CN1411469A - 脱敏蛋白及置换蛋白的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了维持酶活性和杀虫活性，同时减少或消除了变应原性的修饰蛋白。鉴定了与抗马铃薯贮藏蛋白的抗体结合的表位，其可经由定点诱变而被除去。人们观察到酪氨酸通常会促进马铃薯贮藏蛋白的变应原性。此外，人们还观察到糖基化位点的除去可减少或消除抗体结合。本发明还公开了具有重排氨基酸序列，同时保留了酶活性的置换蛋白。脱敏蛋白和置换蛋白均可被用作杀虫材料，营养补充物及免疫治疗剂。

Description

脱敏蛋白及置换蛋白的制备

                          发明领域

本发明一般涉及新的，非天然存在的蛋白，其具有杀虫性能，本发明特别涉及这些蛋白的设计，制备，及用途，其中所述的这些蛋白已经脱敏，同时还维持了它们的杀虫性能。脱敏的马铃薯贮藏蛋白包括具有修饰过的变应原性序列的变体，及其氨基酸序列在一个或多个断点重排的置换蛋白(permutein)。

                         发明背景杀虫蛋白

天然产物，包括蛋白的使用是人们所熟知的一种控制多种昆虫，真菌，病毒，细菌，及线虫病原体的方法。例如，苏云金芽孢杆菌(B.t.)的内毒素可用于控制鳞翅目和鞘翅目的害虫。产生这些内毒素的基因已经被引入到各种植物中，并被各种植物所表达，所述植物包括棉花，烟草和番茄。然而，有许多对经济影响非常大的害虫，如棉铃象鼻虫(BWV)，Anthonomus grandis，及玉米根虫(CRW)，叶甲虫等，它们不像鳞翅目昆虫那样对B.t.内毒素敏感。此外，其它用于控制对苏云金芽孢杆菌内毒素敏感的昆虫的不同基因产物即使不是致死的，对于抗性的处理也是很重要的。

最近人们已经发现，马铃薯块茎的主要贮藏蛋白，即马铃薯贮藏蛋白(Gaillaird，T.，Biochem.J.121：379-390，1971；Racusen，D.，Can.J.Bot.，62：1640-1644，1984；Andrews，D.L.等，Biochem.J.，252：199-206，1988)，可控制各种昆虫，包括西方玉米根虫(WCRW，Diabrotica virigifera)，南方玉米根虫(SCRW，Diabroticaundecimpunctata)，和棉铃象鼻虫(BWV，Anthonomus grandis)(美国专利No.5,743,477)。马铃薯贮藏蛋白对某些幼虫是致死的，并会阻碍幸存者的生长，以致阻止或严重延迟了幼虫的成熟，从而导致其无法繁殖。这些蛋白，具有非特异性的脂酰基水解酶活性，且研究表明该酶的活性对于其杀虫活性是非常重要的(Strickland，J.A.等，Plant Physiol.，109：667-674，1995；美国专利No.5,743,477)。可将马铃薯贮藏蛋白直接用于植物上或使用现有技术中其它熟知的方法将其引入到植物中，所述方法包括使用已经转化并产生酶的，集群在植物上的微生物，或使用相似转化后的植物本身。

在马铃薯中，马铃薯贮藏蛋白主要是在块茎中发现的，而在其它植物器官中的水平则较低(Hofgen，R.和Willmitzer，L.，PlantScience，66：221-230，1990)。编码马铃薯贮藏蛋白的基因先前已经由Mignery，G.A.等(Nucleic Acids Research，12：7987-8000，1984；Mignery，G.A.等，Gene，62：27-44，1988；Stiekema等，PlantMol.Biol.，11：255-269，1988)及其他人分离出来。在其它植物，特别是茄科植物中也发现了马铃薯贮藏蛋白(Ganal等，Mol.Gen.Genetics，225：501-509，1991；Vancanneyt等，PlantCell，1：533-540，1989)，且最近在玉米属中也发现了马铃薯贮藏蛋白(WO96/37615)。Rosahl等(EMBO J.6：1155-1159，1987)将它转移到烟草植物中，并观察到了马铃薯贮藏蛋白的表达，证明马铃薯贮藏蛋白基因可被植物异源表达。

马铃薯贮藏蛋白作为昆虫控制剂用于植物中是很有吸引力的，但如下所述，不幸的是，人群的一小部分对马铃薯贮藏蛋白，特别是对马铃薯的马铃薯贮藏蛋白过敏。食物过敏

有很多种蛋白均可引起过敏反应。已确定的引起超敏患者过敏反应的蛋白存在于多种植物和动物来源的食物，花粉，真菌孢子，昆虫毒液，昆虫粪便，及动物皮屑和尿液中(King，H.C.，Ear Nose ThroatJ.，73(4)：237-241，1994；Astwood，J.D.，等，Clin.Exp.Allergy，25：66-72，1995；Astwood，J.D.和Fuchs R.L.，Monographs inallergy Vol.32：Highlights in food allergy，pp.105-120，1996；Metcalfe，D.D.等，Critical Reviews in Food Science andNutrition，36S：165-186，1996)。通过临床和分子方法已经鉴定了很多主要变应原来源的攻击蛋白的特性。变应原性蛋白在体内的功能是不同的，范围从酶到细胞骨架的调节剂。

为了理解过敏性疾病的分子基础，已经描绘了许多变应原蛋白重要的IgE结合表位(Elsayed，S.和Apold，J.，Allergy38(7)：449-459，1983；Elsayed，S.等Scand J.Clin.Lab.Invest.Suppl.204：17-31，1991；Zhang L.等，Mol.Immunol.29(11)：1383-1389，1992)。已经报道了IgE结合所需的最佳肽长度为8-12个氨基酸。在不同物种的同源变应原中观察到表位序列的保守性(Astwood，J.D.，等，Clin.Exp.Allergy，25：66-72，1995)。事实上，当作为肽存在时，通过定点诱变引入的保守取代可减少已知表位与IgE的结合。

食物过敏的人数占人口总数的2-6％。其中的八种食物或食物种类(奶，蛋，鱼，甲壳动物，小麦，花生，大豆和坚果)就占食物过敏的90％。然而，据报道超过160种不同的食物，包括马铃薯，均可引起不良反应(Hefle，S.，等，Crit.Rev.in Food Sci.Nutr.，368：69-90，1996)。变应原的作用方式

不考虑变应原的同一性，从理论上说过敏反应的基础机理是相同的。速发型超敏反应(或过敏性反应)是过敏反应的一种形式，其发病非常迅速，即在患者与成因的变应原接触的几秒或几分钟内就发病，且其是由B淋巴细胞IgE抗体的产生而介导的。过敏患者IgE的水平升高，从而通过引发肥大细胞而介导过敏症，肥大细胞富含于皮肤，淋巴器官，眼、鼻和口腔的膜中，及呼吸结构和肠中。过敏患者的IgE与肥大细胞的IgE受体结合。当随后此结合的IgE与适合的变应原接触时，所述肥大细胞脱粒，并释放各种物质，如组胺到周围组织中去(Church等，In：Kay，A.B.ed.，Allergy and AllergicDisease，Oxford，Blackwell Science，pp.149-197，1997)。

这些物质的释放导致速发型超敏反应典型临床症状，如呼吸道或肠平滑肌的收缩，小血管的扩张，及它们对水和血浆蛋白通透性的增加，浓稠粘液的分泌，及导致瘙痒或疼痛的(皮肤)神经末梢刺激。速发型超敏反应的最好情况是对患者的一种损害，最差它可导致非常严重的问题，极少数甚至可导致死亡。马铃薯过敏反应

马铃薯食物过敏在普通人群中是比较少见的(Castells，M.C.等，Allergy Clin Immunol.，8：1110-1114，1986；Hannuksela，M.等，Contact Dermatitis，3：79-84，1977；Golbert，T.M.等，Journal ofAllergy，44：96-107，1969)。大约200个人参与了马铃薯过敏反应的公开临床报告(Hefle，S.等，Critical Reviews in Food Science andNutrition，36S：69-90，1996)。在马铃薯块茎提取物中已经鉴定了很多IgE结合蛋白(见表1)，然而，这些蛋白的氨基酸序列及功能还未确定(Wahl，R.等，Intl.Arch.Allergy Appl.Immunol.，92：168-174，1990)。

                表1：马铃薯块茎IgE结合蛋白(变应原)的研究

研究	蛋白特性
		(Castells，M.C.等，J.Allergy Clin.Immunol.78，1110-1114，1986)	未知14-40kDa
(Wahl，R.等，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.92：168-174，1990)	未知42/43kDa
			未知65kDa
	未知26kDa
			未知20kDa
	未知14kDa
			未知＜14kDa(～5kDa)
(Ebner，C.等，in：Wuthrich，B.& Ortolani，C.(eds.)，Highlights in food allergy.Monographs inAllergy，Volume32 Basil，Karger，pp.73-77，1996)	未知42/43kDa
			未知23kDa
	未知～16kDa
			未知＜14kDa(～5kDa)

使用低变应原性蛋白提高安全性

马铃薯贮藏蛋白已被鉴定为一种变应原性蛋白(Seppala，U.等，J.Allergy Clin.Immunol.103：165-171，1999)。因此，马铃薯过敏患者可能不能安全地食用含未修饰的马铃薯贮藏蛋白的食物，如叶上施用马铃薯贮藏蛋白的农作物，或已经被人工改造过的表达马铃薯贮藏蛋白的农作物。此外，食物供给中食物变应原的增加也是非常危险的(Metcalfe，D.D.等，Critical Reviews and Food Science andNutrition，36S：165-186，1996)。关于潜在的变应原性食物蛋白的使用，人们还有许多其它的担心，即劳动者可能与空气中的微粒接触，从而引发一种新的过敏反应(Moneret Vautrin，D.A.，等，Rev.Med.Interne.17(7)：551-557，1996)。置换蛋白

由序列转座法产生的新蛋白与天然存在的蛋白对类似，它们是通过其氨基酸序列的线性再组织而相关联的(Cunningham等，Proc.Natl.Sci.，U.S.A.，76：3218-3222，1979；Teather等，J.Bacteriol.，172：3837-3841，1990；Schimming，等，Eur.J.Biochem.，204：13-19，1992；Yamiuchi等，FEBSLett.，260：127-130，1991；MacGregor等，FEBS.Lett.，378：263-266，1996)。蛋白序列重排的首次体外应用是由Goldenberg和Creighton(Goldenberg和Creighton，J.Mol.Biol.，165：407-413，1983)描述的。在原始序列的内部位点(断点)选择新的N-端，从断点开始，新序列与原始序列具有相同的氨基酸顺序，直到它到达位于或接近原始C-端的氨基酸。在此点，该新序列直接或通过其它部分或序列(连接体)与位于或接近原始N-端的氨基酸连接，且该新序列以与原始序列相同的序列延续，直到它到达位于或接近原始序列的断点N端的氨基酸，此残基形成链的新C-端。此方法已经用于大小为58-462个氨基酸的蛋白上，且其代表了较宽范围的结构分类(Goldenberg和Creighton，J.Mol.Biol.，165：407-413，1983；Li和Coffino，Mol.Cell.Biol.，13：2377-2383，1993；Zhang等，NatureStruct.Biol.，1：434-438，1995；Buchwalder等，Biochemistry，31：1621-1630，1994；Protasova等，Prot.Eng.，7：1373-1377，1995；Mullins等，J.Am.Chem.Soc.，116：5529-5533，1994；Garrett等，Protein Science，5：204-211，1996；Hahn等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：10417-10421，1994；Yang和Schachman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：11980-11984，1993；Luger等，Science，243：206-210，1989；Luger等，Prot，Eng.，3：249-258，1990；Lin等，Protein Science，4：159-166，1995；Vignais等，Protein Science，4：994-1000，1995；Ritco-Vonsovici等，Biochemistry，34：16543-16551，1995；Horlick等，Protein Eng.，5：427-431，1992；Kreitman等，Cytokine，7：311-318，1995；Viguera等，Mol.Biol.，247：670-681，1995；Koebnik和Kramer，J.Mol.Biol.，250：617-626，1995；Kreitman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：6889-6893，1994)。

因此我们需要开发一种植物可表达的杀虫蛋白，其具有最小的变应原性或没有变应原性。

                       发明概述

本发明公开了新的蛋白序列，及编码它们的核酸序列。该蛋白可维持人们所期望的酶活性及杀虫活性，同时可减少或消除变应原性。

变应原性的表位是通过使用免疫反应性测定法扫描重叠肽序列来确定的。丙氨酸扫描及‘合理取代’是在所识别的肽序列上进行的，从而确定有助于抗体结合的特异性氨基酸，并推测整个蛋白的变应原性。通过诸如定点诱变编码核酸序列的方法，可将个体突变引入到整个蛋白序列中，从而缺失或修饰变应原性序列。

糖基化靶残基在蛋白的氨基酸序列中被确定，已经证实其具有过敏反应诱导性。用其它氨基酸残基合理地取代糖基化靶氨基酸残基可消除糖基化作用，并提供一种变异的去糖基化蛋白。该变异蛋白可减少变应诱导性，并可减少与患者血清中IgE的结合，其中所述的患者对所述糖基化蛋白过敏。

具有脱敏蛋白序列的置换蛋白的构建可进一步减少或消除过敏反应。修饰该编码核酸序列以产生一种非天然存在的蛋白，其具有与天然存在的蛋白序列不同的线性氨基酸序列，同时维持了酶活性及杀虫特性。该置换蛋白优选在植物细胞中产生，更优选以对摄取植物细胞的昆虫具有毒性的浓度产生。

此处特别考虑了减少，消除，或降低蛋白的变应原诱导性的方法。这种方法包括下列步骤：确定一个或多个对变应原诱导蛋白过敏的患者，并获得该患者的血清样品；使患者血清暴露于第一组代表变应原诱导蛋白的合成重叠肽中，以鉴定这种表位与存在于过敏患者血清中的IgE相结合的肽，且其中存在于血清中的IgE对所述变应原诱导蛋白具有特异性的亲和力，所述变应原诱导蛋白可产生第二组肽，该第二组肽是以第一组肽为基础的变异肽，经鉴定其与存在于患者血清中的IgE特异性结合，且显示丙氨酸扫描或合理扫描的氨基酸取代，与第一组非变异肽相比，其减少、降低或消除了IgE结合，且经鉴定这种减少、消除或降低IgE结合的取代是有效产生结果的取代；以及修饰变应原诱导蛋白的氨基酸序列，使其包含一个或多个所述有效产生结果的取代，其中该修饰蛋白是变应原诱导蛋白的一种变体，其缺少变应原诱导蛋白或表现出变应原诱导性减少，且其中该变应原诱导蛋白的变体包含一个或多个所得的有效取代，其可减少，降低，或完全消除存在于所述患者血清中的IgE的结合。

该新蛋白可用于控制昆虫，作为营养补充物，免疫治疗方案，及其它可能的应用中。含编码核酸的转基因植物细胞和植物对于控制昆虫，及作为营养/免疫疗法的材料是特别有益的。

                        附图描述

下列附图形成本发明说明书的一部分，并可用于进一步证明本发明的某些方面。参考这些附图的一幅或多幅，并结合此处提出的特殊实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。

图1是马铃薯的马铃薯贮藏蛋白PatA(酰基脂水解酶)与马铃薯贮藏蛋白(酰基脂水解酶)同系物及相关氨基酸序列的序列对比，该同系物及相关序列来源于双子叶植物和单子叶植物。

图2是结合重叠肽序列的IgE。

图3是编码马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白的核酸序列的构建，且在此图中示范性标出了位于247位的断点。

                     序列表说明

下列序列表说明形成本发明说明书的一部分，并用于进一步证实本发明的某些方面。参考这些序列的一个或多个，并结合此处提出的特殊实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。SEQ ID NO：1       编码马铃薯贮藏蛋白(酰基脂水解酶)的DNA序列SEQ ID NO：2       马铃薯贮藏蛋白的蛋白序列SEQ ID NO：3       热扩增引物SEQ ID NO：4       热扩增引物SEQ ID NO：5       热扩增引物SEQ ID NO：6       在巴斯德毕赤氏酵母中产生的剪切前的马铃薯贮藏蛋白SEQ ID NO：7       在巴斯德毕赤氏酵母中产生的剪切后的马铃薯贮藏蛋白SEQ ID NO：8       Y106F诱变引物SEQ ID NO：9       Y129F诱变引物SEQ ID NO：10      Y185F诱变引物SEQ ID NO：11      Y193F诱变引物SEQ ID NO：12      Y185F和Y193F诱变引物SEQ ID NO：13      Y270F诱变引物SEQ ID NO：14      Y316F诱变引物SEQ ID NO：15      Y362F诱变引物SEQ ID NO：16-104  马铃薯贮藏蛋白的肽扫描序列SEQ ID NO：105-241 所选马铃薯贮藏蛋白肽的丙氨酸及合理扫描序列SEQ ID NO：242     热扩增引物27SEQ ID NO：243     热扩增引物48SEQ ID NO：244     热扩增引物47SEQ ID NO：245     热扩增引物36SEQ ID NO：246     编码置换蛋白的pMON37402序列SEQ ID NO：247     pMON37402序列编码的置换蛋白SEQ ID NO：248     热扩增引物58SEQ ID NO：249     热扩增引物59SEQ ID NO：250     编码置换蛋白的pMON37405序列SEQ ID NO：251     pMON37405序列编码的置换蛋白SEQ ID NO：252     热扩增引物60SEQ ID NO：253     热扩增引物61SEQ ID NO：254     编码置换蛋白的pMON37406序列SEQ ID NO：255     pMON37406序列编码的置换蛋白SEQ ID NO：256    热扩增引物62SEQ ID NO：257     热扩增引物63SEQ ID NO：258     编码置换蛋白的pMON37407序列SEQ ID NO：259     pMON37407序列编码的置换蛋白SEQ ID NO：260     热扩增引物60SEQ ID NO：261     热扩增引物65SEQ ID NO：262     编码置换蛋白的pMON37408序列SEQ ID NO：263     pMON37408序列编码的置换蛋白SEQ ID NO：264     编码置换蛋白的pMON40701序列SEQ ID NO：265     pMON40701序列编码的置换蛋白SEQ ID NO：266     热扩增引物Syn1SEQ ID NO：267     热扩增引物Syn2SEQ ID NO：268     热扩增引物Syn3SEQ ID NO：269     热扩增引物Syn4SEQ ID NO：270     编码置换蛋白的pMON40703序列SEQ ID NO：271     pMON40703序列编码的置换蛋白SEQ ID NO：272     热扩增引物Syn10SEQ ID NO：273     热扩增引物Syn1lSEQ ID NO：274     编码置换蛋白的pMON40705序列SEQ ID NO：275     pMON40705序列编码的置换蛋白SEQ ID NO：276-277 置换蛋白连接体序列SEQ ID NO：278     马铃薯贮藏蛋白同工酶PatA+(包括信号肽)SEQ ID NO：279     马铃薯贮藏蛋白同工酶PatB+(包括信号肽)SEQ ID NO：280     马铃薯贮藏蛋白同工酶PatFm(缺少信号肽的成熟蛋白)SEQ ID NO：281     马铃薯贮藏蛋白同工酶PatIm(缺少信号肽的成熟蛋白)SEQ ID NO：282     马铃薯贮藏蛋白同工酶PatL+(包括信号肽)SEQ ID NO：283     合理取代的肽SEQ ID NO：284     米同系物肽SEQ ID NO：285     马铃薯贮藏蛋白同系物Pat17的DNA编码序列及氨基

               酸翻译SEQ ID NO：286     马铃薯贮藏蛋白同系物Pat17的氨基酸序列SEQ ID NO：287     双子叶植物马铃薯贮藏蛋白同系物的氨基酸序列

               pentin1_phbSEQ ID NO：288     双子叶植物马铃薯贮藏蛋白同系物的氨基酸序列5c9_phbSEQ ID NO：289     玉米马铃薯贮藏蛋白同系物的氨基酸序列玉米1_pepSEQ ID NO：290     玉米马铃薯贮藏蛋白同系物的氨基酸序列玉米2_pepSEQ ID NO：291     玉米马铃薯贮藏蛋白同系物的氨基酸序列玉米3_pepSEQ ID NO：292     玉米马铃薯贮藏蛋白同系物的氨基酸序列玉米4_pepSEQ ID NO：293     玉米马铃薯贮藏蛋白同系物的氨基酸序列玉米5_pep

                         定义

我们提供下列定义来帮助本领域的技术人员理解有关本发明的详细描述。某些词和短语也可能在说明书的其它部分中定义。对于以下提出的词和短语的定义没有限制，除了下面说明的那些，在说明书的其它地方也说明了其它的含义。

“变应原”是指一种生物或化学物质，其可诱导过敏反应或应答。过敏反应可以是一种免疫球蛋白E介导的反应。

氨基酸代码：A(Ala)＝丙氨酸；C(Cys)＝半胱氨酸；D(Asp)＝天冬氨酸；E(Glu)＝谷氨酸；F(Phe)＝苯丙氨酸；G(Gly)＝甘氨酸；H(His)＝组氨酸；I(Ile)＝异亮氨酸；K(Lys)＝赖氨酸；L(Leu)＝亮氨酸；M(Met)＝甲硫氨酸；N(Asn)＝天冬酰胺；P(Pro)＝脯氨酸；Q(Gln)＝谷氨酰胺；R(Arg)＝精氨酸；S(Ser)＝丝氨酸；T(Thr)＝苏氨酸；V(Val)＝缬氨酸；W(Trp)＝色氨酸；Y(Tyr)＝酪氨酸。

“扩增”是指增加所期望分子的拷贝数。

“编码序列”，“可读框”，及“结构序列”指的是编码蛋白，多肽，或肽序列的连续的核酸碱基对三联体。

“密码子”指的是指定特定氨基酸的三个核苷酸的序列。

“互补性”是指DNA或RNA的相反链上，腺嘌呤与胸腺嘧啶(或RNA中的尿嘧啶)及胞嘧啶与鸟嘌呤的特异性结合。

“脱敏”(产生低变应原性)是指人工改造或修饰蛋白或编码DNA的方法，与未修饰的蛋白相比，这种修饰蛋白具有减少或消除诱导过敏反应的能力。脱敏蛋白可被看作是低变应原性的。蛋白的脱敏程度可通过IgE抗体结合的减少在体外进行测量。

“与启动子区异源的DNA片段”是指与目前附着的启动子在天然状态下不存在于相同基因中的编码性DNA片段。

“DNA片段”指的是一种DNA分子，其已被从一种特定物种的总基因组DNA中自由分离出来。

“电穿孔”是指，用短暂的高压DC(直流)电使宿主细胞通透，从而将外源DNA引入到细胞中，使它们摄取染色体外DNA的方法。

“编码DNA”指的是染色体DNA，质粒DNA，cDNA，或合成DNA，其编码此处讨论的任意一种酶。

“内源性”是指来源于生物体或细胞内的物质。

“内切核酸酶”是指一种在内部位置水解双链DNA的酶。

“表位”是指变应原上的一个区，其与免疫系统的细胞相互作用。通常，根据与它们相互作用的抗体或细胞的类型，可进一步定义表位，即，如果该区与B-细胞或抗体(IgE)反应，则它被称为B-细胞表位。

“外源性”是指来源于生物体或细胞外部的物质。典型地，其可应用于产生转化的或转基因的宿主细胞和植物所使用的核酸分子中。

“表达偶联”和“表达连锁”是指一种启动子或启动子区和一种编码或结构序列，其方向和距离可使启动子或启动子区指导编码或结构序列的转录。

“表达”指的是基因的转录，它产生相应mRNA及其翻译，以便产生相应基因产物，即，肽，多肽或蛋白。

“异源DNA”指的是与受体细胞来源不同的DNA。

“同源DNA”指的是与受体细胞来源相同的DNA。

“同一性”是指两个核酸或蛋白序列间的相似程度。两个序列的序列比对是通过适当的计算机程序完成的。用于进行序列比对的，被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等，Nucl.Acids Res.，22：4673-4680，1994)。用匹配对的碱基或氨基酸数除以碱基或氨基酸的总数，然后乘以100，即可得到百分比同一性。例如，如果两个580个碱基对的序列有145个匹配的碱基，那么它们的同一性为25％。如果两个比较序列的长度不同，那么用匹配数除以两个之中长度较短的一个。例如，如果在200个氨基酸的蛋白和400个氨基酸的蛋白之间，有100个匹配的氨基酸，那么它们对于较短序列的同一性为50％。如果较短序列的长度小于150个碱基对或50个氨基酸，那么用匹配数除以150(对于核酸碱基而言)或50(对于氨基酸而言)，然后乘以100，即得到百分比同一性。

“IgE”(免疫球蛋白E)是指由B细胞分泌的一种特殊种类的免疫球蛋白。IgE结合肥大细胞上的特异性受体。变应原与肥大细胞结合的IgE相互反应可引发过敏症状。

“免疫疗法”指的是针对免疫系统的任何类型的治疗。过敏反应免疫疗法是一种逐渐增加变应原量，从而诱导特征为对抗原/变应原耐受的免疫应答的治疗方法，也称为脱敏。

“体外”指的是“在实验室中”和/或“活的生物体的外部”。

“体内”指的是“在活的生物体中”。

“杀虫多肽”是指一种具有杀虫特性的多肽，它可不利地影响害虫的生长和发育。

“单子叶”指的是具有单一子叶(种子植物胚的第一片叶)的植物；实例包括谷类如玉米，水稻，小麦，燕麦和大麦。

“多克隆位点”指的是载体中，人工构建的限制酶位点的集合，其可促进外源DNA插入到载体中。

“突变”是指核酸序列的任意改变或变化。它有多种类型，包括点突变，读框改变，剪接，和插入/缺失。

“天然的”是指“天然存在于同一生物体中”。例如，天然启动子是指一种在生物体中天然存在的，与给定的编码序列可操作连接的启动子。天然蛋白是指一种在自然界天然存在的，未被人为改变或操作过的蛋白。

“核酸片段”是一种从特殊物种的总基因组DNA中分离出来的核酸分子，或合成的核酸分子。术语“核酸片段”包括DNA片段，重组载体，质粒，粘粒，噬菌粒，噬菌体，病毒等。

“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。

核酸代码：A＝腺苷；C＝胞苷；G＝鸟苷；T＝胸苷；N＝等摩尔的A，C，G和T；I＝脱氧肌苷；K＝等摩尔的G和T；R＝等摩尔的A和G；S＝等摩尔德C和G；W＝等摩尔的A和T；Y＝等摩尔的C和T。

“可读框(ORF)”是指一种编码肽，多肽或蛋白或能够被翻译成蛋白的DNA或RNA区，或一种能够被转录到RNA产物中的DNA区。

“质粒”是指一种环状的，染色体外的，自我复制的DNA片段。

“点突变”是指核酸序列中单一核苷酸的改变。

“聚合酶链式反应(PCR)”是指一种制造一个核酸序列的多个拷贝的酶促技术。DNA序列的拷贝是通过在两个寡核苷酸之间穿梭DNA聚合酶而制备的。此扩增方法的基础是多次循环改变温度从而变性，使扩增序列再-退火，然后延伸，在位于侧翼扩增序列间的区域中合成新的DNA链。这种方法也被称为热扩增。

“探针”是指一种多核苷酸序列，它与被分析物中靶多核苷酸序列互补。抗体也可被用作探针，以检测抗原的存在。也就是说，抗体的抗原结合域对抗原具有某些可检测的亲和力，从而与其结合。抗体与抗原的结合可通过本领域已知的方法来测量，如结合位点的化学发光，磷光，荧光，比色化学沉积，或其它。

