CN1365365A - 制备活性炭-gm1络合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供制备在不同pH条件下稳定的吸附活性炭-GM1络合物的方法。该方法基于被例举的悬浮液配制方法。本发明也公开了使用高效液相层析测定水溶液中的未衍生的GM1的分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及活性炭-GM1络合物的制备方法和设计用来通过高效液相色谱法(HPLC)测定在水溶液中未衍生的GM1的分析方法。
该络合物可以用作霍乱治疗中的辅助剂,它中和相应的毒素[STOLL等《柳叶刀》(Lancet),p.888-891,1980]。而且,体外试验证明它可能作为亚铁离子中毒的解毒剂。
为了评定制备活性炭-GM1络合物的方法的效率,已经发展了使用分析未衍生形式的神经节苷脂的新的溶剂系统,通过HPLC测定GM1的分析方法。
该等浓度系统可有利地对实施文献所述的方法进行分析。
得到本申请公开的活性炭-GM1络合物的方法被开发用于寻求在胃肠道pH条件下得到的产品的稳定性,由此促进它的安全性。
背景技术领域
导致肠道感染的细菌,导致腹泻,痢疾和伤寒,是引起严重的健康问题的原因[BLACK.,R.E.,BROWN,K.H.,BECKER,S.,ALIM,A.R.M.A..HUQ,I.《美国流行病学杂志》(Am.J.Epidemiol.),v.115,p.315-324,1982]。
这类最重要的病理当中,我们使用霍乱,由来自革兰氏阴性细菌霍乱弧菌01的肠毒素作用产生的病理症状。与小肠近端部分的粘液良好结合的微生物生产了这些毒素[LEVINE,R.,KAPER,J.B,BLACK,R.E.,CLEMENTS,M.L.,《微生物学研究》(Microbiol.Rev.),v.47,n.4,p.510-550,1983]。
这些毒素呈现为由相同的5个较小的亚单位(亚单位B)形成的环平面分离的亚单位A。它的分子量大约为84,000,各亚单位B分子量当量为11,000,亚单位A被分成A1(PM=24,000)和A2(PM=5,000)[LEVINE,R.,KAPER,J.B.,BLACK,R.E.,CLEMENTS.M.L.《微生物学研究》(Microbiol.Rev.),v.47,n.4,p.510-550,1983]。
B五聚体与肠上皮细胞膜中的GM1神经节苷脂有关[SUREWICZ,W.K.,LEDDY,J.J.,MANTSCH,H.H.《生物化学》(Biochemistry),v.29,p.8106-8111,1990]。亚单位A被插入细胞质中,从而释放A1片断,激活潜在的腺苷酸-环化酶。结果迅速增加环-AMP的产生[LEVINE,R.,KAPER,JB.,BLACK,R.E.,CEMENTS,M.L.Microbiol.Rev.,v.47,n.4,p.510-550,1983]。这些及其他因素的结果为肠腔中盐和水过度积聚以及细胞死亡[FIELD,M.,RAO,M.C.,CHANG,E.B.,N.Engl.J.Med.,v.321,p.800-806,1989].
