CN1357104A - 用于高通量荧光探测的新型扫描光谱仪 - Google Patents

用于高通量荧光探测的新型扫描光谱仪 Download PDF

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Abstract

一种荧光光谱仪,具有一个激发光双单色仪(104),一个共轴激发/发射光传递模块(106),和一个发射光双单色仪(110)。每个单色仪包括一对全息凹形光栅(203,210),用于从入射的宽带光中精确选择所需的波段而无需其它的光学元件如反射镜。选取的激发光被包括一个共轴激发光反射镜(302)的光传递模块(106)导入样品腔(108)中。射出腔开口的荧光被较大的共轴发射反射镜(304)会集。会集的发射光是由发射光双单色仪(110)选取波长。选取的发射光通过光电探测器模块(112)探测。

Description

用于高通量荧光探测的新型扫描光谱仪
                    技术领域
本发明涉及利用双光栅单色仪而非滤光片的波长扫描荧光光谱仪，用于选择光的激发和辐射波长并探测和量化从同一样品中从多个荧光团的同时荧光辐射。
                    发明背景
定义：
1)荧光：某种自然界存在的矿物质、多芳香核碳氢化合物和其它的杂环的电子能量吸收和释放的多级过程的结果。
2)激发：由光源提供能量光子e＝hνexc并被一个荧光团的外层电子吸收，外层电子从基态S0跃升为单一的电子激发态S’1。
3)激发态寿命：一个受激电子保持在一种单一态的一段有限的时间，典型值为1～20ns，在该阶段内荧光团经历各种变化，包括结构的变化和与溶剂相互作用的改变。做为这些变化的结果，S’1态单电子的能量部分地损耗为弛豫单激发态S1，其间发生能量的荧光辐射，电子返回到基态S0。
4)辐射：激发态电子释放的能量光子e＝hνexc，使荧光团返回到基态。由于激发态寿命期间的能量损耗，这些光子的能量低于激发光子的能量，并且辐射的光属于长波。能量之差(或波长)称作斯托克斯平移，该平移值是在选择用作标签或用在探针中的染料时的一个重要特征。斯托克斯平移越大，越容易从背景激发光中区分少量的光子。
5)荧光团：荧光分子统称为荧光团。当荧光团被用于给其它的分子增加颜色时，荧光团被称作荧光染料，并且组合物被称作荧光探针。荧光探针设计成：1)把可视目标定位并抑制在生物样品的特定区域之内，或，2)响应于一种特定的刺激。
6)电磁波谱：所有类型的电和磁辐射的整个波谱，被认做是一个连续谱，从波长为0.001埃的伽马射线到波长大于1,000,000千米的长波，还包括紫外、可见和红外波谱。
7)荧光光谱：除非荧光团不稳定(光褪色)，在样品被照明期间激发和辐射是一个重复的过程。对于溶液中的多原子分子，不连续的电子跃迁分别被称作荧光团激发和荧光团辐射谱的宽能量带取代。
8)单色仪：一种允许从电磁波谱开始的很宽频谱范围的波长经入射腔进入、并通过在空间色散波长而使得只能够在出射口得到窄频带的预定波长的仪器。滤色片不同于单色仪之处在于滤色片通过透射选定波长而非空间色散地提供波长选择。单色仪的第二个区别特征在于输出波长、以及在很多情况下的输出频谱带宽可以是连续选择地。单色仪的最小光学元件典型地包括：
(a)提供一个窄的光学图象的入射狭缝；
(b)确保从狭缝进入的光线平行的准直器；
(c)一些用于把进入的光线色散成空间分离的波长的元件；
(d)由选取的波长重新建立狭缝图象的聚焦元件；和
(e)隔离所需波长的光的出射狭缝。
在一个单色仪中，波长选择通过一个驱动系统实现，该系统使色散元件绕经过其中心的轴系统性地旋转。在单色仪中狭缝是具有可调节尺寸的窄腔。狭缝影响所需波长的选择并且它们的尺寸可以调节。
9)双单色仪：两个串接的单色仪。第二个单色仪接受第一个单色仪选择的光的波长，并进一步将预定的波长与无用的波长分开。
10)波长扫描：离开单色仪出射狭缝的预定输出波长的连续改变。在一个光谱仪中，由激发光单色仪扫描电磁波谱的波长以确定或规定荧光团被激发处的波长；由发射光单色仪进行的波长扫描被用于确定并探测荧光团发射荧光处的波长。在自动的荧光团光谱仪中，激发光单色仪和发射光单色仪既可以单独地工作，也可以共同地(同步)工作。
11)区域扫描：区域扫描不同于波长扫描，它是在限定的二维空间中对局域荧光团强度的集中测量。结果是一个强度图象、数据库或图表，映射出在二维样品中实际位置处的荧光团强度。在一个其最简单的例子中，区域扫描可以是一幅相机拍摄的照片，其中一致地受激所有的数据。或者，可以把样品移过一个探测器，探测器测量在限定的样品分区中的荧光团。收集的信息形成一个涉及荧光团强度的矩阵，其中其位置处可以产生代表原始样品中荧光团的图象、图表或曲线。
12)荧光探测器
在最近的二十年里在实验室通过使用荧光团建立了五个元件的荧光探测器：
(a)一个激发光源；
