另外，用PCR(BACS系统，Qaulicom,Wilmington,DE)验证抗特异性沙门氏菌O组抗原抗血清(Difco Inc.,Detroit,MI)凝集阳性的样品，因该样品不能得到纯培养物。
统计方法：用卡方检验比较疫苗接种鸡与对照鸡之间的参数结果
结果和讨论
位置1的实验：
1．基线样品的分析：
在实验开始之前，分析由收集的小鸡纸盘、纸盘拭子、水、饲料和饲养房垫草拭子组成的基线样品，表明对照饲养房的饲料为姆班达卡沙门氏菌阳性，三个种鸡群中有两个的小鸡泄殖腔为海德尔堡沙门氏菌培养阳性。三个种鸡群中的一个泄殖腔为微生物(怀疑为O群抗原C3)培养阳性，但未回收到纯分离物。在该实验6个星期生长期的其余时间，从农场的任何一个饲养房的饲料、水或垫草拭子中没有回收到其它沙门氏菌或疫苗菌。
2．存活率
由养鸡人每周记录农场每个饲养房存活率数据。表12显示了在本实验鸡的生长期间死亡的鸡数目。对照和疫苗处理饲养房之间家禽的死亡未见差异，两个饲养房的总死亡百分比分别为2.8％。实验期间平均死亡率恰巧与位置#1所在地区的值一致，为4.4-4.7％(The Poultry Informed Professional,Department of Avian Medicine,University of Georgia,Athens,GA,January,1998)。
表12．位置#1实验的鸡生长期间的死亡率。
    对照     处理
第1周     205     210
第2周     117     87
第3周     57     55
第4周     62     63
第5周     74     81
第6周     81     87
死亡总数     596     5831
总百分比     2.8％     2.8％
1用卡方检验未发现明显差异(P＞0.05)。
1996-1997年位置#1的历史存活率范围为95.5-99.6。对照和处理组家禽的存活率(97.3％)在此范围中。根据这些数据，此疫苗对家禽的存活率无任何不良作用。
3．FSIS监察员的损失报告：
表13列出了USDA监察员对每个饲养场的损失报告。监察员报告表明处理饲养场与对照饲养场相比，禽体的肺泡炎和炎性过程(IP)增加。从The PoultryInformed Professional得到了该地区实验中一星期的平均值。
                 表13．位置#1实验过程中的损失百分比
    损失原因     对照     处理 该区域的平均值
造白细胞组织增生     0.02     0.02     0.03
败血病/毒血症     0.25     0.28     0.35
    肿瘤     0.28     0.15     N/A1
    肺泡炎     0.14     0.51     0.17
    滑膜炎     0     0     N/A
    炎性过程     0.64     2.06     0.14
    过度烫伤     0     0     N/A
    挫伤     ＜0.01     ＜0.01     0.02
    肺结核     0     0     N/A
    尸体     ＜0.01     ＜0.01     N/A
    受到污染     ＜0.01     ＜0.01     N/A
    运到时已死亡     0.3     0.24     N/A
    总损失     1.33     3.022
1N/A表示未得到数据。
2用卡方检验，与对照组相比有明显差异(P≤0.05)。
由共同研究者提供的历史数据表明该试验农场在过去的两年中曾经历过呼吸系统疾病的循环发作，因为在冬季月份中肺泡炎百分比曾升高。在疫苗接种实验前，该农场种鸡群的肺泡炎为1.71％，与之相比，实验中疫苗处理饲养场的鸡为0.51％。没有文件记录导致肺泡炎或炎症过程的沙门氏菌病例。另外，禽体检查方法不像USDA主管监察员所要求鉴定受处理禽类那么盲目。在该报告所述两个后续实验中，肺泡炎和IP百分比在对照和疫苗接种处理的禽类之间无差异。基于这些原因，不可能作出这些状况的原因(归因于采用了疫苗制品)的论断。
4．加工中禽体重量的评定
禽类在处理过程中的平均重量是家禽生长阶段状况的指示物。位置#1的8轮生长检查显示大于49日龄禽类的平均体重范围为4.36到4.79lbs；在48日龄，与对照家禽(4.85lbs)相比，疫苗处理家禽的体重平均范围为4.84lbs。根据这些平均体重的数据，疫苗接种家禽体重维持在生产者所期望的水平没有影响。
5．禽体漂洗液的评估
