CN1363006A - 物质的电泳辅助染色 - Google Patents
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Abstract
一种对生物样品进行en boc染色的方法,包括:(a)将样品浸入染色液中,这种染色液含有一种离子导电溶液以及一种与样品组分相结合的染色剂前体或带电染色剂分子,以及(b)施加穿越染色液的电场使染色剂分子渗透入样品中。这种方法缩短了染色时间。
Description
发明背景
本发明涉及对生物样品成像的染色。
用于透射显微镜，包括可见光显微镜和电子显微镜成像的器官组织样品和其他物质样品，通常是通过对样品进行一系列的化学处理，最后形成包埋样品的实心块。
在一种传统的组织样品制备过程中，首先将组织通过福尔马林、戊二醛或其他物质进行化学固定，这些物质可保护样品免予自我分解(自我降解)，可赋予样品刚性，增加样品的渗透性，从而提高了随后的溶液渗透。紧接固定步骤的是渗透这一步，这一步通过逐渐增加溶剂如乙醇和二甲苯的浓度来逐步替代其中的水，最后将其全部去除掉。紧接渗透的是石蜡包埋，然后将样品冷却到室温，使其凝固。另一种方法，组织可以用塑料多聚体来渗透，然后通过加热、紫外线或其他方式来使起变硬。随后将此坚硬的、渗透过的组织块安置在一个模子中，以石蜡或塑料来包被以产生组织块。
在组织切片机上对包含有组织的样品块进行切片。对于使用光学显微镜来讲，要将切片收集后放于载玻片上。切片在载玻片上固定好后就要利用能够标记特异细胞部位(如核酸、脂质等)的多种染料进行染色，或者进行免疫组织化学处理。
另外还有en boc染色法，其中整个样品是通过浸没染色，这一步是在以形成组织块的渗透和包埋之前进行的。然后进行组织切片进行透射显微镜成像，或者组织块本身的切割面可通过一种叫做组织块表面显微镜方法的加工过程进行成像。后一种情况包括了使用Surface Imaging Microscope(U.S.专利号4,960,330，″ImageRecording Apparatus″)，其中样品是经过en boc染色后利用非常不透明的介质进行渗透和包被，或者通过其他处理方法，这样就就防止了在组织块几微米深处产生的组织成像。通过这样操作就制备了一种与在传统的载玻片上固定发组织切片非常相似的薄的、‘实质’切片(virtual section)。
因为在组织块表面显微镜技术中成像的物质的体积是与传统的基于载玻片的技术中更加薄的物质切片相对较大，因而en boc染色就要对更厚的物质进行渗透。这种情况令人不快的延长了样品的制备时间。
在en boc染色中，可用于加速染色剂渗透如组织的方法包括合适的固定剂选择；应用加热、微波辐射、真空或超声波；以及向染色液中添加去污剂或其他化学品。然而，即使应用这些方法，染色剂渗透入体积相对较大的组织中也需要以天甚至周来计的时间。当染色剂分子或染色剂前体与大载体分子，如免疫组织化学操作中的用到的载体，相结合时，渗透时间就会更长。
发明概述
一般来讲，本发明特征在于通过应用电泳技术，来提高生物样品染色所用到的染色剂组分的渗透速度和渗透程度。电泳技术是指在电场的作用下带电分子在流体中移动的一种方法。染色过程中用到的染色剂或其各个组分包括自由染料(free dye)或着色剂分子、抗体的化学缀合物，核酸探针和其他高分子量载体分子，如抗体。
本发明的特征在于一种可对生物样品进行en boc染色的方法，包括以下步骤：(a)将样品浸入染色液中，这种染色液含有一种离子导电溶液(ionically conductive solution)以及一种与样品组分相结合的染色剂前体或带电染色剂分子，以及(b)施加穿越染色液的电场使染色剂分子渗透过样品。提高了染色剂对样品的渗透作用。
本发明的方法的另一特征包括：(c)将含有第一抗体的样品浸没到染色溶液中，这种溶液含有离子导电溶液和可与第一抗体进行结合并且带有电荷的第二抗体；以及(d)施加穿越染色液的电场使染色剂分子渗透过样品。提高了第二抗体对组织的渗透作用。
在本发明的另一种优选实施方案中，含有第一抗体的样品是浸没在含有可结合到第一抗体上的第二抗体的溶液中。
在本发明的一种优选实施方案中，在将样品浸没到染色溶液中之前是将样品用凝胶支持物进行渗透作用。