(b)一个荧光团；
(c)某种类型的滤波器，用于分开发射光子和激发光子；
(d)某种类型的光敏响应元件，把发射光子转变成一种可记录的形式，典型的是电子信号或照片图象，和
(e)限制环境光的闭光外壳。
荧光探测器主要有四种类型，每一种提供不同的信息：
(a)相机通过捕获一幅图象而将荧光分辨为二维空间坐标：[a]做为高敏感性胶片上的一幅照片图象，或[b]做为捕获到电荷耦合器件(CCD)中象素阵列上的重现图象。
(b)荧光显微镜还将荧光分辨为二维或三维空间坐标。显示外在同一时间对一个规定的视场收集一个图象的所有信息，既不用移动样品，也不用移动目镜。显微镜可以通过利用相机捕获图象而引入对荧光团浓度的量的估算，其中测量结果是曝光时间的函数。
(c)血细胞流量器测量流体中每个生物细胞中的荧光团，使得能够识别、量化以及在某些情况下分离细胞混合物内的亚种群。流量器不能用于产生限定区的图象或执行波长扫描。激发光光源永远是一个激光器，波长的识别通过可调谐染料激光器和滤光器的某种组合来完成。虽然这些设备可以采用光电倍增管探测一个可测量的信号，但没有采用单色仪进行波长扫描的流量器。
(d)分光荧光计(光谱仪主要采用PMT探测荧光，而且还测量(a)荧光产生的平均电流(信号平均)，或(b)单位时间里由样品发出的光子数(光子计数))。
荧光光谱仪是一种分析仪器，其中的荧光染料或探针可以由特定波长的光激发，从而探测并分析其发射光以识别、测量和量化探针的浓度。例如，一套DNA可以与荧光染料分子化学连接或由其标识，当该荧光染料分子暴露在规定波长的光照下时吸收能量，从基态跃迁到激发态。如上所述，激发态分子通过各种途径释放过剩的能量，包括荧光发射。发射的光可以集中和分解。或者分子的特性可以与酶共轭，酶可以把特定的衬底分子从非荧光转变成荧光产物，之后可以如上所述地激发并探测该荧光产物。
用在荧光光谱仪中的激发和发射波长的范围一般限定在电磁波谱的紫外和可见部分。为了荧光探测的目的，有用的染料是那些被激发并发射少量的窄带波长的荧光，波长处在电磁波谱的近紫外和可见部分。激励特定的荧光分子的所需波长可以如下产生：
1)光通过一系列带通滤波器(透射所需波长的光并对其它光不透明的材料)或截止滤波器(透过所有长于或短于规定值的波长的材料)的宽带光源，
2)窄带光源，如激光器，或
3)一个适当的单色仪。
对于宽带光源，主要通过带通滤波器分离对荧光染料曝光的光，从而从紫外或可见光谱中选择所需的波长用于激发。在基于单色仪的仪器中，当光源发出的光被色散成一个光谱时获得波长的选择，从中选取所需的波长。无论是什么光源都主要通过带通滤波器、截止滤波器或发射光单色仪离析荧光发射，通过除去规定波长以外的所有任何波长而选取用于探测的所需波长。大部分荧光探测包括对处于液相的样品检查。液体可以包含在玻璃、塑料或石英腔中，可以以例如单独的比色杯、流经盒或管、显微镜滑片、柱状或矩形多腔板、或是可具有许多核酸或保护它们的连接面的硅微阵列等形式携带。或者，液体也可以收集在二维聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中。在这些每个情形中，已穿过滤光片以选择用于激发的正确波长的光对腔或凝胶中的样品照明；同时也收集发射的光，使其穿过第二组滤光片以离析发射波长，并再利用相机或光传感器进行探测。
用在荧光探测器中的滤光片呈现出的特性在于限定荧光探测的敏感度、动态范围和灵活性，包括：经过系统时导致效率损耗的光吸收；固有的自发荧光，产生强背景信号；所需带宽的波长以外的其它波长的透射，它反之限定敏感度和动态范围。滤光片必需设计并制造成选择不连续范围的波长(“中心宽度的带通”)，把荧光探测限定到利用被激发的化合物并在适用于那些滤光片的波长处发射。开发具有非常特性的新荧光染料必需设计新的激发/发射滤光片对。
为了提高荧光比色杯光谱仪的效率以及提供波长的连续选择，已知利用光栅或基于棱镜的单色仪从激发光源色散入射光、选择窄带激发波长，并分别选择发射波长。光栅可以有多种形式，但蚀刻有把宽带光色散成许多波长的线。
单色仪主要包括一个带有入射狭缝和出射狭缝的闭光腔。从光源发出的光聚焦到入射狭缝上。壳内的准直反射镜把接收到的光束导向平面光栅，光栅把光波色散到出射狭缝上。通过旋转光栅移动波长的线性阵列超过出射狭缝来选择所需波长的光，使得只有较窄带宽的波长能够从单色仪出射。选取的光波的实际范围由狭缝的尺寸决定。
从一个连续谱的所有波长中连续选择窄带波长的过程被称作波长扫描，并且散射光栅相对于入射和出射狭缝的角度旋转与单色仪的输出波长相关。为了更精确地选择激发和荧光探测的波长，已知在每个单色仪中使用两个光栅以增强对荧光光谱仪中激发和发射光的波长选择。