神经节苷脂-GM1为霍乱毒素的特异受体[WU,G.,LEDDEN,Anal R.《生物化学》(Biochem.),v.173,p.368-375.1988]。GM1亦称单唾液酰神经节苷脂,属于glicosphingolipids类,由于唾液酸的存在而与该类其他组分区别(与其他神经节苷脂一起)[HADJICONSTANTIONOU.M.,NEFF,N.H.《神经化学杂志》(J.Neurochem.),v.70,n.4,p.1335-1342,1998]。
如下文所示,它的结构显示疏水和亲水区域。第一部分由鞘氨醇和硬脂酸构成的神经酰胺组成以及亲水部分由唾液酸寡糖链表示。这些特征可以提供胶粒的构造,人们相信唾液酸(sialic)片段与具有毒素的神经节苷脂的活性有关。
鉴于它的霍乱毒素特性,GM1能通过中和肠腔中的毒素用于治疗毒性感染。这已由STOLL等在开发活性炭-GM1吸附性络合物时试验[STOLL等《柳叶刀》,p.888-891,1980]。尽管这样,应当指出,该作者引用的得到该络合物的方法并未公开,并且该络合物的流程的稳定性的研究也未公开。因此,在该文献中未公开获得该络合物的方法,上述工作集中于通过该络合物产生有益的治疗的分析或霍乱常规治疗的分析上。
目前,霍乱治疗包括抗菌治疗的消毒,疫苗的应用,以及减轻由感染所引起的症状的不同方法。在这方面,络合物的使用是该治疗的重要的补充。
针对该化合物应用的安全性,开发使用它的在类似于胃肠道中的pH值的环境下同样稳定的方法是必不可少的。这特别是由于在肠细胞膜中掺入GM1通过增加受体的数目而增加了对霍乱毒素的生物反应[HOLMGREN,J,LONNROTH,J,SVENNERHOLM,L.《美国国家科学院报》(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)72,p.2520-2524,1975]。
为了实施制备活性炭-GM1络合物的方法,显然人们应该分别确定该络合物、活性炭和GM1的基本组分的数量和纯度。
因此本发明也包含测定水溶液中的GM1的新方法。
上述的技术已经使用梯度洗脱系统的HPLC,有时将受设备产生的限制。
下列表1概括了文献中公开的方法。
表1-非衍生的神经节苷脂的色谱分析参数。文献中公开的分析方法
(HPLC)的比较表。
柱 溶剂系统 λ(探测) 平均分析 参考文献(compr.XD.l.x D.part.) (等浓度的/梯度的) 时间
胺柱 乙腈-缓冲液 215nm 80min GAZZOT等3(LiChrosorb-NH2) 磷酸盐5mM,pH(25cm×4mm×7μm) 5,6
(梯度)
硅(aquasil SS- 正已醇-异 208nm 25min ANDO等1
542N) 丙醇-氯化钾(20cm×6mm×5μm) 5mM
(梯度)
硅(aquasil SS- 乙腈-异丙醇 208min 30min ANDO等2
542N) -氯化钾(20cm×6mm×5μm) 50mM
梯度
胺柱 乙腈-dissodic 215nm 1h 20min PREVITI等4(LiChrosorb-NH2) 磷丙盐,磷酸缓冲液(25cm×4mm×5μm) Ph5,6
梯度
1-ANDO,S.,WAKI,H.,K.ON,High-performance liquidchromatography of undenvatized gangliosides(未衍生的神经节苷脂的高效液相层析).《色层学杂志》J.Chromatogr.,Amsterdam,v.408,p.285-290,1987。
2-ANDO,S.,WAKI,H.,KON,K..New solvent system for high-performance thin-layer chromatography and hagh-performance liquidchromatography of gangliosides(神经节苷脂的高效薄层层析和高效液相层析).《色层学杂志》(J.Chromacogr.),Amsterdam,v.405,p.125-134,1987。
