CN1371424A

CN1371424A - 可活化的重组神经毒素

Info

Publication number: CN1371424A
Application number: CN00812009A
Authority: CN
Inventors: J·O·多利; Y·李; K·C·陈
Original assignee: Allergan Sales LLC
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 1999-08-25
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2002-09-25
Anticipated expiration: 2020-08-25
Also published as: EP2267009A2; US7709228B2; EP2267010B1; US20090069238A1; US20080081355A1; US7959933B2; ATE348178T1; AU777556B2; EP2267009A3; US8071110B2; CN1214114C; US7419676B2; US8273358B2; US20090081730A1; US20080182294A1; ES2277854T5; EP2267010A3; DE60032367T3; US20090087458A1; EP1700918B1

Abstract

包含可激活的重组神经毒素和由其衍生的多肽。本发明也包括编码这些多肽的核酸,以及产生这些多肽和核酸的方法。

Description

可活化的重组神经毒素

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求1999年8月25日提交的临时申请No.60/150,710的优先权，在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及在神经生物、分子生物和医学领域有用的方法和组合物，以及生产潜在毒性治疗剂及其衍生物的方法。本发明也涉及重组梭菌神经毒素(特别是肉毒杆菌毒素)、其修饰本、以及为用作治疗剂、转运蛋白分子、加合物等而构造这些分子的方法。

发明背景

神经毒素，如从肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)获得的神经毒素，在为治疗目的在神经细胞和其它细胞中运送时是这些细胞的高能和特异性毒药。这些革兰氏阳性细菌表达两个相关但不同的毒素类型，每种包含两个由二硫键连接的氨基酸链：一条约50KDa的轻链(L)和一条约100KDa的重链(H)，它们全权负责这些疾病的症状。全毒素在体内以单链合成，然后在翻译后修饰中被切割，形成包含分开的L和H链的活性神经毒素。

破伤风和肉毒杆菌毒素是已知对人最致死的物质之一，对人的致死剂量在每千克体重0.1ng到1ng之间。Tonello et al.，Adv.Exp.Med. & Biol.389：251-260(1996)。两种毒素都通过抑制所影响神经元中的神经递质释放而起作用。破伤风神经毒素(TeNT)主要作用于中枢神经系统，而肉毒杆菌毒素(BoNT)作用于神经肌肉接头和周围神经系统的其它胆碱能突触；两者都是通过抑制从所影响神经元的轴突到突触的神经递质释放，产生麻痹。

已知破伤风神经毒素(TeNT)以一种免疫学独特的类型存在；已知肉毒杆菌神经毒素(BoNT)有7种不同的免疫类型，命名为BoNT/A到BoNT/G。而所有这些类型都是由肉毒梭菌的分离株产生，另外两种细菌，巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)也分别产生类似于/F和/E的毒素。见例如Coffield et al.，The Site andMechanism of Action of Botulinum Neurotoxin in Therapy withBotulinum Toxin 3-13(Jankovic J.& Hallett M.Eds.1994)，在此引入其公开内容作为参考。

不考虑类型，中毒的分子机制是相似的。在此过程的第一步中，毒素通过重链(H)和细胞表面受体之间的相互作用与靶神经元突触前膜结合；认为每种类型肉毒杆菌毒素的受体是不同的，见TeNT.Dollyet al..Seminars in Neuroscience 6：149-158(1994)，在此引入作为参考。重链的羧基端对于毒素定向于细胞表面表现得很重要。

在第二步中，毒素跨过中毒细胞的质膜。首先由细胞通过受体介导的胞吞吞噬毒素，形成含有毒素的内体。然后毒素离开内体进入细胞质。最后一步认为是由H链的氨基端介导的，它应答约5.5或更低的PH值而触发构象改变。已知内体具有降低内体内部pH的质子泵。构象改变暴露了毒素的疏水基团，允许毒素将其自身包埋于内体膜内。然后毒素通过内体膜移位到胞质中。

肉毒杆菌毒素活性的最后一步表现为涉及连接H和轻(L)链的二硫键的还原。肉毒杆菌和破伤风毒素的全部毒性包含在全毒素的L链中；L链为一种锌(Zn⁺⁺)内肽酶，它选择性剪切在神经递质小泡识别和对接质膜胞浆面以及小泡与质膜融合中起关键作用的蛋白。TxNT，BoNT/B，BoNT/D，BoNT/F和BoNT/G导致一种突触小泡蛋白(也称作小泡相关膜蛋白(VAMP))的降解。作为这些酶切事件的结果，VAMP的大多数从突触小泡表面伸出的胞质结构域被去除。每种毒素(除TeNT和BoNT/B)特异性切除不同的键。

BoNT/A和/E选择性剪切质膜相关蛋白SNAP-25；这种也被BoNT/C1剪切的蛋白(Foran et al.，Biochem.35：2630-2636(1996))绝大部分与质膜的胞浆面结合并出现在质膜的胞浆面。BoNT/C剪切突触素，即一种大部分体积暴露于胞质的内在蛋白。突触素在突触前端活性区与钙通道相互作用。见Tonello et al.，Tetanus and Botulinum Neurotoxins in intracellular ProteinCatabolism 251-260(Suzuki K.& Bond J.eds.1996)，在此引入其公开内容作为本说明的一部分参考。

TeNT和BoNT都在神经肌肉连接处吸收。BoNT保持在外周神经元内并阻断神经递质乙酰胆碱从这些细胞释放。通过它的受体，TeNT进入以逆行方式沿轴突移动到胞体的小泡并释放到运动神经元和脊髓抑制性神经元之间的突触间隙。在此位点，TeNT与抑制性神经元的受体结合，再次被内化，轻链进入胞质从而阻断抑制性神经递质4-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸从这些细胞的释放。

由于其特异性定位作用，从1981年开始将微量BoNT作为治疗张力失常，包括斜视(眼失调)、bephlarospasm(不自主性眨眼)和半面痉挛患者的治疗剂。见如Borodic et al，Pharmacology andHistology of the Therapeutic Application of Botulinum Toxinin Therapy with Botulinum Toxin 119-157(Jankovic J.& Halletteds.1994)，在此引入作为参考。在七种毒素类型中，BoNT/A是BoNTs中功能最强的并且是最容易鉴定的。用小量BoNT/A肌内注射到痉挛组织已经有效用于治疗脑损伤、脊髓损伤、卒中、多发性硬化和脑瘫引起的痉挛。麻痹的程度取决于运送到靶位点的剂量和体积。

尽管L链是负责神经中毒的部分，为产生毒性必需将它运送到神经细胞浆。同样，单链全毒素前体显示相对低的毒性，直到在它们的H和L之间的暴露环区中的一个或更多肽键处将其剪切并产生全活性的成熟神经毒素。如前面提供的机制中所提示的，每种神经毒素的H链对细胞受体结合和胞吞是关键的，而毒素移位到胞浆中同时需要L和H链(以及完整二硫键)。如上面所提示的，L链单独负责乙酰胆碱分泌的抑制导致的毒性。

尽管梭菌神经毒素制剂有明确的疗效，此毒素的工业生产是困难的。从厌氧梭菌培养物产生神经毒素是繁琐和耗时的过程，包括涉及一些蛋白沉淀步骤及延长和重复毒素结晶或一些柱层析阶段的多步纯化方案。重要的是，产品的高毒性规定此程序必需在严格的防范措施下进行(BL-3)。在发酵过程中，折叠的单链神经毒素经过命名为切割的过程由内源性梭菌蛋白酶激活。此过程包括从单链去除约10个氨基酸残基从而产生双链形式，其中两条链通过链间二硫键保持共价连接。

被切割的神经毒素比未切割形式活跃得多。切割的量和精确位置随产生毒素的细菌的血清型而改变。单链神经毒素激活和切割毒素产量的不同是由于某种菌株产生的蛋白水解活性类型和量的改变。例如，99％以上的A型肉毒梭菌单链神经毒素由Hall A肉毒梭菌株激活，而B和E型菌株产生较少量激活(取决于发酵时间为0到75％)的毒素。所以，成熟神经毒素的高毒性在作为治疗剂的神经毒素的商业生产中起主要作用。

所以，制造的梭菌毒素的激活程度是生产这些物质的重要考虑。如果神经毒素如BoNT和TeTx可以以高产量在迅速生长的细菌中(如异源大肠杆菌)表达为安全、容易分离并可简便转化为完全活性形式的相对无毒单链(或毒性减少的单链)，这将是一个主要优点。

由于安全成为一个主要考虑，以前的工作集中于TeTx和BoNT的单独H和L链在大肠杆菌中的表达及纯化；这些分离链自身是无毒的；见Li et al.，Biochemistry 33：7014-7020(1994)；Zhouet al.，Biochemistry 34：15175-15181(1995)，在此引入作为参考。在严格控制条件下分别产生这些肽链之后，可以用氧化二硫键结合H和L亚单位形成神经麻痹性双链。不幸的是，这种策略有一些缺陷。

首先，表达和分离大量单独链是不实际的；特别是在没有L链时，分离H链在水溶液中相当难溶并高度易受蛋白水解降解。其次，体外氧化单独表达和纯化的H和L链而产生活性双链是非常低效的，并导致活性毒素的低产量和许多无活性的不正确折叠或氧化的形式的产生。含有正确折叠和氧化的H和L链的毒素的纯化，及其从这些无活性形式和不反应的分开的H和L链中的分离是困难的。

所以，以下过程是有用和有利的：将梭菌毒素作为无活性(或低活性)单链形式表达，去除构成链的耗时和低效重构的需要，保持蛋白链的溶解性，减少蛋白错误折叠及其导致的对蛋白酶攻击的易感性，改进毒素产量，和/或提供纯化毒素的简便方法。

另外，制造这些毒素从而提供单链、修饰的有新的治疗特性和/或更长作用时间神经毒素分子，或作为可以运送治疗部分到神经或其它细胞类型的运输分子的毒性或无毒形式是非常有用的。通过将这些蛋白表达为单链，将很大程度改进这些制造蛋白的产量和纯化。

发明概述

本发明涉及含有功能性结合域、移位域和治疗域的重组和分离蛋白，其中这些蛋白也包括表达为单链之后对于体外特异性剪切敏感的氨基酸序列。这种蛋白可以包括梭菌毒素及其衍生物，如美国专利5,989,545和国际专利申请WO95/32738中所公开的，在此引入二者作为参考。

在本发明的一种实施方案中，蛋白在一条链中包含梭菌神经毒素H链的功能域和梭菌神经毒素L链的一些或全部功能，并且在H域和L域之间有插入的蛋白酶剪切位点，单链蛋白通过此位点被剪切，产生独立的链，优选由二硫键共价连接。本发明也包括产生这些蛋白并在细胞内表达它们的方法，和用于转移和表达编码这些蛋白的核酸区域的核酸载体以及含有这些载体的细胞。蛋白酶剪切位点包含选择性识别并由特异酶剪切的氨基酸序列。

在本发明的一种优选方面，被表达的单链蛋白包含梭菌神经毒素H链和L链的生物活性域。在将链结构域隔离开的内部蛋白酶剪切位点的剪切导致有完全活性的神经毒素的激活。

在本发明的另一方面，单链蛋白包含定向于运动神经元受体以外的细胞受体的结合域。这种结合域可以特异性与例如感觉传入神经元或非神经元细胞类型或组织如胰腺腺泡细胞结合。这些单链蛋白将含有与梭菌神经毒素的移位域相似的移位域，以及治疗部分。治疗部分可以是梭菌神经毒素轻链或可以是不同的治疗部分如酶、可转录核苷酸序列、生长因子、反义核苷酸序列等。

优选地，本发明的毒素和基于毒素的蛋白将被修饰为含有包含可以与靶化合物以足够高的效率结合的结合标记的额外氨基酸序列，以便促进毒素蛋白的迅速分离。含有这种结合位点的蛋白有许多并且是本领域技术人员公知的，而且可以包括，不限于，单克隆抗体，麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、蛋白A、His₆标记等。

由于这些蛋白显示了对某种化合物或化合物类型的结合选择性，可以将靶化合物固定在固体载体中，包括不限于，层析树脂或微量滴定加样孔，并用于修饰毒素的亲和纯化。然后可以用标准方法如通过高盐溶液或特异性拮抗剂洗脱毒素分子。

为将与处理神经毒素相关的危险性减到最小，本发明这方面的毒素表达为低活性(或无活性)单链前体，然后，通过精密控制的体外蛋白酶水解反应，它们被激活，优选激活到与衍生它们的天然神经毒素相同的效价水平。为改善蛋白酶剪切的效率和速度，可以将制造的蛋白酶剪切位点设计为出现在特别设计的在单氨基酸链H和L部分之间促进蛋白酶与全毒素底物可接近性的环中。