表14显示了禽体漂洗液评估的结果。与对照组相比，疫苗处理组禽体漂洗液中沙门氏菌阳性的样品数(由PCR和O抗原抗血清凝集试验鉴定)明显少(p≤0.05)。从50个处理组禽体漂洗液样品中既未鉴定活的何修饰的鼠伤寒沙门氏菌也可土著沙门氏菌(由实验室分析)。而50个对照组禽体的8％漂洗液样品为C组沙门氏菌阳性，表明此疫苗能有效消除肉制品中土著沙门氏菌。
表14．位置#1禽体漂洗液的评估
组别     阳性样品的数量
对照组     4/50(8％)
处理组     0/50(0％)1
1用卡方检验表明与对照组相比有显著差异(P≤0.05)。
位置No.2的实验
1．基线样品的分析：
分析收集的基线样品表明对照饲养场的饲料和小鸡盘的胎粪含有怀疑为O群抗源C3的细菌，但未回收到纯分离物。在此实验6个星期生长阶段的其余时间，从农场的任何一个饲养场的饲料、水或垫草拭子中未鉴定到其它沙门氏菌或疫苗菌。
2．存活率
定期收集农场每个饲养场的存活率数据。表15显示了本实验的生长期间死亡率数据。在实验的第一个星期中，对照组比处理组死亡的禽类要少。在实验第一个星期后，两组之间家禽的死亡数无差异。实验所在地区在实验过程中一星期的平均死亡百分比为5.0-6.2(The Poultry InformedProfessional,February,1998)。在这一期间每个饲养场的死亡率都低于该地区的平均值。表15．位置#2实验在鸡成长期间鸡的死亡率。
 对照组     处理组
    第7天     236     363
    第14天     88     73
    第30天     281     306
    第35天     64     60
    第42天     82     78
    总死亡数     751     8801
    总百分比     3.7     4.3
1用卡方检验表明与对照组相比有明显差异(P≤0.05)。
处理组和对照组禽类在第一个星期死亡率的0.6％差异是在预计的孵化偏差中的。从第一个星期以后至实验结束，死亡率数没有差异。在用此疫苗制品进行的三个实验的另两个中没有观察到第一个星期中死亡率的这种差异。可能影响孵化存活率的因素包括种鸡年龄的不同、种鸡的质量和孵化场的管理以及暴露于85°F以下温度的时间过长。该实验农场在该实验年份中40-42日龄家禽的存活百分比曾得到提高，存活率为94.7-97.5。对照组和疫苗处理组家禽的存活率在该范围中(96.3-95.7)。
3．FSIS监察员的损失报告：
表16列出了USDA监察员对每个饲养场的损失报告。从the PoultryInformed Professional(1998年2月)得到了位置2同一地区的平均百分比数据。在该研究中未观察到对照组和处理组损失家禽数的差异。
                        表16．位置#2实验中的死亡百分比
    损失原因 对照组 处理组 与位置#2同一地区的平均百分比
造白细胞组织增生     ＜0.01     ＜0.01     0.01
败血病/毒血症     0.21     0.13     0.41
    肿瘤     0.07     0.02     N/A1
    肺泡炎     0.25     0.18     0.39
    腹水     0.11     0.15     N/A
    炎性过程     0.43     0.58     0.45
    过度烫伤     0.05     0.01     N/A
    挫伤     0.03     0.04     0.08
    肺结核     0     0     N/A
    尸体     0.03     0.04     N/A
    受污染     0.05     0.05     N/A
    运到时已死亡     0.21     0.21     N/A
    总损失     1.44     1.412
1N/A表示数据未得到。
2用卡方检验，与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。
4．加工中禽体重量的评定
在位置#2的9轮生长中，家禽的平均体重范围为3.35到3.93lbs；在42日龄，疫苗处理组家禽的体重在该范围中，平均为3.7lbs。在疫苗处理过程中，处理饲养场家禽的体重比对照组禽类的平均体重低6.1％。但处理组家禽的体重不能与对照组相比，因为在实验的第4周期间发现处理饲养场中四条饮水线有两条被阻塞了。从童子鸡管理角度来看，这种体重的差异部分或全部是由于这个原因。
5．禽体漂洗液的评估
表17显示了从疫苗处理组的禽体漂洗液中没鉴定到沙门氏菌阳性样品。两组各100个漂洗液样品中都没有鉴定到疫苗菌或野生型沙门氏菌。
表17．位置#2禽体漂洗液的评估