在本发明的一种优选实施方案中，施加的电压为50-700V，优选的是100-400V。维持电场的时间为1-25小时，优选的是3-15小时。
在本发明的另一种优选实施方案中，染色液包括染色剂前体和染色剂分子，或第一抗体与第二抗体，此处所选的分子对可在电场中以相反方向运动。将一种组分，如染色剂前在样品的第一面加入染色液中，第二种组分，例如染色剂分子在样品的另一面加入染色液中。
本发明的另一方面，在切片组织中的未结合的染色剂分子的比例降低了，这是通过：(a)首先将样品浸入染色液中，这种染色液含有一种离子导电溶液以及一种与样品组分相结合的染色剂前体，以及(b)然后，施加穿越染色液的电场使染色剂分子渗透至样品，未结合的染色剂前体从样品中移除。
此处所用的样品指将要进行染色或包埋的组织或其他物质。在染色之前，还没有通过组织切片术来制备样品。一般来讲，样品的厚度为大于200微米，也可为大于1毫米、1厘米或更大一些。
此处所用的术语‘染色剂’或‘染色分子’指能够在要进行检测的组织或微生物体中产生颜色的染料、试剂或其他物质。染色剂可以是自由染料或着色剂分子，或者可以是可与抗体结合的染料或试剂，与样品组分有特异亲和性的核酸探针、外源凝集素或其他大载体分子。着色剂分子包括可进行反应以提供可见的颜色或荧光的染料前体。
此处用到的名词‘染料前体’指与未标记的，也即与不包括染料或着色剂在内的化合物有特异亲和力的载体分子。为了使组织更加的形象化，染色剂前体可与第二种标记化合物进行复合来形成多分子缀合物。这样的染色缀合物可包括一种第一化合物，如与组织组分具有亲和性的第一抗体，其自身利用传统的成像技术是看不见的；以及一种第二化合物，例如与第一抗体具有特异亲和性的第二抗体，如一种抗免疫球蛋白抗体，它含有可对组织成像的染料或着色剂，或将无色的底物转化为有色底物的酶。
此处所用的术语‘组织或样品的组分’指在此组织中优先与染料或其部分进行相互作用的抗原决定簇或其他部位。
图表简述
关于图表，本发明中有描述，介绍这些图表的目的仅仅是为了图解本发明，其中：
图1是概略的图解在本发明中的有用的电泳单位，以及
图2是概略的图解本发明的另一实施方案，其中第一中抗体和第二抗体是在通过一步就加到了抗体中。
优选实施方案的描述
利用合适的标记以进行随后检测的抗体进行组织染色是一种多方面的成像技术，这要归因于抗原-抗体结合的特异性。抗体染色不仅能够揭示感兴趣抗原的存在，而且能够对其进行亚细胞定位，因而可使组织的亚细胞组分成像。
当应用于大体积的样品时，由于抗原抗体结合是依赖于扩散作用的，从而抗体染色就引起了一些重要问题。在结合前，抗体必须首先扩散到组织中，这在较大的组织中就需要几天甚至几星期的时间。长时间的染色对组织质量会产生有害作用，并且会削弱成像技术的商业可行性。
通过对浸没在染色液中的样品施加电场作用，本发明解决了这个问题。电驱动力推动和加快了染色剂对样品的渗透，显著缩短了染色时间。对一个组织染色所需的时间从数周降至数小时。
这种方法可通过利用传统的管室电泳装置(tube cellelectrophoresis assembly)10来实现，如图1中所示；然而，人们预期之中方法可以通过使用能限制电流流至组织所在的窄孔的传统装置来进行的。本方法中所用的电极和缓冲液是电泳中常用的。
此方法是通过对可作为染色剂前体，并且在染色过程中提供组织特异性的抗体来进行描述的。在优选的实施方案中，染色剂前体是第一抗体，并且在随后的步骤中将与第一抗体有亲和力的已标记的第二抗体引入。
这种方法可应用任何在电场中具有定向移动能力的染色剂前体或染色剂分子。分子需要带电荷以在电场中进行移动。不带电荷或所带电荷不充分的分子可通过改变pH、化学衍生等等方法来提供所需的电荷。如果其他所有的条件都相同，那么分子所带净电荷越多，在电场中的迁移率越大。
关于图1，上部的12和底部的14号槽盛有缓冲溶液16，并且分别含有电极18和20。电极的极性可正常应用或反过来应用，这依赖于所用的染色剂分子或染色剂前体的总体电荷。电泳装置包括一或多个管24，他们与上部和底部的槽12、14进行电接触。如图1中所述，电泳装置可同时处理多个样品。