为减小由人或通常遇到的蛋白酶对毒素的无意激活的危险性，剪切位点的氨基酸序列优选设计为人体内不常出现的蛋白水解酶(人蛋白酶或出现在部分可预见的与人类接触的动物群或植物群)具有高度特异性。这种蛋白酶的非排他性的例子包括牛肠激酶，它剪切氨基酸序列DDDDK；烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶，它剪切序列EXXYXQS/G；从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyliquifaciens)得到的GENENASE^，它剪切序列HY或YH；以及从人鼻病毒3C得到的PRESCISSION^蛋白酶，它剪切氨基酸序列LEVLFQGP。前面用到的X表示任何氨基酸。本发明说明中表示的所有氨基酸序列是按照从氨基端到羧基端的方向，除非特别指明，所有核苷酸序列是从5’端到3’端(从左到右)。

在本发明的一方面，单链多肽为分离多肽。“分离”表示从其天然环境中移取。例如，对于在细胞内表达的蛋白质，分离包括制备细胞溶解产物以及随后的纯化步骤。在细胞外表达的蛋白质可以通过例如从细胞中分离上清液以及随后的纯化步骤而分离。

在本发明的另一方面，通常抗细菌和哺乳动物中蛋白酶切割的肉毒梭菌E亚型神经毒素的链间环区被修饰为包括插入的蛋白酶剪切位点，而且此环用作本发明单链毒素或修饰毒素分子的链间环区。相信使用从肉毒梭菌E亚型得到的环将稳定体内未切割毒素，使其在使用所选蛋白酶激活之前抵抗不需要的剪切。

而在本发明的另一方面，考虑了包含表达为单链多肽的BoNT/E重组形式的组合物。

在另一方面，考虑了表达为单链多肽的重组嵌合和/或修饰毒素衍生物。这种多肽可以是分子转运蛋白，如，但不限于，公开在Dolly等的欧洲专利说明EP 0 760 681 B1中的转运蛋白，在此引入作为参考。

另一方面，本发明包括含有梭菌或其亚型神经毒素的一条轻链的至少一部分，和另一种神经毒素或神经毒素亚型的一条重链的至少一部分的神经毒素衍生物，以及生产它们的方法。在一种实施方案中，杂交神经毒素可以包含一种神经毒素亚型一条轻链的完整轻链和另一种神经毒素亚型的重链。在另一种实施方案中，嵌合神经毒素衍生物可以包含一种神经毒素亚型重链的一部分(如结合域)，而重链的另一部分来自于另一种神经毒素亚型。同样或另外，治疗元素可以包含不同神经毒素的轻链部分。

这种杂交或嵌合神经毒素衍生物是有用的，例如，作为运送这种神经毒素亚型的治疗益处到免疫抵抗某种神经毒素亚型的病人，到某种神经毒素重链结合部分的受体浓度低于平均浓度的病人，或到可能有膜或小泡毒素底物(如SNAP-25，VAMP和突触素)的抗蛋白酶变异的病人。创建有一条有不同底物的轻链的重组嵌合或杂交神经毒素衍生物将允许这些病人应答于神经毒素治疗。

对于免疫抵抗，已知大多数神经毒素表位存在于毒素的重链部分。这样如果病人有例如含有BoNT/A的中和抗体，那么有BoNT/E重链和BoNT/A轻链(与另一条神经毒素轻链相比有更长的治疗活性持续时间)的嵌合神经毒素将克服这种抵抗。同样，如果病人有很少的BoNT/A细胞表面受体，那么同样病人有充足的另一种BoNT亚型的受体的可能性很大。通过创建将此亚型的重链与最适合治疗的轻链(如BoNT/A轻链)结合的杂交或嵌合神经毒素(如含有HC_A，HC_B，HC_C1，HC_D，HC_E，HC_F和HC_G之一的重链的至少一部分和不同梭菌神经毒素亚型的轻链的至少一部分的神经毒素，该轻链为LC_A，LC_B，LC_C1，LC_D，LC_E，LC_F和LC_G之一)病人可以更好地应答于神经毒素治疗。

上述杂交或嵌合神经毒素衍生物的另一种优点是关于某种轻链(如LC_A)的活性持续时间长，其它的活性持续时间短(如LC_E和LC_F)，而还有其它的一些活性持续时间中等(如LC_B)。这样，杂交或嵌合神经毒素代表了神经毒素活性可以根据特定治疗需要或条件而修饰的第二和第三代神经毒素药物，不同药物有不同活性、底物特异性或活性持续时间。

这些杂交或嵌合神经毒素可以用于治疗接种了五价BoNT疫苗的病人(如士兵或实验室工作者)。这些疫苗不含BoNT/F；这样，将适当轻链与BoNT/F重链结合将创立对这种病人有效的治疗剂，而当前的治疗神经毒素可能不可以。

在使用有治疗部分而不是活性神经毒素轻链的梭菌神经毒素衍生物时同样的策略也是有用的。由于这种试剂的重链是由神经毒素衍生，使用了解较少或较稀少的重链对避免中和治疗性神经毒素衍生物效果的抵抗机制是有利的。

通过同样的标记，结合部分可以是从梭菌神经毒素重链衍生的结合部分之外的结合部分，这样为运动神经元以外的细胞类型提供了定向功能。

这里也包括了以高产量构建、表达和纯化这种分子为生物活性实体的方法。

附图简述

图1A显示在质粒pTrcHisA上的单链TeTx构建体和连接区域的核苷酸序列。

图1B显示L链的羧基端和H链氨基端连接部位的氨基酸序列和含有肠激酶切割位点的工程化的茎环区域。

图2A表示含有两种不同重组单链毒素的E.coli JM109转化体，用IPTG诱导表达质粒蛋白之前或之后，细胞提取液SDS-PAGE凝胶的Western杂交结果。检测抗体是抗His₆的单克隆抗体。

图2B是用E234A构建体转化的细胞，IPTG诱导的细胞提取物的Western杂交。

图3A表示利用亲和纯化得到的重组单链TeTx被肠激酶切割后，用SDS-PAGE分离，在还原条件和非还原条件下用考马斯亮蓝染色的结果。

图3B表示利用亲和纯化得到的重组单链(SC)TeTx被肠激酶切割(nick)后，在还原和非还原条件下用SDS-PAGE分离，然后用抗TeTx％X重链的抗体进行Western杂交的实验结果。

图4是在神经/肌肉制备物体外实验中，切割之前和之后，天然TeTx和重组的单链神经毒素诱导瘫痪程度对时间的函数图。

图5描述了重组单链TeTx与胰蛋白酶和Arg C蛋白酶温育所得到的多肽片段，以及从其中一个片段的N末端序列推导得出的氨基酸序列，该序列能被这些试剂识别。

图6表示未切割的SC WT TeTx和SC R496G TeTx用不同浓度胰蛋白酶消化的结果。

图7显示，E234A突变体TeTx先与小脑细胞温育后，TeTx刺激小脑细胞Ca²⁺依赖性神经传导释放的抑制效应。

图8显示，小脑细胞神经元分别与天然、重组E234A突变体单链和重组R496G突变体单链TeTx作用，Ca²⁺依赖性神经传导释放的效应。

图9显示，E234A突变体TeTx先与鼠的半隔膜温育，TeTx引发的偏瘫活性的抑制效应。

图10显示编码单链BoNT/E的质粒构建图及在质粒构建过程中，得到PCR片段的琼脂糖凝胶电泳图。

图11显示编码E212Q蛋白水解灭活的单链BoNT/E突变体的质粒构建图，以及在质粒构建过程中，得到的反向PCR片段的琼脂糖凝胶电泳图。

图12显示重组单链BoNT/E的表达和纯化简图及纯化组分的SDS-PAGE电泳和Western杂交结果。

图13显示在还原和非还原条件下，天然重组未切割的和重组切割的BoNT/E的SDS-PAGE电泳图以及毒素重链和轻链的Western杂交结果。

图14显示GST-SNAP-25[140-205]蛋白酶底物分别与天然的BoNT/E、重组切割的和未切割的BoNT/E以及E212Q突变体温育的结果。

图15显示小脑细胞分别与天然的BoNT/E、未切割的重组单链BoNT/E和切割的重组单链BoNT/E温育后，Ca²⁺依赖性谷氨酸释放的效应。

图16A显示0.2nM切割的重组BoNT/E(○)或0.2nM天然BoNT/E(□)与小鼠神经隔的半膈膜温育后，对肌肉张力的效应。

图16B显示1nM未切割的重组(○)、1 nM切割的重组(●)或0.05nM切割的重组()BoNT/E与小鼠神经隔的半膈膜温育后，对肌肉张力的效应。

图17显示用灭活的E212Q突变体先与鼠神经隔的半膈膜温育，之后用切割的天然BoNT/E毒素处理，降低了肌肉瘫痪活性。

发明详述

本发明的组成和方法涉及修饰的神经毒素、及其合成和用途。在正常情况下，通过内源蛋白酶对单链多肽的切割而活化的双链神经毒素，可在核苷酸水平通过改变或删除编码内源蛋白酶酶切位点或插入编码其它不同的蛋白水解位点的核苷酸序列被修饰，这些插入序列能抗宿主细胞或人的蛋白酶切割(cleavage)。通过设计，插入的氨基酸序列在体外能被所选择的试剂切割，在表达之前，这些试剂已经确定的，即不是出现于人或宿主细胞组织的。

通过选择，可插入的氨基酸序列使其对具有切割多肽键的化学试剂更加敏感，例如溴化氰。然而，更加优选的是在编码的氨基酸序列中包含蛋白水解切割位点，它对所选择的蛋白酶高度特异。被选中的蛋白酶在正常条件下不存在于表达单链毒素分子的细胞内(例如，大肠杆菌或天然梭状芽孢杆菌)。

另一方面，本发明涉及重组单链被修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素，需要时，此毒素可以通过蛋白酶特异的切割作用而生成有活性的双链分子。这种修饰的神经毒素不必是有毒性的；在某些蛋白中，由于毒素L链的酶活性可能丧失，毒素可以与药物或者作为具有治疗作用的其它生物活性制剂。或者是，在其它修饰的神经毒素中，L链具有酶活性，而H链的某些部分被修饰后，使毒素对天然靶细胞外的其它靶细胞产生特异性，但仍然具有天然毒素的转移和刺激性胞吞活性。

本发明所描述那些修饰的神经毒素已经公开，例如在国际专利出版物WO95/32738、WO99/55359、WO96/33273、WO98/07864和WO99/17806中，这些出版物在此引入作为参考。本发明给出了这些单链和可切割分子及其制备此类分子的改进方法。

另一方面，本发明包括修饰的梭状芽孢杆菌神经毒素，它起源于破伤风毒素(TeNT)，或一种或多种肉毒毒素(BoNT)亚型，这些亚型天然形成的链间茎环区域已经被修饰的茎环区域所代替，在新的茎环区域内所包含的不同的氨基酸序列具有以下作用：1)抗宿主蛋白酶或自溶的切割作用，和/或2)易于被所选择的蛋白酶切割。特别值得注意的是切割位点对所选蛋白酶具有高度特异性。

某些梭状芽孢杆菌神经毒素，例如BoNT/E，其链间茎环区域天然地抗体内蛋白水解的切割。这种蛋白酶抗性可能反映在其二级结构或三级结构上，这种结构可以使茎环比其它的梭状芽孢杆菌神经毒素更能抵抗内源蛋白酶的切割。因此，在本发明的一个实施方案中，BoNT/E的链间茎环区域被BoNT的天然茎环区域代替，例如BoNT/A或/B，具有更大的治疗活性或更长的作用时间。在发明的另一个实施方案中，修饰了的BoNT/E的茎环区域，在亚克隆之前，就已包括对所选蛋白酶具有高度特异性的蛋白水解位点。另外，高度保守的BoNT/E茎环区域抗内源或人体蛋白酶，但在所选蛋白酶消化后，仍然能被活化。

因此，所选蛋白酶目前基本上起神经毒素毒性(或修饰的毒素活性)的“激活剂”的作用，此神经毒素毒性可在重组表达之后任意添加。

所选蛋白酶可以是任意一个能够识别特异氨基酸序列，并且能在识别位置或附近切割肽键的蛋白酶，但是最好不是人的胰蛋白酶、糜蛋白酶或胃蛋白酶，以及宿主细胞的蛋白酶。而且，所选蛋白酶不能与内源蛋白酶识别相同的氨基酸序列。最后，所选蛋白酶不能由含有编码重组神经毒素质粒的宿主细胞表达。