    组别     阳性样品的数量
    对照组     0/50
    处理组     0/50
位置No.3的实验
1．基线样品的分析：
分析收集的基线样品表明从对照饲养场取得的垫草拭子含有怀疑为O群抗原C3的细菌，但未回收到纯分离物。从两种鸡群培养的小鸡为土著沙门氏菌培养阴性。在为时64天的该实验生长期的其余时间中，未从农场的任何一个饲养场的饲料、水或垫草拭子中鉴定到其它沙门氏菌或疫苗菌。
2．存活率
每周收集每个饲养场的存活率数据。表18显示了该实验的鸡生长期间收集的死亡率数据。
表18．位置#3实验鸡成长期间鸡的死亡率。
    对照组     处理组
    第1周     293     328
    第2周     151     176
    第3周     76     114
    第4周     60     70
    第5周     86     68
    第6周     103     97
    第7周     109     84
    第8周     97     118
    第9周     105     119
    总死亡数     1080     11741
    总百分比     6.8     7.3
1用卡方检验表明与对照组相比有显著性(P≤0.05)。
需要指出的是，对照组和疫苗处理组死亡率的差异仅在于5只家禽的偏差。我们推测标准差是由于每天死亡率图所得误差数目较大，因此，实际死亡数不确定。可以认为低至0.03％的误差界线对该统计学最终差异有很大影响。然而当最终存活值与实验当年该位置先前6个月生长周期相比，百分比为90-95。本实验的对照组和处理组家禽的存活率分别为93.2和92.7，在此范围中。
3．加工中FSIS监察员的损失报告：
USDA监察员无意中将位置#3两个处理组的损失数据混合在一起。表19列出了监察员对两个饲养场的损失报告。包括位置#3地区的平均值是根据6周龄童子鸡实验同期的值(The Poultry Informed Professional,1998年4月)。表19中本实验有五项的报废率，与实验同期在位置#3地区一周测得的值相同或比其低。在观察的任一项中未发现用疫苗处理家禽对损失百分比有任何不利影响。
                  表19．位置#3加工中的损失百分比
损失原因 处理组和对照组禽类的混合数据(％) 位置#2相同区域的平均百分比
造白细胞组织增生     ＜0.01     0.04
败血病/毒血症     0.26     0.26
    肿瘤     0.01     N/A1
    肺泡炎     0.16     0.3
    腹水     0.05     N/A
    炎性过程     0.1     0.3
    过度烫伤     0     N/A
    挫伤     0     0.01
    肺结核     0     N/A
    尸体     0.04     N/A
    受污染物     ＜0.01     N/A
    运到时已死亡     0.3     N/A
    总损失     0.92
1N/A表示数据未得到。
4．加工中禽体重量的评定
检查了位置#3的3个生长周期表明家禽的体重范围为6.67到7.2lbs。本研究中，禽类在加工过程中的平均体重为7.33lbs。需要指出的是，虽然生产者在过去年份中经历了从种禽获得的小鸡质量的降低(在实验的头两个星期的高死亡率)，在本研究加工中小鸡的优良状况和加工中的最终体重是出乎意料的。根据这些平均体重的数据，此疫苗不影响家禽体重维持在生产者期望的水平。
5．禽体漂洗液的评估
表20显示了两组家禽禽体漂洗液样品分析的结果。50个疫苗处理饲养场的禽体漂洗液样品中没有鉴定出修饰的活鼠伤寒沙门氏菌或土著沙门氏菌。但对照组50个禽体中有20％漂洗液样品的PCR和培养物为海德尔堡沙门氏菌和哈达尔沙门氏菌阳性。
表20．位置#3禽体漂洗液的评估
组别     阳性样品的数量
对照组     6/50(12％)1
处理组     0/50(0％)2
1培养物鉴定为海德尔堡沙门氏菌或哈达尔沙门氏菌。
2卡方检验表明与对照组相比有显著性差异(P≤0.05)。
结论：
发现鼠伤寒沙门氏菌活疫苗χ3985(产品编码19C1.01)喷淋接种用于商品童子鸡是安全的。在接触此疫苗制品后，生产者可期望家禽能维持健康水平和状况。立即进行的环境检测未发现疫苗残留。在三个实验的两个中发现，采用此疫苗能有效地完全消除接种组禽体中的土著沙门氏菌(与对照组相比)。在与三个商品家禽饲养场经营者合作进行的实验中，发现比疫苗是安全而有效的。