“启动子”或“启动子区”是指一种DNA序列，通常位于编码序列的上游(5’)，其通过为RNA聚合酶和/或其它在正确位点开始转录所必需的因子提供识别位点，控制信使RNA(mRNA)的产生来控制编码序列的表达。如此处所考虑的那样，启动子或启动子区包括启动子的变异，该变异是由与各种调节序列的连接，随机或控制的诱变，及增强子序列的添加或复制得来的。此处公开的启动子区，及其生物功能性的等价物，当将其作为适当重组载体的一部分引入到宿主中时，在它们的控制之下，可驱动编码序列的转录，这是由它产生mRNA的能力所证明的。

“重组DNA构建体”或“重组载体”指的是任何来源的任意一种介质，如质粒，粘粒，病毒，自主复制的序列，噬菌体，或线性或环状的单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，它们能够基因组整合或自主复制，且其包括一种DNA分子，其中的一个或多个DNA序列以功能性可操作的方式连接。这种重组DNA构建体或载体能够将5’调节序列或启动子区和选定基因产物的DNA序列以这样一种方式引入到细胞中，即所述DNA序列被转录到功能性mRNA中，从而被翻译和表达。重组DNA构建体或重组载体可被构建成能够表达反义RNAs，从而抑制人们感兴趣的特异性RNA的翻译。

“重组蛋白”也称为“异源蛋白”，是指通常不是由宿主细胞产生的蛋白。

“再生”指的是从植物细胞(例如，植物的原生质体或外植体)生长成植物的过程。

“调节序列”指的是位于DNA序列的上游(5’)，内部，和/或下游(3’)的核苷酸序列，所述DNA序列编码选定的基因产物，其转录和表达是通过调节序列和细胞的蛋白合成器控制的。

“限制酶”是指一种识别双链DNA中核苷酸的特异性回文序列，并能裂解双链的酶，也称其为限制性内切核酸酶。典型地，剪切发生于限制位点内。

“有效产生结果的取代”(RES)指的是靶蛋白IgE结合区(表位)内的一种氨基酸取代，其可通过该表位减少或消除IgE结合。此处的例子涉及马铃薯贮藏蛋白及其同系物，然而，可被本领域的那些技术人员很容易地识别，该方法更广泛的用于除马铃薯贮藏蛋白之外的蛋白，特别适用于具有变应原诱导性的任意一种蛋白。

“可选择的标记”是指一种核酸序列，它的表达提供了一种促进含核酸序列细胞的鉴定的表型。可选择的标记包括对有毒化学物质提供抗性(例如，氨苄西林抗性，卡那霉素抗性)，补充营养缺乏(例如，尿嘧啶，组氨酸，亮氨酸)，或给予可见的区别性(例如，色彩改变或发荧光)的那些标记。

“转录”是指从DNA模板产生RNA拷贝的过程。

“转化”是指一种将外源核酸序列(例如，载体，重组核酸分子)引入到细胞或原生质体中的过程，其中该外源核酸被掺入到染色体中，或，能够自主复制。

“转化细胞”是一种DNA被改变的细胞，所述改变是由于外源性核酸分子被引入到该细胞中而产生的。

“转基因细胞”指的是任意一种来源于或再生于转化细胞或来源于转基因细胞的细胞。转基因细胞的实例包括来源于转化植物细胞的植物愈伤组织，和来源于转基因植物的特定细胞如叶，根，茎细胞，即体细胞，或生殖细胞。

“转基因植物”是指来源于转化植物细胞或原生质体的植物或其后代，其中该植物DNA包含一种引入的外源核酸序列，该引入的外源核酸序列不是原始天然存在于相同物种的非转基因植物中的。可供选择地，该植物DNA所包含的引入核酸序列的拷贝数比相同物种的天然非转基因植物要高。

“翻译”指的是从信使RNA产生蛋白。

“载体”是指将外源DNA运载到宿主生物体中的质粒，粘粒，噬菌体，或病毒。

“蛋白质印迹”是指已经被电泳分离，并被转化和固定在固体支持物上，然后用抗体探测的蛋白。

                        发明详述脱敏马铃薯贮藏蛋白的设计

使蛋白脱敏可通过鉴定变应原性的位点，然后修饰该位点，从而减少或消除抗体与该位点的结合来进行。马铃薯贮藏蛋白的IgE结合区以前从未被报导过。IgE表位的作图是通过合成10肽进行的，所述10肽是以马铃薯贮藏蛋白17(马铃薯贮藏蛋白17)的蛋白序列(SEQ IDNO：2)为基础的，有6个氨基酸的重叠。由于蒸煮马铃薯后马铃薯蛋白的变性，人们期望10肽足以模拟用于抗体结合的未折叠的全长蛋白。肽是根据它们结合IgE抗体的能力来鉴定的。改变所鉴定肽的个别氨基酸，从而减少或消除与存在于马铃薯过敏患者血清中的IgE的结合。这些改变被称作的氨基酸取代(RES)。通过编码核酸序列的定点诱变或其它本领域熟知的方法，可将RES随后引入到全长蛋白中。类似的策略已经被用于其它地方，以确定主要花生变应原中的优势IgE表位(Stanley，J.S.等，Arch.Biochem.Biophys.，342(2)：244-253，1997)。

我们还鉴定了对于马铃薯贮藏蛋白的变应原性非常重要的氨基酸残基。用丙氨酸或苯丙氨酸取代某些马铃薯贮藏蛋白肽中的单一氨基酸残基，可显著减少或不再与马铃薯过敏患者的血清结合。

“脱敏马铃薯贮藏蛋白”是指这样一种马铃薯贮藏蛋白，其氨基酸残基与由有效产生结果的取代所定义的氨基酸残基至少有一个是不同的，所述有效产生结果的取代可产生对马铃薯过敏患者血清的反应性降低的马铃薯贮藏蛋白。该脱敏马铃薯贮藏蛋白优选维持杀虫特性，并优选维持它的酶活性。使马铃薯贮藏蛋白脱敏的方法的概述

·用马铃薯过敏患者的血清，通过合成重叠肽的免疫测定给IgE表位作图

·通过丙氨酸扫描和/或合理扫描确定有效产生结果的取代

通过编码核酸序列的定点诱变修饰马铃薯贮藏蛋白的氨基酸序列

·评估修饰蛋白的酶活性(酯酶)和/或杀虫活性；并

·通过IgE免疫测定法评估新蛋白的变应原性

编码马铃薯贮藏蛋白的核酸序列已经被很多研究人员克隆出来了(例如，Mignery等，Nucleic Acids Research，12：7987-8000，1984；Mignery等，Gene，62：27-44，1988；WO94/21805；加拿大专利申请No.2090552)。用定点诱变操作这些核酸序列，从而编码低变应原性的马铃薯贮藏蛋白。这些核酸序列可用于转化细菌，酵母或植物细胞，产生低变应原性的马铃薯贮藏蛋白。脱敏的马铃薯贮藏蛋白

为简单起见，我们用单个字母的代码表示各个氨基酸。单个字母的代码，三个字母的代码，及完整的氨基酸名称之间的相互关系已经在上述定义部分中提出。

本发明的一个实施方案是一种分离的，脱敏的马铃薯贮藏蛋白。该蛋白相对于野生型的蛋白序列是被修饰过的，这样它们就可减少与如来源于对马铃薯过敏的人或动物的抗马铃薯贮藏蛋白抗体的结合。所减少的结合是相对于未修饰的马铃薯贮藏蛋白与抗马铃薯贮藏蛋白抗体的结合而测量的。

脱敏的马铃薯贮藏蛋白可包含在下列一个或多个区中修饰的SEQID NO：2，或在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：7。相对于相应未修饰蛋白的结合，单一或多个氨基酸修饰可减少修饰蛋白的结合。修饰区包括SEQ ID NO：2的104-113位(SEQ ID NO：7的85-94位)，SEQ ID NO：2的128-137位(SEQ ID NO：7的109-118位)，SEQ ID NO：2的184-197位(SEQ ID NO：7的165-178位)，SEQ ID NO：2的264-277位(SEQ ID NO：7的245-258位)，SEQ ID NO：2的316-325位(SEQ IDNO：7的297-306位)，和SEQ ID NO：2的360-377位(SEQ ID NO：7的341-358位)的氨基酸位置。可能的氨基酸修饰包括用A，E，F，P，或S取代氨基酸。该修饰是取代确定区中的一个或多个氨基酸，而不会增加或减少蛋白中氨基酸的总数。

优选地，该脱敏马铃薯贮藏蛋白包含通过一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2，或通过一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7。SEQ ID NO：7与野生型SEQ ID NO：2的区别在于SEQ ID NO：2的前22个氨基酸被取代为EAE(Glu-Ala-Glu)。例如，SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：7的改变可以是：用F或A取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的I；用F或A取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的K；用A取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的S；用F或A取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用S取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ ID NO：7的169位的A；用A或P取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用A或E取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的K；用A取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用A取代SEQ IDNO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的K；用E取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的K；用A取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的N；用A取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的N；用F或A取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ IDNO：7的343位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的367位或SEQI ID NO：7的348位的K；用A取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的R；用A取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的F；用A取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ ID NO：7的352位的K；用A取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的L；用A取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的L。

更优选地，SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ IDNO：7是通过下列改变而被修饰的：用F取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ IDNO：7的110位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

最优选地，SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ IDNO：7是通过下列改变而被修饰的：用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ IDNO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。核酸

本发明的另一实施方案是一种含结构核酸序列的，分离的核酸分子片段，其编码脱敏的马铃薯贮藏蛋白。

所述结构核酸序列通常可编码任意一种脱敏的马铃薯贮藏蛋白。该结构核酸序列优选编码一种脱敏的马铃薯贮藏蛋白，其包含在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：7。相对于相应未修饰蛋白的结合，单一或多个氨基酸的修饰可减少修饰蛋白的结合。修饰区包括SEQ ID NO：2的104-113位(SEQID NO：7的85-94位)，SEQ ID NO：2的128-137位(SEQ ID NO：7的109-118位)，SEQ ID NO：2的184-197位(SEQ ID NO：7的165-178位)，SEQ ID NO：2的264-277位(SEQ ID NO：7的245-258位)，SEQID NO：2的316-325位(SEQ ID NO：7的297-306位)，SEQ ID NO：2的360-377位(SEQ ID NO：7的341-358位)。可能的氨基酸修饰包括用A，E，F，P或S取代氨基酸。该修饰是取代确定区中的一个或多个氨基酸，而不是增加或减少蛋白中氨基酸的总数。

可供选择地，所述结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQID NO：7：用F或A取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的I；用F或A取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的K；用A取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的S；用F或A取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用S取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ ID NO：7的169位的A；用A或P取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用A或E取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的K；用A取代SEQ IDNO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的K；用E取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的K；用A取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ IDNO：7的295位的N；用A取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的N；用F或A取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的K；用A取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的R；用A取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的F；用A取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ ID NO：7的352位的K；用A取代SEQID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的L；用A取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的L。

更优选地，所述结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ IDNO：2或通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ IDNO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

最优选地，所述结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ IDNO：2或通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ IDNO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。重组载体

另一个实施方案涉及含结构核酸序列的重组载体，其编码脱敏的马铃薯贮藏蛋白。所述重组载体包含在5’-3’方向可操作连接的：一种指导结构核酸序列转录的启动子；一种结构核酸序列，和一种3’转录终止子。

所述结构核酸序列可编码在下列一个或多个区中被修饰的SEQ IDNO：2，或在下列一个或多个区中被修饰的SEQ ID NO：7。相对于相应未修饰蛋白的结合，单一或多个氨基酸的修饰可减少修饰蛋白的结合。修饰区包括SEQ ID NO：2的104-113位(SEQ ID NO：7的85-94位)，SEQ ID NO：2的128-137位(SEQ ID NO：7的109-118位)，SEQID NO：2的184-197位(SEQ ID NO：7的165-178位)，SEQ ID NO：2的264-277位(SEQ ID NO：7的245-258位)，SEQ ID NO：2的316-325位(SEQ ID NO：7的297-306位)，SEQ ID NO：2的360-377位(SEQ IDNO：7的341-358位)。可能的氨基酸修饰包括用A，E，F，P或S取代氨基酸。该修饰是取代确定区中的一个或多个氨基酸，而不是增加或减少蛋白中氨基酸的总数。

可供选择地，所述重组载体包含在5’-3’方向可操作连接的：一种指导结构核酸序列转录的启动子；一种编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7的结构核酸序列：用F或A取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的113位或SEQID NO：7的94位的I；用F或A取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ IDNO：7的110位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的K；用A取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的S；用F或A取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用S取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ ID NO：7的169位的A；用A或P取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用A或E取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的K；用A取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的K；用E取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的K；用A取代SEQ IDNO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的N；用A取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的N；用F或A取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的K；用A取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ IDNO：7的349位的R；用A取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的F；用A取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ ID NO：7的352位的K；用A取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的L；用A取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的L。

更优选地，所述载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

最优选地，所述载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。重组宿主细胞

本发明的又一实施方案涉及含结构核酸序列的重组宿主细胞，该结构核酸序列编码脱敏的马铃薯贮藏蛋白。该重组宿主细胞优选产生一种脱敏的马铃薯贮藏蛋白。更优选地，该重组宿主细胞产生一种脱敏的马铃薯贮藏蛋白，其浓度足以抑制摄取重组宿主细胞的昆虫生长或将其杀死。该重组宿主细胞通常可包含任意一种编码脱敏马铃薯贮藏蛋白的结构核酸序列。

所述重组宿主细胞可包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：7。相对于相应未修饰蛋白的结合，单一或多个氨基酸的修饰可减少修饰蛋白的结合。修饰区包括SEQ ID NO：2的104-113位(SEQ ID NO：7的85-94位)，SEQ ID NO：2的128-137位(SEQ ID NO：7的109-118位)，SEQ ID NO：2的184-197位(SEQ ID NO：7的165-178位)，SEQ ID NO：2的264-277位(SEQ ID NO：7的245-258位)，SEQ ID NO：2的316-325位(SEQ ID NO：7的297-306位)，SEQID NO：2的360-377位(SEQ ID NO：7的341-358位)。可能的氨基酸修饰包括用A，E，F，P或S取代氨基酸。该修饰是取代确定区中的一个或多个氨基酸，而不是增加或减少蛋白中氨基酸的总数。

可供选择地，所述重组宿主细胞包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F或A取代SEQID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的I；用F或A取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的K；用A取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的S；用F或A取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用S取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ IDNO：7的169位的A；用A或P取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用A或E取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的K；用A取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的K；用E取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的K；用A取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的N；用A取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的N；用F或A取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的K；用A取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的R；用A取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的F；用A取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ IDNO：7的352位的K；用A取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的L；用A取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的L。

更优选地，所述重组宿主细胞包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

最优选地，所述重组宿主细胞包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

所述重组宿主细胞通常可以是任何一种类型的宿主细胞，优选细菌，真菌，或植物细胞。细菌细胞优选大肠杆菌细胞。真菌细胞优选酿酒酵母，粟酒裂殖糖酵母，或巴斯德毕赤氏酵母的细胞。植物细胞可以是单子叶植物，双子叶植物，或松柏类植物的细胞。植物细胞优选苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦的植物细胞。该重组宿主细胞优选进一步包含与结构核酸序列可操作连接的一种启动子，其可指导结构核酸序列的转录。该重组宿主细胞优选进一步包含与结构核酸序列可操作连接的一种3’转录终止子和一个聚腺苷酸化位点。重组植物

本发明的另一实施方案是一种含结构核酸序列的重组植物，该结构核酸序列编码脱敏的马铃薯贮藏蛋白。所述重组植物优选产生一种脱敏的马铃薯贮藏蛋白。更优选地，该重组植物产生一种脱敏的马铃薯贮藏蛋白，其浓度足以抑制从重组植物中摄取植物组织的昆虫生长或将其杀死。

所述重组植物可包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：7。相对于相应未修饰蛋白的结合，单一或多个氨基酸的修饰可减少修饰蛋白的结合。修饰区包括SEQ ID NO：2的104-113位(SEQ ID NO：7的85-94位)，SEQ ID NO：2的128-137位(SEQ ID NO：7的109-118位)，SEQ ID NO：2的184-197位(SEQ ID NO：7的165-178位)，SEQ ID NO：2的264-277位(SEQ ID NO：7的245-258位)，SEQID NO：2的316-325位(SEQ ID NO：7的297-306位)，SEQ ID NO：2的360-377位(SEQ ID NO：7的341-358位)。可能的氨基酸修饰包括用A，E，F，P或S取代氨基酸。该修饰是取代确定区中的一个或多个氨基酸，而不是增加或减少蛋白中氨基酸的总数。

可供选择地，所述重组植物可包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F或A取代SEQ IDNO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的I；用F或A取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的K；用A取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的S；用F或A取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用S取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ IDNO：7的169位的A；用A或P取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用A或E取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的K；用A取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的K；用E取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的K；用A取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的N；用A取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的N；用F或A取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的K；用A取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的R；用A取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的F；用A取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ IDNO：7的352位的K；用A取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的L；用A取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的L。

更优选地，所述重组植物包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或编过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ IDNO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

最优选地，所述重组植物包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

所述重组植物通常可以是任何一种类型的植物。该植物可以是单子叶植物，双子叶植物，或松柏目植物。所述植物优选苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦。

所述重组植物优选进一步包含与结构核酸序列可操作连接的一种启动子，其指导结构核酸序列的转录。该重组植物优选进一步包含与结构核酸序列可操作连接的一种3’转录终止子和一个聚腺苷酸化位点。制备方法

本发明的实施方案进一步涉及制备用于生产脱敏马铃薯贮藏蛋白的重组宿主细胞和重组植物的方法。

制备用于生产脱敏马铃薯贮藏蛋白的重组宿主细胞的方法包括：选择一种宿主细胞；用重组载体转化该宿主细胞；得到重组宿主细胞。

所述重组载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：7。相对于相应未修饰蛋白的结合，单一或多个氨基酸的修饰可减少修饰蛋白的结合。修饰区包括SEQ ID NO：2的104-113位(SEQ ID NO：7的85-94位)，SEQ ID NO：2的128-137位(SEQ ID NO：7的109-118位)，SEQ ID NO：2的184-197位(SEQ ID NO：7的165-178位)，SEQ ID NO：2的264-277位(SEQ ID NO：7的245-258位)，SEQID NO：2的316-325位(SEQ ID NO：7的297-306位)，SEQ ID NO：2的360-377位(SEQ ID NO：7的341-358位)。可能的氨基酸修饰包括用A，E，F，P或S取代氨基酸。该修饰是取代确定区中的一个或多个氨基酸，而不是增加或减少蛋白中氨基酸的总数。

可供选择地，所述重组载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2，或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F或A取代SEQ IDNO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的I；用F或A取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的K；用A取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的S；用F或A取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用S取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ IDNO：7的169位的A；用A或P取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用A或E取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的K；用A取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的K；用E取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的K；用A取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的N；用A取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的N；用F或A取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的K；用A取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的R；用A取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的F；用A取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ IDNO：7的352位的K；用A取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的L；用A取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的L。

更优选地，所述载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

最优选地，所述载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

该方法通常可用于制备任何一种类型的重组宿主细胞。优选地，该方法可用于制备重组细菌细胞，重组真菌细胞，或重组植物细胞。所述细菌细胞优选大肠杆菌细胞。所述真菌细胞优选酿酒酵母，粟酒裂殖糖酵母，或巴斯德毕赤氏酵母的细胞。所述植物细胞可以是单子叶植物，双子叶植物，或松柏目植物的细胞。该植物细胞优选苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦的细胞。

另一个实施方案涉及制备用于生产脱敏马铃薯贮藏蛋白的重组植物的方法。该方法包括：选择一种宿主植物细胞；用重组载体转化该宿主植物细胞；得到重组宿主细胞；并从重组宿主植物细胞再生重组植物。

所述重组载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：7。相对于相应未修饰蛋白的结合，单一或多个氨基酸的修饰可减少修饰蛋白的结合。修饰区包括SEQ ID NO：2的104-113位(SEQ ID NO：7的85-94位)，SEQ ID NO：2的128-137位(SEQ ID NO：7的109-118位)，SEQ ID NO：2的184-197位(SEQ ID NO：7的165-178位)，SEQ ID NO：2的264-277位(SEQ ID NO：7的245-258位)，SEQID NO：2的316-325位(SEQ ID NO：7的297-306位)，SEQ ID NO：2的360-377位(SEQ ID NO：7的341-358位)。可能的氨基酸修饰包括用A，E，F，P或S取代氨基酸。该修饰是取代确定区中的一个或多个氨基酸，而不是增加或减少蛋白中氨基酸的总数。

可供选择地，所述重组载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2，或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：用F或A取代SEQ IDNO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的I；用F或A取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的K；用A取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的S；用F或A取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用S取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ IDNO：7的169位的A；用A或P取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用A或E取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的K；用A取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的T；用F或A取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的K；用E取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的K；用A取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的N；用A取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的N；用F或A取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y；用A取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的K；用A取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的R；用A取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的F；用A取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ IDNO：7的352位的K；用A取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的L；用A取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的L。

更优选地，所述载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

最优选地，所述载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列改变而被修饰的SEQID NO：7：用F取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的Y；用F取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的Y。

所述重组植物通常可以是任何一种类型的植物。该植物可以是单子叶植物，双子叶植物或松柏目的植物。所述植物优选苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦。

脱敏马铃薯贮藏蛋白可通过从上述任意一种宿主细胞或植物中分离脱敏的马铃薯贮藏蛋白来制备。脱糖基化

此处的实施例为糖基化作用可提供蛋白的变应原性提供了证据。因此，合理取代很可能是目标变应原蛋白内糖基化作用的靶点的氨基酸残基可减少或消除蛋白的变应原性，而不会不利地影响蛋白的酶活性，杀虫活性，抗真菌性或其它功能特性。

糖基化作用通常以N-连接或O-连接的形式发生。N-连接的糖基化作用通常发生于基序Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa是除Pro之外的任意一种氨基酸(Kasturi，L.等，Biochem J.323：415-519，1997；Melquist，J.L.等，Biochemistry37：6833-6837，1998)。O-连接的糖基化作用发生于丝氨酸或苏氨酸的羟基和氨基糖之间。

所选天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸的定点诱变可用于减少或消除马铃薯贮藏蛋白的糖基化作用。对SEQ ID NO：2的Asn-Xaa-Ser/Thr基序进行的检索揭示了其发生于氨基酸的202-204位。编码此区的核酸序列的诱变可能使所编码蛋白的变应原性降低。

为了试验此概念性方法可降低马铃薯贮藏蛋白的变应原性，我们进行了两组试验：a)在大肠杆菌中生产马铃薯贮藏蛋白，其不能使蛋白糖基化；b)生产具有N202Q定点突变的马铃薯贮藏蛋白。

来源于患者HS-07和G15-MON(对马铃薯不过敏)的抗体不与野生型马铃薯贮藏蛋白，在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白，或N202Q变体特异性结合。来源于患者HS-01(对马铃薯过敏)的抗体结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，但不结合在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白或N202Q的变体。来源于患者HS-02(对马铃薯过敏)的抗体强有力地结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，但极微弱地结合在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白，并类似载体对照那样结合N202Q变体。来源于患者HS-03(对马铃薯过敏)的抗体结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，但不结合在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白或N202Q变体。来源于患者HS-05(对马铃薯过敏)的抗体结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，但非常弱地结合在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白和N202Q变体。来源于患者HS-06(对马铃薯过敏)的抗体强有力地结合野生型马铃薯贮藏蛋白，N202Q变体，及在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白。这些结果强有力地表明糖基化作用至少部分负责马铃薯贮藏蛋白的抗原性，且定点诱变可用于减少或消除特异性的抗体结合。SEQ ID NO：2的202位的诱变可用于减少或消除特异性的抗体结合。置换蛋白

下列实例中所述内部断点的位置位于蛋白表面，并贯穿线性序列分布，且其相对于末端或中间均没有任何明显的偏斜。此外，还可选择蛋白表面以下的断点。重排的两个亚单位可通过肽连接体连接。虽然可使用各种大小的连接体，但优选实施方案包括通过三个氨基酸的连接体连接N-端和C-端亚单位。另外，N-端和C-端的亚单位可在缺少连接体序列的情况下连接。此外C-端亚单位的一部分还可缺失，所述连接是按以前所述截短的C-端亚单位与原始的N-端亚单位形成的，反之亦然(Yang和Schachman，Proc.Natl，Acad.Sci.U.S.A.，90：11980-11984，1993；Viguera，等，Mol.Biol.，247：670-681，1995；Protasova等，Prot.Eng.，7：1373-1377，1994)。

本发明新的杀虫蛋白可由下列通式代表：

X¹-(L)_a-X²

其中a是0或1，且如果a是0，那么置换蛋白不包含连接体序列；

X¹是一种多肽序列，其对应于n+1到J的氨基酸；

X²是一种多肽，其对应于1到n的氨基酸；

n是1-J-1的整数；

J是大于n+1的整数；且

L是连接体。

在上述通式中，新杀虫蛋白的组成氨基酸残基从原始的氨基端到原始的羧基端被顺序标为1-J。此蛋白内一对相邻的氨基酸可分别被标为n和n+1，其中n是1-J-1的整数。残基n+1变成新杀虫蛋白的新N-端，残基n变成新杀虫蛋白的新C-端。

例如，一种由120个氨基酸组成的母体蛋白序列可被选作设计置换蛋白(J＝120)的起始点。如果将40位和41位之间选为断点，那么n＝40。如果选择连接体来连接两个亚单位，那么所得置换蛋白具有下列通式：(氨基酸41-120)-L-(氨基酸1-40)。如果未使用连接体，那么所得置换蛋白具有下列通式：(氨基酸41-120)-(氨基酸1-40)。

通过利用结构信息，或利用两种方法的结合，可根据经验选择连接体氨基酸序列的长度。当没有有效的结构信息时，可制造一小部分连接体，其长度为0-50_，其序列与表面暴露基本上一致(Hopp和Woods，Mol，Immunol.，20：483-489，1983；Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132，1982；Lee和Richards，J.Mol.Biol.，55：379-400，1971)，且其具有接受不会对蛋白的整个构型造成显著的影响的构象的能力(Karplus和Schulz，Naturwissenchaften，72：212-213，1985)。假设每个残基的平均长度为2.0-3.8_，那么这意味着所测试的长度约为0-30个残基，优选0-约15个残基。因此，有许多这种序列，它们的长度或组成不同，主要考虑可充当连接体使用，它们的长度不能过长，也不能过短(Sandhu等，Critical Rev.Biotech.12：437-467，1992)。如果连接体太长，熵效果可使三维折叠去稳定，并可影响蛋白的折叠。如果连接体太短，那么由于扭应变或立体应变，可使分子去稳定。

链端之间的距离，如C-α碳之间的距离所定义的那样，可用于定义所用序列的长度，或至少用于限制在连接体经验选择中试验的可能数。使用所计算的长度作为指导，可选择具有一定范围残基数的连接体(使用2-3.8_/残基计算)。这些连接体可由原始序列组成，根据需要可缩短或加长，如前所述，当需加长时，添加的残基应是可弯曲的和亲水的；或可选择地，可使用一系列连接体取代原始序列，其中一个实例是Gly-Pro-Gly(SEQ ID NO：277)；或可选择地，使用原始序列及具有适宜总长的新序列的组合。一种可供选择的，短的可弯曲的连接体序列是Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：276)。置换蛋白断点的选择