假如氨基酸的识别序列也是已知的，任何能够识别相对稀有氨基酸序列的非人蛋白酶都可以选用。作为激活剂而选择的蛋白酶可以包括以下举例，但不受此限制：牛肠激酶，植物蛋白酶如木瓜蛋白酶(来源于Carica papaya)和豆蛋白，昆虫木瓜蛋白酶的同源物(来源于蚕Sitophilus zeamatus)，和甲壳类木瓜蛋白酶的同源物(十足类动物)，切割EXXYXQS/G序列的烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶；来源于Bacillus amyliquifaciens的切割HY或YH序列的GENENASE；来源于人鼻病毒3C的切割LEVLFQGP氨基酸序列的PRESCISSION^蛋白酶。在以上使用中，字母X表示任一氨基酸。

除非另外指出，否则以下术语在这里具有以下含义：

“结合元件”是指在生理条件下，能够优先与靶细胞特异的细胞表面标记物结合的一段氨基酸序列区域。细胞表面标记物包括多肽、多糖、脂类、糖蛋白、脂蛋白，或具有其中一个或多个的结构特征。“优先相互作用”是指结合元件与细胞表面标记物的解离常数(K_d)至少比结合元件与其它任何细胞表面标记物的解离常数要低一个数量级。优选地，当与神经毒素或修饰后的神经毒素一起相互作用时，解离常数要比结合元件与其它任何细胞表面标记物的解离常数至少低两个数量级，更优选地，解离常数至少低三个数量级。

“转运元件”包括具有转运活性的梭状芽孢杆菌神经毒素的重链部分。使用“转运”是指能够帮助多肽通过泡囊膜，由此使许多或全部的多肽进入细胞质。

在各种各样的肉毒神经毒素中，认为转运涉及重链的变构构象的变化，这是由于内体pH值降低而引起。

这种构象的变化可能涉及并且由重链的N末端部分介导，导致在泡囊膜上形成穿孔；这种变化使蛋白水解的轻链从内体小泡进入细胞质。参见，Lacy，等，Nature Struct.Biol.5：898-902(10，1998)。

对本领域的技术人员，肉毒神经毒素重链中介导转运部分的氨基酸序列是众所周知的；此外，其中的已知对转运活性必需的那些氨基酸残基也是已知的。

因此，本领域普通技术人员的能力足以，例如，用任何一个天然存在的Clostridium tetanus或Clostridium botulinum神经毒素亚型重链的N端肽作为转运元件，或者通过比对各种重链N端部分的一级结构，以序列之间的保守氨基酸、极性、立体结构及疏水特征为基础，选择相同的一级转运序列，从而设计相似的转运元件。

本发明中的“治疗元件”，没有限制，包括：活化的或非活化的(即修饰的)激素受体(例如，雄激素、雌激素、retinoid、周氧化体增殖素(perioxysome proliferator)和蜕皮激素受体等)和激素的激动剂和拮抗剂，能用于复制、转录或翻译模板(例如，用于具有理想生物活性的蛋白药物的表达或作为反义链制剂用于核酸药物的合成)的核酸、酶、毒素(包括诱导凋亡或抑制凋亡的制剂)，等。

在优选的实施方案中，治疗元件是一个多肽，它包含梭状芽孢杆菌神经毒素的轻链或及其具有梭状芽孢杆菌神经毒素轻链的SNARE蛋白序列特异的内切多肽酶活性的部分。与破伤风神经毒素(TeNT)轻链的氨基酸序列一样，肉毒神经毒素(BoNT)A-G亚型的轻链氨基酸序列已经确定了。每一条链包括Zn²⁺结合域His-Glu-X-X-His(左侧为N末端)，是Zn²⁺依赖的内多肽酶的特征(在TeNT、BoNT/A/B和/E中是HELIH；在BoNT/C中是HELNH；在BoNT/D中是HELTH)。

近来对BoNT/A轻链的研究揭示了某些重要的特征，这些特征影响毒素作用靶底物SNAP-25的活性和特异性。因此，Zhou等Biochemistry 34：15175-15181(1995)的研究指出，当轻链氨基酸残基His₂₂₇被酪氨酸代替后，生成的多肽就不能切割SNAP-25；Kurazono等人J.Biol.Chem.14721-14729(1992)利用重组的BoNT/A轻链在Aplysia californica的口腔神经节的突触前胆碱能神经元进行研究，表明在这个系统中，除去N端8个氨基酸残基或C端32个氨基酸残基后，毒性并没有丧失，但是将N端10个氨基酸残基或C端57个氨基酸残基除去后，毒性消失。最近，完整的BoNT/A全毒素的晶体结构已经解析；表明其活性位点由His₂₂₂、Glu₂₂₃、His₂₂₆、Glu₂₆₁和Tyr₃₆₅参与组成。Lacy等，上述。(这些残基与Kurazono等，上述中BoNT/A轻链的His₂₂₃、Glu₂₂₄、His₂₂₇、Glu₂₆₂和Tyr₃₆₆相对应)。有趣的是，通过BoNT/E和TeNT的轻链与BoNT/A的轻链的比对发现，每一条轻链在BoNT/A中相似的位置上毫无例外的具有这些残基。Kurazono等，上述。

BoNT/A的催化功能域对SNAP-25的C端具有特异性，并且需要SNAP-25至少17个氨基酸才能进行切割。催化位点象一个口袋；当轻链通过Cys₄₂₉和Cys₄₅₃之间的二硫键与重链连接后，重链的转运功能域就封闭了催化口袋的入口，直到轻链进入胞浆。然后当二硫键被还原后，催化口袋张开，轻链完全活化。

如上所述，VAMP和突出融合蛋白分别能被BoNT/B、D、F、G及TeNT，和BoNT/C1切割，而SNAP-25被BoNT/A E和C1切割。

除了BoNT/A之外，与各种梭状芽孢杆菌神经毒素轻链相作用的底物特异性是已知的。因此，在本领域具有基本技术的人员就能很容易地在这些亚型中确定切割和底物识别所必须的毒素残基(例如，通过对毒素分子的各区域定点突变或缺失，然后检验蛋白水解活性和底物特异性)，并且很容易地设计出保持或丢失相同或相似活性的天然神经毒素轻链的变异体。

在一个更具体的优选实施方案中，本发明的单链神经毒素或神经毒素衍生物，进行如上改变后，可以进一步修饰，去除其它诸如胰蛋白酶、Arg C蛋白酶、糜蛋白酶或宿主细胞蛋白酶切割的、随机的内源蛋白水解位点。如下所述，在这些区域对氨基酸序列一级结构进行修饰，给予蛋白酶抗性，能增加神经毒素的产量，并在切割和活化之前降低单链神经毒素的毒性。

很多蛋白酶识别的氨基酸序列及其切割的特异性是本领域的技术人员所熟悉的。这样，在单链毒素轻链和重链之间的茎环区域内，设计特异性蛋白切割位点，和修饰多肽中随机蛋白酶位点使之抗蛋白酶，都只是比较各种蛋白的特异性和识别序列的常规操作。首先，候选的蛋白水解位点的特异性无需彻底具有专一性，但只需要排除人或宿主细胞蛋白酶的切割位点，因为在单链神经毒素的操作、保存和纯化过程中，可能存在这些蛋白酶。当然，蛋白酶位点尽可能的特异是最好的。其次，修饰蛋白水解切割位点，只需使该位点耐激活剂蛋白酶和人或宿主细胞蛋白酶就足够了。

在另外一个优选实施方案中，通过在重组的、修饰的单链神经毒素上接上结合标签对其做进一步修饰，该标签包括特异性结合复合体的成员。“特异性结合复合体”是指两种或多种化学或生化物质，在特定条件下它们能彼此结合，并且在相同的条件下，它们不与环境中的其它化学或生化物质明显结合。特异性结合复合体成员的例子是没有限制的，包括抗体及其相应的抗原、凝集素及其相应的靶碳水化合物、核酸链及其互补链、细胞表面受体及其配体、金属及其能够与该金属形成协同或螯合复合体的化合物，等等。

在这个实施方案中，结合标签可以通过接头，优选地是可切割的接头结合到单链毒素中。尽管没有全部列出，可能的接头包括1)脂肪二羧酸，具有分子式为HOOC-(CH₂)n-COOH，其中n＝1-12(可与游离的氨基基团连接)；2)HO-(CH₂)n-COOH，其中n＞10(适合粘附在多肽的氨基端)；3)发生取代的联苯结构；和4)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯接头。使用含有酯的接头，可以在相对温和的酸性条件下纯化单链神经毒素后，切割酯接头。

另外，最优选地是结合标签可以包括所选多肽中的部分或全部氨基酸序列，作为融合蛋白，它与单链毒素共同表达；这些多肽毫无限制，可以包括麦芽糖结合蛋白(MBP)的麦芽糖结合域；His₆标签(一串6个组氨酸残基)；钙调蛋白结合蛋白的钙调蛋白结合域；以及谷胱甘肽硫转移酶的谷胱甘肽结合域。其它多肽结合标签为本领域的技术人员所熟悉，因此能很容易被采用，应用于本发明中。

此外，可以构建在自身和单链毒素的氨基端或羧基端之间具有蛋白酶切割位点的结合标签，从而在多肽纯化后可以将其除去。选择与在H与L链之间切割单链毒素相同的激活剂蛋白酶，设计其切割的蛋白水解切割位点。

因此，本发明的目的就是给出重组的可活化的单链神经毒素分子，此分子与天然神经毒素比较，毒性降低；直至通过与非梭状芽孢杆菌蛋白酶反应而被活化。这个单链神经毒素很容易纯化，在纯化过程中操作的危险性更小，并且可以选择性的修饰以赋予毒素更多的期望特性。

提供一种生产可活化的重组单链神经毒素的方法也是本发明的目的。用一种氨基酸序列代替H链与L链之间天然氨基酸的蛋白水解切割序列，这一替代通过修饰编码神经毒素的核苷酸序列来完成，这种氨基酸序列对内源梭状芽孢杆菌或宿主细胞的蛋白酶是稳定的，但在体外对所选蛋白酶切割的是敏感的。

本发明进一步的目的是，通过对轻H和L链编码区的核苷酸序列进行修饰，生产更加稳定的神经毒素多肽。用其它能使毒素抗不需要的蛋白水解性降解的氨基酸残基代替其中的不稳定氨基酸，从而除去随机蛋白水解切割位点。

此外，本发明的目的是提供纯化单链重组神经毒素的方法，将连接部分与表达的单链神经毒素结合，其中连接部分包括特异结合复合体的配偶体，用结合配偶体亲和纯化此复合体，其中结合配偶体包括结合复合体的其余半部分。可以采用分批纯化或过色谱柱纯化。亲和纯化后，可以除去连接部分，从而使其与神经毒素分开。

本发明目的也是生产修饰的重组单链神经毒素分子，作为治疗剂得以使用。与天然来源的神经毒素相比，修饰的神经毒素分子可以具有改变的靶位特异性或改变的活性或二者兼而有之。

本发明的目的也是生产可活化的重组单链神经毒素，它比野生型神经毒素更易于纯化。这种神经毒素允许为临床使用而大规模制备恰当折叠和高纯度的毒素。

以下实例用于解释说明本发明具体的实施方案，而且决不限定在本发明的权利要求所规定的范围内。

实例1

构建含有单链TeTx编码区域的表达载体

本发明举例说明在E.coli中表达TeTx质粒的构建，其表达产物是单体蛋白，可方便地用亲和层析纯化。TeTx可作为中试系统，因为(1)能获得优越的疫苗将大大降低其操作的危险；(2)在表达HC和LC结构域方面，它是得到了广泛地研究的毒素。然而，本领域的技术人员知道采用相同或相似策略，用任何双链或双元毒素或其它生物活性分子表达单体多肽并被蛋白水解活化。分别构建单链分子，包括野生型TeTx链和突变体TeTx轻链，其243位的谷氨酸残基突变为丙氨酸(称为E234A，Ala²³⁴，或E234A突变轻链)。后者突变体导致轻链失活，并按Li等在Biochemistry 33：7014-7020(1994)中的描述(因此，在此引入作为参考)，构建编码E234A突变轻链的质粒(pMAL-E234A)。用以下方法构建每条单链毒素。