本说明书中引用的所有参考文献全部纳入本文作为参考。本文就参考文献所作的讨论只是总结了其作者作出的断言，任何参考文献都未构成已有技术。申请者保留对本文所引用的参考文献的准确性和恰当性表示异议的权利。
从上述可见，可实现本发明的若干利益，并得到其它有益结果。
可对上述方法和组合物作各种改变均不脱离本发明的范围，本文以上的描述以及附图仅起说明作用，无任何限制意义。

Claims (25)

1．一种家禽疫苗接种的方法，其特征在于，该方法包括通过全身喷淋，将有效剂量的含肠道致病菌无毒活衍生菌的疫苗给予禽类。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肠道致病菌是沙门氏菌。
3．如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的喷淋是以剂量约105到108菌落形成单位的肠道致病菌的无毒衍生菌给予的。
4．如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌。
5．如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的鼠伤寒沙门氏菌是χ3985。
6．如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的家禽为三周龄或更小。
7．如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的家禽小于1日龄。
8．如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的家禽是鸡。
9．如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的喷淋给药后还至少给予一次加强剂量的疫苗。
10．如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的加强剂量疫苗是在饮水中给予的。
11．如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的加强剂量是在喷淋给药后的14天后给予的。
12．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述喷淋是以雾滴直径范围为50微米到150微米的粗喷淋。
13．一种降低禽类微生物污染的方法，其特征在于，该方法包括通过全身喷淋给予含有肠道致病菌无毒活衍生菌的疫苗免疫接种家禽来抵御微生物污染。
14．如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的肠道致病菌是沙门氏菌。
15．如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的喷淋是以剂量约105到108菌落形成单位的肠道致病菌的无毒活衍生菌给予的。
16．如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌。
17．如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的鼠伤寒沙门氏菌是χ3985。
18．如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的家禽小于104周龄。
19．如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的家禽为3周龄或更小。
20．如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的家禽小于1日龄。
21．如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的禽类是鸡。
22．如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的喷淋给药后还至少在饮水中给予一次加强剂量的疫苗。
23．如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的加强剂量是在喷淋给药后的第14天给予的。
24．如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述喷淋给药包括喷淋直径范围为50微米到150微米的雾滴。
25．一种将蛋白质送递给家禽的方法，其特征在于，该方法包括通过全身喷淋给予所述家禽有效剂量的肠道致病菌的无毒活衍生菌，该衍生菌含有编码表达所述蛋白的重组基因。
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