能够折叠成生物活性分子的新马铃薯贮藏蛋白类似物的序列是通过原始多肽链内起始(氨基端)和终止(羧基端)位置的适当选择而制备的，选择性地还可使用如前所述的连接体序列。根据下述指导原则，氨基和羧基端可从一段共同的序列，也称为断点区内选择。因而，新的氨基酸序列是通过从相同的断点区内选择氨基和羧基端而产生的。在许多情况下，新末端的选择使羧基端的原始位置在氨基端原始位置前面。然而，无论在区内何处进行末端选择，均可产生一种功能性的蛋白，而实际上，这些会有效地导致新序列氨基或羧基部分的缺失或添加。

蛋白的一级氨基酸序列可折叠成对其生物功能表达有益的三维结构。使用单个蛋白结晶的X-射线衍射或蛋白溶液的核磁共振光谱可得到并解释三维结构的信息。与断点区的确定有关的结构信息实例包括：蛋白二级结构的类型和位置(α和3-10螺旋，平行和反平行的β折叠，链反转和转角，及环状结构(Kabsch和Sander，Biopolymers，22：2577-2637，1983)，氨基酸残基的溶剂暴露程度，残基彼此相互作用的类型和程度(Chothia，C.，Ann.Rev.Biochem.，53：537-572，1984)，构象沿着多肽链的静态和动态分布(Alber和Mathews，MethodsEnzymol.，154：511-533，1987)。在某些情况中，有关残基溶剂暴露的其它信息是已知的，其中一个实例是碳水化合物的翻译后附着位点，其必需位于蛋白的表面。当没有有效的试验性结构信息时，或当不可能获得信息时，可分析一级氨基酸的序列，以预测蛋白的二级和三级结构，溶剂的可及性和转角及环状结构的出现(Fasman，G.，Ed.Plenum，New York，1989；Robson，B.和Garnier，J.Nature361：506，1993)。

当直接结构方法不可行时，可使用生物化学方法，根据经验确定表面暴露；例如，确定限制性蛋白水解后链的切割点，从而推断表面暴露(Gentile，F.和Salvatore，G.，Eur.J.Biochem.，218：603-621，1993)。因而，或者使用试验得来的结构信息，或者使用预测方法(Srinivasan，R.和Rose，G.D.Proteins，22：81-99，1995)，对母体氨基酸序列进行分析，从而根据它们对于二级和三级结构的保持是否完整而将各区分类。已知包括在循环性二级结构中的区域中的序列(α，3-10螺旋，平行和反平行的β折叠)是应该避开的区。类似地，观察到或预测具有低度溶剂暴露的氨基酸序列区更有可能形成所谓蛋白疏水核心的一部分，并也应该避免氨基和羧基端的选择。已知或预测位于表面转角或环状结构中的区域，特别是那些已知生物活性所不需要的区域，是新氨基和羧基端的优选位点。根据上述标准优选的一些氨基酸序列段可作为断点区。

本发明的一个实施方案涉及马铃薯贮藏蛋白置换蛋白。所述置换蛋白优选维持酯酶活性及杀虫性能。相对于对马铃薯过敏的个体或动物而言，所述置换蛋白优选比野生型马铃薯贮藏蛋白的变应原性要小。

所述置换蛋白选择性地可包含一种连接体序列。该连接体通常可以是任何一种氨基酸序列，优选Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ IDNO：276)或Gly-Pro-Gly(SEQ ID NO：277)，更优选Gly-Pro-Gly(SEQID NO：277)。特殊的置换蛋白包括：(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)，(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的 氨基酸24-268)，SEQ IDNO：247，和SEQ ID NO：259。

本发明的实施方案还包括分离的核酸分子片段，其包含一种编码马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白的结构核酸序列。所述被编码的置换蛋白通常可以是任意一种置换蛋白，且优选包含(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)，(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-268)，SEQ ID NO：247，和SEQ ID NO：259。所述连接体通常可以是任何一种氨基酸序列，优选Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：276)或Gly-Pro-Gly(SEQ ID NO：277)，更优选Gly-Pro-Gly(SEQ IDNO：277)。可供选择地，该被编码马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白可缺少连接体序列。所述结构核酸序列优选为SEQ ID NO：246或SEQ ID NO：258。

本发明的其中一个实施方案涉及编码马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白的重组载体。该载体包括在5’-3’方向可操作连接的：一种指导结构核酸序列转录的启动子；一种编码蛋白的结构核酸序列，该蛋白选自：(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)；和(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQID NO：2的氨基酸24-268)；和一种3’转录终止子。该连接体可包括Gly-Pro-Gly(SEQ ID NO：277)或Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：276)。可供选择地，该被编码马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白可缺少连接体序列。所述结构核酸序列优选为SEQ ID NO：246或SEQ ID NO：258，且优选编码SEQ ID NO：247或SEQ ID NO：259。

本发明的另一个实施方案涉及用于生产马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白的重组宿主细胞。所述重组宿主细胞优选产生一种马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白。更优选地，该重组宿主细胞产生一种马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白，其浓度足以抑制摄取重组宿主细胞的昆虫生长或将其杀死。所述重组宿主细胞可包含一种编码蛋白的结构核酸序列，该蛋白选自：(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)；和(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-268)。所述连接体通常可以是任何一种氨基酸序列，优选Gly-Pro-Gly(SEQ ID NO：277)或Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：276)。可供选择地，所述被编码的马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白可缺少连接序列。所述结构核酸序列优选SEQID NO：246或SEQ ID NO：258，且优选编码SEQ ID NO：247或SEQ IDNO：259。所述结构核酸序列与指导结构核酸序列转录的启动子序列，与3’转录终止子，及3’聚腺苷酸化信号序列可操作连接。所述重组宿主细胞通常可以是任何一种类型的宿主细胞，优选细菌，真菌，或植物宿主细胞。细菌细胞优选大肠杆菌细胞。真菌细胞优选酿酒酵母，粟酒裂殖糖酵母，或巴斯德毕赤氏酵母的细胞。植物细胞可以是单子叶植物，双子叶植物或松柏目植物的细胞。所述植物细胞优选苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦的细胞。

本发明的另一个实施方案涉及用于生产马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白的重组植物。所述重组植物优选产生一种马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白。更优选地，该重组植物产生一种马铃薯贮藏蛋白的置换蛋白，其浓度足以抑制摄取重组植物组织的昆虫生长或将其杀死。所述重组植物可包含一种编码蛋白的结构核酸序列，该蛋白选自：(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)；和(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-268)。所述连接体可包括Gly-Pro-Gly(SEQ ID NO：277)或Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：276)。可供选择地，该编码的蛋白可缺少连接体序列。所述结构核酸序列优选SEQ IDNO：246或SEQ ID NO：258，且优选编码SEQ ID NO：247或SEQ IDNO：259。所述结构核酸序列与指导结构核酸序列转录的启动子序列，与3’转录终止子，及3’聚腺苷酸化信号序列可操作连接。所述重组植物通常可以是任何一种类型的植物，优选苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦。

置换蛋白可通过从上述任意一种宿主细胞或植物中分离置换蛋白来制备。马铃薯过敏反应的免疫疗法

由于缺少适当的治疗试剂，食物过敏的免疫疗法多数都没有成功(Sampson，H.A.，J.Allergy Clin.Immunol.，90(2)：151-152，1992)。免疫疗法典型地包括给予(口服或皮下注射)剂量不断增加的攻击性变应原实体的粗蛋白提取物，其中所述的攻击性变应原实体通常包括多种不同蛋白的各种混合物(Scheiner，O.，Wien KlinWochenschr.，105(22)：653-658，1993)。虽然有一些关于免疫疗法在食物变应原的临床应用中非常成功的报道(Romano，P.C.等，Allergol.Immunopathol.(Madr)，12(4)：275-281，1984)，但那些报道很少，且大多数临床报告通常更倾向于建议患者尽量避免食用可能会导致过敏的食物，而不是治疗(Gay，G.，Allerg.Immunol.(Paris)，29(6)：169-170，1997)。为了诱导大多数人对变应原的耐受性并减少食物过敏而进行的许多临床试验失败的首要原因是患者不能耐受获得耐受性所需的变应原量。用于检验抗原剂量与耐受性诱导之间关系的动物研究已经证实了它们之间一种非常确定的正相关(Chen，Y.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.93：388-391，1996；Tokai，T.等，Nat.Biotechnol.，15(8)：754-758，1997)。由于用天然变应原诱导患者过敏反应的非常真实的可能性，绝大多数临床治疗学家对于使用高剂量进行治疗都是非常犹豫的，并因此损害了成功治疗的可能性。

在最近的报告中，重组技术已经用于减少主要变应原的变应原潜在性，其中没有修饰T细胞的表位，且在治疗中可使用更高剂量的蛋白(Tokai，T.等，Nat.Biotechnol.，15(8)：754-758，1997)。此外，由于对适当的给药途径缺乏了解，对诱导过敏反应的机理不确定，及对免疫疗法抑制或阻断T-细胞-IgE嗜酸性细胞/肥大细胞循环机理的不确定，导致了大量模棱两可的研究和临床试验。近来，涉及机理，给药途径，佐剂和疫苗制剂的动物模型研究已经增加了免疫治疗过敏反应，包括食物过敏的可能性，当使用适当的治疗试剂时，其可变成一种能够再现的成功的临床治疗方法(Sampson，H.A.和Burks，A.W.，Annu.Rev.Nutr.，16：161-177，1996；Kaminogawa S.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，60(11)：1749-1756，1996；Chapman，M.D.，等，Allergy，52：374-379，1997；Barbeau，W.E.，Adv.Exp.Med.Biol.，415：183-193，1997；Cao，Y.等Immunology，90(1)：46-51，1997；Garside，P.和Mowat，A.M.，Crit.Rev.Immunol.，17(2)：119-137，1997；Rothe，M.J.和Grant-Kels，J.M.，J.Am.Acad.Dermatol.，35(1)：1-13，1996；Strobel，S.，Allergy，50(20)：18-25，1995；Kruisbeek，A.M.和Amsen，D.，Curr.Opin.Immunol.，8(2)：233-244，1996；Herz，U.，等，Adv.Exp.Med.Biol.，409：25-32，1996；Litwin，A.，等，J.Allergy Clin.Immunol.，100：30-38，1997；Vandewalker，M.L.，Mo.Med.，94(7)：311，1997；Marshall，G.D.，Jr.和Davis，F.，Nat.Biotechnol.，15(8)：718-719，1997；Van Deusen，M.A.，等，Ann.Allergy Asthma Immunol.，78：573-580，1997；Jacobsen，L.等，Allergy，52：914-920，1997，Scheiner，O.和Kraft，D.，Allergy50(5)：384-391，1995)。

相对于免疫疗法，本专利中描述的修饰的马铃薯贮藏蛋白基因的重要方面在于它们可用于合成纯的脱敏蛋白，其可用于马铃薯贮藏蛋白(马铃薯)的特异性免疫疗法，且可减少对马铃薯贮藏蛋白或马铃薯过敏的人和动物中不利的可能致命的过敏反应。各种策略，包括固定或交联变应原，将变应原封装入胶囊用于口服给药，使用小的，T-细胞表位肽，及最近使用基因改造的重组蛋白，或修饰的基因疫苗等，均被测试了其降低过敏反应潜在性，同时诱导耐受性的能力(Cao，Y.，等，Immunology，90(1)：46-51，1997；Chapman，M.D.，等，Allergy，52：374-379，1997；Chapman，M.D.，等，Int.Arch.AllergyImmunol.，113(1-3)：102-104，1997；Collins，S.P.，等Clin.Exp.Allergy，26(1)：36-42，1996；Takai，T.等，Mol.Immunol.，34(3)：255-261，1997；Takai，T.，等，Nat.Biotechnol.，15(8)754-758，1997；Jirapongsananruk，O.和Leung，D.Y.M.，Ann.Allergy Asthma Immunol.，79：5-20，1997；Litwin，A.，等，J.Allergy Clin.Immunol.，100：30-38，1997；Vandewalker，M.L.，Mo.Med.，94(7)：311，1997；Raz，E.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S A.，93：5141-5145，1996；Hoyne，G.F.，等，Clin.Immunol.Immunopa thol.，80：S23-30，1996；Hoyne，G.F.，等，Int.Immunol.，9(8)：1165-1173，1997；Vrtala，S.，等，J Clin.Invest.，99(7)：1673-1681，1997；Sato，Y.，等，Science，273：352-354，1996；Lee，D.J.，等，Int.Arch.Allergy Immunol.，113(1-3)：227-230，1997；Tsitoura，D.C.，等，J Immunol.，157(5)：2160-2165，1996；Hsu，C.H.，等，Int.Immunol.，8(9)：1405-1411，1996；Hsu，C.H.，等，Nat.Med.，2(5)：540-544，1996)。

本发明使用一种人工改造的马铃薯贮藏蛋白，其在任意一种活细胞中表达，有或没有合成后修饰，用于皮肤或皮下暴露，注射，或口服，胃肠道，呼吸道或鼻给药的免疫疗法，其中可使用或不使用特殊的载体，赋形剂和佐剂。作为体内(患者中)RNA-，DNA-或基因疫苗的表达模板(基因)，直接给予编码重组马铃薯贮藏蛋白的核酸是此处定义的人工改造遗传物质的预期用途，除了具有修饰的IgE结合位点，其还编码马铃薯贮藏蛋白。本专利的目的还包括此处描述的这些修饰基因的用途，包括插入到具有各种启动子和调节序列的各种DNA载体，如腺病毒，逆转录病毒，痘病毒中，复制或不复制的真核表达质粒(Lee，D.J.等，Int.Arch.Allergy Immunol.，113(1-3)：227-230，1997)，其可被插入到患者的体细胞(树突状细胞，上皮细胞，肌纤维细胞，成纤维细胞等)中，用于表达重组基因产物，改变患者对马铃薯贮藏蛋白的免疫应答(Lee D.J.等，Int.Arch.AllergyImmunol.，113(1-3)：227-230，1997)。本申请预期的有效给药途径包括前述封装入胶囊，乳化，受体或膜融合介导的摄取和将DNA或相应RNA直接渗透或插入到宿主细胞中的方法。

下列实施例可证实本发明的优选实施方案。本领域的那些技术人员应当能够领会在实施例中公开的技术遵循发明人发现的代表性技术，从而很好的实施本发明，这些实施例可被看成是实施它的组成性优选方式。然而，根据本发明公开的内容，本领域的那些技术人员应当理解，在已公开的特殊实施方案中可进行多种改变，在不背离本发明的精神和范围的情况下，仍然可获得同样或相似的结果。

                         实施例实施例1：作为变应原的马铃薯贮藏蛋白的鉴定

因为通常马铃薯贮藏蛋白是从变应原性的来源(马铃薯)中获得的，因此假设编码一类重要的攻击性马铃薯变应原的马铃薯贮藏蛋白是变应原性的，这是由Seppala，U等，J.AllergyClin.Immunol.103：165-171，1999)报道的。对潜在的变应原进行评估优选包括在体外，用马铃薯过敏血清适当的IgE结合测试(Fuchs，R.L.和Astwood，J.D.，Food Technology，50：83-88，1996；Astwood，J.D.，等，Monographs in allergy Vol.32：Highlights in foodallergy，pp.105-120，1996，Metcalfe，D.D.等，Critical Reviews inFoodScience and Nutrition，36S：165-186，1996)。由IFBC和ILSI过敏和免疫学协会组织的工作组建议，应当使用最少5个患者的血清，检测由来源于变应原性来源，如马铃薯(一种不太常见变应原性来源)的核酸序列编码的蛋白，与马铃薯过敏患者的IgE反应的能力(Metcalfe，D.D.等，Critical Reviews in Food Science andNutrition，36S：165-186，1996)。如下所述，使用标准的体外试验方法，用采集自患者的血清测试马铃薯贮藏蛋白-17的IgE结合，其中所述患者在临床上被确定具有过敏反应。马铃薯过敏的受试者(血清供体)的临床特征描述

马铃薯过敏的患者是在Johns Hopkins诊所(Baltimore，MD)鉴定的，并使用表2所列的临床标准对马铃薯过敏反应进行了评估。

血清是从具有确切的马铃薯过敏临床史的患者得到的。所述确切的临床史具备下列一个或多个条件：a)通过双盲的，安慰剂对照的食物试验评估的阳性马铃薯过敏b)由于食用马铃薯而过敏和/或住院或c)引人注目的皮肤试验结果。

                                   表2：临床患者的数据

患者	临床史	潮红/划痕(皮肤刺痛试验)	DBPCFC(马铃薯)
				HS01	最近一次住院：10/19/93AD，A，AR，FH.MFS，IgE＝1397KIAUa/L	7/19，4/14，7/17	未进行
HS02	最近一次住院：6/94AD，FH，Latex(+)RAST，MFS，IgE＝7544K/L	20/26	未进行
				HS03	最近一次住院：7/27/95AD，A，FH，MFS，IgE＝N/A	5/13	是
HS05	最近一次住院：5/30/95AD，A，FH，MFS，IgE＝12341ng/ml	4/9	是
				HS06	最近一次住院：6/13/95AD，A FH，MFS，IgE＝N/A	5/20，4/13，5/12	是
HS07	对马铃薯不过敏，对蛋，奶，花生，海鲜过敏，AD，A，AR，FH，MFS	高IgE对照血清，对马铃薯不过敏
				HS08	非-特应性的(正常)	低IgE对照血清

AD＝特应性皮炎；FH＝食物过敏；AR＝过敏性鼻炎；A＝气喘；MFS＝多种食物过敏；N/A＝未得到数据实施例2：马铃薯贮藏蛋白的蛋白质印迹法

蛋白质印迹试验是使用从基因工程改造过的，产生马铃薯贮藏蛋白的玉米、产生马铃薯贮藏蛋白的粗的基因工程改造过的玉米叶提取物，粗的马铃薯块茎提取物，和非转基因的玉米叶样品中得到的纯化到接近均质的马铃薯贮藏蛋白进行的。

使用SDS-PAGE(Laemmli，U.K.，Nature 227：680-685，1970)对蛋白样品进行电泳，并将其电印迹到硝酸纤维素膜上。蛋白印迹是使用标准的蛋白质印迹(免疫印迹)技术进行的，并在用PBS 1∶5稀释的马铃薯过敏血清中培养1小时。用PBS洗该印迹3次后，在生物素酰化的抗IgE中(Johns Hopkins Hospital，Baltimore，MD)温育1小时，在HRP-偶联的抗生物素蛋白中温育30分钟(Promega，NewYork，NY)。IgE-反应蛋白带是通过DAB(3，3-二氨基联苯胺)染色法观察到的。干燥所述印迹，并将其拍照。根据所用的患者血清标记各印迹。作为对照，其中一个印迹仅在抗IgE中温育。

通过检测纯马铃薯贮藏蛋白与来源于马铃薯过敏患者的血清的反应性可知，马铃薯贮藏蛋白是马铃薯的变应原。用蛋白质印迹技术测试5个马铃薯过敏受试者的血清。纯的马铃薯贮藏蛋白与全部5份血清反应。

用蛋白质印迹法试验马铃薯贮藏蛋白同工酶(SEQ ID NOS：278-282，图1)的IgE结合。将马铃薯贮藏蛋白同工酶克隆到一种酵母表达系统中，并在分析前进行纯化。除收集全部5个患者的血清外，如上所述，对同工酶进行IgE蛋白印迹。所得酵母表达的同工酶的蛋白质印迹表明，全部5个同工酶均以与马铃薯贮藏蛋白17类似的方式结合IgE，且所试验的马铃薯贮藏蛋白的全部同工酶均是变应原。实施例3：马铃薯贮藏蛋白的蛋白质印迹法

使用Genosys SPOTs系统合成89个10肽，各连续的10肽与基于马铃薯贮藏蛋白17(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列有6个氨基酸的重叠。使用与上述相同的温育过程，评估该肽与5个不同马铃薯过敏患者血清的IgE结合。结果在图2中表示，其中显示了主要的和次要的变应原性表位。有趣的是，很多免疫原性的表位均包含酪氨酸。肽的序号，序列，和免疫反应性在表3中详述。

                                   表3：马铃薯贮藏蛋白17的肽扫描

肽序号#(SEQ IDNO)		HS01	HS02	HS03	HS05	HS06	累计总数
								1(16)	QLGEMVTVLS	0.47	0.33	0.02	0.05	0.06	0.93
2(17)	MVTVLSIDGG	0.53	0.33	0.02	0.07	0.05	1
								3(18)	LSIDGGGIRG	0.52	0.38	0.07	0.08	0.09	1.14
4(19)	GGGIRGIIPA	0.53	0.19	0.06	0.19	0.23	1.2
								5(20)	RGIIPATILE	0.46	0.28	0.04	0.09	0.05	0.92
6(21)	PATILEFLEG	0.49	0.31	0.05	0.09	0.07	1.01
								7(22)	LEFLEGQLQE	0.36	0.24	0.04	0.1	0.06	0.8
8(23)	EGQLQEMDNN	0.29	0.19	0.02	0.09	0.05	0.64
								9(24)	QEMDNNADAR	0.22	0.13	0.01	0.05	0.04	0.45
10(25)	NNADARLADY	0.21	0.17	0.03	0.05	0.07	0.53
								11(26)	ARLADYFDVI	0.54	0.31	0.16	0.15	0.25	1.41
12(27)	DYFDVIGGTS	0.61	0.34	0.46	0.06	0.15	1.62
								13(28)	VIGGTSTGGL	0.63	0.72	0.05	0.15	0.09	1.64
14(29)	TSTGGLLTAM	0.3	0.17	0.03	0.06	0.09	0.65
								15(30)	GLLTAMISTP	0.63	0.41	0.05	0.24	0.12	1.45
16(31)	AMISTPNENN	0.34	0.18	0.02	0.07	0.02	0.63
								17(32)	TPNENNRPFA	0.46	0.22	0.03	0.19	0.07	0.97
18(33)	NNRPFAAAKE	0.37	0.21	0.05	0.07	0.06	0.76
								19(34)	FAAAKEIVPF	0.52	0.29	0.08	0.11	0.08	1.08
20(35)	KEIVPFYFEH	0.29	0.14	0.28	0.29	0.23	1.23
								21(36)	PFYFEHGPQI	0.65	0.06	1.08	0.51	0.17	2.47
22(37)	EHGPQIFNPS	0.34	0.15	0.03	0.05	0.06	0.63
								23(38)	QIFNPSGQIL	0.33	0.29	0.02	0.07	0.07	0.78
24(39)	PSGQILGPKY	0	0	0.02	0	0.05	0.07
								25(40)	ILGPKYDGKY	0	0	0.07	0	0.02	0.09

26(41)	KYDGKYLMQV	0.02	0	0.11	0.01	0.04	0.18
								27(42)	KYLMQVLQEK	0.12	0.04	1.08	0.07	0.79	2.1
28(43)	QVLQEKLGET	0.46	0.16	0.01	0.07	0.02	0.72
								29(44)	EKLGETRVHQ	0.5	0.12	0.01	0.07	0.04	0.74
30(45)	ETRVHQALTE	0.42	0.16	0.03	0.05	0.03	0.69
								31(46)	HQALTEVVIS	0.43	0.21	0.04	0.1	0.05	0.83
32(47)	TEVVISSFDI	0.44	0.25	0.05	0.08	0.04	0.86
								33(48)	ISSFDIKTNK	0.1	0.02	0.04	0.06	0.13	0.35
34(49)	DIKTNKPVIF	0.57	0.22	0.04	0.18	0.28	1.29
								35(50)	NKPVIFIKSN	0	0.01	0.02	0.07	0.24	0.34
36(51)	IFTKSNLANS	0	0	0.03	0.06	0.17	0.26
								37(52)	SNLANSPELD	0.43	0.96	0.01	0.09	0.02	1.51
38(53)	NSPELDAKMY	0.18	0.12	0.01	0.05	0.05	0.41
								39(54)	LDAKMYDISY	0.54	0.26	0.19	0.15	0.23	1.37
40(55)	MYDISYSTAA	0.92	0.08	0.52	0.04	0.22	1.78
								41(56)	SYSTAAAPTY	1.15	0.25	1.04	0.33	0.55	3.32
42(57)	AAAPTYFPPH	1.02	0.52	1.12	0.81	0.86	4.33
								43(58)	TYFPPHYFVT	0.02	0.01	0.54	0.03	0.24	0.84
44(59)	PHYFVTNTSN	0.03	0.01	1.17	0.13	0.44	1.78
								45(60)	VTNTSNGDEY	0.23	0.15	0.04	0.03	0.03	0.48
46(61)	SNGDEYEFNL	0.33	0.25	0.08	0.1	0.11	0.87
								47(62)	EYEFNLVDGA	0.34	0.25	0.07	0.1	0.2	0.96
48(63)	NLVDGAVATV	0.3	0.18	0.02	0.06	0.05	0.61
								49(64)	GAVATVADPA	0.45	0.54	0.01	0.07	0.02	1.09
50(65)	TVADPALLSI	0.48	0.29	0.01	0.07	0.03	0.88
								51(66)	PALLSISVAT	0.65	0.33	0.02	0.1	0.01	1.11
52(67)	SISVATRLAQ	0.61	0.23	0.14	0.53	0.53	2.04
								53(68)	ATRLAQKDPA	0.87	0.34	0.05	0.29	0.22	1.77
54(69)	AQKDPAFASI	0.86	0.32	0.04	0.12	0.03	1.37
								55(70)	PAFASIRSLN	0.81	0.15	0.05	0.51	0.59	2.11
56(71)	SIRSLNYKKM	0.07	0.01	0.17	0.07	0.11	0.43
								57(72)	LNYKKMLLLS	0.05	0.01	0.35	0.08	0.39	0.88
58(73)	KMLLLSLGTG	1.15	0.15	0.04	0.38	0.71	2.43
								59(74)	LSLGTGTTSE	0.34	0.23	0.02	0.04	0.03	0.66
60(75)	TGTTSEFDKT	0.92	0.39	0.6	0.1	0.09	2.1
								61(76)	SEFDKTYTAK	1.33	1.35	1.41	0.12	0.28	4.49
62(77)	KTYTAKEAAT	1.36	0.94	1.11	0.76	0.4	4.57
								63(78)	AKEAATWTAV	0.45	0.15	0.01	0.2	0.04	0.85
64(79)	ATWTAVHWML	0.1	0.02	0.01	0.08	0.06	0.27
								65(80)	AVHWMLVIQK	0.69	0.05	0.03	0.43	0.62	1.82
66(81)	MLVIQKMTDA	0.32	0.15	0.02	0.15	0.03	0.67
								67(82)	QKMTDYYLST	0.26	0.125	0.03	0.21	0.05	0.675
68(83)	DAASSYMTDY	0.2	0.14	0.08	0.08	0.1	0.6
								69(84)	SYMTDYYLST	0.5	0.03	0.32	0.06	0.11	1.02
70(85)	DYYLSTAFQA	0.14	0	0.22	0.03	0.13	0.52
								71(86)	STAFQALDSK	0.4	0.3	0.04	0.06	0.08	0.88
72(87)	QALDSKNNYL	0.44	0.46	0.28	0.26	0.43	1.87
								73(88)	SKNNYLRVQE	0.44	0.05	1.31	0.07	0.21	2.08
74(89)	YLRVQENALT	1.38	0.03	1.31	0.11	0.2	3.03
								75(99)	QENALTGTTT	0.47	0.25	0	0.06	0	0.78
76(91)	LTGTTTEMDD	0.41	0.24	0	0.06	0	0.71