虽然单色仪潜在地消除了对利用滤光片进行波长选择的需要并且使科学家不受滤光片的限制，但它们的使用增加了对仪器灵敏度和设计的其它限制。例如，有着上述结构的单色仪具有至少需要四个反射镜和两个色散元件、并且相关的光阻挡入射和出射狭缝的缺点。因此，这种装置较为复杂，并且与基于滤光片的仪器相比较为低效。
利用荧光光谱仪分析多腔板中的多种样品是高度专业化的。典型的做法是激发光从腔上方的一个小角度进入到腔中，从而使得能够通过一个透镜或反射镜校正一个腔内从样品发射的大部分荧光。但是，随着每个板上的腔数增加(如从每个板96个腔增加到超过每个板9600个腔)，此种侧照明结构变得不利，因为大部分入射的激发光照射到腔的侧面而非样品。由于这些腔一般具有黑侧腔，所以大部分激发光被损失。
如上所述，用于克服侧照明结构局限性的一种方法是利用光纤把激发光直接导向位于一个腔之上的光纤的一个照明端。用第二束光纤收集腔中的光并将其传递到PMT。在这种设计的一种改型中，位于一个微腔之上的二分叉光纤被用于把光载入并载出该腔。但是，光纤一般带来吸收损耗，并且在某些波长处还有自发荧光。因此，这种方法不是特别有效。
另一种方法是采用具有透明底面的多腔板，并将一个腔内的样品暴露于从底面而来的激发光下，同时从口渴的顶部收集发射光。虽然此方法在某些情况下是有价值的，但光被吸收以及被腔底的塑料散射而损耗。
另外，透明板材本身可以是自发荧光的。此外，还没有实现腔底面材料的腔对腔的光可再现性，这限制了基于腔对腔或板对板的相关测量。因此，这种方法被证明是比从样品的同侧照明并收集光低效的。
现有的使用光纤光路的一个例子包括Molecular Device于1998年引进的一种单体单一荧光微滴板探测器(“Spectromax GEMINT”)，它采用单光栅、单色仪、滤光片、反射镜和光纤、以及“Fluorolog-3”模块设备和“Skin-Sensor”、一个单元化设备的混合式结构，由Instrument SA制造，二者都采用二分叉光纤束从激发光单色仪导入光，并在光透到激发单色仪之后从一个样品处收集光。
应该注意，荧光单色仪的微滴板应用也被限制到具有384、96或更少腔的微腔板，即1536的腔的微板以及包含2500个腔、3500个腔、甚至9600个腔的纳米板不能与基于目前的光纤/单色仪的仪器一起使用。这种板的探测器主要使用激光器和与共焦显微镜结合的滤光片。
对于大量包括玻璃显微镜滑片、聚丙烯酰胺凝胶或标准的96腔、384腔和1536腔微腔板的应用，希望有一个荧光光谱仪提供高效、高精度连续选择激发和发射波长并提供很大的动态范围、消除使用光纤和滤光片(即光路不通过任何光学材料除空气)的荧光光谱仪，该光谱仪具有把激发光导向样品并从微滴腔中或一个二维表面上的样品收集发射光的高效结构，其中二维表面譬如是一个玻璃显微镜滑片、聚丙烯酰胺凝胶、硅片微阵列或其它固体表面。
一般地，荧光光强度、即亮度的测量定义为每单位时间发出的光子数。从原子或分子发射的荧光可用于量化样品中发射物质的量。荧光强度和被分析物浓度的关系是：
                F＝kQeP0(1-10[Ebc])这里的F是测得的荧光强度，k是仪器的几何因子，Qe是量子效率(发射光子/吸收光子)，P0是激发概率，该值是激发源辐射功率的函数，ε是与波长有关的摩尔吸收率系数，b是路径长度，c是被分析物的浓度。在前面的应用中，通过扩展方程并减去高阶项而把上述方程简化为：
                  F＝kQeP0(2.303*ε*b*c)
过去这个关系式被接收是因为荧光强度显现出与被分析物的浓度成正比。但是此方程不能提供不同荧光团之间荧光强度的比较，因为荧光强度的测量极大地依据于k这一仪器几何因子。
不同类型的探测器在进行测量的时间阶段内以及在光子可以区分时的速度方面有所变化，其特征在比较两个荧光团的发光度时是至关重要的。考虑两个荧光染料，二者的不同之处仅在于其中一个的激发态寿命比另一个荧光团的激发态寿命长十倍(如分别是1ns和10ns)。当利用已曝光了限定曝光时间的照相胶片进行探测时，短寿命的荧光染料在曝光胶片上明显地更为明亮。但是，如果使用一个采用连续激发的探测器，其中该探测器不能以足够高的频率区别光子，则短激发态寿命的荧光团实际上将能够发射更多的光子，但探测器会错误地表示两种染料的荧光强度相同。
光谱仪中通过在一个适当的光敏器件如光电倍增管或其它的光敏器件中产生光电流而探测荧光，两种光敏器件的特点均在于低水平的背景或随机电子噪音。为此，荧光发射过程的最佳特点在于泊松统计和荧光既可以通过光子计数也可以通过信号平均测量。
光子计数是一项用于测量低水平电磁辐射的高灵敏技术。在光子技术探测中，光子以足够的能量碰撞到光电倍增管的阳极、引发电子雪崩而产生的电流通过一个识别电路测试，从而区分随机电子噪音和真实信号。在这种光水平下，光子的分立性支配测量并要求这样的技术，即能够区分光子引发的电脉冲与由于其它原因起源于探测器(如光电倍增管)的暗电流脉冲。
