CN1382158A - 多细胞因子－抗体复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括至少两种不同细胞因子分子的蛋白复合物和融合蛋白。所述蛋白复合物和融合蛋白还可以包括诸如免疫球蛋白区段的靶向部分。本发明还公开了使用所述蛋白复合物和融合蛋白的方法。

Description

多细胞因子-抗体复合物
                        相关申请参考
本申请要求1999年8月9日申请的美国专利申请序号60/147,924的权益，美国专利申请序号60/147,924的公开内容通过引用结合到本文中。
                          发明领域
本发明涉及构建和表达多细胞因子蛋白复合物及其组合物的方法。更具体地讲，本发明涉及由多种细胞因子和一种靶向组分组成的融合蛋白，以及使用所述融合蛋白治疗如癌症和病毒感染的疾病的方法。
                          发明背景
控制免疫系统的调节网络依赖于称为细胞因子的分泌性蛋白信号分子开启和关闭免疫细胞的功能以及调节它们的增殖。这些反应一般涉及协调产生所需要的生物效应的多种细胞因子。某些细胞因子如白介素-2(IL-2)可以单独诱导免疫细胞增殖，并可以激活其它的功能，包括次级细胞因子分泌。另一种细胞因子白介素-12(IL-12)[综述：Trinchieri，1994，Blood 84：4008-4027]可诱导某些免疫细胞增殖，并可以诱导另一种关键免疫调节物γ干扰素(IFN-γ)。这种对IFN-γ的诱导是IL-12的主要活性，但是IL-12具有其它重要的独立于IFN-γ的活性。因为IL-12本身是在感染性疾病的早期被诱导，所以认为IL-12是联系先天免疫系统和后天免疫系统的纽带。
对小鼠和人类免疫细胞的许多体外研究说明了细胞因子组合在产生最适免疫应答中的重要性。例如，大多数T细胞不表达IL-12受体(IL-12R)，直到它们被促细胞分裂原激活或在高浓度IL-2下培养才表达该受体[Desai等(1992)，J.Immunol.148：3125-3132]。一旦表达IL-12受体，则所述细胞对IL-12的反应性要强得多。而且，IL-12诱导IFN-γ转录，但此后不久IFN-γmRNA就被降解。在IL-2存在时，IFN-γmRNA是稳定的，使产生的IFN-γ量急剧增加[Chan等(1992)J.Immunol.148：92-98]。在其他研究中，发现IL-3+IL-11或IL-3+青灰因子的细胞因子组合与IL-12一起对早期造血祖细胞的增殖具有协同作用[以上引用的Trinchieri，1994]。IL-4和GM-CSF组合对刺激树突细胞特别有用(Palucka等[1998]J.Immunology 160：4587-4595)。为了刺激细胞介导的免疫应答，还可使用IL-12与IL-18的组合，IL-18是最近公开的一种具有某些IL-12互补活性的Th1-促进型细胞因子(Hashimoto等[1999]J.Immunology 163：583-589；Barbulescu等[1998]J.Immunology 160：3642-3647)。另外，IL-2与IFN-γ在某些情况下产生协同作用[Palladino，M.A.，美国专利第5,082,658号]。
在许多协同作用研究中，发现每种细胞因子的相对水平非常重要。尽管在存在次优量IL-2时加入IL-12在诱导增殖、溶细胞活性和IFN-γ诱导方面产生协同作用，但发现其中一种细胞因子使用高剂量的IL-2和IL-12组合是拮抗性的[Perussia等，J.Immunol.149：3495-3502(1992)；Mehrotra等，J.Immunol.151：2444-2452(1993)]。IL-12和IL-7组合也存在相似的情况。
IL-12和其它细胞因子在小鼠中产生抗肿瘤反应的协同研究也显示混合性各种结果。在某些模型中，在每种细胞因子的次优剂量和导致毒性增强的较高剂量观察到协同作用，而在其它模型中，IL-12和IL-2组合显示很小或没有协同作用[参见例如Nastala等，J.Immunol.153：1697-1706.(1994)]。这些结果可能反映出体内组合两种潜在协同因子的固有困难，尤其是当需要保持两种具有不同药理特性(如不同的循环半衰期和生物分布)的因子的固定活性比时。
在体外细胞培养实验中，可直接控制细胞因子水平，但许多因素可以影响体内细胞因子的相对生物分布和定位，因此影响它们的免疫刺激能力。这些因素中最重要的是半衰期。在单次快速注射后IL-2的循环半衰期约为10分钟。与这些药代动力学特性显著不同的是，已经报道了IL-12在小鼠中的循环半衰期大于3小时[Wysocka等(1995)Eur.J.Immunol.25：672]，而在人体内的循环半衰期为5-10小时[Lotze等(1996)Ann NY Acad Sci 795：440-454]。
这种差异被认为是由于IL-2和GM-CSF都相对较小(15-25kD，而IL-12为75kD)，使得IL-2和GM-CSF可被肾过滤清除。分子量小于约50kD的蛋白可被肾过滤清除。几乎所有的细胞因子都小于50kD，并存在相似快速的肾过滤清除。当需要用两种这样的被快速清除的小细胞因子治疗时，仅共同给予所述细胞因子就可以了。然而，共同给予对于半衰期显著不同的细胞因子并不是最优的。
难以系统给予细胞因子，因为它们具有有害的副作用。例如，高水平的α-干扰素导致严重副作用，包括皮肤、神经、免疫和内分泌毒性。预期多细胞因子融合蛋白可能出现特别严重的副作用。
为减少系统给予细胞因子的副作用，一种策略是将一种细胞因子与第二种具有靶向能力的分子融合。其中Fc区位于另一种蛋白的N端的融合蛋白(称为‘免疫融合蛋白’或‘Fc-X’融合蛋白，其中X为配体，如α-干扰素)具有许多与众不同的有利生物特性[Lo等，美国专利第5,726,044号和第5,541,087号；Lo等，Protein Engineering 11：495]。具体来说，这样的融合蛋白仍可以结合细胞表面上的相关Fc受体。然而，当所述配体结合细胞表面上的其受体时，Fc区的取向改变，介导抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体结合的序列似乎被封闭。结果，Fc-X分子中的Fc区没有有效介导ADCC或补体结合。N端细胞因子和C端Fc区的融合蛋白产生的细胞毒性作用是众所周知的。例如，IL-2与Fc区的N端融合产生一种能够结合具有IL-2受体的细胞、结合补体并因此溶解细胞的分子[Landolfi，N.F.(1993)，美国专利第5,349,053号]。相反，Fc-IL-2融合蛋白不具有这种特性。因此，预期Fc-X融合蛋白具有增加血清半衰期和肝中相对浓度的功效，而没有ADCC和补体结合的有害副作用。
已经证明，许多不同的短血清半衰期蛋白可以Fc-X构型与Fc区融合，获得的融合蛋白具有长得多的血清半衰期。然而，两种不同Fc融合蛋白的血清半衰期一般不相同。因此，当需要传递两种不同的X部分时，共同给予两种不同的Fc-X蛋白一般不是最优的。
在某些情况下，较好的方法是通过将细胞因子融合至对细胞表面抗原具有特异性和亲和性的抗体(或其衍生片段)(Gillies，美国专利第5,650,150号；Gillies等，Proc.Natl.Acad.Sci.89：1428)，或通过肽键以融合蛋白形式使蛋白抗原和刺激性细胞因子连接(Hazama等，Vaccine 11：629)，将细胞因子的作用靶向细胞表面抗原。尽管抗体自身可增加融合细胞因子的半衰期，但在和相同抗体融合的不同细胞因子融合蛋白之间仍存在差异[参见例如Gillies等，BioconjugateChem.4：230-235(1993)；Gillies等，J.Immunol.160：6195-6203]，这种差异使得难以在靶位共同定位。如上所述，这可以导致细胞因子活性不平衡，降低所需要的协同作用。另外，使用两种不同的融合蛋白需要分别测试每种融合蛋白的安全性和有效性分布，然后作为混合物进一步测试。
                      发明概述
本发明提供两种或多种不同细胞因子的复合物或融合物，它们可用于一般免疫治疗以及靶向免疫治疗。这些复合物或融合物可选地包括其它蛋白部分。所述复合物或融合物的一个特征在于它们提供细胞因子组分固定活性比。
一般而言，本发明涉及含有至少两种不同细胞因子的蛋白复合物。所述细胞因子可位于同一多肽链中，或者可通过共价键(如二硫键或化学交联形成的键)连接。或者，所述细胞因子可为稳定的非共价键结合。在某些优选的实施方案中，所述蛋白复合物包含在哺乳动物中使所述复合物靶向特定部位的靶向部分，如抗体或抗体片段。
在一个优选的实施方案中，本发明提供将一种双链细胞因子(如IL-12)的生物活性和第二种细胞因子的生物活性组合在一起的蛋白复合物。所述细胞因子互相之间可共价结合(例如融合)。所述细胞因子还可以通过其它部分结合。例如，含有第二种细胞因子的多肽链可包括特异性结合IL-12的结合部分，如IL-12抗体或IL-12受体。或者，所述结合部分可作用于结合IL-12的第二个部分。例如，如果编码IL-12亚单位的多肽链还包括抗生物素蛋白，则含有第二种细胞因子的多肽可包括作为靶向部分的生物素蛋白。在一个优选的实施方案中，所述第二种细胞因子为IL-2。
本发明提供制备IL-12融合蛋白的方法，所述融合蛋白既保持IL-12活性，也保持第二种细胞因子的活性，所述融合蛋白在提供一种类似于IL-12自身的更长的单一药代动力学特性的同时，延长第二种细胞因子的活性持续时间，并在注射入动物后保持两种细胞因子的活性平衡。
在本发明的另一个实施方案中，所述融合蛋白包含异源二聚体形式的IL-12，其中IL-12的p35和p40亚单位通过二硫键连接，并在IL-12的p35或p40亚单位的N端或C端与第二种细胞因子共价结合，通式为IL-12-X或X-IL-12，其中X为第二种细胞因子。
在本发明的另一个实施方案中，所述融合蛋白包含与单链(sc)形式IL-12的N端或C端共价结合的第二种细胞因子，通式为scIL-12-X或X-scIL-12，其中所述单链形式的IL-12包含两个通过柔性肽接头连接的多肽亚单位。
在再一个实施方案中，两种细胞因子进一步融合至一种能够形成二聚体或多聚体结构的蛋白，融合部位在所述蛋白链的氨基端或羧基端。在该实施方案的一个优选形式中，IL-12与第二种细胞因子的一种融合蛋白形式进一步融合至能够二聚体化的免疫球蛋白(Ig)链的一部分，如Fc区。进一步的实施方案包括在Ig链部分的任一端的至少一条IL-12多肽链和在另一端融合的第二种细胞因子的融合蛋白。
在另一个实施方案中，两种或多种细胞因子与因为结合特异性受体具有靶向能力的蛋白融合。例如，Fc区能够结合肝脏富有的Fc受体。Fc区与多种细胞因子的融合蛋白例证了二聚体和靶向的优势，但在某些情况下可构建仅具有多聚化能力或靶向能力但二者不同时具备的多种细胞因子的融合蛋白。
在再一个实施方案中，包含多种细胞因子的融合蛋白进一步在氨基端或羧基端与具有多种靶向能力的分子类型中的一种分子融合，所述分子例如为抗体或具有或不具有支架结构的适体(aptamer)(Colas等[1998]Proc Natl Acad Sci USA.95：14272-7)。一个具体的实施方案是多种细胞因子与能够结合抗原的抗体的至少一部分(如完整抗体、单链抗体或单链Fv区)的融合蛋白。其它的实施方案包括在能够结合抗原的至少一部分抗体链的任一端的至少一条IL-12多肽链与融合在另一端的第二种细胞因子的融合蛋白。
按照以上的描述，一般优选通过遗传工程技术使组成蛋白通过共价键(如酰胺键或二硫键)连接，构建多细胞因子融合蛋白和多细胞因子-抗体融合蛋白。但是，也可使用化学交联剂构建所述蛋白复合物。这样的方法在蛋白质化学领域是成熟的方法。另一方面，有时通过将不同的细胞因子与配偶体蛋白融合形成稳定非共价复合物就足以制得蛋白复合物。例如，使用一种非共价异源二聚体支持蛋白：第一种细胞因子融合至所述异源二聚体的一个亚单位，第二种细胞因子融合至所述异源二聚体的第二个亚单位，然后在合适的条件下混合两种融合蛋白。例如，在同一细胞中表达编码两种亚单位-细胞因子融合蛋白的核酸。因此，可构建其中组成细胞因子直接或间接非共价连接的多细胞因子蛋白复合物。为达到本发明的目的，所述复合物必须在给予动物时保持足够稳定并实现生物效应。
本发明还提供编码包含两种或多种细胞因子的融合蛋白的核酸，其中一种细胞因子优选为IL-12，而由所述核酸编码的融合蛋白可选地包括其它蛋白部分。优选的实施方案包括编码两种或多种细胞因子与二聚体蛋白(如抗体链的Fc部分)的融合蛋白的核酸。另一组优选实施方案为编码两种或多种细胞因子与具有靶向能力的蛋白(如抗体)的融合蛋白的核酸。
本发明还提供构建两种或多种细胞因子的融合蛋白的方法以及表达这样的融合蛋白的方法。
本发明还提供治疗疾病和其它病症的方法，其中治疗包括两种或多种蛋白活性的有效组合。在一个实施方案中，至少一种蛋白具有短血清半衰期(例如少于20分钟)或仅具有中等血清半衰期(例如少于40分钟)。通过遗传工程或其它技术融合所述蛋白并给予人或动物。因此，两种蛋白的活性为固定活性比，并且不需要按照两种蛋白的不同给药方案分别给予。另外，融合蛋白的血清半衰期一般更近似于血清半衰期较长的蛋白组分的血清半衰期，因此延长了血清半衰期较短蛋白的有效半衰期。
更具体地说，本发明提供免疫治疗性治疗可用一种双链细胞因子(如IL-12)和第二种细胞因子联合有效治疗的疾病(如癌症或感染或其它疾病)的方法。在一个优选实施方案中，IL-12与IL-2或GM-CSF融合并给予动物或人。在其它优选的实施方案中，GM-CSF与IL-4融合并给予动物或人。在另一个优选实施方案中，IL-12与IL-18融合并给予动物或人。所述治疗可与其它疾病治疗联合使用。另外，本发明提供针对多种抗原的免疫方法，所述方法可用于预防或治疗各种疾病。
在这些方法的其它实施方案中，两种不同的细胞因子与二聚体蛋白部分(如抗体的Fc区)融合并给予动物或人。在这些方法的一个优选形式中，细胞因子IL-12和第二种细胞因子与Fc区融合，所述第二种细胞因子更优选IL-2或GM-CSF。
在这些方法另外的其它实施方案中，两种不同的细胞因子与完整抗体融合，并给予动物或人。在这些方法的一个优选形式中，细胞因子IL-12和第二种细胞因子与抗体部分融合，所述第二种细胞因子更优选IL-2或GM-CSF。本发明还公开了可用于治疗疾病的抗体-细胞因子融合蛋白混合物。在一个实施方案中，使用抗体-IL-2融合蛋白与抗体-IL-12融合蛋白的混合物治疗疾病。例如，治疗癌症、病毒感染或细菌感染。
                            附图简述
当同时阅读以下说明书和附图时，可更充分地理解本发明的前述目的和其它目的及其各种特征。
图1A图示说明两种细胞因子最简单形式的融合蛋白：一种细胞因子可选地通过接头与第二种细胞因子融合。图1B-1I显示了其中第二种细胞因子(标记为‘cyt’)可连接至异源二聚体细胞因子IL-12的各种方式。具体地说，第二种细胞因子可融合至p40的C端(图1B)、p40的N端(图1C)、p35的C端(图1D)或p35的N端(图1E)。另外，图1显示第二种细胞因子如何与单链型IL-12融合。具体而言，单链IL-12分子可为p35(N端)至p40，而第二种细胞因子在C端(图1F)或N端(图1G)。或者，单链IL-12分子可为p40(N端)至p35，而第二种细胞因子在C端(图1H)或N端(图1I)。
图2A-2C图示说明图1描述的多细胞因子融合蛋白(框形)进一步如何与抗体的Fc区(图中所示为铰链区(H)、CH2结构域和CH3结构域(各种卵形))融合。具体而言，图1中的8种分子中的任一种均可与Fc区的C端(图2A)或N端(图2B)融合。另外，第一种细胞因子和第二种细胞因子(分别为框形)互相之间不需要直接连接，而可以通过Fc部分连接(图2C)。