3-GAZZOTI,G.,SONNINO,S.,GHIDONI,R.Normal-phase high-performance liquid chromatography separation of non-derivatizedganglioside mixtures(非衍生的神经节苷脂的正常相位高效液相层析分离).《色层学杂志》(J.Chromatogr.),Amsterdam,v.348,p.371-378,1985
4-PREVITI,M.,DOTTA,M,PONT1ERI,G.M.,DiMAR1O,U.,LENTI,L.,Determination of gangliosides by high-performance liquidchromatography with photodiode-array-detection(通过光电二极管矩阵检测的高效液相层析测定神经节苷脂).《色层学杂志》(J Chromatogr.),Amsterdam,v.605,p.221-225,1992。
可以证实上表中显示的技术中的分析时间的差异在20分钟到1小时20分钟内变化。上述方法的保留时间大约为8分钟。
此外,可以从文献公开的新方法看见,下文中本发明提供的无梯度展开方法,即利用单一流动相(单一组合物),具有相应的技术优势。
活性炭是一种医疗实践,特别是毒理学领域人们经常使用的吸附剂。
在其效率中pH是一个重要因素[ROIVAS,L.,NEUVONEN,P.J,《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci.),v.81,n.9,p.917-919,1992],这加强了证实络合物对pH值的反应和寻找GM1吸附中具有最大效率的条件的重要性。
尽管通过利用活性炭可以引导预防药理学试剂和毒素的选择[BYERLY,W.G,Am.Pharm,V.NS32,n.7,p.36,1992],但是其解毒活性的主要的限制在于对阳离子,例如亚铁离子的吸附无效。
包含铁的制剂的偶然的摄取是常见的,这在儿科学中是严重的问题。按照ENGLE等的研究[ENGLE,J.P.,等,Drug Intell.Clin.Pharm.,v.21,p.153-159,1987],每年报到大约2,000例铁离子中毒的儿童,因此铁摄取在小儿科是最常见的摄取问题。按照上述文献,尽管频繁发生铁中毒,但还没有普遍接受的方案用于摄取中毒量铁的患者。
在这方面,通过建议方法得到的络合物的解毒潜能,如通过体外试验证明的,是可以被选择用于亚铁离子中毒的重要的原因。
发明概要
本发明的目的是提供用于制备活性炭GM1络合物的新方法,该方法的特征包含下列步骤:
(a)制备由0到0.9%氯化钠,0到0.03%磷酸二氢钠-2H2O,和0到0.4%磷酸氢二钠-12H2O,溶于蒸馏水,组成的稀释溶液(A);
(b)用一部分溶液(A)溶解足够量的GM1,使神经节苷脂的浓度范围为0.2到4.0%,得到新溶液(B);
(c)将活化的活性炭悬浮在另一部分溶液(A)中,比率为1∶3到1∶7w/v,开始并且维持5到15分钟的适度的搅动;
(d)在搅动下,慢慢地加入足够量的溶液(B),以获得范围在1∶100到1∶10之间变化的比例(GM1∶活性炭),维持搅动10到20分钟;
(e)过滤该悬浮液,用溶液(A)漂洗该络合物并且干燥;以及,
(f)使干燥的络合物通过40“目”筛,将产品在密封的容器中放置。
在优选方案中,本发明的特征为:
在步骤(a)的稀释溶液(A)中,氯化钠的浓度是0.800%,磷酸二氢钠的浓度是0.025%,磷酸氢二钠的浓度是0.300%;
步骤(b)的溶液(B)中,溶液(A)中的GM1的浓度为2.000%;
在步骤(c)中,悬浮在溶液(A)中的活性炭比率为1∶5w/v,开始并且维持15分钟的适度搅动;
在步骤(d)中,搅动的同时慢慢地加入比率相当于1∶100(GM1∶活性炭)的溶液“B”,继续搅动20分钟;以及,
步骤(e)中的干燥在40℃的温度下进行24小时。
本发明的目的也在于提供一种通过HPLC测定水溶液中未衍生的GM1的新的分析方法,其特征为使用由氯化钾/乙腈组成的流动相的等浓度的溶剂系统。
在优选的本发明方法中,流动相由0.1M氯化钾/乙腈(65∶35)组成。