在以前的光子计数应用中，探测的动态范围受探测器区分时间上紧密相关的光子的能力的制约。另外，在光子计数中的信噪比也是光强度的函数。假设入射到光阴极的稳定光通量每秒钟产生m个光电子。在任何一秒内入射到光阴极上的光平均是m个光电子，标准偏差是m1/2。在测量中的信噪比是：
             S/N＝m/m1/2＝m1/2         (1)
根据它们的频率和能量，可以利用具有足够大增益的探测器对各个光电子计数，但任何测量的精度绝不会好于方程(1)规定的限度。在其最简单的形式中，实用的光子计数仪器由一个快速放大器和一个设置在相对于输入低阈值的识别器组成，识别器低阈值的典型值为-2mV，经验发现该值对应于电子拾波器的灵敏度和光电倍增管在过增益下的工作之间的最佳平衡。
理论上由于小于光子计数的灵敏性以及对电子漂移的较大的灵敏性，信号平均把光电流用作入射光信号的直接测量。考虑到系统带宽(响应频率)B，与光电流Ik有关的噪音由散粒噪音公式给出：
        S/N＝(Ik/2e IkB)1/2         (2)这里的e是电子电荷。方程1和2的形式相似，因为它们是针对相同的现象并且实质上预测相同的结果。与光子计数相反，该方法中信号被固有地数字化，其动态范围受计时器速度的限制，在方程2中信号被认做是光电流的连续变量，并且可以获得较大的动态范围。但是在实际中，由于与大于16位分辨率的A/D转换器有关的较慢的响应时间，模式-数字转变过程严重地限制动态范围。
在荧光探测仪器的一般目的中，光源可以是一个石英卤灯、氙灯或类似的气体放电灯、光电二极管或多种类型激光器中的一种。典型的做法是把样品曝光在连续的照明之下，把总荧光团中百分比稳定的一部分保持在激发态。在这种仪器中，样品被照明的界面尺寸主要由狭缝决定。在更复杂的仪器中，其中包括各种实用成象光、共焦光学元件或点光源照明，激发光束被透镜和反射镜整形并聚焦到样品中的一个点上和一个焦平面上。
                    发明概述
根据本发明的各个实施例，提供一种波长和区域扫描荧光光谱仪，该光谱仪包括一个激发光双单色仪，一个共轴激发/发射光传递模块，一个发射光双单色仪，一个高速计时器-计数器电路板和一个用于相对于激发光的焦平面定位样品的精确的x-y-z安装表。每个元件的工作通过计时器-计数器板指导和调节。每个单色仪包括一对精确安装的全息凹形光栅，用于从入射的宽带光束中精确地选择所需的波段。选取的激发光通过光传递模块导向到样品腔上或二维表面上，如聚丙烯酰胺凝胶或显微镜滑片，其中光传递模块包括一个共轴激发反射镜，该反射镜放置成把激发光直接导向多腔板的一个腔中或凝胶的特定区域、显微镜滑片或微阵列上。射出样品的发射光通过有较大前表面的反射镜会集。会集的发射光通过发射双单色仪选择波长。两个单色仪包含三个精确匹配的狭缝，狭缝设置在限制无需用光的位置，同时产生一个所需波长的“近似点”光源，用于光路的后续阶段。以这种方式离析的发射光投射到光电探测器模块上，光电探测器模块把接收到的能量转换一个代表样品荧光强度的数字。
一个实施例包括一个有光源的荧光光谱仪系统；一个第一双单色仪，用于分开并输出光源发出的选定波长的光做为激发光；一个光传递模块，用于把基本上所有的激发光直接导向样品，并会集、聚焦和导引来自样品的荧光做为发射光；一个第二双单色仪，用于分开并输出选定波长的发射光；和一个光电探测器和分析器，用于探测选定波长的发射光并输出这一探测的指示。
另一实施例包括一个具有接收光的入射狭缝的双单色仪；一个第一光栅，放置在拦截并色散来自入射狭缝的接收光的位置；一个第一选择狭缝，放置在至少拦截一部分来自第一光栅的色散光并选择和通过此色散光的很窄范围内的波长的位置；一个第二光栅，放置在拦截并色散从第一选择狭缝通过的光；和一个第二选择狭缝，放置在至少拦截一部分来自第二光栅的色散光并选择和通过此色散光的很窄范围内的波长的位置。另一个实施例包括一个具有输入反射镜的光传递模块，放置成与被照明的区域共轴的位置，用于导引入射光照明该区域；和一个输出反射镜，放置成与被照明的区域共轴并与入射反射镜反射对齐的位置，用于在照明时会集、聚焦并导引该区域发射的光。
另一个实施例包括一个光子计数光电探测器和一个高速计时器-计数器板，极大地消除仪器偏差，提供更高的灵敏度，同时能够高频率鉴别最大分辨率地区分光子并进行量化，并且因此提供更大的动态范围。
下面通过参考附图对本发明的一个或多个实施例的细节进行描述。本发明的其它特点，目的和优点将从下面的说明、附图及权利要求书中变得更加清晰。
                     附图简述
图1是荧光光谱仪系统的简图；
图2A是双单色仪的另一实施例简图；
图2B是用于转动图2A所示双单色仪光栅的张紧带致动机构的简图；
图3是图1所示光传递模块的实施例简图；
图4是根据本发明的荧光光谱仪简化版简图；
图5A表示本发明第一替换双路径实施例；
图5B表示本发明第二替换双路径实施例。