77(92)	TTEMDDASEA	0.38	0.3	0	0.05	0	0.73
								78(93)	DDASEANMEL	0.44	0.24	0	0.06	0	0.74
79(94)	EANMELLVQV	0.42	0.27	0	0.04	0	0.73
								80(95)	ELLVQVGENL	0.4	0.25	0	0.05	0	0.7
81(96)	QVGENLLKKP	0.44	0.14	0	0.07	0	0.65
								82(97)	NLLKKPVSED	0.47	0.2	0	0.03	0	0.7
83(98)	KPVSEDNPET	0.27	0.21	0	0.03	0	0.51
								84(99)	EDNPETYEEA	0.13	0.11	0	0.01	0	0.25
85(100)	ETYEEALKRF	1.26	1.2	136	0.53	0.71	5.06
								86(101)	EALKRFAKLL	1.38	0.04	0	1.06	1.12	3.6
87(102)	RFAKLLSDRK	0.98	0.05	0	0.84	0.94	2.81
								88(103)	LLSDRKKLRA	0.2	0.01	0	0.37	0.51	1.09
89(104)	RKKLRANKAS	0.28	0	0	0.31	0.64	1.23
	患者累计总数	41.84	20.565	18.1	14.17	16.55

实施例4：有效产生结果的取代的鉴定

对于马铃薯贮藏蛋白各主要和次要的变应原性表位来说，有效产生结果的取代是通过合成肽而确定的，而所述肽通过取代位于表位中各非丙氨酸位置的丙氨酸残基而被改变。类似地，通过在与马铃薯马铃薯贮藏蛋白相应的位置产生肽来评估编码玉米马铃薯贮藏蛋白(美国专利5,882,668；克隆5cq)的核酸序列的IgE结合。

例如，可通过丙氨酸扫描和合理的取代分析表位41。表位41                 SEFDKTYTAK(SEQ ID NO：76)丙氨酸扫描             AEFDKTYTAK(SEQ ID NO：165)

                   SAFDKTYTAK(SEO ID NO：166)

                   SEADKTYTAK(SEQ ID NO：167)

                   SEFAKTYTAK(SEQ ID NO：168)

                   SEFDATYTAK(SEQ ID NO：169)

                   SEFDKAYTAK(SEQ ID NO：17O)

                   SEFDKTATAK(SEQ ID NO：171)

                   SEFDKTYAAK(SEQ ID NO：172)

                   SEFDKTYTAA(SEQ ID NO：173)合理取代               AFFDKTYTAK(SEQ ID NO：283)

                   SEFDKTFTAK(SEQ ID NO：176)玉米同系物             CIFDSTYTAK(SEQ ID NO：284)

所选表位是通过丙氨酸扫描及合理的取代分析的。如上所述，用马铃薯过敏患者的血清进行免疫测定。表4概括了鉴定马铃薯贮藏蛋白有效产生结果的取代的这些试验结果。表中的空格表示未检测到肽与患者IgE的结合。

                 表4：有效产生结果的取代的马铃薯贮藏蛋白扫描

		通过OD测量的修饰肽与患者IgE的结合
						序列	SEQ ID NO	HS03	HS06	HS01	HS02
DYFDVIGGTS	105		0.12	0.16	0.36
						DYFDVIAGTS	106		0.14	0.17	0.4
VIGGTSTGGL	107				0.04
						VIAGTSTGAL	108
AFYFEHGPQI	109		0.96	0.5	0.78
						PAYFEHGPQI	110		0.75	0.41	0.69
PFAFEHGPQI	111
						PFYAEHGPQI	112		0.7	0.43	0.79
PFYFAHGPQI	113	0.93	1.07	0.59	1.44
						PFYFEAGPQI	114	0.08	0.93	0.65	1.34
PFYFEHAPQI	115		0.75	0.54	1.11
						PFYFEHGAQI	116		0.63	0.29	0.6
PFYFEHGPAI	117		0.63	0.25	0.56
						PFYFEHGPQA	118		0.27	0.16	0.33
TFYLENGPKI	119	0.05	0.48	0.68	1.07
						PFFFEHGPQI	120
AYLMQVLQEK	121		0.26	0.11	0.53
						KALMQVLQEK	122
KYAMQVLQEK	123	0.11	0.43	0.1	1.25
						KYLAQVLQEK	124	0.22	0.48	0.11	1.34
KYLMAVLQEK	125	0.22	0.83	0.16	1.33
						KYLMQALQEK	126	0.11	0.6	0.15	0.95
KYLMQVAQEK	127		0.53	0.15	0.81
						KYLMQVLAEK	128	0.06	0.69	0.11	1.34
KYLMQVLQAK	129	0.74	0.79	0.05	0.58
						KYLMQVLQEA	130		0.28	0.27	0.37
VFLHDKIKSL	131	0.06	0.26		0.41
						AYSTAAAPTY	132		0.1	0.12	0.12
SASTAAAPTY	133
						SYATAAAPTY	134		0.16	0.13	0.37
SYSAAAAPTY	135		0.13	0.12	0.32

SYSTAAAATY	136		0.15	0.13	0.34
						SYSTAAAPAY	137		0.15	0.14	0.29
SYSTAAAPTA	138		0.55	0.54	1.13
						CISTSAAPTY	139	0.4
SYSTAAAPAF	140	0.39	1.02	0.65	1.42
						AFAAAAAPTY	141				0.07
SYSTAAAPTF	142	0.15	0.97	0.48	1.09
						STSAAPTYFP	143		0.21	0.23	0.39
STSAAPTFFP	144				0.23
						STSAAPTAFP	145				0.08
STAAAPTFTP	146			0.12	0.28
						AAAATYFPPH	147		0.13	0.1	0.05
AAAPAYFPPH	148			0.07	0.04
						AAAPTAFPPH	149
AAAPTYAPPH	150		0.23	0.14	0.21
						AAAPTYFAPH	151		0.45	0.18	0.44
AAAPTYFPAH	152		0.15	0.07	0.18
						AAAPTYFPPA	153		0.1	0.06	0.31
SAAPTYFPAH	154		0.77	0.73	0.96
						AAAPAFFPPH	155
AAAPPFFPPH	156
						AAAPTFFPPH	157
SISVATRLAQ	158			0.26	0.26
						AMSMLTKEVH	159
PAFASIRSLN	160
						PNFNAGSPTE	161
KMLLLSLGTG	162
						NYLIISVGIG	163	0.49	1.08	0.64	1.48
KMLLLSLGAG	164		0.13
						AEFDKTYTAK	165	0.09	0.22		1.34
SAFDKTYTAK	166	0.66	0.71	0.06	1.42
						SEADKTYTAK	167				0.99
SEFAKTYTAK	168	0.5	0.57		0.91
						SEFDATYTAK	169				0.17
SEFDKAYTAK	170	0.1	0.24		1.38
						SEFDKTATAK	171				0.81
SEFDKTYAAK	172	0.2	0.35		1.39
						SEFDKTYTAA	173			0.1	1.18
KQAEKYTAEQ	174			0.08	0.24
						SEFDAAFAAA	175
SEFDKTFTAK	176	0.09	0.16	0.07	1.45
						AEKYTAEQCA	177
ATYTAKEAAT	178		0.24		0.18
						KAYTAKEAAT	179		0.28		0.33
KTATAKBAAT	180
						KTYAAKEAAT	181	0.1	0.32		0.73
KTYTAAEAAT	182				0.35
						KTYTAKAAAT	183	0.4	0.59		0.82
KTYTAKEAAA	184				0.36
						EKYTAEQCAK	185
AAFAAAEAAT	186

KTFTAKEAAT	187
						QALHCEKKYL	188
QALDSKAAYL	189
						QALDSKNNFL	190
QALHCENNFL	191
						CEKKYLRIQD	192	1.01	0.16
SKNNFLRVQE	193
						SENNYLRVQE	194	0.31	0.96	0.42	1
ALRVQENALT	195
						YARVQENALT	196	1.06	1.02	0.05	0.54
YLAVQENALT	197	0.37	1.04	0.11	1.06
						YLRAQENALT	198	1.1	1	0.06	1.26
YLRVAENALT	199	1.03	0.92	0.08	1.26
						YLRVQANALT	200	1.05	0.92	0.06	1.24
YLRVQEAALT	201	0.93	0.92	0.07	1.11
						YLRVQENAAT	202	0.94	0.93	0.04	1.24
YLRVQENALA	203	1.05	0.96	0.43	1.16
						YLRIQDDTLT	204	1.07	0.85	0.39	1.12
YLTVAAAALT	205	1.05	0.86	0.28	1.33
						FLRVQENALT	206
NNYLRVQENA	207	0.23	0.88	0.5	1.17
						KKYLRIQDDT	208		0.26	0.09	0.37
NNFLRVQENA	209
						NAYLRVQENA	210	0.17	1.02	0.53	1.06
ATYEEAKLRF	211	0.26	1.03		0.65
						EAYEEALKRF	212	0.06	0.43		0.33
ETAEEALKRF	213		1.04
						ETYAEALKRF	214	0.62	1.02		1.15
ETYEAALKRF	215	1.06	0.38		0.89
						ETYEEAAKRF	216	0.08	0.1		0.9
ETYEEALARF	217				0.11
						ETYEEALKAF	218				0.1
ETYEEALKRA	219				0.1
						GTNAQSLADF	220
ETYEAALAAF	221	0.07	0.78	0.33	0.77
						ETFEEALKRF	222
YEEALKTFAK	223	1.08	0.85	0.14	1.46
						FEEALKRFAK	224	0.46	0.72		0.67
AALKRFAKLL	225	0.15	0.17
						EAAKRFAKLL	226	0.08	0.33		0.05
EALARFAKLL	227		0.09
						EALKAFAKLL	228
EALKRAAKLL	229	0.08	0.07
						EALKRFAALL	230
EALKRFAKAL	231	0.06	0.09		0.1
						EALKRFAKLA	232	0.06			0.1
QSLADFAKQL	233
						AALAAFAKLL	234
LADFAKQLSD	235
						DFAKQLSDER	236				0.17
AFAALLSDRK	237

有效产生结果的取代是相对于未取代的肽序列，由IgE结合能力的减少而确定的。表5表示所确定的有效产生结果的取代。表中的空格表示未检测到肽与患者IgE的结合。用丙氨酸或苯丙氨酸取代原始酪氨酸的很多取代均可导致抗体结合的减少或消除。

                        表5：马铃薯贮藏蛋白的有效产生结果的取代

位置(SEQ ID NO)	肽(SEQ ID NO)	HS03	HS06	HS01	HS02
						次要表位21	PFYFEHGPQI   (36)::A:::::::   (111)::F:::::::(r)(120):::::::::A   (118)	1.08	0.170.27	0.650.16	0.060.33
次要表位27	KYLMQVLQEK   (42):A::::::::   (122):::::::::A   (130)VFLHDKIKSL(c)(131)	1.080.06	0.790.280.26	0.120.27	0.040.370.41
						主要表位41	SYSTAAAPTY   (56)A:::::::::   (132):A::::::::   (133)AFAA::::::(r)(141)CI::S:::::(c)(139)	1.040.04	0.550.1	1.150.12	0.250.120.007
重叠表位41/42	STAAAPTYFP   (238)::S::::A::(r)(145)				0.08
						主要表位42(57)	AAAPTYFPPH   57)::::A:::::   148):::::A::::   149)::::AF::::(r)155)::::PF::::(r)156):::::F::::(r)157)	1.12	0.86	1.020.07	0.520.04
主要表位61	SEFDKTYTAK   76)::::A:::::   169)KQAE:YTAEQ(c)174)::::AAFA:A(r)175)	0.12	0.28	1.330.08	1.350.170.24
						主要表位62	KTYTAKEAAT   (77)A:::::::::   (178)::A:::::::   (180):::::A::::   (182)AAFA:A::::(r)(186)::F:::::::(r)(187)EK:::EQC:K(c)(185)	1.11	0.040.24	1.36	0.940.180.35
次要表位72	QALDSKNNYL   (87):::HCEKK::(c)(188)::::::AA::(r)(189)::::::::F:(r)(190):::::E::F:(r)(240)	0.28	0.43	0.44	0.46

次要表位73	SKNNYLRVQE   (88)::::F:::::(r)(193)	1.31	0.21	0.44	0.05
						次要表位74	YLRVQENALT   (87)A:::::::::   (195)F:::::::::(r)(206)	1.31	0.2	1.38	0.03
重叠表位73/74	NNYLRVQENA   (207)::F:::::::(r)(209)	0.23	0.88	0.5	1.17
						主要表位85	ETYEEALKRF   (100):::::::A::   (217)::::::::A:   (218):::::::::A   (219)::F:::::::(r)(222)G:NAQS:AD:(c)(220)	1.36	0.71	1.26	1.20.110.10.1
主要表位86	EALKRFAKLL   (101):::A::::::   (227)::::A:::::   (228):::::A::::   (229):::::::A::   (230)::::::::A:   (231):::::::::A   (232)SD:AD:::Q:(c)(241)A::AA:::::(r)(234)	00.080.060.06	1.120.090.070.09	1.38	0.04
						表位重叠86/87	LKRFAKLLSD  (239)(无结合)
主要表位87	RFAKLLSDRK   (102)D:::Q:::ER(c)(236)A::A::::::(r)(237)	0	0.94	0.98	0.050.17

(r)＝合理的；(c)＝玉米实施例5：定点诱变

为了引入位点特异性突变，利用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，使马铃薯贮藏蛋白的克隆DNA序列(编码马铃薯贮藏蛋白SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1，pMON26820)经历PCR反应，掺入α-因子信号序列的一部分(毕赤氏酵母表达，人工的，Invitrogen，Carlsbad，CA)，及EcoRI和XhoI限制位点，从而促进克隆到巴斯德毕赤氏酵母的分泌型载体pPIC9(Genbank登记号Z46233；Invitrogen，Carlsbad，CA)中。典型的PCR条件是，94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环25次；再加一次10分钟的72℃延伸。50μL反应物包含30pmol各种引物和1μg模板DNA；和具有MgCl₂，200μM dGTP，200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，2.5个单位PWO DNA聚合酶的1 X PCR缓冲液。PCR反应是在RoboCyclerGradient96温度循环器(Stratagene，La Jolla，CA)中进行的。

用限制酶XhoI和EcoRI消化扩增片段SEQ ID NO：5，并将其克隆到pBluescript载体内(Stratagene，La Jolla，CA)，再用同两种限制酶消化。所得质粒(pMON26869)用于定位于寡核苷的诱变，该诱变是在Kunkel方法的基础上，使用Bio-Rad诱变试剂盒(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：477-492，1985)进行的。简单地说，单链pMON26869可被用作诱变的模板，且其是通过用M13K07超感染含质粒的细胞而制备的(Gorman等，DNAProt.Eng.Techniques，2：3-10，1990)。所述诱变的寡核苷酸为SEQ IDNOS：8-15(反向互补)。从转化的DH5α大肠杆菌集落纯化的DNA可被用于序列的测定。测序是使用ABI PRISM测序试剂盒进行的(PerkinElmer Biosystems，Foster City，CA)。用限制酶XhoI和EcoRI消化马铃薯贮藏蛋白基因中含突变的所得质粒。

接着，将马铃薯贮藏蛋白核酸片段连接到pPIC9载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，用同两种限制酶消化，以提供质粒pMON37401。用含适宜突变的pMON37401电穿孔巴斯德毕赤氏酵母的KM71细胞。通过制造商提供的方法(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用所得的转化细胞在巴斯德毕赤氏酵母中生产蛋白。该被编码的蛋白包含一种α因子信号剪切位点。质粒pMON37401编码SEQ ID NO：6，其被剪切从而提供SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：7具有加在SEQ ID NO：2的氨基酸24-386 N-端的4个氨基酸。因此，SEQ ID NO：7的位置4相当于SEQ ID NO：2的位置23。

培养物中马铃薯贮藏蛋白的浓度是使用马铃薯贮藏蛋白ELISA测定法测定的，酶活性是使用Hofgen和Willmitzer方法测量的(PlantScience，66：221-230，1990)。用Mono Q和疏水反应色谱(HIC)进一步纯化含多种突变的变体。各培养物先通过Amicon YM10膜(Millipore，Bedford，MA)的第一分级而被纯化成＞10kDa的部分，接着通过Mono Q HR 10/10柱色谱(Pharmacia，Piscataway，NJ)被进一步纯化。就Mono Q柱色谱而言，将样品在pH7.5的25mM Tris中上样到柱上，并用pH7.5的25mM Tris中的1.0M KCl梯度洗脱。用SDS-PAGE测定含马铃薯贮藏蛋白的部分。就HIC柱色谱而言，收集适当的部分，并将其透析到pH7.5的25mM Tris中的1M硫酸铵。然后将透析的样品上样到16/10苯基琼脂糖凝胶柱上(Pharmacia，Piscataway，N)，并用pH7.5的25mM Tris梯度洗脱。

蛋白浓度是使用Bradford方法，用BSA作为标准测定的。SDS-PAGE分析显示这些蛋白基本上是纯的。新形成的变体的酯酶活性在表6中给出。该活性是使用Hofgen和Wil1mitzer描述的对硝基苯基癸酸盐底物测定的(Plant Science，66：221-230，1990)。

               表6：马铃薯贮藏蛋白突变体的酯酶活性

变体	活性(mOD.min-1μg-1)
		野生型	93.2
Y106F	51.1
		Y129F	74.7
Y185F	85.6
		Y193F	82.2
Y185F/Y193F	99.4
		Y270F	163.4
Y316F	94.88
		Y362F	130.7
Y106F/Y129F/Y185F/Y193F/Y270F/Y316F/Y362F	57.1
		Y185F/Y193F/Y270F/Y316F/Y362F	161.5

在已表达的SEQ ID NO：7的106，129，185，193，270，316和362的每个氨基酸位置(号码与SEQ ID NO：2中的位置相对应)上具有苯丙氨酸取代的马铃薯贮藏蛋白显示出全酶活性。具有多个取代的蛋白也显示出全酶活性。

除在基本多肽序列内编码保守氨基酸改变的核苷酸序列之外，生物功能性等价的核苷酸序列还包括含其它碱基取代，添加，或缺失的核苷酸序列。这些包括含有与cDNA相同的先天遗传信息的核酸，其编码可带来与宿主细胞和植物上的病原体一样或类似的病原体抗性的肽，多肽或蛋白。这种核苷酸序列可被称作cDNA的“遗传等价修饰形式”。并可通过此处所述的方法确定它。

在编码脱敏基因的cDNA，质粒DNA，基因组DNA，合成DNA，或其它核酸中进行的突变优选保存编码序列的读框。此外，这些突变优选不会产生互补区，所述互补区能够杂交产生不利地影响mRNA翻译的二级mRNA结构，如环状或发夹结构。

虽然可预先确定突变位点，但预先确定突变自身的性质是没有必要的。例如，为了选择特定位点上突变的最优特性，可在靶密码子上进行随机诱变。

可供选择地，通过合成含突变序列的寡核苷酸，可将突变引入到特定位点，侧翼为能够连接天然cDNA序列片段的限制位点。连接后，所得重建核苷酸序列编码一种具有所期望的氨基酸插入，取代或缺失的衍生物形式。实施例6：置换蛋白序列的构建

编码置换蛋白的核酸序列可通过下列由Mullins等(J.Am.Chem.Soc.116：5529-5533，1994)描述的一般方法制备，其中所述的置换蛋白具有重排的N-端/C-端蛋白序列。其步骤在图3中表示。该图和下列实施例包括分离原始C-端和N-端的连接体区的设计和使用，但连接体的使用并不是关键性的，且不是设计置换蛋白所必需的元素。

将两组寡核苷酸引物用于构建编码置换蛋白的核酸序列。在第一步中，寡核苷酸引物的“新N-端”和“连接体起点”被用于PCR反应中，以建造扩增核酸分子“新N-端片段”，其包括编码置换蛋白新N-端部分以及其后的连接原始蛋白C-端和N-端的多肽连接体的核酸序列。在第二步中，寡核苷酸引物“新C-端”和“连接体终点”被用于PCR反应中，以建造扩增核酸分子“新C-端片段”，其包括编码与上述所用相同连接体以及其后的置换蛋白的新C-端部分的核酸序列。所述“新N-端”和“新C-端”寡核苷酸引物包括适当的限制酶识别位点，其有助于编码置换蛋白的核酸序列克隆到质粒内。

可使用任何适宜的PCR条件及聚合酶。人们期望使用一种具有高保真度的，耐热的DNA聚合酶，从而减少或消除序列错误的引入。典型的PCR条件是94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环25次；再加一次10分钟的72℃延伸。50μl反应物包含30pmol的各种引物，1μg模板DNA；和具有MgCl₂，200μM dGTP，200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，2.5个单位Pwo DNA聚合酶的1X PCR缓冲液。PCR反应是在RoboCycler Gradient96温度循环器(Stratagene，La Jolla，CA)中进行的。

退火扩增的“新N-端片段”和“新C-端片段”，以在第三次PCR反应中形成一个模板，从而扩增编码置换蛋白的全长核酸序列。将DNA片段的“新N-端片段”和“新C-端片段”溶解在1％的TAE凝胶上，用溴化乙锭染色，并用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离。在第三次PCR反应中，这些片段与寡核苷酸引物的“新N-端”和“新C-端”以等摩尔量结合。PCR条件与先前所用的条件相同。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR反应产物。

可供选择地，连接体序列可包含限制位点，以使两个扩增的PCR产物直接连接。实施例7：质粒pMON37402的构建

马铃薯贮藏蛋白在246位的精氨酸上，含有一个胰蛋白酶的敏感位点，其是通过胰蛋白酶消化反应的电泳测定的。为了确定暴露的蛋白酶位点是否是一种抗原性的表位，用246-247位作为断点构建置换蛋白。

在质粒pMON37402中编码置换蛋白的核酸序列是使用图3所示，实施例6所述的方法建造的。核酸分子的“新N-端片段”是使用寡核苷酸引物27(SEQ ID NO：242)和48(SEQ ID NO：243)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。核酸分子的“新C-端片段”是使用寡核苷酸引物47(SEQ ID NO：244)和36(SEQID NO：245)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。编码置换蛋白的全长核酸分子是使用寡核苷酸引物27(SEQ ID NO：242)和36(SEQ ID NO：245)，从退火片段的“新N-端片段”和“新C-端片段”建造和扩增的。

用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化所得的扩增核酸分子，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。质粒pMON26869(pPIC9的衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)是用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化，用凝胶纯化的，从而产生一个约有2900个碱基对的载体片段。用T4 DNA连接酶结合并连接纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含氨苄青霉素的平板上选择转化体细菌。分离并测序质粒DNA，以确定正确插入的存在。所得质粒被命名为pMON37402(含SEQ ID NO：246，编码蛋白序列SEQ ID NO：247)。实施例8：质粒pMON37405的构建

接近酪氨酸193的氨基酸201-202被选作构建置换蛋白的断点。

在质粒pMON37405中编码置换蛋白的核酸序列是使用图3所示，实施例6所述的方法建造的。核酸分子的“新N-端片段”是使用寡核苷酸引物48(SEQ ID NO：243)和58(SEQ ID NO：249)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。核酸分子的“新C-端片段”是使用寡核苷酸引物47(SEQ ID NO：244)和59(SEQID NO：249)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。编码置换蛋白的全长核酸分子是使用寡核苷酸引物58(SEQ ID NO：248)和59(SEQ ID NO：249)，从退火片段的“新N-端片段”和“新C-端片段”建造和扩增的。

用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化所得的扩增核酸分子，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。质粒pMON26869(pPIC9的衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)是用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化，用凝胶纯化的，并产生一个约有2900个碱基对的载体片段。使用T4 DNA连接酶结合并连接纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含氨苄青霉素的平板上选择转化体细菌。分离并测序质粒DNA，以确定正确插入的存在。所得质粒被命名为pMON37405(含SEQ ID NO：250，编码蛋白序列SEQ ID NO：251)。实施例9：质粒pMON37406的构建

接近酪氨酸185的氨基酸183-184被选作构建置换蛋白的断点。

在质粒pMON37406中编码置换蛋白的核酸序列是使用图3所示，实施例6所述的方法建造的。核酸分子的“新N-端片段”是使用寡核苷酸引物48(SEQ ID NO：243)和60(SEQ ID NO：252)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。核酸分子的“新C-端片段”是使用寡核苷酸引物47(SEQ ID NO：244)和61(SEQID NO：253)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。编码置换蛋白的全长核酸分子是使用寡核苷酸引物60(SEQ ID NO：252)和61(SEQ ID NO：253)，从退火片段的“新N-端片段”和“新C-端片段”建造和扩增的。

用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化所得的扩增核酸分子，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。质粒pMON26869(pPIC9的衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)是用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化，用凝胶纯化的，并产生一个约有2900个碱基对的载体片段。用T4 DNA连接酶结合并连接纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含氨苄青霉素的平板上选择转化体细菌。分离并测序质粒DNA，以确定正确插入的存在。所得质粒被命名为pMON37406(含SEQ ID NO：254，编码蛋白序列SEQ ID NO：255)。实施例10：质粒pMON37407的构建

接近酪氨酸270的氨基酸268-269被选作构建置换蛋白的断点。

在质粒pMON37407中编码置换蛋白的核酸序列是使用图3所示，实施例6所述的方法建造的。核酸分子的“新N-端片段”是使用寡核苷酸引物48(SEQ ID NO：243)和62(SEQ ID NO：256)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。核酸分子的“新C-端片段”是使用寡核苷酸引物47(SEQ ID NO：244)和63(SEQID NO：257)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。编码置换蛋白的全长核酸分子是使用寡核苷酸引物62(SEQ ID NO：256)和63(SEQ ID NO：257)，从退火片段的“新N-端片段”和“新C-端片段”建造和扩增的。

用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化所得的扩增核酸分子，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。质粒pMON26869(pPIC9的衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)是用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化，用凝胶纯化的，并产生一个约有2900个碱基对的载体片段。用T4 DNA连接酶结合并连接纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含氨苄青霉素的平板上选择转化体细菌。分离并测序质粒DNA，以确定正确插入的存在。所得质粒被命名为pMON37407(含SEQ ID NO：258，编码蛋白序列SEQ ID NO：259)。实施例11：质粒pMON37408的构建

接近酪氨酸216的氨基酸321-322被选作构建置换蛋白的断点。

在质粒pMON37408中编码置换蛋白的核酸序列是使用图3所示，实施例6所述的方法建造的。核酸分子的“新N-端片段”是使用寡核苷酸引物48(SEQ ID NO：243)和64(SEQ ID NO：260)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。核酸分子的“新C-端片段”是使用寡核苷酸引物47(SEQ ID NO：244)和65(SEQID NO：261)，从在质粒pMON26820中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。编码置换蛋白的全长核酸分子是使用寡核苷酸引物64(SEQ ID NO：260)和65(SEQ ID NO：261)，从退火片段的“新N-端片段”和“新C-端片段”建造和扩增的。

用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化所得的扩增核酸分子，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。质粒pMON26869(pPIC9的衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)是用限制内切核酸酶XhoI和EcoRI消化，用凝胶纯化的，并产生一个约有2900个碱基对的载体片段。用T4 DNA连接酶结合并连接纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含氨苄青霉素的平板上选择转化体细菌。分离并测序质粒DNA，以确定正确插入的存在。所得质粒被命名为pMON37408(含SEQ ID NO：262，编码蛋白序列SEQ ID NO：263)。实施例12：在巴斯德毕赤氏酵母中生产置换蛋白

根据制造商(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的方法，分别使用质粒pMON37402，pMON37405，pMON37406，pMON37407，和pMON37408电穿孔来源于巴斯德毕赤氏酵母的KM71细胞。接着，根据制造商(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的方法，用所得的转化细胞在巴斯德毕赤氏酵母中生产蛋白。