图3A-3G图解显示多细胞因子融合蛋白进一步与完整免疫球蛋白(如IgG)融合的亚类方式。重链V区显示为卵形标记的VH，轻链V区显示为卵形标记的VL，而恒定区为空白卵形。图1例举的多细胞因子融合蛋白可位于重链的C端(图2A)、重链的N端(图2B)、轻链的N端(图2C)或轻链的C端(图2D)。另外，有多种方式可将第一种和第二种细胞因子分别连接至重链和轻链的N端和C端；图3E-3G显示了其中的三种。
图4A-4C图解显示第一种细胞因子和第二种细胞因子如何与“单链”抗体融合，其中所述抗体的可变区轻链和可变区重链融合，并且所述蛋白以单一多肽表达，然后同源二聚体化。具体地说，多细胞因子融合蛋白可位于C端(图4A)或N端(图4B)。另外，第一种细胞因子和第二种细胞因子不需要直接连接，而可通过单链抗体部分连接(图4C)。
图5A-5C图解显示第一种细胞因子和第二种细胞因子如何与单链Fv区(由重链和轻链的可变区融合组成)融合。具体地说，第一种细胞因子-细胞因子融合蛋白可位于C端(图5A)或N端(图5B)。另外，第一种细胞因子和第二种细胞因子不需要直接连接，而可通过单链Fv部分连接(图5C)。
图6A和6B显示在单独细胞因子或融合蛋白作用下，IL-12和IL-2诱导人外周血单核细胞(PBMC)产生IFN-γ的协同作用。在图6A中，在植物凝集素活化之前(方形)或之后(X形)用人IL-12处理细胞，或在植物凝集素活化之前(菱形)或之后(三角形)用IL-12-IL-2融合蛋白处理细胞。图6B显示其中细胞以1∶1摩尔比加入IL-12和IL-2的混合物(黑色菱形)、人Fc-IL-12-IL-2融合蛋白(灰色方块)和人抗体-IL-12-IL-2融合蛋白(浅灰三角)处理的实验。X轴表示IL-12的浓度(pg/ml)，无论其是以完整蛋白存在还是以融合蛋白存在。y轴表示应用ELISA测定的IFN-γ浓度(ng/ml)。
图7显示了分别检测融合蛋白活性并比较其与非融合IL-12分子活性的典型IL-12生物测定。所描述的是小鼠IL-12(空白圆圈)、小鼠IL-12与以1∶1摩尔比加入的IL-2的混合物(黑色方块)、小鼠IL-2(空白三角形)和抗体-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白(黑色菱形)对人PBMC的3H-胸苷摄取的刺激作用。X轴表示单体细胞因子的浓度(pM)，无论其是以完整蛋白存在还是以融合蛋白存在；y轴表示掺入氚化胸苷的cpm。
图8显示标准的IL-2生物活性测定。曲线图显示小鼠IL-2(圆圈)、抗体-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白(菱形)和小鼠IL-12(方块)对小鼠CTLL细胞增殖的刺激作用。X轴表示单体细胞因子的浓度(pM)，无论其是以完整蛋白存在还是以融合蛋白存在。在含各种量的细胞因子或融合蛋白的培养基中培养细胞48小时，然后使用MTT/MTS测定检测活细胞数。y轴表示490nm吸光度的光密度(OD)单位。
图9显示了小鼠IL-12(空白圆圈)、小鼠IL-12与以1∶1摩尔比加入的IL-2的混合物(黑色圆圈)、小鼠Fc-单链IL-12-IL-2融合蛋白(黑色三角形)和融合小鼠IL-2的小鼠单链IL-12(黑色菱形)对人PBMC的3H-胸苷摄取的刺激作用。x轴表示单体细胞因子的浓度(pM)，无论其是以完整蛋白存在还是以融合蛋白存在；y轴表示掺入氚化胸苷的cpm。
图10显示了小鼠IL-12(空白圆圈)、小鼠IL-12与以1∶1摩尔比加入的GM-CSF的混合物(黑色圆圈)、小鼠GM-CSF(黑色三角形)和小鼠Fc-小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白(X形)对人PBMC的3H-胸苷摄取的刺激作用。x轴表示单体细胞因子的浓度(pM)，无论其是以完整蛋白存在还是以融合蛋白存在；y轴表示掺入氚化胸苷的cpm。
图11显示抗体-细胞因子-细胞因子融合蛋白治疗带有皮下肿瘤的Balb/C小鼠的功效，所述皮下肿瘤由工程为表达人EpCAM(KS-1/4抗原)的CT26结肠癌细胞产生。黑色菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS对照的小鼠肿瘤平均体积。三角形表示用6μg KS-IL-12-IL-2治疗的小鼠中的平均肿瘤体积。正方形表示用3.4μg KS-IL2和5.3μgKS-IL12治疗的小鼠中的平均肿瘤体积。进行肿瘤内注射。x轴表示首次注射后经过的天数；y轴表示平均肿瘤体积(mm3)。
图12.显示抗体-细胞因子-细胞因子融合蛋白治疗带有皮下肿瘤的SCID小鼠的功效，所述皮下肿瘤由工程为表达人EpCAM的CT26结肠癌细胞产生。菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS对照的小鼠中的平均肿瘤体积。三角形表示用6μg KS-IL-12-IL-2治疗的小鼠中的平均肿瘤体积。正方形表示用3.4μg KS-IL2和5.3μg KS-IL12治疗的小鼠中的平均肿瘤体积。进行肿瘤内注射。x轴表示首次注射后经过的天数；y轴表示平均肿瘤体积(mm3)。
图13显示抗体-细胞因子和抗体-细胞因子-细胞因子融合蛋白治疗带有皮下肿瘤的小鼠的功效，所述皮下肿瘤由工程为表达人EpCAM的Lewis肺癌(LLC)细胞产生。菱形表示在第0、1、2、3和4天肿瘤内注射PBS对照的小鼠中的平均肿瘤体积。正方形表示在第0、1、2、3和4天肿瘤内注射20μg KS-IL2的小鼠中的平均肿瘤体积。三角形表示在第0、1、2、3和4天肿瘤内注射20μg KS-IL12的小鼠中的平均肿瘤体积。X形表示在第0、1、2、3和4天肿瘤内注射20μg KS-IL-12-IL-2的小鼠中的平均肿瘤体积。x轴表示首次注射后经过的天数；y轴表示平均肿瘤体积(mm3)。
图14显示抗体-细胞因子-细胞因子融合蛋白对带有皮下肿瘤的小鼠的治疗功效，所述皮下肿瘤由工程为表达人EpCAM的Lewis肺癌细胞产生。菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS对照的小鼠中的平均肿瘤体积。三角形表示用20μg KS-IL-12-IL-2治疗的小鼠中的平均肿瘤体积。正方形表示用11.5μg KS-IL2和18μg KS-IL12治疗的小鼠中的平均肿瘤体积。进行肿瘤内注射。x轴表示首次注射后经过的天数；y轴表示平均肿瘤体积(mm3)。
图15显示抗体-细胞因子-细胞因子融合蛋白对带有皮下肿瘤的小鼠的治疗作用，所述皮下肿瘤由表达或不表达人EpCAM的Lewis肺癌细胞产生。黑色正方形表示带有LLC-KSA衍生肿瘤的小鼠中的平均肿瘤体积。黑色菱形表示带有LLC衍生肿瘤的小鼠中的平均肿瘤体积。在第0、1、2、3和4天用20μg KS-IL12-IL2治疗小鼠。进行肿瘤内注射。x轴表示首次注射后经过的天数；y轴表示平均肿瘤体积(mm3)。
图16显示抗体-细胞因子-细胞因子融合蛋白对带有皮下肿瘤的小鼠的治疗功效，所述皮下肿瘤由Lewis肺癌细胞产生。在第0天皮下注射约106细胞。菱形表示原初小鼠的平均肿瘤体积。正方形表示先前带有Lewis肺癌细胞(工程为表达人EpCAM)产生的皮下肿瘤但已被KS-IL12-IL2治愈的小鼠中的平均肿瘤体积。x轴表示首次注射后经过的天数；y轴表示平均肿瘤体积(mm3)。
图17A和17B显示肿瘤细胞分泌的单一细胞因子蛋白或多细胞因子蛋白对该细胞在免疫系统正常的动物中形成肿瘤能力的作用。在图17A中，比较4组小鼠：皮下注射1×106 LLC肿瘤细胞的C57BL/6小鼠(黑色菱形)；皮下注射5×106LLC肿瘤细胞的C57BL/6小鼠(白色菱形)；皮下注射1×106表达scIL-12的LLC肿瘤细胞的C57BL/6小鼠(黑色三角形)；以及皮下注射5×106表达scIL-12的LLC肿瘤细胞的C57BL/6小鼠(白色三角形)。图17B比较了皮下注射1×106LLC肿瘤细胞的C57BL/6小鼠(黑色菱形)；皮下注射5×106 LLC肿瘤细胞的C57BL/6小鼠(白色菱形)；皮下注射1×106表达scIL-12-IL-2的LLC肿瘤细胞的C57BL/6小鼠(X形)；以及皮下注射5×106表达scIL-12的LLC肿瘤细胞的C57BL/6小鼠(白色圆圈)。x轴表示注射所述肿瘤细胞后的天数。y轴表示肿瘤体积(mm3)。
图18显示肿瘤细胞分泌的单一细胞因子蛋白或多细胞因子蛋白对该细胞在免疫缺陷型动物中形成肿瘤能力的作用。该图比较了皮下注射1×106LLC肿瘤细胞的SCID小鼠(黑色菱形)；皮下注射1×106表达scIL-12的LLC肿瘤细胞的SCD小鼠(黑色三角形)；以及皮下注射1×106表达scIL-12的LLC肿瘤细胞的SCID小鼠(白色圆圈)。x轴表示注射所述肿瘤细胞后的天数。y轴表示肿瘤体积(mm3)。
                              发明详述
本发明提供其中两种或多种不同的细胞因子融合或复合的蛋白分子。所述蛋白复合物或融合蛋白可选地包括其它的蛋白部分，包括具有多聚体化和靶向能力的部分，例如抗体Fc区和包括抗原结合部位的抗体区。本发明还提供编码多细胞因子融合蛋白的核酸。本发明还提供构建多细胞因子融合蛋白编码核酸的方法、产生多细胞因子融合蛋白的方法以及使用多细胞因子融合蛋白治疗疾病和病症的方法。
本文使用的“细胞因子”是指调节免疫系统细胞活性的分泌性蛋白或其活性片段或突变体。细胞因子的实例包括白介素、干扰素、趋化因子、肿瘤坏死因子、免疫细胞前体的集落刺激因子等。
本文使用的“异源二聚体细胞因子”是指由两种不同蛋白亚单位组成的细胞因子。IL-12是目前唯一已知的天然异源二聚体细胞因子。但是，可构建人工异源二聚体细胞因子。例如，IL-6和IL-6R可溶性片段可组合形成异源二聚体细胞因子，CNTF和CNTF-Rα同样可以构建异源二聚体[Trinchieri(1994)Blood 84：4008]。
本文使用的“白介素-12”(IL-12)是指由p35和p40亚单位组成的两个亚单位细胞因子，或p35和p40的活性单链融合物，或其种变异体、片段或衍生物。
本文使用的“白介素-2”(IL-2)是指任何哺乳动物IL-2，如人IL-2、小鼠IL-2或其活性种变异体或等位基因变异体、片段或衍生物。
本文使用的“GM-CSF”是指哺乳动物粒细胞/单核细胞-集落刺激因子细胞因子蛋白，如人GM-CSF、小鼠GM-CSF或其活性种变异体或等位基因变异体、片段或衍生物。
本文使用的“免疫球蛋白Fc区”是指免疫球蛋白重链恒定区的羧基端部分，或其类似物或部分。例如，IgG的免疫球蛋白Fc区可包含至少一部分铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个优选的实施方案中，Fc区包括至少一部分铰链区和CH3结构域。在另一个优选的实施方案中，Fc区包括至少CH2结构域，更优选还包括至少一部分铰链区。
本文使用的“肽接头”是指用于将两种蛋白(例如一个蛋白和一个Fc区)偶联在一起的一个或多个肽。所述肽接头经常是一系列氨基酸，例如主要为甘氨酸和/或丝氨酸。所述肽接头最好是主要为甘氨酸和丝氨酸残基的混合系列，约10-15个氨基酸长度。
本文使用的术语“多聚(的)”是指两个或多个蛋白亚单位通过共价或非共价作用(例如二硫键连接)稳定结合。
本文使用的术语“二聚(的)”是指其中两个蛋白亚单位通过共价或非共价作用稳定结合的特定多聚分子。一种稳定复合物是解离速率至少几分钟的复合物，使得所述复合物在体内使用时稳定足够长时间，以到达靶组织并具有生物效应。Fc片段自身通常形成重链片段二聚体，所述重链片段包含一部分铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域。然而，已知许多蛋白配体结合其二聚体受体。如果细胞因子X天然二聚化，则Fc-X分子中的X部分高得多的程度上二聚化，因为二聚体化过程是浓度依赖性的。由Fc连接的两种X部分的物理接近使二聚体化成为分子内过程，将平衡向有利于二聚体化的方向大幅移动，并增强了其与受体的结合。
本文使用的“载体”是指包含核苷酸序列的任何核酸，它能够掺入到宿主细胞中并与宿主细胞基因组重组和整合入其中，或能够作为附加体自主复制。这样的载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒、RNA载体、病毒载体等。病毒载体的非限制性实例包括反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒。
本文使用的“基因表达”或“蛋白表达”是指DNA序列的转录、mRNA转录物的翻译以及蛋白产物的分泌或可分离形式的蛋白产物的产生。
本文使用的“免疫细胞因子”是如美国专利第5,650,150号公开的包含抗体和细胞因子的融合蛋白。
本文使用的“前导序列”是这样一种蛋白序列：它通常在N端与第二种蛋白序列连接，并引导细胞分泌第二种蛋白序列。前导序列通常由第二种蛋白序列中切除，使所述蛋白成为成熟蛋白。术语“前导序列”一般与“信号序列”同义。
本文使用的“EpCAM”代表上皮细胞粘附分子(Cirulli等[1998]140：1519-1534)，与“KSA”同义，是指单克隆抗体KS-1/4结合的抗原。EpCAM是一种在上皮细胞衍生的癌细胞上丰富表达的细胞表面蛋白。
本文使用的“KS-1/4”是指结合EpCAM的特定单克隆抗体。
本文使用的“KS-IL2”、“KS-IL12”和“KS-IL12-IL2”等是指分别由KS-1/4与IL-2、KS-1/4与IL-12以及KS-1/4与IL-12和IL-2二者组成的抗体-细胞因子融合蛋白。本文还使用类似名称的融合蛋白构建物。因为细胞因子可能在几个位置融合在抗体分子上，所以诸如“KS-IL12-IL2”的描述是指包含在任何可能的位置与IL-12和IL-2二者融合的KS-1/4的蛋白类型，除非另外明确说明。
本文使用的“14.18”是指结合肿瘤特异性抗原GD2的特定单克隆抗体。
在图1-5中举例说明了数个体现本发明的说明性蛋白构建物实施方案。图2-5图示的分子组成部分标记为1A-1I，是指图1A-1I所示的融合蛋白，说明图1的任何融合蛋白均可进一步融合至所示的其它蛋白。细胞因子以矩形表示，抗体恒定区以卵形表示，而重链可变区和轻链可变区以标记卵形表示。
本发明描述了包含两种不同细胞因子和可选地包括另外的蛋白部分的蛋白复合物。同源二聚体细胞因子(例如α干扰素、β干扰素、γ干扰素、IL-5、IL-8等)尽管含有多个亚单位，但仍然是单个细胞因子。同样，异源二聚体细胞因子如IL-12尽管含有不同的亚单位，但也是单个细胞因子。而且，正常同源二聚体细胞因子的异源二聚体形式(如MCP-1/MCP-2异源二聚体)或正常同源二聚体细胞因子的两种等位基因的异源二聚体(例如Zhang，J.Biol.Chem.[1994]269：15918-24)，也是单一细胞因子。本发明的复合物包含两种不同的细胞因子，其中每种细胞因子(例如IL-2和IL-12；IL-4和GM-CSF；MCP-1和eotaxin等)都能够调节免疫系统细胞的活性。
图1A描述了本发明的优选实施方案：在融合蛋白10中，第一种细胞因子12的C端可选地通过连接区(未显示)融合至第二种细胞因子14的N端。在本发明的某些实施方案中，本发明的蛋白复合物包含至少两种血清半衰期显著不同的细胞因子。例如，使用小蛋白和大蛋白通常导致融合蛋白具有较大蛋白的循环半衰期特征。因此，在需要IL-12和第二种细胞因子的联合作用的情况下，优选将两种细胞因子表达为以下通式的融合蛋白：IL-12-X或X-IL-12，其中X为第二种细胞因子。观察到两种特别的优势。首先，更快被清除的细胞因子的血清半衰期延长。第二，两种细胞因子的血清半衰期互相之间变得非常相似。