在各个附图中相同的标号和标识表示相同的元件。
详细描述
图1是根据本发明荧光光谱仪系统的简图。宽带光源100照明反射镜102，该反射镜适当地弯曲，从而把光聚焦到双单色仪104。在另一种结构中，可以用一种窄带光源如光电二极管或激光器代替宽带光源，但与相同结构的单色仪仪器一起使用。
所需波长的光通过双单色仪104到达光传递模块(LTM)106。LTM106把激发光从单色仪104导向样品108，样品例如是微腔板的一个腔或一维聚丙烯酰胺凝胶的一个窄带。样品发射的任何锁定荧光都被LTM 106会集，LTM 106把光导向发射光双单色仪110的入射狭缝。调节发射光单色仪以通过样品的荧光发射谱中的某些波长，并将这些波长导向光电探测器112，在那儿测量发射光的能量。
光电探测器112可以是任何一种合适的光敏器件，包括但不限于光电倍增管、光电晶体管或光电二极管。光电探测器112的电子输出施加到一个自动处理单元114，产生一个表示探测选取的发射光的信号，该信号以适于进一步分析的数字形式储存。一般地，在此仪器中光路上的所有元件，包括双单色仪104和110以及LTM 106，都应该隔离在内部涂敷有非荧光吸收性材料的闭光箱中，以减少反射和来自其它光源的光如室内光。
图2A是根据本发明的双单色仪实施例简图。图中所示的结构既可以用于激发光单色仪104，也可以用于发射光单色仪110。
宽带光通过双单色仪中的一个狭缝200引入并从绕轴203旋转的第一全息凹形光栅202的前表面反射。利用前表面反射，通过避免光学支撑结构、如在后表面反射玻璃镜内的光吸收而提高了双单色仪的效率。凹形光栅的使用允许光色散成可选择的波长而无需补充性的准直反射镜。这种设计使得能够消除常规双单色仪仪器中使用的每个光栅的两个准直反射镜。使用全息光栅还减少了象散象差，并因而减小了无用波长(杂散光)的光量。
每个双单色仪都有三个狭缝：一个入射狭缝，光首先通过该狭缝进入单色仪；一个内部选择狭缝；和一个出射选择狭缝，光通过该狭缝离开单色仪。第一凹形光栅202把入射光波反射成第一空间色散的光束204。此第一空间色散光束204的每一种波长都以相对于其它波长的特有角度反射。通过绕其轴203转动第一凹形光栅202，可以把所需的波段导经单色仪腔内的内部选择狭缝206。
然后，选取范围的波长208反射离开第二全息凹形光栅210，该第二全息凹形光栅210把第一空间色散光束204的波长反射为第二空间色散光束212。通过绕其轴211旋转第二凹形光栅210，可以把所需的窄波段214导经出射选取狭缝216。
选择狭缝206和216的宽度决定离开单色仪的光的选取波长。较宽的狭缝允许更大的光量通过单色仪，而且光包括很宽的波段；较窄的狭缝减少通过单色仪的光量，而且光包括很窄的波段。宽狭缝的使用提高了探测的灵敏性，这对测量一个区域或体积内的总荧光是有益的，与在微腔内测量的情形一样。相反，窄狭缝的使用提高了空间分辨率，这对在特定位置区分不同荧光是有益的，与利用聚丙烯酰胺凝胶中分开的波段的情形一样。即狭缝尺寸越小，样品处的探测面积越小。在激光光源和针孔狭缝的情况下，在任何指定时刻的激发区是一个对应于一对具体数据点，该数据代表荧光强度和位置。
在光学系统中每个光学元件都会减少光通量，这是一个一般规律。图2A所示结构的优点包括但不限于删除用于在双单色仪中重新导向光栅的准直反射镜，如在利用传统的单色仪的情况。在本实施例中，只需要两个光导向元件(第一和第二全息凹形光栅202、210)，因而提高了总体光效率。
在图2A所示的结构中，第一凹形光栅202和第二凹形光栅210相反地并通过适当的机构串联地旋转。根据一个实施例的机构使用张紧带致动机构旋转光栅202、210，如图2B所示。光栅202、210分别关于枢轴轮250、252共轴安装。杠杆臂254的一端连接到枢轴轮250，另一端连接到螺旋驱动机构256。杠杆臂254沿棒258传动时旋转枢轴轮250。枢轴轮250通过张紧带262连结到枢轴轮252。根据本实施例，张紧带262为0.003英寸的不锈钢带。张紧带262导致枢轴轮252和光栅210与枢轴轮250和光栅202串联地反向旋转。连结在腔体和枢轴轮252之间的弹簧264维持张紧带262中的张力。光栅的位置可以通过连结到枢轴轮传感器266和螺旋驱动传感器268的微控制器决定和控制。
图3是图1所示LTM 106的实施例简图。激发光经入射腔进入LTM 106，在那儿通过或不通过一个或多个反射镜300导向共轴激发光反射镜302。共轴激发光反射镜302可以是平的，也可以是有点儿弯曲，以便根据需要聚焦或色散光束。共轴激发光反射镜302放置在把激发光导向样品108上的位置。更具体地说，共轴激发光反射镜302可以放置成与样品108有一点儿偏轴，但应该放置成基本上所有的激发光都入射到样品上以实现最大照明。