培养物中马铃薯贮藏蛋白的浓度是用马铃薯贮藏蛋白ELISA测定法测定的，酶活性是用Hofgen和Willmitzer(PlantScience，66：221-230，1990)的方法测量的。使用Mono Q和疏水反应色谱(HIC)进一步纯化含多种突变的变体。各培养物通过Amicon YM10膜(Millipore，Bedford，MA)的第一分级而被纯化成＞[10kDa]的级分，接着通过Mono Q HR10/10柱色谱(Pharmacia，Piscataway，NJ)被进一步纯化。就Mono Q柱色谱而言，将样品到pH7.5的25mM Tris中上样到的柱上，并用pH7.5的25mM Tris中的1.0M KCl梯度洗脱。用SDS-PAGE测定含马铃薯贮藏蛋白的部分。就HIC柱色谱而言，收集适当的部分，并将其透析到pH7.5的25mM Tris中的1M硫酸铵。然后将透析样品上样到16/10苯基琼脂糖凝胶柱上(Pharmacia，Piscataway，N)，并用pH7.5的25mM Tris梯度洗脱。

蛋白浓度是使用Bradford方法，用BSA作为标准测定的。SDS-PAGE分析显示这些蛋白基本上是纯的。变体的酯酶活性在表7中列出。

                    表7：置换蛋白的活性

pMON	断点	活性(ΔOD.min-1μg-1)
			天然酶		83.21
pMON37402	246/247	66.7
			pMON37405	201/202	未表达
pMON37406	183/184	未表达
			pMON37407	268/269	12.1
pMON37409	321/322	未表达

所述活性是使用Hofgen和Willmitzer描述的对-硝基苯基癸酸盐底物(Plant Science，66：221-230，1990)测定的。实施例13：昆虫生物效率的测定

对SCRW幼虫活性的测定是通过与Marrone(J.Econ.Entom.78：290-293，1985)所述类似的方法，在琼脂食物上覆盖试验样品而进行的。在pH7.5的25mM Tris缓冲液中制备试验样品。让新生的幼虫食用在26℃处理过的食物，5天或6天之后，评估其死亡率和生长停止。此测定的结果在表8中列出。

                  表8：昆虫生物效率的测定

蛋白(200ppm)	平均存活重量	重量减少％
			Tris缓冲液(对照)	1.26±0.3	-
野生型	0.21±0.02	83
			pMON37402	0.21±0.03	83
pMON37407	0.32±0.04	75

这些数据证实，与野生型的马铃薯贮藏蛋白相比，摄取了由pMON37402和pMON37407编码的蛋白的SCRW幼虫的生长都减少了。实施例14：用于单子叶植物表达的改进置换蛋白序列

已经证实了修饰编码序列可改进杀虫蛋白的表达。因而设计一种修饰的编码序列，以改良在植物，特别是玉米(SEQ ID NO：264)中的表达。实施例15：用于单子叶植物表达的pMON40701的构建

用限制内切核酸酶NcoI和EcoRI消化质粒pMON19767，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化1100bp的基因片段。用限制内切核酸酶NcoI和EcoRI消化，并用凝胶纯化质粒pMON33719，产生一个具有约3900个碱基对的载体片段。这两个纯化的限制片段是用T4 DNA连接酶结合并连接的。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含氨苄青霉素的平板上选择转化体细菌。分离并测序质粒DNA，以确定正确插入的存在。所得质粒被命名为pMON40700。用限制内切核酸酶NotI消化质粒pMON40700，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化2200bp的DNA片段。用限制内切核酸酶NotI消化，并用凝胶纯化质粒pMON30460，产生一个具有约4200个碱基对的载体片段。这两个纯化的限制片段是用T4 DNA连接酶结合并连接的。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含卡那霉素的平板上选择转化体细菌。所得质粒被命名为pMON40701(含SEQ ID NO：264，编码蛋白序列SEQ ID NO：265)。实施例16：用于单子叶植物表达的nMON40703的构建

在质粒pMON40703中编码置换蛋白的核酸序列是使用图3所示，实施例6所述的方法建造的。核酸分子的“新N-端片段”是使用寡核苷酸引物Syn1(SEQ ID NO：266)和Syn2(SEQ ID NO：267)，从在质粒pMON19767中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。核酸分子的“新C-端片段”是使用寡核苷酸引物Syn3(SEQ ID NO：268)和Syn4(SEQ ID NO：269)，从在质粒pMON19767中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。编码置换蛋白的全长核酸分子是使用寡核苷酸引物Syn1(SEQ ID NO：266)和Syn4(SEQ ID NO：269)，从退火片段的“新N-端片段”和“新C-端片段”建造和扩增的。

用限制内切核酸酶NcoI和EcoRI消化所得的扩增核酸分子，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。质粒pMON33719是用限制内切核酸酶NcoI和EcoRI消化，用凝胶纯化的，并产生一个具有约3900个碱基对的载体片段。用T4 DNA连接酶结合并连接纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含氨苄青霉素的平板上选择转化体细菌。分离并测序质粒DNA，以确定正确插入的存在。所得质粒被命名为pMON40702。用限制内切核酸酶NotI消化质粒pMON40702，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化2200bp的DNA片段。用限制内切核酸酶NotI消化，并用凝胶纯化质粒pMON30460，产生一个具有约4200个碱基对的载体片段。用T4 DNA连接酶结合并连接这两个纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含卡那霉素的平板上选择转化体细菌。所得质粒被命名为pMON40703(含SEQ ID NO：270，编码蛋白序列SEQ ID NO：271)。质粒pMON40703编码一种野生型马铃薯贮藏蛋白序列(SEQ ID NO：2)的246/247位具有“断点”的置换蛋白。SEQ ID NO：2的前23个氨基酸是一种信号肽序列，其在成熟蛋白中裂解。实施例17：用于单子叶植物表达的pMON40705的构建

在质粒pMON40705中编码置换蛋白的核酸序列是使用图3所示，实施例6所述的方法建造的。核酸分子的“新N-端片段”是使用寡核苷酸引物Syn10(SEQ ID NO：272)和Syn2(SEQ ID NO：267)，从在质粒pMON19767中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。核酸分子的“新C-端片段”是使用寡核苷酸引物Syn3(SEQ ID NO：268)和Syn11(SEQ ID NO：273)，从在质粒pMON19767中编码马铃薯贮藏蛋白的序列建造和扩增的。编码置换蛋白的全长核酸分子是使用寡核苷酸引物Syn10(SEQ ID NO：272)和Syn11(SEQ ID NO：273)，从退火片段的“新N-端片段”和“新C-端片段”建造和扩增的。

用限制内切核酸酶NcoI和EcoRI消化所得的扩增核酸分子，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。质粒pMON33719是用限制内切核酸酶NcoI和EcoRI消化，用凝胶纯化的，并产生一个具有约3900个碱基对的载体片段。用T4 DNA连接酶结合并连接纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含氨苄青霉素的平板上选择转化体细菌。分离并测序质粒DNA，以确定正确插入的存在。所得质粒被命名为pMON40704。用限制内切核酸酶NotI消化质粒pMON40704，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化2200bp的DNA片段。用限制内切核酸酶NotI消化，并用凝胶纯化质粒pMON30460，产生一个具有约4200个碱基对的载体片段。用T4 DNA连接酶结合并连接这两个纯化的限制片段。

所述连接反应的混合物用于转化大肠杆菌菌株DH5α的细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。在含卡那霉素的平板上选择转化体细菌。所得质粒被命名为pMON40705(含SEQ ID NO：274，编码蛋白序列SEQ ID NO：275)。质粒pMON40705编码一种野生型马铃薯贮藏蛋白序列(SEQ ID NO：2)的268/269位具有“断点”的置换蛋白。SEQ ID NO：2的前23个氨基酸是一种信号肽序列，其在成熟蛋白中裂解。实施例18：蛋白在玉米叶原生质体中的瞬时表达

如Sheen(Plant Cell 3：225-245，1991)所述，将质粒pMON40701，pMON40703，和pMON40705(所有均包含用于导向液泡的天然信号序列)分别电穿孔到玉米叶的原生质体中。用玻璃珠萃取蛋白，使用ELISA测定上清液马铃薯贮藏蛋白ELISA和NPTII的蛋白表达。通过蛋白印迹分析证实转化的玉米原生质体的蛋白表达。表达结果在表9中列出。

                          表9：ELISA的数据

样品	马铃薯贮藏蛋白ELISA(μg/mL)	NPTII ELISA(μg/mL)	标准表达(马铃薯贮藏蛋白ELISA/NPTII ELISA)
				pMON40701	1.1	0.6	1.8
pMON40703	2.1	0.3	7.0
				pMON40705	1.3	0.6	2.2

结果表明，由质粒pMON40703编码的置换蛋白令人吃惊的表现出比野生型酶约高4倍的表达。实施例19：蛋白序列的脱糖基化

此实施例为糖基化作用有助于蛋白的变应原性提供了证据。因此，氨基酸残基的合理取代很可能是受试者变应原蛋白内糖基化作用的靶，可减少或消除蛋白的变应原性，而不会不利地影响蛋白的酶活性，杀虫活性，抗真菌活性或其它功能性。

糖基化作用通常以N-连接或O-连接的形式发生。N-连接的糖基化作用通常发生在基序Asn-Xaa-Ser/Thr上，其中Xaa是除Pro之外的任意一种氨基酸(Kasturi，L.等，Biochem J.323：415-519，1997；Melquist，J.L.等，Biochemistry37：6833-6837，1998)。O-连接的糖基化作用发生在丝氨酸或苏氨酸的羟基和氨基糖之间。

所选天冬酰胺，丝氨酸，或苏氨酸的定点诱变可用于减少或消除马铃薯贮藏蛋白的糖基化作用。对SEQ ID NO：2的Asn-Xaa-Ser/Thr基本序列进行的检索揭示了其发生在氨基酸的202-204位。编码此区的核酸序列的诱变使所编码蛋白的变应原性降低。

为了试验此方法可降低马铃薯贮藏蛋白的变应原性，我们进行了两组试验：a)在大肠杆菌中生产马铃薯贮藏蛋白，其不能使蛋白糖基化；b)生产具有N202Q定点突变的马铃薯贮藏蛋白。

来源于患者HS-07和G15-MON(对马铃薯不过敏)的抗体不与野生型马铃薯贮藏蛋白，在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白，或N202Q的变体特异性结合。来源于患者HS-01(对马铃薯过敏)的抗体结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，但不结合在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白或N202Q的变体。来源于患者HS-02(对马铃薯过敏)的抗体强有力地结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，但极微弱地结合在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白，并类似载体对照一样结合N202Q变体。来源于患者HS-03(对马铃薯过敏)的抗体结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，但不结合在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白或N202Q变体。来源于患者HS-05(对马铃薯过敏)的抗体结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，但非常弱地结合在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白和N202Q变体。来源于患者HS-06(对马铃薯过敏)的抗体强有力地结合野生型的马铃薯贮藏蛋白，N202Q变体，及在大肠杆菌中产生的马铃薯贮藏蛋白。这些结果强有力地表明糖基化作用至少部分影响马铃薯贮藏蛋白的抗原性，且定点诱变可用于减少或消除特异性的抗体结合。SEQ ID NO：2的202位的诱变可用于减少或消除特异性的抗体结合。

使用马铃薯贮藏蛋白同系物Pat17检验脱糖基化作用。如上所示，鉴定了具有IgE结合性的马铃薯贮藏蛋白表位，其每个均包含一个Tyr残基。各表位内这些Tyr残基的取代导致IgE结合的缺失。定点诱变可用于生产蛋白中具有单个或多个Tyr取代的变体，其在巴斯德毕赤氏酵母中表达，且评估了它的酶活性。我们发现所有的变体的酶活性均不低于野生型蛋白的酶活性。全部5个酪氨酸残基均被苯丙氨酸取代的单个变体具有不低于未取代的蛋白的杀虫活性，且其在大肠杆菌中表达，并产生非糖基化的译本。我们还评估了大肠杆菌5-“Tyr到Phe”变体的IgE结合。马铃薯贮藏蛋白的同工酶Pat17在玉米中表达时，会产生一种植物糖蛋白，在大肠杆菌中表达时，会产生一种未糖基化的蛋白。通过免疫印迹法，用7个患者(其中5个对马铃薯过敏，1个对其它物质过敏，但对马铃薯不过敏)的血清测定Pat17或Pat17变体的结合。来源于马铃薯过敏患者的5份血清中的4份非常微弱结合，或不结合在大肠杆菌中表达的野生型马铃薯贮藏蛋白，但与5-Tyr变体结合。另一个对马铃薯过敏患者的血清与在大肠杆菌中表达的重组野生型马铃薯贮藏蛋白蛋白强有力的结合，但与5-Tyr变体的结合较微弱。来源于所有5个马铃薯过敏患者的血清均较强的结合在玉米中表达的马铃薯贮藏蛋白和存在于马铃薯中的天然马铃薯贮藏蛋白。来源于对蛋，奶，花生和海鲜过敏，但对马铃薯不过敏的对照患者的血清不与在大肠杆菌中表达的马铃薯贮藏蛋白结合，但与在玉米中表达的马铃薯贮藏蛋白结合。免疫印迹结果表明马铃薯贮藏蛋白中的糖部分是一种非特异性的IgE结合表位，且马铃薯贮藏蛋白的多肽部分也包含免疫原性的IgE表位。

马铃薯过敏的患者是在Johns Hopkins诊所(Baltimore，MD)鉴定的，并使用表2所列的临床标准对马铃薯过敏反应进行了评估。血清是从具有确切的马铃薯过敏临床史的患者得到的。所述确切的临床史具备下列一个或多个条件：a)通过双盲的，安慰剂对照的食物试验评估的阳性马铃薯过敏b)由于食用马铃薯而过敏和/或住院或c)引人注目的皮肤试验结果。肽的合成

肽是使用SPOTS系统(Genosys Biotechnologies，TX)，在纤维素膜上合成的。该膜在-20℃储藏，直到使用。定点诱变

位点特异性突变是首先使用PCR，将α因子信号序列(毕赤氏酵母表达，人工的，Invitrogen，Carlsbad，CA)的一部分掺入到马铃薯贮藏蛋白基因而被引入到马铃薯贮藏蛋白中的。用于PCR的引物是GGAGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGTTGGGAGAAATGGTGACTGTTCT(XhoI位点为斜体字)和GGTCTAGAGGAATTCTCATTAATAAGAAG(EcoRI位点为斜体)。该引物包含限制位点，从而促进克隆到巴斯德毕赤氏酵母的分泌型载体pPIC9内(基因银行登记号Z46233；Invitrogen，Carlsbad，CA)。典型的PCR条件是：94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环25次；再加一次10分钟的72℃延伸。50mL反应物包含30pmol各引物，1mg模板DNA；和具有MgCl₂，200mM dGTP，200mM dATP，200mM dTTP，200mM dCTP，2.5个单位Pwo DNA聚合酶的1X PCR缓冲液。PCR反应是在RoboCycler Gradient96Temperature Cycler(Stratagene，LaJolla，CA)中进行的。

扩增的马铃薯贮藏蛋白基因是用限制酶XhoI和EcoRI消化的，并被克隆到pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)载体内，再用同两种限制酶消化。用于PCR的模板质粒DNA是pMON26820。所得质粒(pMON26869)用于定位于寡核苷酸的诱变，该诱变是在Kunkel方法的基础上，使用Bio-Rad诱变试剂盒(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：477-492，1985)进行的。简单地说，单链pMON26869可被用作诱变的模板，且其是通过用M13K07超感染含质粒的细胞而制备的(Gorman等，DNA and Protein Engineeringtechnique2，3-10(1990))。从转化的DH5α大肠杆菌集落纯化的DNA可用于序列测定。测序是使用ABI PRISM测序试剂盒(Perkin ElmerBiosystems，Foster City，CA)进行的。巴斯德毕赤氏酵母中的蛋白表达

马铃薯贮藏蛋白基因中含突变的质粒是用限制酶XhoI和EcoRI消化的。然后将马铃薯贮藏蛋白的核酸片段连接到pPIC9载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，用同两种限制性酶消化，从而提供质粒pMON37401。用含适当突变的pMON37401电穿孔巴斯德毕赤氏酵母的KM71细胞。用制造商(Invitrogen，Carlsbad，CA)提供的方法，将所得转化细胞用于在巴斯德毕赤氏酵母中生产蛋白。用与在大肠杆菌中表达的蛋白相同的方法纯化该蛋白(见下文)。蛋白的蛋白质印迹法

使用SDS-PAGE对蛋白样品进行电泳，并将其电印迹到PVDF膜(Millipore，Bedford MA)上。蛋白印迹是使用标准的蛋白质印迹(免疫印迹)技术进行的，并在用PBS缓冲液1∶5稀释的马铃薯过敏血清中1小时。用PBS洗该印迹3次后，在生物素酰化的抗IgE中(JohnsHopkins Hospital，Baltimore，MD)温育1小时，在HRP-偶联的抗生物素蛋白中温育30分钟(Promega，New York，NY)。IgE-反应蛋白带是通过使用ECL系统(Amersham Pharmacia Biotech，NJ)观察到的。作为对照，其中一个印迹仅在抗IgE中温育。将RegulatorySciences，Monsanto Company制备的His-标记的草甘膦氧化酶和马铃薯提取物用于此研究。使用如上所述相同的温育步骤评估该肽。马铃薯贮藏蛋白在玉米中的表达和纯化

如Brown等(美国专利5,689,052)所述，使用修饰过的植物最优基因序列，生产在玉米中表达的马铃薯贮藏蛋白同工酶，Pat17。所有构建体均包含导向于液泡的天然的23氨基酸信号肽。通过微粒轰击可转化玉米(Morrish等，in Transgenicplants.Fundamentals andApplications(ed.Hiatt，A.)133-171(Marcel Dekker，New York，1993)；Songstad等，In Vitro Cell Dev Biol-Plant32，179-183(1996))。首先通过在液氮中研磨叶子而纯化来源于转化玉米的蛋白，然后用25mM Tris/HCl提取蛋白。用pH7.5的25mM Tris/HCl进一步透析植物提取物。然后将植物提取物上样到Mono Q HR10/10阴离子交换柱(Amersham Pharmacia，NJ)上，并用pH7.5的25mMTris/HCl(缓冲液A)平衡。使用HPLC系统(Shimadzu)，用含1M KCl的pH7.5的25mM Tris/HCl(缓冲液B)，以0-100％的线性梯度洗脱该蛋白。测定含蛋白部分的酯酶活性，并用含1M硫酸铵的pH7.5的25mMTris/HCl(缓冲液C)透析。将蛋白上样到苯基-琼脂糖凝胶16/10柱(Amersham Pharmacia，NJ)上，用缓冲液C平衡，从而使蛋白纯化至均质。收集酯酶活性部分，并用pH7.5的25mM Tris/HCl透析。马铃薯贮藏蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

Pat17是使用pET表达系统(Novagen，WI)在大肠杆菌中表达的。成熟Pat17基因的编码区(没有它的信号肽)是使用引物5’-GGGCCATGGCGCAGTTGGGAGAAATGGTG-3’(NcoI位点为斜体字)和引物5’-AACAAAGCTTCTTATTGAGGTGCGGCCGCTTGCATGC-3’(NotI位点为斜体字)通过PCR，使用Gene Amp试剂盒(Perkin-Elmer Cetus，CT)中所述的标准PCR反应条件及40℃的退火温度而扩增的。所述模板是质粒pMON26820。所得DNA是用NcoI和NotI消化的，并被克隆到修饰的pET24d质粒内，然后将一个N-端的六-组氨酸标记物加到该蛋白上。PCR产物的正确序列是通过测序加以证实的，且所述质粒被转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，并在含25mg/mL卡那霉素的LB上选择转化体。表达菌株是在含25mg/mL卡那霉素的LB中生长的，并用1mM IPTG在28℃时诱导8小时。采集细胞，并在pH8.5的50mM Tris/HCl，150mMNaCl中洗涤，然后通过French Press在20,000psi下裂解。在所裂解细胞的可溶部分中回收His-标记的蛋白，随后用QIAexpressionist手册(Qiagen CA)中描述的Ni-NTA树脂纯化。然后用pH7.5的25mMTris/HCl(缓冲液A)透析部分纯化的蛋白，并将其上样到Mono Q HR10/10阴离子交换柱(Amersham Pharmacia，NJ)上，用缓冲液A平衡。使用HPLC系统(Shimadzu)，用含1M KCl的pH7.5的25mM Tris/HCl(缓冲液B)以0-100％的线性梯度洗脱。测定含蛋白部分的酯酶活性。收集，浓缩酯酶活性部分，并用pH7.5的25mM Tris/HCl透析，在4℃贮藏。酶活性的测定方法

如前所述，使用对硝基苯基癸酸盐(Sigma，MO)作为底物，在二甲基亚砜(5mM原液)中溶解，然后在4％Triton X-100，1％SDS中稀释至1mM的终浓度，从而测量酶的活性。测定时，将20mL蛋白溶液加到25mL的1mM底物溶液和pH8.5的80mL 50mM Tris的混合物中。以6秒为间隔，在405nm处检测酶活性10分钟。酯酶活性是以DODmin^-1mg^-1蛋白表示的。昆虫的生物测定

与先前所述(Marrone等，J.Econ.Entom.78，290-3(1985))类似，可通过在琼脂食物上覆盖试验样品来测定所述蛋白对Diabrotica virigifera(西方玉米根虫)的活性。在pH7.5的25mMTris/HCl中稀释所要试验的蛋白，并将其覆盖在琼脂的表面。让新生的幼虫食用该食物，6天之后评估幼虫的死亡率及生长发育不良率。马铃薯贮藏蛋白上的IgE结合表位

合成一组代表马铃薯贮藏蛋白氨基酸序列的89个重叠肽，以确定IgE结合区。各肽的长度为10个氨基酸长，且在连续的肽之间包括6个氨基酸重叠。用5个不同马铃薯患者的血清评估该肽的IgE结合。马铃薯贮藏蛋白具有3个主要的表位。这些主要的IgE结合区代表氨基酸184-193，188-197，269-278和360-369。其它次要的IgE结合区代表氨基酸104-113，138-147和316-325。各主要和次要的表位中，对IgE结合比较重要的氨基酸是通过以丙氨酸逐个取代表位中每个非丙氨酸位置而合成每一位置具有单个氨基酸改变的肽而确定的。评估所得丙氨酸取代肽的IgE结合。有效产生结果的取代是通过与非取代的肽序列相比，IgE结合的减少来确定的。有趣的是，所有的表位均包含Tyr残基，而用Ala或Phe取代此Tyr，可消除IgE结合。酶和生物活性

单独或共同使用定点诱变方法，用Phe取代在各个表位中对IgE结合起决定性作用的Tyr残基。所有变体均在巴斯德毕赤氏酵母中表达，并评估了它的酶活性和杀虫活性。所述变体包括Y106F，Y129F，Y185F，Y193F，Y270F，Y316F，Y362F，Y185F/Y193F，Y185F/Y193F/Y270F/Y316F/Y362F(5-Tyr)和Y106F/Y129F/Y185F/Y193F/Y270F/Y316F/Y362F(7-Tyr)。所有变体均维持了酶活性。然后通过覆盖蛋白(200ppm的终浓度)评估5-Tyr和7-Tyr变体的杀虫活性。所述蛋白导致幼虫生长中显著的发育不良，这是通过6天后幼虫的重量而测量的，与7-Tyr和野生型蛋白相比，5-Tyr变体显示出较高的杀虫活性。4℃长期储藏时，7-Tyr变体不稳定，因此不能进一步继续。免疫印迹法

为了试验马铃薯贮藏蛋白上的聚糖部分对于IgE的结合是否重要，在大肠杆菌中表达Pat17，以产生一种非糖基化的蛋白，在玉米中表达Pat17，以产生一种植物糖基化蛋白。在大肠杆菌中表达5-Tyr变体，以评估蛋白上没有聚糖部分的线性表位的作用。用5个马铃薯过敏患者的血清和1个对马铃薯不过敏但对其它很多物质过敏患者的血清试验所述蛋白与IgE的结合。将来源于玉米和大肠杆菌的蛋白纯化至同质。将这些蛋白转化到PVDF膜(Millipore，MA)上，随后用对马铃薯过敏或不过敏患者的血清探测。所有的研究中均包括His-标记的草甘膦氧化酶对照，以证实His-标记物不会影响IgE的结合。来源于患者HS-07(对马铃薯不过敏)的血清不与在大肠杆菌中表达的Pat17结合，但可与来源于玉米的Pat17，及马铃薯提取物中相同分子量的蛋白很好地结合。有趣的是，此血清还可与马铃薯中的其它蛋白(＞46kDa)较强地结合。来源于患者HS-01，HS-02，HS-03，HS-05(对马铃薯过敏)的血清与在玉米中表达的Pat17强有力的结合，但与在大肠杆菌中产生的Pat17的结合非常微弱甚至不结合。且，来源于患者HS-01，HS-02，HS-03和HS-05的血清可结合马铃薯提取物中相似分子量的蛋白。来源于患者HS-01，HS-02和HS-03的血清还与马铃薯提取物中低分子量(＜30kDa)的其它蛋白结合。来源于患者HS-06(对马铃薯过敏)的血清与在玉米和大肠杆菌中表达的野生型马铃薯贮藏蛋白均较强的结合，但与在大肠杆菌中表达的5-Tyr变体的结合则较微弱。来源于HS-06患者的血清还与马铃薯提取物中与马铃薯贮藏蛋白分子量相似的蛋白较强结合。来源于所有患者的血清均不与His-标记的草甘膦氧化酶结合，从而表明His-标记物不结合IgE。这些结果有力地证明，Pat17上的聚糖部分在某些马铃薯过敏患者中结合IgE，且线性表位也有助于马铃薯贮藏蛋白的抗原性。实施例20：可供选择的核酸和蛋白序列

对于马铃薯贮藏蛋白蛋白将来的变化而言，与此处所公开序列具有高度相似性的序列可被用于生产脱敏的马铃薯贮藏蛋白和置换蛋白。例如，可通过进行BLAST检索(Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)来确定其它的马铃薯贮藏蛋白序列。除此处公开的那些之外，其它来源也可用于获得马铃薯贮藏蛋白的核酸序列，及编码的马铃薯贮藏蛋白。此外，可结合各种生物体的亚单位序列，以从不同的来源建造一种新的，掺入结构性，调节性，及酶特性的马铃薯贮藏蛋白序列。实施例21：核酸突变及杂交

编码马铃薯贮藏蛋白的核酸序列的变异可产生突变体马铃薯贮藏蛋白的蛋白序列，与此处公开的序列相比，其显示出等价或较高的酶特性。因此本发明包括与此处公开序列相似的核酸序列，与此处公开序列相似的蛋白序列，及编码它们的核酸序列。突变可包括缺失，插入，截短，取代，融合和亚单位序列的混排等。

核酸序列的突变可以特殊或随机的方式引入，它们对于分子生物学领域的那些技术人员而言是熟知的。现在，存在很多定点诱变技术，典型地是使用寡核苷酸在核酸序列的特殊位置引入突变。实施例包括单链拯救(Kunkel，T.Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.，82：488-492，1985)，单一位点的去除(Deng和Niclolff，Anal.Biochem.200：81，1992)，切口保护(Vandeyar等，Gene65：129-133，1988)，和PCR(Costa等，MethodsMol.Biol.57：31-44，1996)。随机或非特异性突变可通过化学试剂(总论，见Singer和Kusmierek，Ann.Rev.Biochem.52：655-693，1982)如亚硝基胍(Cerda-Olmedo等，J.Mol.Biol.33：705-719，1968；Guerola等，Nature New Biol.230：122-125，1971)和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，J.Bacteriol.103：622-633，1970)，或通过生物方法，如通过增变株传代(Greener等，Mol.Biotechnol.7：189-195，1997)来产生。