载体pTrcHisA购自Invitrogen，用Stratagene QuickChange定点突变试剂盒(定点突变技术，参见Smith等，J.Biol.Chem.253：6651-6560(1979)；在此全部引入作为参考)进行修饰，在编码肠激酶(EK)切割位点的上游核苷酸处产生两个额外的限制性位点(Sal I和Hind III)。质粒也包括转录启示密码(ATG)，随后是6个组氨酸残基，紧接着是肠激酶切割位点上游。多克隆位点包括BamHI、Xho I、Bgl II、Pst I、Kpn I、Eco RI、Bst BI和Hind III切割位点，紧位于EK位点下游；通过定点突变消除Hind III位点。下列引物用于在EK切割位点上游插入限制性位点(下划线)：

SEQ ID NO：1

GACTGGTGGACAGCAA GTCGACCGG AAGCTTTACGACGATGACG，和

Sal I Hind III

SEQ ID NO：2

CGTCATCGTCGTA AAGCTTCCG GTCGACTTGCTGTCCACCAGTC

Hind III Sal I

最终质粒包括位于编码牛肠激酶(EK)核酸序列5’端的Sal I和Hind III位点。

编码野生型TeTx L链的核酸序列是从质粒pMAL-LC上得到的，Li等已在Biochemistry 33，7014-7072(1994)中描述，在此引入作为参考。质粒编码TeTx轻链与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白，麦芽糖结合蛋白紧位于L链编码序列的上游。在MBP和L链的融合蛋白中，设计包括人血凝结因子Xa(Ile-Glu-Gly-Arg)的切割位点，一旦使用亲和纯化，便可切除MBP。

用Sal I和Hind III消化质粒pMAL-LC，产生编码L链序列的DNA片段，凝胶纯化此片段，并连接到质粒pTrcHisA的EK位点上游处新添的Sal I和Hind III位点上。此片段使麦芽糖结合蛋白序列从L链N端切除。

相同的程序用于包括突变L链DNA片段的亚克隆，突变L链来源于质粒pMAL-LC-Ala²³⁴，单氨基酸突变发生在L链234位，用丙氨酸代替天然的谷氨酸。该变化足以使L链的锌内肽酶失活，而且使重新构建的、包括天然H链和Ala²³⁴ L链的重组破伤风毒素没有毒性。

包括H链的DNA片段从质粒pMAL-LC上得到；该质粒的构建已在Li等，J.Biochem.125：1200-1208(1999)中描述，在此引入作为参考。简要地说，构建编码H链的基因，通过组装三个DNA片段，包括编码不同部分的H链序列，这些序列已克隆到不同质粒上。首先用标准的聚合酶链式反应方法(例如，参见Mullis，U.S.专利号4,683,202和Mullis等，U.S.专利号4,800,159，在此全文引入作为参考)和下列引物克隆H链的氨基端片段：用PCR引物a(包括一个Xba I切割位点)和b(包括一个Bgl II切割位点)(分别为序列身份号3和4)从质粒名为pTet8上扩增H链片段；用PCR引物c(包括一个Bgl II切割位点)和d(包括一个Hind III和Sal I切割位点)(分别为序列身份号5和6)从质粒名为pTet14上扩增H链片段。以下是这些引物的核酸序列，限制性位点用下划线表示。

SEQ ID NO：3

AATAGA TCTAGATCATTAACAGATTTAGGA(a)

SEQ ID NO：4

TTCTAA AGATCTATACATTTGATAACT(b)

SEQ ID NO：5

ATGTAT AGATCTTTAGAATATCAAGTA(c)

SEQ ID NO：6

ATCGAT AAGCTTTTATCA GTCGACCCAACAATCCAGATTTTTAGA(d)

PCR扩增后，用凝胶纯化扩增的H链片段，用Bgl II消化每个片段，并连接以产生完整的H链的N端区。用Xba I和Hind III消化连接产物，并亚克隆到pMAL-c2-T(质粒也用Xba I和Hind III消化)的多克隆位点上，其位于MBP和Xa因子位点编码区的下游。pMAL-c2是本领域的技术人员熟悉的一种商业化的载体。所构建的质粒为pMAL-H_N。

完整的H链编码区的构建如下。用Sac I和Sal I消化pMAL-HN质粒产生编码H链N端的DNA片段。用Sac I和Bam HI消化质粒pTet215产生编码H链C端的DNA片段。用Sac I和Bam HI消化载体pMAL-c2-T，并与消化的H链片段连接，因为用了不同的内切酶，因此将按正确的方向组装。所构建的质粒为pMAL-HC。

从pMAL-LC或pMALE234A和pMAL-HC构建体上切割并直接纯化编码H和L链的DNA片段，然后按前述方法亚克隆到已修饰的载体pTrcHisA上。首先把H链连接到已修饰载体的Bam HI位点，其紧位于EK位点的下游，凝胶纯化该载体。用Hind III和Sal I消化此载体后，把L链连接到EK切割位点的上游位置。

此质粒构建体体含有编码单链毒性蛋白的核酸序列，包括(从氨基端到羧基端)：6组氨酸残基(His标签)，随后是L链和肠激酶切割位点及H链。以下序列(方向从N端到C端)和图1显示了包括EK切割位点(DDDDK)在内的、L和H链之间的翻译结合点。

序列身份号：7

EK位点

SKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTA-GEKLY DDDDKDRWGSSR-SLTDLGGELCIKNEDLTFIAEKN

L链链间茎环 H链

为了使两条链作为一个单元表达，用两个引物(序列身份号8和9)进行定点突变，除去在pMAL-LC质粒中L链3’末端存在的终止密码序列，使之成为包括H和L链的单阅读框。

SEQ ID NO：8

AATAGAACTGCAGGAGAAAAGCTTTACGACGATGAC，和

TGATAA(编码链，除去的终止密码)

SEQ ID.NO：9

GTCATCGTCGTAAAGCTTTTCTCCTGCAGTTCTATT

TTATCA(非编码链，除去的终止密码)

用Hanahan热激方法把以pTrcHisA为基础的构建体转化到E.coli菌株JM109中，在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上分离转化体菌落。从转化体中纯化质粒，并通过限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳分析确定插入片段。

实例2

单链TeTx的表达及其物理特征

用IPTG诱导以pTrcHisA为基础的单链TeTx构建体(在杂合的trp/lac启动子控制之下)的表达。加入1mM IPTG到含有100μg/ml氨苄青霉素的200ml LB培养物中，37℃下继续培养代表性的转化体克隆16小时，然后离心收集细胞。

细胞沉淀重悬在30ml缓冲液A(20mM Na₂PO₄，500mM NaCl(pH7.8))中，然后在4℃超声裂解，在中等设置下，以10秒时速进行裂解。以9000Xg于4℃离心30分钟除去不溶性碎片，然后回收上清。

含有每个单链构建体的上清与镍离子树脂(Invitrogen Corp.)在22℃温育20分钟，通过单链毒素分子氨基端的组氨酸残基与镍的螯合进行亲和纯化。树脂上样到微型柱，用200ml洗涤缓冲液(20mMNa₂PO₄，500mM NaCl(pH6.0))洗涤，以除去非特异性结合物，用8-15ml含100mM咪唑的缓冲液A洗脱，以0.5ml一份收集重组的单链蛋白。洗脱的单链蛋白用Bradford蛋白分析仪(Bio-RadLaboratories)测定浓度；大约回收1mg融合蛋白。

实例3

重组单链蛋白TeTx的SDS-PAGE和Western杂交分析

单链TeTx构建体在含氨苄青霉素的LB中于37℃生长，在IPTG诱导蛋白表达之前和之后取一份样品。在β-巯基乙醇(BME)存在的还原条件下，用样品缓冲液稀释制备SDS-PAGE的细胞粗提物。SDS-PAGE电泳之后，对分离的蛋白按下列方法进行Western杂交：用标准方法(例如，参见Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryMannual(2d ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)，在此全部引入目作为参考)，把蛋白电转移到聚偏[二]氟乙烯(PVDF)膜上，处理膜以降低Ig结合背景，然后用抗His₆抗体杂交，在用碱性磷酸酶结合的第二抗体检测之后，用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮蓝四唑基质发光。

如图2A的泳道1和2所示，Western杂交证明在蛋白诱导合成前检测不到TeTx的表达；反之，证明在蛋白诱导后有大约150kDa分子量的单一带(参见泳道3和4)。在图2A中，泳道1和3是WT轻链构建体，而泳道1和4是E234A突变构建体。

图2B是IPTG诱导转化E234A构建体的细胞提取物的Western杂交。没有观察到低分子量的轻链蛋白的水解产物，表明在表达和纯化后单链毒素是相对稳定的。

图3显示第二个实验结果，用肠激酶对亲和纯化的重组单链(SC)TeTx进行如下切割。30微克纯化的单链毒素与1单位肠激酶，在含有50mM Tris-HC(pH8.0)、1mM CaCl和0.1％(v/v)吐温20的溶液温育。设置一对照，重组蛋白在相同的反应混合液中温育，但不含EK。这些样品，包括一份天然(非重组)TeTx，在还原(+MBE)或非还原(-BME)条件下，用8％聚丙烯酰铵凝胶进行SDS-PAGE电泳。电泳后的凝胶用于Western杂交，随后用抗H链抗体检测(图3B)，并用考马斯蓝直接染色(图3A)。

如图3所示，在非还原条件下，所有的三个样品(天然TeTx(泳道1)，未切割的重组毒素(泳道2)和肠激酶切割的重组毒素(泳道3))都以二聚体形式迁移(明显不同的构象异构体还原后解离成单一带)，具有基本上难以能区分的、明显分子量大约150kDa。非还原胶证明1)获得了高水平的表达，2)完全形成了连接轻链和重链的二硫键，和3)未观察到由蛋白水解引起的重组单链毒素的降解。

相反，在还原条件下，用Western杂交和考马斯染色证明野生型和切割的重组毒素为H链，具有大约100kDa的分子量。另外，在考马斯染色胶上，这些样品也显示出大约50kDa分子量的带，对应于L链。野生型L链迁移，具有低于重组L链的表观分子量。由于His₆部分和修饰的EK切割位点，包括链间连接区，使重组L链增加了22个氨基酸残基。未切割的重组毒素(泳道2)作为一条带迁移，具有150kDa的表观分子量。特别是，在泳道3没有看到未切割毒素的痕迹，表明肠激酶处理是有效的。

实例4

重组单链TeTx引起的体外毒素诱导瘫痪

用鼠膈神经的半隔膜，也测定并比较了重组TeTx与野生型毒素的生物活性，因为已知天然毒素能引起神经肌肉的瘫痪，尽管在高于CNS中起作用的浓度下。对该实验，从鼠(品系T/O，4周龄，～20g重)中切取左隔神经的半隔膜，立即转移到封闭的循环式超融合系统，它包括10ml Krebs-Ringer溶液(118mM NaCl，4.7mM KCl，1.2mM MgSO₄，2.5mM CaCl，23.8mM NaHCO₄，1.2mM KH₂PO₄，11.7mM葡萄糖(pH7.4))，用95％ O₂和5％CO₂充气，并添加0.1％(W/V)牛血清白蛋白以降低毒素的非特异性吸附(Li等，Biochemistry33：7014-7020(1994))。半隔膜于37℃在包括10ml Krebs-Ringer缓冲液的浴10分钟，然后分别置于4或10nM天然TeTx(分别为和)或10nM切割的重组TeTx(●)或10nM未切割的重组TeTx(○)中(参见图4)。

用双极电极通过超大刺激膈神经来引起肌肉抽搐，通过与放大和计算机系统(MacLab，AD Instrumen，UK)相连的力置换传导器(Lectromed，UK)记录肌肉抽搐。神经刺激的参数是0.2Hz方波，持续时间0.1毫秒，电压范围为1.5-2.5V。按神经诱发的肌肉收缩所需时间计量，毒素诱导后神经肌肉传导瘫痪降低到原始值的10％(减少了90％)。

如图4所示，发现10nM已切割的重组TeTx与10nM天然毒素一样有效，阻止了神经诱发的肌肉抽搐，在约170分钟内，肌肉张力降低了90％。因此，在E.coli中大量表达这种单链和有活性的多肽，经简单的亲和层析步骤就能纯化，用所有的检测标准证明新的TeTx制备物是完全具有活性的。

相反，10nM未切割的TeTx制备物需要大约2倍长的时间来降低肌肉张力，活性大约与4nM野生型TeTx相当。在对照实验中，半隔膜与EK缓冲液一起温育，而且在实验样品中存在痕量的肠激酶，发现长达5小时内肌肉张力的降低是微不足道的。