在本发明的一个优选实施方案中，待染组织样品22制备后加入管24中。优选的组织样品是与管内径具有相似尺寸并且与其内径形状相符合的样品，使之安要地处于管中。玻璃管内径尺寸是按照能容纳待染组织样品来选择的。组织大小可以变化很大，例如，从100微米级到毫米级，直到厘米级甚至更高。管中注有离子导电溶液26，它一般是缓冲液。特异溶液的选择是基于其与组织样品和其pH(它对在电泳染色过程中用到的抗体的净电荷产生影响，从而也对其迁移率产生作用)的组织相容性之上的。将一种抗体28导入管中。抗体可以通过离子导电溶液来导入或可通过单独的步骤添加。优选的是抗体在单独步骤中直接添加到组织样品的附近，因为这种方法可以减少充分渗透过整个组织所需的抗体数量。例如，可以首先将一种浓缩的抗体溶液在组织22的邻近部位加入管中。随后，可将缓冲液26注入管中。
另外一种方法，抗体可在固体介质如琼脂糖中加入管中。首先将抗体与琼脂糖混合形成半固体凝胶；然后从凝胶中切下一小决栓状物，将其放置在组织的附近。在这个实施方案中，在渗透入组织之前，抗体首先从凝胶中扩散出来。通过这种方式进行抗体运送是有益的，因为这样抗体是通过一种逐渐的方式来导入的。
在一般的应用中，电压需要稳定，安培计调整至获得所需的抗体迁移率。在一种电场条件下，抗体是朝向组织迁移的，进入组织中，并且固定到与其有亲和力的一个抗体组分上形成复合体。在这种方法中组织被用作染色剂的亲和层析柱。保持电场条件直至染色剂完全渗透进组织内部。工作电压为50-700V，优选100-400V。
按照上述的参数来进行电泳，就能够得到基本完全染色的组织样品，例如在数小时内大于85％以及优选的大于90％。通过取出一个样品并确定抗体渗透的程度就可以确定组织染色程度。这种检测可利用传统的技术来进行。例如，通过OCT将样品冷冻在低温恒温器中。切成薄片(直径4微米)并且用第二抗体和着色剂底物来确定第一抗体的渗透程度。在检测结果的基础之上，对电泳过程进行调节来改进染色方法。观察渗透的程度和性质并相应的调节电泳参数等，通过这些经验来确定最优化的染色条件。可以增大电流以进一步的提高渗透程度或缩短整个过程的时间。也可改变组织制备技术，如固定技术，来调节抗体渗透速率。
按照上述的方法，电泳介导的组织样品染色可在简单的缓冲溶液中完成。组织样品提供了完全的机械支持以在电泳管中保持样品。在另一个实施方案中，凝胶支持物可将组织锚定在电泳管中。可例举的介质包括琼脂糖和聚丙烯酰胺等等。当组织样品较电泳管的内径太小以致样品不能自我支持时，使用这些介质是很合意的。半固体凝胶能固定化和支持电泳管中小体积的样品。
在本发明的另一种实施方案中，组织样品在导入电泳管之前就利用电泳介质来渗透。此处的渗透作用是指利用流体或系列流体来处理组织，使其渗透组织直至分子水平，随后将其转化为固体或半固体以给予样品刚性。在这个实施方案中，利用电泳介质进行渗透可保证染色剂均匀通过组织，并且根本不通过体系中能提供低抗性途径的天然或人工缝隙或通道迁移。
一旦组织样品通过第一种染色剂进行了染色之后，就要将第二种样品导入电泳介导的染色液中。样品是按照上述方法进行处理，除了在电泳过程中第二抗体是取代了第一抗体的位置。
可选的，第二抗体也可通过传统的en boc浸没技术来导入。
在本发明的另一个实施方案中，第一和第二抗体，或染色剂分子和染色剂前体可一步加样于组织中。出于这种目的，第一种和第二抗体要选那些在电场中具有相反迁移行为的抗体，也即，一旦电场应用之后，这两个分子要同时向相反的电极迁移。可对这些抗体进行上述的修饰以获得所需的迁移行为。
提及图2，将第一抗体30和第二抗体32安置在电泳管36中的组织样品34的相对两侧。电泳管的相对两端通过电源(未显示)和电极(未显示)来进行电交流。但施加上电压时，第一和第二抗体30、32分别按照箭头38、40所示的方向相反移动。要选择第一抗体和第二抗体以及组织样品的相对位置，从而使得抗体能够穿过那些渗透入样品并且形成染色剂或染色剂前体缀合物。在优选的实施方案中，第一抗体渗透并结合到组织上是先于第二抗体的。
本发明通过降低背景染色剂水平而有益的提高了染色成像的质量。组织成像的质量是受局部抗原水平和背景信号水平的影响的。即使高浓度的抗原在高背景染色剂的情况下也可能很难检测或区别开来。组织样品电泳诱导所有带电物质进行迁移，从而避免了未结合的抗体滞留在组织中。因此，组织样品可作为结合抗体染色剂的亲和柱，而未结合的抗体在电场力的作用下被驱逐出组织。