核酸杂交是DNA操作领域的那些技术人员所熟知的一种技术。一对给定核酸的杂交性能是它们相似性或同一性的指征。根据突变核酸序列与所公开序列的杂交，可选择它们与所公开马铃薯贮藏蛋白的核酸序列的相似性。选择具有多种突变的序列可以使用低严格性条件。我们期望的条件是约0.15M-0.9M氯化钠，约20℃-55℃的温度。选择与公开序列具有更高同一度的核酸序列的条件则使用高严格性条件。所用的条件包括约0.02M-0.15M氯化钠，约0.5％-5％酪蛋白，约0.02％SDS和/或约0.1％N-月桂基肌氨酸，约0.001M-0.03M柠檬酸钠，约50℃-70℃的温度。更优选地，高度严格的条件是0.02M氯化钠，0.5％酪蛋白，0.02％SDS，0.001M柠檬酸钠，50℃的温度。实施例22：源和简并核酸序列的测定

修饰和改变可在本发明的蛋白序列及编码它们的核酸片段中进行，且仍然可获得一种功能性的分子，其编码具有所期望特性的蛋白。下面是以改变蛋白的氨基酸序列，从而产生一种等价或可能是改良的第二代分子为基础的讨论。根据表10给出的密码子，所述氨基酸改变可通过改变核酸序列的密码子而完成。

                表10：氨基酸的密码子简并

氨基酸	一个字母	三个字母	密码子
				丙氨酸	A	Ala	GCA  GCC  GCG  GCT
半胱氨酸	C	Cys	TGC  TGT
				天冬氨酸	D	Asp	GAC  GAT
谷氨酸	E	Glu	GAA  GAG
				苯丙氨酸	F	Phe	TTC  TTT
甘氨酸	G	Gly	GGA  GGC  GGG  GGT
				组氨酸	H	His	CAC  CAT
异亮氨酸	I	Ile	ATA  ATC  ATT
				赖氨酸	K	Lys	AAA  AAG
亮氨酸	L	Leu	TTA  TTG  CTA  CTC  CTGCTT
				甲硫氨酸	M	Met	ATG
天冬酰胺	N	Asn	AAC  AAT
				脯氨酸	P	Pro	CCA  CCC  CCG  CCT
谷氨酰胺	Q	Gln	CAA  CAG
				精氨酸	R	Arg	AGA  AGG  CGA  CGC  CGGCGT
丝氨酸	S	Ser	AGC  AGT  TCA  TCC  TCGTCT
				苏氨酸	T	Thr	ACA  ACC  ACG  ACT
缬氨酸	V	Val	GTA  GTC  GTG  GTT
				色氨酸	W	Trp	TGG
酪氨酸	Y	Tyr	TAC TAT

在酶活性未损失的情况下，可用其它氨基酸置换蛋白序列中的某些氨基酸。因此，在生物活性未损失的情况下，可在所公开蛋白序列的肽序列中，或在它们相应的核酸序列中进行各种改变。

在进行这种改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数对于为蛋白带来相互作用的生物功能的重要性是本领域的技术人员所熟知的(Kyte和Doolittle，Mol.Biol.，157：105-132，1982)。氨基酸的相对亲水性对最终所得蛋白的二级结构是有帮助的，其依次限定蛋白与其它分子，例如酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等的相互作用。

根据各个氨基酸的亲水性和电荷，人们已经给它们分配了亲水指数。这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐/谷氨酰胺/天冬氨酸盐/天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本领域的技术人员都知道，用其它具有相似亲水指数或值的氨基酸取代某些氨基酸，仍然可产生具有相似生物活性的蛋白，即，得到一种生物功能性的蛋白。在进行这种改变时，优选亲水指数为±2的氨基酸的取代，更优选±1的那些，最优选±0.5的那些。

本领域的技术人员也可以理解，根据亲水性可有效地进行氨基酸的取代。美国专利No.4,554,101(Hopp，T.P.，1985年11月19日公开)中记载了蛋白的最大局部平均亲水性，其是通过相邻氨基酸的亲水性确定的，且与蛋白的生物性相关。下面是已经分配的氨基酸亲水值：精氨酸/赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐/谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。

可以理解，用另一个具有相似亲水值的氨基酸取代其中一个氨基酸，仍然可产生具有相似生物活性的蛋白，即，得到一种生物功能性蛋白。在进行这种改变时，优选亲水指数在±2的氨基酸的取代，更优选±1的那些，最优选±0.5的那些。

因此如上所述，氨基酸取代是以氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如疏水性，亲水性，电荷，大小等为基础的。前述各种特殊取代对于本领域的技术人员来说是熟知的，其包括：精氨酸和赖氨酸，谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸，亮氨酸，及异亮氨酸。如果其可产生功能性的马铃薯贮藏蛋白，那么也可使用这些未被期望是有利的改变。实施例23：在植物中生产马铃薯贮藏蛋白和置换蛋白 植物载体

在植物中，可以很容易地设计能够引入编码马铃薯贮藏蛋白和置换蛋白的核酸序列的转化载体，且其通常包含一个或多个在5’和3’调节序列的转录控制下的目的核酸编码序列。这种载体通常包括，以5’-3’方向可操作连接在序列中的以下元件，一种启动子序列，其指导植物中下游异源结构核酸序列的转录；一种5’-非翻译前导序列；一种编码目的蛋白的核酸序列；一种编码聚腺苷酸化信号的3’-非翻译区，其在植物细胞中起作用，引起转录终止并使聚腺苷酸核苷酸添加在编码蛋白的mRNA的3’末端。植物转化载体通常还包括一种选择性的标记物。典型的5’-3’调节序列包括一个转录起始位点，一个核糖体结合位点，一个RNA加工信号，一个转录终止位点，和/或一个聚腺苷酸化信号。用于植物转化的载体已经在Rodriguez等(载体：分子克隆载体的及其用途的调查，Butterworths，Boston.，1988)，Glick等(植物分子生物学及生物技术的方法，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1993)，和Croy(植物分子生物学，Labfax，Hames and Rickwood(Eds.)，BIOS Scientific Publishers Limited，Oxford，UK.，1993)中描述。植物启动子

植物启动子序列可以是组成型或诱导型的，环境或发育调节型的，或细胞或组织特异性的。经常使用的组成型启动子包括CaMV 35S启动子(Odell，J.T.等，Nature313：810-812，1985)，增强型CaMV35S启动子，玄参花叶病毒(FMV)启动子(Richins等，NucleicAcids Res.20：8451-8466，1987)，甘露氨酸合成酶(mas)启动子，胭脂氨酸合成酶(nos)启动子，及章鱼氨酸合成酶(ocs)启动子。有效的诱导型启动子包括由水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子(PR-1，Willams，S.W.等，Biotechnology10：540-543，1992)，由安全剂诱导的(取代的苯磺酰胺除草剂，Hershey，H.P.和Stoner，T.D.，Plant Mol.Biol.17：679-690，1991)启动子，热激启动子(Ou-Lee等，Proc.Natl.Acad Sci.US.A.83：6815-6819，1986；Ainley等，Plant Mol.Biol.14：949-967，1990)，来源于菠菜亚硝酸盐还原酶基因的硝酸盐诱导型启动子(Back等，Plant Mol.Biol.17：9-18，1991)，激素诱导型启动子(Yamaguchi-Shinozaki，K.等，Plant Mol.Biol.15：905-912，1990；Kares等，PlantMol.Biol.15：225-236，1990)，及光诱导型启动子，其与RuBP羧酶小亚单位和LHCP基因家族有关(Kuhlemeier等，Plant Cell 1：471，1989；Feinbaum，R.L.等，Mol.Gen.Genet.226：449-456，1991；Weisshaar，B.等，EMBO J.10：1777-1786，1991；Lam，E.和Chua，N.H.，J Biol.Chem.266：17131-17135，1990；Castresana，C.等，EMBO J.7：1929-1936，1988；Schulze-Lefert等，EMBO J.8：651，1989).。有效的组织特异性启动子，发育调节型启动子的实施例包括β-conglycinin7S启动子(Doyle，J.J.等，J Biol.Chem.261：9228-9238，1986；Slighton和Beachy，Planta 172：356-363，1987)，和种子特异性启动子(Knutzon，D.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：2624-2628，1992；Bustos，M.M.等，EMBO J.10：1469-1479，1991；Lam和Chua，Science 248：471，1991；Stayton等Aust.J Plant.Physiol.18：507，1991)。用于种子质粒优先表达的植物功能性启动子包括来源于植物贮藏蛋白基因的那些和来源于包括在油菜籽中脂肪酸生物合成中的基因的那些启动子。这种启动子的实施例包括来源于这种基因，如napin(Kridl等，Seed Sci.Res.1：209-219，1991)，菜豆球蛋白，玉米蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂，ACP，硬脂酰-ACP去饱和酶及油质蛋白的5’调节区的启动子。在EP0255378中讨论了种子-特异性基因的调节。还可构建启动子杂交体来提高转录活性(Comai，L.和Moran，P.M.，美国专利No.5,106,739，1992年4月21日公开)，或结合所期望的转录活性及组织特异性。植物转化和再生

各种不同的方法，包括农杆菌属介导的转化，粒子枪送递，显微注射，电穿孔，聚乙二醇介导的原生质体转化，脂质体介导的转化等(在Potrykus，I.Ann.Rev.Plant Mol.Biol.42：205-225，1991中论述)均可用于将这些载体引入到植物原生质体，细胞，愈伤组织，叶盘，分生组织等中，以产生转基因植物。通常，转基因植物可经由上述任意一种方法，通过用一种DNA构建体转化植物细胞而产生，其中所述转基因植物包含的细胞含有并表达编码马铃薯贮藏蛋白和置换蛋白的DNAs；选择已被转化到选择性培养基上的植物细胞；再生已被转化的植物细胞，产生不同的植物；并选择一种转化植物，其表达编码蛋白的核苷酸序列。

转化各种双子叶植物并获得转基因植物的特殊方法已经在文献中报道过(Gasser和Fraley，Science244：1293-1299，1989；Fisk和Dandekar，Scientia Horticulture55：5-36，1993；Christou，AgroFood Industry Hitech，p.17，1994；和其中引用的参考文献)。

已经报道过单子叶植物中成功的转化和植物再生，如：天门冬属(石刁柏；Bytebier等，Proc.Natl.Aca d.Sci.U.S.A.84：5345-5349，1987)；大麦(大麦；Wan和Lemaux，Plant Physiol.104：37-48，1994)；玉米(玉米；Rhodes，C.A.等，Science 240：204-207，1988；Gordon-Kamm等，PlantCell 2：603-618，1990；Fromm，M.E.等.，Bi/lTechnology 8：833-839，1990；Koziel等.，Bio/Technology 11：194-200，1993)；燕麦(燕麦；Somers等，Bio/Technology 10：1589-1594，1992)；鸭茅(鸭茅；Horn等，Plant Cell Rep.7：469-472，1988)；稻(稻，包括印度和日本的品种；Toriyama等，Bio/Technology 6：10，1988；Zhang等，Plant Cell Rep.7：379-384，1988；Luo和Wu，Plant Mol.Biol.Rep.6：165-174，1988；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76：835-840，1988；Christou等Bio/Technology 9：957-962，1991)；黑麦(黑麦；De la Pena等，Nature 325：274-276，1987)；蜀黍(两色蜀黍；Casas，A.M.等，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.90：1121211216，1993)；甘蔗(甘蔗；Bower和Birch，Plant J.2：409-416，1992)；高羊茅(苇状羊茅；Wang，Z.Y.等，Bio/Technology 10：691-696，1992)；turfgrass(Agrostispalustris；Zhong等，Plant Cell Rep.13：1-6，1993)；小麦(小麦；Vasil等，Bio/Technology 10：667-674，1992；Weeks，T.等，Plant Physiol.102：1077-1084，1993；Becker等.，PlantJ.5：299-307，1994)，和苜蓿(Masoud，S.A.等，Transgen.Res.5：313，1996)；芥属(canola/油菜籽)(Fry，J.Plant Cell Rep.6：321-325，1987)；和大豆(Hinchee，M.BiolTechnol.6：915-922，1988)。

根据本发明公开的内容，在没有不当试验的情况下，此处描述的所有组分和/或方法均可制造并实施。当已经根据优选实施方案描述本发明的组分和方法时，它对于本领域的技术人员来说是显而易见的，在不背离本发明的概念，精神和范围的前提下，可对此处描述的组分和/或方法，方法的步骤或方法步骤的顺序进行各种改变。更特别的是，如果可获得相同或相似的结果，那么可用某些化学和生理学相关的试剂代替此处描述的制剂，这一点对于本领域的技术人员来说也是显而易见的。对于本领域技术人员显而易见的所有这种相似的取代和改变均被认为包括在本发明的精神，范围和概念之内。

                                 序列表<110>M.F.阿利布海

 J.D.阿斯特伍德

 C.A.麦克维特尔

 H.A.萨姆普森<120>脱敏马铃薯贮藏蛋白及置换蛋白的制备<130>MOBT217-CN<160>293<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1158<212>DNA<213>马铃薯(Solanum tuberosum)<400>1atggcaacta ctaaatcttt tttaatttta atatttatga tattagcaac tactagttca   60acatttgctc agttgggaga aatggtgact gttcttagta ttgatggagg tggaattaga  120gggatcattc cggctaccat tctcgaattt cttgaaggac aacttcagga aatggacaat  180aatgcagatg caagacttgc agattacttt gatgtaattg gaggaacaag tacaggaggt  240ttattgactg ctatgataag tactccaaat gaaaacaatc gaccctttgc tgctgccaaa  300gaaattgtac ctttttactt cgaacatggc cctcagattt ttaatcctag tggtcaaatt  360ttaggcccaa aatatgatgg aaaatatctt atgcaagttc ttcaagaaaa acttggagaa  420actcgtgtgc atcaagcttt gacagaagtt gtcatctcaa gctttgacat caaaacaaat  480aagccagtaa tattcactaa gtcaaattta gcaaactctc cagaattgga tgctaagatg  540tatgacataa gttattccac agcagcagct ccaacatatt ttcctccgca ttactttgtt  600actaatacta gtaatggaga tgaatatgag ttcaatcttg ttgatggtgc tgttgctact  660gttgctgatc cggcgttatt atccattagc gttgcaacga gacttgcaca aaaggatcca  720gcatttgctt caattaggtc attgaattac aaaaaaatgc tgttgctctc attaggcact  780ggcactactt cagagtttga taaaacatat acagcaaaag aggcagctac ctggactgct  840gtacattgga tgttagttat acagaaaatg actgatgcag caagttctta catgactgat   900tattaccttt ctactgcttt tcaagctctt gattcaaaaa acaattacct cagggttcaa   960gaaaatgcat taacaggcac aactactgaa atggatgatg cttctgaggc taatatggaa  1020ttattagtac aagttggtga aaacttattg aagaaaccag tttccgaaga caatcctgaa  1080acctatgagg aagctctaaa gaggtttgca aaattgctct ctgataggaa gaaactccga  1140gcaaacaaag cttcttat                                                1158<210>2<211>386<212>PRT<213>马铃薯(Solanum tuberosum)<400>2Met Ala Thr Thr Lys Ser Phe Leu Ile Leu Ile Phe Met Ile Leu Ala1               5                   10                  15Thr Thr Ser Ser Thr Phe Ala Gln Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu

        20                  25                  30Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile Pro Ala Thr Ile Leu

    35                  40                  45Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu Gln Glu Met Asp Asn Asn Ala Asp Ala

50                  55                  60Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly65                  70                  75                  80Leu Leu Thr Ala Met Ile Ser Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg Pro Phe

            85                  90                  95Ala Ala Ala Lys Glu Ile Val Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro Gln

        100                 105                 110Ile Phe Asn Pro Ser Gly Gln Ile Leu Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Lys

    115                 120                 125Tyr Leu Met Gln Val Leu Gln Glu Lys Leu Gly Glu Thr Arg Val His

130                 135                 140Gln Ala Leu Thr Glu Val Val Ile Ser Ser Phe Asp Ile Lys Thr Asn145                 150                 155                 160Lys Pro Val Ile Phe Thr Lys Ser Asn Leu Ala Asn Ser Pro Glu Leu

            165                 170                 175Asp Ala Lys Met Tyr Asp Ile Ser Tyr Ser Thr Ala Ala Ala Pro Thr

        180                 185                 190Tyr Phe Pro Pro His Tyr Phe Val Thr Asn Thr Ser Asn Gly Asp Glu

    195                 200                 205Tyr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Asp Pro

210                 215                 220Ala Leu Leu Ser Ile Ser Val Ala Thr Arg Leu Ala Gln Lys Asp Pro225                 230                 235                 240Ala Phe Ala Ser Ile Arg Ser Leu Asn Tyr Lys Lys Met Leu Leu Leu

            245                 250                 255Ser Leu Gly Thr Gly Thr Thr Ser Glu Phe Asp Lys Thr Tyr Thr Ala

        260                 265                 270Lys Glu Ala Ala Thr Trp Thr Ala Val His Trp Met Leu Val Ile Gln

    275                 280                 285Lys Met Thr Asp Ala Ala Ser Ser Tyr Met Thr Asp Tyr Tyr Leu Ser

290                 295                 300Thr Ala Phe Gln Ala Leu Asp Ser Lys Asn Asn Tyr Leu Arg Val Gln305                 310                 315                 320Glu Asn Ala Leu Thr Gly Thr Thr Thr Glu Met Asp Asp Ala Ser Glu

            325                 330                 335Ala Asn Met Glu Leu Leu Val Gln Val Gly Glu Asn Leu Leu Lys Lys

        340                 345                 350Pro Val Ser Glu Asp Asn Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg

    355                 360                 365Phe Ala Lys Leu Leu Ser Asp Arg Lys Lys Leu Arg Ala Asn Lys Ala

370                 375                 380Ser Tyr385<210>3<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>3ggagctcgag aaaagagagg ctgaagctca gttgggagaa atggtgactg ttct    54<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>4ggtctagagg aattctcatt aataagaag                                 29<210>5<211>1138<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>5ggagctcgag aaaagagagg ctgaagctca gttgggagaa atggtgactg ttcttagtat   60tgatggaggt ggaattagag ggatcattcc ggctaccatt ctcgaatttc ttgaaggaca  120acttcaggaa atggacaata atgcagatgc aagacttgca gattactttg atgtaattgg  180aggaacaagt acaggaggtt tattgactgc tatgataagt actccaaatg aaaacaatcg  240accctttgct gctgccaaag aaattgtacc tttttacttc gaacatggcc ctcagatttt  300taatcctagt ggtcaaattt taggcccaaa atatgatgga aaatatctta tgcaagttct  360tcaagaaaaa cttggagaaa ctcgtgtgca tcaagctttg acagaagttg tcatctcaag  420ctttgacatc aaaacaaata agccagtaat attcactaag tcaaatttag caaactctcc  480agaattggat gctaagatgt atgacataag ttattccaca gcagcagctc caacatattt   540tcctccgcat tactttgtta ctaatactag taatggagat gaatatgagt tcaatcttgt   600tgatggtgct gttgctactg ttgctgatcc ggcgttatta tccattagcg ttgcaacgag   660acttgcacaa aaggatccag catttgcttc aattaggtca ttgaattaca aaaaaatgct   720gttgctctca ttaggcactg gcactacttc agagtttgat aaaacatata cagcaaaaga   780ggcagctacc tggactgctg tacattggat gttagttata cagaaaatga ctgatgcagc   840aagttcttac atgactgatt attacctttc tactgctttt caagctcttg attcaaaaaa   900caattacctc agggttcaag aaaatgcatt aacaggcaca actactgaaa tggatgatgc   960ttctgaggct aatatggaat tattagtaca agttggtgaa aacttattga agaaaccagt  1020ttccgaagac aatcctgaaa cctatgagga agctctaaag aggtttgcaa aattgctctc  1080tgataggaag aaactccgag caaacaaagc ttcttattaa tgagaattcc tctagacc    1138<210>6<211>452<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>6Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1               5                   10                  15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

        20                  25                  30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

    35                  40                  45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50                  55                  60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65                  70                  75                  80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gln Leu Gly Glu Met Val Thr

            85                  90                  95Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile Pro Ala Thr

        100                 105                 110Ile Leu Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu Gln Glu Met Asp Asn Asn Ala

    115                 120                 125Asp Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr

130                 135                 140Gly Gly Leu Leu Thr Ala Met Ile Ser Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg145                 150                 155                 160Pro Phe Ala Ala Ala Lys Glu Ile Val Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly

            165                 170                 175Pro Gln Ile Phe Asn Pro Ser Gly Gln Ile Leu Gly Pro Lys Tyr Asp

        180                 185                 190Gly Lys Tyr Leu Met Gln Val Leu Gln Glu Lys Leu Gly Glu Thr Arg

    195                 200                 205Val His Gln Ala Leu Thr Glu Val Val Ile Ser Ser Phe Asp Ile Lys

210                 215                 220Thr Asn Lys Pro Val Ile Phe Thr Lys Ser Asn Leu Ala Asn Ser Pro225                 230                 235                 240Glu Leu Asp Ala Lys Met Tyr Asp Ile Ser Tyr Ser Thr Ala Ala Ala

            245                 250                 255Pro Thr Tyr Phe Pro Pro His Tyr Phe Val Thr Asn Thr Ser Asn Gly

        260                 265                 270Asp Glu Tyr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala Val Ala Thr Val Ala

    275                 280                 285Asp Pro Ala Leu Leu Ser Ile Ser Val Ala Thr Arg Leu Ala Gln Lys

290                 295                 300Asp Pro Ala Phe Ala Ser Ile Arg Ser Leu Asn Tyr Lys Lys Met Leu305                 310                 315                 320Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly Thr Thr Ser Glu Phe Asp Lys Thr Tyr

            325                 330                 335Thr Ala Lys Glu Ala Ala Thr Trp Thr Ala Val His Trp Met Leu Val

        340                 345                 350Ile Gln Lys Met Thr Asp Ala Ala Ser Ser Tyr Met Thr Asp Tyr Tyr

    355                 360                 365Leu Ser Thr Ala Phe Gln Ala Leu Asp Ser Lys Asn Asn Tyr Leu Arg

370                 375                 380Val Gln Glu Asn Ala Leu Thr Gly Thr Thr Thr Glu Met Asp Asp Ala385                 390                 395                 400Ser Glu Ala Asn Met Glu Leu Leu Val Gln Val Gly Glu Asn Leu Leu

            405                 410                 415Lys Lys Pro Val Ser Glu Asp Asn Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu

        420                 425                 430Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu Ser Asp Arg Lys Lys Leu Arg Ala Asn

    435                 440                 445Lys Ala Ser Tyr

450<210>7<211>367<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>7Glu Ala Glu Ala Gln Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp1               5                   10                  15Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile Pro Ala Thr Ile Leu Glu Phe Leu

        20                  25                  30Glu Gly Gln Leu Gln Glu Met Asp Asn Asn Ala Asp Ala Arg Leu Ala

    35                  40                  45Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Thr

50                  55                  60Ala Met Ile Ser Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg Pro Phe Ala Ala Ala65                  70                  75                  80Lys Glu Ile Val Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro Gln Ile Phe Asn

            85                  90                  95Pro Ser Gly Gln Ile Leu Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Met

        100                 105                 110Gln Val Leu Gln Glu Lys Leu Gly Glu Thr Arg Val His Gln Ala Leu

    115                 120                 125Thr Glu Val Val Ile Ser Ser Phe Asp Ile Lys Thr Asn Lys Pro Val

130                 135                 140Ile Phe Thr Lys Ser Asn Leu Ala Asn Ser Pro Glu Leu Asp Ala Lys145                 150                 155                 160Met Tyr Asp Ile Ser Tyr Ser Thr Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro

            165                 170                 175Pro His Tyr Phe Val Thr Asn Thr Ser Asn Gly Asp Glu Tyr Glu Phe

        180                 185                 190Asn Leu Val Asp Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Asp Pro Ala Leu Leu

    195                 200                 205Ser Ile Ser Val Ala Thr Arg Leu Ala Gln Lys Asp Pro Ala Phe Ala

210                 215                 220Ser Ile Arg Ser Leu Asn Tyr Lys Lys Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly225                 230                 235                 240Thr Gly Thr Thr Ser Glu Phe Asp Lys Thr Tyr Thr Ala Lys Glu Ala

            245                 250                 255Ala Thr Trp Thr Ala Val His Trp Met Leu Val Ile Gln Lys Met Thr

        260                 265                 270Asp Ala Ala Ser Ser Tyr Met Thr Asp Tyr Tyr Leu Ser Thr Ala Phe

    275                 280                 285Gln Ala Leu Asp Ser Lys Asn Asn Tyr Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala

290                 295                 300Leu Thr Gly Thr Thr Thr Glu Met Asp Asp Ala Ser Glu Ala Asn Met305                 310                 315                 320Glu Leu Leu Val Gln Val Gly Glu Asn Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser

            325                 330                 335Glu Asp Asn Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys

        340                 345                 350Leu Leu Ser Asp Arg Lys Lys Leu Arg Ala Asn Lys Ala Ser Tyr