因此，本实验表明在体外未切割的TeTx比野生型或切割的重组蛋白更具有明显低毒性的。

实例5

进一步修饰单链TeTx，除去蛋白水解切割位点，

降低了未切割的重组毒素的毒性

与切割的重组单链TeTx相比，未切割的重组单链TeTx表现为毒性降低，残留的毒素活性可能是由于体内的额外蛋白酶活化了毒素。为了证实这种可能性，按列步骤鉴定单链毒性分子中对胰蛋白酶和ArgC蛋白酶切割敏感的位点，把胰蛋白酶和Arg C蛋白酶与单链TeTx一起温育。55μg重组单链TeTx与4μg Arg-C在37℃温育4小时，或与0.1μg胰蛋白酶于37℃温育0.5小时，或与无蛋白酶的缓冲液温育，作为对照。加入含0.1％SDS的SDS-PAGE样品缓冲液终止此反应，随后煮沸5分钟；样品进行SDS-PAGE电泳，然后Western电转移到聚偏[二]氟乙烯(PVDF)膜上。用His₆标签特异的IgG杂交，用辣根过氧化物酶染色系统检测。

如图5所示，Western杂交表明胰蛋白酶和Arg C蛋白酶产生了与L链(和H链)相同大小的片段。另外，丽春红染色转移胶，从每一泳道上切取大约分子量100kDa的H链带，并进行N-端测序分析。

在重组单链TeTx中，LC和HC由17个氨基酸(GEKLYDDDDKDRWGSSR)连接，随后开始H链序列(SLTDLGGEL...)。对胰蛋白酶和Arg C蛋白酶产生的大片段进行N-端氨基酸测序表明，100kDa的胰蛋白酶和Arg C蛋白酶切割产物的前5个氨基酸是SLTDL；因此这些蛋白酶似乎在R-S键之间切割了单链毒素(参见图1)，释放H链和L链，包括其C端EK接头。由于这种变体，导致了双链毒素基本上与EK切割的毒素相同。

通过定点突变把EK接头序列羧基端的精氨酸变成甘氨酸(R496G)，此单链毒素多肽按前述方法表达并纯化。

用6微克R496G突变的单链(WT LC)毒素和未突变的SC TeTx滴定0、0.01、0.1、1、10μg/ml胰蛋白酶，然后DSDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，产生的切割谱带见图6。可以看到，两条单链分子对胰蛋白酶切割是敏感的；然而R496G突变体比在链间茎环区没有突变的SC毒素产生较少片段。例如，胰蛋白酶消化的SC WT毒素，可以清楚地看到在轻链带附近有三条胰蛋白酶多肽带，而在R496G消化产物中只看到二条这样的带。事实上在R496G突变SC毒素中存在其余的胰蛋白酶位点，这可能解释了这种突变与未切割的SC毒素相比，并不引起毒性的降低；在鼠致死性和前面描述的神经肌肉的瘫痪分析中，两种制备物产生的值相似。

用一个不同的分析系统测定对CNS神经元的神经毒素活性，TeTx自然感染这种细胞。所用细胞为小脑神经元；它们从7天龄鼠的小脑中分离。以1-2 X10⁶/ml浓度，把神经元悬浮在由3份Basal EagleMedium和1份缓冲液组成的培养基中，缓冲液的组成是：40mMHEPES-NaOH(pH7.3)，78.4mM KCl，37.6mM D-葡萄糖，2.8mM CaCl，1.6 MgSO₄，1.0mM NaH₂PO₄，1 X N2补充物，1.0mM L-谷氨酰胺，60单位/ml青霉素，60μg/ml四环素，5％(v/v)透析的驴血清。1毫升细胞悬浮液加到22mm直径涂有聚-D-赖氨酸的样品孔中。20～24小时后，把胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Ara-C，40uM)加到5％(v/v)CO₂的培养物中，用包括40uM Ara-C的前面所述的培养基每周继代神经元。

对于每个分析，神经元至少体外培养10天，用充O₂的Krebs-Ringer HEPES缓冲液(KRH，mM：20 HEPES.NaOH pH7.4，128 NaCl，5 KCl，1 NaH₂PO₄，1.4 CaCl，1.2mM MgSO₄，10 D-葡萄糖，0.05mg/mlBSA)洗涤4次，再加入0.5ml含有0.25 uCi/ml[¹⁴C]-谷酰胺(即谷氨酸前体)的此缓冲液。所有步骤均在37℃进行。标记45分钟之后，除去培养基，按以前一样洗涤神经元4次。对照和毒素诱导的神经元在含有1.4mM Ca²⁺或0.5mM EGTA(即测定非Ca²⁺依赖性释放)的KRH缓冲液中于37℃温育5分钟；然后取出小份，用闪烁计测定[¹⁴C]-谷氨酸含量。取出上述本底培养基之后，立即加入修改的、含有50mM KCl(含有低浓度83mM NaCl，以维持正常渗透势)的KRH缓冲液和1.4mM Ca²⁺或0.5mM EGTA，刺激5分钟。最后，神经元溶于含有1％(v/v)SDS的20mM EGTA.NaOH pH7.5，小份进行闪烁计数，计算其残留的放射性量。在本底样品和刺激样品中，[¹⁴C]-谷氨酸含量用相对于总细胞含量的百分数表示。用含Ca²⁺样品的[¹⁴C]-谷氨酸含量百分数减去含EGTA缓冲液的值，计算Ca²⁺依赖性释放相关组分，依次，用含50mM KCl的样品的值减去含Ca²⁺样品的值，以计算K⁺诱发的Ca²⁺依赖性谷氨酸释放组分。

图8显示重组毒素抑制神经传导释放的能力。体外保持10天的小脑神经元，用冰冷的含5mM Mg²⁺和0.5mM Ca²⁺的KRH缓冲液洗涤2次，然后置于指定浓度的天然TeTx(●)、EK切割的TeTx R496G(○)、单链未切割的TeTx()、EK切割的TeTx E234A()中，4℃下60分钟(参见图8)。天然TeTx(0.2nM)加到指定的样品孔中，30分钟后，神经元用冰冷的KRH缓冲液洗涤3次，于37℃温育30分钟。随后按前述方法测定K⁺诱发的Ca²⁺依赖性神经传导释放。图8显示了该分析结果。

当小脑神经元置于切割的重组TeTx中时，可见Ca⁺⁺依赖性传导释放的抑制表现为计量依赖性，具有与天然毒素相似的趋势。在本次分析中，切割的重组SC TeTx及野生型和R496G产生的值相似。尽管去除了一个胰蛋白酶切割位点，但未切割的单链分子的毒素活性没有消失。在单链毒素区，除去另外一个位点以产生有活性的单链型毒素是可行的，它表现非常低的毒性，除非体外活化，获得其全部活性。

实例7

蛋白酶缺陷的TeTx突变体拮抗TeTx在边缘和

中心神经元中的作用

表1列表显示了所指的TeTx构建体在三次毒素活性分析中的测试结果：切割HV62肽的能力(只测定蛋白水解活性)；神经肌肉的瘫痪(表示毒素分子进入细胞并由此抑制神经传导释放的能力)；和腹膜内注射不同毒素构建体引起鼠的致死性。前二次分析按照前面所述方法进行。

鼠致死性分析基本上按下列方法进行：纯化的重组单链TeTx、R496G突变TeTx和E234A突变TeTx样品均分成二份，其一份用肠激酶处理以切割毒素。所有样品系列稀释于50mM磷酸缓冲液(pH7.0)、150mM NaCl和0.25％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)中，给鼠腹膜内注射毒素制备物。

如表1所示，在鼠致死性分析中，天然的和切割的TeTx制备物具有相同活性，其LD₅₀大约为1×10⁸/mg。未切割的重组毒素和未切割的R496G突变体只有大约一半的活性。最后，切割的E234A蛋白水解无活性毒素低5×10⁷倍。

表1

肠激酶切割前后SC TeTx野生型和突变体(E234A和R496G)的生物活性
肠激酶切割前后SC TeTx野生型和突变体(E234A和R496G)的生物活性				纯化的毒素制备物	HV62切割^a的初始率(nmol.min^-1mg^-1)[相对率(％)]	鼠致死性^b(LD₅₀/mg)	10nM引起90％神经肌肉瘫痪的时间(分钟)
天然的	20.3±0.91	1×10⁸	145	纯化的毒素制备物	HV62切割^a的初始率(nmol.min^-1mg^-1)[相对率(％)]	鼠致死性^b(LD₅₀/mg)	10nM引起90％神经肌肉瘫痪的时间(分钟)
天然的	20.3±0.91	1×10⁸	145	未切割的SC WT	8.0±0.03	0.5×10⁸	260
切割的^c SC WT	22.7±3.37	1×10⁸	150	未切割的SC WT	8.0±0.03	0.5×10⁸	260
切割的^c SC WT	22.7±3.37	1×10⁸	150	未切割的SC R496G	11.7±0.6	0.5×10⁸	250±15
切割的^c SC R496G	52.3±4.9	1×10⁸	135±10	未切割的SC R496G	11.7±0.6	0.5×10⁸	250±15
切割的^c SC R496G	52.3±4.9	1×10⁸	135±10	未切割的SC E234A	≤0.01^d	未测	未测
切割的^c SC E234A	≤0.01^d	＜50	未测到活性	未切割的SC E234A	≤0.01^d	未测	未测

^a用RP-HPLC为基础的方法测定蛋白水解的初始率，该方法Foran等有详细的描述(1994)。对应于人VAMP-2(HV62)的33-94残基的合成肽15uM，在含2mM DTT、0.2mg.ml^-1BSA和50uM ZnCl的50mM HEPES.NaOH pH7.5溶液中于37℃下温育，用适当浓度的每种还原毒素制备物，蛋白水解10-15％的基质30分钟。数据为平均值(±S.D.；n＝4)。^bLD₅₀是在4天内杀死50％鼠的所注射的毒素剂量。^c毒素制备物是用肠激酶(1单位/30μg)于22℃切割1小时。^dV⁰值代表PR-HPLC分析的检测极限；延长反应时间没有观察到有HV62的蛋白水解作用。

纯化的SC E234A TeTx，其234位催化残基E被A取代，对包括人VAMP-2(称为HV62)33～94残基的肽，无论是EK切割前或切割后，都没有任何可检测的蛋白水解作用。因此，证明切割的E234A TeTx在鼠内是缺乏毒性的，并且不能抑制神经肌肉结合处或小脑神经元的传导释放。

然而，重要的是该突变体毒素仍然能结合到周边和中心神经元的细胞表面受体上。小脑神经元与切割的(10-60nM)或未切割的(7-40nM)TeTx E234A在4℃温育之后，再加入0.2nM天然毒素，在37℃拮抗天然毒素传导释放的抑制程度相似(图7)。

如图9所示，先加入1nM天然毒素后，把鼠横隔膜置于4℃的100nM TeTx E234A中60分钟，结果延长了引起神经肌肉瘫痪所需时间。

鼠隔神经的半隔膜与20nM重组TeTx E234A(△)在KR中于37℃温育，刺激神经(0.2Hz，1.5-2.5v)，记录肌肉张力。为了评价竞争，半隔膜在4℃与只含有0.1％BSA(□)或含有0.1％BSA和100nM切割的TeTx E234A(○)的MKR温育60分钟，之后加入1nM天然TeTx，放置30分钟后，于37℃用MKR洗涤组织3次，用KR洗涤2次。温度升到37℃，前面概括了神经诱发的肌肉抽搐。在两种组织中，都可见突变体对毒素的结合具有明显的竞争性，这表明重组双链TeTx对细胞表面受体的亲和性比TeTx的重链或Hc高。这些结果暗示重组双链TeTx的构象对细胞表面受体有高的亲和性。

此外，更重要的是，这些数据表明，根据本专利申请所发明的方法，可以制造重组分子，它能与TeTx相同的细胞受体特异结合。然而，这类分子，如E234A突变体，是无活性的毒素分子，但仍然具有被靶细胞吸收的能力，这样起了潜在的转运蛋白分子的作用。

实例8

单链BoNT/A的表达

用类似于前面所述的方法，包含BoNT亚型A神经毒素H和L链的DNA片段连接到在一起，由EK切割位点隔离，该单链毒素编码序列插入到不同的表达载体含有N端序列和启动子，如下表2所示。

表2

载体	启动子	融合标签	标签大小(氨基酸)	融合大小(kDa)	E.coli菌株
载体	启动子	融合标签	标签大小(氨基酸)	融合大小(kDa)	E.coli菌株	pTrcSCPHY	trc	聚组氨酸	18	150	JM109
pCalSCPHY	T7	钙调蛋白结合蛋白	31	154	BL21(DE3)	pTrcSCPHY	trc	聚组氨酸	18	150	JM109
pCalSCPHY	T7	钙调蛋白结合蛋白	31	154	BL21(DE3)	pETSCPHY	T7	聚组氨酸	32	154	BL21(DE3)
pGEXSCPHY	tac	谷胱甘肽硫转移酶	224	177	JM109	pETSCPHY	T7	聚组氨酸	32	154	BL21(DE3)
pGEXSCPHY	tac	谷胱甘肽硫转移酶	224	177	JM109	pMALPHY	tac	麦芽糖结合蛋白	390	193	JM109