最后,本发明也包括以数个体外试验为基准的,该络合物作为亚铁离子中毒解毒剂的应用远景的研究。
发明的详细说明
测定GM1的分析方法
利用配备具有250°L“环形(looping)”的Rheodyne计量器,以及与收集系统结合在一起的,具有控制和数据效果的“二极管阵列”检波器的Hewlett-Packard色谱仪,型号HP 1090M series 2,使用HPLC技术测定GM1容量(溶液(B))。流动相由0.1M(65/35,v/v)氯化钾/乙腈组成,使用LiChrosorb柱NH2HPLC(250mm×4.6mm×5μm)。流速选择为1mL/分钟,检测波长相当于210nm。在分析条件下,设备稳定周期为60分钟。
该方法被证实和已经证明在1.50μg和6.04μg GM1之间具有完全可接受的线性(r=0.9997),显示相对标准偏差低于0.700%的复制性,精确度和准确度分别在0.230-1.280%和97.930-103.440%之间变化(一天内或两天之间的测定(assays infra and inter-days))。
检测极限和量化适于建议的目的,计算值分别为0.2518μg和0.4689±0.0265μg GM1。
通过使用高效液相层析技术,使用用于未衍生GM1测定的非常用的溶剂系统开发的方法显示比文献中现有技术多数个优点。这样的方法使用梯度洗脱系统,分析时间在25到80分钟之间(表1),建议的方法使用等浓度的系统,保留时间大约8分钟,它的实施简单化,显著地降低分析成本。
活性炭-GM1络合物制备方法
作为本发明目的的方法,包括下列步骤:
开始,制备稀释溶液(A),由至多0.900%氯化钠,至多0.030%磷酸二氢钠-2H2O,至多0.400%磷酸氢二钠-12H2O组成,以及用蒸馏水加到溶液的100.000%。
将GM1(TRB Pharma)溶于溶液(A),使浓度在0.200%到4.000%之间变化,产生新的溶液(B)。
在适当的容器中,将活性炭按1∶3-1∶7w/v的比例悬浮在溶液(A)中,以及维持适度的搅动5-15分钟。该步骤后,在搅动下慢慢地加入溶液“B”。搅动维持10-20分钟。
使用What nan纸滤器42过滤该悬浮液,用大约25%体积的溶液(A)洗涤该络合物。
然后干燥(40℃/24h)该络合物,干燥时,使它通过40“目”筛,以及装入密封的容器。
吸附方法效率的研究
活性炭吸附GM1的方法的效率可通过分析滤液中的神经节苷脂的含量校验。滤液中GM1的量与该方法的效率成反比。
按照上述公开的方法测定,滤液中无GM1,显示该络合物的最低效率为98%。
该络合物在不同pH水平的稳定性的研究
络合物稳定性试验在1.3;7.0以及8.3的pH水平进行。将络合物在各溶液中保持20分钟,然后用纸过滤。测定进行三次,滤液中无GM1,显示了该络合物在这样的条件下的稳定性。
制备pH1.2的HCl溶液,在溶解装置中的4个立方体加入300mL该溶液,搅拌开始。
使用的速度为100rpm,平均温度为37℃,一旦系统建立平衡,即将该络合物加入装置的3个立方体中,第四个立方体留作用于对照组活性炭的加入。
在该实验条件下,将该络合物在酸性介质中保持20分钟,随后将其通过纸过滤。
检测滤液中的GM1。GM1的浓度与络合物的稳定性成反比。
在碱性介质(O.18M NaHCO3溶液-pH=8.2)和蒸馏水以及脱气水中重复该测定。
本试验产生的滤液中不存在GM1表明,在实验条件下,该络合物在所研究pH值下的稳定性。
络合物在其中具有最佳稳定性的条件为:
稀释溶液(A):
氯化钠 0.800%磷酸二氢钠-2H2O 0.025%磷酸氢二钠-12H2O 0.300%蒸馏水 q.s.p.100%GM1溶液(B):神经节苷脂GM1 2.000%稀释溶液(A): q.s.p.100.0%
活性炭必须按1∶5w/v的比例悬浮在溶液A中,开始以及维持适度的搅动5分钟。在搅动下,按照选定的比例(见实施例),慢慢地加入溶液(B),搅动20分钟。
过滤该悬浮液,使用大约25%体积的用于该方法的溶液(A)洗涤该络合物,使其干燥(40℃/24hours)。将该络合物通过40“目”筛,装入密封的容器。