在一种应用中，多腔板的每个板都可以通过LTM 106或多腔板的X-Y平移放置在共轴激发光反射镜302之下。在另一个包括配备有任选的显微镜光学装置的单色仪的应用中，可以通过利用光路上的光学元件并通过LTM 106或玻璃滑片或培养片的X-Y平移把样品放置到共轴激发光反射镜302之下而可以单独对安放在玻璃滑片或培养片上的完整生物细胞的不同区域成象。从样品中一个或多个荧光团发射的任何荧光都被共轴发射光反射镜304会集。共轴发射光反射镜304必须是凹形的，从而直接地或通过一个或多个光导向反射镜306聚焦并导引发射光从LTM 106的出射口出射。在图3所示的实施例中，发射光从LTM 106上与激发光进入时相同的一侧出射。但是入射和出射口的不同放置可以被光导向元件300、306的适当布局所利用。
激发光反射镜302和发射光反射镜304的共轴分布确保高百分比的激发光被导向一个腔108中的样品上，并且从敞开腔中发出的高百分比的荧光被会集以用于分析。
在优选实施例中，LTM 106内的所有反射镜包括前表面反射镜，即“第一”表面反射镜。此反射镜具有一种涂敷在衬底如玻璃或陶瓷表面上的反射性材料，如铝，光被导向该衬底表面。涂层用作反射表面，使得光不会穿过衬底，如同在普通的第二表面反射镜中一样。此第一表面反射镜实质上更高效。
本领域的普通技术人员应该理解，如果需要，可以用多个不同的反射镜把光导入LTM 106中。但是，希望此反射面的数量最少以便提高LTM 106的效率。在优选实施例中，共轴激发光反射镜302是一个尺寸约为6×9mm的椭圆反射镜，而共轴发射光反射镜直径约为75mm。也可以采用其它的尺寸，并且一般随仪器整体的尺寸而变。
图4是根据本发明实施例的荧光光谱仪简化版简图。在此实施例中，通过激发光双单色仪104从宽带光源100中选择激发光波长。激发光被共轴激发光反射镜302导向腔108内的样品。发射的荧光被与共轴激发光反射镜302反射对齐的共轴发射光反射镜304会集并聚焦。共轴发射光反射镜304把会集并聚焦的光指向发射光双单色仪110。发射光双单色仪110选择所需的发射波长并把该波长导向光电探测器112，用于计数和分析。此实施例将LTM 106中的反射面减为最少。
图4中所示实施例的一个方面在于它的紧凑结构允许该仪器用作双路径光谱仪。即样品可以从腔108敞开的一侧或从腔的底侧激发。
图5A表示本发明第一种替换双路径实施例。光源100和激发光双单色仪104均可以任选地从它们的正常位置平移到多腔板以下的位置，以致于激发光入射到底照明共轴激发光反射镜302’，该反射镜将激发光导经腔108的透明的底部衬底。(如果光源不平移，则可以插入光导向反射镜以把光引到乳剂发光双单色仪104)。从腔108的敞口发出的荧光被共轴发射光反射镜304会集。当构成成底部照明时，可以从光路中移去顶部照明共轴激发光反射镜302，以便使发射光反射镜304会集的荧光量被最大化。或者，可以把顶部照明激发光反射镜302(图5A中未示出)留在适当的位置，如图4所示。在任何一种情况下，底部照明激发光反射镜302’都处于与发射光反射镜304对齐的方向(与反射对齐相反)。
图5B表示本发明第二种替换双路径实施例。在此结构中，从底部照明，在从激发光双单色仪104发出的正常光路中插入一组一个或多个重新定向的反射镜303A、303B，以便拦截激发光。拦截的激发光重新定向入射到底部照明的共轴激发光反射镜302’，该反射镜把激发光导经腔108的透明的底部衬底。
顶部照明的共轴激发光反射镜302可以留在适当的位置，如图所示，或者也可以当把重定向反射镜303A、303B移入适当位置中时将反射镜302移出其位置。这种移动例如可以通过一个车架的平移运动来完成，其中车架上安置所有的四个反射镜302、303A、303B、302’。另外，底部照明的激发光反射镜302’处于与发射光反射镜304对齐的方向(与反射对齐相反)。
在图4、5A和5B所示的所有结构中，附加的重定向反射镜可以用于把光适当地导向仪器中所需的位置。
根据一个实施例，使用一种以超过100MHz的频率工作的计时器-计数器。识别器模块可以以高达30MHz的频率响应于光子。此系统的动态范围从零到超过30×106个光子，由此消除了动态范围的限制，这在以前限制了荧光探测中光子计数的使用。如果从PMT观察到的电流大于在识别器中建立的规定的阈值电流，则产生5V的电脉冲，该脉冲具有大约2ns的持续周期；计时器-计数器电路对这些脉冲计数以作为时间的函数，即对单位时间的光子建立一个直接的定量。
在根据一个实施例的光谱仪中，把包含荧光标记的核酸或蛋白质放置在本发明定位机构中的平板上，LTM的正下方。通过设置在适合于荧光标记的波长的激发光和发射光单色仪，凝胶在LTM下方前后移动，直到所有的凝胶区都被横向往返移动到。在此往返运动的每一点进行荧光阅读，并储存为代表在每个凝胶点处发射荧光的二维阵列。