每个融合标签构成了一个有利于纯化的特异结合复合体，也改进了表达蛋白的可溶性和稳定性。这些质粒转化到如表2所示的E.coli菌株中，并检测单链毒素的表达。

在另一个实验中，把单链BoNT/A构建体插入到质粒pMAL-c2的Bam HI和Hind III限制性位点之间，产生的编码序列是融合多肽，包括其N端是麦芽糖结合蛋白，随后是Xa因子切割位点。

转化JM109的克隆在含有氨苄青霉素的LB上筛选。加入IPTG至终浓度0.3mM诱导表达。就像TeTx构建体一样，在诱导前后收集小份培养物，超声波裂解每个样品细胞，制备上清，在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE电泳。根据明显的分子量，电泳分离蛋白后，用抗BoNT/A的H链抗体对凝胶进行Western杂交。Western杂交产生了分子量大约200kDa的明显的免疫反应单链毒素带。进一步对单链BoNT/A分子进行修饰，除去意外的蛋白酶切割位点(类似于在TeTx位点所作的修饰，对胰蛋白酶和Arg C蛋白酶不稳定，如前所述)，将使单链BoNT/A分子具有更长时间的稳定性。

实例9

表达BoNT/E质粒载体的构建

按下列方法构建表达单链重组神经毒素的质粒，该神经毒素来源于Clostridium botulinum亚型E(Belμga菌株)(BoNT/E)。根据EMBL数据库中BoNT/E神经毒素的cDNA序列(Genbank登录号X62089)，设计PCR引物。在此所述的核酸序列为序列身份号10：gaattcaagt agtagataat aaaaataatg ccacagattt ttattattaa taatgatatatttatctcta actgtttaac tttaacttat aacaatgtaa atatatattt gtctataaaaaatcaagatt acaattgggt tatatgtgat cttaatcatg atataccaaa aaagtcatatctatggatat taaaaaatat ataaatttaa aattaggaga tgctgtatat gccaaaaattaatagtttta attataatga tcctgttaat gatagaacaa ttttatatat taaaccaggcggttgtcaag aattttataa atcatttaat attatgaaaa atatttggat aattccagagagaaatgtaa ttggtacaac cccccaagat tttcatccgc ctacttcatt aaaaaatggagatagtagtt attatgaccc taattattta caaagtgatg aagaaaagga tagatttttaaaaatagtca caaaaatatt taatagaata aataataatc tttcaggagg gattttattagaagaactgt caaaagctaa tccatattta gggaatgata atactccaga taatcaattccatattggtg atgcatcagc agttgagatt aaattctcaa atggtagcca agacatactattacctaatg ttattataat gggagcagag cctgatttat ttgaaactaa cagttccaatatttctctaa gaaataatta tatgccaagc aatcaccgtt ttggatcaat agctatagtaacattctcac ctgaatattc ttttagattt aatgataatt gtatgaatga atttattcaagatcctgctc ttacattaat gcatgaatta atacattcat tacatggact atatggggctaaagggatta ctacaaagta tactataaca caaaaacaaa atcccctaat aacaaatataagaggtacaa atattgaaga attcttaact tttggaggta ctgatttaaa cattattactagtgctcagt ccaatgatat ctatactaat cttctagctg attataaaaa aatagcgtctaaacttagca aagtacaagt atctaatcca ctacttaatc cttataaaga tgtttttgaagcaaagtatg gattagataa agatgctagc ggaatttatt cggtaaatat aaacaaatttaatgatattt ttaaaaaatt atacagcttt acggaatttg atttacgaac taaatttcaagttaaatgta ggcaaactta tattggacag tataaatact tcaaactttc aaacttgttaaatgattcta tttataatat atcagaaggc tataatataa ataatttaaa ggtaaattttagaggacaga atgcaaattt aaatcctaga attattacac caattacagg tagaggactagtaaaaaaaa tcattagatt ttgtaaaaat attgtttctg taaaaggcat aaggaaatcaatatgtatcg aaataaataa tggtgagtta ttttttgtgg cttccgagaa tagttataatgatgataata taaatactcc taaagaaatt gacgatacag taacttcaaa taataattatgaaaatgatt tagatcaggt tattttaaat tttaatagtg aatcagcacc tggactttcagatgaaaaat taaatttaac tatccaaaat gatgcttata taccaaaata tgattctaatggaacaagtg atatagaaca acatgatgtt aatgaactta atgtattttt ctatttagatgcacagaaag tgcccgaagg tgaaaataat gtcaatctca cctcttcaat tgatacagcattattagaac aacctaaaat atatacattt ttttcatcag aatttattaa taatgtcaataaacctgtgc aagcagcatt atttgtaagc tggatacaac aagtgttagt agattttactactgaagcta accaaaaaag tactgttgat aaaattgcag atatttctat agttgttccatatataggtc ttgctttaaa tataggaaat gaagcacaaa aaggaaattt taaagatgcacttgaattat taggagcagg tattttatta gaatttgaac ccgagctttt aattcctacaattttagtat tcacgataaa atctttttta ggttcatctg ataataaaaa taaagttattaaagcaataa ataatgcatt gaaagaaaga gatgaaaaat ggaaagaagt atatagttttatagtatcga attggatgac taaaattaat acacaattta ataaaagaaa agaacaaatgtatcaagctt tacaaaatca agtaaatgca attaaaacaa taatagaatc taagtataatagttatactt tagaggaaaa aaatgagctt acaaataaat atgatattaa gcaaatagaaaatgaactta atcaaaaggt ttctatagca atgaataata tagacaggtt cttaactgaaagttccacat cctatttaat gaaaataata aatgaagtaa aaattaataa attaagagaatatgatgaga atgtcaaaac gtatttattg aattatatta tacaacatgg atcaatcttgggagagagtc agcaagaact aaattctatg gtaactgata ccctaaataa tagtattccttttaagcttt cttcttatac agatgataaa attttaattt catattttaa taaattctttaagagaatta aaagtagttc agttttaaat atgagatata aaaatgataa atacgtagatactccaggat atgattcaaa tataaatatt aatggagatg tatataaaca tccaactaataaaaatcaat ttggaataca taatgataaa cttagtgaag ttaatatatc tcaaaatgattacattatat atgataataa atataaaaat tttagtatta gtttttgggt aagaattcctaactatgata ataagatagt aaatgttaat aatgaataca ctataataaa ttgtatgagagataataatt caggatggaa agtatctctt aatcataatg aaataatttg gacattcgaagataatcgag gaattaatca aaaactagca tttaactatg gtaacgcaaa tggtatttctgattatataa ataagtggat ttttgtaact ataactaatg atagattagg agattctaaactttatatta atggaaattt aatagatcaa aaatcaattt taaatttagg taatattcatgttagtgaca atatattatt taaaatagtt aattgtagtt atacaagata tattggtattagatatttta atatttttga taaagaatta gatgaaacag aaattcaaac tttatatagcaatgaaccta atacaaatat tttgaaggat ttttggggaa attatttgtt ttatgacaaagaatactatt tattaaatgt gttaaaacca aataacttta ttgataggag aaaagattctactttaagca ttaataatat aagaagcact attcttttag ctaatagatt atatagtggaataaaagtta aaatacaaag agttaataat agtagtacta acgataatct tgttagaaagaatgatcagg tatatattaa ttttgtagcc agcaaaactc acttatttcc attatatgctgatacagcta ccacaaataa agagaaaaca ataaaaatat catcatctgg caatagatttaatcaagtag tagttatgaa ttcagtagga aattgtacaa tgaattttaa aaataataatggaaataata ttgggttgtt aggtttcaag gcagatactg tcgttgctag tacttggtattatacacata tgagagatca tacaaacagc aatggatgtt tttggaactt tatttctgaagaacatggat ggcaagaaaa ataaaaatta gattaaacgg ctaaagtcat aaattcc

正向引物的核苷酸碱基序列如下：

CCC GGATCC CCA AAA ATT AAT AGT TTT AAT TAT AAT G

SEQ ID NO：11

其中，下划线是Bam HI内切酶位点，粗体是缺失起始密码的轻链序列。反向引物的序列是：

CCC CTGCAG tca TTT TTC TTG CCA TCC ATG TTC TTC

SEQ ID NO：12其中，下划线是Pst I内切酶位点，粗体是重链终止区域的末端序列，而粗体小写是终止密码。用标准的DNA合成方法制备这些引物。

用2条引物进行PCR反应，该反应含有不同量的Clostridiumbotulinum类型E(Belμga菌株)染色体DNA。用具有校读活性的DNA聚合酶(Pfx DNA聚合酶，来源于Life Technology)进行PCR反应，以免扩增的基因序列错误。扩增反应条件如下：95℃变性45秒，56℃退火45秒，68℃引物延伸3分钟48秒，30个循环。

用Bam HI和Hind III消化PCR产物，然后琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色凝胶表明是一条主带，大约3.5kb的DNA(参见图10)。从凝胶上切取含该片段的带，纯化DNA并连接到pQE30载体的Bam HI和Hind III切点上(Qiagen)。如前所述，连接的质粒转化到E.coliJM109菌株中，转化体铺在选择性LB琼脂平板上。收获数个克隆，并经限制性酶切检查含有正确的BoNT/E DNA插入片段。最后的构建体包括与pQE30载体上His₆标签融合的BoNT/E基因(缺少第一个蛋氨酸)，还包括2个额外的氨基酸残基(甘氨酸和丝氨酸)，它由工程的Bam HI位点所产生。

实例11通过定点突变构建蛋白水解钝化(Proteolytically-Inactive)

突变体BoNT/E

通过把BoNT/E多肽构建体212位的谷氨酸(在活性位点内)突变为谷酰胺，获得无蛋白水解钝化和无毒性单链BoNT/E多肽。

用常规的定点突变方法，在正向引物中引入谷酰胺的取代。突变DNA引物的序列是：

cag TTA ATA CAT TCA TTA CAT GGA CTA TAT G

SEQ ID NO：13其中，小写字母表示212位编码谷酰胺的密码。用上述引物和反向引物

ATG CAT TAA TGT AAG AGC AGG ATC TT

SEQ ID NO：14及Pfx DNA聚合酶(Life Technology)，按前述方法进行反向PCR反应。PCR模板是野生型单链BoNT/E构建体(称为pQEESCwt)。循环参数(30个循环)如下：1)95℃变性45秒；2)56℃退火45秒；3)68℃延伸7分钟48秒。

扩增反应结束后，用限制性酶Dpn I消化DNA模板，使之仅筛选突变的克隆。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切取一条大约7kb的带，纯化DNA，并用于在有T4 DNA连接酶(Promega)时自连，而多核苷酸激酶(Promega)的存在使PCR产物磷酸化。连接混合物用于转化E.coli DH10B菌株，转化体铺在选择性琼脂平板上。通过限制性消化鉴定了数个代表性转化体，其含有正确的质粒构建体，DNA测序也证实了突变。图11显示了构建突变BoNT/E质粒的方案和溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，PCR反应混合物(泳道2和3)及标准分子量(泳道1)。

实例12

单链重组BoNT/E的纯化

由于表达蛋白的N端有组氨酸标签，用金属亲和层析一步就能纯化重组神经毒素。

用E.coli M15菌株(Qiagen)表达BoNT/E单链构建体。该菌株携带一个内源质粒(pREP4，卡那霉素抗性)，它含有编码lac I^q阻遏子基因的区域，阻止了神经毒素基因在IPTG诱导前的转录。pQE30载体含有T5噬菌体RNA聚合酶启动子，它也能被E.coli RNA聚合酶识别。

含有pQEESCwt的M15单克隆在5ml 2YT培养基中于37生长过夜，2YT培养基还包括0.1mg/ml氨苄青霉素、0.025mg/ml卡那霉素和0.2％(w/v)葡萄糖，此5ml培养物用于接种500ml相同培养基。当第二次培养物的光密度达到600nm为0.5-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.3mM，于25培养过夜，表达神经毒素。