下列为实施本发明方法的实施例。这样的实施例作为说明加入,但是它们不限制本发明的范围。
实施例
加入盐可以防止胶粒形成。因此,如下面配方所列举,它们可以存在可变的浓度:
实施例I
溶液(A):
氯化钠 0.800%
磷酸二氢钠-2H2O 0.025%
磷酸氢二钠-12H2O 0.300%
神经节苷脂GM1 0.020%
活性炭-GM1络合物
活性炭 100份
GM1 1份
实施例II
溶液(A):
氯化钠 0.800%
磷酸二氢钠-2H2O 0.025%
磷酸氢二钠-12H2O 0.300%
神经节苷脂GM1 0.020%
活性炭-GM1络合物
活性炭 50份
GM1 1份
实施例III
溶液(A):
氯化钠 0.800%
磷酸二氢钠-2H2O 0.025%
磷酸氢二钠-12H2O 0.300%
神经节苷脂-GM1 0.020%
活性炭-GM1络合物
活性炭 10份
GM1 1份
在铁,纯活性炭以及活性炭-GM1络合物之间相互作用能力的鉴定
我们注意到活性炭-GM1络合物呈现用作亚铁离子中毒解毒剂的可能性。
按照以下描述,这样的结论来自体外试验的结果。
采用的方法由FAVIN等的方法修改[FAVIN,F.D.等,Clin.ToxicoL,NewYork.v.26,n.7,p.443-450,1988],用硫酸亚铁-7H2O制备的溶液,在容积为1L的测定容积的球形瓶中加入2.50g盐,用蒸馏水补充至所需体积。
在3个250ml的烧杯中,加入100mL得到的溶液,加入1.00g活性炭-GM1络合物。使用FANEM磁性搅拌器,将该悬浮液保持搅动15分钟,随后用纸过滤。使用纯活性炭重复该步骤。
使用盐酸溶液(pH=1.2)重复上述步骤。不使用碱性介质(碳酸氢钠),这是由于铁在该媒介中不溶解。
对滤液进行铁分析。
使用原子吸收分光光度测定技术测定滤液中的铁。样品被稀释到2ppm到20ppm的浓度。事实上,样品被精确稀释100倍,最高浓度预见为5ppm。
注射铁浓度为2.5ppm到15ppm变化的硝酸铁-9H2O标准溶液,精心制作校准曲线。进行线性回归分析,得到该直线的公式。同法测定三次。结果如下:
IRON(ppm(DPR))
酸(pH=1.2) 水0(对照) 554.00(1.990%) 439.00(2.330%)活性炭 562.00(0.890%) 384.00(2.340%)活性炭GM1 450.00(0.670%) 332.00(3.220%)
Claims (4)
1.制备活性炭-GM1络合物的方法,其特征为包括下列步骤:
(a)制备由0到0.900%氯化钠,0到0.030%磷酸二氢钠-2H2O,和0到0.400%磷酸氢二钠-12H2O,溶于蒸馏水,组成的稀释溶液(A);
(b)将GM1溶解于一部分溶液(A)中,使浓度为0.200到4.000%,得到新溶液(B);
(c)将活性炭悬浮在另一部分溶液(A)中,比率为1∶3到1∶7w/v,开始并且维持5到15分钟的适度的搅动;
(d)在搅动下,慢慢地加入足够量的溶液(B),使比例范围为1∶100和1∶10(GM1∶活性炭),维持搅动10到20分钟;
(e)过滤该悬浮液,用溶液(A)洗涤该络合物并且干燥;以及,
(f)使干燥的络合物通过40“目”筛,在密封的容器中存储该产品。
2.按照权利要求1的方法,其特征为:
在步骤(a)的稀释溶液(A)中,氯化钠的浓度是0.800%,磷酸二氢钠的浓度是0.025%,磷酸氢二钠的浓度是0.300%;
在步骤(b)的溶液(B)中,溶液(A)中的GM1的浓度为2.000%;
在步骤(c)中,将活性炭悬浮在溶液(A)中,比率为1∶5w/v,开始并且维持15分钟的适度搅动;
在步骤(d)中,在搅动下,慢慢地加入等于比例为1∶100(GM1∶活性炭)的溶液(B),维持搅动20分钟;以及
在步骤(e)中,在40℃的温度下干燥24小时。
3.使用高效液相层析测定水溶液中未衍生的GM1的分析方法,其特征为使用由乙腈/氯化钾组成的流动相的等浓度溶剂系统。
4.按照权利要求3的方法,其特征为由0.1M乙腈/氯化钾(65∶35)组成流动相。
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