    355                 360                 365<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>8atgttcgaag aaaaaaggta caat                                24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>9ttgcataaga aattttccat cata                                24<210>  10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>10tgctgtggaa aaacttatgt cata                                24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>11cggaggaaaa aatgttggag ctgc                                  24<210>12<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>12atgcggagga aaaaatgttg gagctgctgc tgtggaaaaa cttatgtcat a    51<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>13ttttgctgta aatgttttat caaa                                  24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>14aaccctgagg aaattgtttt ttga                                  24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>15agcttcctca aaggtttcag gatt                                  24<210>16<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>16Gln Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser1               5                   10<210>17<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>17Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly1               5                   10<210>18<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>18Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly1               5                   10<210>19<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>19Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile Pro Ala1               5                   10<210>20<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>20Arg Gly Ile Ile Pro Ala Thr Ile Leu Glu1               5                   10<210>21<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>21Pro Ala Thr Ile Leu Glu Phe Leu Glu Gly1               5                   10<210>22<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>22Leu Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu Gln Glu1               5                   10<210>23<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>23Glu Gly Gln Leu Gln Glu Met Asp Asn Asn1               5                   10<210>24<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>24Gln Glu Met Asp Asn Asn Ala Asp Ala Arg1               5                   10<210>25<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>25Asn Asn Ala Asp Ala Arg Leu Ala Asp Tyr1               5                   10<210>26<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>26Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile1               5                   10<210>27<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>27Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly Thr Ser1               5                   10<210>28<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>28Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly Leu1               5                   10<210>29<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>29Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Thr Ala Met1               5                   10<210>30<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>30Gly Leu Leu Thr Ala Met Ile Ser Thr Pro1               5                   10<210>31<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>31Ala Met Ile Ser Thr Pro Asn Glu Asn Asn1               5                   10<210>32<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>32Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg Pro Phe Ala1               5                   10<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>33Asn Asn Arg Pro Phe Ala Ala Ala Lys Glu1               5                   10<210>34<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>34Phe Ala Ala Ala Lys Glu Ile Val Pro Phe1               5                   10<210>35<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>35Lys Glu Ile Val Pro Phe Tyr Phe Glu His1               5                   10<210>36<21 1>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>36Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro Gln Ile1               5                   10<210>37<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>37Glu His Gly Pro Gln Ile Phe Asn Pro Ser1               5                   10<210>38<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>38Gln Ile Phe Asn Pro Ser Gly Gln Ile Leu1               5                   10<210>39<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>39Pro Ser Gly Gln Ile Leu Gly Pro Lys Tyr1               5                   10<210>40<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>40Ile Leu Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr1               5                   10<210>41<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>41Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Met Gln Val1               5                   10<210>42<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>42Lys Tyr Leu Met Gln Val Leu Gln Glu Lys1               5                   10<210>43<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>43Gln Val Leu Gln Glu Lys Leu Gly Glu Thr1               5                   10<210>44<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>44Glu Lys Leu Gly Glu Thr Arg Val His Gln1               5                   10<210>45<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>45Glu Thr Arg Val His Gln Ala Leu Thr Glu1               5                   10<210>46<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>46His Gln Ala Leu Thr Glu Val Val Ile Ser1               5                   10<210>47<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>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>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>86Ser Thr Ala Phe Gln Ala Leu Asp Ser Lys1               5                   10<210>87<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>87Gln Ala Leu Asp Ser Lys Asn Asn Tyr Leu1               5                   10<210>88<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>88Ser Lys Asn Asn Tyr Leu Arg Val Gln Glu1               5                   10<210>89<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>89Tyr Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala Leu Thr1               5                   10<210>90<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>90Gln Glu Asn Ala Leu Thr Gly Thr Thr Thr1               5                   10<210>91<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>91Leu Thr Gly Thr Thr Thr Glu Met Asp Asp1               5                   10<210>92<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400> 92Thr Thr Glu Met Asp Asp Ala Ser Glu Ala1               5                   10<210>93<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>93Asp Asp Ala Ser Glu Ala Asn Met Glu Leu1               5                   10<210>94<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>94Glu Ala Asn Met Glu Leu Leu Val Gln Val1               5                   10<210>95<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>95Glu Leu Leu Val Gln Val Gly Glu Asn Leu1               5                   10<210>96<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>96Gln Val Gly Glu Asn Leu Leu Lys Lys Pro1               5                   10<210>97<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>97Asn Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser Glu Asp1               5                   10<210>98<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>98Lys Pro Val Ser Glu Asp Asn Pro Glu Thr1               5                   10<210>99<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>99Glu Asp Asn Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Ala1               5                   10<210>100<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>100Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe1               5                   10<210>101<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>101Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu1               5                   10<210>102<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>102Arg Phe Ala Lys Leu Leu Ser Asp Arg Lys1               5                   10<210>103<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>103Leu Leu Ser Asp Arg Lys Lys Leu Arg Ala1               5                   10<210>104<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>104Arg Lys Lys Leu Arg Ala Asn Lys Ala Ser1               5                   10<210>105<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>105Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly Thr Ser1               5                   10<210>106<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>106Asp Tyr Phe Asp Val Ile Ala Gly Thr Ser1               5                   10<210>107<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>107Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly Leu1               5                   10<210>108<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>108Val Ile Ala Gly Thr Ser Thr Gly Ala Leu1               5                   10<210>109<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>109Ala Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro Gln Ile1               5                   10<210>110<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>110Pro Ala Tyr Phe Glu His Gly Pro Gln Ile1               5                   10<210>111<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>111Pro Phe Ala Phe Glu His Gly Pro Gln Ile1               5                   10<210>112<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>112Pro Phe Tyr Ala Glu His Gly Pro Gln Ile1               5                   10<210>113<211>10<212>RRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>113Pro Phe Tyr Phe Ala His Gly Pro Gln Ile1               5                   10<210>114<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>114Pro Phe Tyr Phe Glu Ala Gly Pro Gln Ile1               5                   10<210>115<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>115Pro Phe Tyr Phe Glu His Ala Pro Gln Ile1               5                   10<210>116<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>116Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Ala Gln Ile1               5                   10<210>117<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>117Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro Ala Ile1               5                   10<210>118<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>118Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro Gln Ala1               5                   10<210>119<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>119Thr Phe Tyr Leu Glu Asn Gly Pro Lys Ile1               5                   10<210>120<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>120Pro Phe Phe Phe Glu His Gly Pro Gln Ile1               5                   10<210>121<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>121Ala Tyr Leu Met Gln Val Leu Gln Glu Lys1               5                   10<210>122<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>122Lys Ala Leu Met Gln Val Leu Gln Glu Lys1               5                   10<210>123<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>123Lys Tyr Ala Met Gln Val Leu Gln Glu Lys1               5                   10<210>124<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>124Lys Ty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    5                   10<210>201<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>201Tyr Leu Arg Val Gln Glu Ala Ala Leu Thr1               5                   10<210>202<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>202Tyr Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala Ala Thr1               5                   10<210>203<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>203Tyr Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala Leu Ala1               5                   10<210>204<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>204Tyr Leu Arg Ile Gln Asp Asp Thr Leu Thr1               5                   10<210>205<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>205Tyr Leu Thr Val Ala Ala Ala Ala Leu Thr1               5                   10<210>206<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>206Phe Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala Leu Thr1               5                   10<210>207<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>207Asn Asn Tyr Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala1               5                   10<210>208<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>208Lys Lys Tyr Leu Arg Ile Gln Asp Asp Thr1               5                   10<210>209<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>209Asn Asn Phe Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala1               5                   10<210>210<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>210Asn Ala Tyr Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala1               5                   10<210>211<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>211Ala Thr Tyr Glu Glu Ala Lys Leu Arg Phe1               5                   10<210>212<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>212Glu Ala Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe1               5                   10<210>213<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>213Glu Thr Ala Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe1               5                   10<210>214<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>214Glu Thr Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Arg Phe1               5                   10<210>215<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>215Glu Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Arg Phe1               5                   10<210>216<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>216Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Ala Lys Arg Phe1               5                   10<210>217<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>217Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Ala Arg Phe1               5                   10<210>218<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>218Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Ala Phe1               5                   10<210>219<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>219Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg Ala1               5                   10<210>220<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>220Gly Thr Asn Ala Gln Ser Leu Ala Asp Phe1               5                   10<210>221<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>221Glu Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Ala Phe1               5                   10<210>222<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>222Glu Thr Phe Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe1               5                   10<210>223<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>223Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Thr Phe Ala Lys1               5                   10<210>224<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>224Phe Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys1               5                   10<210>225<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>225Ala Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu1                5                  10<210>226<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>226Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu1               5                   10<210>227<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>227Glu Ala Leu Ala Arg Phe Ala Lys Leu Leu1               5                   10<210>228<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>228Glu Ala Leu Lys Ala Phe Ala Lys Leu Leu1               5                   10<210>229<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>229Glu Ala Leu Lys Arg Ala Ala Lys Leu Leu1               5                   10<210>230<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>230Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Ala Leu Leu1               5                   10<210>231<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>231Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Ala Leu1               5                   10<210>232<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>232Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Ala1               5                   10<210>233<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>233Gln Ser Leu Ala Asp Phe Ala Lys Gln Leu1               5                   10<210>234<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>234Ala Ala Leu Ala Ala Phe Ala Lys Leu Leu1               5                   10<210>235<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>235Leu Ala Asp Phe Ala Lys Gln Leu Ser Asp1               5                   10<210>236<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>236Asp Phe Ala Lys Gln Leu Ser Asp Glu Arg1               5                   10<210>237<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>237Ala Phe Ala Ala Leu Leu Ser Asp Arg Lys1               5                   10<210>238<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>238Ser Thr Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro1               5                   10<210>239<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>239Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu Ser Asp1               5                   10<210>240<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>240Gln Ala Leu Asp Ser Glu Asn Asn Phe Leu1               5                   10<210>241<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>241Ser Asp Leu Ala Asp Phe Ala Lys Gln Leu1               5                   10<210>242<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>242ggagctcgag aaaagagagg ctgaagcttc attgaattac aaaaaaatgc tgttg    55<210>243<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>243tcccaactgt cctggtccat aagaagcttt gtttgctcgg ag                  42<210>244<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>244gcttcttatg gaccaggaca gttgggagaa atggtg                               36<210>245<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>245ggtctagagg aattctcatt acctaattga agcaaatgc                            39<210>246<211>1128<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>246tcgagaaaag agaggctgaa gcttcattga attacaaaaa aatgctgttg ctctcattag     60gcactggcac tacttcagag tttgataaaa catatacagc aaaagaggca gctacctgga    120ctgctgtaca ttggatgtta gttatacaga aaatgactga tgcagcaagt tcttacatga    180ctgattatta cctttctact gcttttcaag ctcttgattc aaaaaacaat tacctcaggg    240ttcaagaaaa tgcattaaca ggcacaacta ctgaaatgga tgatgcttct gaggctaata    300tggaattatt agtacaagtt ggtgaaaact tattgaagaa accagtttcc gaagacaatc    360ctgaaaccta tgaggaagct ctaaagaggt ttgcaaaatt gctctctgat aggaagaaac    420tccgagcaaa caaagcttct tatggaccag gacagttggg agaaatggtg actgttctta    480gtattgatgg aggtggaatt agagggatca ttccggctac cattctcgaa tttcttgaag    540gacaacttca ggaaatggac aataatgcag atgcaagact tgcagattac tttgatgtaa    600ttggaggaac aagtacagga ggtttattga ctgctatgat aagtactcca aatgaaaaca    660atcgaccctt tgctgctgcc aaagaaattg taccttttta cttcgaacat ggccctcaga     720tttttaatcc tagtggtcaa attttaggcc caaaatatga tggaaaatat cttatgcaag     780ttcttcaaga aaaacttgga gaaactcgtg tgcatcaagc tttgacagaa gttgtcatct     840caagctttga catcaaaaca aataagccag taatattcac taagtcaaat ttagcaaact     900ctccagaatt ggatgctaag atgtatgaca taagttattc cacagcagca gctccaacat     960attttcctcc gcattacttt gttactaata ctagtaatgg agatgaatat gagttcaatc    1020ttgttgatgg tgctgttgct actgttgctg atccggcgtt attatccatt agcgttgcaa    1080cgagacttgc acaaaaggat ccagcatttg cttcaattag gtaatgag                 1128<210>247<211>366<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>247Ser Leu Asn Tyr Lys Lys Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly Thr1               5                   10                  15Thr Ser Glu Phe Asp Lys Thr Tyr Thr Ala Lys Glu Ala Ala Thr Trp

        20                  25                  30Thr Ala Val His Trp Met Leu Val Ile Gln Lys Met Thr Asp Ala Ala

    35                  40                  45Ser Ser Tyr Met Thr Asp Tyr Tyr Leu Ser Thr Ala Phe Gln Ala Leu

50                  55                  60Asp Ser Lys Asn Asn Tyr Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala Leu Thr Gly65                  70                  75                  80Thr Thr Thr Glu Met Asp Asp Ala Ser Glu Ala Asn Met Glu Leu Leu

            85                  90                  95Val Gln Val Gly Glu Asn Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser Glu Asp Asn

        100                 105                 110Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu Ser

    115                 120                 125Asp Arg Lys Lys Leu Arg Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gly Pro Gly Gln

130                 135                 140Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg145                 150                 155Gly Ile Ile Pro Ala Thr Ile Leu Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu Gln

            165                 170                 175Glu Met Asp Asn Asn Ala Asp Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val

        180                 185                 190Ile Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Thr Ala Met Ile Ser Thr

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210                 215                 220Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro Gln Ile Phe Asn Pro Ser Gly Gln Ile225                 230                 235                 240Leu Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Met Gln yal Leu Gln Glu

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    275                 280                 285Asn Leu Ala Asn Ser Pro Glu Leu Asp Ala Lys Met Tyr Asp Ile Ser

290                 295                 300Tyr Ser Thr Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro Pro His Tyr Phe Val305                 310                 315                 320Thr Asn Thr Ser Asn Gly Asp Glu Tyr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly

            325                 330                 335Ala Val Ala Thr Val Ala Asp Pro Ala Leu Leu Ser Ile Ser Val Ala

        340                 345                 350Thr Arg Leu Ala Gln Lys Asp Pro Ala Phe Ala Ser Ile Arg

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    115                 120                 125Glu Met Asp Asp Ala Ser Glu Ala Asn Met Glu Leu Leu Val Gln Val

130                 135                 140Gly Glu Asn Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser Glu Asp Asn Pro Glu Thr145                 150                 155                 160Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu Ser Asp Arg Lys

            165                 170                 175Lys Leu Arg Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Leu Gly Glu

        180                 185                 190Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile

    195                 200                 205Pro Ala Thr Ile Leu Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu Gln Glu Met Asp

210                 215                 220Asn Asn Ala Asp Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly225                 230                 235                 240Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Thr Ala Met Ile Ser Thr Pro Asn Glu

            245                 250                 255Asn Asn Arg Pro Phe Ala Ala Ala Lys Glu Ile Val Pro Phe Tyr Phe

        260                 265                 270Glu His Gly Pro Gln Ile Phe Asn Pro Ser Gly Gln Ile Leu Gly Pro

    275                 280                 285Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Met Gln Val Leu Gln Glu Lys Leu Gly

290                 295                 300Glu Thr Arg Val His Gln Ala Leu Thr Glu Val Val Ile Ser Ser Phe305                 310                 315                 320Asp Ile Lys Thr Asn Lys Pro Val Ile Phe Thr Lys Ser Asn Leu Ala

            325                 330                 335Asn Ser Pro Glu Leu Asp Ala Lys Met Tyr Asp Ile Ser Tyr Ser Thr

        340                 345                 350Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro Pro His Tyr Phe Val Thr

    355                 360                 365<210>252<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>252ggagctcgag aaaagagagg ctgaagctag ttattccaca gcagcagctc caaca       55<210>253<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>253ggtctagagg aattctcatt atatgtcata catcttagc                         39<210>254<211>1128<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>254tcgagaaaag agaggctgaa gctagttatt ccacagcagc agctccaaca tattttcctc   60cgcattactt tgttactaat actagtaatg gagatgaata tgagttcaat cttgttgatg  120gtgctgttgc tactgttgct gatccggcgt tattatccat tagcgttgca acgagacttg  180cacaaaagga tccagcattt gcttcaatta ggtcattgaa ttacaaaaaa atgctgttgc  240tctcattagg cactggcact acttcagagt ttgataaaac atatacagca aaagaggcag   300ctacctggac tgctgtacat tggatgttag ttatacagaa aatgactgat gcagcaagtt   360cttacatgac tgattattac ctttctactg cttttcaagc tcttgattca aaaaacaatt   420acctcagggt tcaagaaaat gcattaacag gcacaactac tgaaatggat gatgcttctg   480aggctaatat ggaattatta gtacaagttg gtgaaaactt attgaagaaa ccagtttccg   540aagacaatcc tgaaacctat gaggaagctc taaagaggtt tgcaaaattg ctctctgata   600ggaagaaact ccgagcaaac aaagcttctt atggaccagg acagttggga gaaatggtga   660ctgttcttag tattgatgga ggtggaatta gagggatcat tccggctacc attctcgaat   720ttcttgaagg acaacttcag gaaatggaca ataatgcaga tgcaagactt gcagattact   780ttgatgtaat tggaggaaca agtacaggag gtttattgac tgctatgata agtactccaa   840atgaaaacaa tcgacccttt gctgctgcca aagaaattgt acctttttac ttcgaacatg   900gccctcagat ttttaatcct agtggtcaaa ttttaggccc aaaatatgat ggaaaatatc   960ttatgcaagt tcttcaagaa aaacttggag aaactcgtgt gcatcaagct ttgacagaag  1020ttgtcatctc aagctttgac atcaaaacaa ataagccagt aatattcact aagtcaaatt  1080tagcaaactc tccagaattg gatgctaaga tgtatgacat ataatgag               1128<210>255<211>366<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>255Ser Tyr Ser Thr Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro Pro His Tyr Phe1               5                   10                  15Val Thr Asn Thr Ser Asn Gly Asp Glu Tyr Glu Phe Asn Leu Val Asp

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    35                  40                  45Ala Thr Arg Leu Ala Gln Lys Asp Pro Ala Phe Ala Ser Ile Arg Ser

50                  55                  60Leu Asn Tyr Lys Lys Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly Thr Thr65                  70                  75                  80Ser Glu Phe Asp Lys Thr Tyr Thr Ala Lys Glu Ala Ala Thr Trp Thr

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    115                 120                 125Ser Lys Asn Asn Tyr Leu Arg Val Gln Glu Asn Ala Leu Thr Gly Thr

130                 135                 140Thr Thr Glu Met Asp Asp Ala Ser Glu Ala Asn Met Glu Leu Leu Val145                 150                 155                 160Gln Val Gly Glu Asn Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser Glu Asp Asn Pro

            165                 170                 175Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu Ser Asp

        180                 185                 190Arg Lys Lys Leu Arg Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Leu

    195                 200                 205Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly

210                 215                 220Ile Ile Pro Ala Thr Ile Leu Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu Gln Glu225                 230                 235                 240Met Asp Asn Asn Ala Asp Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile

            245                 250                 255Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Thr Ala Met Ile Ser Thr Pro

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    355                 360                 365<210>256<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>256ggagctcgag aaaagagagg ctgaagctac atatacagca aaagaggcag ctacc    55<210>257<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>257ggtctagagg aattctcatt atttatcaaa ctctgaagt                       39<210>258<211>1128<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>258tcgagaaaag agaggctgaa gctacatata cagcaaaaga ggcagctacc tggactgctg     60tacattggat gttagttata cagaaaatga ctgatgcagc aagttcttac atgactgatt    120attacctttc tactgctttt caagctcttg attcaaaaaa caattacctc agggttcaag    180aaaatgcatt aacaggcaca actactgaaa tggatgatgc ttctgaggct aatatggaat    240tattagtaca agttggtgaa aacttattga agaaaccagt ttccgaagac aatcctgaaa    300cctatgagga agctctaaag aggtttgcaa aattgctctc tgataggaag aaactccgat    360caaacaaagc ttcttatgga ccaggacagt tgggagaaat ggtgactgtt cttagtattg    420atggaggtgg aattagaggg atcattccgg ctaccattct cgaatttctt gaaggacaac    480ttcaggaaat ggacaataat gcagatgcaa gacttgcaga ttactttgat gtaattggag    540gaacaagtac aggaggttta ttgactgcta tgataagtac tccaaatgaa aacaatcgac    600cctttgctgc tgccaaagaa attgtacctt tttacttcga acatggccct cagattttta    660atcctagtgg tcaaatttta ggcccaaaat atgatggaaa atatcttatg caagttcttc    720aagaaaaact tggagaaact cgtgtgcatc aagctttgac agaagttgtc atctcaagct    780ttgacatcaa aacaaataag ccagtaatat tcactaagtc aaatttagca aactctccag    840aattggatgc taagatgtat gacataagtt attccacagc agcagctcca acatattttc    900ctccgcatta ctttgttact aatactagta atggagatga atatgagttc aatcttgttg    960atggtgctgt tgctactgtt gctgatccgg cgttattatc cattagcgtt gcaacgagac   1020ttgcacaaaa ggatccagca tttgcttcaa ttaggtcatt gaattacaaa aaaatgctgt   1080tgctctcatt aggcactggc actacttcag agtttgataa ataatgag                1128<210>259<211>366<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>259Thr Tyr Thr Ala Lys Glu Ala Ala Thr Trp Thr Ala Val His Trp Met1               5                   10                  15Leu Val Ile Gln Lys Met Thr Asp Ala Ala Ser Ser Tyr Met Thr Asp

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50                  55                  60Asp Ala Ser Glu Ala Asn Met Glu Leu Leu Val Gln Val Gly Glu Asn65                  70                  75                  80Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser Glu Asp Asn Pro Glu Thr Tyr Glu Glu

            85                  90                  95Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu Ser Asp Arg Lys Lys Leu Arg

        100                 105                 110Ser Asn Lys Ala Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Leu Gly Glu Met Val Thr

    115                 120                 125Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile Pro Ala Thr

130                 135                 140Ile Leu Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu Gln Glu Met Asp Asn Asn Ala145                 150                 155                 160Asp Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr

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    195                 200                 205Pro Gln Ile Phe Asn Pro Ser Gly Gln Ile Leu Gly Pro Lys Tyr Asp

210                 215                 220Gly Lys Tyr Leu Met Gln Val Leu Gln Glu Lys Leu Gly Glu Thr Arg225                 230                 235                 240Val His Gln Ala Leu Thr Glu Val Val Ile Ser Ser Phe Asp Ile Lys

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    275                 280                 285Pro Thr Tyr Phe Pro Pro His Tyr Phe Val Thr Asn Thr Ser Asn Gly

290                 295                 300Asp Glu Tyr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala Val Ala Thr Val Ala305                 310                 315                 320Asp Pro Ala Leu Leu Ser Ile Ser Val Ala Thr Arg Leu Ala Gln Lys

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            85                  90                  95Leu Val Gln Val Gly Glu Asn Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser Glu Asp

        100                 105                 110Asn Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Arg Phe Ala Lys Leu Leu

    115                 120                 125Ser Asp Arg Lys Lys Leu Arg Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gly Pro Gly

130                 135                 140Gln Leu Gly Glu Met Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile145                 150                 155                 160Arg Gly Ile Ile Pro Ala Thr Ile Leu Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu

            165                 170                 175Gln Glu Met Asp Asn Asn Ala Asp Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp

        180                 185                 190Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Thr Ala Met Ile Ser

    195                 200                 205Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg Pro Phe Ala Ala Ala Lys Glu Ile Val

210                 215                 220Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro Gln Ile Phe Asn Pro Ser Gly Gln225                 230                 235                 240Ile Leu Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Met Gln Val Leu Gln

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    275                 280                 285Ser Asn Leu Ala Asn Ser Pro Glu Leu Asp Ala Lys Met Tyr Asp Ile

290                 295                 300Ser Tyr Ser Thr Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro Pro His Tyr Phe305                 310                 315                 320Val Thr Asn Thr Ser Asn Gly Asp Glu Tyr Glu Phe Asn Leu Val Asp

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        340                 345                 350Ala Thr Arg Leu Ala Gln Lys Asp Pro Ala Phe Ala Ser Ile Arg Ser

    355                 360                 365Leu Asn Tyr Lys Lys Met Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Gly Thr Thr

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        20                  25                  30Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Lys Gly Ile Ile Pro Ala Ile Ile Leu

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50                  55                  60Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly65                  70                  75                  80Leu Leu Thr Ala Met Ile Thr Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg Pro Phe

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    35                  40                  45Glu Phe Leu Glu Gly Gln Leu Gln Glu Val Asp Asn Asn Lys Asp Ala

50                  55                  60Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr Gly Gly65                  70                  75                  80Leu Leu Thr Ala Met Ile Thr Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg Pro Phe

            85                  90                  95Ala Ala Ala Lys Asp Ile Val Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro His

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130                 135                 140Gln Ala Leu Thr Glu Val Ala Ile Ser Ser Phe Asp Ile Lys Thr Asn145                 150                 155                 160Lys Pro Val Ile Phe Thr Lys Ser Asn Leu Ala Lys Ser Pro Glu Leu

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210                 215                 220Ala Leu Leu Ser Leu Ser Val Arg Thr Lys Leu Ala Gln Val Asp Pro225                 230                 235                 240Lys Phe Ala Ser Ile Lys Ser Leu Asn Tyr Asn Glu Met Leu Leu Leu

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290                 295                 300Thr Val Phe Gln Ala Arg His Ser Gln Asn Asn Tyr Leu Arg Val Gln305                 310                 315                 320Glu Asn Ala Leu Thr Gly Thr Thr Thr Glu Met Asp Asp Ala Ser Glu

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370                 375                 380Ser Tyr385<210>280<211>365<212>PRT<213>马铃薯(Solanum tuberosum)<400>280Met Ala Leu Glu Glu Met Val Ala Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly1               5                   10                  15Ile Lys Gly Ile Ile Pro Gly Thr Ile Leu Glu Phe Leu Glu Gly Gln

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50                  55                  60Thr Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg Pro Phe Ala Ala Ala Asn Glu Ile65                  70                  75                  80Val Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro His Ile Phe Asn Ser Arg Tyr

            85                  90                  95Trp Pro Ile Phe Trp Pro Lys Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Met Gln Val

        100                 105                 110Leu Gln Glu Lys Leu Gly Glu Thr Arg Val His Gln Ala Leu Thr Glu

    115                 120                 125Val Ala Ile Ser Ser Phe Asp Ile Lys Thr Asn Lys Pro Val Ile Phe

130                 135                 140Thr Lys Ser Asn Leu Ala Lys Ser Pro Glu Leu Asp Ala Lys Thr Tyr145                 150                 155                 160Asp Ile Cys Tyr Ser Thr Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro Pro His

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50                  55                  60Thr Thr Pro Asn Glu Asn Asn Arg Pro Phe Ala Ala Ala Lys Asp Ile65                  70                  75                  80Val Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro His Ile Phe Asn Tyr Ser Gly

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        180                 185                 190Asp Gly Ala Val Ala Thr Val Gly Asp Pro Ala Leu Leu Ser Leu Ser

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290                 295                 300Thr Thr Thr Glu Met Asp Asp Ala Ser Glu Ala Asn Met Glu Leu Leu305                 310                 315                 320Val Gln Val Gly Glu Thr Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser Arg Asp Ser

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    355                 360<210>282<211>386<212>PRT<213>马铃薯(Solanum tuberosum)<400>282Met Ala Thr Thr Lys Ser Phe Leu Ile Leu Phe Phe Met Ile Leu Ala1               5                   10                  15Thr Thr Ser Ser Thr Cys Ala Lys Leu Glu Glu Met Val Thr Val Leu

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            85                  90                  95Ala Ala Ala Lys Asp Ile Val Pro Phe Tyr Phe Glu His Gly Pro His

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    195                 200                 205Tyr Glu Phe Asn Leu Val Asp Gly Ala Val Ala Thr Val Gly Asp Pro

210                 215                 220Ala Leu Leu Ser Leu Ser Val Ala Thr Arg Leu Ala Gln Glu Asp Pro225                 230                 235                 240Ala Phe Ser Ser Ile Lys Ser Leu Asp Tyr Lys Gln Met Leu Leu Leu

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            325                 330                 335Ala Asn Met Glu Leu Leu Val Gln Val Gly Ala Thr Leu Leu Lys Lys

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    355                 360                 365Phe Ala Lys Leu Leu Ser Asp Arg Lys Lys Leu Arg Ala Asn Lys Ala

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        340                 345                 350Ile Leu Phe Gln Ala Leu His Cys Glu Lys Lys Tyr Leu Arg Ile Gln

    355                 360                 365Leu Tyr Tyr Ala Gly Tyr Phe Asp Trp Glu Arg Ile Val Arg Gly His

370                 375                 380Arg His Gln Gly Glu His Gly Val Ser Asp Ile Asp Arg Pro Gly Ala385                 390                 395                 400Ala Gln Glu Ala Ser Gly Glu Ser Glu His Arg His Arg Ala Val Arg

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        100                 105                 110Lys Ala Gly Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asn Leu Leu Gly Leu Val Arg

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            245                 250                 255Glu Tyr Thr Asn Tyr Leu Ile Ile Ser Val Gly Thr Gly Ser Ala Lys

        260                 265                 270Gln Ala Glu Lys Tyr Thr Ala Glu Gln Cys Ala Lys Trp Gly Leu Ile

    275                 280                 285Gln Trp Leu Tyr Asn Gly Gly Phe Thr Pro Ile Ile Asp Ile Phe Ser

290                 295                 300His Ala Ser Ser Asp Met Val Asp Ile His Ala Ser Ile Leu Phe Gln305                 310                 315                 320Ala Leu His Cys Glu Lys Lys Tyr Leu Arg Ile Gln Asp Asp Thr Leu

            325                 330                 335Thr Gly Asn Ala Ser Ser Val Asp Ile Ala Thr Lys Glu Asn Met Glu

        340                 345                 350Ser Leu Ile Ser Ile Gly Gln Glu Leu Leu Asn Lys Pro Val Ala Arg

    355                 360                 365Val Asn Ile Asp Thr Gly Leu Tyr Glu Ser Cys Glu Gly Glu Gly Thr

370                 375                 380Asn Ala Gln Ser Leu Ala Asp Phe Ala Lys Gln Leu Ser Asp Glu Arg385                 390                 395                 400Lys Leu Arg Lys Ser Asn Leu Asn Ser Asn