诸如IL-12的双链细胞因子可在其任一条链的N端或C端与另一个细胞因子融合。在一个实施方案中，第二种细胞因子融合在IL-12的p35或p40亚单位的N端或C端(图1B-1E)。在图1B的融合蛋白16中，第一种细胞因子12的N端融合至IL-12亚单位p40 18的C端。亚单位p40 18通过共价键22与IL-12亚单位p35 20连接。在图1C的融合蛋白24中，p40亚单位18的N端融合至第一种细胞因子12的C端，并通过共价键22与p35亚单位20连接。图1D描述了其中第一种细胞因子12的N端融合至p35亚单位20的C端的融合蛋白26，p35亚单位20通过共价键22与p40亚单位18连接。在图1E中，融合蛋白28包括p35亚单位20，其N端融合第一种细胞因子12的C端，并通过共价键22与p40亚单位18连接。
在第二个实施方案中，IL-12亚单位可融合形成单链蛋白scIL-12，处于N端部位的或者为p35亚单位或者为p40亚单位；第二种细胞因子可结合至产生的scIL-12的N端或C端(图1F-1I)。因此，在图1F描述的一个优选实施方案中，融合蛋白30包含单链IL-12，其中p40亚单位18的N端可选地通过肽接头融合至p35亚单位20的C端。在该实施方案中，细胞因子12的N端融合至p40亚单位18的C端。在图1G显示的实施方案中，p35亚单位20的N端可选地通过肽接头融合至细胞因子12的C端。图1H和1I显示了包含另一种单链型IL-12的融合蛋白34和36，其中p35亚单位的N端可选地通过肽接头融合至p40亚单位的C端。在图1H显示的融合蛋白34中，细胞因子12的N端融合至p35亚单位的C端。在图1I显示的融合蛋白36中，p40亚单位18的N端融合至细胞因子12的C端。在一个高度优选的实施方案中，IL-12融合至IL-2。
在实施例中进一步描述了这些分子的制备。
将异源多聚体分子如IL-12或抗体表达为其中不相同的亚单位通过短氨基酸接头连接的单链分子通常是很方便的[Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879；Lieschke等(1997)Nat Biotechnol.15：35；Lieschke；G.J.和Mulligan；R.C.，美国专利第5,891,680号]。构建基因融合物，然后可以在包含单一重组DNA构建物的细胞中表达需要的蛋白。这样的单链型异源多聚体细胞因子可进一步融合至第二种细胞因子，这仍然允许由单一重组DNA构建物表达具有需要活性的融合蛋白。在实施例中描述了所述分子的表达。
本发明还描述了包含IL-4和GM-CSF的融合蛋白。该组合在功能性刺激树突细胞提呈抗原方面特别有用。另一种有用的融合蛋白包含IL-12和IL-18。这些细胞因子都促进Th1应答，但互补活性稍有不同。
本发明还描述了其中多种不同的融合细胞因子进一步融合至能够形成多聚体(如同源二聚体或异源二聚体)的蛋白的融合蛋白。这种分子的优势在于二聚体化可增强一种或多种细胞因子的效力。在某些情况下，二聚化对效力的增强可能因为细胞因子结合其二聚体受体。在一个实施方案中，多种细胞因子融合至抗体分子的一部分，如Fc区(图2)。在另一个实施方案中，IL-12和第二种细胞因子融合至同源二聚化蛋白部分。在一个优选的实施方案中，所述第二种细胞因子为IL-2或GM-CSF。所述融合蛋白可以各种方式产生，反映几种不同蛋白部分由融合蛋白的N端至C端的所有不同排序。例如当IL-12和第二种细胞因子融合至Fc区时，两种细胞因子都可以任何顺序融合至Fc区的N端或C端，或者一种细胞因子可融合在N端，而另一种细胞因子融合在C端。
在图2描述了一些这样的排列。例如，在图2A所示的实施方案中，本发明的融合蛋白44融合至含有铰链区38、CH2区40和CH3区42的Fc区的C端。融合蛋白44可具有各种结构，包括例如图1A-1I中描述的融合蛋白10、16、24、26、28、30、32、34或36的结构。如果融合蛋白44如同融合蛋白16、24、26和28一样具有一个以上的N端和C端，则Fc区可融合至融合蛋白44的任一个N端。如图2B所示，融合蛋白44可融合至Fc区的N端。在图2C所示的实施方案中，第一种细胞因子12可融合至Fc区的N端，而第二种细胞因子14可融合至Fc区的C端。结构设想
要着重指出的是，细胞因子作为一类蛋白质，在大小和一般折叠特性上是相似的。因此，本文公开的具体实施例描述了如何构建细胞因子蛋白家族的多细胞因子融合蛋白。例如，许多细胞因子属于称为“四螺旋束”的蛋白折叠类型。四螺旋束蛋白包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、生长激素、睫状神经营养因子(CNTF)、苗条蛋白、促红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素5(IL-5)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、IL-2、IL-4、白介素3(IL-3)、IL-10、β干扰素、α干扰素和密切相关的τ干扰素以及γ干扰素(IFN-γ)。
除了IL-5和IFN-γ以外，所有这些蛋白都折叠为具有四个大致平行的α螺旋和两个交叉连接的单体。在除了IL-5和IFN-γ以外的每种情况下，N端和C端都在所述蛋白的同一面。因为IL-5和IFN-γ以外的四螺旋束蛋白都具有相同的折叠模式，本文描述的用于IL-2、IL-4和GM-CSF的方法也适用于其它四螺旋束蛋白和其它的折叠为单体的细胞因子小蛋白。
趋化因子是一类特殊的细胞因子，人们认为其形成胞外梯度和介导特定类型免疫细胞的趋化性。例如，MCP-1是单核细胞、巨噬细胞和活化T细胞的化学引诱物；eotaxin是嗜酸性粒细胞的化学引诱物；而IL-8是嗜中性粒细胞的化学引诱物。趋化因子除了其化学引诱物功能以外，同其它细胞因子一样，也能够诱导特定基因在特定的靶细胞中表达。例如，认为MCP-1在血管平滑肌细胞中诱导组织因子表达(Schecter等，J Biol Chem.[1997]272：28568-73)。
本发明公开了其中一种或多种细胞因子为趋化因子的细胞因子-细胞因子融合蛋白和抗体-细胞因子-细胞因子融合蛋白。本发明还公开了具有三种或三种以上的细胞因子的蛋白构建物，其中一种或多种细胞因子为趋化因子。例如，趋化因子IP-10、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、巨噬细胞趋化蛋白、eotaxin、淋巴趋化因子(lymphotactin)、BLC可融合至有或没有其它部分(如抗体部分)的第二种细胞因子。
例如人基因组编码至少50个趋化因子。已知的趋化因子一般具有相似的三维单体结构和蛋白折叠模式。因此，本文公开的一般类型的蛋白构建物和构建策略可适用于各种已知的趋化因子和迄今尚未发现的趋化因子。
趋化因子具有一种独特的含三个β链和一个α螺旋的折叠模式。在某些但不是所有情况下，趋化因子折叠为单体，然后在折叠后二聚化。对于所有的趋化因子，单体亚单位的折叠模式相同，整体结构极其相似。例如，IL-8、血小板因子4、黑素瘤生长刺激因子(MGSA)、巨噬细胞炎性蛋白、MIP、RANTES(受激活作用调节的正常T细胞表达和分泌的蛋白)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1、MCAF)、Eotaxin、单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)、fractalkine趋化因子结构域、嗜中性白细胞活化肽-2(NAP-2)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、巨噬细胞炎性蛋白-2、趋化因子hcc-2(巨噬细胞炎性蛋白-5)、Groβ、细胞因子诱导性嗜中性白细胞化学引诱物和CINC/Gro的三维结构已通过X射线晶体学和/或NMR方法测定；所有这些结构都显示相同的折叠和广泛的相似。因为趋化因子具有相同的折叠模式，所以本文描述的用于淋巴趋化因子的方法也适用于其它趋化因子蛋白。
趋化因子的自由N端对其功能通常很重要。因此，在某些实施方案中可优选构建其中第二种细胞因子、抗体部分或其它蛋白部分与趋化因子C端融合的融合蛋白。为了构建含有两种活性趋化因子的蛋白复合物，例如将两种不同趋化因子融合至抗体重链和轻链的N端是有效的。某些趋化因子如IL-8在生理条件下为二聚体。对于某些用途，有效的作法是共表达多细胞因子抗体融合蛋白(如IL-8-抗体-细胞因子融合蛋白)以及未融合的IL-8部分或具有不与抗体部分相互作用的不同融合配偶体的IL-8部分。因此，不同的IL-8部分可异源二聚化而没有在所有的IL-8部分都融合至抗体链时可能导致的空间约束或多聚化。然后可根据大小或根据与抗体结合蛋白(如葡萄球菌A蛋白)的结合分离需要的多细胞因子融合蛋白。
对于含有趋化因子的多细胞因子融合蛋白，一个优选的实施方案为所述融合蛋白还包含定位功能，如结合抗原的抗体部分。尽管希望不受理论的束缚，但是一般认为趋化因子在体内的广泛分布将失去作用或导致细胞对所述趋化因子全面脱敏。另外，认为趋化因子的化学引诱物功能仅可以在所述趋化因子存在浓度差时才能表现出来。
一个优选的实施方案是淋巴因子-抗体-IL-2融合蛋白。另一个优选的实施方案是其中趋化因子和第二种细胞因子都促进Th1应答的融合蛋白。例如，含有IP-10和IL-12的融合蛋白是一个高度优选的
实施方案。延长血清半衰期短的多细胞因子的半衰期
本发明还描述了含有两种细胞因子的融合蛋白，所述两种细胞因子的血清半衰期均短，并融合至血清半衰期长的第三部分。例如，当需要刺激树突细胞时，有效的做法是将IL-4和GM-CSF活性组合在一起(Thurner，J Immunol.Methods[1999]223：1-15；Palucka等，[1998]J Immunol.160：4587-4595)。因为IL-4和GM-CSF都是血清半衰期短的小分子，所以构建含有Fc区、IL-4和GM-CSF的融合蛋白是有用的。得到的分子是树突细胞增殖和活性的强刺激物。同样地，IL-4和GM-CSF都可以融合至靶向组分(如抗体)，以便将组合的细胞因子活性传递至表达预定抗原的细胞部位。
单独的Fc区或作为完整抗体组成部分的Fc区，可以赋予多细胞因子融合蛋白几种特性，这些特性可能是有利的或是不利的，取决于具体的用途。这些特性包括二聚体化、延长血清半衰期、结合补体的能力、介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力以及与Fc受体结合。如果血清半衰期延长是主要需要的特征，并且Fc区的免疫特性是不重要或不需要的，则优选使用缺乏一种或多种免疫特性的Fc区天然变异体或突变体。例如，如果需要均等或延长两种或多种血清半衰期短的细胞因子的血清半衰期，则优选构建含有人IgG2或IgG4的Fc区的多细胞因子融合蛋白，所述人IgG2或IgG4的Fc区各自对Fc受体的亲和力降低或消失，或者优选使用在Fc受体结合位点具有突变的Fc区。实际上，已经表明某些细胞因子与抗体的融合蛋白增加了所述融合蛋白对Fc受体的亲和性，导致其在动物体内的清除速率更快。使用对Fc受体亲和力降低的Fc区极大改善这些分子的血清半衰期(Gillies等[1999]Cancer Res.59：2159-2166)。在某些情况下并取决于所使用的细胞因子，结合Fc受体的Fc区导致多细胞因子融合蛋白内化和一种或多种细胞因子部分的降解。靶向
本发明还描述了其中两种或多种细胞因子连接到能够将所述细胞因子定位到特定靶分子、细胞或机体部位的蛋白的融合蛋白。优选的具有定位能力的分子为抗体或含有抗原结合可变区的抗体部分。然而，可以使用其它定位分子或其结构域，诸如特异性配体或受体、天然存在的结合蛋白、结合特定底物的酶、经选择特定结合或定位能力的人工制备肽、具有产生靶向能力的特殊物理-化学特性的肽、因为与另一个靶向分子结合而具有靶向能力的蛋白或其它类型的蛋白。在融合两种细胞因子至靶向分子的情况下，优选的第一种细胞因子为IL-12。当使用IL-12时，优选的第二种细胞因子为IL-2或GM-CSF。
在使用抗体的情况下，存在无数可将两种或多种细胞因子融合的方式，因为存在若干可能的连接部位。例如，IgG抗体由两个重链和两个轻链组成。两种细胞因子可互相融合，然后融合至重链或轻链中任一条链的N端或C端。或者，每种细胞因子可分别融合至所述抗体分子上的一个N端或C端。
图3描述了一部分可将两种细胞因子融合至抗体分子的方法。例如，参照图3A，本发明的融合蛋白44可融合至免疫球蛋白重链46的C端，而免疫球蛋白重链46与免疫球蛋白轻链48相连。如图2所示，融合蛋白44可具有许许多多的结构，包括例如图1A-1I中描述的融合蛋白10、16、24、26、28、30、32、34或36的结构。如图3B所示，融合蛋白44可融合至与免疫球蛋白轻链48相连的免疫球蛋白重链46的N端。在图3C和3D显示的实施方案中，融合蛋白44融合至与免疫球蛋白重链46相连的免疫球蛋白轻链48的N端(图3C)或C端(图3D)。如图3E和3F所示，第一种细胞因子12可融合至免疫球蛋白轻链48，而免疫球蛋白轻链48与融合第二种细胞因子14的免疫球蛋白重链46相连。细胞因子12和14可融合至免疫球蛋白链的N端(图3E)或C端(图3F)。或者，如图3G所示，第一种细胞因子12可融合至免疫球蛋白轻链48的N端，而第二种细胞因子14融合至免疫球蛋白重链46的C端。与单链抗体融合
将抗体表达为单链抗体有时是非常适合的。本发明还提供其中两种或多种细胞因子融合至单链抗体的融合蛋白。其优势是在表达特别用于基因治疗的需要的融合蛋白时减少了使用的DNA构建物数。具体地说，如果所述细胞因子为单链分子，则其与单链抗体的融合将允许所述融合蛋白以单一蛋白链表达。
如图4A-4C所示，在某些实施方案中，细胞因子可融合至单链抗体的N端、C端或两端。例如，如图4A所示，融合蛋白44可融合至具有轻链可变区52和重链可变区54的单链抗体50的C端。如图4B所示，融合蛋白44也可融合至单链抗体50的N端。在图4C显示的实施方案中，第一种细胞因子12融合至单链抗体50的N端，而第二种细胞因子融合至单链抗体50的C端。
一个优选的实施方案包含IL-12和第二种细胞因子与单链抗体的融合蛋白。一个更优选的实施方案包含作为第二种细胞因子的IL-2或GM-CSF。
抗体的恒定区具有介导各种效应子功能的潜能。例如，IgG1介导补体结合、ADCC和与Fc受体的结合。所述细胞因子融合的位置可改变抗体恒定区的效应子功能，这在需要调节这些效应子功能时是有用的。
在某些情况下，可能需要构建两种或多种细胞因子与具有抗体靶向区但不具有恒定区的部分的融合蛋白。这样的融合蛋白小于完整抗体与两种或多种细胞因子的融合蛋白，这可能在某些用途上具有优势。另外，这样的融合蛋白缺少完整抗体的一种或多种效应子功能，但仍保留抗体的靶向能力。
因此本发明的特征在于其中两种或多种细胞因子融合至单链Fv区的融合蛋白。如图5A-5C描述的实施方案所示，两种细胞因子可融合至Fv区的N端或C端，或者一端融合一种细胞因子。例如，如图5A所示，本发明的融合蛋白44可融合至含有免疫球蛋白轻链可变区52和免疫球蛋白重链可变区54的单链Fv区的C端。融合蛋白44还可以融合至示于图5B的Fv区的N端。如图5C所示，第一种细胞因子12可融合至Fv区的N端，而第二种细胞因子14可融合至Fv区的C端。作为多细胞因子异源二聚体载体的抗体
在某些情况下，需要构建两种或多种细胞因子的融合蛋白，其中对于两种所述细胞因子而言，所述蛋白的同一末端是其活性必须的。例如，两种不同的细胞因子的天然存在的N端对每种细胞因子的活性都可能是必不可少的。不可能构建其中两种细胞因子部分都有活性的单一多肽链融合蛋白。
抗体为由重链和轻链组成、通过二硫键共价连接的异源二聚体蛋白。如果需要构建具有两种细胞因子部分(都需要完整的非融合N端)的多细胞因子融合蛋白，最好将所述两种细胞因子分别融合至抗体重链和轻链的N端(图3E)。同样地，如果需要构建具有两种细胞因子部分(都需要完整的非融合C端)的多细胞因子融合蛋白，最好将所述两种细胞因子分别融合至抗体重链和轻链的C端(图3F)。如果所述抗体仅用作以此方式连接两种细胞因子的载体，则突变或去除所述抗体的那些具有其它免疫功能相关特性的部分可能有用。例如，可优选使用Fab区作为载体，因为Fab区保留了抗体的异源二聚体特征但缺少Fc区的功能特征。使用其中抗原结合部位无功能的抗体或抗体片段也可能有用。