点之间的距离调节成产生对于给定数据获取时间的最佳响应。在实际实验中，凝胶也扫描成代表从凝胶顶部的样品腔到凝胶的根部的电泳路径的“通道”，因为电泳凝胶中的荧光团被排列成一条线而不是一个点。从样品腔到凝胶的底部扫描每个通道，以达到基本上减少整个数据会集时间。作为一个背景基准，扫描空白通道，并且对于包含荧光团的通道点对点地从对应于数据中减去该数据。然后以两种方式分析该校正的数据。在一种分析中，一幅图象由原始凝胶构成，将该图象与相同凝胶的标准实验室照片比较以计算标准凝胶参数，如分别由数字图象和胶片确定的迁移距离、分子分离和分子种类的浓度。在另一种分析中，利用平台扫描探测器创建与自动射线摄影胶片的凝胶通道产生的相同的“光密度测量”曲线。从关于一条通道的荧光强度的数据库确定每个荧光谱段的中心，并且制作作为迁移距离函数的荧光强度的横截面曲线。从利用相同荧光标识的核酸的不同量制备的凝胶的使用中确定标准曲线，建立灵敏度、分辨率和凝胶探测的总动态范围的上下限。
在荧光探测的未来发展中一个和两个光子系数过程的“平方强度点扩散函数”和“纵向穿透深度”特性被认为是非常重要的特征。这两个特征通过把毫微微秒的短脉冲激光聚焦到待研究的样品中的焦平面上来实现。在根据另一个实施例的光谱仪中，来自适当激光器的激光束被用于激发的石英卤灯或氙灯光源代替。激光束用于照明激发光单色仪的入射狭缝。在某些情况下需要的附加的改型例如包括使用一个或两个针孔狭缝而不用标准的矩形狭缝，在光通过单色仪之后插入物镜以对其聚焦。发射的荧光先经光传递模块会集，并且作为时间的函数测量荧光，或在某些成象和区域扫描的情况下作为样品上光传递模块的位置以及时间的函数，与上述的凝胶分析一样。在此结构中，激发光单色仪上的针孔出射狭缝用于在一个样品上用光成象，并且图象的每个点用于激发荧光。以x-y-z的方式移动样品位置，使得样品区域的扫描产生一幅图象或数据库。对于共焦显微术需要如下的两个针孔狭缝。对于多光子应用，只用一个针孔狭缝作为激发光单色仪的出射狭缝。对于双光子发光，如果需要聚焦光束以便高透射，则可以使用微透镜阵列。一般地，虽然在某些偏振应用中该结构是表层荧光，但激发是从底部进行并且从顶部会集光束。
在另一实施例中，本发明用于制作扫描荧光偏振探测器。当用平面偏振光激发时，如果分子在荧光团的激发周期内保持稳定，则溶液中的荧光分子将发射光束回到固定平面中(即光保持偏振)。但是溶液中的分子随机翻滚和旋转，并且如果在激发态寿命起见以及发射之后发生旋转，则光射入的平面可以与用于原始激发的光的平面非常不同。
分子的偏振值与其旋转弛豫时间成正比，该时间通常定义为分子旋转68.5°所需的时间。旋转弛豫时间涉及溶液粘滞度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)和气体常数(R)：
偏振值∝旋转弛豫时间＝3ηV/RT
如果粘滞度和温度是常数，则偏振值直接涉及分子体积(分子大小)，而体积通常与分子的重量相关。分子体积的变化由几种原因导致，包括衰变、变性、构造形态的变化或连杆分子的键联或分离。这些任何一种变化都可以探测为溶液偏振值变化的函数。具体地说，激发态寿命期间在溶液中自由旋转的小荧光分子可以在非常不同于入射光平面的平面中发光。如果相同的小分子链接到大分子，则小分子的旋转速度则降低，并且探测到偏振值减小的结果。结果的测量要求由偏振光激发，而偏振光可以利用一束激光或通过使用偏振滤光片的光选择而获得，偏振滤光片只透射在单一平面传播的光。在一个实施例中，通过本发明激发光单色仪获得的确定波长的光穿过称为“起偏器”的偏振滤光片而细化，获得单色的、用于激发的平面偏振光(对于本发明目的，指定“垂直偏振光”)。同样地，会集发射光的光路通过引入称为“检偏器”的第二偏振滤光片而类似地改进，检偏器既可以旋转到激发光平面的垂直位置，也可以旋转到水平位置。当把溶液型的荧光样品放入在“起偏器”和“检偏器”之间的光路中时，只有那些被适当地定向为吸收光垂直偏振面的分子被激发，并且随后发射光。通过旋转检偏滤光片，则可以测量垂直和水平平面中的发射光量，并且用于估算溶液中的小荧光分子在链接到大分子之前和之后的旋转程度。
在另一种应用中，本发明用在共焦显微镜中，一种消除荧光显微镜的一个基本困难、即由于散焦光而降低显微镜焦平面上的空间分辨率的方法。根据另一实施例的光谱仪用于由以上所述的激光激发的基本实施例制造一个新型共焦显微镜，并且光束图象聚焦到整个细胞载片上并实现样品中荧光标识的多光子和单光子激发。没被聚焦的平面中的荧光团不被照明并且不发荧光。
在共焦成象中，光圈用在激发光和发射光光路中，以便减少散射和平面外的荧光。锁模染料激光器已经达到同时进行多光子激发，因为这种激光器能够以非常简单的脉冲并以足够大的效率给焦点输送激发能，从而达到双光子激发。在多光子成象中，激光提供的焦点激发一个足够小的体积，当与本发明的光传递模块仪器一起使用时，能够会集所有的发射光而无需在发射面上有第二针孔狭缝。发射光圈不变化是必须的。