在大多数情况下，利用本发明中的方法来处理传统的薄组织切片没有明显的优势，因为在这种情况下，染色时间不会过长。然而，在这种情况下，将电泳介导的组织染色技术与传统的组织载玻片显微镜技术相结合是我们所需的，因为这种情况下的高背景染色会干涉成像过程。然后进行组织切片，并且利用传统技术用第二抗体和着色剂进行处理。由于在电泳过程中去除掉了组织中的未结合抗体而显著降低了背景染色。
按照上述的方法，可以进行直接或间接的检测。在直接检测中，第一抗体用染料或着色剂来标记，并且直接用于成像染色。在直接检测方法中，第一抗体没有进行标记，其结合检测是通过与第二种化合物，如第二种标记抗体复合来进行检测。同一种标记试剂可用于标记与第一抗体联合使用的第二抗体进行标记。此外，由于第一抗体没有进行化学修饰，所以具有较低的活性损失的危险。另外，第二抗体可复合到酶或其他试剂上将不带色底物转化为有色底物。
最普通的标记方法可用于本发明中的方法之中。染色剂可以是带色的或荧光物质。荧光染色或暗视野染色是通过荧光染料和标准物质来进行的，而亮视野染色是利用荧光染料来进行的。用于组织染色中标记检测试剂的典型方法包括利用可进行反应生成永久着色或发射荧光物质的荧光染料和酶。
相对于荧光标记，酶标记具有更高的灵敏度和更低的分辨率。酶标记试剂可通过可溶性发色物质来进行检测，这种物质在酶反应之后在酶位点沉淀产生不溶性的带色产物。可例举使用的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。与此相对，当使用荧光标记的抗体时，亚细胞特征的分辨率非常好。本发明的缺点是发色团发射较弱和易于被光漂白。可例举使用的荧光染料包括荧光素、罗丹明和德克萨斯红。
另一种检测方法包括使用生物素/链霉抗生物素体系。第一抗体(或第二抗体)可与生物素进行结合。生物素化作用可在温和的条件下进行，这样一般不会对抗原结合产生负面影响。为了对检测缀合物进行检测，就要将标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素与生物素结合。这种方法的优点在于易得到的标记分子，并且没有损失活力的危险。
对于在这些或其他组织样品标记方法方面的进一步的信息来讲，感兴趣的读者可参看″Antibodies：A Laboratory Manual″(E.Harlow and D.Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，其全部内容在本发明中引用以作为参考。
一旦样品进行了en boc染色，就可对其进行进一步的处理来为制作切片和检测做准备。组织可通过化学溶液来固定，这些化学溶液可保存、硬化以及渗透入样品，然后通过流体或系列流体来渗透过组织达到分子水平，从而转化组织为固体或半固体状态且给予样品刚性。为了获得可观察的表面，可对组织进行包埋，这种包埋是通过将组织放置在一个模子中并在其周围充入物质(一般是与渗透物质相同的物质)，这些物质随后硬化形成包埋组织块。包埋物质起到刚性支持的作用，并且能够促进切割过程。从组织块上切割薄片，然后将其固定在玻璃载玻片或其他支持物上就得到了供观察的标本。另外，组织块的暴露面可利用USP4,960,330中提出的方法进行成像。
本发明中的方法在下列实施例中有描述，这些实施例是用来说明本发明的，但这些实施例并不局限于本发明。
实施例1：利用4mm的Fray生物打孔机从人肾中制备得到直径4mm、长2mm的柱状组织栓块。肾组织原先是固定在EXCEL防腐剂(MasterTech，Lodi，CA)中。在旋转器上用蒸馏水冲洗栓10分钟，然后用含有0.5％的表面活性剂Triton X-100的0.1 M HEPES缓冲液(pH 7.5)冲洗3次(每次10分钟)。
电泳中使用的是带有Bio-Rad电源供应型Power Pac 300的Bio-Rad Model #175管细胞电泳装置。所用的玻璃管为125毫米长、稍小于4毫米宽。开始时，在使用含有0.5％Triton X-100的0.1M HEPES缓冲液冲洗之前要用其漂洗玻璃管。电泳槽的下槽充入不含表面活性剂的0.1 M HEPES缓冲液，直至稍低于溢流标志的位置。