多种细胞因子与抗体的融合蛋白兼有多种本发明的新特征。在抗体-多细胞因子融合蛋白中，所述细胞因子的血清半衰期均等或延长；两种细胞因子的活性局限于靶，并避免了由于系统给予多种协同作用的细胞因子而产生的特别毒性作用；各细胞因子有效二聚化或多聚化；所述细胞因子不需要直接融合但可以融合至抗体分子重链和轻链上的不同部位。
在设计含有多种细胞因子和一种抗体的融合蛋白时，存在许多可通过常规实验方法区分的选择和构型。结构性生物学设想也是有用的。例如，许多细胞因子属于叫做4螺旋束的一类。这些结构由4个α螺旋组成，并且N端和C端在同一邻近位置。一般而言，细胞因子在N端和C端周围的一面不用于结合细胞因子受体，所以任一端都可用于和抗体或第二种细胞因子融合。然而，有时由于空间原因难以直接将4螺旋束细胞因子的N端和C端融合至不同的部分。因此，当需要将两种不同的4螺旋束细胞因子融合至抗体时，有效作法是将每种细胞因子融合至所述抗体上的不同部位。或者，如果必须构建Ig链-细胞因子-细胞因子形式的多肽链，则可使用一种或多种柔性接头克服空间问题。
还可能使用其它分泌性异源二聚体分子代替抗体来携带多种细胞因子。例如，可使用包括前列腺特异性抗原和与其复合的蛋白酶抑制剂的复合物、IgA重链和J链、TGF-β家族成员及其虾红素样结合配偶体或IL-12。核酸
本发明的特征还在于能够表达上述每种类型蛋白的核酸。这些核酸包括含两种或多种细胞因子的融合蛋白的编码核酸、含两种或多种细胞因子以及二聚体化结构域(如Fc区)的融合蛋白的编码核酸、含两种或多种融合至抗体的细胞因子的融合蛋白的编码核酸以及含两种或多种融合至Fc区的细胞因子的融合蛋白的编码核酸。优选形式的核酸为可在细菌和哺乳动物细胞中表达融合蛋白的DNA载体。对于含多条多肽链的融合蛋白，可使用一个以上的编码核酸。或者，可将两种或多种融合蛋白编码序列置于单一核酸分子上。实施例描述了编码多细胞因子的特征核酸的具体形式。
本发明的核酸特别用于表达多细胞因子融合蛋白，或用于产生这些蛋白或用于基因治疗目的。
在实施例中描述了合成本发明有用实施方案的方法，以及用于测试其药理学活性的测定。
本发明还提供药用组合物及其用于治疗和预防各种疾病(包括但不限于治疗各种感染和癌症)的方法，以及针对各种疾病的疫苗接种。
多细胞因子融合蛋白可用于治疗细菌、寄生物、真菌或病毒感染，或者用于治疗癌症。例如，已知IL-12在许多类型的感染中具有保护作用，所述感染包括但不限于细菌单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)感染；寄生物鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)和曼氏裂体吸虫(Schistosomamansoni)感染；真菌白色念珠菌(Candida albicans)感染；以及病毒脉络丛脑膜炎病毒和巨细胞病毒感染。因为细胞因子一般联合起作用，故使用含两种或多种已知协同起作用的细胞因子常常是有用的。例如，因为IL-2增强IL-12的作用，所以在治疗细菌、寄生物、真菌和病毒感染性疾病时组合这些细胞因子是有用的。
治疗感染性疾病的一个优选方法是使用进一步融合至靶向剂的多细胞因子融合蛋白，所述靶向剂将所述多种细胞因子靶向感染部位。以下描述各种靶向策略。
可使用固体、半固体或液体剂型的本发明药用组合物，例如丸剂、胶囊剂、粉末剂、液体制剂、悬浮剂等，优选适用于准确剂量给予的单位剂型。所述组合物包括常规药用载体或赋形剂，以及另外可包括其它医疗药物、药用剂、载体、佐剂等。这样的赋形剂可包括其它蛋白，例如人血清白蛋白或血浆蛋白。制备所述剂型的实际方法是已知的，或者是对本领域技术人员而言显而易见的。要给予的组合物或制剂在任何情况下都含有一定量的活性组分，其量可有效在受治疗患者体内实现治疗作用。
关于所述组合物的给予，可通过任何已接受的给予模式，以使所给予的药物具有所述活性。这些给药方法包括口服、胃肠外或局部给予以及其它的系统形式，注射是优选的给予方法。
当然，给予活性化合物的量取决于要治疗的患者、病患的严重程度、给予方式和主治医师的判断。
如上所述，已经研究了细胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、IL-4和其它一些细胞因子在治疗癌症方面的作用。在某些情况下，使用多细胞因子融合蛋白治疗癌症是有利的，原因是给予较简单、增加了一种组成细胞因子的血清半衰期和/或良好调节两种细胞因子的相对活性。
治疗癌症的一个优选方法是将细胞因子靶向特定的器官和组织，因此可集中细胞因子的功效，并可避免系统分布的副作用。例如，期望多种细胞因子和Fc区的融合蛋白集中于肝脏，这对于治疗局限于肝脏的癌症有利。一个更优选的方法是使用进一步融合至靶向剂(如抗体)的多细胞因子融合蛋白。具体地说，抗体KS-1/4和14.18针对肿瘤特异性抗原(Varki NM等，Cancer Res[1984]44：681-7；Gillies等，Journal of Immunological Methods 125：191[1989]；美国专利第4,975,369号和第5,650,150号)。当使用抗体-多细胞因子融合蛋白时，常常需要分析肿瘤类型和选择针对可能存在于所述类型肿瘤上的抗原的抗体。例如，可通过FACS分析、蛋白质印迹、检测肿瘤DNA或仅鉴定肿瘤细胞类型，特征鉴定肿瘤。这样的肿瘤表征方法是肿瘤表征领域技术人员(如肿瘤学家和肿瘤生物学家)众所周知的。还可通过多种其它方法靶向多细胞因子融合蛋白，如与特异性配体或受体部分融合、与具有预先选定的结合活性的肽适体融合、与具有定位特性的小分子化学结合等等。这些靶向方法还可用于治疗其它疾病，如感染。通过基因疗法治疗癌症和其它细胞疾病
本发明的核酸可用作治疗癌症和其它需要将免疫系统靶向特殊细胞类型的疾病的基因治疗药物。例如，由人或动物中取出癌细胞，将一种或多种编码多细胞因子融合蛋白的核酸转染入癌细胞中，然后将癌细胞再导入人或动物体内。或者可将DNA引入到癌细胞原位。人或动物随后建立起针对癌细胞的免疫应答，这可治愈或缓解癌症。可通过众多技术中的任一种，将偶合至在哺乳动物细胞中促进表达的合适调节元件的多细胞因子基因融合物转染入癌细胞中，所述方法包括磷酸钙法、“基因枪”法、腺病毒载体转染方法、阳离子脂质体转染方法、反转录病毒载体转染方法或任何其它有效的转染方法。所述核酸可编码进一步融合至其它部分的多细胞因子融合蛋白。
采用表达一种以上融合细胞因子的融合蛋白的核酸进行的抗癌基因治疗可与其它癌症治疗组合进行，如可增强融合细胞因子蛋白的免疫刺激特性的治疗。例如，本发明的核酸还可以表达其它蛋白部分，这些蛋白部分可帮助激发针对癌细胞表达抗原的免疫应答，或者可以与其它表达所述蛋白部分的核酸共转染。具体地说，表达B7共刺激表面蛋白的核酸可共转染入癌细胞中[Robinson等，美国专利第5,738,852号]。用表达多细胞因子融合蛋白的核酸转染癌细胞还可以与采用针对癌细胞的抗体或免疫细胞因子的治疗同时进行[Lode等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95：2475]。用表达多细胞因子融合蛋白的核酸转染癌细胞还可以与采用血管发生阻断剂的治疗同时进行[Lode等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.9：1591]。
采用其它免疫刺激物和/或血管发生阻断剂的治疗也可以与采用多细胞因子融合蛋白的系统治疗组合进行。与其它的免疫刺激物或血管发生阻断剂共同治疗的优势在于这些治疗与DNA损伤剂和细胞周期阻断剂不同，它们不杀死可能由于所述多细胞因子融合蛋白的刺激而正在分裂的免疫细胞。
所述基因疗法的一个优选实施方案是将一种或多种编码IL-12和第二种细胞因子的核酸引入到癌细胞中，然后再将所述癌细胞引入到人或动物中。第二种细胞因子优选为IL-2或GM-CSF。
本发明提供新型疫苗组合物和辅助疫苗的方法，该方法使用两种或多种已经融合的细胞因子作为佐剂，用来在接种宿主哺乳动物中产生一种抗某些病原体的保护性细胞介导免疫应答。例如，如果需要Th1型免疫应答，则可以融合多种Th1促进型细胞因子，并将获得的融合蛋白与抗原一起给予动物。
具体地说，可融合IL-12和IL-2，并与抗原一同给予。或者，可将IL-12和IL-2进一步融合至抗原性蛋白自身，并用于刺激免疫应答。在此情况下，本发明涉及依赖于宿主的细胞介导免疫的疫苗，即激发细胞毒性T淋巴细胞和活化吞噬细胞，以提供抗特定病原体感染的保护。特别有用的是用含IL-12、IL-2和所述抗原的融合蛋白进行疫苗接种，因为这种组合产生针对所述抗原的Th1应答。在人类使用的常规佐剂，如明矾，常常用于诱导Th2应答。
如果需要Th2型免疫应答，则可使用Th2促进型细胞因子的融合组合物。例如，可融合IL-4和IL-10以形成单一分子，获得的融合蛋白用作佐剂。具体地说，如果需要在动物中募集树突细胞，则可将IL-4和GM-CSF的融合组合物与促进结合抗原提呈细胞的Fc区进一步融合，或者与能够将所述融合细胞因子导向靶组织(如肿瘤)的抗体进一步融合。
本发明还提供新型治疗组合物和用来提供与某些治疗组合物的协同作用的辅助方法，所述治疗组合物包括所谓的‘癌症疫苗’，可以包括存在于癌细胞上的选定抗原。例如，可通过合适的途径，将含两种或多种融合细胞因子的蛋白连同适当处理的癌细胞一起直接给予。
                         实施例实施例1：构建能够表达细胞因子-细胞因子融合蛋白的基因融合物
为制备有众多细胞因子的多功能蛋白，合成IL-12 p40和IL-2基因融合物以及IL-12 p40和GM-CSF基因融合物。另外，将成熟小鼠p35的编码序列(SEQ ID NO：1)融合至允许高水平表达和有效分泌的启动子序列和前导序列。小鼠p40-IL-2和p40-GM-CSF的编码序列分别示于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。还构建了人p40-IL-2融合蛋白(SEQ ID NO：4)。使用先前公开的表达质粒(Lo等，ProteinEngineering 11：495-500[1998]；Lo等，美国专利第5,726,087号)，构建小鼠IgG2a Fc区与小鼠p35的融合物(SEQ ID NO：5)以及人p35与人IgG1 Fc区的融合物(SEQ ID NO：6)。
Gillies等人描述了成熟小鼠和人p35与KS-1/4抗体重链C端的融合蛋白(J.Immunology[1998]160：6195-6203)。以相似的方式构建了成熟小鼠和人p35与14.18抗体重链C端的融合蛋白(PCT国际公开号WO99/29732)。
本文讨论的融合p40与IL-2以及融合p40与GM-CSF的策略类型一般可应用于两种或多细胞因子的融合蛋白。具体地说，大多数N端部分的编码序列包含用于分泌的信号序列，而C端部分不需要信号序列。在某些情况下，可将短肽接头编码序列(优选10-15个氨基酸长，富含甘氨酸和丝氨酸)置于两种细胞因子的编码序列之间。涉及制备所有所述类型的融合蛋白的DNA操作都在本领域的技术水平范围内。
例如，以下描述了构建小鼠IL-12 p40亚单位与小鼠IL-2的融合蛋白的细节。通过PCR由伴刀豆球蛋白A(Concavalin A)活化的小鼠脾细胞(每ml培养基5μg伴刀豆球蛋白A，活化3天)克隆小鼠IL-12p40亚单位的全长cDNA。正向引物序列为AA GCT AGC ACC ATGTGT CCT CAG AAG CTA ACC(SEQ ID NO：7)，其中NheI位点GCTAGC(SEQ ID NO：7的残基3-8)位于翻译起始密码子ATG的上游，而反向引物序列为CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCAGGG(SEQ ID NO：8)，其中XhoI位点CTCGAG(SEQ ID NO：8的残基1-6)紧接着位于翻译终止密码子TAG(反密码子为CTA)的下游。验证序列后，将含有mu-p40 cDNA及其天然前导序列的NheI-XhoI片段连接至XbaI-XhoI消化的表达载体pdCs[Lo等(1998)ProteinEngineering 11：495-500]。限制位点NheI和XbaI具有匹配粘性末端，而NheI位点用于克隆mu-p40，因为mu-p40具有内部XbaI位点。
为了构建mu-p40-muIL-2编码DNA，使用寡核苷酸接头经由PstI位点(C TGC AG)连接mu-p40 DNA与含有成熟小鼠IL-2 cDNA的SmaI-XhoI片段。在所述融合蛋白连接处的DNA序列为C TGC AGGGTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC(SEQ ID NO：9)，其中CTGC AG(SEQ ID NO：9的残基1-6)为PstI位点，C CCG GG(SEQ IDNO：9的残基15-20)为SmaI位点，TCC是小鼠p40的C端氨基酸残基，而GCA是成熟小鼠IL-2的N端残基。
通过用muGMCSF cDNA在SmaI位点置换muIL2 cDNA，由编码以上的单链muIL12-muIL2的DNA构建物获得单链muIL12-muGMCSF编码DNA。在单链muIL2和muGMCSF连接处的DNA序列为C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA AAA GCA(SEQ IDNO：10)，其中C TGC AG(SEQ ID NO：10的残基1-6)为PstI位点，C CCG GG(SEQ ID NO：10的残基17-22)为SmaI位点，TCC是小鼠p40的C端氨基酸残基，而GCA是成熟小鼠GMCSF的N端残基。实施例2：表达IL-12融合蛋白
如下表达IL-12-IL-2融合蛋白。将不同组合的编码p40融合蛋白的单个载体和编码含p35的蛋白的载体共转染入人293表皮癌细胞，以瞬时表达融合蛋白。使用制备型试剂盒(Wiazrd，Promega Inc.)纯化DNA，乙醇沉淀以灭菌，并在无菌水中重悬浮。
为了表达生物活性IL-12融合蛋白异源二聚体，通过共转染人293表皮癌细胞瞬时表达不同组合的编码融合形式亚单位和非融合形式亚单位的单个载体。使用制备型试剂盒(Wiazrd，Promega Inc.)纯化DNA，乙醇沉淀以灭菌，并在无菌水中重悬浮。使用10μg DNA/ml(当共转染两个质粒时质粒DNA各5μg)通过标准方法制备磷酸钙沉淀，按0.5ml/板加入到在60mm平板中培养的约70％融合的293培养物中(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。16小时后，去除含所述沉淀的培养基，代之以新鲜培养基。3天后，取出上清液，通过ELISA分析产生的转染基因表达、生物测定IL-12活性或者对放射性标记蛋白进行免疫沉淀和SDS凝胶分析。为了标记，在培养第2天使用无甲硫氨酸的培养基代替所述生长培养基，并加入35S-甲硫氨酸(100μCi/ml)。再温育16小时后，收获所述培养基，通过离心澄清(在台式微型离心机中以13,000rpm离心5分钟)并与A蛋白琼脂糖珠(每ml培养上清液10μl珠量)温育。于室温1小时后，通过重复的离心和在含1％Nonidet-P40(NP-40)的PBS缓冲液中重悬浮清洗所述琼脂糖珠。将最终的沉淀在含SDS的凝胶缓冲液中重悬浮，并煮沸2分钟。离心去除琼脂糖珠后将上清液分为两等份。向1个样品中加入还原剂(5％2-巯基乙醇)，将两个样品都煮沸5分钟，然后上SDS聚丙烯酰胺凝胶。电泳后将所述凝胶对X射线胶片曝光(放射自显影)。