以上描述了本发明的多个实施例。毋庸赘述，在不脱离本发明构思和范围的前提下可以进行各种改变。例如，本发明的双单色仪可以用在其它类型的仪器中，并且LTM可以用在基于滤光片的光谱仪或其它光学仪器中。作为另一个例子，LTM可以用于把入射光导向被照明的区域，并且有效地会集、聚焦和导引该照明区的发射光(如既可以是发射光，也可以是荧光)。因此，其它实施例也将处于下面权利要求的范围中。

Claims (22)

1.一种荧光光谱仪系统，包括：
(a)一个光源；
(b)一个第一双单色仪，用于分开并输出光源发出的选定波长的光做为激发光；
(c)一个反射光传递模块，用于把基本上所有的激发光导向样品，并会集、聚焦和导引来自样品发射的荧光做为发射光；
(d)一个第二双单色仪，用于分开并输出选定波长的发射光；和
(e)一个光电探测器和分析器，用于探测选定波长的发射光并输出这一探测的指示。
2.如权利要求1所述的荧光光谱仪系统，其特征在于第一双单色仪或第二双单色仪包括：
(a)用于接收光的入射狭缝；
(b)一个第一光栅，放置在拦截并色散来自入射狭缝的接收光的位置；
(c)一个第一选择狭缝，放置在拦截至少一部分来自第一光栅的色散光并选择和通过此色散光的很窄范围内的波长的位置；
(d)一个第二光栅，放置在拦截并色散从第一选择狭缝通过的光的位置；和
(e)一个第二选择狭缝，放置在至少拦截一部分来自第二光栅的色散光并选择和通过此色散光的很窄范围内的波长的位置。
3.如权利要求2所述的荧光光谱仪系统，其特征在于第一光栅和第二光栅都是凹形光栅。
4.如权利要求3所述的荧光光谱仪系统，其特征在于凹形光栅是全息凹形光栅。
5.如权利要求2所述的荧光光谱仪系统，其特征在于第一光栅和第二光栅绕旋转轴转动，用于选择作为旋转角函数的所需波长范围内的光。
6.如权利要求2所述的荧光光谱仪系统，还包括一个耦合到第一光栅和第二光栅的带驱动器，用于同步旋转第一光栅和第二光栅。
7.如权利要求1所述的荧光光谱仪系统，其特征在于反射光传递模块包括：
(a)一个激发光反射镜，放置在基本上与包含样品的腔共轴的位置，用于导引激发光对样品照明；和
(b)一个发射光反射镜，放置在基本上与包含样品的腔共轴的位置，用于会集、聚焦和导引样品发射的荧光。
8.如权利要求7所述的荧光光谱仪系统，其特征在于发射光反射镜是一个球面镜。
9.如权利要求7所述的荧光光谱仪系统，其特征在于激发光反射镜和发射光反射镜是第一表面反射镜。
10.如权利要求7所述的荧光光谱仪系统，其特征在于激发光反射镜位于把激发光导入腔的开口的位置，发射光反射镜位于会集从腔的开口发射的荧光的位置。
11.如权利要求7所述的荧光光谱仪系统，其特征在于所述的腔有一个透明的底部衬底，激发光反射镜位于把激发光经透明的底部衬底导入腔中的位置，发射光反射镜位于会集从腔的顶部开口发射的荧光的位置。
12.如权利要求11所述的荧光光谱仪系统，其特征在于移动的光源和第一双单色仪二者或其中之一，以把激发光直接导向激发光反射镜。
13.如权利要求11所述的荧光光谱仪系统，其特征在于将一个或多个光导向反射镜放置成把从第一双单色仪发出的激发光导向激发光反射镜的位置。
14.如权利要求1所述的荧光光谱仪系统，其特征在于光电探测器和检偏器对探测到的发射光选定波长的光子数进行计数。
15.一种双单色仪，包括：
(a)用于接收光的入射狭缝；
(b)一个第一光栅，放置在拦截并色散来自入射狭缝的接收光的位置；
(c)一个第一选择狭缝，放置在至少拦截一部分来自第一光栅的色散光并选择和通过此色散光的很窄范围内的波长的位置；
(d)一个第二光栅，放置在拦截并色散从第一选择狭缝通过的光的位置；和
(e)一个第二选择狭缝，放置在至少拦截一部分来自第二光栅的色散光并选择和通过此色散光的很窄范围内的波长的位置。
16.如权利要求15所述的双单色仪，其特征在于第一光栅和第二光栅都是凹形光栅。
17.如权利要求16所述的双单色仪，其特征在于凹形光栅是全息凹形光栅。
18.如权利要求15所述的双单色仪，其特征在于第一光栅和第二光栅绕旋转轴转动，用于选择作为旋转角函数的所需波长范围内的光。
19.如权利要求15所述的双单色仪，还包括一个耦合到第一光栅和第二光栅的带驱动器，用于同步旋转第一光栅和第二光栅。
20.一种反射光传递模块包括：
(a)一个输入反射镜，放置在基本上与照明区域共轴的位置，用于导引激发光对该区域照明；和
(b)一个输出反射镜，放置在基本上与照明区域共轴并与输入的射镜反射对准的位置，用于会集、聚焦和导引由照明区域发射的光。
21.如权利要求20所述的反射光传递模块，其特征在于发射光反射镜是一个球面镜。
22.如权利要求20所述的反射光传递模块，其特征在于激发光反射镜和发射光反射镜是第一表面反射镜。
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