含有0.5％Triton X-100的0.1 M HEPES缓冲液仅仅是用于抗体稀释和漂洗玻璃管。在实验进行中，不含表面活性剂的0.1 M HEPES缓冲液用做电泳缓冲液。大约须要3-4升流体来充满管细胞电泳仪的上下槽。利用含有0.5％Triton X-100的0.1 M HEPES缓冲液进行1∶5稀释过的Novocastro抗-CD34做第一抗体；而利用含有0.5％TritonX-100的0.1 M HEPES缓冲液进行1∶5稀释的Southern Biotech山羊抗鼠IgGI-AP(AP＝碱性磷酸酶)缀合物做为第二抗体。
在其起始的组织制备完成后，将栓小心的插入玻璃管中，利用涂药器的棒将其推至大约玻璃管的中部位置。利用1个注射器和针头将玻璃管末端和组织栓间的底部空间充入HEPES缓冲液，然后将玻璃管塞住。然后将此玻璃管放置在上电泳槽中，并且沉至下电泳池，然后将塞子取出。在所有的玻璃管都经过这样的处理并放置在上电泳池中后，将100ul的第一抗体铺在每一个组织栓之上。然后在每个组织栓之上小心的加入一层HEPES缓冲液，直至玻璃管完全充满为止。电泳仪中任何没有使用的通道都用橡皮塞子塞住。上槽中充入HEPES缓冲液直至电极平台。
对第一抗体来讲，电压设定在100V。电流取决于所用的玻璃管的数目，但是一般认为最低4毫安培的电流是必须的。当总共的样品总数小于3种时(总数为4或更多管)，放置有充有1％琼脂糖的过量假柱可保证显示正确的安培数。由于第一抗体的总电荷数，电极的极性在进行操作前要进行反转。电泳进行6小时。
在电泳过程的最后，取出一个样品来评估抗体渗透程度。用TRIS-HCL缓冲液(0.5M，pH7.5，3X，10min)漂洗栓。利用OCT将样品冷冻在低温恒温器中，然后切下大约4微米的薄栓以进行下面的第二中抗体和着色剂处理。利用Vector Red(Vector Laboratories，Burlingame，CA)进行检测。
在人组织中，这种方法对所有血管，包括peritubular和glomerular capillaries产生了高特异性染色。达到了高达90％的渗透。
随后将第二抗体加入组织中。在添加第二抗体之前，要用HEPES缓冲液漂洗栓以清除仍然附着的第一抗体。用一长针头和注射器来注射大量的缓冲液冲洗栓至少3次。用涂药器棒将组织栓推至玻璃管的远端。用橡皮塞子塞住另一端，然后将玻璃管倒转，这样相对于其使用第一抗体时的位置，现在的位置就正好相反了。玻璃管底部也如前面所述充入缓冲液，并且放置在电泳槽中，将橡胶塞子取出。仔细的在组织栓的上层加入100ul山羊抗鼠IgGI-AP缀合物溶液。随后将管中小心加入HEPES缓冲液直至顶部。
对第二抗体来讲，电压设定在200V。电流取决于所用的玻璃管的数目，但是一般认为最低4毫安培的电流是必须的。电极的极性在进行操作前不进行反转。电泳进行12小时。
如上所述，要取出一个样品来评估抗体渗透程度。用TRIS-HCL缓冲液(0.5M，pH7.5，3X，10min)漂洗栓。利用Vector Red进行检测。这种方法对血管产生了高特异性染色，但背景信号极少。第二抗体的渗透程度只要达到15％，这样染色就足够用于给出一个高质量的成像。这种方法可提供高质量的成像，但却有低背景信号。
另外一种方法，也可利用传统的en boc浸没技术来完成第二抗体的渗透。将组织浸没在第二抗体的染色液中，耗时大约1星期。组织显示了100％的染色剂渗透。
实施例2
按照本发明中的上述实施例1中用于制备染色样品的方法来制备人肾组织样品以进行检测。由于不同组织类型的染色剂不同，因而我们做了一种尝试来制备肾组织皮质样品，然而组织类型有稍微的变化。样品的组织类型在表1中给出。
如实施例1中所描述的，利用第一抗体Novocastro抗-CD34进行组织电泳，只是对电压和时间做了一下变动。电压设定在100、200和300V，而电泳时间为3、6、12和24小时。
电泳一步完成后，将组织样品取出，并对抗体渗透程度进行评估。样品用TRIS-HCL缓冲液(0.5M，pH7.5，3X，10min)漂洗并且利用OCT将其冷冻在低温恒温器中。然后切下大约4微米的薄栓以进行下面的第二中抗体和着色剂处理。利用Vector Red进行检测。
每一种样品都要进行染色程度评估，结果在表1中有示。具有相同样品号的样品表示这些组织样品是从同一个样品块中切下来的。