使用以下的表达质粒剂进行转染：mu.p35+mu.p40-IL-2、KS-1/4-mu.p35+mu.p40、KS-1/4-mu.p35+mu.p40-IL-2、14.18-mu.p35+mu.p40-IL-2、hu.Fc-.p35+hu.p40-IL-2、KS-1/4-hu.p35+hu.p40-IL-2和14.18-hu.p35+hu.p40-IL-2，其中“mu”是指小鼠蛋白，而“hu”是指人蛋白。
当用35S-甲硫氨酸代谢标记细胞并用还原性SDS凝胶电泳和放射自显影检测分泌性蛋白时，在每种情况下都观察到高水平表达。根据组成蛋白的分子量预测的还原性融合蛋白的分子量如下：IL-12p35，35kD；IL-12p40，40kD；IL-12，16kD；Fc，32kD；Ig重链，55kD；以及Ig轻链，28kD。观测到的蛋白迁移约为预测的分子量。
还分离了表达多细胞因子融合蛋白的稳定转染细胞系。在异源二聚体构建物情况下，编码IL-12 p40-IL-2或IL-12 p40-GM-CSF融合蛋白的表达载体如早前对单独的IL-12 p40亚单位所述(Gillies等[1998]J.Immunol.160：6195-62030)。按照所述(Gillies等[1998]J.Immunol.160：6195-62030)用编码IL-12 p35亚单位、Fc-p35融合蛋白或抗体-p35融合蛋白的表达载体第二次转染表达p40融合蛋白的转染细胞系。
收集表达人Fc-IL-12-IL-2(即表达KS-p35和p40-IL-2)的稳定转染细胞系的上清液，按照生产商的方法(Repligen，Needham，MA)通过与A蛋白琼脂糖结合并从其上洗脱，纯化产物。通过ELISA测定纯化蛋白中的IL-12和IL-2含量。结果显示各种细胞因子含量在质量上相差约4倍，与IL-12和IL-2的分子量相差4倍有关。同样地，通过ELISA测定表达人KS-IL-12-IL-2的转染细胞产物的IL-12和IL-2水平得到相似的IL-12和IL-2值。因此，在ELISA精度范围内，检测值表示IL-12和IL-2以约1∶1摩尔比产生。用Fc或完整抗体制备的IL-12-GM-CSF融合蛋白获得相同的结果。实施例3：融合蛋白在IFN-γ诱导测定中的协同活性
使用人类志愿者的静止或促有丝分裂原活化的人外周血单核细胞(PBMC)以IFN-γ诱导测定检测IL-12-IL-2融合蛋白的生物活性(图6)。通过ELISA检测IFN-γ产生。
由健康志愿者获得人外周血单核细胞(PBMC)，通过Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度离心(1700rpm，20分钟)纯化。用无血清培养基(SF-RPMI)将含PBMC的“血沉棕黄”层稀释至50ml体积，于1000rpm.离心5分钟收集。梯度离心后，在有或没有植物凝集素(PHA；10μg/ml)的情况下，在含10％胎牛血清的细胞培养基(RPMI-10)中以5×106细胞/ml的密度重悬浮细胞，并在湿润的CO2培养箱中于37℃培养3天。离心收集细胞，用等体积的SF-RPMI清洗三次，并在新鲜RPMI-10中重悬浮(1×106细胞/ml)。将等份溶液(100μl)分散入多个96孔平板的各孔中，每孔的最终细胞数为105个。在新鲜培养基中连续稀释培养基测试样品，并加入到所述96孔平板的各孔中。对照孔加入IL-12(图6A)或市售IL-2和IL-12的等摩尔混合物(图6B；细胞因子购自R&D Systems)。在CO2温育箱中于37℃温育所述平板48小时，此时取出等份溶液(20μl)按照生产商的说明(Endogen，Inc.，Woburn，MA USA)通过ELISA分析IFN-γ浓度。
在图6A中，比较人IL-12-IL-2融合蛋白和单独的IL-12的活性。结果表明单独的IL-12诱导中等水平的IFN-γ，而IL-12-IL-2融合蛋白强烈诱导IFN-γ合成。因为还已知IL-2不足以合成IFN-γ，所以这些结果表明IL-12和IL-2部分不但在所述融合蛋白中都有功能，而且还协同起作用。
再者，比较了Fc-IL-12-IL-2融合蛋白、KS-IL-12-IL-2融合蛋白和由1∶1摩尔比的IL-12和IL-2组成的混合物在诱导IFN-γ能力方面的活性。图6B的结果表明，Fc-IL-12-IL-2融合蛋白和KS-IL-12-IL-2融合蛋白与IL-12和IL-2等摩尔混合物具有大约相同的活性。当使用小鼠形式的IL-2和IL-12构建融合蛋白时，获得了相同的结果，其中所述小鼠形式的IL-2和IL-12通过在实施例1描述的用于构建人类形式的IL-2和IL-12的方式构建。实施例4：IL-12-IL-2融合蛋白的IL-2和IL-12生物活性
以增殖型测定比较了融合蛋白中的IL-2和IL-12活性与单独的细胞因子的活性。以典型的IL-12增殖测定测试了小鼠抗体14.18-IL-12-IL-2分子的活性。由志愿者获得人PBMC，将其与5μg/ml植物凝集素-P培养3天，用Hank’s HBSS清洗，按照标准方法以105细胞/孔平板接种入微量培养板(Gately，M.K.，Chizzonite，R.和Presky，D.H.Current Protocols in Immunology[1995]6.16.1-6.16.15页)。在各种测试蛋白存在下温育细胞48小时，并在测定放射性掺入水平之前10小时加入0.3μCi3H-胸苷。IL-12和IL-12与IL-2的等摩尔混合物以剂量依赖方式刺激3H-胸苷掺入细胞，14.18-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激3H-胸苷掺入方面差不多等效。IL-2仅在较高摩尔浓度刺激3H-胸苷掺入，表明所观察到的14.18-IL-12-IL-2融合蛋白刺激的3H-胸苷掺入主要是由于其IL-12活性。结果示于图7。
另外，按照标准方法(Davis，L.S.，Lipsky，P.E.和Bottomly，K.Current Protocols in Molecular Immunology[1995]6.3.1-6.3.7页)以不同的细胞增殖测定测试IL-2部分的生物活性。小鼠CTLL-2细胞系增殖依赖于IL-2。CTLL-2细胞系还可以在IL-4作用下增殖，但对IL-12没反应。将处于活跃对数生长期的CTLL-2细胞在缺少IL-2的培养基中清洗2次，并在各种量的市售小鼠IL-2、小鼠14.18-IL-12-IL-2融合蛋白或市售小鼠IL-12存在下以约1×104细胞/孔接种在微量滴定板上，培养48小时。在培养结束时，使用MTT/MTS测定定量活细胞数。图8显示了一个其中IL-2、IL-12或14.18-IL-12-IL-2融合蛋白水平变化的实验。结果显示小鼠IL-2和小鼠14.18-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激细胞增殖方面差不多等效，而小鼠IL-12量增加没有对细胞增殖产生可检测的刺激作用。该结果表明14.18-IL-12-IL-2融合蛋白刺激CTLL-2细胞增殖是缘于IL-2部分而不是IL-12部分。实施例5：构建和表达具有和没有抗体部分的单链和多链IL-12-IL-2融合蛋白
如下构建单链小鼠IL-12-IL-2融合蛋白。通过与实施例1中构建人p40-IL-2融合蛋白使用方法类似的方法构建p40-IL-2编码序列融合蛋白。为连接编码IL-12的p35和p40亚单位的DNA和产生单一编码序列，合成在5′末端具有XhoI位点和在3′末端具有BamHI位点的接头编码DNA。修饰成熟p40-IL-2编码序列的5′末端，以引入限制性位点，然后连接至所述接头的3′末端。修饰小鼠p35编码序列的3′末端，以产生限制性位点，并连接至所述接头的XhoI位点。利用p40中适宜的限制性位点组合编码实施例1中所述的单链muIL12和mu-p40-muIL2的cDNA，获得编码单链muIL12-muIL2的第三个DNA构建物。这些步骤使用不同载体进行，并根据需要分离DNA片段。获得的小鼠p35-接头-p40-IL-2编码区序列为SEQ ID NO：11。
与此同时，通过相应的方法构建对应的单链小鼠IL-12编码序列。该编码序列为SEQ ID NO：12。
另外，我们还构建了编码融合至p35-接头-p40-IL-2N端的小鼠IgG2a Fc区的DNA序列。该编码序列为SEQ ID NO：13。
用编码小鼠单链Fc-IL-12-IL-2和Fc-IL-12蛋白的表达质粒转染培养的293细胞。如实施例2所述测定融合蛋白的表达。通过与A蛋白琼脂糖凝胶结合纯化Fc融合蛋白，并观测到Fc-IL-12-IL-2和Fc-IL-12高水平表达。根据SDS凝胶迁移的表观分子量：Fc-IL-12-IL-2，123kD；和Fc-IL-12，107kD推断，合成了完整蛋白。
实施例1中描述的KS-scIL12-IL2融合蛋白是一种四聚体，具有两种不同多肽链：KS-1/4轻链和KS-1/4重链及在C端的scIL 12-IL2部分。为研究抗体分子上的哪些位点适于结合细胞因子部分，构建了其中KS-1/4抗体、IL-12和IL-2部分的构型与实施例1中的KS-IL12-IL-2构型不同的第二种融合蛋白。该第二种蛋白为四聚体，由两种不同的多肽组成。一种多肽由KS-1/4抗体的轻链组成。另一种多肽包括融合至KS1/4抗体重链成熟N端的单链muIL12，后面是在重链羧基端的小鼠IL-2。
通过PCR由伴刀豆球蛋白A活化的小鼠脾细胞(每ml培养基5μg伴刀豆球蛋白A，活化3天)克隆编码小鼠IL-12p35亚单位的cDNA。正向引物序列为AAGCTT GCTAGCAGC ATG TGT CAA TCA CGCTAC(SEQ.ID NO：14)，其中HindIII位点AAGCTT(SEQ ID NO：14的残基1-6)位于翻译起始密码子ATG的上游，而反向引物序列为CTCGAG CTT TCA GGC GGA GCT CAG ATA GCC(SEQ ID NO：15)，其中XhoI位点CTCGAG(SEQ ID NO：15的残基1-6)位于翻译终止密码子TGA(反密码子为TCA)的下游。
编码单链IL-12的DNA包括连接寡核苷酸的mup35 DNA，其后为mup40 DNA，其中所述寡核苷酸编码富含甘氨酸和丝氨酸残基的接头。获得的构建物在寡核苷酸连接处具有以下序列：
          Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerG AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCCAla        (SEQ ID NO：17)GCC ATG    (SEQ ID NO：16)其中G AGC TC(SEQ ID NO：16的残基1-6)为SacI限制位点，恰好位于小鼠p35翻译终止密码子上游，GCG编码小鼠p35的C端氨基酸残基，GGA TCC(SEQ ID NO：16的残基50-55)是为了有利于连接而引入的BamHI限制性位点，而ATG编码成熟mu-p40的N端残基。
编码单链muIL12-KS重链-muGMCSF的DNA在mup40和KS重链的成熟N端连接处的序列如下：
                  Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyC TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGAGly Gly Ser Leu Ser     (SEQ ID NO：19)GGG GGC TCC TTA AGC CAG (SEQ ID NO：18)其中C TGC AG(SEQ ID NO：18的残基1-6)为PstI位点，恰好位于小鼠p40翻译终止密码子上游，TCC编码小鼠p40的C端氨基酸残基，而CAG编码成熟KS重链的N端残基。然后将获得的编码单链muIL 12-KS重链-muIL2的DNA与KS轻链共表达。
为进一步研究抗体分子的哪个末端可用于产生融合连接以及为了研究许多截然不同的多肽怎样可以装配入一个多细胞因子融合蛋白中，表达含KS-1/4、IL-12和IL-2的第三种蛋白，即IL12-KS(轻链)+KS(重链)-IL2，并测试其活性。该融合蛋白为六聚体，并含有三种不同多肽。一种多肽由小鼠p35与KS1/4抗体轻链融合组成。第二种多肽由融合至人IL-2的KS1/4抗体重链组成[Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：1428]，而第三种多肽为小鼠p40。在表达时，两条轻链和两条重链以二硫键键合，形成四聚体抗体-细胞因子结构。另外，轻链N端的p35还与p40以二硫键结合。
编码mup35-KS轻链的DNA在连接处的序列如下：
          Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerG AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCCLeu Ser      (SEQ ID NO：21)TTA AGC GAG  (SEQ ID NO：20)其中G AGC TC(SEQ ID NO：20的残基1-6)为SacI限制性位点，恰好位于小鼠p35翻译终止密码子上游，GCG编码小鼠p35的C端氨基酸残基，GGA TCC(SEQ ID NO：20的残基50-55)是为有利于连接而引入的BamHI限制性位点，而GAG编码轻链的N端氨基酸残基。
为表达此六聚体融合蛋白，通过用含新霉素抗性基因的表达载体转染并用G418选择，获得表达小鼠p40的细胞系。然后用含轻链和重链转录单元以及允许用氨甲蝶呤选择的二氢叶酸还原酶选择标记的表达载体转染表达小鼠p40的细胞系[Gillies等(1998)J.Immunol.160：6195]。实施例6：小鼠单链IL-12-IL-2融合蛋白活性
使用在实施例4中使用的相同方法测试通过瞬时表达产生的小鼠单链IL-12-IL-2的活性。首先通过ELISA测定细胞培养上清液中每种细胞因子的量，并用于建立剂量-反应曲线。所述活性与用上述Fc和抗体IL-12-IL-2融合蛋白发现的活性密切相关。
具体而言，以实施例4描述的人PBMC细胞增殖测定测试小鼠单链(sc)IL-12-IL-2和小鼠Fc-scIL-12-IL-2分子的IL-12活性。IL-12和IL-12与IL-2的等摩尔混合物以剂量依赖方式刺激3H-胸苷掺入细胞中。以每摩尔为基准，scIL-12-IL-2和Fc-scIL-12-IL-2融合蛋白在刺激3H-胸苷掺入方面与IL-12大致等效(图9)。如实施例4所述，IL-2仅在非常高摩尔浓度刺激3H-胸苷掺入，表明所观察到的scIL-12-IL-2融合蛋白刺激的3H-胸苷掺入主要是由于其IL-12活性。
另外，在细胞型测定中测试scIL-12-IL-2融合蛋白的IL-2部分的生物活性，发现其与市售IL-2以每摩尔为基准在所述测定的精度范围内大致相同。如实施例4所述，在CTLL-2细胞增殖测定中测试IL-2部分的生物活性。结果表明，小鼠IL-2、小鼠scIL-12-IL-2和小鼠Fc-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激增殖的能力上大致相等，小鼠IL-12对CTLL-2细胞增殖不产生可检测的刺激作用。这些结果表明scIL-12-IL-2融合蛋白对CTLL-2细胞增殖的刺激作用缘于IL-2部分而不是IL-12部分。