            405                 410<210>291<211>410<212>PRT<213>玉米(Zea mays)<400>291Met Gly Ser Ile Gly Arg Gly Thr Ala Asn Cys Ala Thr Val Pro Gln1               5                   10                  15Pro Pro Pro Ser Thr Gly Lys Leu Ile Thr Ile Leu Ser Ile Asp Gly

        20                  25                  30Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile Pro Ala Thr Ile Ile Ala Tyr Leu Glu

    35                  40                  45Ala Lys Leu Gln Glu Leu Asp Gly Pro Asp Ala Arg Ile Ala Asp Tyr

50                  55                  60Phe Asp Val Ile Ala Gly Thr Ser Thr Gly Ala Leu Leu Ala Ser Met65                  70                  75                  80Leu Ala Ala Pro Asp Glu Asn Asn Arg Pro Leu Phe Ala Ala Lys Asp

            85                  90                  95Leu Thr Thr Phe Tyr Leu Glu Asn Gly Pro Lys Ile Phe Pro Gln Lys

        100                 105                 110Lys Ala Gly Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asn Leu Leu Gly Leu Val Arg

    115                 120                 125Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Val Phe Leu His Asp Lys Ile Lys Ser Leu

130                 135                 140Thr His Asp Val Arg Val Ala Asp Thr Val Thr Asn Val Ile Val Pro145                 150                 155                 160Ala Phe Asp Val Lys Tyr Leu Gln Pro Ile Ile Phe Ser Thr Tyr Glu

            165                 170                 175Ala Lys Thr Asp Ala Leu Lys Asn Ala His Leu Ser Asp Ile Cys Ile

        180                 185                 190Ser Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro Ala His Phe Phe Lys Thr

    195                 200                 205Glu Ala Thr Asp Gly Arg Pro Pro Arg Glu Tyr His Leu Val Asp Gly

210                 215                 220Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala Met Ser Met Leu Thr225                 230                 235                 240Lys Glu Val His Arg Arg Asn Pro Asn Phe Asn Ala Gly Ser Pro Thr

            245                 250                 255Glu Tyr Thr Asn Tyr Leu Ile Ile Ser Val Gly Thr Gly Ser Ala Lys

        260                 265                 270Gln Ala Glu Lys Tyr Thr Ala Glu Gln Cys Ala Lys Trp Gly Leu Ile

    275                 280                 285Gln Trp Leu Tyr Asn Gly Gly Phe Thr Pro Ile Ile Asp Ile Phe Ser

290                 295                 300His Ala Ser Ser Asp Met Val Asp Ile His Ala Ser Ile Leu Phe Gln305                 310                 315                 320Ala Leu His Cys Glu Lys Lys Tyr Leu Arg Ile Gln Asp Asp Thr Leu

            325                 330                 335Thr Gly Asn Ala Ser Ser Val Asp Ile Ala Thr Lys Glu Asn Met Glu

        340                 345                 350Ser Leu Ile Ser Ile Gly Gln Glu Leu Leu Lys Lys Pro Val Ala Arg

    355                 360                 365Val Asn Ile Asp Thr Gly Leu Tyr Glu Ser Cys Asp Gly Glu Gly Thr

370                 375                 380Asn Ala Gln Ser Leu Ala Asp Phe Ala Lys Gln Leu Ser Asp Glu Arg385                 390                 395                 400Lys Leu Arg Lys Ser Asn Leu Asn Ser Asn

            405                 410<210>292<211>410<212>PRT<213>玉米(Zea mays)<400>292Met Gly Ser Ile Gly Arg Gly Thr Ala Asn Cys Ala Thr Val Pro Gln1               5                   10                  15Pro Pro Pro Ser Thr Gly Lys Leu Ile Thr Ile Leu Ser Ile Asp Gly

        20                  25                  30Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile Pro Ala Thr Ile Ile Ala Tyr Leu Glu

    35                  40                  45Ala Lys Leu Gln Glu Leu Asp Gly Pro Asp Ala Arg Ile Ala Asp Tyr

50                  55                  60Phe Asp Val Ile Ala Gly Thr Ser Thr Gly Ala Leu Leu Ala Ser Met65                  70                  75                  80Leu Ala Ala Pro Asp Glu Asn Asn Arg Pro Leu Phe Ala Ala Lys Asp

            85                  90                  95Leu Thr Thr Phe Tyr Leu Glu Asn Gly Pro Lys Ile Phe Pro Gln Lys

        100                 105                 110Lys Ala Gly Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asn Leu Leu Gly Leu Val Arg

    115                 120                 125Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Val Phe Leu His Asp Lys Ile Lys Ser Leu

130                 135                 140Thr His Asp Val Arg Val Ala Asp Thr Val Thr Asn Val Ile Val Pro145                 150                 155                 160Ala Phe Asp Val Lys Ser Leu Gln Pro Ile Ile Phe Ser Thr Tyr Glu

            165                 170                 175Ala Lys Thr Asp Thr Leu Lys Asn Ala His Leu Ser Asp Ile Cys Ile

        180                 185                 190Ser Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro Ala His Phe Phe Lys Ile

    195                 200                 205Glu Ala Thr Asp Gly Arg Pro Pro Arg Glu Tyr His Leu Val Asp Gly

210                 215                 220Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala Met Ser Met Leu Thr225                 230                 235                 240Lys Glu Val His Arg Arg Asn Pro Asn Phe Asn Ala Gly Ser Pro Thr

            245                 250                 255Glu Tyr Thr Asn Tyr Leu Ile Ile Ser Val Gly Thr Gly Ser Ala Lys

        260                 265                 270Gln Ala Glu Lys Tyr Thr Ala Glu Gln Cys Ala Lys Trp Gly Leu Ile

    275                 280                 285Gln Trp Leu Tyr Asn Gly Gly Phe Thr Pro Ile Ile Asp Ile Phe Ser

290                 295                 300His Ala Ser Ser Asp Met Val Asp Ile His Ala Ser Ile Leu Phe Gln305                 310                 315                 320Ala Leu His Cys Glu Lys Lys Tyr Leu Arg Ile Gln Asp Asp Thr Leu

            325                 330                 335Thr Gly Asn Ala Ser Ser Val Asp Ile Ala Thr Lys Glu Asn Met Glu

        340                 345                 350Ser Leu Ile Ser Ile Gly Gln Glu Leu Leu Asn Lys Pro Val Ala Arg

    355                 360                 365Val Asn Ile Asp Thr Gly Leu Tyr Glu Ser Cys Glu Gly Glu Gly Thr

370                 375                 380Asn Ala Gln Ser Leu Ala Asp Phe Ala Lys Gln Leu Ser Asp Glu Arg385                 390                 395                 400Lys Leu Arg Lys Ser Asn Leu Asn Ser Asn

            405                 410<210>293<211>337<212>PRT<213>玉米(Zea mays)<400>293Met Gly Ser Ile Gly Arg Gly Thr Ala Asn Cys Ala Thr Val Pro Gln1               5                   10                  15Pro Pro Pro Ser Thr Gly Lys Leu Ile Thr Ile Leu Ser Ile Asp Gly

        20                  25                  30Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile Pro Ala Thr Ile Ile Ala Tyr Leu Glu

    35                  40                  45Ala Lys Leu Gln Glu Leu Asp Gly Pro Asp Ala Arg Ile Ala Asp Tyr

50                  55                  60Phe Asp Val Ile Ala Gly Thr Ser Thr Gly Ala Leu Leu Ala Ser Met65                  70                  75                  80Leu Ala Ala Pro Asp Glu Asn Asn Arg Pro Leu Phe Ala Ala Lys Asp

            85                  90                  95Leu Thr Thr Phe Tyr Leu Glu Asn Gly Pro Lys Ile Phe Pro Gln Lys

        100                 105                 110Lys Ala Gly Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asn Leu Leu Gly Leu Val Arg

    115                 120                 125Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Val Phe Leu His Asp Lys Ile Lys Ser Leu

130                 135                 140Thr His Asp Val Arg Val Ala Asp Thr Val Thr Asn Val Ile Val Pro145                 150                 155                 160Ala Phe Asp Val Lys Tyr Leu Gln Pro Ile Ile Phe Ser Thr Tyr Glu

            165                 170                 175Ala Lys Thr Asp Ala Leu Lys Asn Ala His Leu Ser Asp Ile Cys Ile

        180                 185                 190Ser Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Phe Pro Ala His Phe Phe Lys Thr

    195                 200                 205Glu Ala Thr Asp Gly Arg Pro Pro Arg Glu Tyr His Leu Val Asp Gly

210                 215                 220Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala Met Ser Met Leu Thr225                 230                 235                 240Lys Glu Val His Arg Arg Asn Pro Asn Phe Asn Ala Gly Ser Pro Thr

            245                 250                 255Glu Tyr Thr Asn Tyr Leu Ile Ile Ser Val Gly Thr Gly Ser Ala Lys

        260                 265                 270Gln Ala Glu Lys Tyr Thr Ala Glu Gln Cys Ala Lys Trp Gly Leu Ile

    275                 280                 285Gln Trp Leu Tyr Asn Gly Gly Phe Thr Pro Ile Ile Asp Ile Phe Ser

290                 295                 300His Ala Ser Ser Asp Met Val Asp Ile His Ala Ser Ile Leu Phe Gln305                 310                 315                 320Ala Leu His Cys Glu Lys Lys Tyr Leu Arg Ile Gln Leu Tyr Tyr Ala

            325                 330                 335Gly

Claims (60)

1.一种分离的，脱敏的酰基脂水解酶蛋白，其包含在下列一个或多个区域中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区域中修饰的SEQ ID NO：7：

SEQ ID NO：2的104-113位或SEQ ID NO：7的85-94位；

SEQ ID NO：2的128-137位或SEQ ID NO：7的109-118位；

SEQ ID NO：2的184-197位或SEQ ID NO：7的165-178位；

SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位；

SEQ ID NO：2的264-277位或SEQ ID NO：7的245-258位；

SEQ ID NO：2的316-325位或SEQ ID NO：7的297-306位；和

SEQ ID NO：2的360-377位或SEQ ID NO：7的341-358位；其中：

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸或谷氨酰胺取代上述区中的一个或多个氨基酸而被修饰的；且

相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，修饰蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少。

2.一种分离的，脱敏的酰基脂水解酶蛋白，其包含通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2或通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ ID NO：7的169位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ ID NO：7的352位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的亮氨酸。

3.根据权利要求2所述的脱敏的酰基脂水解酶蛋白，其中SEQ IDNO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

4.根据权利要求2所述的脱敏的酰基脂水解酶蛋白，其中SEQ IDNO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

5.一种分离的核酸分子片段，其包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码在下列一个或多个区域中修饰的SEQ ID NO：2或在下列一个或多个区域中修饰的SEQ ID NO：7：

SEQ ID NO：2的104-113位或SEQ ID NO：7的85-94位；

SEQ ID NO：2的128-137位或SEQ ID NO：7的109-118位；

SEQ ID NO：2的184-197位或SEQ ID NO：7的165-178位；

SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位；

SEQ ID NO：2的264-277位或SEQ ID NO：7的245-258位；

SEQ ID NO：2的316-325位或SEQ ID NO：7的297-306位；及

SEQ ID NO：2的360-377位或SEQ ID NO：7的341-358位；其中：

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸或谷氨酰胺取代上述区中的一个或多个氨基酸而被修饰的；且

相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，修饰蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少。

6.一种分离的核酸分子片段，其包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ ID NO：7的169位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ ID NO：7的352位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的亮氨酸。

7.根据权利要求6所述的核酸分子片段，其中SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

8.根据权利要求6所述的核酸分子片段，其中SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

9.一种重组宿主细胞，其包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码在下列一个或多个区域中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区域中修饰的SEQ ID NO：7：

SEQ ID NO：2的104-113位或SEQ ID NO：7的85-94位；

SEQ ID NO：2的128-137位或SEQ ID NO：7的109-118位；

SEQ ID NO：2的184-197位或SEQ ID NO：7的165-178位；

SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位；

SEQ ID NO：2的264-277位或SEQ ID NO：7的245-258位；

SEQ ID NO：2的316-325位或SEQ ID NO：7的297-306位；及

SEQ ID NO：2的360-377位或SEQ ID NO：7的341-358位；其中：

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸或谷氨酰胺取代上述区中的一个或多个氨基酸而被修饰的：且

相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，修饰蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少。

10.一种重组宿主细胞，其包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ ID NO：7的169位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ ID NO：7的352位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的亮氨酸。

11.根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其中SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

12.根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其中SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

13.根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其中的宿主细胞是一种细菌细胞。

14.根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其中的宿主细胞是一种植物细胞。

15.一种重组植物，其包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码在下列一个或多个区域中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区域中修饰的SEQ ID NO：7：

SEQ ID NO：2的104-113位或SEQ ID NO：7的85-94位；

SEQ ID NO：2的128-137位或SEQ ID NO：7的109-118位；

SEQ ID NO：2的184-197位或SEQ ID NO：7的165-178位；

SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位；

SEQ ID NO：2的264-277位或SEQ ID NO：7的245-258位；

SEQ ID NO：2的316-325位或SEQ ID NO：7的297-306位；及

SEQ ID NO：2的360-377位或SEQ ID NO：7的341-358位；其中：

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸或谷氨酰胺取代上述区中的一个或多个氨基酸而被修饰的：且

相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，修饰蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少。

16.一种重组植物，其包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ ID NO：7的169位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ ID NO：7的352位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的亮氨酸。

17.根据权利要求16所述的重组植物，其中SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

18.根据权利要求16所述的重组植物，其中SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

19.根据权利要求16所述的重组植物，其中该植物是苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦。

20.一种制备重组植物的方法，该重组植物被转化，从而产生一种修饰蛋白，当对未修饰蛋白过敏的人食用它时，可减少变应原诱导性，该方法包括：

选择一种宿主植物细胞；

用重组载体转化该宿主植物细胞；

得到重组宿主细胞；并

从重组宿主植物细胞再生重组植物；其中

所述重组载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：2，或在下列一个或多个区中修饰的SEQ ID NO：7：

SEQ ID NO：2的104-113位或SEQ ID NO：7的85-94位；

SEQ ID NO：2的128-137位或SEQ ID NO：7的109-118位；

SEQ ID NO：2的184-197位或SEQ ID NO：7的165-178位；

SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位；

SEQ ID NO：2的264-277位或SEQ ID NO：7的245-258位；

SEQ ID NO：2的316-325位或SEQ ID NO：7的297-306位；及

SEQ ID NO：2的360-377位或SEQ ID NO：7的341-358位；其中：

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸或谷氨酰胺取代上述区中的一个或多个氨基酸而被修饰的：且

相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，修饰蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少。

21.一种制备重组植物的方法，该重组植物被转化，从而产生一种修饰蛋白，当对未修饰蛋白过敏的人食用它时，可减少变应原诱导性，

该方法包括：

选择一种宿主植物细胞；

用重组载体转化该宿主植物细胞；

得到重组宿主细胞；并

从重组宿主植物细胞再生重组植物；其中

所述重组载体包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：2，或编码通过下列一个或多个改变而被修饰的SEQ ID NO：7：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位或SEQ ID NO：7的94位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位或SEQ ID NO：7的118位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位或SEQ ID NO：7的165位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位或SEQ ID NO：7的169位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位或SEQ ID NO：7的173位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位或SEQ ID NO：7的183位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位或SEQ ID NO：7的249位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位或SEQ ID NO：7的250位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位或SEQ ID NO：7的254位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位或SEQ ID NO：7的294位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位或SEQ ID NO：7的295位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位或SEQ ID NO：7的296位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位或SEQ ID NO：7的348位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位或SEQ ID NO：7的349位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位或SEQ ID NO：7的350位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位或SEQ ID NO：7的352位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位或SEQ ID NO：7的353位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位或SEQ ID NO：7的354位的亮氨酸。

22.根据权利要求21所述的方法，其中SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位或SEQ ID NO：7的87位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位或SEQ ID NO：7的110位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

23.根据权利要求21所述的方法，其中SEQ ID NO：2是通过下列改变而被修饰的，或SEQ ID NO：7是通过下列改变而被修饰的：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位或SEQ ID NO：7的166位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位或SEQ ID NO：7的174位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位或SEQ ID NO：7的251位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位或SEQ ID NO：7的297位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位或SEQ ID NO：7的343位的酪氨酸。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述植物为苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦。

25.一种显示出酰基脂水解酶活性的分离的蛋白，其包含：

(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)或(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ IDNO：2的氨基酸24-268)；

所述-连接体-选自SEQ ID NO：277中的Gly-Pro-Gly和SEQ IDNO：276中的Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly。

26.根据权利要求25所述的蛋白，由SEQ ID NO：247组成。

27.根据权利要求25所述的蛋白，由SEQ ID NO：259组成。

28.一种重组宿主细胞，其包含一种编码蛋白的结构核酸序列，所述蛋白选自：

(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)和(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ IDNO：2的氨基酸24-268)；

其中所述的连接体选自SEQ ID NO：277和SEQ ID NO：276。

29.一种重组植物，其包含一种编码蛋白的结构核酸序列，所述蛋白选自：

(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)和(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ IDNO：2的氨基酸24-268)；

其中所述的连接体选自SEQ ID NO：277和SEQ ID NO：276。

30.一种制备重组宿主细胞的方法，该方法包括：

选择一种宿主细胞；

用重组载体转化该宿主细胞；并

得到重组宿主细胞；其中该重组载体包含一种编码蛋白的结构核酸序列，所述蛋白选自SEQ ID NO：247和SEQ ID NO：260。

31.一种制备重组植物的方法，该方法包括：

选择一种宿主植物细胞；

用重组载体转化该宿主植物细胞；

得到重组宿主细胞；并从重组宿主植物细胞再生重组植物；其中该重组载体包含一种编码蛋白的结构核酸序列，所述蛋白选自SEQ IDNO：247和SEQ ID NO：260。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述植物为苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦。

33.一种分离的蛋白，包含：

(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)或(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ IDNO：2的氨基酸24-268)；该蛋白是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，或谷氨酰胺取代下列区域中的一个或多个氨基酸而被修饰的：

SEQ ID NO：2的104-113位；

SEQ ID NO：2的128-137位；

SEQ ID NO：2的184-197位；

SEQ ID NO：2的202位；

SEQ ID NO：2的264-277位；

SEQ ID NO：2的316-325位；及

SEQ ID NO：2的360-377位；

其中相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，该蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少；且

其中所述的连接体选自SEQ ID NO：277及SEQ ID NO：276。

34.根据权利要求33所述的蛋白，其是通过下列一个或多个改变而被修饰的：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位的亮氨酸。

35.根据权利要求33所述的蛋白，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

36.根据权利要求33所述的蛋白，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

37.一种分离的核酸分子片段，其包含一种结构核酸序列，该结构核酸序列编码的蛋白选自：

(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)和(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ IDNO：2的氨基酸24-268)；所述蛋白是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，或谷氨酰胺取代下列区域中的一个或多个氨基酸而被修饰的：

SEQ ID NO：2的104-113位；

SEQ ID NO：2的128-137位；

SEQ ID NO：2的184-197位；

SEQ ID NO：2的202位；

SEQ ID NO：2的264-277位；

SEQ ID NO：2的316-325位；及

SEQ ID NO：2的360-377位；

其中相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，该蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少；且

其中所述的连接体选自SEQ ID NO：277和SEQ ID NO：276。

38.根据权利要求37所述的核酸分子片段，其中该蛋白是通过下列一个或多个改变而被修饰的：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位的亮氨酸。

39.根据权利要求37所述的核酸分子片段，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

40.根据权利要求37所述的核酸分子片段，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

41.一种重组载体，其包含在5’-3’方向可操作连接的：

一种指导结构核酸序列转录的启动子；

一种编码蛋白的结构核酸序列，所述蛋白选自(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)和(SEQ IDNO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-268)；及

一种3’转录终止子；

所述蛋白是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，或谷氨酰胺取代下列区中的一个或多个氨基酸而被修饰的：

SEQ ID NO：2的104-113位；

SEQ ID NO：2的128-137位；

SEQ ID NO：2的184-197位；

SEQ ID NO：2的202位；

SEQ ID NO：2的264-277位；

SEQ ID NO：2的316-325位；及

SEQ ID NO：2的360-377位；

其中所述的连接体选自SEQ ID NO：277和SEQ ID NO：276；且

其中相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，该蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少。

42.根据权利要求41所述的重组载体，其中该蛋白是通过下列一个或多个改变而被修饰的：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位的亮氨酸。

43.根据权利要求41所述的重组载体，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

44.根据权利要求41所述的重组载体，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

45.一种重组宿主细胞，其包含一种编码蛋白的结构核酸序列，所述蛋白选自：(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ IDNO：2的氨基酸24-246)；及(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-268)；

所述蛋白是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，或谷氨酰胺取代下列区域中的一个或多个氨基酸而被修饰的：

SEQ ID NO：2的104-113位；

SEQ ID NO：2的128-137位；

SEQ ID NO：2的184-197位；

SEQ ID NO：2的202位；

SEQ ID NO：2的264-277位；

SEQ ID NO：2的316-325位；及

SEQ ID NO：2的360-377位；

其中所述的连接体选自SEQ ID NO：277和SEQ ID NO：276；且

其中相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，该蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少。

46.根据权利要求45所述的重组宿主细胞，其中该蛋白是通过下列一个或多个改变而被修饰的：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位的亮氨酸。

47.根据权利要求45所述的重组宿主细胞，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

48.根据权利要求45所述的重组宿主细胞，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

49.一种重组植物，其包含一种编码蛋白的结构核酸序列，所述蛋白选自：(SEQ ID NO：2的氨基酸247-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-246)；及(SEQ ID NO：2的氨基酸269-386)-连接体-(SEQ ID NO：2的氨基酸24-268)；

所述蛋白是通过用丙氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，或谷氨酰胺取代下列区域中的一个或多个氨基酸而被修饰的：

SEQ ID NO：2的104-113位；

SEQ ID NO：2的128-137位；

SEQ ID NO：2的184-197位；

SEQ ID NO：2的202位；

SEQ ID NO：2的264-277位；

SEQ ID NO：2的316-325位；及

SEQ ID NO：2的360-377位；

其中所述的连接体选自SEQ ID NO：277和SEQ ID NO：276；且

其中相对于未修饰的酰基脂水解酶蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合，该蛋白与抗-酰基脂水解酶抗体的结合减少了。

50.根据权利要求49所述的重组植物，其中该蛋白是通过下列一个或多个改变而被修饰的：

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的113位的异亮氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的137位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的184位的丝氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用丝氨酸取代SEQ ID NO：2的188位的丙氨酸；

用丙氨酸或脯氨酸取代SEQ ID NO：2的192位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2的202位的天冬酰胺；

用丙氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：2的268位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的269位的苏氨酸；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的273位的赖氨酸；

用谷氨酸取代SEQ ID NO：2的313位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的314位的天冬酰胺；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的315位的天冬酰胺；

用苯丙氨酸或丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的367位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的368位的精氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的369位的苯丙氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的371位的赖氨酸；

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的372位的亮氨酸；及

用丙氨酸取代SEQ ID NO：2的373位的亮氨酸。

51.根据权利要求49所述的重组植物，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的106位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的129位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

52.根据权利要求49所述的重组植物，其中：

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的185位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的193位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的270位的酪氨酸；

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的316位的酪氨酸；及

用苯丙氨酸取代SEQ ID NO：2的362位的酪氨酸。

53.根据权利要求49所述的重组植物，其中所述植物为苜蓿，香蕉，canola，玉米，棉花，黄瓜，花生，马铃薯，水稻，大豆，向日葵，甘薯，烟草，番茄或小麦。

54.一种降低天然蛋白的变应原诱导性的方法，包括下列步骤：

a)确定对所述天然蛋白过敏的患者，并获得所述患者的血清；

b)使代表所述天然蛋白的合成重叠肽暴露于所述患者的血清中，以确定表现出与存在于所述患者血清中的IgE结合的表位的肽；

c)在步骤(b)中的肽的基础上，生产表现出丙氨酸扫描或合理扫描氨基酸取代的变异肽，与步骤(b)中的肽相比，其中所述变异肽与IgE的结合减少，所述氨基酸取代包括有效产生结果的取代；

(d)修饰所述天然蛋白的氨基酸序列，使其包含一个或多个所述有效产生结果的取代；并

(e)分离和纯化修饰蛋白，该修饰蛋白包含一个或多个有效产生结果的取代；

与所述天然蛋白相比，其中包含所述一个或多个有效产生结果的取代的修饰蛋白与存在于所述患者血清中的IgE的结合减少。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述的天然蛋白选自SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：278，SEQ ID NO：279，SEQ ID NO：280，SEQ ID NO：281，SEQ ID NO：282，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：286，SEQ ID NO：287，SEQ ID NO：288，SEQ ID NO：289，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：291，SEQ ID NO：292，及SEQ ID NO：293。

56.一种生产修饰的酰基脂水解酶蛋白的方法，包括：

a)确定对所述水解酶蛋白的天然形式过敏的患者，并获得所述患者的血清；

b)使代表所述天然蛋白的合成重叠肽暴露于所述患者的血清中，以确定表现出与存在于所述患者血清中的免疫球蛋白结合的表位的肽，所述免疫球蛋白对所述天然蛋白具有结合特异性；

c)在步骤(b)中的肽的基础上，生产表现出丙氨酸扫描或合理扫描氨基酸取代的变异肽，与步骤(b)中的肽相比，其中所述变异肽与免疫球蛋白的结合的减少，所述氨基酸取代包括有效产生结果的取代；

(d)修饰所述天然蛋白的氨基酸序列，使其包含一个或多个所述有效产生结果的取代；并

(e)分离和纯化包含一个或多个有效产生结果的氨基酸取代的修饰蛋白；

与所述天然蛋白相比，其中包含所述一个或多个有效产生结果的取代的该修饰的酰基脂水解酶蛋白与存在于所述患者血清中的免疫球蛋白的结合减少，且其脂酰基水解酶活性不低于天然蛋白，其杀虫活性也不低于天然蛋白。

57.一种分离的脱敏的酰基脂水解酶蛋白，其含有苯丙氨酸残基，该苯丙氨酸残基取代了SEQ ID NO：2的106，129，185，193，270及316位中的一个或多个氨基酸位置上的酪氨酸残基，或取代了与第9幅图中的SEQ ID NO：2(patatin_mtc)对比的酰基脂水解酶蛋白同系物中的对应氨基酸序列位置上的酪氨酸残基。

58.根据权利要求57所述的分离脱敏的酰基脂水解酶蛋白，其含有取代了选自SEQ ID NO：2的202位，SEQ ID NO：7的183位，SEQ IDNO：281的183位，及SEQ ID NO：280的181位的氨基酸序列位置上的天冬酰胺残基的谷氨酰胺残基。

59.一种分离的脱敏的酰基脂水解酶蛋白，其含有取代了选自SEQID NO：2的202位，SEQ ID NO：7的183位，SEQ ID NO：281的183位，及SEQ ID NO：280的181位的氨基酸序列位置上的天冬酰胺残基的谷氨酰胺残基。

60.一种分离并纯化的肽序列，其具有玉米根虫抑制活性和酰基脂水解酶活性，且其包含SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：247，SEQ ID NO：251，SEQ ID NO：255，SEQ ID NO：259，SEQ ID NO：263，SEQ ID NO：265，SEQ ID NO：271，SEQ ID NO：275，SEQ ID NO：278，SEQ ID NO：279，SEQ ID NO：280，SEQ ID NO：281，SEQ ID NO：282，SEQ ID NO：284，SEQ ID NO：286，SEQ ID NO：289，SEQ ID NO：290，SEQ ID NO：291，SEQ ID NO：292，或SEQ ID NO：293所表示的肽序列。

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