随后离心培养物，产生～2.3g湿细胞沉淀，悬浮于10ml提取缓冲液(20mM Hepes pH7.0，300mM NaCl，5mM苯甲咪，2uM胃蛋白酶抑制剂，2uM E-64)中。加入溶菌酶至终浓度0.25mg/ml，细胞悬浮液置冰上60分钟。再加入大约0.5ml玻璃珠(0.1mm直径，Biospec)，涡旋2分钟破碎细胞。10000Xg于4℃离心30分钟，得到无细胞提取物。用提取缓冲液预洗树脂，然后0.5ml Tal钴金属亲和树脂(Clontech)与上清在4℃下的旋转平台上温育45分钟。然后把树脂上样到一次性层析柱上，用10倍床体积的洗涤缓冲液(20mM Hepes pH7.0，300mM NaCl，2mM咪唑)洗涤2次，之后用6倍床体积的洗脱缓冲液(20mM Hepes pH7.0，300mM NaCl，150mM咪唑)洗脱结合的神经毒素。

洗脱液于4℃在含有150mM NaCl的10mM Hepes(pH7.0)中过夜透析，离心过虑浓缩(分子量截断阈10KDa)至蛋白终浓度为1mg/ml。

如图12所示，SDS-PAGE显示还原条件下亲和纯化的毒素纯度，然后考马斯染色，并且用Qiagen公司的鼠抗His单克隆抗体(稀释2000倍)进行Western杂交。用增强化学发光溶液(Santa Cruz)和鼠二抗辣根过氧化物酶(Sigma，纯化的亲和性)检测结合的抗体。每样品孔上样大约2μg蛋白样品。

实例13

纯化的重组BoNT/E单链多肽的胰蛋白酶活化

通过胰蛋白酶(终浓度为1.5μg/ml)切割单链来活化纯化的BoNT/E单链神经毒素多肽样品，反应在10mM Hepes(pH7.0)、150mM NaCl中进行，毒素浓度为1mg/ml，时间60分钟。反应后，用0.5mM PMSF和10μg/ml胰蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活。胰蛋白酶消化的质量用还原条件和非还原条件下SDS-PAGE检测并确证，然后考马斯染色，并且用鼠抗His单克隆抗体(稀释2000倍，Qiagen)和鼠抗Hc IgG单克隆(稀释26倍)进行聚丙烯酰胺凝胶的Western杂交。如图13所示，考马斯染色的切割蛋白在还原条件下分离成2条带，而重链和轻链在非还原条件下仍然有二硫键连接，与天然毒素相似。抗体检测的重组重链大小与其野生型Clostridium对应物大约相同，然而重组轻链的迁移比天然蛋白稍微较慢。后者的特性是由于N端His₆标签的额外残基造成的。

实例14

重组BoNT/E被蛋白水解活化

在HEPES缓冲的盐溶液(HBS，150mM NaCl，10mM HEPES，pH7.4，10μg/ml BSA)中制备1uM下列贮液：切割的天然BoNT/E毒素、未切割的单链重组毒素、切割的双链重组毒素和切割的突变(E212Q)BoNT/E。在有或没有20mM DTT存在时，这些样品于37℃温育30分钟，然后系列稀释于0.02ml HBS中，至终浓度如图14所示。

SNAP-25的140-205氨基酸与谷胱甘肽硫转移酶融合(称为GST-SNAP-25[140-205])，用此重组多肽为蛋白酶水解基质，来测定重组BoNT/E多肽的蛋白水解活性。10μg蛋白水解基质与毒素样品温育。消化反应中有或没有2mM DTT，于37℃进行30分钟，加SDS-PAGE样品缓冲液终止反应，随后煮沸5分钟。

SDS-PAGE(每泳道3μg GST-SNAP-25[140-205])电泳并银染分析上述样品。如图14所示，甚至未切割的重组单链毒素具有蛋白水解活性。正如预期的那样，突变体E212Q BoNT/E构建体没有可检测的蛋白水解活性。图14仅显示了GST-SNAP-25[140-205]带。

实例15

切割使重组BoNT/E具有完全功能

培养10天的小脑神经元(2×10⁶/22mm直径孔)，用Krebs-Ringer HEPES(KRH)缓冲液洗涤，然后置于特定浓度的天然BoNT/E(●)、胰蛋白酶切割的重组BoNT/E(○)或未切割的单链BoNT/E()(参见图15)。37℃，60分钟后，除去含有毒素的缓冲液，细胞洗涤2次，然后与含有0.25uCi/ml[¹⁴C]标记的谷酰胺(即谷氨酸前体)的KHR缓冲液温育。45分钟后，除去KHR缓冲液，神经元于37℃洗涤4次，评价谷氨酸的释放。对照和毒素处理的神经元在KHR缓冲液中于37℃温育5分钟，KHR缓冲液含有1.4mM Ca²⁺或0.5mM EGTA以评价非Ca²⁺依赖性释放，取小份测定其[¹⁴C]谷氨酸含量(参见下文)。

除去底部基质后，立即加入含有50mM KCl和1.4mM Ca²⁺或50mM KCl和0.5mM EGTA的KRH缓冲液，取小份刺激5分钟后，进行[14C]谷氨酸分析。最后神经元用含有1％ SDS(w/v)的20mM EGTA.NaOHpH7.5溶解，取小份测定细胞中残留的放射性剂量。用闪烁计数测定每个样品中[¹⁴C]谷氨酸剂量，在基线和刺激条件下的释放剂量用相对于所计算的总细胞含量的百分数表示。

每个样品的[¹⁴C]谷氨酸百分量是，含Ca²⁺的KRH样品值减去含EGTA缓冲液的值以得到Ca²⁺依赖性释放组分；含50mM KCl样品的值减去含Ca²⁺的KRH样品基线值，以得到K⁺诱发的Ca²⁺依赖性释放。这样，神经元的毒素处理值是相对于无毒素对照的百分数。

图15显示，尽管未切割的重组BoNT/E保持蛋白水解活性，但它比天然的或切割的重组BoNT/E具有非常显著低的活性。该发现表明未切割的毒素不能恰当地进入靶细胞。另外，切割的重组BoNT/E比天然毒素显得抑制谷氨酸释放更有效。

实例16在鼠神经肌肉末梢板，重组BoNT/E具有与天然毒素相同的神经肉

瘫痪活性：切割增加了效力

鼠膈神经的半隔膜在KR中浸泡，其中添加0.1％ BSA并被95％O₂/5％ CO₂所饱和。刺激(0.2Hz，1.5-2.5mV)膈神经，在加入以下成分之前和之后记录神经诱发的肌肉张力：0.2nM切割的重组BoNT/E(○)或0.2nM天然BoNT/E(□)(图16A)；和1nM未切割的重组BoNT/E(○)、1nM切割的重组BoNT/E(●)或0.05nM切割的重组BoNT/E()(图16B)。如图16A和图16B所示，切割的重组BoNT/E是有效的瘫痪剂，在分析中表现出的活性比天然毒素更大。在本次分析中，未切割的毒素活性比切割的毒素明显低。

在鼠中，把切割的重组BoNT/E通过肌内注射到后肢肌肉中，也显示出其神经肌肉瘫痪活性。用典型的肉毒中毒症状模式，通过足趾扩散反射分析评价，注射切割的重组BoNT/E导致了瘫痪。

把毒素注射到鼠体内，确定了切割的重组神经毒素在体内的神经毒性，其特异的神经毒性低于鼠LD₅₀ 10⁷单位/mg。

实例17

BoNT/E E212Q蛋白酶钝化突变体拮抗BoNT/E诱导的神经瘫痪

鼠膈神经的半隔膜暴露于10nM BoNT/E E212Q的KR培养基中，刺激神经，记录诱发的肌肉张力。如图17所示，BoNT E212Q突变体不能抑制传递，由于其不能降低神经诱发的肌肉张力(○)。为了测定该无毒性突变体拮抗天然毒素活性的能力，于4℃在MKR中浸泡鼠膈神经的半隔膜60分钟，其中添加0.1％ BSA并被95％ O₂/5％ CO₂所饱和，有(□)或没有(△)5nM BoNT/E E212Q的包含物。加入切割的天然BoNT/E(至终浓度0.05nM)，进一步温育组织30分钟。神经肌肉用MKR洗涤3次，然后用KR洗涤。刺激神经，记录诱发的肌肉张力，然后温度升到37℃。

如图17所示，在本次分析中，当隔神经的半隔膜预先与E212Q蛋白酶失活突变体一起温育时，推迟并拮抗了天然BoNT/E的起始活性，因此表明重组突变体完全结合到与天然毒素结合相同的细胞表面受体上。这样，本专利申请的方法可用于生产重组和修饰的毒素，其具有全功能的受体结合结构域，和与BoNT相关的转运细胞间治疗剂的分子。

本领域的技术人员懂得此处提供的实例描述了优选的组成和方法，懂得各种不同的克隆策略、蛋白酶切割位点和特异结合复合体成员可用于本发明的实践和应用，但这属于本发明的范围之内。另外，不同双链和双元毒素分子及其修饰的分子(例如，BoNT/B-E及其修饰的变异体)可作为本发明的方法和组成的基础。

序列表

<110>Dolly，James Oliver

Li，Yan

Chan，C.K.

Aoki，Kei Roger

<120>可活化的重组神源毒素

<130>17311

<150>60/150，710

<151>1999-08-25

<160>14

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>1

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1gactggtgga cagcaagtcg accggaagct ttacgacgat gacg 44

<210>2

<211>44

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2cgtcatcgtc gtaaagcttc cggtcgacttgctgtccacc agtc 44

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3aatagatcta gatcattaac agatttagga 30

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4ttctaaagat ctatacattt gataact 27

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5atgtatagat ctttagaata tcaagta 27

<210>6

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6atcgataagc ttttatcagt cgacccaaca atccagattt ttaga 45

<210>7

<211>65

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Engineered Intrachain Loop Region for C.Tetani

toxin

<400>7Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile1 5 10 15Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Gly Glu Lys Leu Tyr Asp Asp

20 25 30Asp Asp Lys Asp Arg Trp Gly Ser Ser Arg Ser Leu Thr Asp Leu Gly

35 40 45Gly Glu Leu Cys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu Lys

50 55 60Asn65

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8aatagaactg caggagaaaa gctttacgac gatgac 36