还在细胞型测定中测试了实施例5描述的Fc-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(轻链)+KS(重链)-IL2蛋白的IL-12活性和IL-2活性。使用PBMC细胞增殖/氚化胸苷掺入测定，Fc-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(轻链)+KS(重链)-IL2蛋白都显示出有效的IL-12活性。同样地，使用CTLL-2细胞增殖测定，Fc-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(轻链)+KS(重链)-IL2蛋白都显示出有效的IL-2活性。另外，在ELISA中IL12-KS-IL2和IL12-KS(轻链)+KS(重链)-IL2蛋白都紧密结合EpCAM抗原，即使重链和轻链V区分别融合至其它蛋白的N端。实施例7：小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白的活性
在细胞增殖测定中测试小鼠Fc-IL-12-GM-CSF的IL-12活性(图10)。由三个志愿者获得人PBMC，将其与5μg/ml植物凝集素-P培养3天，用Hank’s HBSS清洗，按照标准方法以105细胞/孔接种入微量滴定板(Gately，M.K.，Chizzonite，R.和Presky，D.H.CurrentProtocols in Immunology[1995]6.16.1-6.16.15页)。在各种测试蛋白存在下温育细胞48小时，并在测定放射性掺入水平之前10小时加入0.3μCi3H-胸苷。IL-12和IL-12与GM-CSF的等摩尔混合物以剂量依赖方式刺激3H-胸苷掺入细胞，而14.18-IL-12-GM-CSF融合蛋白在刺激3H-胸苷掺入方面差不多等效。GM-CSF在测试浓度不刺激3H-胸苷掺入，表明所观察到的14.18-IL-12-GM-CSF融合蛋白刺激的3H-胸苷掺入主要是由于其IL-12活性。
另外，在细胞型测定中测试了各种IL-12-Gm-CSF融合蛋白的GM-CSF部分的生物活性。发现GM-CSF部分有活性，每摩尔的活性与市售GM-CSF在相同的常规范围内。例如，在不同的细胞增殖测定中按照分子免疫学领域熟练技术人员已知的方法(Cooper，S.C.和Broxmeyer，H.E.，Current Protocols in Molecular Immunology[1996]6.4.1-6.4.20页)测试GM-CSF部分的生物活性。小鼠32D(GM)细胞系增殖依赖于GM-CSF；该细胞系由Cooper和Broxmeyer描述的原始32D细胞系改变获得，对GM-CSF特别敏感(Faas等，Eur.J.Immunol.[1993]23：1201-14)。32D(GM)细胞系对IL-12无应答。将处于活跃对数生长期的32D(GM)细胞在没有GM-CSF的培养基中清洗两次，并在各种量的市售小鼠GM-CSF或小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白存在下以约5×103细胞/孔接种在微量滴定板各孔中，培养48小时。在测定放射性掺入水平之前16小时加入0.3μCi3H-胸苷。随着IL-12-GM-CSF融合蛋白水平增加，3H-胸苷掺入呈剂量反应性增加，表明IL-12-GM-CSF融合蛋白的GM-CSF部分有活性。而且，以1摩尔为基准计算，所述融合蛋白的GM-CSF生物活性与市售小鼠GM-CSF相当。实施例8：用多细胞因子融合蛋白治疗免疫功能良好(immune-proficient)的哺乳动物的结肠癌
为测试多细胞因子-抗体融合蛋白是否可用于治疗免疫系统完好的哺乳动物的结肠癌，进行了以下实验。CT26是得自Balb/C小鼠的结肠癌细胞系。通过标准的遗传工程技术工程该细胞系，使其表达人上皮细胞粘附分子(EpCAM)，EpCAM是KS-1/4抗体识别的抗原；这些细胞被称为CT26/KSA细胞。
用2×106CT26/KSA细胞皮下接种Balb/C小鼠。当肿瘤体积达到约100-200mm3时，随机将小鼠分为三组，每组9只，供进一步研究用。从第0天开始用PBS、约3.4μg KS-IL2与约5.3μg KS-IL12的混合物或约6μg KS-IL2-IL12治疗肿瘤小鼠。这些剂量用来将相等数量IL-12和IL-2分子传递给每组小鼠。对小鼠进行肿瘤内注射，每天一次，共5天。用测径器检测肿瘤大小。
一个这样的实验的结果示于图11。在该实验中，KS-IL12-IL2极为显著地抑制肿瘤生长。KS-IL12和KS-IL2的混合物也明显抑制肿瘤生长，但不如KS-IL12-IL2彻底。在KS-IL12-IL2治疗的小鼠组中，9只小鼠中的6只肿瘤表观治愈：这6只小鼠直至所述实验终止时的第93天仍存活；而且这些小鼠中的肿瘤萎缩和消失，从第39天至第93天不能检测到皮下肿瘤。另3只小鼠的肿瘤生长延迟，肿瘤体积仅在第87天后超过4,000mm3。
在KS-IL12和KS-IL2混合物治疗的小鼠中，2只小鼠的皮下肿瘤表观治愈，直至实验结束时仍存活。余下的7只小鼠的肿瘤没有消失，最终生长至体积为1,000mm3(1只小鼠)或大于4,000mm3(6只小鼠)。
KS-IL12-IL2比KS-IL12和KS-IL2的等摩尔混合物更有效的事实令人惊奇。该实验中的给予剂量为每剂约19pmol融合蛋白，相当于约9×1012个分子。在治疗开始时，每个肿瘤的体积约160mm3，相当于约1.6亿个细胞。每个细胞表达约106个EpCAM分子，由此KS抗体可能结合的EpCAM抗原分子约1.6×1014个。因此，当混合KS-IL12和KS-IL2并注射入带有所述肿瘤的小鼠中时，这两种免疫细胞因子融合蛋白互相之间不大可能竞争抗原结合部位。因此，对于KS-IL12和KS-IL2混合物和KS-IL12-IL2而言，在肿瘤部位的IL12和IL2有效剂量应当至少一样高。实施例9.用多细胞因子融合蛋白治疗免疫缺陷哺乳动物中的结肠癌
许多形式的癌症治疗具有杀伤分裂细胞的作用，包括免疫系统细胞。因此，癌症患者常常发生免疫抑制。为了了解多细胞因子融合蛋白是否可用于治疗免疫系统受抑制的哺乳动物，用KS-IL12-IL2、KS-IL12和KS-IL2的混合物或PBS治疗带有CT26/KSA肿瘤的SCID小鼠。SCID小鼠的B细胞和T细胞均存在缺陷，依赖于具抗感染能力的先天免疫系统分支如NK细胞。
如实施例8所述制备携带皮下CT26/KSA肿瘤的小鼠。用与实施例8相同的给药剂量和方案通过肿瘤内注射治疗三组各8只携带约100-200mm3肿瘤的小鼠。结果示于图12。在该实验中，KS-IL12-IL2融合蛋白与KS-IL12和KS-IL2的混合物差不多等效：第25天时每组8只小鼠中的5只被治愈。然而，在未治愈的小鼠中，6个肿瘤中的5个开始以未治疗小鼠的肿瘤特征性速率生长，有效延迟约14-21天。这与实施例8中的免疫良好小鼠的肿瘤大不相同：即使在用KS-IL12-IL2治疗未完全消除肿瘤时，实验开始后约60天后肿瘤才开始侵蚀性生长。
这些实验证明，多细胞因子抗体融合蛋白可用于治疗免疫抑制动物癌症。实施例10.通过肿瘤内注射多细胞因子融合蛋白治疗肺癌：与单独免疫细胞因子治疗比较
为了解多细胞因子融合蛋白和具有单一细胞因子部分的免疫细胞因子抗肺细胞衍生癌症的有效性，进行了以下实验。
Lewis肺癌(LLC)是在C57BL/6小鼠中产生的一种侵袭性肿瘤。通过标准遗传工程技术构建表达人EpCAM蛋白的LLC细胞系；此细胞系称为LLC/KSA。
如实施例8所述制备携带皮下LLC/KSA肿瘤的C57BL/6小鼠(用KML核对细胞序号#)。通过肿瘤内注射治疗四组各5只携带约100-200mm3肿瘤的小鼠5天。用PBS、约20μg KS-IL12、约20μg KS-IL12或约20μg KS-IL12-IL2注射小鼠。
结果示于图13。在此实验中，KS-IL12-IL2融合蛋白远比KS-IL12或KS-IL2有效。在用KS-IL12-IL2融合蛋白治疗的所有小鼠中，肿瘤至第27天全部消失。在第74天，对这些小鼠进行实施例14所述的肺转移测定；在干预期或第二个实验期间，原来的皮下肿瘤没有再出现。相反，KS-IL2或KS-IL12治疗使肿瘤外观有一定缩小以及肿瘤生长明显延迟，但肿瘤最终还是生长。比较此实验和前述实验的结果表明，对于某些疾病和给予方式，用具有不同细胞因子部分的免疫细胞因子混合物治疗优于用单一类型的免疫细胞因子治疗。实施例12.通过肿瘤内注射多细胞因子融合蛋白治疗肺癌：与免疫细胞因子混合物治疗比较
为了解多细胞因子融合蛋白和具有不同细胞因子部分的免疫细胞因子混合物对肺细胞性癌症的有效性，进行以下实验。
如实施例11所述制备携带皮下LLC/KSA肿瘤的C57BL/6小鼠。通过肿瘤内注射治疗三组各7只携带约100-200mm3肿瘤的小鼠5天。用PBS、约18μg KS-IL12和约11.5μg KS-IL12的混合物或约20μgKS-IL12-IL2注射小鼠。
结果示于图14。在此实验中，KS-IL12-IL2融合蛋白远比KS-IL12和KS-IL2的混合物有效。在用KS-IL12-IL2融合蛋白治疗的所有小鼠中，肿瘤至第27天为止全部消失。相反，用KS-IL12和KS-IL2的混合物治疗使肿瘤表观有一定缩小以及肿瘤生长明显延迟，但此治疗组的所有肿瘤最终再发生生长。实施例13.多细胞因子抗体融合蛋白的抗原依赖性抗肿瘤活性
为了解多细胞因子-抗体融合蛋白治疗肿瘤的有效性是否依赖于肿瘤特异性表达的所述抗体识别抗原，进行以下实验。
如实施例11所述制备携带皮下LLC/KSA肿瘤的一组7只C57BL/6小鼠和携带亲代LLC细胞系衍生肿瘤的第二组9只小鼠。通过肿瘤内注射治疗这两组携带约100-200mm3肿瘤的小鼠5天。用约20μgKS-IL12-IL2注射小鼠。
结果示于图15。在此实验中，携带LLC/KSA肿瘤的所有小鼠的肿瘤都完全治愈。相反，LLC肿瘤小鼠只有2只治愈，其余的LLC肿瘤小鼠的肿瘤体积都曾有短时缩小，但肿瘤体积最终增大。
这些结果表明，对EpCAM表面抗原的识别促进了KS-IL12-IL2粘附于LLC/KSA肿瘤细胞表面，增强了产生的免疫应答。也观察到对LLC-衍生肿瘤的一定抗肿瘤作用；尽管不希望受理论束缚，但是仍然认为在此实验中的KS-IL12-IL2抗肿瘤作用是由于以下事实：所述融合蛋白直接注射入肿瘤并因此瞬时局限于肿瘤。实施例14.产生抗肿瘤细胞类型的免疫记忆
发生转移是癌症治疗中的主要问题。为测试多细胞因子抗体融合蛋白治疗是否可形成抗肿瘤细胞类型的长久免疫记忆，以及是否可预防形成转移，进行了以下实验。
实施例11中的5只C57BL/6小鼠用KS-IL12-IL2进行了治疗，并且其皮下肿瘤已表观治愈。如实施例14所述，从治疗开始计的第74天，这5只小鼠静脉内注射106LLC/KSA细胞。作为对照，还对8只C57BL/6小鼠静脉内注射106LLC/KSA细胞。
在第28天，处死小鼠，检查肺部转移。8只对照小鼠的肺部转移占70％-100％，肺表面覆盖平均为85％。这些小鼠的平均肺重量为0.86克。相比之下，在5只预治疗小鼠的肺表面未发现转移，平均肺重量为0.28克，与正常小鼠的肺重量相当。这些结果表明，对原肿瘤细胞的治疗产生了对所述肿瘤细胞的长久免疫记忆；该记忆防止所述肿瘤细胞类型形成转移。
表X.“肿瘤消退”小鼠对LLC-KSA肺转移的保护作用
    在先治疗             转移记分             肺重量(g)
    无              4，4，4，4，4，4，3，3    0.88+/-0.27
    KS-IL12/IL2         0，0，0，0，0         0.27+/-0.03无肿瘤对照组的平均肺重量为0.2克。转移记分是基于融合肿瘤转移结节的表面范围百分率，其中0＝无转移；1＝1-25％范围；2＝25-50％范围；3＝50-75％范围；而4＝75-100％范围。
测试免疫记忆形成的第二个实验使用实施例12的7只小鼠中的6只，这6只小鼠已经注射了LLC/KSA肿瘤细胞，产生了皮下肿瘤并且已经使这些肿瘤消失。在实施例12的治疗开始后62天，对6只预治疗小鼠和10只原初未治疗的C57BL/6对照小鼠皮下注射106LLC细胞。这些细胞不表达人KS抗原EpCAM。
在所述原初小鼠中，注射的LLC细胞形成的肿瘤在所有小鼠中快速生长。相比之下，预治疗小鼠肿瘤的生长要慢得多，而在1只小鼠中未检测到皮下肿瘤。结果示于图16。因为人KS抗原EpCAM不在LLC细胞上表达，所以针对LLC细胞的免疫应答是基于这些细胞表达的其它抗原。实施例15.作为疫苗的多细胞因子融合蛋白
多细胞因子融合蛋白当融合至抗原蛋白时可用作疫苗。疫苗部分由N端至C段的具体顺序或者所述融合蛋白是单一多肽链还是寡聚物，可根据构建表达质粒的方便性而有所变化。可通过各种途径如静脉内、皮下、腹膜内等给予所述蛋白。同样地，给予的剂量和频率一般需要经验性确定，这是人类疫苗的标准操作，是疫苗开发领域的技术人员众所周知的。
例如，给予小鼠抗原-IL-12-细胞因子形式的融合蛋白，其中所述融合蛋白中的细胞因子为与IL-12不同的第二种细胞因子。对照小鼠给予相同量的抗原-细胞因子、抗原-IL-12或单独的抗原。在给予所述抗原融合蛋白期间和/或以后的各个时间通过眼眶后取血收集血样，然后制备血浆并分析抗所述抗原的抗体存在情况。发现产生了抗所述抗原的抗体。而且，针对所述抗原的免疫应答性质为Th1型应答特征性的。与某些对照免疫相比，所述抗体应答更强，产生的抗体类型不同。
更具体地说，将人源化抗体-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白的PBS缓冲液静脉注射入Balb/c小鼠中(5μg/天×5)。对照小鼠接受相同量的相同抗体，但所述抗体未附着IL-12-IL-2。两种注射溶液都不含有任何其它类型的佐剂。在第10天，通过眼眶后取血将血样收集到微量离心管中，并通过收集含柠檬酸钠的塑料管中的血样，接着在Eppendorf台式微量离心机中全速离心制备血浆。用人源化抗体蛋白包被ELISA板(96孔)，所述人源化抗体蛋白含有人恒定区，并用于捕获免疫应答中产生的任何小鼠抗体。洗去未结合物质之后，用偶合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠Fc抗体(Jackson ImmunoResearch)检测结合的小鼠抗体。任何结合抗体都可能涉及人恒定区或可变区，而人源化抗体和所述融合蛋白共有这二者。
对没有融合IL-12-IL-2的人源化抗体几乎没有反应性。另一方面，所述融合蛋白在没有外源佐剂的情况下诱导强抗体应答，尽管静脉内给予途径和皮下或腹膜内给予相比对于诱导这种应答是非常不宜的。为典型的IL-12增强型应答的IgG2a同种型抗体见于抗体-IL-12-IL-2注射组，但不见于人源化抗体注射组。
通过注射融合蛋白(诸如上述融合蛋白)的PBS溶液或其它生物相容性缓冲溶液或已知的佐剂(如弗氏不完全佐剂或完全佐剂)，测试由各种途径给予的抗原-IL-12多细胞因子融合蛋白的免疫原性。例如，可每两周给予单次或多次的皮下、皮内或腹膜内注射。或者，所述融合蛋白首先可通过皮下注射给予，然后通过腹膜内注射给予。弗氏佐剂由于刺激注射部位而不能用于人类用途。其它佐剂如氢氧化铝沉淀(Alum)被批准用于人类用途并可用于本发明。基于鲨烯和脂质的新型有机化学佐剂也可由于皮肤注射。实施例16.用多细胞因子融合蛋白进行基因治疗
通过基因疗法传递多细胞因子融合蛋白的抗癌活性也已经被证明可用于治疗肺癌。使用前述病毒载体系统稳定转染Lewis肺癌细胞(pLNCX-scIL-12-IL-2DNA或pLNCX-scIL-12 DNA转染入PA317包装细胞系)。这些构建物编码其中p35和p40已通过接头连接起来的单链型IL-12。使用含G418的培养基体外选择克隆，并通过ELISA(R&D Systems)鉴定稳定表达约50-60ng/ml IL-12的克隆。