对组织切片的总染色百分比、不足染色的比率、过量染色的比率以及良好染色的比率进行评估。总染色百分比通过观察染色方向上的样品，也即电泳管长轴来确定。将沿长轴的染色记录下来并包括在总染色中。不足染色表示可以观察到对组织的轻微染色，但这种染色又不足以作为合适的染色的情况。可观察到非特异性或空隙染色的情况就认为是对样品的过量染色。良好染色样品就是那些在组织中可观察到对于抗原结合的特异性染色，而这些染色水平又足以进行成像。结果在表1中有报告。表1
| 样品号 | 组织类型 | 时间(h) | 电压 | 总染色百分比 | 不足染色百分比 | 过量染色百分比 | 良好染色百分比 |
| 3a | C | 3 | 100 | 100 | 5 | 10 | 85 |
| 3b | C | 3 | 100 | 95 | 15 | 10 | 70 |
| 12a | C | 3 | 100 | 100 | 0 | 10 | 90 |
| 12b | C | 3 | 100 | 90 | 10 | 5 | 75 |
| 22a | C | 3 | 100 | 100 | 10 | 10 | 80 |
| 22b | C | 3 | 100 | 100 | 20 | 0 | 80 |
| 26a | C | 3 | 100 | 100 | 10 | 5 | 85 |
| 样品号 | 组织类型 | 时间(h) | 电压 | 总染色百分比 | 不足染色百分比 | 过量染色百分比 | 良好染色百分比 |
| 26b | C | 3 | 100 | 100 | 10 | 0 | 90 |
| 52a | J | 3 | 100 | 100 | 10 | 0 | 90 |
| 52b | C | 3 | 100 | 80 | 0 | 5 | 75 |
| 55a | J | 3 | 100 | 100 | 10 | 5 | 85 |
| 55b | C | 3 | 100 | 100 | 5 | 5 | 85 |
| 1a | J | 3 | 200 | 30 | 5 | 10 | 15 |
| 1b | J | 3 | 200 | 30 | 5 | 10 | 15 |
| 11a | C | 3 | 200 | 80 | 50 | 10 | 20 |
| 11b | C | 3 | 200 | 50 | 15 | 5 | 30 |
| 13a | C | 3 | 200 | 45 | 10 | 5 | 30 |
| 13b | C | 3 | 200 | 35 | 15 | 5 | 15 |
| 2a | C | 3 | 300 | 30 | 5 | 5 | 20 |
| 2b | M | 3 | 300 | 50 | 15 | 10 | 25 |
| 21a | M | 3 | 300 | 20 | 0 | 0 | 20 |
| 21b | J | 3 | 300 | 20 | 5 | 5 | 10 |
| 37a | C | 3 | 300 | 35 | 5 | 5 | 25 |
| 37b | M | 3 | 300 | 35 | 10 | 0 | 25 |
| 24a | C | 6 | 100 | 90 | 30 | 15 | 45 |
| 24b | C | 6 | 100 | 100 | 0 | 10 | 90 |
| 48a | C | 6 | 100 | 85 | 20 | 20 | 45 |
| 48b | C | 6 | 100 | 100 | 0 | 20 | 80 |
| 54a | C | 6 | 100 | 80 | 25 | 20 | 35 |
| 54b | C | 6 | 100 | 100 | 0 | 10 | 90 |
| 61a | C | 6 | 100 | 75 | 20 | 15 | 40 |
| 样品号 | 组织类型 | 时间(h) | 电压 | 总染色百分比 | 不足染色百分比 | 过量染色百分比 | 良好染色百分比 |
| 61b | J | 6 | 100 | 100 | 10 | 15 | 75 |
| 18a | J | 6 | 200 | 90 | 35 | 25 | 30 |
| 18b | C | 6 | 200 | 100 | 20 | 10 | 70 |