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR primer

<400>9gtcatcgtcg taaagctttt ctcctgcagt tctatt 36

<210>10

<211>4017

<212>DNA

<213>Clostridium botulinum

<400>10gaattcaagt agtagataat aaaaataatg ccacagattt ttattattaa taatgatata 60tttatctcta actgtttaac tttaacttat aacaatgtaa atatatattt gtctataaaa 120aatcaagatt acaattgggt tatatgtgat cttaatcatg atataccaaa aaagtcatat 180ctatggatat taaaaaatat ataaatttaa aattaggaga tgctgtatat gccaaaaatt 240aatagtttta attataatga tcctgttaat gatagaacaa ttttatatat taaaccaggc 300ggttgtcaag aattttataa atcatttaat attatgaaaa atatttggat aattccagag 360agaaatgtaa ttggtacaac cccccaagat tttcatccgc ctacttcatt aaaaaatgga 420gatagtagtt attatgaccc taattattta caaagtgatg aagaaaagga tagattttta 480aaaatagtca caaaaatatt taatagaata aataataatc tttcaggagg gattttatta 540gaagaactgt caaaagctaa tccatattta gggaatgata atactccaga taatcaattc 600catattggtg atgcatcagc agttgagatt aaattctcaa atggtagcca agacatacta 660ttacctaatg ttattataat gggagcagag cctgatttat ttgaaactaa cagttccaat 720atttctctaa gaaataatta tatgccaagc aatcaccgtt ttggatcaat agctatagta 780acattctcac ctgaatattc ttttagattt aatgataatt gtatgaatga atttattcaa 840gatcctgctc ttacattaat gcatgaatta atacattcat tacatggact atatggggct 900aaagggatta ctacaaagta tactataaca caaaaacaaa atcccctaat aacaaatata 960agaggtacaa atattgaaga attcttaact tttggaggta ctgatttaaa cattattact 1020agtgctcagt ccaatgatat ctatactaat cttctagctg attataaaaa aatagcgtct 1080aaacttagca aagtacaagt atctaatcca ctacttaatc cttataaaga tgtttttgaa 1140gcaaagtatg gattagataa agatgctagc ggaatttatt cggtaaatat aaacaaattt 1200aatgatattt ttaaaaaatt atacagcttt acggaatttg atttacgaac taaatttcaa 1260gttaaatgta ggcaaactta tattggacag tataaatact tcaaactttc aaacttgtta 1320aatgattcta tttataatat atcagaaggc tataatataa ataatttaaa ggtaaatttt 1380agaggacaga atgcaaattt aaatcctaga attattacac caattacagg tagaggacta 1440gtaaaaaaaa tcattagatt ttgtaaaaat attgtttctg taaaaggcat aaggaaatca 1500atatgtatcg aaataaataa tggtgagtta ttttttgtgg cttccgagaa tagttataat 1560gatgataata taaatactcc taaagaaatt gacgatacag taacttcaaa taataattat 1620gaaaatgatt tagatcaggt tattttaaat tttaatagtg aatcagcacc tggactttca 1680gatgaaaaat taaatttaac tatccaaaat gatgcttata taccaaaata tgattctaat 1740ggaacaagtg atatagaaca acatgatgtt aatgaactta atgtattttt ctatttagat 1800gcacagaaag tgcccgaagg tgaaaataat gtcaatctca cctcttcaat tgatacagca 1860ttattagaac aacctaaaat atatacattt ttttcatcag aatttattaa taatgtcaat 1920aaacctgtgc aagcagcatt atttgtaagc tggatacaac aagtgttagt agattttact 1980actgaagcta accaaaaaag tactgttgat aaaattgcag atatttctat agttgttcca 2040tatataggtc ttgctttaaa tataggaaat gaagcacaaa aaggaaattt taaagatgca 2100cttgaattat taggagcagg tattttatta gaatttgaac ccgagctttt aattcctaca 2160attttagtat tcacgataaa atctttttta ggttcatctg ataataaaaa taaagttatt 2220aaagcaataa ataatgcatt gaaagaaaga gatgaaaaat ggaaagaagt atatagtttt 2280atagtatcga attggatgac taaaattaat acacaattta ataaaagaaa agaacaaatg 2340tatcaagctt tacaaaatca agtaaatgca attaaaacaa taatagaatc taagtataat 2400agttatactt tagaggaaaa aaatgagctt acaaataaat atgatattaa gcaaatagaa 2460aatgaactta atcaaaaggt ttctatagca atgaataata tagacaggtt cttaactgaa 2520agttctatat cctatttaat gaaaataata aatgaagtaa aaattaataa attaagagaa 2580tatgatgaga atgtcaaaac gtatttattg aattatatta tacaacatgg atcaatcttg 2640ggagagagtc agcaagaact aaattctatg gtaactgata ccctaaataa tagtattcct 2700tttaagcttt cttcttatac agatgataaa attttaattt catattttaa taaattcttt 2760aagagaatta aaagtagttc agttttaaat atgagatata aaaatgataa atacgtagat 2820acttcaggat atgattcaaa tataaatatt aatggagatg tatataaata tccaactaat 2880aaaaatcaat ttggaatata taatgataaa cttagtgaag ttaatatatc tcaaaatgat 2940tacattatat atgataataa atataaaaat tttagtatta gtttttgggt aagaattcct 3000aactatgata ataagatagt aaatgttaat aatgaataca ctataataaa ttgtatgaga 3060gataataatt caggatggaa agtatctctt aatcataatg aaataatttg gacattcgaa 3120gataatcgag gaattaatca aaaattagca tttaactatg gtaacgcaaa tggtatttct 3180gattatataa ataagtggat ttttgtaact ataactaatg atagattagg agattctaaa 3240ctttatatta atggaaattt aatagatcaa aaatcaattt taaatttagg taatattcat 3300gttagtgaca atatattatt taaaatagtt aattgtagtt atacaagata tattggtatt 3360agatatttta atatttttga taaagaatta gatgaaacag aaattcaaac tttatatagc 3420aatgaaccta atacaaatat tttgaaggat ttttggggaa attatttgct ttatgacaaa 3480gaatactatt tattaaatgt gttaaaacca aataacttta ttgataggag aaaagattct 3540actttaagca ttaataatat aagaagcact attcttttag ctaatagatt atatagtgga 3600ataaaagtta aaatacaaag agttaataat agtagtacta acgataatct tgttagaaag 3660aatgatcagg tatatattaa ttttgtagcc agcaaaactc acttatttcc attatatgct 3720gatacagcta ccacaaataa agagaaaaca ataaaaatat catcatctgg caatagattt 3780aatcaagtag tagttatgaa ttcagtagga aattgtacaa tgaattttaa aaataataat 3840ggaaataata ttgggttgtt aggtttcaag gcagatactg tcgttgctag tacttggtat 3900tatacacata tgagagatca tacaaacagc aatggatgtt tttggaactt tatttctgaa 3960gaacatggat ggcaagaaaa ataaaaatta gattaaacgg ctaaagtcat aaattcc 4017

<210>11

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR primer

<400>11cccggatccc caaaaattaa tagttttaat tataatg 37

<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR primers

<400>12cccctgcagt catttttctt gccatccatg ttcttc 36

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>13cagttaatac attcattaca tggactatat g 31

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>14atgcattaat gtaagagcag gatctt 26

Claims

1.一种被分离的单链多肽，包括：

a)第一个氨基酸序列区域，它包括

i)第一个结构域，它包括在生理条件下能特异地结合靶细胞表面标识物的结合元件；和

ii)第二个结构域，它包括能提供跨囊泡膜转移多肽的转运元件；及

b)第二个氨基酸序列区域，它包括治疗因子，当其释放到靶细胞质中时，该治疗因子具有生理活性。

其中，第一个和第二个氨基酸序列区域是被第三个氨基酸序列区域分隔开来的，第三个氨基酸序列区域包括一个蛋白酶切割位点，只有当暴露于蛋白酶中时该位点才发生切割；其前提是，在所述表达单链多肽的细胞中，在正常情况下不表达所说的蛋白酶。

2.权利要求1的多肽，其第一个氨基酸序列区域至少包括一部分梭状芽孢杆菌神经毒素H链。

3.权利要求2的多肽，其部分梭状芽孢杆菌神经毒素H链是由C.botulinum亚型A的神经毒素重链衍生而来。

4.权利要求2的多肽，其第二个氨基酸序列区域至少包括梭状芽孢杆菌神经毒素L链的一部分。

5.权利要求4的多肽，其梭状芽孢杆菌神经毒素L链的部分是由C.botulinum亚型A、B或E其中之一的神经毒素衍生而来。

6.权利要求2的多肽，其部分梭状芽孢杆菌神经毒素H链是由C.tetani的神经毒素衍生而来。

7.权利要求2的多肽，其部分梭状芽孢杆菌神经毒素H链是由以下一种所选生物的神经毒素重链衍生而来：C.botulinum亚型B，C.botulinum亚型C，C.botulinum亚型D，C.botulinum亚型E，C.botulinum亚型F，C.botulinum亚型G，C.baratii和C.butyricum。

8.权利要求1的多肽，其第一个结构域包括一个能结合到胰腺腺泡细胞表面的结合元件。

9.权利要求8的多肽，其第二个结构域包括梭状芽孢杆菌神经毒素L链。

10.权利要求1的多肽，其结合元件特异结合感觉传入神经元的靶细胞表面标识物。

11.权利要求1-10的任一多肽，其切割蛋白酶切割位点的蛋白酶，包括选自一组以下蛋白酶：

a)非人肠激酶；

b)烟草蚀刻病毒蛋白酶；

c)源于Bacillus subtilus的蛋白酶；

d)来源于Bacillus amyliquifaciens的蛋白酶；

e)来源于鼻病毒的蛋白酶；

f)木瓜蛋白酶；

g)昆虫木瓜蛋白酶的同源物和

h)甲壳动物木瓜蛋白酶的同源物。

12.权利要求1的多肽，其组成蛋白酶切割位点包括的氨基酸序列选自：

a)DDDDK；

b)EXXYXQS/G；

c)HY；

d)YH和

e)LEVLFQGP，

其中X为任一氨基酸。

13.权利要求1或权利要求11的多肽还包括结合标签。

14.权利要求13的多肽，其结合标签包括多肽的靶结合部分，该多肽选自：His₆、单克隆抗体、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽硫转移酶、蛋白A和钙调蛋白结合蛋白。

15.权利要求1的多肽，其第一个氨基酸序列区域至少包括重链部分，它来源于第一个梭状芽孢杆菌神经毒素亚型；其第二个氨基酸序列区域至少包括轻链部分，它来源于第二个梭状芽孢杆菌神经毒素亚型；其第一个和第二个梭状芽孢杆菌神经毒素亚型是不相同的

16.权利要求15的多肽，其重链部分选自一组重链，包括HC_A、HC_B、HC_C1、HC_D、HC_E、HC_F和HC_G；其轻链部分选自一组轻链，它包括LC_A、LC_B、LC_C1、LC_D、LC_E、LC_F、LC_G；其轻链和重链部分来源于不同的梭状芽孢杆菌神经毒素亚型。

17.权利要求16的多肽，其重链和轻链部分，至少其一分别比所说的来源于梭状芽孢杆菌神经毒素亚型的完整重链或轻链小。

18.权利要求16的多肽，其重链和轻链部分分别包括所说的来源于梭状芽孢杆菌神经毒素亚型的完整重链或轻链。

19.权利要求1、2、8、10或15的任一多肽，其第一或第二个氨基酸序列区域是修饰的，至少除去一个被蛋白酶特异性切割的氨基酸序列。

20.一种有核酸序列区域的质粒，该区域包括一个编码可切割的单链多肽的开放阅读框架，该开放阅读框架包括：

a)第一个核苷酸序列区域，它包括

i)编码第一个氨基酸序列区域的第一部分，包括在生理条件下能特异的结合靶细胞表面标识物的结合元件；和

ii)编码第二个氨基酸序列区域的第二部分，包括能便利多肽跨囊泡膜转移的转运元件；

b)编码第三个氨基酸序列区域的第二个核苷酸序列区域，包括治疗因子，当释放到靶细胞质中时，该治疗因子具有生物活性；及其第一和二个核苷酸序列区域被第三个核苷酸序列区域分隔开来，它编码第四个氨基酸序列区域，该区域包蛋白酶切割位点，当暴露于蛋白酶中时该位点发生切割；其前提是在表达所说的单链多肽的细胞中，在正常情况下不表达所说的蛋白酶；其单链多肽用所说的质粒在适宜的宿主细胞中表达。

21.权利要求20的质粒，其第一和第二个核苷酸序列区域进一步包括编码结合标签的氨基酸序列区域。

22.权利要求21的质粒，其结合标签包括多肽的靶结合部分，该多肽选自His₆、单克隆抗体、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽硫转移酶、蛋白A和钙调蛋白结合蛋白。

23.权利要求20的质粒，其第一个核苷酸序列区域至少编码梭状芽孢杆菌神经毒素的重链的一部分。

24.权利要求23的质粒，其第一个核苷酸序列区域至少编码C.botulinum神经毒素的重链的一部分。

25.权利要求23的质粒，其第一个核苷酸序列区域至少编码C.tetani神经毒素的重链的一部分。

26.权利要求20或23的质粒，其第二个核苷酸序列区域至少编码梭状芽孢杆菌神经毒素的轻链的一部分。

27.权利要求26的质粒，其第二个核苷酸序列区域至少编码C.botulinum神经毒素的轻链的一部分。

28.权利要求26的质粒，其第二个核苷酸序列区域至少编码C.tetani神经毒素的轻链的一部分。

29.权利要求20的质粒，其第一个核苷酸序列区域编码结合元件，它特异结合除运动神经元以外的细胞类型。

30.权利要求29的质粒，其第一个核苷酸序列区域编码结合元件，它特异结合的细胞类型选自一组细胞，包括胰腺腺泡细胞和感觉传入神经元。

31.权利要求20的质粒，其第二个核苷酸序列区域编码治疗因子而不是梭状芽孢杆菌神经毒素的轻链。

32.一种制备由梭状芽孢杆菌神经毒素衍生的单链多肽的方法，包括：

a)把权利要求20-31任一质粒转化到适宜的宿主细胞中，

b)在该宿主细胞中培养，及

c)允许或诱导宿主细胞表达该质粒编码的轻链多肽。

33.一种纯化权利要求13的重组单链多肽的方法，包括的步骤是：裂解表达所说单链多肽的细胞，产生细胞溶解产物，把这些细胞溶解产物与靶化合物接触，形成特异结合复合体，它包括其结合标签及其靶化合物，且可被固定化。

34.一种被分离的单链多肽包括：

a)第一个氨基酸序列区域，它包括

i)第一个结构域，它包括结合元件，在生理条件下结合元件能特异结合靶细胞表面标识物；和

ii)第二个结构域，它包括能便利多肽的跨囊泡膜转移转运元件；及

b)第二个氨基酸序列区域，它包括治疗因子，当其释放到靶细胞质中时，该治疗因子具有生理活性，

其中，第一个和第二个氨基酸序列区域是被第三个氨基酸序列区域分隔开来的，第三个氨基酸序列区域包括BoNT/E神经毒素的链间茎环区。