将大约1×106和大约5×106的表达scIL-12或scIL-12-IL-2的LLC细胞皮下注射入C57BL/6小鼠以及SCID小鼠。作为对照，将2×106 LLC细胞注射入C57BL/6小鼠以及SCID小鼠。表达IL-12的LLC细胞形成的肿瘤的生长速率与没有被工程为表达细胞因子的LLC细胞产生的肿瘤大致相同。然而，在C57BL/6小鼠以及在SCID小鼠中，表达scIL-12-IL-2的LLC细胞或者不形成皮下肿瘤，或者形成随后缩小消失的肿瘤(图17和18)。实施例17.构建含IL-4和GM-CSF的多细胞因子融合蛋白
细胞因子IL-4和GM-CSF当联合使用时是有效的树突细胞激活物。如下构建含IL-4和GM-CSF活性的多细胞因子-抗体融合蛋白。将GM-CSF的编码序列按照读框融合至位于前导序列之后的KS-1/4抗体重链编码序列的3′末端。另外，用接头将IL-4的编码序列(包括前导序列)按照读框融合至成熟KS-1/4抗体轻链编码序列的5′末端。
具体而言，为构建小鼠IL-4和KS-1/4抗体轻链的融合蛋白编码DNA，使用正向引物序列TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAGC(SEQ ID NO：22)通过PCR修饰小鼠IL-4 cDNA，其中XbaI位点TCTAGA(SEQ ID NO：22的残基1-6)位于翻译起始密码子ATG的上游，而反向引物序列为C GGA TCC CGA GTA ATC CAT TTG CATGAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G(SEQ ID NO：23)，它含有的BamHI位点GGA TCC(SEQ ID NO：23的残基2-7)紧接着编码小鼠IL-4的C端氨基酸残基的TCG密码子(反密码子为CGA)的3′。克隆PCR片段并验证序列后，将含有小鼠IL-4 cDNA的XbaI-BamHI片段连接至编码富含甘氨酸和丝氨酸残基的柔性肽接头的BamHI-AflII寡核苷酸双链体。AflII末端又连接至人工放置于成熟KS-1/4轻链N端之前的AflII位点。在两次连接产生的连接处的DNA和蛋白序列如下。DNA：     TCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA蛋白：   (Ser)Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGGG GGC TCC TTA AGC GAG         (SEQ ID NO：24)Gly Gly ser Leu Ser (Glu)       (SEQ ID NO：25)
在该DNA序列中，GGATCC(SEQ ID NO：24的残基4-9)和CTTAAG(SEQ ID NO：24的残基48-53)分别为用于再构建的两个限制性位点BamHI和AflII；TCG编码小鼠IL-4的C端丝氨酸残基；GAG编码KS-1/4轻链的成熟N端；而在DNA序列之下显示了富含GlySer的肽接头的氨基酸序列。使用前面实施例描述的技术和其它分子生物学标准技术，将包括强启动子的用于高水平表达的辅助序列适当地置于两种融合多肽编码DNA节段的周围。
将编码IL4-KS(轻链)和KS(重链)-GM-CSF的融合蛋白的DNA序列转染入NS/0细胞，高水平表达相应的多肽。SDS-PAGE在还原条件下显示约80kD的分散带(对应于重链-GM-CSF多肽)和约50kD的多条带(对应于IL-轻链融合蛋白)。出现分散带和多条带分别是由于IL-4和GM-CSF的可变糖基化。
将所述亚单位装配入其结构对应于图3G通式结构的二硫键结合的四聚体蛋白。该蛋白具有KS-1/4抗原结合活性、通过其Fc区结合Staph A蛋白的能力以及IL-4和GM-CSF的细胞因子活性。通过IL-4依赖性刺激CTLL-2细胞的氚化胸苷掺入检测IL-4活性。通过GM-CSF依赖性刺激32(D)GM细胞的氚化胸苷掺入检测GM-CSF活性。以1摩尔为基准，KS-IL4-GMCSF的IL-4活性和GM-CSF活性与纯化的IL-4和GM-CSF相似。
如下构建没有结合抗体序列的细胞因子IL-4和GM-CSF的融合蛋白。通过PCR由小鼠脾细胞RNA克隆小鼠IL-4。正向引物序列为TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C(SEQ ID NO：26)，其中XbaI位点TCTAGA(SEQ ID NO：26的残基1-6)位于翻译起始密码子ATG的上游，而反向引物序列为CGA TAT CCC GGA CGAGTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G(SEQ ID NO：27)，其中EcoRV位点GAT ATC(SEQ ID NO：27的残基2-7)紧接着编码小鼠IL-4C端氨基酸残基的TCG密码子(反密码子为CGA)的3′。验证序列后，将含有muIL-4 cDNA与其天然前导序列的XbaI-EcoRV片段连接至含muGM-CSF cDNA的SmaI-XhoI片段，在muIL-4和muGM-CSF融合的连接处产生以下序列：ATG GATTAC TCG TCC GGG ATG GGA AAA GCA CCC GCC CGC(SEQ IDNO：28)，其中muIL-4的C端序列和muGM-CSF的N端序列为粗体，而G ATG GG(SEQ ID NO：28的残基17-22)是将EcoRV平端连接至SmaI平端产生的序列。然后将获得的编码muIL4-muGMCSF的DNA克隆入表达载体。通过SDS-PAGE分析所表达的蛋白，发现跑出一条表观分子量为45-50kD的分散带。以1摩尔为基准，IL4-GMCSF的IL-4活性和GM-CSF活性与纯化的IL-4和GM-CSF相似。实施例18.构建淋巴趋化因子-KS-IL2编码DNA和表达淋巴趋化因子-KS-IL2蛋白
趋化因子是一类独特的被认为形成梯度和介导免疫细胞趋化性的细胞因子。另外，同其它细胞因子一样，趋化因子也能够诱导特定基因在靶细胞中表达。趋化因子的一个特征在于自由N端往往是其活性必需的，这可能对构建融合蛋白的途径构成限制。
构建一种细胞因子-抗体-细胞因子融合蛋白，包含细胞因子淋巴趋化因子(为一种趋化因子)、抗体KS-1/4和细胞因子IL-2。该融合蛋白为四聚体，并含有两种不同多肽。一种多肽包括融合至KS-1/4抗体重链N端的小鼠淋巴趋化因子，其后为位于C端的IL-2。先前已经描述了KS-1/4重链与在C端的IL-2的融合蛋白-“KS-IL2重链”[Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：1428]。另一种多肽由KS1/4抗体轻链组成。
Kelner和Zlotnik公开了小鼠淋巴趋化因子的完全编码序列(Science 266：1395[1998])。为构建小鼠淋巴趋化因子与KS-IL2重链的融合蛋白的编码DNA，使用正向引物TCTAGAGCCACC ATGAGA CTT CTC CTC CTG AC(SEQ ID NO：29)通过PCR修饰小鼠淋巴趋化因子cDNA，其中XbaI位点TCTAGA(SEQ ID NO：29的残基1-6)位于翻译起始密码子ATG的上游，而反向引物序列为GGATCC CCC AGT CAG GGT TAC TGC TG(SEQ ID NO：30)，其BamHI位点GGA TCC(SEQ ID NO：30的残基1-6)紧接着编码小鼠淋巴趋化因子的C端氨基酸残基的GGG密码子(反密码子为CCC)的3′。克隆PCR片段并验证序列后，将含有小鼠淋巴趋化因子cDNA的XbaI-BamHI片段连接至编码富含甘氨酸和丝氨酸残基的柔性肽接头的BamHI-AflII寡核苷酸双链体。AflII末端又连接至人工放置于KS-IL2重链成熟N端之前的AflII位点。在两次连接产生的连接处的DNA序列如下：
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser LeuCCC GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA GGG GGC TCC TTASer            (SEQ ID NO：32)AGC CAG        (SEQ ID NO：31)其中GGATCC(SEQ ID NO：31的残基4-9)和CTTAAG(SEQ ID NO：31的残基48-53)分别为用于再构建的两个限制性位点BamHI和AflII；CCC编码小鼠淋巴趋化因子的C端氨基酸残基；CAG编码KS-IL2重链的成熟N端；而在DNA序列之上显示了富含GlySer的肽接头的氨基酸序列。然后将小鼠淋巴趋化因子-KS-IL2重链的编码DNA克隆入表达载体，再与KS1/4轻链共表达。
使用T细胞以Boyden室迁移测定(Boyden chamber migrationassay)测试表达的淋巴趋化因子-KS-IL2融合蛋白的淋巴趋化因子活性(Leonard等，[1999]Current Protocols in Immunology 6.12.3页)。或者，使用NK细胞。或者，用在G蛋白偶联受体活化作用下的标准细胞钙流量测定观测淋巴趋化因子活性(Maghazachi等，FASEB J.[1997]；11：765-74)。另外，测试了淋巴趋化因子-KS-IL2融合蛋白，发现其在结合EpCAM的能力测定中有活性，并且在IL-2活性测定(如CTLL-2细胞增殖测定)中也有活性。
                            文献引用
本文以上提及的所有出版物都通过引用整体结合到本申请中。
                          等同实施方案
可在不背离本发明精神或基本特征的情况下以其它具体形式实施本发明。因此认为前述的实施方案是在所有方面进行阐述，而不是限制本文描述的本发明。因此，本发明的范围由所附 而不是由以上描述限定，所以权利要求书包括权利要求书等同含义和范围内的所有变化。
说明书的核苷酸和氨基酸序列表序列表<110>Gillies，Stephen
Lo，Kin Ming<120>多细胞因子蛋白复合物<130>LEX-010PC<140><141><150>60/147，924<151>1999-08-09<160>32<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>582<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220><223>人工序列的描述：成熟蛋白的小鼠p35编码序列<400>1agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct ga                    582<210>2<211>1472<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：小鼠p40-IL-2融合蛋白编码序列<400>2atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020gatccccggg taaagcaccc acttcaagct ctacagcgga agcacagcag cagcagcagc 1080agcagcagca gcagcagcag cacctggagc agctgttgat ggacctacag gagctcctga 1140gcaggatgga gaattacagg aacctgaaac tccccaggat gctcaccttc aaattttact 1200tgcccaagca ggccacagaa ttgaaagatc ttcagtgcct agaagatgaa cttggacctc 1260tgcggcatgt tctggatttg actcaaagca aaagctttca attggaagat gctgagaatt 1320tcatcagcaa tatcagagta actgttgtaa aactaaaggg ctctgacaac acatttgagt 1380gccaattcga tgatgagtca gcaactgtgg tggactttct gaggagatgg atagccttct 1440gtcaaagcat catctcaaca agccctcaat aa                               1472<210>3<211>1409<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：小鼠p40-GM-CSF融合蛋白编码序列<400>3atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020gatccccggg aaaagcaccc gcccgctcac ccataattgt tacccggcct tggaagcatg 1080tagaggccat caaagaagcc ctaaacctcc tggatgacat gcctgtcacg ttgaatgaag 1140aggtagaagt cgtctctaac gagttctcct tcaagaagct aacatgtgtg cagacccgcc 1200tgaagatatt cgagcagggt ctacggggca atttcaccaa actcaagggc gccttgaaca 1260tgacagccag ctactaccag acatactgcc ccccaactcc ggaaacggac tgtgaaacac 1320aagttaccac ctatgcggat ttcatagaca gccttaaaac ctttctgact gatatcccct 1380ttgaatgcaa aaaaccaagc caaaaatga                                   1409<210>4<211>1389<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人p40-IL-2融合蛋白编码序列<400>4atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420acctgctggt ggctgacga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20><223>人工序列的描述：在单链小鼠IL12和GMCSF连接处的DNA序列<220><221>其它特征<222>(14)..(16)<223>编码小鼠p40的C端氨基酸残基<220><221>其它特征<222>(26)..