| 19a | J | 6 | 200 | 100 | 5 | 30 | 65 |
| 19b | C | 6 | 200 | 100 | 15 | 35 | 50 |
| 64a | C | 6 | 200 | 80 | 20 | 10 | 50 |
| 64b | J | 6 | 200 | 90 | 25 | 15 | 50 |
| 4a | M | 6 | 300 | 90 | 65 | 10 | 15 |
| 4b | C | 6 | 300 | 40 | 15 | 5 | 20 |
| 9a | M | 6 | 300 | 95 | 70 | 10 | 15 |
| 9b | C | 6 | 300 | 40 | 20 | 5 | 15 |
| 65a | M | 6 | 300 | 55 | 25 | 5 | 25 |
| 65b | C | 6 | 300 | 45 | 20 | 5 | 20 |
| 23a | J | 12 | 100 | 100 | 5 | 25 | 70 |
| 23b | C | 12 | 100 | 100 | 0 | 30 | 70 |
| 51a | C | 12 | 100 | 100 | 0 | 25 | 75 |
| 51b | C | 12 | 100 | 100 | 0 | 25 | 75 |
| 59a | C | 12 | 100 | 100 | 0 | 20 | 80 |
| 59b | C | 12 | 100 | 100 | 0 | 60 | 40 |
| 62a | C | 12 | 100 | 100 | 0 | 40 | 60 |
| 62b | C | 12 | 100 | 100 | 0 | 50 | 50 |
| 10a | J | 12 | 200 | 70 | 30 | 0 | 40 |
| 29a | C | 12 | 200 | 60 | 0 | 0 | 60 |
| 56a | C | 12 | 200 | 100 | 0 | 0 | 100 |
| 样品号 | 组织类型 | 时间(h) | 电压 | 总染色百分比 | 不足染色百分比 | 过量染色百分比 | 良好染色百分比 |
| 58a | J | 12 | 200 | 70 | 30 | 0 | 40 |
| 32a | J | 12 | 300 | 65 | 15 | 10 | 40 |
| 32b | M | 12 | 300 | 50 | 20 | 15 | 15 |
| 36a | M | 12 | 300 | 70 | 30 | 25 | 15 |
| 36b | M | 12 | 300 | 30 | 5 | 20 | 5 |
| 42a | M | 12 | 300 | 65 | 25 | 25 | 15 |
| 42b | M | 12 | 300 | 45 | 10 | 15 | 20 |
| 5a | C | 24 | 100 | 100 | 20 | 30 | 50 |
| 5b | C | 24 | 100 | 100 | 0 | 35 | 65 |
| 27a | C | 24 | 100 | 100 | 20 | 40 | 40 |
| 27b | C | 24 | 100 | 100 | 10 | 30 | 60 |
| 40a | C | 24 | 100 | 100 | 10 | 20 | 70 |
| 40b | C | 24 | 100 | 100 | 0 | 25 | 75 |
| 43a | C | 24 | 100 | 100 | 5 | 10 | 85 |
| 43b | C | 24 | 100 | 100 | 10 | 50 | 40 |
| 7a | C | 24 | 200 | 95 | 10 | 50 | 35 |
| 7b | J | 24 | 200 | 80 | 10 | 25 | 45 |
| 33a | C | 24 | 200 | 95 | 15 | 55 | 25 |
| 33b | C | 24 | 200 | 80 | 15 | 30 | 35 |
| 34a | C | 24 | 200 | 85 | 15 | 50 | 20 |