(28)<223>编码成熟小鼠GMCSF的N端氨基酸残基<400>10ctgcagggtc cga tccccgg gaaaagca                              28<210>11<211>2013<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：小鼠p35-接头-p40-IL-2融合蛋白编码序列<400>11agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac 960tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc 1020aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct 1080gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag 1140gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca 1260gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg 1320gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga 1380atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560cgatccccgg gtaaagcacc cacttcaagc tctacagcgg aagcacagca gcagcagcag 1620cagcagcagc agcagcagca gcacctggag cagctgttga tggacctaca ggagctcctg 1680agcaggatgg agaattacag gaacctgaaa ctccccagga tgctcacctt caaattttac 1740ttgcccaagc aggccacaga attgaaagat cttcagtgcc tagaagatga acttggacct 1800ctgcggcatg ttctggattt gactcaaagc aaaagctttc aattggaaga tgctgagaat 1860ttcatcagca atatcagagt aactgttgta aaactaaagg gctctgacaa cacatttgag 1920tgccaattcg atgatgagtc agcaactgtg gtggactttc tgaggagatg gatagccttc 1980tgtcaaagca tcatctcaac aagccctcaa taa                              2013<210>12<211>1569<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：小鼠p35-接头-p40融合蛋白编码序列<400>12agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac 960tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc 1020aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct 1080gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag 1140gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca 1260gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg 1320gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga 1380atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560cgatcctag                                                         1569<210>13<211>2709<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：小鼠Fc-p35-接头-p40-IL-2融合蛋白编码序列<400>13gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240gattacaaca gtactctccg ggtggtca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27<210>23<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR扩增小鼠IL-4的反向引物<220><221>其它特征<222>互补物((8)..(10))<223>编码小鼠IL-4的C端氨基酸残基<400>23cggatcccga gtaatccatt tgcatgatgc tctttaggct ttccagg            47<210>24<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：在小鼠IL-4和成熟KS-1/4轻链的连接处的编码序列<220><221>其它特征<222>(1)..(3)<223>编码小鼠IL-4的C端丝氨酸残基<220><221>其它特征<222>(55)..(57)<223>编码成熟KS-1/4轻链的N端氨基酸残基<400>24tcgggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagcgag     57<210>25<211>19<212>蛋白<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：在小鼠IL-4和成熟KS-1/4轻链连接处的蛋白序列<400>25Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1               5              10                      15Leu Ser Glu<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR扩增小鼠IL-4的正向引物<220><221>其它特征<222>(9)..(11)<223>翻译起始密码子<400>26tctagaccat gggtctcaac ccccagc                                  27<210>27<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR扩增小鼠IL-4的反向引物<220><221>其它特征<222>互补物((13)..(15))<223>编码小鼠IL-4的C端氨基酸残基<400>27cgatatcccg gacgagtaat ccatttgcat gatgctcttt aggctttcca gg    52<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：在小鼠IL-4和小鼠GM-CSF之间连接处的编码序列<220><221>其它特征<222>(1)..(12)<223>编码muIL4的C端序列<220><221>其它特征<222>(28)..(39)<223>编码muGM-CSF的N端序列<400>28atggattact cgtccgggat gggaaaagca cccgcccgc                       39<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR扩增小鼠淋巴趋化因子的正向引物<220><221>其它特征<222>(13)..(15)<223>翻译起始密码子<400>29tctagagcca ccatgagact tctcctcctg ac                               32<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于PCR扩增小鼠淋巴趋化因子的反向引物<220><221>其它特征<222>互补物((7)..(9))<223>编码小鼠淋巴趋化因子的C端氨基酸残基<400>30ggatccccca gtcagggtta ctgctg                                26<210>31<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：在小鼠淋巴趋化因子和KS-IL2重链之间连接处的编码序列<220><221>其它特征<222>(1)..(3)<223>编码小鼠淋巴趋化因子的C端氨基酸残基<220><221>其它特征<222>(55)..(57)<223>编码KS-IL2重链的N端氨基酸残基<400>31cccggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagccag  57<210>32<211>17<212>蛋白<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：在小鼠淋巴趋化因子和KS-IL2重链之间连接处的蛋白序列<400>32Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu1               5                  10                  15Ser

Claims (53)

1.一种多功能融合蛋白，它包含限定为免疫球蛋白区段(Ig)、第一种细胞因子(C1)和第二种不同的细胞因子(C2)的多肽链。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述Ig、所述C1和所述C2从N端至C端的方向排列产生由选自以下的组成式定义的融合蛋白：
(i)Ig—C1—C2；
(ii)C1—Ig—C2；和
(iii)C1—C2—Ig，其中破折号表示多肽键或多肽接头。
3.权利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2包括IL-2、IL-4或GM-CSF。
4.权利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2包括异源二聚体细胞因子亚单位。
5.权利要求1的融合蛋白，其中所述C1为趋化因子。
6.权利要求4的融合蛋白，其中所述亚单位包括IL-12的p35亚单位或IL-12的p40亚单位。
7.权利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2为人细胞因子。
8.权利要求1的融合蛋白，其中所述Ig包括免疫球蛋白重链可变区结构域(VH)。
9.权利要求1或8的融合蛋白，其中所述Ig包括免疫球蛋白重链恒定区。
10.权利要求9的融合蛋白，其中所述恒定区包含铰链区结构域、CH2结构域和CH3结构域。
11.权利要求10的融合蛋白，其中所述恒定区还含有CH1结构域。
12.权利要求9的融合蛋白，其中所述VH对癌症特异性抗原或病毒抗原具有免疫反应性。
13.权利要求1的融合蛋白，其中所述C1和所述C2当以所述融合蛋白连接时在体内具有相似的循环半衰期。
14.权利要求1的融合蛋白，其中所述Ig、所述C1和所述C2在相同条件下都具有活性。
15.一种多功能蛋白复合物，它包含第一条多肽链和第二条多肽链，其中所述第一条多肽链限定为免疫球蛋白区段和第一种细胞因子的第一部分，所述第二条多肽链限定为第二种细胞因子和第一种细胞因子的第二部分。
16.权利要求15的多功能蛋白复合物，其中所述第一条多肽链与所述第二条多肽链共价连接。
17.权利要求15的多功能蛋白复合物，其中所述第一种细胞因子为二聚体细胞因子。
18.权利要求15的多功能蛋白复合物，其中所述第一种细胞因子为IL-12。
19.权利要求15的多功能蛋白复合物，其中所述第二种细胞因子为IL-2。
20.一种多功能蛋白复合物，它至少包含：第一种融合蛋白：它包含与至少一部分免疫球蛋白轻链融合的第一种细胞因子，以及第二种融合蛋白：它包含与至少一部分免疫球蛋白重链融合的第二种不同的细胞因子。
21.权利要求20的蛋白复合物，其中所述第一种融合蛋白与所述第二种融合蛋白共价结合。
22.权利要求21的蛋白复合物，其中所述免疫球蛋白轻链部分以二硫键与所述免疫球蛋白重链部分结合。
23.权利要求20的蛋白复合物，其中所述第一种细胞因子的N端与所述免疫球蛋白轻链的C端融合。
24.权利要求20的蛋白复合物，其中所述第二种细胞因子的N端与所述免疫球蛋白重链的C端融合。
25.权利要求20的蛋白复合物，其中所述第一种细胞因子为IL-12。
26.权利要求20的蛋白复合物，其中所述第二种细胞因子为IL-12。
27.一种多功能融合蛋白，它包含限定为第一种细胞因子(C1)和第二种不同的细胞因子(C2)的多肽链，其中所述C2单独具有的体内循环半衰期比单独的C1高约2倍，但当所述C1以所述融合蛋白与所述C2连接时，所述融合蛋白中的所述C1的体内循环半衰期与所述C2大致相同。
28.权利要求27的融合蛋白，其中所述C1为IL-2或GM-CSF。
29.权利要求27的融合蛋白，其中所述C2为IL-4、IL-12或其亚单位。
30.权利要求27的融合蛋白，其中所述C1的C末端与所述C2的N末端连接。
31.权利要求27的融合蛋白，其中所述C2的C末端与所述C1的N末端连接。
32.权利要求30或31的融合蛋白，其中所述C末端通过多肽接头与所述N末端连接。
33.权利要求32的融合蛋白，它还含有免疫球蛋白区段(Ig)。
34.权利要求33的融合蛋白，其中所述Ig含有免疫球蛋白重链可变区结构域(VH)。
35.权利要求33的融合蛋白，其中所述Ig含有免疫球蛋白重链恒定区。
36.权利要求35的融合蛋白，其中所述恒定区包含铰链区结构域、CH2结构域和CH3结构域。
37.权利要求36的融合蛋白，其中所述重链恒定区还含有CH1结构域。
38.权利要求27的融合蛋白，其中所述单独的C2的体内循环半衰期比C1的体内循环半衰期至少高约4倍。
39.权利要求38的融合蛋白，其中所述C2的循环半衰期比C1的体内循环半衰期至少高约8倍。
40.一种核酸，它编码权利要求1、15、20或27的融合蛋白。
41.一种细胞，它包含权利要求40的核酸。
42.一种制备融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含第一种细胞因子(C1)、第二种不同的细胞因子(C2)和能够靶向哺乳动物预先选定部位的靶向部分，所述方法包括以下步骤：
(a)在宿主细胞中表达编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含所述C1、所述C2和在给予哺乳动物时能够将所述融合蛋白靶向预先选定部位的靶向部分；和
(b)收获所述融合蛋白。
43.一种将第一种细胞因子(C1)和第二种不同的细胞因子(C2)靶向哺乳动物预先选定部位的方法，所述方法包括：给予所述哺乳动物一种多功能融合蛋白，该融合蛋白包含C1、C2和能够将所述融合蛋白靶向哺乳动物预先选定部位的免疫球蛋白区段(Ig)。
44.权利要求42或43的方法，其中所述Ig包含与布局在哺乳动物预先选定部位的抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白重链可变区结构域。
45.权利要求44的方法，其中所述抗原为癌症特异性抗原或病毒抗原。
46.权利要求42或43的方法，其中所述Ig包含能够结合布局在哺乳动物预先选定部位的免疫球蛋白Fc受体的免疫球蛋白重链恒定区。
47.权利要求42或43的方法，其中所述Ig、所述C1和所述C2在所述融合蛋白给予所述哺乳动物时均有活性。
48.权利要求42或43的方法，其中所述哺乳动物为人。
49.权利要求42或43的方法，其中所述C1为IL-12或其亚单位。
56.权利要求49的方法，其中所述C2选自IL-2和GM-CSF。
57.一种治疗哺乳动物疾病的方法，该方法包括给予所述哺乳动物权利要求1、15、20或27的蛋白。
58.一种治疗哺乳动物疾病的方法，该方法包括给予所述哺乳动物权利要求40的核酸。
59.一种治疗哺乳动物疾病的方法，该方法包括给予所述哺乳动物权利要求41的细胞。
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