| 34b | C | 24 | 200 | 85 | 15 | 25 | 45 |
| 14a | C | 24 | 300 | 50 | 15 | 25 | 10 |
| 14b | C | 24 | 300 | 70 | 30 | 20 | 20 |
| 15a | C | 24 | 300 | 50 | 15 | 15 | 20 |
| 样品号 | 组织类型 | 时间(h) | 电压 | 总染色百分比 | 不足染色百分比 | 过量染色百分比 | 良好染色百分比 |
| 15b | C | 24 | 300 | 50 | 10 | 10 | 30 |
所有的样品都显示沿着组织样品的外缘有非电泳染色，然而这样染色是非常少的。结果表明随着时间的延长多至1小时，染色剂的渗透倾向于提高。有意思的是，最好的染色剂渗透作用是在较低电压为100V的条件下观察到的。这可能是由于较高电压的容量次级效应(capacifance secondary effect)造成的。每次电泳的时间和电压的平均值在表2中有示。
表2特定时间和电压下的染色剂渗透百分比
本发明中的以上描述的目的只不过是说明本发明的特定实施方案和方面。对本领域中的熟练技术人员来讲，其他的实施方案是显而易见的，并且也包括在本发明的范围之内，这些将在下面的 中提出
Claims (21)
1.生物样品的一种en boc染色方法，该方法包括以下步骤：
(a)将样品浸入染色液中，这种染色液含有一种离子导电溶液以及一种与样品组分相结合的带电染色剂前体或染色剂分子，
(b)施加穿越染色液的电场，其中第一抗体渗透入样品中。
2.权利要求1中的方法，其中染色剂前体是选自由抗体、核酸探针和外源凝集素组成的组中。
3.权利要求1中的方法，其中的染色剂分子含有一种标记的载体分子，该载体分子是选自包括抗体、核酸探针和外源凝集素在内的组中，并且该标记染色剂含有一个可在样品中产生颜色的组分。
4.权利要求3中的方法，其中的标记包括荧光探针。
5.权利要求3中的方法，其中的染色剂分子包括可反应生成永久着色产物的酶。
6.权利要求2中的方法，其中的染色剂前体是第一抗体。
7.权利要求6中的方法，进一步包括下列步骤：
(a)将会有第一抗体的样品浸入染色液中，这种染色液含有一种离子导电溶液以及与第一抗体结合的带电第二抗体。
(b)施加穿越染色液的电场，
籍此，第二抗体渗透入样品中。
8.权利要求6中的方法，进一步包括下面步骤：
将含有第一抗体的样品浸没在含有可与第一抗体相结合的第二抗体的溶液中。
9.权利要求7或8中的方法，其中第二抗体是被标记的，该标记包括可在样品中产生颜色的组分。
10.权利要求9中的方法，其中的标记包括荧光探针。
11.权利要求9中的方法，其中的染色剂分子包括可反应生成永久性着色产物的酶。
12.权利要求1中的方法，进一步包括下面的步骤：
在将样品在染色液中浸没之前用凝胶支持物对样品进行渗透。
13.权利要求12中的方法，其中的凝胶支持是选自包括琼脂糖和聚丙烯酰胺的组中。
14.权利要求1中的方法，其中染色液在窄槽中，并且样品基本上占用了且适应于槽的截面积。
15.权利要求1中的方法，其中应用的电压为100-400V。
16.权利要求15中的方法，其中应用的电压为50-700V。
17.权利要求1中的方法，其中电场维持时间为1-25小时。
18.权利要求1中的方法，其中电场维持时间为3-15小时。
19.权利要求1中的方法，其中染色液包括染色剂前体和染色剂分子或两种染色剂前体。
20.权利要求19中的方法，其中染色剂前体导入样品的第一面的染色液中，而染色剂分子或第二种染色剂前体则导入与第一面相对的、样品的另一面的染色液中；该染色剂前体和该染色剂分子或第二种染色剂前体要选那些在电场中以相反方向移动的那些。
21.一种可减少切片组织中的未结合染色剂分子的数量的方法，该方法包括下列步骤：
(a)将组织样品浸入染色液中，这种染色液含有一种离子导电溶液以及一种与样品组分相结合的染色剂前体或带电染色剂分子，
(b)施加穿越染色液的电场，
借此使染色剂前体渗透入样品中，未结合染色剂前体从样品中迁移。
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